WO2009122540A1

WO2009122540A1 - しわを防止または改善するための経口、注射、皮膚外用剤および美容方法

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Publication number: WO2009122540A1
Application number: PCT/JP2008/056421
Authority: WO
Inventors: 入山俊介; 松永由紀子; 天野聡
Original assignee: 株式会社資生堂
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2008-03-31
Publication date: 2009-10-08

Abstract

　ヘパラナーゼを制御する物質を有効成分として経口、注射、皮膚外用剤として適用し、しわを改善した。

Description

しわを防止または改善するための経口、注射、皮膚外用剤および美容方法

　本発明は、しわを防止しまたは改善するための経口、注射、皮膚外用剤および美容方法、ならびに抗しわ効果の評価方法に関するものである。

　年をとるにつれて皮膚老化の１つの現象としてしわが増加するが、美容等の観点から特に女性においてしわの防止および改善に対する関心が非常に高まっている。しわは、その発生部位や発生メカニズム等によって、大じわ、小じわ、ちりめんじわに大きく分類される。大じわは主に光老化によって額や首の後ろ等に生じる深いしわであり、小じわは目尻や口元に生じる比較的浅いしわであり、またちりめんじわは老人の腹部等の非露光部に生じるひだ状のしわである。

　中でも小じわに関しては、しわ面積率が角層水分量の少ない肌状態の人で高い値を示すことが報告され（芋川ら、Fragrance Journal; 1992(11) 29-42（非特許文献１）参照）、小じわが、肌荒れや乾燥による角層水分量の低下によって悪化することが明らかになっている。現代女性はエアコンの普及により夏場でも肌が常に乾燥した環境下に置かれており、小じわに対する悩みが増大し、小じわへの関心も高まっている。

　これまで小じわを改善するには、低下した角層水分量を回復させるため、グリセリンやＮＭＦ（natural moisturizing factor）関連成分、コラーゲン誘導体等の保湿成分を肌に塗布して皮膚の水分保持を高める方法等が提案されているが、保湿作用以上の優れた小じわ改善効果を有する薬剤はほとんど開発されていないのが現状であった。

　しかし近年、小じわモデルが確立され、皮膚における生化学的変化が解明されつつある（松永ら、British Journal of Dermatology、2007、May;156(5):884-91（非特許文献２）参照）。その一つとして、表皮でのADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)の活性化と、それに伴うHB-EGF(ヘパリン結合性EGF様増殖因子;heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor)およびAmphiregulin等の表皮細胞の膜に結合した増殖因子の遊離が表皮肥厚、真皮肥厚を引き起こし、小じわ形成を促進することが明らかになっている。この小じわ形成を防ぐために、例えばTAPI-1または4-メトキシベンゾヒドロキサム酸等のADAM活性阻害剤を配合した皮膚の老化を抑制するための組成物が提案されている（特開2006-137744（特許文献１）、特開2007-119444（特許文献２）参照）。

　しかしながら、小じわが生じた皮膚における、タンパクレベル、遺伝子レベル等の各種生化学レベルの変化に関する詳細な検討は十分に行われておらず、このような詳細な検討に基づき、より効果的に小じわを防止・改善することができる経口、注射、外用剤や美容方法が強く望まれていた。

特開2006-137744 特開2007-119444 Fragrance Journal; 1992(11) 29-42 British Journal of Dermatology、2007、May;156(5):884-91 Semin Cancer Biol., 2002;12(2):121-129

　本発明は、上記のような事情に鑑み、皮膚における小じわ形成に関与する生化学的変化を解明し、かつその変化を抑制することができる物質を特定し、その物質を用いて、より効果的にしわを防止または改善できる、経口、注射、皮膚外用剤または美容方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、上記の生化学的変化の抑制を指標として、より効率的かつ簡便に被験物質の抗しわ効果を評価できる方法を提供することを目的とするものである。

　本発明者は、小じわモデルによって誘導されるしわ形成過程を生化学的に解析した結果、しわ形成過程において、ヘパラナーゼの発現が増加し、基底膜のヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンのヘパラン硫酸鎖が分解されることを見出し、ヘパラナーゼの活性を阻害する物質を塗布することによって、しわ形成を抑制できることを発見したことに基づくものである。

　ヘパラナーゼは、種々の細胞に存在し、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖を特異的に分解する酵素である。皮膚では、表皮を構成する表皮角化細胞および真皮の線維芽細胞、血管内皮細胞などが産生する。各種癌細胞でも産生が高まっていることが知られ、癌の悪性度との関連も示唆されている。癌細胞でヘパラナーゼの産生が高いと転移性が高く、血管新生の誘導能も高いことが知られている（Vlodavsky I., et. al., Semin Cancer Biol., 2002;12(2):121-129（非特許文献３）参照）。ヘパラナーゼは、本発明では、小じわモデルにて、ヘパラナーゼの発現および活性が亢進し、ヘパラン硫酸鎖を分解することを新たに見出した。

　ヘパラン硫酸プロテオグリカンはヘパリン結合性増殖因子（bFGF, HGF, VEGF, HB-EGF等）を細胞外に蓄積させる働きをする。ヘパラン硫酸プロテオグリカンの１種であるパールカンは、表皮と真皮の境界部に存在する表皮基底膜にも存在し、皮膚では、ヘパリン硫酸結合性増殖因子を表皮基底膜に結合させることによって、表皮、真皮間の増殖因子の移動を制御している。また、表皮基底膜に存在するパールカンは、基底膜に結合している表皮基底細胞に対する増殖因子の作用も制御しており、表皮の良好な増殖・分化に必須であることが明らかにされている。

　したがって、ヘパラナーゼの活性化または発現亢進によるパールカンのヘパラン硫酸鎖の分解は、蓄積された増殖因子の放出ならびに表皮、真皮間の増殖因子の制御を崩壊させ、表皮の分化・増殖制御の破綻および真皮の肥厚を生じさせることが、小じわ形成の１つの重要な機構であると考えられる。そこで、ヘパラナーゼの活性を抑制するスラミンを外用塗布することによって、皮膚におけるヘパラナーゼ活性を抑制することを試みた結果、ヘパラン硫酸鎖の分解が抑えるとともに、しわ、特に小じわ形成が抑制されることを見出した。

　皮膚のバリア破壊に伴って増加するヘパラナーゼを遺伝子発現、翻訳、酵素の活性化、および活性化酵素を抑制することが、皮膚の継続バリア破壊によって起こるしわ形成を抑制できることより、ヘパラナーゼを制御することで、本発明のしわを防止または改善するための美容方法、そして、ヘパラナーゼの制御剤を経口、注射、皮膚外用等の経路で皮膚に到達させることによってしわ形成の防止および改善剤が完成する。

　本発明のしわを防止または改善する物質としては、皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を阻害する物質、発現を阻害する物質、翻訳を阻害する物質、活性化を阻害する物質等のヘパラナーゼ制御物質を有効成分として含有することを特徴とする。

　また、本発明のしわを防止または改善する美容方法は、皮膚に存在するヘパラナーゼに対して上記ヘパラナーゼ制御物質を経口、注射または外用の方法で投与し、皮膚のヘパラナーゼを制御することを特徴とする。

　また、そのようなヘパラナーゼ制御物質の例としてヘパラナーゼの活性を阻害する物質、例えばスラミンが挙げられる。

　本発明は、スラミンからなるしわ改善剤も提供する。これら化合物は、ヘパラナーゼの活性を阻害することによって、しわ形成を防止し、または、形成されたしわを改善する作用を有する。

　本明細書において、「ヘパラナーゼの制御」とは、ヘパラナーゼの酵素活性を阻害するのみならず、遺伝子の発現やタンパク質生合成を阻害する、ヘパラナーゼの活性化を阻害する等、皮膚におけるヘパラナーゼの働きを抑制する任意の作用を含む。

　本発明の抗しわ効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織、細胞または酵素に被験物質を接触させ、前記皮膚、組織または細胞におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として抗しわ効果を評価することを特徴とする。

　本明細書において、「抗しわ効果」とは、しわの形成を防止し、または形成されたしわを改善する任意の効果を意味する。

　本発明の経口、注射、皮膚外用剤を適応することによって、また、本発明の美容方法によって、皮膚に存在するヘパラナーゼを制御し、非常に効果的に、しわ、特に小じわを防止または改善することが可能である。また、本発明の評価方法によって、効率的かつ簡便に、より高い効果を有する抗しわ物質を特定することが可能である。

図１は、ヘパラナーゼの遺伝子発現の変化を示す。結果は、平均値＋標準偏差で示した。＊：p＜0.01。図２は、ヘパラナーゼによる表皮基底膜上のヘパラン硫酸鎖の分解の経時変化を示す、パールカンコアタンパク質およびヘパラン硫酸鎖に対する特異的抗体を用いた免疫染色写真である。（Ａ）-（Ｃ）：パールカンコアタンパク質特異的抗体にて免疫染色した皮膚：Ｄａｙ０，Ｄａｙ２，Ｄａｙ７。（Ｄ）-（Ｆ）：ヘパラン硫酸特異的抗体にて免疫染色した皮膚：Ｄａｙ０，Ｄａｙ２，Ｄａｙ７。図３は、ヘパラナーゼ阻害剤、スラミンの抗しわ効果を示す。＊：P＜0.05、n=5～6。図４は、スラミンの表皮基底膜ヘパラン硫酸鎖の保護効果を示す、顕微鏡写真である。（Ａ）-（Ｄ）：皮膚をヘパラン硫酸特異的抗体にて免疫染色した顕微鏡写真。（Ｅ）－（Ｈ）：1mM スラミン塗布した皮膚をヘパラン硫酸特異的抗体にて免疫染色した顕微鏡写真。図５は、ヘパラナーゼ阻害剤、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの抗しわ効果を示す。＊＊：P＜0.001、n=6。図６は、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの表皮基底膜ヘパラン硫酸鎖の保護(分解抑制）効果を示す、パールカンコアタンパク質およびヘパラン硫酸鎖特異的抗体にて免疫染色した顕微鏡写真である。（Ａ）： 50％エタノールを塗布した皮膚をパールカン特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。（Ｂ）：1mM 1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアを塗布した皮膚をパールカン特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。（Ｃ）： 50％エタノールを塗布した皮膚をヘパラン硫酸特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。（Ｄ）：1mM 1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアを塗布した皮膚をヘパラン硫酸鎖特異的抗体にて染色した顕微鏡写真。

　本発明のしわを防止または改善する美容方法において、上記のヘパラナーゼを制御する物質は、本発明の目的を達成できる限り、任意の形態で適用することができ、また単独で適用しても、あるいは他の任意の成分と共に配合して適用してもよい。皮膚への適用する場合には、皮膚の場所も限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。
　本発明の抗しわ効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織、細胞または酵素に被験物質を接触させる工程を含む。

　本評価方法で用いることができるヒトまたは動物の皮膚は、本発明の目的を達成できる限り特に限定はされない。本発明の評価方法において、例えば、小じわモデルにおいて亢進された遺伝子発現を低下させる物質、ヘパラン硫酸鎖の分解を阻害する物質を特定することによって、抗しわ物質を効率的に特定できると考えられる。

　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

ヘパラナーゼ阻害剤スラミンの抗しわ効果の評価
　小じわモデル（非特許文献２）を用いて、ヘパラナーゼ阻害剤であるスラミンの抗しわ効果について検討した。
　図１に示すように、小じわモデルでは、ヘパラナーゼ遺伝子の発現が上昇した。7日目の皮膚では、図２に示すように、表皮・真皮接合部に存在する表皮基底膜上のヘパラン硫酸鎖の染色がほぼ消失した。

　小じわが形成される2週間、週3回、スラミンを1mMになるように50%エタノール水溶液に溶解させ、小じわモデルの皮膚に100μlずつ塗布した。溶媒対照として50％エタノール水溶液を塗布した。

　2週間後のしわの発生状況を視感判定によりスコア化した。しわの発生状況の評価基準は「しわなし；０」、「うすいしわ；１」、「明らかなしわ；２」、「深いしわ；３」とし、0.5刻みで点数化した。評点が大きいほどしわが深いことを示す。各群の平均値および標準偏差を算出し、結果を図３に示した。溶媒対照のスコアが平均値で0.78なのに対して、スラミンは0.31であり、溶媒対照と比較して有意なしわ抑制効果を示した。すなわち、しわスコアは、1mM スラミンを塗布することによって、 50％エタノールを塗布した溶媒対照と比較して有意にしわ形成を阻害した。

　次に、２日、１週間、２週間後の皮膚に関して、ヘパラン硫酸鎖の免疫染色を行い、染色結果を図４に示した。溶媒対照の皮膚は、２日から１週間後にかけて、基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色が低下するが、スラミン塗布によって基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色性が保護されていた。

　これらの結果から、スラミンは、ヘパラナーゼ酵素を阻害することにより、小じわ形成が抑制されることが明らかとなった。

ヘパラナーゼ阻害剤1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの抗しわ効果の評価
　ヘパラナーゼ特異的阻害剤として知られている1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレア（W. Pan, et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006;(16):409-412.）の抗しわ効果について検討した。
　1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアはスラミンと同様に、1mMになるように50%エタノール水溶液に溶解させ、皮膚に100μlずつ塗布した。溶媒対照として50％エタノール水溶液を塗布した。

　2週間後のしわの発生状況を視感判定によりスコア化した。しわの発生状況の評価基準は「しわなし；０」、「うすいしわ；１」、「明らかなしわ；２」、「深いしわ；３」とし、0.5刻みで点数化した。評点が大きいほどしわが深いことを示す。各群の平均値および標準偏差を算出し、結果を図５に示した。溶媒対照（50％エタノール水溶液）塗布のスコアが平均値で1.31なのに対して、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアは0.36であり、有意にしわ形成を抑制した。

　次に皮膚中のヘパラン硫酸鎖及びパールカンコアタンパク質の免疫染色を行い、染色結果を図６に示した。溶媒対照では、基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色性が著しく低下するが、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレア塗布群では、基底膜のヘパラン硫酸鎖の染色性が保護されていた。

　これらの結果から、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアは、ヘパラナーゼ酵素を阻害することにより小じわ形成を抑制した。

Claims

　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、遺伝子発現を抑制する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、遺伝子の翻訳を抑制する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、酵素活性を阻害する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する方法として、酵素の活性化を阻害する物質を適用することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを抑制する物質を、経口、注射、外用塗布などの方法にて投与することを特徴とする、しわを防止または改善する美容方法。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための経口投与薬剤。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための注射剤。
　皮膚に存在するヘパラナーゼの働きを制御する物質を有効成分として含有する、しわを防止または改善するための皮膚外用剤。
　前記ヘパラナーゼ抑制物質が、スラミン(Suramin)であることを特徴とする請求項７－９記載の経口、注射、皮膚外用剤。
　スラミンからなるしわ改善剤。
　前記物質が、スラミンであることを特徴とする請求項１，２、３または４記載の美容方法。
　ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖を検出し、ヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として被験物質の抗しわ効果を評価することを特徴とする、抗しわ効果の評価方法。
　表皮角化細胞を用いることを特徴とする請求項１３記載の方法。
　真皮線維芽細胞を用いることを特徴とする請求項１３記載の方法。