KR20160003188A

KR20160003188A - 주름을 방지 또는 개선하기 위한 경구, 주사, 피부 외용제 및 미용 방법

Info

Publication number: KR20160003188A
Application number: KR1020157034011A
Authority: KR
Inventors: 슌스케 이리야마; ?스케 이리야마; 유키코 마츠나가; 사토시 아마노; 겐이치 우미시오; 겐 구사카리; 다쿠야 히루마
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2016-01-08
Also published as: AU2009232715B2; EP2889027A2; KR20100132511A; EP2295028A1; AU2009232715A1; EP2987536A1; KR101578342B1; CN101983051A; EP2889027A3; JP2014208720A; EP2295028A4; JPWO2009123215A1; JP5722030B2; RU2010144505A; JP2016169238A; BRPI0910342A2; US20110020477A1; HK1150027A1; US20150335692A1; JP6298737B2

Abstract

본 발명에서는 헤파라나제(heparanase)를 제어하는 물질을 유효 성분으로 하여 경구, 주사, 피부 외용제로서 적용하여, 주름을 개선하였다.

Description

주름을 방지 또는 개선하기 위한 경구, 주사, 피부 외용제 및 미용 방법{PREPARATION FOR PREVENTING OR AMELIORATING WRINKLES, TO BE TAKEN ORALLY, THROUGH INJECTION, OR THROUGH EXTERNAL APPLICATION TO SKIN, AND COSMETIC METHOD}

본 발명은 주름을 방지 또는 개선하기 위한 경구, 주사, 피부 외용제 및 미용 방법과, 항주름 효과의 평가 방법에 관한 것이다.

나이를 먹음에 따라 피부 노화의 하나의 현상으로서 주름이 증가하지만, 미용 등의 관점에서 특히 여성에게 있어서 주름의 방지 및 개선에 대한 관심이 매우 높아져 있다. 주름은, 그 발생 부위나 발생 메커니즘 등에 따라, 큰주름, 잔주름, 오글오글한 잔주름으로 크게 분류된다. 큰주름은 주로 광노화에 의해 이마나 목 뒤 등에 생기는 깊은 주름이며, 잔주름은 눈꼬리나 입가에 생기는 비교적 얕은 주름이고, 오글오글한 잔주름은 노인의 복부 등의 비노광부에 생기는 주름형의 주름이다.

그 중에서도 잔주름에 관해서는, 주름 면적률이 각질층 수분량이 적은 피부 상태의 사람에게서 높은 값을 나타내는 것으로 보고되어 있고(이모카와 등, Fragrance Journal; 1992(11) 29-42(비특허문헌 1) 참조), 잔주름이, 피부 거칠음이나 건조에 의한 각질층 수분량의 저하에 의해 악화되는 것이 밝혀져 있다. 현대 여성은 에어컨의 보급에 의해 여름철에도 피부가 항상 건조한 환경 하에 놓여 있어, 잔주름에 대한 고민이 증대하며, 잔주름에의 관심도 높아져 있다.

지금까지 잔주름을 개선하기 위해서는, 저하한 각질층 수분량을 회복시키기 위해, 글리세린이나 NMF(natural moisturizing factor) 관련 성분, 콜라겐 유도체 등의 보습 성분을 피부에 도포하여 피부의 수분 유지를 높이는 방법 등이 제안되어 있지만, 보습 작용 이상의 우수한 잔주름 개선 효과를 갖는 약제는 거의 개발되어 있지 않은 것이 현재 상황이었다.

그러나 최근, 잔주름 모델이 확립되고, 피부에서의 생화학적 변화가 해명되고 있다(마츠나가 등, British Journal of Dermatology, 2007, May; 156(5): 884-91(비특허문헌 2) 참조). 그 하나로서, 표피에서의 ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)의 활성화와, 그에 따른 HB-EGF(헤파린 결합성 EGF 유사 증식 인자; heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor) 및 Amphiregulin 등의 표피 세포의 막에 결합한 증식 인자의 유리가 표피 비후, 진피 비후를 야기하며, 잔주름 형성을 촉진하는 것이 밝혀져 있다. 이 잔주름 형성을 막기 위해, 예컨대 TAPI-1 또는 4-메톡시벤조히드록삼산 등의 ADAM 활성 저해제를 배합한 피부의 노화를 억제하기 위한 조성물이 제안되어 있다(일본 특허 공개 제2006-137744(특허문헌 1), 일본 특허 공개 제2007-119444(특허문헌 2) 참조).

그러나, 잔주름이 생긴 피부에서의, 단백질 레벨, 유전자 레벨 등의 각종 생화학 레벨의 변화에 관한 상세한 검토는 충분히 행해져 있지 않아, 이러한 상세한 검토에 기초하여, 보다 효과적으로 잔주름을 방지·개선할 수 있는 경구, 주사, 외용제나 미용 방법이 강하게 요구되고 있었다.

[특허문헌]

특허문헌 1: 일본 특허 공개 제2006-137744호

특허문헌 2: 일본 특허 공개 제2007-119444호

특허문헌 3: 일본 특허 공표 제2003-502054호

[비특허문헌]

비특허문헌 1: Fragrance Journal; 1992(11) 29-42

비특허문헌 2: British Journal of Dermatology, 2007, May; 156(5): 884-91

비특허문헌 3: Semin Cancer Biol., 2002; 12(2): 121-129

비특허문헌 4: Mol Cancer Ther., 2004; 3(9): 1069-1077

비특허문헌 5: Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006; (16): 409-412.

본 발명은 상기와 같은 사정을 감안하여, 피부에서의 잔주름 형성에 관여하는 생화학적 변화를 해명하고, 또한 그 변화를 억제할 수 있는 물질을 특정하며, 그 물질을 이용하여, 보다 효과적으로 주름을 방지 또는 개선할 수 있는, 경구, 주사, 피부 외용제 또는 미용 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 생화학적 변화의 억제를 지표로 하여, 보다 효율적이며 또한 간편하게 피험 물질의 항주름 효과를 평가할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명자는 잔주름 모델에 의해 유도되는 주름 형성 과정을 생화학적으로 해석한 결과, 주름 형성 과정에서, 헤파라나제(heparanase)의 발현이 증가하고, 기저막의 헤파란 황산프로테오글리칸인 퍼레칸(Perlecan)의 헤파란 황산쇄가 분해되는 것을 발견하여, 헤파라나제의 활성을 저해하는 물질을 도포함으로써, 주름 형성을 억제할 수 있는 것을 발견한 것에 기초하는 것이다.

따라서, 본원 이하의 발명을 포함한다.

(1) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 것을 특징으로 하는 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법.

(2) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 방법으로서, 유전자 발현을 억제하는 물질을 적용하는 것을 특징으로 하는 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법.

(3) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 방법으로서, 유전자의 번역을 억제하는 물질을 적용하는 것을 특징으로 하는 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법.

(4) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 방법으로서, 효소 활성을 저해하는 물질을 적용하는 것을 특징으로 하는 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법.

(5) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 방법으로서, 효소의 활성화를 저해하는 물질을 적용하는 것을 특징으로 하는 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법.

(6) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 억제하는 물질을, 경구, 주사, 외용 도포 등의 방법으로 투여하는 것을 특징으로 하는 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법.

(7) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 물질을 유효 성분으로서 함유하는, 주름을 방지 또는 개선하기 위한 경구 투여 약제.

(8) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 물질을 유효 성분으로서 함유하는, 주름을 방지 또는 개선하기 위한 주사제.

(9) 피부에 존재하는 헤파라나제의 작용을 제어하는 물질을 유효 성분으로서 함유하는, 주름을 방지 또는 개선하기 위한 피부 외용제.

(10) 상기 헤파라나제 억제 물질이, 수라민(Suramin)인 것을 특징으로 하는 (7)∼(9) 중 어느 하나의 경구 투여 약제, 주사제 또는 피부 외용제.

(11) 수라민으로 이루어지는 주름 개선제.

(12) 상기 물질이 수라민인 것을 특징으로 하는 (1)∼(6) 중 어느 하나의 방법.

(13) 상기 헤파라나제 억제 물질이 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 (7)∼(9) 중 어느 하나의 경구 투여 약제, 주사제 또는 피부 외용제.

(14) 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민 또는 그 유도체로 이루어지는 주름 개선제.

(15) 상기 물질이 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 (1)∼(6) 중 어느 하나의 방법.

(16) 상기 헤파라나제 억제 물질이 쥐오줌풀 엑기스, 노송나무 엑기스, 키위 엑기스, 레몬 엑기스, 토마토 엑기스, 마늘 엑기스, 백합 엑기스, 장명초(갯기름나물) 엑기스, 등피 엑기스, 무환자나무 엑기스, 파슬리 엑기스, 대추 엑기스, 진피 엑기스, 및 쐐기풀 엑기스 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상으로 이루어지는 헤파라나제 활성 저해제인 것을 특징으로 하는 (7)∼(9) 중 어느 하나의 경구 투여 약제, 주사제 또는 피부 외용제.

(17) 쥐오줌풀 엑기스, 노송나무 엑기스, 키위 엑기스, 레몬 엑기스, 토마토 엑기스, 마늘 엑기스, 백합 엑기스, 장명초(갯기름나물) 엑기스, 등피 엑기스, 무환자나무 엑기스, 파슬리 엑기스, 대추 엑기스, 진피 엑기스, 및 쐐기풀 엑기스 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상으로 이루어지는 헤파라나제 활성 저해제로 이루어지는 주름 개선제.

(18) 상기 물질이 쥐오줌풀 엑기스, 노송나무 엑기스, 키위 엑기스, 레몬 엑기스, 토마토 엑기스, 마늘 엑기스, 백합 엑기스, 장명초(갯기름나물) 엑기스, 등피 엑기스, 무환자나무 엑기스, 파슬리 엑기스, 대추 엑기스, 진피 엑기스, 및 쐐기풀 엑기스 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상으로 이루어지는 헤파라나제 활성 저해제인 것을 특징으로 하는 (1)∼(6) 중 어느 하나의 방법.

(19) 인간 또는 동물의 피부, 피부 조직 또는 세포에 피험 물질을 접촉시켜, 상기 피부에서의 헤파라나제의 효소 활성, 유전자 발현 레벨 또는 헤파란 황산쇄를 검출하고, 헤파라나제의 효소 활성, 유전자 발현 레벨 또는 헤파란 황산쇄의 변화를 지표로 하여 피험 물질의 항주름 효과를 평가하는 것을 특징으로 하는 항주름 효과의 평가 방법.

(20) 표피 각화 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 (19)의 방법.

(21) 진피 섬유아세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 (19)의 방법.

본 발명의 경구, 주사, 피부 외용제를 적응함으로써, 또한, 본 발명의 미용 방법에 따라, 피부에 존재하는 헤파라나제를 제어하여, 매우 효과적으로, 주름, 특히 잔주름을 방지 또는 개선하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 평가 방법에 따라, 효율적이며 또한 간편하게, 보다 높은 효과를 갖는 항주름 물질을 특정하는 것이 가능하다.

도 1은 헤파라나제의 유전자 발현의 변화를 나타낸다. 결과는, 평균값+표준 편차로 나타내었다. *: p<0.01.
도 2는 헤파라나제에 의한 표피 기저막 상의 헤파란 황산쇄의 분해의 경시 변화를 나타내는, 퍼레칸 코어 단백질 및 헤파란 황산쇄에 대한 특이적 항체를 이용한 면역 염색 사진이다. (A)-(C): 퍼레칸 코어 단백질 특이적 항체로 면역 염색한 피부: 0일, 2일, 7일. (D)-(F): 헤파란 황산 특이적 항체로 면역 염색한 피부: 0일, 2일, 7일.
도 3은 헤파라나제 저해제, 수라민의 항주름 효과를 나타낸다. *: P<0.05, n=5∼6.
도 4는 수라민의 표피 기저막 헤파란 황산쇄의 보호 효과를 나타내는, 현미경 사진이다. (A)-(D): 피부를 헤파란 황산 특이적 항체로 면역 염색한 현미경 사진. (E)-(H): 1 mM 수라민 도포한 피부를 헤파란 황산 특이적 항체로 면역 염색한 현미경 사진.
도 5는 헤파라나제 저해제, 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아의 항주름 효과를 나타낸다. **: P<0.001, n=6.
도 6은 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아의 표피 기저막 헤파란 황산쇄의 보호(분해 억제) 효과를 나타내는, 퍼레칸 코어 단백질 및 헤파란 황산쇄 특이적 항체로 면역 염색한 현미경 사진이다. (A): 50％ 에탄올을 도포한 피부를 퍼레칸 특이적 항체로 염색한 현미경 사진. (B): 1 mM 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아를 도포한 피부를 퍼레칸 특이적 항체로 염색한 현미경 사진. (C): 50％ 에탄올을 도포한 피부를 헤파란 황산 특이적 항체로 염색한 현미경 사진. (D): 1 mM 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아를 도포한 피부를 헤파란 황산쇄 특이적 항체로 염색한 현미경 사진.
도 7은 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민의 헤파라나제 활성 저해의 평가 결과를 나타낸다.
도 8은 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민의, HT1080 세포를 이용한 창상 치유 어세이의 결과를 나타내는 HT1080 세포의 현미경 관찰 사진. (A): 스크래치 직후의 사진. (B): DMSO를 첨가한 배지로 교환한 후, 스크래치를 행하고 12시간 후의 사진. (C-E): 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민을 (1 μM; C, 10 μM; D, 100 μM; E) 첨가한 배지로 교환한 후, 스크래치를 행하고 12시간 후의 사진.
도 9는 (A), (B) 함께 실시예에서의 헤파라나제 활성 저해의 스크리닝의 결과를 나타낸다.

헤파라나제는, 여러가지 세포에 존재하고, 여러가지 헤파란 황산 프로테오글리칸의 헤파란 황산쇄를 특이적으로 분해하는 효소이다. 피부에서는, 표피를 구성하는 표피 각화 세포 및 진피의 섬유아세포, 혈관 내피 세포 등이 산생한다. 각종 암 세포에서도 산생이 높아져 있는 것이 알려져 있고, 암의 악성도와의 관련도 시사되어 있다. 암 세포에서 헤파라나제의 산생이 높으면 전이성이 높고, 혈관 신생의 유도능도 높은 것이 알려져 있다(Vlodavsky I., et. al., Semin Cancer Biol., 2002; 12(2): 121-129(비특허문헌 3) 참조). 본 발명에서는, 잔주름 모델에서, 헤파라나제의 발현 및 활성이 항진하여, 헤파란 황산쇄를 분해하는 것을 새롭게 발견하였다.

또한, 노인성 색소반 조직에서는 노광부 피부와 비교하여, 기저막의 헤파란 황산이 분해되어 있는 것이 분명하게 되었다. 헤파란 황산의 분해에 따라, 표피에서 발현하고 있는 혈관 내피 세포 증식 인자-A(VEGF-A)의 제어가 파탄하며, 이에 따라 진피의 혈관이나 림프관의 변화에 의해 염증을 생기게 하여, 멜라노사이트를 활성화시킨다. 또한, 진피에서 발현하고 있는 섬유아세포 증식 인자-7(FGF-7)의 제어가 파탄함으로써, 멜라노사이트로부터 표피 세포에서 멜라노솜의 교환이 촉진된다. 즉, 헤파라나제 활성화에 따른 헤파란 황산의 분해는, 염증에 의한 멜라노사이트의 활성화와 FGF-7 제어의 파탄에 의한 멜라노사이트 교환 촉진에 의해, 상승적으로 멜라노사이트가 케라티노사이트에 축적된다고 생각된다.

헤파란 황산 프로테오글리칸은 헤파린 결합성 증식 인자(bFGF, HGF, VEGF, HB-EGF 등)를 세포 밖에 축적시키는 작용을 한다. 헤파란 황산 프로테오글리칸의 1종인 퍼레칸은, 표피와 진피의 경계부에 존재하는 표피 기저막에도 존재하고, 피부에서는, 헤파린황산 결합성 증식 인자를 표피 기저막에 결합시킴으로써, 표피, 진피 사이의 증식 인자의 이동을 제어하고 있다. 또한, 표피 기저막에 존재하는 퍼레칸은, 기저막에 결합하고 있는 표피 기저 세포에 대한 증식 인자의 작용도 제어하고 있고, 표피의 양호한 증식·분화에 필수인 것이 분명하게 되어 있다.

따라서, 헤파라나제의 활성화 또는 발현 항진에 의한 퍼레칸의 헤파란 황산쇄의 분해는, 축적된 증식 인자의 방출 및 표피, 진피 사이의 증식 인자의 제어를 붕괴시켜, 표피의 분화·증식 제어의 파탄 및 진피의 비후를 생기게 하는 것이, 잔주름 형성의 하나의 중요한 기구라고 생각된다. 그래서, 헤파라나제의 활성을 억제하는 수라민을 외용 도포함으로써, 피부에서의 헤파라나제 활성을 억제하는 것을 시도한 결과, 헤파란 황산쇄의 분해가 억제되며, 주름, 특히 잔주름 형성이 억제되는 것을 발견하였다.

피부의 배리어 파괴에 따라 증가하는 헤파라나제를 유전자 발현, 번역, 효소의 활성화, 및 활성화 효소를 억제하는 것이, 피부의 계속 배리어 파괴에 의해 일어나는 주름 형성을 억제할 수 있기 때문에, 헤파라나제를 제어하는 것으로, 본 발명의 주름을 방지 또는 개선하기 위한 미용 방법, 그리고, 헤파라나제의 제어제를 경구, 주사, 피부 외용 등의 경로로 피부에 도달시킴으로써 주름 형성의 방지 및 개선제가 완성된다.

본 발명의 주름을 방지 또는 개선하는 물질로서는, 피부에 존재하는 헤파라나제의 활성을 저해하는 물질, 발현을 저해하는 물질, 번역을 저해하는 물질, 활성화를 저해하는 물질 등의 헤파라나제 제어 물질을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법은, 피부에 존재하는 헤파라나제에 대하여 상기 헤파라나제 제어 물질을 경구, 주사 또는 외용의 방법으로 투여하여, 피부의 헤파라나제를 제어하는 것을 특징으로 한다.

또한, 그와 같은 헤파라나제 제어 물질의 예로서 헤파라나제의 활성을 저해하는 물질, 예컨대 수라민을 들 수 있다.

본 발명은, 수라민으로 이루어지는 주름 개선제도 제공한다. 이들 화합물은, 헤파라나제의 활성을 저해함으로써, 주름 형성을 방지하고, 또는, 형성된 주름을 개선하는 작용을 갖는다.

본 명세서에서, 「헤파라나제의 제어」란, 헤파라나제의 효소 활성을 저해할 뿐만 아니라, 유전자의 발현이나 단백질 생합성을 저해하는, 헤파라나제의 활성화를 저해하는 등, 피부에서의 헤파라나제의 작용을 억제하는 임의의 작용을 포함한다.

본 발명의 항주름 효과의 평가 방법은, 인간 또는 동물의 피부, 피부 조직, 세포 또는 효소에 피험 물질을 접촉시켜, 상기 피부, 조직 또는 세포에서의 헤파라나제의 효소 활성, 유전자 발현 레벨 또는 헤파란 황산쇄의 변화를 지표로 하여 항주름 효과를 평가하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 「항주름 효과」란, 주름의 형성을 방지하고, 또는 형성된 주름을 개선하는 임의의 효과를 의미한다.

본 발명의 주름을 방지 또는 개선하는 미용 방법에서, 상기 헤파라나제를 제어하는 물질은, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태로 적용할 수 있고, 또한 단독으로 적용하여도, 혹은 다른 임의의 성분과 함께 배합하여 적용하여도 좋다. 피부에 적용하는 경우에는, 피부의 장소도 한정되지 않으며, 두피를 포함하는 체표면의 모든 피부를 포함한다.

본 발명의 항주름 효과의 평가 방법은, 인간 또는 동물의 피부, 피부 조직, 세포 또는 효소에 피험 물질을 접촉시키는 공정을 포함한다.

본 평가 방법에서 이용할 수 있는 인간 또는 동물의 피부는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 특별히 한정은 되지 않는다. 본 발명의 평가 방법에서, 예컨대, 잔주름 모델에서 항진된 유전자 발현을 저하시키는 물질, 헤파란 황산쇄의 분해를 저해하는 물질을 특정함으로써, 항주름 물질을 효율적으로 특정할 수 있다고 생각된다.

헤파라나제의 활성을 지표로 하는 1차 평가는, 예컨대 하기의 실시예에서 상세하게 기재한 대로, 비오틴화한 헤파란 황산을 96웰에 고정화한 후, 약제나 생약 존재 하에서 헤파라나제를 작용시키고, 비오틴화 헤파란 황산의 감소량을 퍼옥시다아제 표지한 아비딘을 작용시켜, 발색시킴으로써 헤파라나제 활성을 평가함으로써 행할 수 있다. 1차 평가에서 헤파라나제 활성 저해 효과가 있었던 약제는, 1차 평가와는 다른 헤파라나제 활성을 지표로 한 2차 평가계에서 재현성 및 농도 의존성의 평가를 행할 수 있다. 2차 평가는, 헤파라나제를 발현하고 있는 HT1080 세포를 이용하여 평가를 행할 수 있다. HT1080 세포는, 컨플루언트(confluent)로 배양한 후에 세포를 스크래치하면, 헤파라나제 활성 의존적으로 세포가 유주하는 것이 알려져 있다(Ishida K., et. al., Mol Cancer Ther., 2004; 3(9): 1069-1077. 참조(비특허문헌 4)). 그래서 평가 약제를 첨가함으로써, 스크래치 부위의 유주(회복)의 정도로부터 헤파라나제 저해 활성을 평가한다.

그 결과, 헤파라나제 활성을 유의하게 억제하는 화합물로서 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민이 발견되었다. 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민 및 그 유도체는 헤파라나제 활성 저해 작용이나 항노화 작용을 나타내는 것이 종래 기술에서 전혀 알려져 있지 않다. 또한 「항노화」란, 가령이나 광노화에 따른 기저막 프로테오글리칸의 헤파란 황산의 분해에 의한 헤파란 황산 결합성 증식 인자의 유리에 따른 피부 변화, 구체적으로는 표피 분화 이상, 진피 혈관 신생, 림프관 확장, 엘라스틴 분해를 억제함으로써, 피부의 주름, 처짐, 경화 등을 방지, 개선하여, 탄력이 있는 젊고 건강한 피부의 상태를 유지하는 것을 의미한다.

또한, 더욱 스크리닝을 행한 결과, 헤파라나제 활성을 유의하게 억제하는 생약 쥐오줌풀 엑기스, 노송나무 엑기스, 키위 엑기스, 레몬 엑기스, 토마토 엑기스, 마늘 엑기스, 백합 엑기스, 장명초(갯기름나물) 엑기스, 등피 엑기스, 무환자나무 엑기스, 파슬리 엑기스, 대추 엑기스, 진피 엑기스, 및 쐐기풀 엑기스가 발견되었다. 이들 생약에 대해서도, 헤파라나제 활성 저해 작용이나 항노화 작용을 나타내는 것이 종래 기술에서 전혀 알려져 있지 않다.

쥐오줌풀 엑기스는, 마타리과 쥐오줌풀속(Valeriana)에 속하는 다년초인 쥐오줌풀(V. fauriei) 또는 그 외의 근연종의 뿌리 및 근경으로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 상기 근연종으로서는 쓰루쥐오줌풀(V. flaccidissima), 서양쥐오줌풀(V. officinalis) 등을 들 수 있다.

노송나무 엑기스는, 노송나무과 노송나무속(Chamaecyparis)이나 나한백속(Thujopsis)에 속하는 식물이며, 천연 노송나무, 천연 나한백 등이라고 불리고 있는 수목의 잎, 가지 및 재부로부터 추출하여 얻어지는 히노키티올을 주성분으로 한 추출액이다. 히노키티올에는 항균·살균·방충·방진균·방부 등의 효과가 있다. 상기 천연 노송나무로서는, 구체적으로는 일본산 노송나무(Chamaecyparis obtuse), 대만의 중앙 산맥에 분포하는 타이완 노송나무(Chamaecyparis obtuse var. formosana, 혹은 C. taiwanensis) 등이 바람직하게 이용된다. 상기 천연 나한백으로서는, 나한백(Thujopsis delabrata)이나 그 변종인 나한백(T. d. var. hondae) 등이 바람직하게 이용된다. 천연 나한백은 아오모리현에 자라는 소위 쓰가루 나한백(무쓰 나한백, 아오모리 나한백이라고도 한다)이 유명하다.

키위 엑기스는, 다래나무과 다래나무속(Actinidia)에 속하는 키위(A. chinensis)의 과실로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 비타민 C 외에, 단백질 분해 효소, 아미노산, 탄닌, 당류 등의 천연의 식물 성분을 포함하며, 보습 작용, 수렴 작용, 피부 유연화 작용, 항산화 작용이 있다.

레몬 엑기스는, 귤과 귤속(Citrus)에 속하는 레몬(C. limon)의 과실로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 P 등이 포함된다. 미백, 소염 효과가 있다.

토마토 엑기스는, 가지과 토마토속(Lycopersicon)에 속하는 토마토(L. esculentum)의 과피나 과실로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 특히 과피에는 토마토 특유의 폴리페놀을 포함하며, 항알레르기 활성이 있다.

마늘 엑기스는, 백합과 파속(Allium)에 속하는 마늘(A. sativum, 혹은 A. scorodoplasum)의 인경으로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 알리신, 스코르진, 효소, 비타민류 등을 포함하며, 피로 회복·건위·정장 작용 등이 있다. 마늘의 알리신에는, 강력한 살균, 항균력이 있고, 스코르진은, 강장 작용이나 신진 대사를 왕성하게 하여, 비타민 B1의 효과를 높이는 작용도 있다.

백합 엑기스는, 백합과 백합속(Lilium)에 속하는 성모마리아 백합(L. candidum. 별칭 마돈나·릴리)의 구근으로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 안토시아닌, 옥시다아제 외에, 다량의 전분을 포함하며, 보습 작용, 보호 작용, 유연화 작용이 있다.

장명초(갯기름나물) 엑기스는, 미나리과 기름나물속(Peucedanum)에 속하는 식물로, 오키나와현에 자생하는 상록 다년초인 장명초(갯기름나물)(P. japonicum)의 잎 및 줄기로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 카로틴, 비타민 C, 비타민 E를 많이 포함하며, 항산화 작용이 있다.

등피 엑기스는, 귤과 귤속(Citrus)에 속하는 등자나무(C. aurantium)의 과피로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 등자나무의 성숙 과피를 등피(橙皮)라고 말한다. 등피 엑기스에는 리모넨, 헤스페리딘, 유성 성분 등이 포함된다. 진정 효과, 피부 기능 활성화 효과가 있다.

무환자나무 엑기스는, 무환자나무과 무환자나무속(Sapindus)에 속하는 무환자나무(S. mukorossi)의 과피로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 천연의 계면 활성제인 무환자나무 사포닌을 포함하며, 세정 효과가 있는 것 외에, 항염증 작용, 항균 작용도 있다.

파슬리 엑기스는, 미나리과 파슬리속(Petroselinum)에 속하는 유럽 원산의 다년초인 파슬리(P. crispum)의 잎으로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 주성분으로서, 아피올(apiole), 미리스티신(myristicin) 등을 포함한다. 아피올에는 이뇨 작용이 있다.

대추 엑기스는, 갈매나무과 대추속(Ziziphus)에 속하는 대추(Z. jujuba var. inermis)의 과실로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 주성분으로서, 사포닌이나 프룩토오스 등의 당류, 유기산류 외에 핵산 관련 물질인 사이클릭 AMP 등을 포함한다. 이 사이클릭 AMP는 피지 조직 단백질의 신생(재생)이나 피지 분비 조정 등의 작용이 있다.

진피 엑기스는, 한방약의 진피(陳皮)이며, 일본에서는 귤과 귤속(Citrus)에 속하는 귤나무(C. unshiu), 중국에서는 C. chachiensis 등의 과피로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 폴리페놀이 매우 많으며, 항염증 작용, 혈행 촉진 작용이 있다.

쐐기풀 엑기스는, 쐐기풀과 쐐기풀속(Urtica)에 속하며, 산지의 음지에 자생하는 다년초인 쐐기풀(U. thunbergiana, 혹은 U. dioica)의 잎으로부터 추출하여 얻어지는 추출액이다. 수렴 작용, 소취 작용이 있다.

상기 각 식물 엑기스는 통상법에 따라 얻을 수 있고, 예컨대, 각 엑기스의 기원이 되는 식물을 추출 용매와 함께 침지 또는 가열 환류한 후, 여과하고, 농축하여 얻을 수 있다. 추출 용매로서는, 통상 추출에 이용되는 용매이면 임의로 이용할 수 있고, 예컨대, 물, 메탄올, 에탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린 등의 알코올류, 함수 알코올류, 클로로포름, 디클로로에탄, 4염화탄소, 아세톤, 초산에틸, 헥산 등의 유기 용매 등을, 각각 단독 혹은 조합하여 이용할 수 있다. 상기 용매로 추출하여 얻어진 엑기스를 그대로, 혹은 농축한 엑기스를 흡착법, 예컨대 이온 교환 수지를 이용하여 불순물을 제거한 것이나, 다공성 폴리머(예컨대 앰버라이트 XAD-2)의 컬럼으로 흡착시킨 후, 메탄올 또는 에탄올로 용출하여, 농축한 것도 사용할 수 있다. 또한, 추출하여 얻어진 엑기스에 수증기 증류나 분배법, 예컨대 물/초산에틸로 추출하는 방법을 조합하여 얻어진 엑기스 등도 이용된다.

상기 각 식물 엑기스는, 안전성이 높고, 우수한 헤파라나제 활성 저해 작용을 갖는다. 따라서, 헤파라나제 활성을 원인으로 하는 여러가지 증상이나 질병, 병태 등의 치료, 예방, 개선 등에 도움이 된다. 특히, 피부에서의 헤파라나제 활성의 저해에 기초한 항노화에 적합하게 적용된다. 보다 자세하게는, 가령이나 광노화 등에 의한 기저막 프로테오글리칸의 헤파란 황산쇄의 분해에 의한 헤파린 결합성 증식 인자(HBGF)의 컨트롤의 파탄, 및 그에 따른 HBGB의 유리(방출)에 따른 피부 변화를 억제하고, 피부의 주름, 처짐, 경화 등을 방지, 개선하여, 탄력이 있는 젊고 건강한 피부의 상태를 유지하는 일 등에 적합하게 적용된다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제를 피부 외용제에 배합하는 경우, 상기 각 헤파라나제 활성 저해제 배합량은 외용제 전량 중, 건조 질량(고형분 질량)으로서 0.0001∼1 질량％가 바람직하고, 특히는 0.0001∼0.2 질량％이다. 0.0001 질량％ 미만에서는 본 발명의 효과가 충분히 발휘되기 어렵고, 한편, 1 질량％를 넘어 배합하여도 그다지 큰 효과의 향상은 보이지 않으며, 또한 제제화가 어려워지기 때문에 바람직하지 못하다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제를, 예컨대 피부 외용제에 적용하는 경우, 상기 필수 성분 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 통상 화장품이나 의약품 등의 외용제에 이용되는 성분, 예컨대, 미백제, 보습제, 산화 방지제, 유성 성분, 자외선 흡수제, 계면 활성제, 증점제, 알코올류, 분말 성분, 색제, 수성 성분, 물, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라 적절하게 배합할 수 있다.

또한, 에데트산2나트륨, 에데트산3나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 이온 봉쇄제, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤 등의 방부제, 카페인, 탄닌, 베라파밀, 트라넥삼산 및 그 유도체, 감초 추출물, 글라브리딘(glabridin), 모과나무 과실의 열수 추출물, 각종 생약, 초산토코페롤, 글리시리진산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르빈산인산마그네슘, 아스코르빈산글루코시드, 알부틴, 코지산 등의 미백제, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 자당, 트레할로오스 등의 당류, 레티노인산, 레티놀, 초산레티놀, 팔미틴산레티놀 등의 비타민 A 유도체류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

또한 이 피부 외용제는, 외피에 적용되는 화장료, 의약부외품 등, 특히 적합하게는 화장료에 널리 적용하는 것이 가능하고, 그 제형도, 피부에 적용할 수 있는 것이면 어떤 것이라도 좋으며, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말 분산계, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계, 연고, 화장수, 겔, 에어졸 등, 임의의 제형이 적용된다.

사용 형태도 임의이며, 예컨대 화장수, 유액, 크림, 팩 등의 페이셜 화장료나 파운데이션, 립스틱, 아이섀도우 등의 메이크업 화장료, 방향 화장료, 목욕용제 등에 이용할 수 있다.

또한, 메이크업 화장품이라면, 파운데이션 등, 욕실 제품으로서는 바디소프, 비누 등의 형태에 널리 적용 가능하다. 또한, 의약부외품이라면, 각종 연고제 등의 형태에 널리 적용이 가능하다. 그리고, 이들 제형 및 형태에, 본 발명의 헤파라나제 활성 저해제의 채득 형태가 한정되는 것이 아니다.

본 발명의 헤파라나제 활성 저해제를 의약 제제로서 이용하는 경우, 상기 제제는 경구적으로 혹은 비경구적(정맥 투여, 복강 내 투여, 등)으로 적절하게 사용된다. 제형도 임의이며, 예컨대 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 경구용 고형 제제나, 내복 액제, 시럽제 등의 경구용 액체 제제, 또는, 주사제 등의 비경구용 액체 제제 등, 어떠한 형태로도 공지의 방법에 따라 적절하게 조제할 수 있다. 이들 의약 제제에는, 통상 이용되는 결합제, 붕괴제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 교미제(矯味劑), 완충제, 계면 활성제, 용해 보조제, 보존제, 유화제, 등장화제, 안정화제나 pH 조제제 등의 부형제를 적절하게 사용하여도 좋다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

헤파라나제 저해제 수라민의 항주름 효과의 평가

잔주름 모델(비특허문헌 2)을 이용하여, 헤파라나제 저해제인 수라민의 항주름 효과에 대해서 검토하였다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 잔주름 모델에서는, 헤파라나제 유전자의 발현이 상승하였다. 7일째의 피부에서는, 도 2에 나타내는 바와 같이, 표피·진피 접합부에 존재하는 표피 기저막 상의 헤파란 황산쇄의 염색이 거의 소실되었다.

잔주름이 형성되는 2주간, 주 3회, 수라민을 1 mM가 되도록 50％ 에탄올 수용액에 용해시켜, 잔주름 모델의 피부에 100 ㎕씩 도포하였다. 용매 대조로서 50％ 에탄올 수용액을 도포하였다.

2주간 후의 주름의 발생 상황을 시각 판정에 의해 스코어화하였다. 주름의 발생 상황의 평가 기준은 「주름 없음; 0」, 「연한 주름; 1」, 「분명한 주름; 2」, 「깊은 주름; 3」으로 하고, 0.5 단위로 점수화하였다. 평점이 클수록 주름이 깊은 것을 나타낸다. 각 군의 평균값 및 표준 편차를 산출하여, 결과를 도 3에 나타내었다. 용매 대조의 스코어가 평균값으로 0.78인데 대하여, 수라민은 0.31이며, 용매 대조와 비교하여 유의한 주름 억제 효과를 나타내었다. 즉, 주름 스코어는, 1 mM 수라민을 도포함으로써, 50％ 에탄올을 도포한 용매 대조와 비교하여 유의하게 주름 형성을 저해하였다.

다음에, 2일, 1주일, 2주간 후의 피부에 관해서, 헤파란 황산쇄의 면역 염색을 행하여, 염색 결과를 도 4에 나타내었다. 용매 대조의 피부는, 2일부터 1주일 후에 걸쳐, 기저막의 헤파란 황산쇄의 염색이 저하하지만, 수라민 도포에 의해 기저막의 헤파란 황산쇄의 염색성이 보호되어 있었다.

이들 결과로부터, 수라민은, 헤파라나제 효소를 저해함으로써, 잔주름 형성이 억제되는 것이 분명하게 되었다.

헤파라나제 저해제 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아의 항주름 효과의 평가

헤파라나제 특이적 저해제로서 알려져 있는 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아(W. Pan, et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006; (16): 409-412.(비특허문헌 5))의 항주름 효과에 대해서 검토하였다.

1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아는 수라민과 마찬가지로, 1 mM이 되도록 50％ 에탄올 수용액에 용해시켜, 피부에 100 ㎕씩 도포하였다. 용매 대조로서 50％ 에탄올 수용액을 도포하였다.

2주간 후의 주름의 발생 상황을 시각 판정에 의해 스코어화하였다. 주름의 발생 상황의 평가 기준은 「주름 없음; 0」, 「연한 주름; 1」, 「분명한 주름; 2」, 「깊은 주름; 3」으로 하고, 0.5 단위로 점수화하였다. 평점이 클수록 주름이 깊은 것을 나타낸다. 각 군의 평균값 및 표준 편차를 산출하여, 결과를 도 5에 나타내었다. 용매 대조(50％ 에탄올 수용액) 도포의 스코어가 평균값으로 1.31인데 대하여, 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아는 0.36이며, 유의하게 주름 형성을 억제하였다.

다음에 피부 중 헤파란 황산쇄 및 퍼레칸 코어 단백질의 면역 염색을 행하여, 염색 결과를 도 6에 나타내었다. 용매 대조에서는, 기저막의 헤파란 황산쇄의 염색성이 현저하게 저하하지만, 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아 도포군에서는, 기저막의 헤파란 황산쇄의 염색성이 보호되어 있었다.

이들 결과로부터, 1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐]-유레아는, 헤파라나제 효소를 저해함으로써 잔주름 형성을 억제하였다.

헤파라나제 활성 저해의 스크리닝(1)

1차 평가

헤파라나제 활성 저해를 지표로 한 평가

A431 세포(침윤성 인간 상피 암 세포)를 10％ 혈청들이 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 세포는 Lysis Buffer(50 mM Tris, 0.5％ TritonX-100, 0.15 M NaCl, pH 4.5)로 가용화하고, 스크레이퍼로 회수한 후, 피펫팅을 행하여 얼음위에서 30분간 정치시켰다. 그 후 10,000 rpm으로 10분 원심함으로써, 불용해물을 제거하여 상청을 세포 추출액으로 하였다. 세포 추출액 중 단백량은 BCA Protein Assay Kit(PIERCE, CA46141)로 측정하였다.

세포 추출액을 어세이 Buffer(50 mM HEPES, 50 mM CH₃COONa, 150 mM NaCl, 9 mM CaCl₂, 0.1％ BSA)로 소정의 농도로 희석하고, 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민을 첨가, 혼합하고 나서, 비오틴화 헤파란 황산 고정화 플레이트에 100 μL/well로 파종하였다. 37℃에서 2시간 반응시켜, PBS-T로 3회 세정하고 나서, 10,000배 희석 HRP-avidin(Vector, A-2004)/PBS-T를 100 μL/well로 파종하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 재차 3회 PBS-T로 세정을 행하고, TMB 시약(BIO-RAD, 172-1066)을 100 μL/well로 파종하여 반응시키고, 1NH₂SO₄로 반응을 멈춘 후, OD 475 ㎚를 측정하였다(일본 특허 공표 제2003-502054호 참조(특허문헌 3)).

헤파라나제 활성은, A431 세포 추출액의 검량선으로부터 활성을 산출하여, 약제 추출물을 첨가하지 않는 자료(컨트롤)에 대한 상대적인 값을 가지고, 저해율(％)을 나타내었다.

그 결과, 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민이 농도 의존적으로 헤파라나제 활성을 효과적으로 억제하는 것이 분명하게 되었다. 이 결과를 도 7에 나타낸다. 컨트롤은, 후보 약제 대신에 DMSO를 작용시킨 것이다.

IC50 = 256 μM

2차 평가

HT1080 세포를 이용한 창상 치유 어세이

HT1080 세포를 6 well plate에 50만 세포/well로 파종하고, 24시간 후에 각 약제를 첨가한 배지로 치환하여, 1000 μL칩으로 수직으로 스크래치하였다. 6시간 후에 사진을 촬영하여, 스크래치 부위의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민 첨가군에서 농도 의존적으로 세포 유주 활성이 저하하고 있으며, 헤파라나제 활성을 억제하고 있는 것이 분명하게 되었다. 이 결과를 도 8에 나타낸다. 컨트롤은, 후보 약제 대신에 DMSO를 작용시킨 것이다.

헤파라나제 활성 저해의 스크리닝(2)

1. 시료의 조제

(1) 식물 엑기스

표 1에 나타내는 바와 같이, 각 식물을 각각 실온에서 1주일, 동 표에 기재하는 용매에 침지하여, 추출액을 얻었다. 이 추출액을 농축하여 각 식물 엑기스를 얻었다.

식물명	부위	식물 사용량(g)	용매	용매 사용량(㎖)	식물 엑기스 수량(g)
쥐오줌풀 (Valerian faurieia)	근경	100	물	1000	쥐오줌풀 엑기스 (17.2 g)
노송나무 (Chamaecyparis obtuse)	줄기	500	물	5000	노송나무 엑기스 (1.3 g)
키위 (Actinidia chinensis)	과실	100	30％ 에탄올수	1000	키위 엑기스 (10.5 g)
레몬 (Citrus limon)	과실	200	30％ 에탄올수	1000	레몬 엑기스 (9.8 g)
토마토 (Lycopersicon esculentum)	과실	200	물	1000	토마토 엑기스 (5.0 g)
마늘 (Allium sativum)	인경	100	30％ 에탄올수	1000	마늘 엑기스 (11.0 g)
성모마리아 백합 (Lilium candidum)	구근	100	80％ 에탄올수	1000	백합 엑기스 (6.9 g)
장명초(갯기름나물) (Percedanum japonicum)	잎과 줄기	100	메탄올	1000	장명초 엑기스 (13.2 g)
등자나무 (Citrus aurantium)	과피	100	30％ 에탄올수	1000	등피 엑기스 (38.0 g)
무환자나무 (Sapindus mukorossi)	과피	100	80％ 에탄올수	1000	무환자나무 엑기스 (7.3 g)
파슬리 (Petroselinum crispum)	잎	100	50% 에탄올수	1000	파슬리 엑기스 (1.6 g)
대추 (Ziziphus jujuba)	과실	100	10% 에탄올수	1000	대추 엑기스 (42.0 g)
귤나무 (Citrus unshiu)	과피	100	물	1000	진피 엑기스 (12.5 g)
쐐기풀 (Urtica thunbergiana)	잎	100	80% 에탄올수	1000	쐐기풀 엑기스 (8.4 g)

(2) 시료 용액

상기 식물 엑기스를 디메틸설폭시드(DMSO)에 농도 1 질량％가 되도록 용해하여, 식물 엑기스 함유 용액으로 하였다.

이 식물 엑기스 함유 용액을 각각, 측정용 완충액(0.4 M NaCl, 10 mM CaCl₂를 포함하는 pH 7.4의 0.1 M 트리스)으로 희석하여, 각각 0.05 v/v％, 0.5 v/v％, 5 v/v％가 되도록 농도를 조정하고, 이들을 시료 용액으로서 이용하여, 이하의 실험을 행하였다.

2. 헤파라나제 저해 효과의 평가 방법 및 그 결과

4-(1H-벤조이미다졸-2-일)-페닐아민 대신에 상기 식물 엑기스의 시료 용액을 이용하여, 상기 1차 및 2차 평가 방법에 따라, 이들 식물 엑기스에 대해서 헤파라나제 저해 효과의 평가를 행하였다.

결과를 도 9(A), (B)에 나타낸다.

도 9(A), (B)에 나타내는 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에서 이용하는 쥐오줌풀 엑기스, 노송나무 엑기스, 키위 엑기스, 레몬 엑기스, 토마토 엑기스, 마늘 엑기스, 백합 엑기스, 장명초(갯기름나물) 엑기스, 등피 엑기스, 무환자나무 엑기스, 파슬리 엑기스, 대추 엑기스, 진피 엑기스, 및 쐐기풀 엑기스가, 헤파라나제 활성을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었다.

이하에 처방예를 더 나타낸다. 또한 이하에서 「POE」는 「폴리옥시에틸렌」을 의미한다.

(배합 처방예 1: 크림)

(배합 성분) (질량％)

(1) 스테아르산 3.0

(2) 스테아릴알코올 5.0

(3) 이소프로필미리스테이트 18.0

(4) 글리세린모노스테아르산에스테르 3.0

(5) 프로필렌글리콜 10.0

(6) 본 헤파라나제 활성 저해제〔쥐오줌풀 엑기스(50％ 에탄올수 추출물. 고형분 환산)〕 1.0

(7) 가성칼리 0.2

(8) 아황산수소나트륨 0.01

(9) 방부제 적량

(10) 향료 적량

(11) 이온 교환수 잔여

(제법)

(11)에 (5)∼(7)을 부가하여 용해하고, 가열하여 70℃로 유지한다(수상). (1)∼(4), (8)∼(10)을 혼합하고 가열 융해하여 70℃로 유지한다(유상). 수상에 유상을 서서히 부가하고, 전부 부가하고 나서 잠시 그 온도로 유지하며 반응을 일으키게 한다. 그 후, 호모믹서로 균일하게 유화하고, 잘 섞으면서 30℃까지 냉각한다.

(배합 처방예 2: 크림)

(배합 성분) (질량％)

(1) 스테아르산 2.0

(2) 스테아릴알코올 7.0

(3) 수소첨가 라놀린 3.0

(4) 스쿠알렌 4.0

(5) 2-옥틸도데실알코올 6.0

(6) POE(25몰)세틸알코올에테르 3.0

(7) 글리세린모노스테아르산에스테르 2.0

(8) 프로필렌글리콜 6.0

(9) 본 헤파라나제 활성 저해제〔노송나무 엑기스(70％ 에탄올수 추출물. 고형분 환산)〕 0.2

(10) 아황산수소나트륨 0.03

(11) 에틸파라벤 0.3

(12) 향료 적량

(13) 이온 교환수 잔여

(제법)

(13)에 (8)을 부가하고, 가열하여 70℃로 유지한다(수상). (1)∼(7), (9)∼(12)를 혼합하고 가열 융해하여 70℃로 유지한다(유상). 수상에 유상을 부가하여 예비 유화를 행하고, 호모믹서로 균일하게 유화한 후, 잘 섞으면서 30℃까지 냉각한다.

(배합 처방예 3: 크림)

(배합 성분) (질량％)

(1) 고형 파라핀 5.0

(2) 밀랍 10.0

(3) 바셀린 15.0

(4) 유동 파라핀 41.0

(5) 글리세린모노스테아르산에스테르 2.0

(6) POE(20몰)소르비탄모노라우린산에스테르 2.0

(7) 비누 분말 0.1

(8) 붕사 0.2

(9) 본 헤파라나제 활성 저해제〔키위 엑기스(에탄올 추출물. 고형분 환산)〕 0.5

(10) 아황산수소나트륨 0.03

(11) 에틸파라벤 0.3

(12) 향료 적량

(13) 이온 교환수 잔여

(제법)

(13) 물에 (7), (8)을 부가하고, 가열 용해하여 70℃로 유지한다(수상). (1)∼(6), (9)∼(12)를 혼합하고 가열 융해하여 70℃로 유지한다(유상). 수상에 유상을 섞으면서 서서히 부가하여 반응을 행한다. 반응 종료 후, 호모믹서로 균일하게 유화하고, 유화 후 잘 섞으면서 30℃까지 냉각한다.

(배합 처방예 4: 유액)

(배합 성분) (질량％)

(1) 스테아르산 2.5

(2) 세틸알코올 1.5

(3) 바셀린 5.0

(4) 유동 파라핀 10.0

(5) POE(10몰)모노올레인산에스테르 2.0

(6) 폴리에틸렌글리콜1500 3.0

(7) 트리에탄올아민 1.0

(8) 카르복시비닐폴리머 0.05

(9) 본 헤파라나제 활성 저해제〔레몬 엑기스(50％ 1,3-부틸렌글리콜수 추출물. 고형분 환산)〕 0.03

(10) 아황산수소나트륨 0.01

(11) 에틸파라벤 0.3

(12) 향료 적량

(13) 이온 교환수 잔여

(제법)

소량의 (13)에 (8)을 용해한다(A상). 나머지 (13)에 (6), (7)을 부가하고, 가열 용해하여 70℃로 유지한다(수상). (1)∼(5), (9)∼(12)를 혼합하고 가열 융해하여 70℃로 유지한다(유상). 수상에 유상을 부가하여 예비 유화를 행하고, A상을 부가하여 호모믹서로 균일 유화하며, 유화 후 잘 섞으면서 30℃까지 냉각한다.

(배합 처방예 5: 유액)

(배합 성분) (질량％)

(1) 마이크로크리스탈린왁스 1.0

(2) 밀랍 2.0

(3) 라놀린 20.0

(4) 유동 파라핀 10.0

(5) 스쿠알렌 5.0

(6) 소르비탄세스퀴올레인산에스테르 4.0

(7) POE(20몰)소르비탄모노올레인산에스테르 1.0

(8) 프로필렌글리콜 7.0

(9) 본 헤파라나제 활성 저해제〔토마토 엑기스(70％ 1,3-부틸렌글리콜수 추출물. 고형분 환산) 0.2

(10) 아황산수소나트륨 0.01

(11) 에틸파라벤 0.3

(12) 향료 적량

(13) 이온 교환수 잔여

(제법)

(13)에 (8)을 부가하고, 가열하여 70℃로 유지한다(수상). (1)∼(7), (9)∼(12)를 혼합하고, 가열 융해하여 70℃로 유지한다(유상). 유상을 섞으면서 이것에 수상을 서서히 부가하여, 호모믹서로 균일하게 유화한다. 유화 후 잘 섞으면서 30℃까지 냉각한다.

(배합 처방예 6: 젤)

(배합 성분) (질량％)

(1) 95％ 에탄올 10.0

(2) 디프로필렌글리콜 15.0

(3) POE(50몰)올레일알코올에테르 2.0

(4) 카르복시비닐폴리머 1.0

(5) 가성소다 0.15

(6) L-아르기닌 0.1

(7) 본 헤파라나제 활성 저해제〔마늘 엑기스(50％ 에탄올수 추출물. 고형분 환산)〕 1.0

(8) 2-히드록시-4-메톡시벤조페논술폰산나트륨 0.05

(9) 에틸렌디아민테트라아세테이트·3Na·2H2O 0.05

(10) 메틸파라벤 0.2

(11) 향료 적량

(12) 이온 교환수 잔여

(제법)

(12)에 (4)를 균일하게 용해한다(수상). 한편, (1)에 (7), (3)을 용해한다(알코올상). 상기 알코올상을 수상에 첨가한다. 계속해서, 여기에 (2), (8)∼(11)을 부가한 후, (5), (6)으로 중화시켜 증점한다.

(배합 처방예 7: 미용액)

(배합 성분) (질량％)

(A상)

(1) 95％ 에탄올 10.0

(2) POE(20몰)옥틸도데칸올 1.0

(3) 판토테닐에틸에테르 0.1

(4) 본 헤파라나제 활성 저해제〔백합 엑기스(50％ 1,3-부틸렌글리콜수 추출물. 고형분 환산)〕 0.0225

(5) 메틸파라벤 0.15

(B상)

(6) 수산화칼륨 0.1

(C상)

(7) 글리세린 5.0

(8) 디프로필렌글리콜 10.0

(9) 아황산수소나트륨 0.03

(10) 카르복시비닐폴리머 0.2

(11) 정제수 잔여

(제법)

A상, C상을 각각 균일하게 용해하고, C상에 A상을 부가하여 가용화한다. 계속해서 B상을 부가한 후 충전을 행한다.

(배합 처방예 8: 팩)

(배합 성분) (질량％)

(A상)

(1) 디프로필렌글리콜 5.0

(2) POE(60몰) 경화 피마자 오일 5.0

(B상)

(3) 본 헤파라나제 활성 저해제〔장명초 엑기스(70％ 에탄올수 추출물. 고형분 환산)〕 0.0005

(4) 올리브 오일 5.0

(5) 초산토코페롤 0.2

(6) 에틸파라벤 0.2

(7) 향료 0.2

(C상)

(8) 아황산수소나트륨 0.03

(9) 폴리비닐알코올(비누화도 90, 중합도 2,000) 13.0

(10) 탄올 7.0

(11) 정제수 잔여

(제법)

A상, B상, C상을 각각 균일하게 용해하고, A상에 B상을 부가하여 가용화한다. 계속해서 이것을 C상에 부가한 후 충전을 행한다.

(배합 처방예 9: 고형 파운데이션)

(배합 성분) (질량％)

(1) 탈크 43.1

(2) 카올린 15.0

(3) 견운모 10.0

(4) 아연화 7.0

(5) 이산화티탄 3.8

(6) 황색 산화철 2.9

(7) 흑색 산화철 0.2

(8) 스쿠알렌 8.0

(9) 이소스테아르산 4.0

(10) 모노올레인산POE소르비탄 3.0

(11) 옥탄산이소세틸 2.0

(12) 본 헤파라나제 활성 저해제〔등피 엑기스(에탄올 추출물. 고형분 환산)〕 0.00001

(13) 방부제 적량

(14) 향료 적량

(제법)

(1)∼(7)의 분말 성분을 블렌더로 충분히 혼합하고, 이것에 (8)∼(11)의 유성 성분, (12), (13), (14)를 부가하여 잘 혼련한 후, 용기에 충전, 성형한다.

(배합 처방예 10: 유화형 파운데이션(크림 타입))

(배합 성분) (질량％)

(분체부)

(1) 이산화티탄 10.3

(2) 견운모 5.4

(3) 카올린 3.0

(4) 황색 산화철 0.8

(5) 벵갈라 0.3

(6) 흑색 산화철 0.2

(유상)

(7) 데카메틸시클로펜타실록산 11.5

(8) 유동 파라핀 4.5

(9) POE 변성 디메틸폴리실록산 4.0

(수상)

(10) 정제수 46.5

(11) 1,3-부틸렌글리콜 4.5

(12) 본 헤파라나제 활성 저해제〔무환자나무 엑기스(30％ 1,3-부틸렌글리콜수 추출물. 고형분 환산)〕 0.0025

(13) 소르비탄세스퀴올레인산에스테르 3.0

(14) 방부제 적량

(15) 향료 적량

(제법)

수상을 가열 교반후, 충분히 혼합 분쇄한 분체부를 첨가하여 호모믹서 처리한다. 더욱 가열 혼합한 유상을 부가하여 호모믹서 처리한 후, 교반하면서 향료를 첨가하여 실온까지 냉각한다.

(배합 처방예 11: 유액)

(배합 성분) (질량％)

(1) 디이소스테아르산글리세린 15.0

(2) 스쿠알렌 2.0

(3) 디메티콘 2.0

(4) 스테아릴알코올 3.0

(5) 본 헤파라나제 활성 저해제〔파슬리 엑기스(90％ 에탄올수 추출물. 고형분 환산)〕 1.0

(6) 스테아로일메틸타우린나트륨 1.0

(7) POE(20)베헤닐에테르 0.5

(8) 글리세린 5.0

(9) 1,3-부틸렌글리콜 5.0

(10) 카르복시비닐폴리머 0.2

(11) 방부제 적량

(12) 정제수 잔여

(제법)

(8)∼(12)를 균일 용해한 것을 60℃로 가열하고, 여기에, (1)∼(7)을 70℃에서 혼합한 것을 교반하면서 첨가하여 균일 분산하며, 30℃로 냉각하여 유액을 얻는다.

(배합 처방예 12: 화장수)

(배합 성분) (질량％)

(1) 에탄올 5.0

(2) 글리세린 0.5

(3) 디프로필렌글리콜 2.0

(4) 1,3-부틸렌글리콜 5.5

(5) 시트르산 0.02

(6) 시트르산나트륨 0.08

(7) 헥사메타인산나트륨 0.03

(8) 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 0.1

(9) 본 헤파라나제 활성 저해제〔대추 엑기스(70％ 1,3-부틸렌글리콜수 추출물. 고형분 환산)〕 0.015

(10) 라벤더 오일 0.1

(11) 알긴산나트륨 0.001

(12) 정제수 잔여

(제법)

상기 각 성분을 통상법에 따라 혼합 용해하여, 화장수를 얻는다.

(배합 처방예 13: 유액)

(배합 성분) (질량％)

(1) 디메틸폴리실록산 3.0

(2) 데카메틸시클로펜타실록산 4.0

(3) 에탄올 5.0

(4) 글리세린 6.0

(5) 1,3-부틸렌글리콜 5.0

(6) POE메틸글루코시드 3.0

(7) 스쿠알렌 2.0

(8) 수산화칼륨 0.1

(9) 헥사메타인산나트륨 0.05

(10) 본 헤파라나제 활성 저해제〔진피 엑기스(70％ 에탄올수 추출물. 고형분 환산)〕 0.0002

(11) 크산탄 검 0.3

(12) 카르복시비닐폴리머 0.1

(13) 아크릴산·메타크릴산알킬 공중합체 0.1

(14) 메틸파라벤 적량

(15) 향료 적량

(16) 정제수 잔여

(제법)

(16)에 (9), (12), (13)을 부가하여 용해하고, 추가로 (10) 및 (4)∼(6)을 혼합한다. 여기에, (3)에 (14), (11), (15)를 부가하여 용해한 것을 부가하여 혼합하고, 추가로 (1), (2), (7)의 혼합액을 부가하여 유화, (8)에 의해 중화시켜 증점시킨다.

(배합 처방예 14: 유액)

(배합 성분) (질량％)

(1) 바셀린 1.0

(2) 디메틸폴리실록산 3.0

(3) 메틸페닐폴리실록산 3.0

(4) 스테아릴알코올 0.5

(5) 글리세린 7.0

(6) 디프로필렌글리콜 3.0

(7) 1,3-부틸렌글리콜 7.0

(8) 스쿠알렌 1.0

(9) 이소스테아르산 0.5

(10) 스테아르산 0.5

(11) 모노스테아르산폴리옥시에틸렌글리세린 1.0

(12) 모노스테아르산글리세린 2.0

(13) 수산화칼륨 0.05

(14) 본 헤파라나제 활성 저해제〔(쐐기풀 엑기스(에탄올 추출물. 고형분 환산)〕 1.0

(15) EDTA·3나트륨 0.05

(16) 카르복시비닐폴리머 0.1

(17) 페녹시에탄올 적량

(18) 향료 적량

(19) 정제수 잔여

(제법)

(19)에 (6), (7), (13)을 부가하고, 가열하여 70℃로 유지한다(수상). 한편, (1)∼(4), (8)∼(12) 및 (17)을 혼합하고, 가열 용융하여 70℃로 유지한다(유상). 수상을 교반하면서 유상을 서서히 부가하고, 추가로 (15), (16), (18), (5) 및 (14)를 부가하여 호모믹서로 균일하게 유화하며, 유화 후 잘 교반하면서 30℃까지 냉각한다.

Claims

장명초 엑기스로 이루어진 헤파라나제(heparanase) 활성 억제제를 포함하는, 헤파라나제의 발현에 기인하는 주름을 억제하기 위한 주름 개선제.
인간 또는 동물의 피부, 피부 조직 또는 세포에 피험 물질을 접촉시켜, 상기 피부에서의 헤파라나제의 효소 활성, 유전자 발현 레벨 또는 헤파란 황산쇄를 검출하고, 헤파라나제의 효소 활성, 유전자 발현 레벨 또는 헤파란 황산쇄의 변화를 지표로 하여 피험 물질의 항주름 효과를 평가하는 것을 특징으로 하는 항주름 효과의 평가 방법.
제2항에 있어서, 표피 각화 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 진피 섬유아세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.