KR101531415B1 - Ｆｇｆ-2 또는 ｆｇｆ-베타 성장인자 보호 물질의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FGF-2를 보호할 수 있는 물질, FGF-2의 분해를 방지 또는 제어하기 위한 조성물, 및 피부에서 FGF-2를 분해로부터 보호하는 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 FGF-2를 그의 분해로부터 보호하기 위한 유효량의 히비스쿠스 아벨모스쿠스 또는 암브레트 추출물, 레보크자 추출물, 구기지 베리 추출물, 반하 추출물, 레소니아 추출물, 겨자 가루 추출물, 우인 추출물, 보리 추출물 및/또는 참깨 추출물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 특히 진피에서 세포외 매트릭스가 재건되는 것을 가능하게 하며, 이는 예를 들어 노화 조절을 위해 유용하다.

섬유아세포 성장 인자 (FGF-2), FGF-2의 분해, 화장품 조성물

Description

ＦＧＦ-2 또는 ＦＧＦ-베타 성장인자 보호 물질의 용도 {USE OF SUBSTANCES TO PROTECT FGF-2 OR FGF-BETA GROWTH FACTOR}

도 1은 서로 다른 온도에서 시간의 함수로서 시간 경과에 따른 FGF-2의 안정성의 그래프이다.

도 2는 헤파린의 존재하의 여러 온도에서 FGF-2의 안정성의 그래프이다.

도 3은 피부의 GAG에 의한 FGF-2 보호를 나타내는 그래프이다.

도 4는 프로테오글리칸에 의한 FGF-2의 보호를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 1종 이상의 성장인자의 분해를 제어하기 위한, 화장품, 피부-화장품 또는 제약학적 용도의 활성 성분의 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 섬유아세포 성장인자 (FGF-2 또는 염기성 FGF 또는 FGF-β)의 분해 방지에 관한 것이다.

또한 본 발명은 피부가, 특히 인간의 피부가 노화되고 있을 때, 피부의 성질을 보호하거나, 제한하거나 개선하는 활성 성분의 용도에 관한 것이다.

여러 성장인자가 피부 수준에 관여한다. 이러한 성장인자의 예로는, 섬유아 세포의 증식을 비롯한 광범위한 활성 스펙트럼을 가지며, 그에 따라 피부의 무결함(integrity)을 위해서 필수적인 매트릭스 거대분자의 합성을 가능하게 하는 FGF-2가 있다. FGF-2는 피부에서 헤파란 술페이트 프로테오글리칸에 의해 보호된다. 1990년대에, 페이지(Feige) 및 베어드(Baird) (Medecine/Sciences, 1992;8:805-10)는 성장인자와 세포내 매트릭스의 프로테오글리칸 사이의 밀접한 관계를 개시하면서, 이러한 상호작용이 저장소 현상 외에도, 성장인자를 단백질가수분해로부터 보호한다는 것을 설명하였다. 이로부터 성장인자의 보다 높은 안정성 (예를 들면, 생체내에서 반감기 연장)이 초래되어, 성장인자의 기능이 최적으로 발휘되도록 한다.

FGF -2 및 프로테오글리칸

FGF-2는 현재 고려되고 있는 23가지의 다양한 FGF들로 이루어진 족의 일원이다. FGF-2는 여러가지 이소형으로 존재한다. 척추동물에서는, 18, 22, 22.5, 24 및 34 kDa의 분자량을 갖는 5가지 이소형이 발견된다. 18 kDa 형태만이 세포 외부에서 검출되고, 반면 다른 이소형들은 세포 내부로, 보다 구체적으로는 핵에 한정된다. FGF-2는 생리학적 수준에서 매우 중요한 역할을 하는 편재하는 단백질이다; FGF-2는 태아 발달, 혈관신생, 뉴론 분화 및 조직 회복에 관여한다. 실제로, 이는 대부분의 조직에서, 보다 구체적으로 조직의 기저막을 표적으로 하는 분포 상태로 존재한다. FGF-2가 이를 정제하여 특징확인할 수 있을 정도로 유기체에 존재하지만, 그의 mRAN는 검출가능하지 않다. 이러한 사실과 조직의 기저막에 직접 결합된 상태로 분포한다는 특이성은 초기 속도로 생산된 다음 MEC에 저장되도록 발달 중에 세포에 의해 방출된다는 것을 암시한다 (이 과정 동안 기저막은 FGF-2가 국소적으로 방출되도록 하는 집중적인 리모델링하에 있음). 이러한 저장에 의해, FGF-2가 조직 회복에 참여하고 특수화된 기능을 유지하기 위하여 필요하다면 성숙한 상태로 방출된다. 따라서 노화됨에 따라 FGF-2의 공급은 감소함과 동시에 더이상 최고 활성 상태를 제공하지 않는다.

프로테오글리칸 (PG)은 세포외 매트릭스에서 18 kDa FGF-2의 세포외 형태의 잠재적인 저장소를 형성한다.

프로테오글리칸은 세포외, 막 또는 세포내 위치하는 분자이다. 이들은 다양한 글리코사미노글리칸 (GAG)이 이식된 "코어 단백질"이라고 하는 단백질 사슬로 이루어진다. 주요 GAG로는 헤파린 술페이트 (HS); 헤파린 (HP); 콘드로이틴 술페이트 (CS); 더마탄 술페이트 (DS; 콘드로이틴 술페이트의 이성질체) 및 케라틴 술페이트 (KS)가 있다.

헤파란 술페이트 프로테오글리칸 (HSPG)은 FGF-2와 비교적 강력한 친화력으로 회합하여, 이를 다양한 분해로부터 보호하고 저장소로서 사용되는 것에 대해 문헌에 개시되어 있다. FGF-2와 특정 GAG의 특이적인 연결이 확인되었다: 헤파란 술페이트. 헤파린 또는 헤파란 술페이트의 존재하에서 성장한 내피세포의 MEC와 FGF-2의 연결 억제가 확인되었지만 콘드로이틴 술페이트, 케라탄 술페이트 또는 히알루론산의 존재하에서는 그렇지 않았다. 또한, 헤파리티나제 (헤파린 및 헤파란 술페이트에 대한 특이적 효소)로 전처리된 MEC와 FGF-2의 연결은 나타나지 않았지만 콘드로이티나제 ABC (콘드로이틴 술페이트, 케라탄 술페이트 및 히알루론산에 대한 특이적 효소)로 전처리된 경우에는 그렇지 않았다. 상기 결과는 모두 FGF-2와 MEC의 헤파란 술페이트 사이에 특정한 관계가 존재하며, 다른 GAG와는 이러한 관계가 발견되지 않았다는 것을 입증한다.

구조 수준에서, 이러한 상호작용의 조사를 통해 FGF-2와 결합하기 위해 필요한 헤파란 술페이트 사슬 상의 최소의 서열은 1개 이상의 C₂-술페이트화된 이드우론산 잔기 및 1개 이상의 N-술페이트기를 함유하는 5당류이다. 또한, FGF-2 상에 헤파린 술페이트 결합 부위의 존재가 이러한 상호작용을 가능하게 한다. 이러한 부위는 몇몇 염기성 아미노산 잔기를 함유하는 2개의 β 시트 (β10 및 β11 시트) 수준에서 발견된다. 또한 FGF-2 상에 그의 생물학적 수용체: FGFR과의 결합을 위한 특이한 부위가 발견된다. FGF와 그의 시그널링 수용체의 상호작용은 상기 수용체의 이량체화 및 보조-수용체로서 헤파린 술페이트의 존재를 포함한다. FGF-2에 대한 반응의 모델은, FGF-2/HSPG의 2성분 복합체가 형성되고, 이어서 FGFR의 즉각적인 회합으로, 수용체의 단백질 키나제를 통해 생체내 생물학적 활성을 제공하기 위해 이량체화가 일어날 3성분 복합체의 형성이 유도된다는 것을 설명한다 (문헌 [IBRAHIMI ＆ coll., Biochemistry, 2004, 43, 4724-4730]). 상기 모델은 또한 FGFR 상에서 헤파린/헤파린 술페이트 결합 부위의 발견에 의해 지지된다.

여러 헤파란 술페이트 프로테오글리칸이 FGF-2와 결합할 수 있고, 이들 프로테오글리칸은 세포의 표면에 부착되거나, MEC 또는 기저막에서 유동할 수 있다. 이들 중에서 4가지가 문헌에서 열람되었다. 이들은 β-글리칸 (TGFβ에 대해 보다 강력한 친화력을 갖는 막 헤파란 술페이트 프로테오글리칸); 글리피칸 (glypican; 글리코실포스포이노시톨 연결을 통해 세포막에 연결된 헤파란 술페이트 프로테오글리칸); 신데칸 (syndecan; FGF-2에 대해 가장 큰 친화력을 갖는, 막횡단 헤파란 술페이트 프로테오글리칸); 및 퍼레칸 (perlecan; 매트릭스의 헤파란 술페이트 프로테오글리칸)이다.

FGF -2의 분해 및 보호

FGF-2는 단백질가수분해에 민감하고 생리학적 온도에서도 급속히 분해될 수 있다. FGF-2에 대한 매우 강력한 친화력 때문에 표준 대조군을 이루는 헤파린 (천연으로 고도로 술페이트화된 GAG)의 부재시 및 존재시에 FGF-2의 분해를 위한 조건이 조사되었고 문헌에 개시되었다.

타르듀(TARDIEU) 등 (문헌 [Tardieu and coll., Journal of cellular Physiology, 150:194-203; (1992)])은 1992년에 pH의 변화에 직면하게 된 (산) FGF-1 및 FGF-2의 거동을 조사하였다. 상기 헤파린을 사용하거나 사용하지 않고 3가지 조건을 시험하였다: pH 2, pH 7 및 pH 9. FGF의 분해를 섬유아세포 증식 모델에서 방사성 원소의 도입에 의해 조사하였다. 그 결과는 FGF-2가 산성 pH 및 염기성 pH에서 비활성화되지만 헤파린의 존재하에서는 중성 pH에서 관찰되는 것과 유사한 (또는 매우 약간 약해진) FGF-2의 활성을 보유할 수 있다는 것을 보여준다.

상기 저자는 또한 동일한 모델에서 FGF-1 및 FGF-2의 열분해를 조사하였다. 헤파린이 존재하거나 존재하지 않는 FGF 용액을 0℃, 20℃, 37℃, 60℃ 및 90℃에서 서로 다른 시간 동안: 1시간, 24시간, 7일, 14일, 30일 및 60일 동안 인큐베이 션하였다. 얻어진 결과는 FGF-2의 활성이 온도에 좌우된다는 것을 보여준다. 온도의 상승은 FGF-2의 활성 감소를 야기한다. 특히, 60℃ 및 90℃에서는 활성이 검출되지 않았고, 헤파린의 존재하에서도 검출되지 않았다. 한편, 다른 조사 온도에서는 헤파린이 시간 경과에 따라 FGF-2의 활성 보호를 제공한다.

최종적으로, 트립신 및 키모트립신에 의한 FGF-1 및 FGF-2의 효소적 분해가 조사되었다. 헤파린이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서, 37℃에서 3시간 동안 FGF 용액의 인큐베이션 후에, 18％ 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동을 실시하여 비-분해된 FGF를 관찰하였다. 인큐베이션 시간은 트립신이든지 키모트립신이든지 샘플에 존재하는 FGF 전체가 분해되도록 한다. 한편, 헤파린이 존재하는 경우에는 FGF-2에 있어서 18 kDa 밴드를 발견할 수 있고, 이는 헤파린에 의한 FGF-2의 전체 보호를 의미한다.

동일한 방식으로, GAG는 FGF-2의 활성 형태를 안정화하여, 산 변성 또는 심지어 열 변성으로부터 이를 보호하고 특정 세포 수용체와의 특이적 상호작용을 증가시킨다는 것이 확인되었다. 헤파린의 존재하에서, FGF는 저장되는 동안에 더욱 안정하고 변성 및 단백질가수분해 조건에 대해서 더욱 내성이다.

치료학, 치유, 조직 회복, 및 온도 및 효소적 단백질가수분해와 같은 상이한 스트레스에 대한 감수성에 있어서 FGF-2의 중요한 역할을 고려하여, 연구팀은 FGF-2의 추가의 공급 또는 심지어는 천연 또는 합성 분자에 의한 FGF-2의 보호의 효과를 연구하였다.

실제로 2005년에 야마나까(Yamanaka) (문헌 [Basic fibroblast growth factor treatment for skin ulcerations in scleroderma, cutis, 2005; 76: 373-376])는 피부 궤양의 치료에 있어서 재조합 FGF-2의 국소적 사용을 개시하고 있다. FGF-2는 섬유아세포의 FGF 수용체를 자극하고 섬유아세포의 활성화 및 혈관 증식을 유도한다. 회복 과정 및 재건 단계 동안, FGF-2는 또한 케라티노사이트의 증식에도 작용한다.

FGF-2를 열, pH로 인한 변성 및 효소적 분해 (트립신 및 키모트립신)에 대해 보호함으로써 FGF-2의 활성 (섬유아세포의 세포분열 활성)을 증대시키기 위해 덱스트란 유도체가 합성되었다 (상기 인용된 타르듀의 문헌 (1992)). 이들 유도체는 FGF-2를 헤파린보다 더욱 잘 보호하고, 따라서 강력한 항응고 활성을 갖는 헤파린 사용의 대안을 제시하는 화합물 제공이 가능하다. 이들은 조직 회복에 작용하는 제약학적 제제를 위한 매트릭스의 안정화제, 강화제 및 보호제이다. 또한, 2004년에 프랭크(Franck) 등 (문헌 [J. Biomater Sci. Polymer Edn. Vol. 15. N^o11, pp. 1463-1480 (2004)])은 섬유아세포 배양액에서 다른 덱스트란 유도체가 세포의 증식을 증가시키고 성장인자가 세포 성장에 미치는 영향을 촉진할 수 있다고 밝혔다.

최종적으로, 실비아 콜리-조울(Sylvia Colliec-Jouault) 등 (문헌 [Exopolysaccharides produced by bacteria isolated from deep-sea hydrothermal vents: new agents with therapeutic potential, Pathologie Biologie, 52, 127-130 (2004)])은 래트의 실험용 모델에서 골 충전을 위한 이식물로서 사용되는, 박테리아에 의해 신합성된 특정 세포외다당류(exopolysaccharide)의 사용을 다루었 다. 15일 후에, 동물은 관찰되는 염증 반응 없이 완벽한 치유를 보였다. 이러한 결과는 세포외다당류와 FGF-2를 비롯한 가용성 조정자의 상호작용에 의해 설명되고, 이는 FGF-2의 증식 활성이 증가하도록 하여 치유 현상을 촉진한다. 이러한 세포외다당류는 치아의 치유를 위해 사용된다.

피부: FGF -2, 프로테오글리칸 및 노화

피부에서, FGF-2는 표피, 진피-표피 경계부 (JDE), 진피, 하피 및 모세혈관에서 발견되고, 이는 광범위한 활성 스펙트럼을 갖는다. FGF-2는 진피에서 섬유아세포의 증식을 보장하여 피부의 무결함을 위해서 필수적인 매트릭스 거대분자를 합성할 수 있지만, 이는 또한 피부의 다른 세포에도 작용한다. 멜라노사이트의 증식은 실제로 모세혈관의 형성을 위한 촉진제이기도 한, 이러한 FGF-2에 의해 제어된다. FGF-2는 섬유아세포에서, 그의 증식 외에도 히알루로난 신타아제를 코딩하는 유전자의 mRNA 비율을 증가시켜 히알루로난 (진피의 주요 GAG)의 생산을 증가시킨다.

상해를 입었을 때, FGF-2는 치유 현상의 중요한 물질이다. FGF-2는 섬유아세포 수준에서 항상 그들의 증식을 증가시킴으로써 작용하지만, 또한 케라티노사이트에도 작용하여 콜라게나제-1의 발현을 억제함으로써 피부의 보다 신속한 재건을 가능하게 한다. 치유 동안에 이러한 작용은 운반자/저장소로서 헤파란 술페이트를 사용하였을 때는 발생하지 않지만 더마탄 술페이트를 사용하였을 때는 발생한다. 이어서 FGF-2의 발현이 주로 케라티노사이트, 대식세포 및 섬유아세포에 의해 일어난다. 시험관내 FGF-2의 반감기는 37℃ 및 중성 pH에서 약 24시간인 것으로 평가 되었다 (문헌 [SOMMER ＆ RIFKIN, Journal of cellular Physiology 138:215-220 (1989)]). 따라서, FGF-2는 그것이 수행하는 수많은 기능 때문에 피부의 중요한 사이토카인이다.

피부의 프로테오글리칸 및 그의 분포가 연구되었다. FGF-2와 상호작용할 수 있는 능력을 나타내는 주요 GAG가 피부에서 발견되었다. GAG의 정량적 및 정성적 분포가 하기와 같이 측정되었다: 히알루론산 (31％), 콘드로이틴 술페이트 (25％), 케라탄 술페이트 (24％), 더마탄 술페이트 (20％) 및 마지막으로 헤파란 술페이트 (18％). 진피에 함유된 헤파란 술페이트는 존재하는 FGF-2의 저장을 가능하게 한다.

노화되는 동안, 피부는 수많은 생리학적 변화를 겪게 된다. 가장 가시적인 흔적을 형성하는 주름 외에도, 드러나는 피하의 구조적인 변화가 있다. 진피는 특히 세포외 매트릭스 거대분자의 변화를 야기하는 섬유아세포의 갯수와 그들의 합성 능력이 감소한 결과 현저히 위축된다. 글리코사미노글리칸 합성의 감소 또한 존재하는 프로테오글리칸의 재조직에 관여하는 것으로 보고되었다. 섬유아세포 배양액에 대한 연구에서, 히알루론산의 합성이 노화되는 동안 현저히 감소하고 반면 케라탄 및 콘드로이틴 술페이트의 합성은 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 더마탄 및 헤파란 술페이트 경우에는, 그들의 합성이 감소하는 것이 중단되지 않을 것이다. 이러한 감소는 FGF-2의 저장을 더이상 가능하게 하지 않고 따라서 FGF-2의 내생성 효능을 더이상 보호하지 않을 것이다.

<발명의 목적>

성장인자, 특히 FGF-2를 특히 피부에서 일어나는 그의 분해 또는 변성으로부터 보호하기 위한 선행기술에 관한 문헌은 없었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부, 특히 진피에서 FGF-2의 내생성 공급을 보호하기 위하여, 헤파란 술페이트의 작용을 모방하고, 바람직하게는 피부 장벽을 관통하여 그의 표적에 도달할 수 있는 활성 성분을 개발함으로써 헤파란 술페이트 프로테오글리칸의 보호 작용을 완성하는 것으로 이루어진 신기술상의 문제 해결이다. 또다른 목적은 FGF-2의 내생성 양을 보호함과 동시에 이를 세포외 매트릭스, 특히 피부 매트릭스의 회복에 이용가능하도록 하는 활성 성분을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 특히 FGF-2를 여러 조직, 바람직하게는 피부에서 일어나는 그의 분해 또는 변성으로부터 보호하는 활성 성분을 제공하여, 특히 인간에게서 피부 매트릭스의 재건에 의해 세포외 매트릭스를 재건하거나, 피부의 보습을 향상시키거나, 피부의 회복을 촉진하거나, 진피의 무결함을 유지하거나, 멜라노사이트의 증식을 향상시키거나, 표피 분화를 증대시키거나, 표피의 재생을 증대시키기 위한 화장품, 피부-화장품 또는 제약 조성물을 제공하는 것으로 이루어진 기술상의 문제점 해결이다.

본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하기 위한 식물성 활성 성분을 제공하는 것으로 이루어진 새로운 문제점의 해결이다. 이러한 기술상의 문제점을 해결할 수 있는 활성 성분은 피부에 자극성이거나 독성이어서는 안된다.

따라서 본 발명의 목적은 특히 인간에게 국소 적용하기 위한 화장품, 피부- 화장품 또는 제약 분야에서 언급된 기술상의 문제점을 해결하는 활성 성분을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 언급한 목적을 달성할 수 있는 활성 성분을 선별하는 방법을 제공하는 것으로 이루어진 새로운 기술상의 문제점 해결이다. 상기 선별 방법은 바람직하게는 다수의 활성 성분을 재생가능하고 신뢰할 수 있는 방식으로 함께 선별하도록 해야 한다.

<발명의 요약>

상기 언급한 기술상의 문제점을 해결하는 활성 성분을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 선별된 다수의 물질의 FGF-2 보호 활성, 특히 FGF-2의 열분해시에 보호 활성이 입증될 수 있는 시험관내 선별 모델을 개발하였다.

FGF-2를 보호하기 위하여, 이들 활성 성분은 섬유아세포의 세포군을 재생함으로써, 특히 피부 매트릭스의 세포외 매트릭스의 무결함을 보장하는 주역할을 한다. 따라서 이들은 FGF-2의 분해를 효과적으로 제어하고 예를 들면 피부 노화를 제어하기 위한 최초 선택된 활성 성분이다.

제1 측면에 따라서, 본 발명은 FGF-2의 분해와 관련있는 적어도 하나의 피부 변화를 방지 또는 제어하기 위하여, 화장품 또는 피부-화장품 또는 제약 조성물 중의 활성 성분으로서, 술페이트화된 글리코사미노글리칸 (술페이트화된 GAG)도 아니고 술페이트화된 GAG의 구조적 유사체도 아닌 FGF-2 보호 물질의 용도에 관한 것이다.

바람직하게는, FGF-2 보호 물질은 식물 추출물이고 어떤 술페이트화된 GAG나 술페이트화된 GAG의 구조적 유사체도 포함하지 않는다.

상기 물질로서 히비스쿠스 아벨모스쿠스(Hibiscus Abelmoschus) 또는 암브레트(ambrette) 추출물, 레보크자(rebokza) 추출물, 구기지 베리(gougizi berry) 추출물, 반하(banha) 추출물, 레소니아(lessonia) 추출물, 겨자 가루 추출물, 우인(wooyin) 추출물, 보리 추출물, 참깨 추출물, 또는 열거된 추출물 중 2개 이상의 배합으로 생성된 조합물 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 유리하다.

유리하게는, FGF-2는 인간 피부에서, 바람직하게는 JDE 및/또는 진피에서, 및/또는 하피에서, 및/또는 표피에서, 및/또는 피부 혈관벽에서 보호된다.

유리하게는, 피부 변화는 인간 피부에서, 바람직하게는 JDE 및/또는 진피에서, 및/또는 하피에서, 및/또는 표피에서, 및/또는 피부 혈관벽에서 일어나는 FGF-2의 분해에 관한 것이다.

유리하게는, 상기 물질은 건조 상태에서 총 용액의 중량을 기준으로, 1 내지 10％의 식물 또는 식물 일부로부터 얻어진 용액 중의 수성 또는 히드로알콜성 추출물이다. 바람직하게는, 수성 추출물은 히드로글리콜성 추출물이다.

특히, 성장인자의 분해는 통상적으로 생리학적 온도에서 일어나거나, 열에 노출됨으로써 일어나는 열분해 및/또는 특히 카텝신 G에 의한 효소적 분해와 같은 하나 이상의 분해로부터 초래된다.

유리하게는, 상기 물질 또는 조성물은 피부 세포의 증식, 특히 섬유아세포 및/또는 멜라노사이트의 증식을 자극하고/하거나 1종 이상의 매트릭스 성분, 특히 1종 이상의 콜라겐 및/또는 1종 이상의 미세원섬유의 특정 단백질, 예컨대 피브릴린 1 또는 2 및/또는 피불린 3 또는 5, 및/또는 1종 이상의 글리코사미노글리칸 (GAG), 특히 술페이트화된 GAG의 합성을 증가시키기 위해 사용된다.

특정 실시양태에 따라서, 상기 물질 또는 조성물은 피부 매트릭스의 재건에 의해 세포외 매트릭스, 특히 JDE, 피부 혈관벽, 하피, 표피 및 특히 진피의 세포외 매트릭스를 재건하거나, 피부의 보습을 향상시키거나, 피부의 회복을 촉진하거나, 진피의 무결함을 유지하거나, 표피 분화를 향상시키거나, 표피의 재생을 증대시키는데 뿐만 아니라, 이들의 임의 조합에 특히 유용할 수 있다.

상기 기재된 이러한 다양한 용도는 FGF-2의 분해와 관련있는 피부 변화를 방지 또는 제어하는 것에 관한 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 농도는 특히 국소적으로 적용될 때 FGF-2를 보호하는 유효 농도이다. 이러한 물질이 국소 적용될 때의 유효량은 총 조성물의 0.01 내지 10 중량％ 범위인 것으로 밝혀졌다.

조성물은 특히 인간용 화장품, 피부-화장품 또는 제약 조성물로서 유용하다.

본 발명에 따른 물질은 바람직하게는 FGF-2를 그의 분해로부터 보호하는 식물 추출물이다. 이러한 식물 추출물은 수성 또는 히드로알콜성일 수 있고, 바람직하게는 히드로글리콜성 추출물이다.

한 바람직한 실시양태에서, 상기 물질은 히비스쿠스 아벨모스쿠스의 종자로부터 얻어지는 히비스쿠스 아벨모스쿠스의 수성 또는 히드로알콜성 추출물이다.

제2 측면에 따라서, 본 발명은 특히 상기 열거된 다양한 용도에서 FGF-2를 그의 분해로부터 보호하기 위한 조성물, 특히 화장 조성물, 제약 조성물 또는 피부-화장 조성물을 제조하기 위한 물질의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 특히 상기 열거된 다양한 용도 중 적어도 하나에 있어서 처치를 달성하기 위하여, 임의 실시양태에 따라 상기 정의된 조성물을 사용하는 화장학적, 제약학적 또는 피부-화장학적 처치 방법에 관한 것이다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명으로, FGF-2의 이와 동일한 매트릭스의 프로테오글리칸에 의한 보호가 달성될 수 있다.

"FGF-2의 보호"란 FGF-2를 그의 분해 또는 변성으로부터 보호하는 것을 의미한다. 상기 분해 또는 변성은 일반적으로 효소적 분해 또는 열분해와 같은 주위 조건으로 인한 분해로서 일어난다. 상기 분해 또는 변성은 프로테오글리칸에 의해 제공되는 보호의 약화로 인해 일어날 수 있다.

본 발명에 따른 선별 방법은 식물로부터 추출된 다양한 활성 성분이 선별되도록 한다. 식물 추출물은 피부, 특히 인간의 피부에서 FGF-2를 그의 분해로부터 보호하는 것에 대해 개시된 바 없으며, 헤파란 술페이트와 유사한 구조를 갖는 물질만이 사용되었다.

열분해로부터 FGF-2의 보호에 있어서 특히 효과적인 예상밖의 활성 성분이 확인되었다: 이것은 아욱과(Malvaceae)에 속하는 식물, 특히 히비스쿠스 속에 속하는 식물, 보다 특히 히비스쿠스 아벨모스쿠스 또는 암브레트의 종자로부터 얻어지는 수성 추출물이다.

히비스쿠스 아벨모스쿠스는 오직 화장품에서 슬리밍(slimming) 성질, 보다 구체적으로는 봉와직염을 제어하기 위해, 식물 전체로부터 얻어지는 수성 추출물로서 알려져 있다 (예를 들면, 미국 특허 제5,705,170호 참조).

본 발명에 있어서 목적하는 활성을 갖는 다른 추출물이 선택될 수 있다. 이들의 활성은 특히 FGF-2의 보호에 있어서 예상밖이었다. 추출물은 특히 탈수된 전체의 베리로부터 얻어지는 리시움 키넨세(Lycium chinense) 또는 구기지 베리의 수성 추출물, 구근으로부터 얻어지는 피넬리애 터나타(Pinelliae ternata) 또는 반하의 수성 추출물, 종자로부터 얻어지는 라파누스 사티부스(Raphanus sativus) 또는 레보크자의 수성 추출물, 종자로부터 얻어지는 브라시카 준세아(Brassica juncea) 또는 겨자의 추출물, 종자로부터 얻어지는 코이시스 세멘(Coicis semen) 또는 우인의 수성 추출물, 종자로부터 얻어지는 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) 또는 보리의 추출물, 종자로부터 얻어지는 세사뭄 인디쿰(Sesamum indicum) 또는 골든(golden) 참깨의 추출물, 및 레소니아 종의 조류 전체 또는 레소니아의 추출물이다.

그러나 이러한 추출물은 단독 수성 추출물로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 범주 내에서 목적하는 성질을 제공하기 위하여, 그것을 사용하여 활성 화합물 전체가 본질적으로 수성 추출물로 수득될 수 있는 임의의 극성 용매를 포함한다. 본 발명자들에 의해 고안된 시험으로부터, 목적하는 성질이 히드로글리콜성 추출물로 수득될 수 있다. 물/글리콜 유형의 추출 용매가 히드로글리콜성 추출물 중에서 바람직하다. 물/부틸렌글리콜 혼합물이 특히 바람직하다.

물/알콜 혼합물의 비율은 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 다양할 수 있다. 물/알콜 비율은 일반적으로 10/90 내지 90/10이고, 예를 들면 50/50 내지 85/15로 다양하다.

본 발명에서 활성 성분으로서, 건조 상태에서 총 용액의 중량을 기준으로 1 내지 10％의 식물 또는 식물 일부로부터 얻어진 용액 중 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물은 유리하게는 총 조성물의 중량을 기준으로, 본 발명에 따른 활성 성분을 0.001 내지 20％, 바람직하게는 0.01 내지 10％로 포함한다. 조성물은 국소적으로 적용되거나 경구로 투여될 수 있다.

인간에게서 FGF-2를 그의 분해로부터 보호하기 위한 잠재적 활성 물질의 선별 방법은 특히

a) 약 45℃의 온도에서 약 2시간 동안 잠재적 활성 물질을 FGF-2와 접촉하도록 두는 단계, 및

b) FGF-2를 그의 분해로부터 50％ 이상, 바람직하게는 65％로 보호하는 물질을 선택하는 단계

를 포함한다.

유리하게는, 선별 방법은 피부 장벽을 관통하는 활성 물질을 선택하기 위하여 경피성 침투를 시험하는 추가 단계를 포함한다.

유리하게는, 본 발명은 상기 선별 방법을 적용한 후에 선택된 활성 물질을 조성물을 제조하기 위한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물의 제조 방법 에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 실시예를 참조하는 설명 기재 부분을 읽으면 당업자에게 확실하게 명백해질 것이며, 여기서 실시예는 설명을 위해서만 제공되었을 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예는 본 발명의 필수적인 부분이며, 실시예를 포함하는 설명 전체를 고려하여 당업계의 선행기술에 비해 신규한 것으로 보이는 임의의 특징이 그의 목적 및 일반성에 있어서 본 발명의 필수적인 부분이다.

따라서, 실시예는 각각 일반적인 범주를 갖는다.

실시예에서, 모든 백분율은 달리 언급하지 않는 한 중량을 기준으로 제공되고, 온도는 달리 언급하지 않는 한 섭씨 온도로 표시되고, 압력은 달리 언급하지 않는 한 대기압이다.

<실시예>

실시예 1: FGF -2의 열 분해 연구

타르듀 등은 1992년에 방사성 원소 혼입에 의한 섬유아세포 증식 모델에서의 FGF-2의 열 분해를 연구하였다. 본원 발명자들은 FGF-2의 안정성을 조사할 수 있는 방법을 개발하였으며, 이 정량 방법은 대규모로 사용될 수 있어 상기 타르듀의 문헌에 기재된 방법으로는 불가능하였던 활성 성분의 선별을 달성할 수 있다.

0.1％의 BSA 및 0.1％의 메틸파라벤을 포함하는 10 mM PBS 완충액 중 FGF-2의 5 ng/ml 용액을 제조하였다.

상기 용액을 500 ㎍/ml의 헤파린의 존재 또는 부재하에 다양한 온도, 즉 4 ℃, 20 ℃, 37 ℃, 50 ℃ 및 80 ℃에 넣었다.

시판 중인 ELISA 키트 (R＆D 시스템(R＆D system), 프랑스)를 이용하여 상이한 시점 (T = 0 시간, 3 시간, 24 시간 및 48 시간)에 FGF-2의 투여를 수행하여 각 조사 온도에서의 분해 동역학을 확립하였다.

상기 결과를 시간 T = 0에 대한 FGF-2의 백분율로 표시하였다. 실험은 3회 수행하였다 (n = 3). 수득한 결과는 도 1 및 2에 도시하였다.

FGF-2는 제공되는 온도 조건에 민감하다.

도　1은 서로 다른 온도에서 시간의 함수로서 시간 경과에 따른 FGF-2의 안정성 그래프를 도시하고 있다. 4 ℃에 보관된 FGF-2는 이 온도에서 FGF-2의 20％가 분해되었으므로 48 시간에 걸쳐 상대적으로 안정하였다. 온도가 증가함에 따라, 분해율이 증가하였다: 즉 37 ℃에서는 3 시간 후에 FGF-2의 65％가 분해되었으며, 50 ℃에서는 80％ 분해되었다. 최종적으로, 80 ℃에서는 단백질이 변성되기 때문에 상기 온도에서 3 시간이 경과한 후에는 FGF-2가 모두 분해되는 것으로 관찰되었다.

최종적으로, 좀 더 오랜 시간 후에 분해가 좀 더 많이 관찰되는 것이 유의적이며, 37 ℃에서 24 시간 후에 FGF-2의 80％가 분해되었다.

도　2는 헤파린의 존재하에 여러 온도에서 FGF-2의 안정성 그래프를 도시하고 있다. 도　2는 실험 양성 대조군인 0.05％ 헤파린의 존재에 의해 상기 분해 반응이 중단되며, 이 때 헤파린이 FGF-2에 대해 강력한 친화력을 가져 FGF-2를 안정화시킨다는 것을 보여준다. 헤파린은 FGF-2에 대해 매우 강력한 친화력을 가진 것으로 알려진 고도로 술페이트화된 다당류이다.

헤파린은 80 ℃의 온도에서 변성되기 때문에 이 온도에서도 상기 보호 반응이 효과적이지 않았다.

놀랍게도, 약 50 ℃에서의 FGF-2의 분해는 짧은 기간에 걸쳐 일어났다. 45 ℃에 근접한 온도를 실제 목적을 위해 선택된 것으로, 이는 활성 성분의 선별을 위한 스트레스 모델을 수행하기 위해 선택된 파라미터이며, 여기서 실험 양성 대조군은 바람직하게는 헤파린으로 구성된다.

실시예 2: 열 분해에 대해 FGF-2를 보호하는 활성물질을 선별하기 위한 시험관내 모델

약 50 ℃에서 관찰된 FGF-2의 분해는 단기간에 FGF-2가 약 80％ 분해되어 다수의 시험을 수행할 수 있었기 때문에 특히 흥미로웠다. 이와 같은 이유로, 선별은 45 ℃에서 2.15 시간 동안의 스트레스를 이용하여 수행하며, 상기 열 분해에 대해 FGF-2를 보호하는 다수의 활성물질의 능력을 연구하기로 결정하였다.

적용되는 선별 모델은 다음과 같다:

0.1％ BSA/PBS 완충액으로 제조된 4.5 ng/ml의 FGF-2 용액 180 ㎕를 96-웰 마이크로플레이트에 분배하였다. 20 ㎕의 증류수, 0.05％ 헤파린 또는 여러 식물로부터 추출된 다양한 시험 활성 성분을 함유하는 용액을 첨가하였다. 플레이트 교반기를 이용하여 플레이트를 교반한 후에, 접착 테이프로 덮고, 45 ℃의 오븐에 2.15 시간 동안 넣어 두었다. 인큐베이션 시간이 끝나는 시점에, 플레이트를 꺼내고, 이어서 ELISA 키트를 이용하여 FGF-2의 투여를 수행하였다.

FGF-2 및 증류수만을 함유하는 대조군 플레이트를 동일한 조건하에 처리하여 실온에 방치하였다.

상기 결과는 스트레스를 받지 않았거나 또는 분해되지 않은 FGF-2 대조군에 대한 FGF-2 보호율(％)로서 표시하였다.

실시예 3: 피부의 GAG 및 프로테오글리칸에 의한 모델의 확인

모델을 확인하기 위해 시판 중인 GAG 및 PG를 사용하여 시험을 수행하였다.

상이한 농도를 갖는 GAG 용액를 제조하였다: 헤파란 술페이트, 더마탄 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 및 히알루론산을 용해시키고, 0.1％, 0.01％ 및 0.001％에서 시험하였다.

양성 대조군으로 사용되는 헤파린을 0.1％, 0.01％, 0.001％, 0.0001％ 및 0.00001％에서 시험하였다.

시험된 프로테오글리칸은 0.1％, 0.01％ 및 0.001％에서 시험된 글리피칸-3 및 데코린이다.

물 20 ㎕를 상응하는 GAG 또는 PG 용액 20 ㎕로 교체하여 실시예 2에 기재된 스트레스 프로토콜을 적용하였다. 이에 따라, 시험된 GAG 및 PG를 1/10로 추가 희석하였다.

도　3은 피부의 GAG에 의한 FGF-2 보호에 관한 연구 결과를 보여주고 있다.

도 3에서 수득한 결과는 문헌의 데이타를 입증하였다:

더마탄 술페이트 뿐만 아니라 헤파린 술페이트도 각각의 시험된 농도에서 FGF-2를 보호하였다. 또한, 치유 과정 동안 FGF-2' 활성의 주요 프로모터는 더마 탄 술페이트였다. 히알루로난은 분자량에 관계없이 그 어느 경우에도 FGF-2를 보호한다. 콘드로이틴 술페이트의 경우와 같이, 이것이 제공하는 보호는 투여량에 의존하지만, 100％에 도달하지는 않는다.

2 가지 프로테오글리칸 (도　4; PG에 의한 FGF-2의 보호에 대한 연구) 글리피칸-3 및 데코린의 시험으로 문헌의 데이타를 입증하였다. 즉, 헤파란 술페이트 쇄를 갖는 글리피칸-3이 투여량 의존적 방식으로 FGF-2를 보호하는 반면, 데코린 (콘드로이틴 술페이트 및 더마탄 술페이트 쇄로 구성됨)은 비효과적인 것으로 증명되었다.

본 연구는 FGF-2 보호가 GAG의 구조에 좌우됨을 보여준다. FGF-2에 대한 헤파란 술페이트의 상호작용이 적절한 것으로 확인되었다. 상기 상호작용은 헤파란 술페이트 쇄를 보유하는 PG를 모델로 시험하였을 때 확인되었다.

본 연구는 문헌의 결과를 확인하여 본 발명의 선별 모델을 확인할 수 있도록 한다.

실시예 4: 활성 성분의 선별

2,000가지 식물 추출물 및 특징적인 분자로 구성된 라이브러리로부터 실시예 2에 따라 선별을 수행하였다. 이들 용해된 화합물, 식물 추출물, 해조류 또는 특징적인 분자를 실시예 2에 기재된 반응 배지 중 0％, 또는 10％ 또는 1％에서 시험하였다.

가장 효과적인 활성 성분의 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

<표 1a>

<표 1b>

상기 추출물은 바람직하게는 100/0 내지 0/100 (부피/부피) 범위의 물/알콜 혼합물, 바람직하게는 물/글리콜 중 식물의 부분을 침연시켜 수득하였다. 이어서, 상기 용매 또는 용매의 혼합물로 희석시켰다.

시험된 특정 활성물질은 강한 보호 활성을 나타내었으며, 이는 또한 투여량 의존적인 것으로 나타났다.

실시예 5: 히비스쿠스 아벨모스쿠스 (암브레트) 추출물

5a - 히드로알콜 암브레트 추출물을 환류 에탄올 중에서 5 ％(중량/중량)의 분쇄된 시드로부터 제조하였다. 추출을 1 시간 동안 수행한 후에 용액을 여과하고, 에탄올을 제거하고, 결과물을 물/글리콜 (75/25) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)로 용해시키고, 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프(cut-off) 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

5b - 히드로글리콜 암브레트 추출물을 물 (75％)/GG (25％) 혼합물에서, 우선적으로 5 ％(중량/중량)의 분쇄된 시드로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다. BG는 부틸렌글리콜을 의미한다.

5c- 수성 암브레트 추출물을 물에서, 바람직하게는 5 ％(중량/중량) 분쇄된 시드로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 6: 구기지 베리 추출물

구기지 베리 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 탈수된 전체 베리로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 7: 반하 추출물

반하 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 줄기로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 8: 레보크자 추출물

레보크자 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 시드로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 9: 레소니아 추출물

레소니아 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 전체 조류(藻類)로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 10: 겨자 가루 추출물

겨자 가루 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 시드로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 11: 우인 추출물

우인 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 시드로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 12: 보리 추출물

보리 추출물을 바람직하게는 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 5 ％(중량/중량)의 시드로부터 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

실시예 13: 참깨 추출물

참깨 추출물은 우선적으로 5 ％(중량/중량) 시드로부터 물(75％)/BG(25％) 혼합물에서 제조하였다. 4 ℃에서 1일 밤새 침연을 수행한 후에, 용액을 세라믹 필터에서 상이한 컷-오프 역치로 한외여과하고, 최종적으로 0.45 ㎛에서 여과하였다.

각각의 추출물 (실시예 5 내지 13)을 부분적으로 저장하였다. 임의의 보존제 (바람직하게는, 카프릴릴 글리콜, 페녹시에탄올, 1％ 헥실렌 글리콜의 혼합물로 구성됨)를 크산탄의 존재 또는 부재하에 최종적으로 첨가하였다.

실시예 14: 활성 성분 또는 식물 추출물의 선택

실시예 2의 선별에 따라 가장 효과적인 추출물을 선택하여 상이한 농도에서 시험하였다. 사용되는 활성 성분은 실시예 5 내지 13으로부터의 추출물이며, 이들을 추출에 사용되는 용매 (또는 용매의 혼합물)를 이용하여 희석하였다. FGF-2의 열 분해에 대한 상기 활성 성분의 특이성을 연구하기 위해 상기 용매를 0.1％ 내지 10％의 농도 범위에서 시험하였다. 투여는 3회 수행하였다. 수득된 결과를 하기 표 2에 열거하였다.

상기 추출물은 매우 효과적이었으며, 모두 투여량 의존적 활성을 가져 각각의 활성물질이 주어진 표적에 대해 활성 특이성을 나타내었다.

히비스쿠스 아벨모스쿠스 (암브레트) 추출물이 가장 강한 활성을 나타내었으며, 따라서 상기 추출물이 성장 인자 FGF-2의 보호에 선택된 활성 성분이다.

실시예 15 내지 21에서, 활성 성분 (추출물 5c)의 농도는 물 중 부피 백분율 (부피/부피)이다.

실시예 15: 실시예 5c에 따라 제조된 히비스쿠스 아벨모스쿠스 (암브레트)의 수성 추출물 (추출물 5c)에 의한 FGF-2의 보호에 관한 연구

추출물 5c에 의한 FGF-2의 보호에 대한 조사를 2 가지 산업적 배치 상에서 수행하였다. 실시예 2의 조건에 따른 스트레스를 적용하여 보호 반응을 조사하였다.

최종 반응 배지 중 시험된 0.01％ 헤파린으로 구성된 양성 대조군은 물에 미리 희석시킨 후에 105.52％±3.04까지 보호하였다.

수득된 결과를 하기 표 3에 열거하였다.

추출물 5c는 물 중 1％의 활성 성분 농도에서 강한 활성을 나타내는 투여량 의존적 방식으로 FGF-2를 보호하였다. 2 가지 산업적 배치에 대해 수득된 결과는 실질적으로 동일하였다.

추출물 5c가 생리학적 온도, 즉 37 ℃에서 FGF-2를 보호할 수 있는지 여부는 반드시 확인해야 할 필요가 있다. 이 때문에 조사는 농도를 증가시킨 추출물 5c의 부재 또는 존재하에 37 ℃에서 24 시간 후에 FGF-2를 투여하는 것을 포함한다.

0.01％ 헤파린에 의해 형성된 양성 대조군은 110.53％±3.20까지 보호하였다.

수득된 결과를 하기 표 4에 열거하였다.

수득된 결과는 추출물 5c가 생리학적 온도에서 투여량 의존적 방식으로 FGF-2를 보호한다는 것을 보여준다. 추출물 5c는 상기 온도에서 FGF-2를 더 보호하는데, 이는 45 ℃에서 보다 덜 분해된다.

실시예 16: PNPP 투여를 통한 단일층 섬유아세포에 대한 추출물 5c의 세포독성에 관한 연구

본 연구의 목적은 정상적인 인간 섬유아세포에 대한 추출물 5c의 세포독성을 조사하는 것이다.

상기 투여는 살아있는 세포의 세포내 산 포스파타제에 의한 p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)의 p-니트로페놀로의 전환에 기초한다. 405 nm에서의 p-니트로페놀의 흡광도는 배양물 웰에 함유된 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다.

일단 정상적인 인간 섬유아세포가 전면생장 상태에 도달하면, 배양 배지를 추출물 5c (농도를 0.1, 0.5, 1, 2, 3 및 5％로 증가시킴)의 200 ㎕/웰 보충 배지로 교체하거나, 교체하지 않았다 (대조군).

세포를 오븐에서 48 시간 동안 37 ℃로 인큐베이션하였다.

인큐베이션하고 배양 배지를 제거한 후에, 세포를 PBS (포스페이트 완충 용액)로 2회 세정하고, 이어서 0.1 M 아세트산 나트륨 (pH 8), 0.1％ Triton X-100 및 5 mM p-니트로페닐 포스페이트 (시그마(Sigma), 프랑스)를 함유하는 완충액 200 ㎕에 주입하였다. 5％ CO₂를 함유하는 대기 중에서 2 시간 동안 37 ℃로 인큐베이션한 후에, 1 N NaOH 20 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 플레이트-판독기 (빅터² V(Victor² V), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 핀란드)를 이용하여 405 nm에서의 반응 배지의 흡광도를 결정하였다.

임의 세포를 함유하지 않은 웰 ("블랭크")에서 각 실험을 수행하는 동안 p-니트로페닐 포스페이트의 비-효소적 가수분해를 측정하였다. 모든 측정은 6회 수행하였다 (n=6).

수득한 결과를 하기 표 5에 열거하였다.

추출물 5c는 시험된 모든 농도 범위에서 세포독성을 나타내지 않았다.

실시예 17: 추출물 5c에 의해 보호된 FGF-2에 의한 섬유아세포 증식의 연구

본 연구의 목적은 추출물 5c에 의해 보호된 FGF-2가 정상적인 인간 섬유아세포의 증식을 자극함을 확인하기 위한 것이다.

FGF-2의 용액을 즉석에서 제조하였다 (= 분해되지 않은 FGF-2); FGF-2의 용액을 0.01％의 헤파린의 부재 (= 분해된 FGF-2) 및 존재 (= FGF-2 + 헤파린, 37 ℃)하에 37 ℃에서 24 시간 동안 방치하였다.

각각의 FGF-2 용액은 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 및 1 ng/ml의 최종 FGF-2 농도로 세포에 적용되도록 희석하였다.

정상적인 인간 피부 섬유아세포를 낮은 농도로 6-웰 플레이트에 분배하였다. 이어서, 이들을 다양한 농도의 FGF-2의 부재 (대조군) 또는 존재하에 배지에서 증식시켰다.

48 시간 후에, 세포내 산 포스파타제 (PNPP)의 활성을 부여하여 처리되거나 처리되지 않은 FGF-2 용액이 세포 증식에 미치는 영향을 평가할 수 있도록 하였다.

상기 결과를 대조군 웰, 즉 처리되지 않은 웰에 대한 증식율(％)로 표시하였다.

수득한 결과는 하기 표 6 및 도 5에 도시하였다.

도　5는 분해되지 않은 FGF-2, 분해된 FGF-2 및 FGF-2 + 헤파린 (37 ℃)의 존재 하에서의 섬유아세포의 증식에 대한 연구 결과를 보여주고 있다.

수득된 결과는 FGF-2 (분해되지 않음)가 배양물에서 정상적인 인간 섬유아세포의 증식을 자극하며, 또는 이는 투여량 의존적 방식으로 자극된다는 것을 보여준다.

37 ℃에서 분해된 FGF-2는 증식을 자극하지만, 37 ℃에서 분해되지 않은 FGF-2보다는 훨씬 약하게 자극하였다. 또한, 각각의 시험된 농도에서, 증식 및 분해된 FGF-2의 존재는 분해되지 않은 FGF-2에서 얻은 것보다 통계적으로 더 적었다.

본 실시예는 더 이상 피부 세포 재생 역할을 수행할 수 없는 생리학적 온도에서 분해되는 매트릭스의 FGF-2를 보호할 수 있는 활성물질을 개발해야 하는 타당성을 보여준다.

열 분해로부터 FGF-2를 보호하면 증식이 유지되거나, 심지어는 즉석 제조된 FGF-2를 사용하여 얻은 것보다 더 높기 때문에 0.01％에서 사용된 헤파린은 FGF-2가 0.5　ng/ml의 농도까지 그의 생물학적 성질을 유지하도록 한다.

소량의 FGF-2에 대해 관찰되는 매우 유의한 자극 및 헤파린의 존재가 보다 상당한 양의 FGF-2에 대해서는 관찰되지 않았다.

헤파린 대신 추출물 5c를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 0.5％의 추출물 5c에 주입한 FGF-2 용액을 37 ℃에서 24 시간 동안 방치하였다. 이어서, 섬유아세포를 함유하는 웰에 0.5 ng/ml의 FGF-2가 적용되도록 용액을 희석하였다.

세포에 최종적으로 적용되는 5c 추출물의 농도는 0.0025％이다. 상기 농도의 5c 추출물이 섬유아세포 증식의 자극을 유도할 수 없는지 사전에 확인하였다. 이는 관찰되는 증식의 자극이 실제로 추출물 5c에 의한 FGF-2의 보호에 의한 것이라는 것을 의미한다 (표 8 참조).

수득된 결과는 처리되지 않은 대조군에 대한 증식율(％)로서 표시하였으며, 이를 하기 표 7에 나타내었다.

도　6은 분해되지 않은 FGF-2 (0.5 ng/ml), 분해된 FGF-2 (0.5 ng/ml), 및 0.5％의 5c 추출물 (37 ℃)이 존재하는 경우의 FGF-2의 존재 하에서의 섬유아세포의 증식에 대한 연구 결과를 보여주고 있다.

37 ℃에서 FGF-2 및 추출물 5c를 동시에 인큐베이션하면 배양된 정상 인간 섬유아세포의 증식을 자극하는 능력을 보유하는 FGF-2가 보호된다. 수득된 결과에서, 즉석 제조된 FGF-2의 존재하에 수득한 것과 통계적으로 다르지 않은 섬유아세포 증식을 얻을 수 있다.

FGF-2가 보호될 수 있는 활성의 이점이 섬유아세포의 세포 재생에 있어 중요한 관심사인 것으로 여겨진다.

추출물 5c (농도를 증가시킴)의 존재 하에서의 정상적인 인간 섬유아세포의 증식에 대한 연구를 37 ℃에서 48 시간 동안 수행하였다.

0.0025％, 0.01％, 0.25％, 0.5％, 1％ 및 2％의 다양한 농도를 갖는 5c 추출물의 존재하에 섬유아세포를 분배하였다. 48 시간 후에, 405　nm에서 산 포스파타제의 투여 (PNPP 투여)를 수행한 후에, 음성 대조군 (= 처리되지 않은 세포)에 대한 증식율(％)을 계산하였다. 각각의 조건을 6회 (n = 6) 시험하였다.

수득한 결과를 하기 표 8에 열거하였다.

10％ 혈청으로 구성된 양성 대조군은 실험으로 확인된 유의한 증식의 자극을 제공한다 (T+ = +126％* 증식).

수득된 결과는 5c 추출물이 배양물에서 정상적인 인간 섬유아세포의 증식을 자극하지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 18: 콜라겐 합성에 대한 성장 인자의 보호의 영향

52세 연령의 공여자로부터 유래된 정상적인 인간 섬유아세포를 배지 (DMEM, 2 mM 글루타민, 50 IU/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 10％ 태아 소 혈청으로 구성됨)를 포함하는 96-웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양하였다. 인큐베이션한 후에, 세포를 20 ㎍/ml의 비타민 C (양성 대조군) 및 2％ 및 1％의 5c 추출물로 구성된 생성물로 48 시간 동안 처리하였다. 대조군은 배지만을 사용하여 동시에 제조하였다.

접촉 24 시간 후에, 방사성 프롤린 (³H-프롤린)을 배지에 첨가하였다.

실험 마지막 부분에, 세포내 단백질로의 방사성 프랄린의 혼입물을 투여하기 위해 상층액을 수집하였다.

수득한 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

2％ 및 1％에서 시험한 5c 추출물은 정상적인 인간 섬유아세포에서 콜라겐의 합성을 자극할 수 있으며, 이는 상당한 정도였다.

수득된 결과는 배지의 성장 인자 및 섬유아세포에 의해 합성된 성장 인자의 보호가 시험관내 자극되는 콜라겐의 합성을 가능하게 할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 19: 총 GAG 및 술페이트화된 GAG의 합성에 대한 성장 인자의 보호의 영향

본 연구의 목적은 단일층 섬유아세포 배양물 상에서 5c 추출물로 성장 인자를 보호함으로써 방사성 방법에 의한 총 GAG의 합성을 자극할 수 있는지 여부를 결정하는 것이다.

52세 연령의 공여자로부터 유래된 정상적인 인간 섬유아세포를 배지 (DMEM, 2 mM 글루타민, 50 IU/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 10％ 태아 소 혈청으로 구성됨)를 포함하는 96-웰 플레이트에서 24 시간 동안 증식시켰다. 인큐베이션한 후에, 세포를 20 ㎍/ml의 비타민 C (양성 대조군) 및 2％ 및 1％의 5c 추출물로 구성된 생성물로 72 시간 동안 처리하였다. 대조군은 배지만을 사용하여 동시에 제조하였다.

접촉 48 시간 후에, 방사성 글루코사민 (D-(6-³H)-글루코사민)을 배지에 첨가하였다.

실험의 마지막 부분에, 세포내 단백질로의 방사성 글루코사민의 혼입물을 투여하기 위해 상층액을 수집하였다. 단백질의 투여는 시판 키트 (바이오래드 500-0116)를 이용하여 수행하였다.

상기 결과를 하기 표 10에 열거하였다.

수득한 결과는 정상적인 인간 섬유아세포에 2％ 및 1％로 적용시킨 5c 추출물이 투여 효과를 나타내는 총 GAG의 합성을 자극할 수 있으며, 이는 양성 대조군 (10 ng/ml로 적용된 TGF-β) 보다 유의하게 더 높은 것임을 보여준다.

얻어진 결과는, 배지의 성장 인자 및 섬유아세포에 의해 합성된 것들의 보호가 전체 GAG의 합성이 시험관내에서 자극될 수 있게 한다는 것을 보여준다.

동일한 방식으로, 술페이트화 GAG를 정량화하기 위해 ³⁵S-술페이트의 혼입 연구를 수행하였다. 적용된 절차는 방사성 전구체의 특성을 제외하고는 전체 GAG에 대한 것과 동일하였다. 결과를 하기 표 11에 기재하였다.

5c 추출물에 의한 술페이트화 GAG의 합성 자극에 대한 연구
생성물	활성 (cpm)	단백질 (mg/ml)	비율 (활성/단백질)	％ 대조군	p
대조군	3028	3.579	846	100	-
TGF-β 10 ng/ml	5442	3.650	1491	176	P<0.01
5c 추출물 2％	5586	3.058	1827	216	P<0.01
5c 추출물 5c 1％	4300	3.396	1266	150	P<0.01

얻어진 결과는, 추출물 5c가 술페이트화 GAG의 합성이 투여량 의존적 방식으로 매우 현저히 자극될 수 있게 한다는 것을 보여준다.

이는, 추출물 5c에 의한 FGF-2에 대한 모방 역할에 추가로, 추출물 5c가 술페이트화 GAG의 합성을 자극하는 성장 인자를 보호할 수 있고, 따라서 FGF-2의 보호가 이들이 FGF-2를 보호하는 헤파란 술페이트화 GAG와 동일하기 때문에 강화될 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 20: 경피 투과 후 5c 추출물에 의한 FGF -2의 보호 활성에 대한 연구

목적은, 5c 추출물이 피부 투과 후에 성장 인자를 보호하는 그의 특성을 유지한다는 것을 확인하는 것이었다.

5c 추출물의 순수 용액을 프란츠(Franz) 세포로서 배치된 피부 체외이식편의 표면 상에 침착시켰다.

24시간 인큐베이션 후, 세포의 수용 구획내에 함유된 배지를 회수하여 동결건조시켰다. 이어서, 동결건조물을 증류수 중에 용해시켜 37℃에서 24시간 동안 열 스트레스를 가하여 실시예 15에 기재된 모델에서 최종 테스트하였다.

도　7은 피부 통과 후 5c 추출물에 의한 FGF-2 보호에 대한 연구를 나타낸다.

얻어진 결과가 실시예 15의 표 4에서 얻어진 결과와 동일하였기 때문에, 얻어진 결과 (99.96％ 보호)는 추출물 5c가 그의 보호 특성을 완전히 유지한다는 것을 보여준다.

결과는, 피부 조직을 통과한 후에 추출물 5c가 성장 인자를 보호할 수 있고, 따라서 그의 목적에 도달하기 위한 완전성을 유지한다는 것을 보여준다.

실시예 21: 효소적 분해에 대한 FGF -2의 보호 연구

본 연구의 목적은, 인간 피부의 진피에 존재하는 단백분해효소에 의한 FGF-2의 분해를 정량화하는 것이었다. 이들 효소는 세포외 매트릭스의 분해에서 중요한 역할을 한다.

명백하게, 카텝신 G는 염증 동안 개입되고, 세포외 환경에서 분비된다. 이것은 염기성으로 인해 매트릭스의 세포 표면에 강하게 부착된다. 카텝신 G는 또한 콜라겐에 대해, 또한 매트릭스의 당단백질 및 프로테오글리칸의 코어 단백질에 대해 활성이다.

이러한 이유로, 카텝신 G에 의한 FGF-2 분해에 대한 연구를 수행하였다. 분해 동력학을 0.1％ BSA를 함유하는 pH 7의 100 mM 헤페스(Hepes) 완충액에서 수행하였다. 카텝신 G를 플레이트의 웰에 웰 당 0.02U의 농도로 2 ng/웰 FGF-2 용액에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고, 15, 30, 60, 90 및 120분에 샘플링하여 나머지 FGF-2를 투여하였다.

FGF-2의 임시 투여에 의해 대조군 (100％)을 형성하였다. 동시에, 무효소 대조군 용액을 37℃에 배치하여 상이한 시점에서 열 분해를 연구함으로써, 온도로 인한 분해를 배제하고 효소적 분해에 의한 부분만을 정량화하였다.

얻어진 FGF-2 (pg/ml)의 양을 하기 표 12에 기재하였다.

카텝신 G에 의한 FGF-2 분해에 대한 연구
시간(분)	FGF-2 농도 온도 조절	카텝신 G의 존재 하에서의 FGF-2의 농도 (분해％)
0	391.8±3.64	339.05±7.43 (13.29％)
15	324.99±1.7	295.61±8.49 (8.95％)
30	291.83±2.4	248.04±1.97 (14.77％)
60	280.64±3.23	203.67±1.13 (27.5％)
90	259.81±4.9	141.94±5.14 (45.55％)
120	241.67±1.97	131.36±2.49 (45.6％)

얻어진 결과에서, FGF-2의 분해가 시간에 따라 증가한다는 것을 보여주는 것이 가능하다. 효소는 FGF-2가 90분에 매우 현저히 분해될 수 있게 하였다.

이것은, 상기 시간이 5c 추출물에 의한 카텝신 G의 존재 하에서의 FGF-2 보호 연구에서 선택되는 이유이다.

다양한 농도, 즉: 0.01％, 0.05％, 0.1％, 0.5％ 및 1％의 추출물 5c를 상기한 바와 같이 (실시예 21) 반응 매질에 첨가하였다.

37℃에서 90분 후, FGF-2 농도를 평가하고, 남아있는 FGF-2의 비율 및 FGF-2의 보호율을 계산하였다. 테스트된 각 농도에서, 투여는 n=9로 수행하였다. 결과를 하기 표 13에 기재하였다.

카텝신 G에 의해 분해된 FGF-2의 추출물 5c에 의한 보호에 대한 연구
테스트	FGF-2 농도 (pg/ml)	남아있는 FGF-2 (％)	FGF-2 보호율 (％)
대조군 (100％)	455.23	100	-
분해된 대조군 (효소)	288.11	63.29	0
5c 추출물 0.01％	336.93	74.01	29.21
5c 추출물 0.05％	344.65	75.71	33.83
5c 추출물 0.1％	409.08	89.86	72.38
5c 추출물 0.5％	414.02	90.95	75.33
5c 추출물 1％	406.58	89.31	70.89

5c 추출물은 투여량 의존적 방식으로 효소적 분해에 대해 FGF-2를 보호할 수 있다.

본 시험관내 연구에 의해, 5c 추출물의 적용은 성장 인자를 세포외 매트릭스의 효소에 의해 발생되는 단백 분해로부터 보호할 수 있다는 것을 입증할 수 있다. 이는 화장품에서의 추출물 5c의 사용에 대한 이점을 강화시킨다.

실시예 22: 연령에 따른 FGF -2 비율 검출

본 연구의 목적은, 주로 피부 GAG 함량 변화로 인한 연령과 FGF-2 함량 손실간의 관계를 확립하기 위해, 소위 "젊은" 및 소위 "늙은" 피부의 FGF-2 농도를 연구하는 것이었다.

소위 젊은 공여자 (21, 30, 31 및 38세의 연령) 유래의 피부 생검 및 소위 늙은 공여자 (50, 55, 57 및 58세의 연령) 유래의 피부 생검을 샘플링하고, 0.1％ 트리톤(Triton) X100을 함유하는 pH　7의 PBS 완충액에서 밀링한 후 추출하여, 시판되는 엘리사(ELISA) 키트 (R＆D 시스템, DFB50)를 사용하여 투여하였다. FGF-2 농도를 시판되는 키트 피코그린(Picogreen)에 의해 측정한 DNA 비율과 연관지었다.

얻어진 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 소위 "젊은" 및 "늙은" 피부 가수분해물에서의 FGF-2 농도에 대한 연구를 나타낸다.

결과는, 젊은 피부와 늙은 피부간의 FGF-2 함량 차이를 보여준다. 또한, 이러한 차이는 통계적으로 유의한 것이다 (p=0.046).

본 실시예에 의해, 성장 인자, 보다 특별하게는 FGF-2의 보호제로서의 활성을 이용함으로써 피부 노화와 관련된 효과를 조절할 수 있다는 것을 보여주는 것이 가능하다.

실시예 23: 본 발명의 생성물의 제제

본 발명에 따른 조성물을 제조하기 위해 상이한 부분 A, B, C, D, E 또는 F를 함께 혼합하여, 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행하였다. "본 발명의 생성물"은 본 발명에서 언급된 활성 성분을 나타낸다.

수중유(oil-in-water) 에멀젼형의 화장품 또는 제약 제제에서의 본 발명의 생성물의 사용.

제제 23a:

A 물 100이 되도록 하는 충분량

부틸렌 글리콜 2

글리세린 3

나트륨 디히드록시세틸 포스페이트,

이소프로필 히드록시세틸 에테르 2

B 글리콜 스테아레이트 SE 14

트리이소노나오인 5

옥틸 코코에이트 6

C 부틸렌 글리콜, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, pH 5.5로 조정

2

D 본 발명의 생성물 0.01 내지 10％

제제 23b:

A 물 100이 되도록 하는 충분량

부틸렌 글리콜 2

글리세린 3

폴리아크릴아미드, 이소파라핀, 라우레트-7

2.8

B 부틸렌 글리콜, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤

2

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

2

부틸렌 글리콜 0.5

D 본 발명의 생성물 0.01 내지 10％

제제 23c:

A 카르보머 0.50

프로필렌 글리콜 3

글리세롤 5

물 100이 되도록 하는 충분량

B 옥틸 코코에이트 5

비스아볼롤 0.30

디메티콘 0.30

C 수산화나트륨 1.60

D 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

0.50

E 향수 0.30

F 본 발명의 생성물 0.01 내지 10％

본 발명의 실시예 24

유중수(water-in-oil)형 제제에서의 본 발명의 생성물의 사용

A PEG 30 - 디폴리히드록시스테아레이트 3

카프릭 트리글리세리드 3

세테아릴 옥타노에이트 4

디부틸 아디페이트 3

포도씨유 1.5

호호바유 1.5

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

0.5

B 글리세린 3

부틸렌 글리콜 3

마그네슘 술페이트 0.5

EDTA 0.05

물 100이 되도록 하는 충분량

C 시클로메티콘 1

디메티콘 1

D 향수 0.3

E 본 발명의 생성물 0.01 내지 10％

본 발명의 실시예 25

샴푸 또는 샤워 겔형 제제에서의 본 발명의 생성물의 용도

A 크산탄 검 0.8

물 100이 되도록 하는 충분량

B 부틸렌 글리콜, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤

0.5

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

0.5

C 시트르산 0.8

D 나트륨 라우레트 술페이트 40.0

E 본 발명의 생성물 0.01 내지 10％

본 발명의 실시예 26

립스틱형 및 기타 무수 생성물의 제제에서의 본 발명의 생성물의 용도

A 미네랄 왁스 17.0

이소스테아릴 이소스테아레이트 31.5

프로필렌 글리콜 디펠라르고네이트 2.6

프로필렌글리콜 이소스테아레이트 1.7

PEG 8 밀랍 3.0

수소화된 팜핵유 글리세리드, 수소화된 팜 글리세리드

3.4

라놀린유 3.4

참기름 1.7

세틸 락테이트 1.7

미네랄유, 라놀린 알콜 3.0

B 피마자유 100이 되도록 하는 충분량

이산화티타늄 3.9

CI 15850:1 0.616

CI 45410:1 0.256

CI 19140:1 0.048

CI 77491 2.048

C 본 발명의 생성물 0.01 내지 5％

본 발명의 실시예 27

수성 겔 (아이 컨투어(eye contour), 슬리밍제 등)의 제제에서의 본 발명의 생성물의 사용

A 물 100이 되도록 하는 충분량

카르보머 0.5

부틸렌 글리콜 15

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

0.5

B 본 발명의 생성물 0.01 내지 10％

본 발명의 실시예 28

삼중 에멀젼형 제제에서의 본 발명의 생성물의 사용

1차 에멀젼 W1/O

A PEG 30 - 디폴리히드록시스테아레이트 4

카프릭 트리글리세리드 7.5

이소헥사데칸 15

PPG-15 스테아릴 에테르 7.5

B 물 65.3

C 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

0.7

2차 에멀젼 W1/O/W2

A 1차 에멀젼 60

B 폴록사머 407 2

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올 0.3

물 100이 되도록 하는 충분량

C 카르보머 15

D 트리에탄올아민 PH 6.0-6.5

본 발명의 실시예 29

본 발명의 생성물을 함유하는 제약 제제의 제조

제제 29a: 정제 제조

A 부형제 정제 당 g

락토스 0.359

사카로스 0.240

B 본 발명의 생성물^* 0.001 내지 0.1

^*본 발명의 생성물은, 예를 들어 실시예 5c에 기재된 추출 절차에 따른 후 건조 단계를 수행하여 얻었다.

제제 29b: 연고 제조

A 부형제

저밀도 폴리에틸렌 5.5

액체 파라핀 100이 되도록 하는 충분량

B 본 발명의 생성물^* 0.001 내지 0.1

^*본 발명의 생성물은, 예를 들어 실시예 5c에 기재된 추출 절차에 따른 후 건조 단계를 수행하여 얻었다.

제제 29c: 주사용 제제의 제조

A 부형제

염처리한 등장액 5 ml

B 본 발명의 생성물^* 0.001 내지 0.1 g

^*본 발명의 생성물은, 예를 들어 실시예 5c에 기재된 추출 절차에 따른 후 건조 단계를 수행하여 얻었다.

실시예 30: 본 발명의 생성물을 함유하는 제제의 화장품 허용성 평가

토끼의 피부 및 눈 평가에 의해, 래트에의 단일 경구 투여에 의한 비정상적 독성의 부재에 대한 연구에 의해, 또한 기니아-피그에 대한 민감성 효능에 대한 연구에 의해, 실시예 5c에 따라 얻어진 화합물에 대한 독물학 테스트를 수행하였다.

토끼에서의 1차 피부 자극 평가:

실시예 5c에 기재된 제제를, "피부에 대한 급성 자극/부식 효과" 연구에 관한 OECD 지침에 의해 제안된 방법에 따라, 3마리 토끼의 피부 상에 0.5 ml 투여량으로 희석 없이 적용하였다.

생성물을 1982년 2월 21일자 JORF (프랑스 공식 저널)에 공개된 1982년 2월 1일로부터의 규칙에 의해 정의된 기준에 따라 분류하였다.

이들 테스트의 결과는, 본 발명의 생성물이 피부에 대해 비자극성인 것으로 분류되었다는 결론을 제공하였다.

토끼에서의 눈 자극 평가:

상기한 제제를, "눈에 대한 급성 자극/부식 효과" 연구에 관한 1987년 2월 24일자 OECD 지침 NO. 405에 의해 제안된 방법에 따라, 3마리 토끼의 눈에 0.1 ml의 양으로 단순히 한번에 적하하였다.

이들 테스트의 결과는, 순수하게 또는 희석되지 않고 사용되는 91/326 EEC 지시에 따라, 제제가 눈에 대해 비자극성인 것으로 간주될 수 있다는 결론을 제공하였다.

래트에의 단일 경구 투여에 의한 비정상적 독성의 부재에 대한 테스트:

상기한 제제를, 1987년 2월 24일로부터의 OECD 지시 NO. 401에 의해 시사되어 화장품 제품에 채택된 절차에 따라, 5마리의 수컷 래트 및 5마리의 암컷 래트에 5 g/체중 kg의 투여량으로 한번에 경구 투여하였다.

DL0 및 DL50이 5,000 mg/kg 초과인 것으로 나타났다. 따라서, 테스트된 제제는 섭취에 의해 위험한 제제로 분류되지 않았다.

기니아-피크에서의 피부 민감성 효능에 대한 평가

기재된 제제에 대해, OECD의 지침 No. 406에 따른 프로토콜인 마그누슨과 클리그만(Magnusson and Kligmann)에 의해 기재된 최대화 테스트를 수행하였다.

제제는 피부 접촉에 의해 비민감성인 것으로 분류되었다.

본 발명은 FGF-2를 그의 분해로부터 보호하기 위한 유효량의 히비스쿠스 아벨모스쿠스 또는 암브레트 추출물, 레보크자 추출물, 구기지 베리 추출물, 반하 추출물, 레소니아 추출물, 겨자 가루 추출물, 우인 추출물, 보리 추출물 및/또는 참깨 추출물에 관한 것으로서, 특히 이는 진피에서 세포외 매트릭스가 재건되는 것을 가능하게 하며, 이는 예를 들어 노화 조절을 위해 유용하다.

Claims (15)

1. 인간 피부에서의 섬유아세포 성장인자-2의 분해를 방지 또는 제어하기 위한, 히비스쿠스 아벨모스쿠스(Hibiscus Abelmoschus) 종자의 수성 추출물, 라파누스 사티부스(Raphanus sativus) 추출물, 리시움 키넨세(Lycium chinense) 추출물, 피넬리애 터나타(Pinelliae ternata) 추출물, 레소니아 종(Lessonia sp.) 전체 조류 추출물, 브라시카 준세아(Brassica juncea) 추출물, 코이시스 세멘(Coicis semen) 추출물, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) 추출물, 세사뭄 인디쿰(Sesamum indicum) 추출물 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는 화장품 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 식물 추출물이 표피, 진피-표피 경계부, 진피 세포외 매트릭스, 하피(hypodermis) 및 피부 혈관벽 중 하나 이상에서 섬유아세포 성장인자-2를 보호하기 위한 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 추출물이 수성 추출물인 조성물.
4. 제3항에 있어서, 추출물이 용액의 중량을 기준으로 1 내지 10％의 건조 상태의 식물 또는 식물 일부로부터 얻어진 용액 상태인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 분해가 열분해인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 추출물이 히비스쿠스 아벨모스쿠스(Hibiscus Abelmoschus) 종자 추출물인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 히비스쿠스 아벨모스쿠스(Hibiscus Abelmoschus) 추출물이 히비스쿠스 아벨모스쿠스 종자로부터 얻어진 수성 추출물인 조성물.
8. 제1항에 있어서, 식물 추출물이 화장품 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량％ 내지 20 중량％로 포함된 조성물.
9. 제8항에 있어서, 식물 추출물이 화장품 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량％ 내지 10 중량％로 포함된 조성물.
10. 히비스쿠스 아벨모스쿠스(Hibiscus Abelmoschus) 종자의 수성 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 추출물을 포함하는 화장품 조성물.
11. 제10항에 있어서, 식물 추출물이 총 조성물의 0.001 중량％ 내지 20 중량％로 포함된 화장품 조성물.
12. 제11항에 있어서, 식물 추출물이 총 조성물의 0.01 중량％ 내지 10 중량％로 포함된 화장품 조성물.
13. 삭제
14. 제3항에 있어서, 상기 식물 수성 추출물이 히비스쿠스 아벨모스쿠스(Hibiscus Abelmoschus) 종자 추출물, 라파누스 사티부스(Raphanus sativus) 종자 추출물, 탈수된 전체의 베리로부터 얻어지는 리시움 키넨세(Lycium chinense) 추출물, 피넬리애 터나타(Pinelliae ternata) 구근 추출물, 레소니아 종(Lessonia sp.) 전체 조류 추출물, 브라시카 준세아(Brassica juncea) 종자 추출물, 코이시스 세멘(Coicis semen) 종자 추출물, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) 종자 추출물, 세사뭄 인디쿰(Sesamum indicum) 종자 추출물 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
15. 제7항에 있어서, 인간 피부가 노화중인 피부인 조성물.

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