JP5705397B2 - ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−β増殖因子を保護するための物質の使用 - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも１種の増殖因子の変質を抑制する目的で化粧品、皮膚化粧品または製薬学的用途用の有効成分を開発することに関する。より詳細には、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２または塩基性ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−β）の変質を防ぐことに関する。

本発明は、更に、真皮の特質、とりわけ後者が加齢の影響、特にヒトにおける加齢の影響を受けた時の特質を予防、制限または改善する有効成分の使用にも関する。

いろいろな増殖因子が皮膚レベルで関与している。そのような増殖因子の一例はＦＧＦ−２であり、これは幅広い活性スペクトルを示し、そのようなスペクトルには線維芽細胞の増殖が含まれ、それによって、皮膚の保全にとって必須であるマトリクスの巨大分子が合成される。皮膚の中のＦＧＦ−２はヘパラン硫酸プロテオグリカンで保護されている。増殖因子と細胞内マトリクスのプロテオグリカンの間に密な関係が存在することが１９９０年代の非特許文献１に記述され、このことは、貯留現象に加えて、そのような相互作用によって増殖因子が蛋白分解から保護されていることを説明している。その結果として増殖因子の安定性がより高くなり（例えば生体内の半減期が長くなり）、それによって、それらはそれらの機能を最適に満たすことが可能になる。

ＦＧＦ−２およびプロテオグリカン
ＦＧＦ−２は、現時点で数えられる如き２３種類の異なるＦＧＦで構成されるファミリーの一部である。ＦＧＦ−２は数種のアイソフォームで存在する。脊椎動物では、分子量が１８、２２、２２．５、２４および３４ｋＤａの５種類のアイソフォームが存在する。細胞の外側で検出されるフォームは１８ｋＤａのフォームのみである一方、他のアイソフォームは細胞内、より具体的には核内に拘束されている。ＦＧＦ−２は、生理学的レベルで非常に重要な役割を果たす遍在する蛋白質であり、ＦＧＦ−２は胚の発生、血管形成、ニューロン分化および組織修復に関与している。実際、それは大部分の組織に存在するが、より詳細には、後者の基底膜の所を標的に分布している。ＦＧＦ−２は有機体の中に精製および特徴付け可能な比率で存在してはいるが、それのｍＲＮＡは検出不可能である。このことおよびそれが組織の基底膜に最終的に結合した状態で分布していると言った特殊性によって、それは初期速度で産生された後に発達中に細胞から放出されることでＭＥＣの中に貯蔵される（この過程中に基底膜が強力なリモデリングを受けることでＦＧＦ−２が局所的に放出される）と提案されている。そのような貯蔵によって成人になって必要になった状態の時にＦＧＦ−２が放出されることで組織修復および分化機能の維持に参与すると思われている。従って、加齢に伴ってＦＧＦ−２の供給が低下すると同時に最大活性状態はもはやもたらされないと思われている。

プロテオグリカン（ＰＧ）は細胞外形態の１８ｋＤａ ＦＧＦ−２の潜在的貯留層を細胞外マトリクスの中に形成する。

プロテオグリカンは細胞外、膜または細胞内に存在する分子である。それらは「コア蛋白質」と呼ばれる蛋白質鎖で構成されていて、それにいろいろなグリコアミノグリカン（ＧＡＧ）が接合している。主なＧＡＧはヘパリン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＰ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、コンドロイチン硫酸の異性体およびケラチン硫酸（ＫＳ）である。

ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）はＦＧＦ−２と比較的強い親和力で結合していることでそれをいろいろな変質から保護しておりかつ貯留層として用いられることが文献に記述された。ＦＧＦ−２と個々のＧＡＧの特異的結合が立証された：ヘパリン硫酸。増殖する内皮細胞のＭＥＣとＦＧＦ−２の結合がヘパリンまたはヘパリン硫酸の存在下で阻害されることが立証されたが、コンドロイチン硫酸の存在下でもケラタン硫酸の存在下でもヒアルロン酸の存在下でも阻害されなかった。その上、ヘパリチナーゼ（ヘパリンおよびヘパリン硫酸の特異的酵素）による前処理を受けさせておいたＭＥＣはＦＧＦ−２と結合しないことも分かったが、コンドロイチナーゼＡＢＣ（コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸の特異的酵素）を用いた時には確認されなかった。そのような結果は全部がＦＧＦ−２とＭＥＣのヘパリン硫酸の間に特異的関係が存在することを立証しており、そのような関係は他のＧＡＧに関しては確認されていない。

そのような相互作用に関する調査を構造レベルで実施した結果、ヘパリン硫酸がＦＧＦ−２と結合するに必要な最低限の鎖配列はＣ_２−硫酸化イズロン酸残基を少なくとも１個とＮ−スルフェート基を少なくとも１個含有する五糖であることが分かった。その上、ＦＧＦ−２にヘパリン硫酸結合部位が存在していることでそのような相互作用が可能になる。この部位は数個の塩基性アミノ酸残基を含有する２つのβシートであるβ１０およびβ１１シートのレベルで存在する。また、ＦＧＦ−２の生物学的受容体と結合する個別の部位がそれに存在することも分かった：ＦＧＦＲ。ＦＧＦとこれのシグナル伝達受容体の相互作用には、その受容体の二量化および共受容体としてのヘパリン硫酸の存在が関与している。ＦＧＦ−２に対する反応のモデルは、２成分複合体であるＦＧＦ−２／ＨＳＰＧが生じた後にＦＧＦＲが瞬時に結合することによって３成分複合体の生成がもたらされそして前記受容体の蛋白質キナーゼによって前記３成分複合体が二量化を起こすことで生体内生物学的活性がもたらされることを示している（非特許文献２）。このモデルは、更に、ＦＧＦＲにヘパリン／ヘパリン硫酸結合部位が存在することが見つかったことでも裏付けされた。

数種のヘパラン硫酸プロテオグリカンがＦＧＦ−２と結合する可能性があり、そのようなプロテオグリカンは細胞表面と結合しているか、ＭＥＣ内に自由に存在するか或は基底膜上に存在する可能性がある。それらの中の４種類が文献の中に挙げられている。それらはβ−グリカン、即ち膜ヘパラン硫酸プロテオグリカン（しかしながら、これはＴＧＦβに対する親和力の方が強い）；グリピカン、即ちグリコシルホスホイノシトール結合を通して細胞膜と結合しているヘパラン硫酸プロテオグリカン；シンデカン、即ちＦＧＦ−２に対して最も高い親和力を有する膜貫通型ヘパラン硫酸プロテオグリカン；およびペルレカン、即ちマトリクスのヘパラン硫酸プロテオグリカンである。

ＦＧＦ−２の変質および保護
ＦＧＦ−２は蛋白分解を起こし易く、生理学的温度でさえ急速に変質し得る。ＦＧＦ−２がヘパリン（高度に硫酸化された天然のＧＡＧ）［これはＦＧＦ−２と非常に強力に親和することで標準的な防御をもたらす］の存在有り無しで変質を起こす条件が調査されそして文献に記述された。

ＴＡＲＤＩＥＵおよび同僚が１９９２年に（酸）ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２がｐＨの変化に遭遇した時に示す挙動を調査した（非特許文献３）。前以てヘパリンを用いるか或は用いないで下記の３種類の条件下で試験された：ｐＨ２、ｐＨ７およびｐＨ９。線維芽細胞増殖モデルを用い、放射性元素を取り込ませることで、ＦＧＦの変質が調査された。その結果は、ＦＧＦ−２は酸性ｐＨおよび塩基性ｐＨで不活性になるが、ヘパリンを存在させるとＦＧＦ−２が中性のｐＨの時に示す観察される活性と同様な活性（または僅かのみ弱い）を維持し得ることを示している。

前記著者は、また、同じモデルを用いてＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２が熱で変質することも調査した。ＦＧＦの溶液をヘパリンの存在有り無しで０℃、２０℃、３７℃、６０℃および９０℃で下記のいろいろな時間インキュベートしている：１時間、２４時間、７日、１４日、３０日および６０日。その得た結果は、ＦＧＦ−２の活性が温度に依存することを示している。温度を高くするとＦＧＦ−２の活性が低下する。注目すべきは、６０℃および９０℃の時には活性が検出されず、ヘパリンを存在させた時でさえ検出されない。他方、他の調査された温度の時、ヘパリンはＦＧＦ−２の活性を経時的に保護する。

最後に、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２がトリプシンおよびキモトリプシンと遭遇した時にそれらが酵素によって起こす変質が調査された。ＦＧＦ溶液をヘパリンの存在有り無しで３７℃で３時間インキュベートした後、変質しなかったＦＧＦを調査する目的で１８％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動が実施された。そのようなインキュベーション時間にするとトリプシンを用いるか或はキモトリプシンを用いるかに拘わらずサンプルに存在するＦＧＦが全部変質を起こす。他方、ヘパリンを存在させると、ＦＧＦ−２に関係した１８ｋＤａの帯を確認することができ、このことは、ＦＧＦ−２がヘパリンによって完全に保護されたことを意味する。

同じようにして、ＧＡＧがＦＧＦ−２の活性形態を安定化させ、それを酸または熱による変性からさえも保護しかつ特定の細胞受容体との特異的相互作用を高めることが示された。ヘパリンを存在させるとＦＧＦは貯蔵中の安定性がより高くなりかつ変性および蛋白分解条件に対する耐性がより高くなる。

ＦＧＦ−２が治療、治癒および組織修復で重要な役割を果たしかついろいろなストレス、例えば温度および酵素による蛋白分解などに敏感であることを考慮して、あるチームは、ＦＧＦ−２を追加的に供給するか或は天然もしくは合成分子を用いてＦＧＦ−２を更に保護した時の効果を研究した。

実際、Ｙａｍａｎａｋａは２００５年に組換え型ＦＧＦ−２を皮膚の潰瘍を治療する目的で局所的に用いることを記述している（非特許文献４）。ＦＧＦ−２は線維芽細胞のＦＧＦ受容体を刺激して線維芽細胞の活性化および血管増殖を誘発する。ＦＧＦ−２はまた修復過程中の再構築段階中にケラチノサイトの増殖に対しても作用すると思われている。

ＦＧＦ−２を熱、ｐＨによる変性および酵素（トリプシンおよびキモトリプシン）による分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対して保護することでＦＧＦ−２の活性（線維芽細胞のマイトジェン活性）に可能性を持たせる目的でデキストラン誘導体が合成された（この上で引用した非特許文献３）。そのような誘導体はヘパリンよりもＦＧＦ−２を大きく保護することが分かり、その結果として、強力な抗凝血活性を有するヘパリンの代替使用に相当する化合物を得ることができる可能性が存在する。それらは組織修復に作用する製薬学的製剤用マトリクスの安定剤、ポテンシャライザー（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｚｅｒｓ）および保護剤である。更に、Ｆｒａｎｃｋ他は２００４年にデキストランの他の誘導体が線維芽細胞培養物中で細胞の増殖を増大させかつ増殖因子が細胞増殖に対して示す効果を助長する可能性があることも示した（非特許文献５）。

最後に、Ｓｙｌｖｉａ Ｃｏｌｌｉｅｃ−Ｊｏｕａｕｌｔ他は、細菌を用いて新合成した特別なエキソ多糖の使用を取り扱っており、それは、ラットを用いた実験モデルで骨充填用移植片として用いられた（非特許文献６）。その動物は１５日後に完全な治癒を示し、炎症反応は全く観察されなかった。このような結果は、エキソ多糖と可溶媒介物（ＦＧＦ−２を包含）が相互作用することで説明可能であり、それによって、ＦＧＦ−２の増殖活性が高まることで治癒現象が助長されると思われる。前記エキソ多糖は歯科治癒で用いられている。

皮膚：ＦＧＦ−２、プロテオグリカンおよび老化
皮膚におけるＦＧＦ−２は表皮、真皮−表皮接合部（ＪＤＥ）、真皮、下皮および毛細管に存在し、それは幅広い活性スペクトルを示す。それによって真皮内で起こる線維芽細胞の増殖が確保されることで皮膚の保全に必須なマトリクスの巨大分子が合成され得るが、それはまた皮膚の他の細胞にも作用する。実際、メラニン細胞の増殖はＦＧＦ−２（これはまた毛細管形成助長因子でもある）によって抑制される。ＦＧＦ−２は、線維芽細胞の所でそれを増殖させることに加えて、また、ヒアルロナンシンターゼの遺伝暗号を指定する遺伝子のｍＲＮＡ率を高めることで、真皮の主ＧＡＧであるヒアルロナンの産生も高める。

ＦＧＦ−２は創傷時の治癒現象の重要な作用因子である。それは線維芽細胞レベルで常にそれの増殖を高めることで作用するが、また、ケラチノサイトに対しても作用することでコラゲナーゼ−１の発現を抑制し、それによって、皮膚が再構築される速度を速める。治癒中のそのような作用はヘパリン硫酸をトランスポータ／貯留層として用いた時には起こらないが、デルマタン硫酸を用いた時に起こる。その後に起こるＦＧＦ−２の発現は主にケラチノサイト、マクロファージおよび線維芽細胞によって起こる。ＦＧＦ−２が生体内で示す半減期は３７℃で中性ｐＨの時に約２４時間であると検定された（非特許文献７）。このように、ＦＧＦ−２は数多くの機能を満たすことから皮膚の重要なサイトカインである。

皮膚のプロテオグリカンおよびそれらの分布が研究された。ＦＧＦ−２と相互作用し得ることが確認された主ＧＡＧは皮膚に存在する。ＧＡＧの量的および定性的分布は下記の通りであると測定された。ヒアルロン酸（３１％）、コンドロイチン硫酸（２５％）、ケラタン硫酸（２４％）、デルマタン硫酸（２０％）そして最後にヘパラン硫酸（１８％）。真皮に含まれているヘパラン硫酸によって存在するＦＧＦ−２が貯蔵される。

皮膚は老化中にいろいろな生理学的変化を起こす。最も目に見える印を形成するしわに加えて深い構造的変化も現れる。注目すべきは、真皮は退化を起こし、特に線維芽細胞の数が減少しかつ合成効力が低下する結果として退化を起こすことで、細胞外マトリクスの巨大分子が変化する。また、グリコサミノグリカンの合成が減少するとそれに伴って存在するプロテオグリカンが再編成されることも報告されている。線維芽細胞培養物を用いた研究で、老化中にヒアルロン酸の合成が非常に低下する一方でケラタンおよびコンドロイチン硫酸の合成が増加することを示すことができた。デルマタンおよびヘパラン硫酸に関して、それらの合成の減少は止まらないと思われる。それが減少するともはやＦＧＦ−２が貯蔵されなくなり、従って、ＦＧＦ−２の内因性効力が保護されなくなると思われる。

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従来技術の文献は増殖因子、とりわけＦＧＦ−２を変質または変性から保護、特に皮膚で起こるそれから保護することを探求するものでない。

従って、本発明の目的は、皮膚、特に真皮に内因的に供給されるＦＧＦ−２を保護、好適にはそれが皮膚バリヤーを通過してそれらの標的に到達する能力を保護する目的でヘパラン硫酸の作用を模擬する有効成分を開発することで、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの保護作用と競合することから成る新規な技術的課題を解決することにある。別の目的は、内因的量のＦＧＦ−２を保護する有効成分を提供することで、それが細胞外マトリクス、特に真皮マトリクスの回復で利用されるようにすることにある。

本発明の目的は、特に、ＦＧＦ−２をいろいろな組織、好適には皮膚に介在する変質（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）または変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）から保護する有効成分を提供することから成る技術的課題を解決することで、とりわけ、真皮マトリクスの再構築によって細胞外マトリクスの再構築、皮膚の保湿の改善、皮膚修復の助長、真皮の保全の維持、メラニン細胞増殖の改善、表皮分化の補強、または表皮、注目すべきはヒトにおける表皮の回復の補強を意図した化粧品、皮膚化粧品または製薬学的組成物を提供することにある。

本発明の目的は、上述した課題を解決する目的で植物を源とした有効成分を提供することから成る新規な課題を解決することにある。そのような技術的課題を解決する可能性のある有効成分は毒性も皮膚の刺激も示すべきではない。

従って、本発明の目的は、また、化粧品、皮膚−化粧品または薬剤の分野、特にヒトに局所投与の目的で用いられるそれらに関して述べられている技術的課題を解決する有効成分を提供することにある。

本発明の目的は、また、上述した目的の達成を可能にする有効成分を選別する方法を提供することから成る新規な技術的課題を解決することにある。そのような選別方法は、好適には、多数の有効成分を一緒に再現可能かつ信頼できる様式で選別することを可能にすべきである。

上述した技術的課題を解決する有効成分を同定する目的で、本発明者らは、特にＦＧＦ−２が熱で変質することに直面して、選別すべき多数の物質に関してＦＧＦ−２保護活性を立証することを可能にするインビトロ選別モデルを開発した。

ＦＧＦ−２の保護に関して、そのような有効成分は、線維芽細胞の細胞集団を回復させることで細胞外マトリクス、とりわけ真皮マトリクスの保全を確保する主要な役割を果たすものである。従って、それらは、最初に、ＦＧＦ−２の変質を有効に抑制、例えば皮膚の老化を抑制するように選択した有効成分である。

本発明は、１番目の面に従い、ＦＧＦ−２の変質に関連した少なくとも１種の皮膚変化を予防または抑制する目的で、硫酸化グリコサミノグリカン（硫酸化ＧＡＧ）でも硫酸化
ＧＡＧの構造的類似物でもなくて化粧品または皮膚化粧品または製薬学的組成物に入れる有効成分としてＦＧＦ−２を保護する物質の使用に関する。

ＦＧＦ−２を保護する物質は、好適には、植物抽出物であり、硫酸化ＧＡＧも硫酸化ＧＡＧの構造的類似物も全く含有しないものである。

前記物質として、有利には、それをハイビスカス・アベルモスカス（Hibiscus Abelmoschus）、即ちアンブレットの抽出物、レボクザ（rebokza）の抽出物、ゴーギジベリー（gougizi berries）の抽出物、バンハ（banha）の抽出物、レソニア（lessonia）の抽出物、カラシナ粉の抽出物、ウーイイン（wooyin）の抽出物、オオムギの抽出物、ゴマの抽出物、またはこの挙げた抽出物の中の少なくとも２種類を一緒にする結果としてもたらされる組み合わせ物の中の１種から成る群から選択する。

有利には、ヒトの皮膚、好適にはＪＤＥおよび／または真皮および／または下皮および／または表皮および／または皮膚血管壁におけるＦＧＦ−２を保護する。

有利には、ＦＧＦ−２の変質に関連した皮膚変化はヒトの皮膚、好適にはＪＤＥおよび／または真皮および／または下皮および／または表皮および／または皮膚血管壁において起こる。

有利には、前記物質は、乾燥状態の植物もしくは植物部分を溶液に前記溶液全体の重量を基準にして１から１０％入れることを通して得た水もしくは水アルコール抽出物である。その水抽出物は好適には水グリコール抽出物である。

増殖因子の変質は、特に少なくとも１種の変質、例えば熱による変質などの結果として起こり、それは一般に生理学的温度で起こるか或は熱にさらされそして／または酵素による変質、とりわけカテプシンＧによる変質で起こる。

有利には、前記物質または組成物を皮膚細胞の増殖、特に線維芽細胞および／またはメラニン細胞の増殖を刺激しそして／または少なくとも１種のマトリクス成分、特に少なくとも１種のコラーゲンおよび／またはミクロフィブリルの少なくとも１種の特定蛋白質、例えばフィブリリン１または２および／またはフィブリン３または５などおよび／または少なくとも１種のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、とりわけ硫酸化ＧＡＧの合成を増加させる目的で用いる。

特別な態様に従う物質または組成物は、特に、細胞外マトリクス、特にＪＤＥの細胞外マトリクス、皮膚血管壁、下皮、表皮の再構築、特に真皮マトリクスの再構築による真皮の再構築、皮膚の保湿の向上、皮膚修復の助長、真皮保全の維持、表皮分化の改善および表皮回復の補強ばかりでなくこれらの任意組み合わせ物で使用可能である。

この上に記述したいろいろな使用は、ＦＧＦ−２の変質に関連した皮膚変化を予防または抑制することに向けたものである。

前記物質の濃度を、有利には、ＦＧＦ−２の保護に有効、特に局所的に塗布した時に有効な濃度にする。前記物質を局所的に塗布した時の有効量は全組成物の０．０１から１０重量％の範囲であることを見いだした。

本組成物は化粧品、皮膚−化粧品または製薬学的組成物、特にヒト用のそれらとして用いるに有用である。

本発明に従う物質は、好適には、ＦＧＦ−２を変質から保護する植物抽出物である。そのような植物抽出物は水もしくは水アルコール、好適には水グリコール抽出物であり得る。

１つの好適な態様における物質は、ハイビスカス・アベルモスカスの種子から得た水もしくは水アルコール系ハイビスカス・アベルモスカス抽出物である。

２番目の面に従い、本発明は、ＦＧＦ−２を変質から保護する物質を組成物、とりわけ化粧品、製薬学的または皮膚−化粧品組成物を製造する目的で特にこの上に挙げたいろいろな用途で用いることに関する。

本発明は、更に、この上に示した態様のいずれかに従って定義した組成物を特にこの上に挙げたいろいろな用途の中の少なくとも１つに関連した処理を達成する目的で用いて化粧品、製薬学的または皮膚−化粧品的に処理する方法に関する。
本発明の詳細な説明
本発明を用いて、前記マトリクスのプロテオグリカンによるＦＧＦ−２の保護を得ることができる。

「ＦＧＦ−２の保護」は、ＦＧＦ−２を変質または変性に対して保護することを意味する。そのような変質または変性は一般に環境条件が理由の分解、例えば酵素または熱などによる分解として起こる。そのような変質または変性はプロテオグリカンによって与えられている保護が低下することが理由で起こり得る。

本発明に従う選別方法を用いて、植物から抽出したいろいろな有効成分を選別することができる。植物抽出物は、ＦＧＦ−２が皮膚、特にヒトの皮膚の所で起こす変質からそれを保護するとして記述されてはおらず、用いられた物質は構造がヘパラン硫酸に近い物質のみであった。

ＦＧＦ−２を熱による変質から保護するに予想外で特に有効な有効成分を同定し、これは、アオイ科、より詳細にはハイビスカス属に属する植物、更により詳細にはハイビスカス・アベルモスカス、即ちアンブレットの種子から得た水抽出物である。

ハイビスカス・アベルモスカスは、特に、植物全体から得られた水抽出物として化粧品では専ら痩身特性を有する、より詳細には蜂巣炎を抑制するとして知られている（例えば米国特許第５，７０５，１７０号明細書を参照）。

本発明が必要とする活性を有する他の抽出物も選択することができた。それらの活性は特に予想外であり、注目すべきは、ＦＧＦ−２の保護に関して予想外である。そのような抽出物は、特に、リシウムチャイニーズ（Lycium chinense）、即ちゴーギジベリーの全体に脱水を受けさせたものから得た水抽出物、ピネリアエ・テルナタ（Pinelliae ternata）、即ちバンハの塊茎から得た水抽出物、ラファナス・サチブス（Raphanus sativus ）、即ちレボクザの種子から得た水抽出物、ブラシカ・ジュンセア（Brassicajuncea ）、即ちカラシナの種子から得た抽出物、コイシス・セメン（Coicis semen ）、即ちウーイインの種子から得た水抽出物、ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare ）、即ちオオムギの種子から得た抽出物、セサマム・インジカム（Sesamum indicum ）、即ちゴールデンセサミ（golden sesame）の種子から得た抽出物、およびレソニア種の藻、即ちレソニアの全体から得た抽出物である。

しかしながら、そのような抽出物を水抽出物単独に限定するものでない。このように、本発明は、また、本発明の範囲内の所望特性を得る目的で活性化合物の全体を水抽出物の
状態で本質的に得ることを可能にする如何なる極性溶媒も包含する。本発明者らが行った試験から、水グリコール抽出物を用いることでも所望の特性を得ることができる。水グリコール抽出物の中では水／グリコールの種類の抽出用溶媒が好適である。特に、水／ブチレングリコールの混合物が好適である。

そのような水／アルコール混合物の比率を本分野の技術者に公知の如く変えることができる。水／アルコールの比率を一般に１０／９０から９０／１０、例えば５０／５０から８５／１５に及んで変える。

乾燥状態の植物もしくは植物部分を溶液状態で、前記溶液全体の重量を基準にして１から１０％の範囲の量で入れることを通して得た抽出物を有効成分として本発明で用いるのが好適である。

本発明に従う組成物の本発明に従う有効成分含有量を有利には本組成物全体の０．００１から２０重量％、好適には０．０１から１０重量％にする。本組成物を局所的に塗布するか或は経口投与してもよい。

ヒトにおけるＦＧＦ−２を変質に関して保護する潜在的活性を有する物質を選別する方法は特に下記を含んで成る：
ａ）潜在的活性を有する物質をＦＧＦ−２と約４５℃の温度で約２時間接触させた状態にし、
ｂ）ＦＧＦ−２を変質から少なくとも５０％、好適には６５％防ぐ物質を選択する。

本選別方法に、有利には、皮膚バリヤーを貫通して活性を示す物質を選択する目的で経皮貫通を試験する追加的段階を含める。

本発明は、有利に、組成物調製方法にも関し、この方法は、前記選別方法を適用した後に選択した活性物質を組成物調製用賦形剤と混合する段階を含んで成る。

単に例示として提供しかつ本発明の範囲を決して限定し得ない実施例を言及する説明的記述を読んだ後の本分野の技術者に本発明の他の目的、特徴および利点が明らかになるであろう。

本実施例は本発明の一体部分であり、本説明（実施例を包含）を全体として解釈することで如何なる最新の従来技術と比較しても新規であると見られる如何なる特徴も機能および一般性の点で本発明の一体部分である。

このように、各実施例の範囲は一般的範囲である。

本実施例では、パーセントを特に明記しない限り全部重量で示し、温度を特に明記しない限り摂氏度で表し、そして圧力は特に明記しない限り大気圧である。

［実施例］

熱によるＦＧＦ−２変質の研究
Ｔａｒｄｉｅｕ他は１９９２年に熱によるＦＧＦ−２変質を線維芽細胞増殖モデルを用いて放射性元素を組み込むことで研究した。本発明者らは、ＦＧＦ−２の安定性の調査を可能にする方法を開発し、この定量方法は大規模に使用可能であり、Ｔａｒｄｉｅｕが記述した方法を用いたのは達成不可能であると思われる有効成分選別の達成を可能にするも
のである。

ＢＳＡが０．１％とメチルパラベンが０．１％入っている１０ｍＭのＰＢＳにＦＧＦ−２が５ｎｇ／ｍｌ入っている溶液を調製する。

この溶液を５００μｇ／ｍｌのヘパリンの存在有り無しでいろいろな温度、即ち４℃、２０℃、３７℃、５０℃および８０℃に置く。

ＦＧＦ−２が各調査温度で示す変質速度を測定する目的で商業的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、フランス）を用いてＦＧＦ−２の量測定をいろいろな時間（Ｔ＝０、３時間、２４時間および４８時間）で実施する。

その結果を時間Ｔ＝０を基準にしたＦＧＦ−２のパーセントとして表す。実験を三重（ｎ＝３）に実施する。得た結果を図１および２に示す。

ＦＧＦ−２は、これに受けさせた温度条件に敏感である。

図１に、ＦＧＦ−２がいろいろな温度で示した安定性の時間過程を時間の関数として示す。ＦＧＦ−２を４℃で貯蔵すると、ＦＧＦ−２がその温度で変質したのは２０％であったことから、４８時間に渡って比較的安定である。温度を高くすると変質パーセントが高くなり、３７℃で３時間にＦＧＦ−２は６５％が変質しそして５０℃の時には８０％が変質する。最後に、８０℃で３時間後にはＦＧＦ−２の全部が変質することが観察され、これはその温度で蛋白質が変性を起こしたことによる。

最後に、時間を長くすればするほど観察される変質の度合がより大きくなり、３７℃で２４時間後にＦＧＦ−２の８０％が変質する。

図２に、ＦＧＦ−２がヘパリンの存在下でいろいろな温度で示す安定性を示す。図２は、ヘパリン（これは実験的に正の対照でありかつＦＧＦ−２と強力に親和することでそれを安定にする）を０．０５％存在させるとそのような変質が阻止されることを示している。ヘパリンは、ＦＧＦ−２に非常に強力に親和することが知られている高度に硫酸化された多糖である。

このような保護は８０℃の時には有効でない、と言うのは、ヘパリンもまたそのような温度で変性を起こすからである。

驚くべきことに、ＦＧＦ−２が約５０℃で起こす変質は短期間に起こる。実用の目的で４５℃に近い温度を選択し、有効成分を選別するストレスモデルを達成するための選択パラメーターにし、実験的正の対照を好適にはヘパリンで構成させる。

ＦＧＦ−２を熱変質に対して保護する有効成分を選択するためのインビトロモデル
約５０℃で観察されるＦＧＦ−２の変質に特に興味が持たれる、と言うのは、短時間の間にＦＧＦ−２の約８０％が変質することで数多くの試験を実施することが可能であるからである。この理由で、４５℃で２．１５時間のストレスを用いて選別を達成しかつＦＧＦ−２をそのような熱変質に対して保護する多数の有効成分の能力を検定することを決定した。

適用する選別モデルは下記である：
９６穴ミクロプレートの中にＦＧＦ−２を０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液に４．５ｎｇ
／ｍｌ入れることで生じさせた溶液を１８０μｌ分配する。蒸留水または０．０５％のヘパリンまたは試験を受けさせるべきいろいろな植物から抽出したいろいろな有効成分が入っている溶液を２０μｌ加える。前記プレートをプレート撹拌装置で撹拌した後、接着テープで覆って、４５℃のオーブンの中に２．１５時間入れる。このインキュベーション期間が終了した時点で前記プレートを取り出した後、ＦＧＦ−２の量測定をＥＬＩＳＡキットを用いて実施する。

ＦＧＦ−２と蒸留水のみを入れておいた対照プレートにも処理を同じ条件下で受けさせ、室温に放置する。

その結果を、応力も変質も受けていないＦＧＦ−２対照を基準にしたＦＧＦ−２保護パーセントとして表す。

ＧＡＧおよび皮膚のプロテオグリカンを用いたモデルの検証
前記モデルを検証する目的で市販のＧＡＧおよびＰＧを用いた試験を実施した。

いろいろな濃度のＧＡＧ溶液を作成する：ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸を０．１％、０．０１％および０．００１％溶解させて試験する。

正対照として用いたヘパリンには試験を０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％および０．００００１％で受けさせる。

試験を受けさせたプロテオグリカンはグリピカン−３およびデコリンであり、これらに試験を０．１％、０．０１％および０．００１％で受けさせる。

実施例２に記述したストレスプロトコルを適用し、２０μｌの水の代わりに相当するＧＡＧまたはＰＧ溶液を２０μｌ用いた。このようにして、試験を受けさせるＧＡＧおよびＰＧに１／１０の追加的希釈を受けさせる。

図３に、皮膚のＧＡＧによるＦＧＦ−２保護の検定を示す。

図３に示した得た結果は、文献によるデータを立証している、即ち
ヘパリン硫酸ばかりでなくデルマタン硫酸もＦＧＦ−２を保護し、これは試験を実施した濃度の各々で起こる。実際、治癒過程中にＦＧＦ−２が示す活性を主に助長する助長因子はデルマタン硫酸である。ヒアルロナンは、これの分子量に関係なく、ＦＧＦ−２を決して保護しない。コンドロイチン硫酸に関しては、それがもたらす保護はそれの用量に依存するが、しかしながら、１００％には到達しない。

図４に示す２種類のプロテオグリカン、即ちグリピカン−３およびデコリンの試験（ＰＧによるＦＧＦ−２の保護に関する試験）は、文献によるデータを立証していた、即ちヘパリン硫酸鎖を有するグリピカン−３は用量依存様式でＦＧＦ−２を保護する一方、デコリン（コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸鎖で構成）は有効ではないことが分かる。

この研究により、ＦＧＦ−２の保護はＧＡＧの構造に依存することが分かる。ヘパリン硫酸とＦＧＦ−２が相互作用することは妥当に明らかである。このような相互作用は、ヘパリン硫酸鎖を持つＰＧに前記モデルを用いた試験を受けさせた時に立証される。

このような研究で文献による結果が立証されたことで我々の選別モデルは有効であり得
る。

有効成分の選別
２，０００種類の植物抽出物および特徴付けられた分子から成るライブラリーを用いた選別を実施例２に従って実施した。そのような溶解させた化合物、植物抽出物、海草または特徴付けられた分子に試験を高純度でか或は実施例２に記述した反応用媒体に１０％または１％入れた状態で受けさせる。

最も有効な有効成分の結果を以下の表１に記述する。

この上に示した抽出物を好適には植物の一部を水／アルコール混合物、好適には水／グリコールが１００／０から０／１００（体積／体積）の混合物の中に浸漬することで得る。次に、前記溶媒もしくは溶媒混合物を用いて希釈を実施する。

試験を受けさせた特定の有効成分は強力な保護活性を有し、それは更に用量依存である。

ハイビスカス・アベルモスカス（アンブレット）抽出物
５ａ 粉砕した種子をエタノールに５％（重量／重量）入れて還流させることを通して水アルコール系アンブレット抽出物を作成する。この抽出を１時間実施した後、その溶液を濾過し、エタノールを除去し、その結果として得たものを水／グリコール（７５／２５）混合物に５％（重量／重量）入れて溶解させた後、いろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。
５ｂ 粉砕した種子を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に選択的に５％（重量／重量）入れることを通して水グリコール系アンブレット抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。ＢＧはブチレングリコールを意味す
る。
５ｃ 粉砕した種子を水に好適には５％（重量／重量）入れることを通して水系アンブレット抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

ゴーギジベリー抽出物
好適には、脱水を受けさせたベリー全体を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してゴーギジベリー抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

バンハ抽出物
好適には、塊茎を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してバンハ抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

レボクザ抽出物
好適には、種子を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してバンハ抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

レソニア抽出物
好適には、藻全体を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してバンハ抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

カラシナ抽出物
好適には、種子を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してカラシナ抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

ウーイイン抽出物
好適には、種子を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してウーイイン抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

オオムギ抽出物
好適には、種子を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してオオムギ抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

ゴマ抽出物
選択的に種子を水（７５％）／ＢＧ（２５％）混合物に５％（重量／重量）入れることを通してゴマ抽出物を作成する。浸漬を４℃で一晩実施した後、その溶液をいろいろなカットオフ閾値を有するセラミック製フィルターで限外濾過し、そして最終的に０．４５μｍで濾過する。

各抽出物（実施例５−１３）を部分的に保持した。最終的に、任意の防腐剤、好適にはカプリリルグリコールとフェノキシエタノールと１％のヘキシレングリコールで構成させた防腐剤をキサンタンの存在有り無しで加えた。

有効成分または植物抽出物の選択
最も有効な抽出物を実施例２の選別に従って選択した後、いろいろな濃度で試験する。使用した有効成分は実施例５−１３で得た抽出物であり、それらを抽出で用いた溶媒（または溶媒混合物）で希釈する。そのような有効成分がＦＧＦ−２の熱分解に対して示す特殊性を試験する目的で前記溶媒中０．１％から１０％の範囲の濃度で試験した。量測定を三重に実施する。得た結果を以下の表２に挙げる。

前記抽出物は非常に有効であり、全部が用量に依存した活性を示し、従って、各有効成分が所定標的に対して示した活性特異性を表す。

ハイビスカス・アベルモスカス（アンブレット）抽出物が最も高い活性を示し、従って、増殖因子ＦＧＦ−２の保護で選択する有効成分である。

実施例１５−２１では有効成分（抽出物５ｃ）の濃度を水中の体積（体積／体積）パーセントで表す。

実施例５ｃに従って調製したハイビスカス・アベルモスカス（アンブレット）の水抽出物（抽出物５ｃ）によるＦＧＦ−２の保護に関する研究
抽出物５ｃによるＦＧＦ−２の保護に関する調査を２つの産業的バッチで実施した。実施例２の条件に従うストレスに遭遇した時の保護を調査した。

水で前以て希釈しておいた後に試験を受けさせる最終的反応媒体中０．０１％のヘパリンで構成させた正の対照による保護は１０５．５２％±３．０４である。

得た結果を以下の表３に挙げる：

抽出物５ｃはＦＧＦ−２を水中１％の有効成分濃度で強力な活性を伴って用量依存様式で保護する。２つの産業的バッチで得た結果は実質的に同じである。

抽出物５ｃが生理学的温度、即ち３７℃でＦＧＦ−２を保護し得るか否かを検査することが絶対的に必要であった。その理由で調査を抽出物５ｃの存在無しにか或は存在させる抽出物５ｃの濃度を高くしながら３７℃で２４時間後のＦＧＦ−２の量を測定することで構成させた。

０．０１％のヘパリンで構成させた正の対照が示した保護は１１０．５３％±３．２０である。

得た結果を以下の表４に挙げる：

得た結果は、抽出物５ｃはＦＧＦ−２を生理学的温度で用量依存様式で保護することを示している。抽出物５ｃは、更に、４５℃の時よりも変質度が低い前記温度でもＦＧＦ−２を保護する。

抽出物５ｃが単層線維芽細胞に対して示す細胞毒性をＰＮＰＰ量測定で試験することに関する実施例
この目的は、抽出物５ｃが正常なヒト線維芽細胞に対して示す細胞毒性を調査することにあった。

この量測定はｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）が生存濃能力のある細胞の
細胞内酸ホスファターゼによってｐ−ニトロフェノールに変化することが基になっている。ｐ−ニトロフェノールが４０５ｎｍの所で示す吸光度は培養穴の中に入っている生存能力のある細胞の数に正比例する。

正常なヒト線維芽細胞が密集に到達した時点で培養培地を抽出物５ｃを補充（濃度を０．１、０．５、１、２、３および５％に高くして）した培地または補充していない培地（対照）（２００μｌ／穴）と交換した。

細胞を３７℃のオーブンに入れて４８時間インキュベートした。

インキュベーションそして培養培地を除去した後の細胞をＰＢＳ（燐酸塩緩衝溶液）で２回濯いだ後、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ８）と０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェートが入っている緩衝液（Ｓｉｇｍａ、フランス）（２００μｌ）の存在の中に入れた。インキュベーションをＣＯ_２含有量が５％の雰囲気中で３７℃で２時間実施した後、１ＮのＮａＯＨを２０μｌ添加することで反応を停止させた。次に、反応媒体が４０５ｎｍの所に示す吸光度をプレート読み装置（Ｖｉｃｔｏｒ^２ Ｖ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フィンランド）で測定した。

細胞を全く入れなかった穴（「ブランク」）でｐ−ニトロフェニルホスフェートが酵素以外で起こす加水分解を各実験中に測定した。測定を全部六重に実施した（ｎ＝６）。

得た結果を以下の表５に挙げる：

抽出物５ｃは、試験を実施した濃度範囲全部に渡って細胞毒性を示さない。

抽出物５ｃで保護させたＦＧＦ−２による線維芽細胞増殖の研究
この研究の目的は、抽出物５ｃで保護されたＦＧＦ−２が正常なヒト線維芽細胞の増殖を刺激するか否かを検査することにあった。

ＦＧＦ−２の溶液を即時調製し（＝変質していないＦＧＦ−２）；ＦＧＦ−２の溶液をヘパリンの存在無しに３７℃に２４時間（＝変質したＦＧＦ−２）そして０．０１％のヘパリンの存在下３７℃に２４時間置く（＝ＦＧＦ−２＋ヘパリン）。

各ＦＧＦ−２溶液を細胞に加える目的で希釈することで最終的ＦＧＦ−２濃度が下記になるようにする：０．１、０．２５、０．５、０．７５および１ｎｇ／ｍｌ。

正常なヒト真皮線維芽細胞を６穴プレートに低密度になるように接種した。次に、それらをＦＧＦ−２の存在無し（対照）またはいろいろな濃度のＦＧＦ−２の存在下の培地中で増殖させた。

４８時間後に細胞内酸ホスファターゼ（ＰＮＰＰ）の活性量を測ることで、処理を受けさせておいたか或は受けさせてないＦＧＦ−２溶液が細胞増殖に対して示す効果を評価することができる。

その結果を対照穴、即ち処理を受けさせていない穴を基準にした増殖パーセントとして表す。

得た結果を以下の表６および図５に示す。

図５に、変質していないＦＧＦ−２、変質したＦＧＦ−２およびＦＧＦ−２＋ヘパリンの存在下で線維芽細胞が３７℃で示した増殖の検定を示す。

得た結果は、ＦＧＦ−２（変質していない）は培養物中で正常なヒト線維芽細胞が示す増殖を刺激しかつそれが用量依存様式であることを示している。

変質したＦＧＦ−２は３７℃で増殖を刺激したが、変質していないＦＧＦ−２が３７℃で示した様式よりもずっと弱い様式である。実際、試験を実施した各濃度に関して、変質したＦＧＦ−２が示した増殖および存在は変質していないＦＧＦ−２を用いた時に得たそれらよりも統計学的に低い。

この実施例は、生理学的温度で変質することで真皮細胞を回復させる役割をもはや果た
すことができなくなるマトリクスのＦＧＦ−２を保護し得る有効成分を開発することが妥当であることを示している。

ヘパリンを０．０１％用いると、それはＦＧＦ−２を熱変質から保護することで、ＦＧＦ−２は生物学的特性を保持する、と言うのは、増殖が維持されるか或は即時調製したＦＧＦ−２溶液を０．５ｎｇ／ｍｌの濃度に及んで用いた時に得られた増殖よりも大きくさえあったからである。

ＦＧＦ−２を少量用いた時に観察した非常に有意な刺激およびヘパリンの存在はＦＧＦ−２をより多い量で用いた時には観察されない。

ヘパリンの代わりに抽出物５ｃを用いて同じ実験を実施した。０．５％の抽出物５ｃが存在している中にＦＧＦ−２溶液を入れて、３７℃に２４時間置く。次に、線維芽細胞を入れて置いた穴にＦＧＦ−２を０．５ｎｇ／ｍｌ加える目的で前記溶液を希釈する。

細胞に最終的に加える５ｃ抽出物の濃度を０．００２５％にする。その濃度の５ｃ抽出物が線維芽細胞の増殖の刺激を誘発し得るか否かを前以て検査しておいた。このことは、増殖の刺激が観察されることは実際にＦＧＦ−２が抽出物５ｃで保護されたことによるものであることを意味する（表８を参照）。

その得た結果を未処理対照を基準にした増殖のパーセントとして表し、以下の表７に示す：

図６に、変質していないＦＧＦ−２を０．５ｎｇ／ｍｌ、変質したＦＧＦ−２を０．５ｎｇ／ｍｌそしてＦＧＦ−２を０．５％の５ｃ抽出物の存在下で存在させて３７℃で得た線維芽細胞増殖の検定を示す。

ＦＧＦ−２と抽出物５ｃを３７℃で一緒にインキュベートするとＦＧＦ−２が保護され、それは培養した正常なヒト線維芽細胞の増殖を刺激する能力を維持する。この得た結果により、得た線維芽細胞増殖は瞬時調製したＦＧＦ−２の存在下で得た線維芽細胞増殖と統計学的に同じであり得る。

ＦＧＦ−２を保護し得る有効成分の利点は主に線維芽細胞の細胞回復にとって興味が持たれると思われる。

存在させる抽出物５ｃの濃度を高くしながら行う正常なヒト線維芽細胞の増殖の検定を３７℃で４８時間実施した。

線維芽細胞をいろいろな濃度、即ち０．００２５％、０．０１％、０．２５％、０．５％、１％および２％の５ｃ抽出物の存在下で接種する。４８時間後に酸ホスファターゼの量測定（ＰＮＰＰ量測定）を４０５ｎｍの所で実施した後、負の対照（＝未処理細胞）を基準にした増殖を計算する（％として）。各条件を六重に試験する（ｎ＝６）。

得た結果を以下の表８に示す：

１０％の血清で構成させた正の対照がもたらした増殖刺激は有意であり、実験が正当であることを立証している（Ｔ＋＝＋１２６％^*の増殖）。

得た結果は、５ｃ抽出物は培養中の正常なヒト線維芽細胞の増殖を刺激しないことを示している。

増殖因子の保護がコラーゲンの合成に対して示す影響
年齢が５２歳のドナーから得た正常なヒト線維芽細胞を９６穴プレートに培地（ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン−５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のウシ胎仔血清で構成）と一緒に入れて２４時間培養した。インキュベーション後の細胞を２０μｇ／ｍｌのビタミンＣ（正の対照）および２％および１％の５ｃ抽出物で構成させた生成物で４８時間処理した。並行して、培地のみを用いた対照も作成した。

２４時間接触させた後の培地に放射性プロリン（３Ｈ−プロリン）を加える。

実験終了時に上澄み液を集めて、細胞内蛋白質の中に取り込まれた放射性プロリンの量を測定する。

その得た結果を以下の表９に示す：

２％および１％で試験した５ｃ抽出物は正常なヒト線維芽細胞におけるコラーゲンの合成を刺激する能力を有し、これは有意であった。

その得た結果は、培地の増殖因子および線維芽細胞が合成した増殖因子が保護されることでコラーゲンの合成がインビトロで刺激され得ることを示している。

増殖因子の保護が全ＧＡＧおよび硫酸化ＧＡＧの合成に対して示す影響
この研究の目的は、単層線維芽細胞培養物上で増殖因子が５ｃ抽出物で保護されることによって全ＧＡＧの合成が刺激され得るか否かを放射能方法で測定することにあった。

年齢が５２歳のドナーから得た正常なヒト線維芽細胞を９６穴プレートに培地（ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン−５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のウシ胎仔血清で構成）と一緒に入れて２４時間増殖させた。インキュベーション後の細胞を２０μｇ／ｍｌのビタミンＣ（正の対照）および２％および１％の５ｃ抽出物で構成させた生成物で７２時間処理した。並行して、培地のみを用いた対照も作成した。

４８時間接触させた後の培地に放射性グルコサミン（Ｄ−（６−^３Ｈ）−グルコサミン）を加える。

実験終了時に上澄み液を集めて、細胞内蛋白質の中に取り込まれた放射性プロリンの量を測定する。蛋白質の量測定を市販キット（ＢｉｏＲａｄ ５００−０１１６）を用いて実施する。

その結果を以下の表１０に示す：

得た結果は、５ｃ抽出物を正常なヒト線維芽細胞に２％および１％加えると全ＧＡＧの合成が用量効果を伴って刺激されかつこれの方が正の対照（ＴＦＧ−βを１０ｎｇ／ｍｌ加えた）よりも有意であり得ることを示している。

その得た結果は、培地の増殖因子および線維芽細胞が合成した増殖因子が保護されることで全ＧＡＧの合成がインビトロで刺激され得ることを示している。

同じようにして、硫酸化ＧＡＧを量化する目的で^３５Ｓ−スルフェート取り込み研究を実施する。適用する手順は、前駆体が放射性を示す以外は全ＧＡＧで適用した手順と同じである。その結果を以下の表１１に挙げる：

得た結果は、抽出物５ｃが硫酸化ＧＡＧの合成を非常に有意に用量依存様式で刺激し得ることを示している。

このことは、抽出物５ｃがＦＧＦ−２に対して果たす模擬役割に加えて抽出物５ｃは硫酸化ＧＡＧの合成を刺激する増殖因子を保護する能力を有することでＦＧＦ−２の保護が補強され得ることを意味する、と言うのは、それらはＦＧＦ−２を保護する同じヘパリン硫酸化ＧＡＧであるからである。

５ｃ抽出物が経皮貫通後にＦＧＦ−２を保護する活性の研究
この目的は、５ｃ抽出物が皮膚を貫通した後でも増殖因子を保護する特性を保持しているか否かを確かめることにあった。５ｃ抽出物の純粋な溶液をＦｒａｎｚ細胞として置いた皮膚移植片の表面に付着させた。

２４時間のインキュベーション後、細胞を受け取るコンパートメントに入っている培地
を回収した後、凍結乾燥させた。次に、その凍結乾燥品を蒸留水に溶解させ、それに最終的に３７℃の熱ストレスを用いた試験を実施例１５に記述したモデルを用いて２４時間受けさせた。

図７に、５ｃ抽出物が皮膚を貫通した後にＦＧＦ−２を保護することに関する検定を示す。

得た結果（９９．９６％の保護）は、抽出物５ｃが保護特性を完全に保持していることを示している、と言うのは、その得た結果は実施例１５の表４に示した得た結果と同じであったからである。

この結果は、抽出物５ｃは皮膚組織を貫通した後でも増殖因子を保護する能力を有することで標的に到達するインテガー（ｉｎｔｅｇｅｒ）のままであることを示している。

ＦＧＦ−２を酵素による変質に対して保護する研究
この研究の目的は、ヒト皮膚の真皮の所に存在するプロテイナーゼによって起こるＦＧＦ−２の変質を量化することにある。そのような酵素は細胞外マトリクスの変質で重要な役割を果たす。

特に、カテプシンＧは炎症に介在しかつ細胞外環境の中に分泌される。それは塩基性を有することからマトリクスの細胞表面に強力に接着する。カテプシンＧはまたコラーゲンに対しても活性を示すばかりでなくまたプロテオグリカンのコア蛋白質およびマトリクスの糖蛋白に対しても活性を示す。

この理由で、カテプシンＧによるＦＧＦ−２の変質の研究を実施した。ＢＳＡを０．１％入れておいた１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７）中で変質速度測定を実施した。カテプシンＧをプレートの穴に穴１個当たり０．０２Ｕの濃度で２ｎｇ／穴のＦＧＦ−２溶液が生じるように加えた。前記プレートを３７℃でインキュベーションした後、サンプリングを１５、３０、６０、９０および１２０分の時に実施して、残存するＦＧＦ−２の量を測定した。

ＦＧＦ−２を瞬時計量することで対照（１００％）を作成する。それと同時に、温度が原因で起こる変質を取り除きかつ酵素による変質部分のみを量化する目的で、酵素が入っていない対照の溶液を３７℃にいろいろな時間で置くことで熱変質を検定する。

得たＦＧＦ−２量（ｐｇ／ｍｌ）を以下の表１２に記述する。

得た結果から、ＦＧＦ−２の変質度は時間に伴って高くなることが分かるであろう。前記酵素はＦＧＦ−２を９０分で非常に有意に変質させ得る。

このことから、５ｃ抽出物によるＦＧＦ−２の保護をカテプシンＧの存在下で研究する目的で前記時間を選択する。

この上（実施例２１）に記述した如き反応媒体に抽出物５ｃを下記のいろいろな濃度で加える：即ち０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％および１％。

３７℃で９０分後のＦＧＦ−２濃度を検定し、そして残存するＦＧＦ−２のパーセントばかりでなくＦＧＦ−２の保護パーセントも計算する。試験した各濃度毎に量測定をｎ＝９で実施する。その結果を以下の表１３に記述する：

５ｃ抽出物はＦＧＦ−２を酵素による分解に対して用量依存様式で保護し得る。

このインビトロ検定により、５ｃ抽出物を加えることで増殖因子を細胞外マトリクスの酵素が及ぼす蛋白分解による変質から保護することができることを立証することができる。これは正に抽出物５ｃを化粧品で用いることの利点を補強するものである。

加齢によるＦＧＦ−２率の検出
この研究の目的は、主に皮膚のＧＡＧ含有量が変化することによって起こるＦＧＦ−２含有量の損失と年齢の間の関係を確立する目的でいわゆる「若い」皮膚といわゆる「年老いた」皮膚のＦＧＦ−２濃度を検定することにあった。

いわゆる若いドナー（２１、３０、３１および３８歳）およびいわゆる年老いたドナー（５０、５５、５７および５８歳）から皮膚生検を採取し、粉砕した後、それにＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を０．１％入れておいたＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７）を用いた抽出を受けさせ、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＦＢ５０）を用いてＦＧＦ−２の量測定を実施した。そのＦＧＦ−２の濃度を市販のキットＰｉｃｏｇｒｅｅｎで測定したＤＮＡ率と関係付ける。

得た結果を図８に示す。

図８に、いわゆる「若い」および「年老いた」皮膚の加水分解物に入っているＦＧＦ−２濃度の検定を示す。

その結果は、若い皮膚と年老いた皮膚の間でＦＧＦ−２含有量に差があることを示している。その上、その差は統計学的に有意である（ｐ＝０．０４６）。

この実施例により、有効成分を増殖因子、より詳細にはＦＧＦ−２の保護剤として用いることで皮膚の老化に関連した影響を抑制することができることを示すことができる。

本発明の生成物の配合
いろいろな部分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦを一緒に混合することを本分野の技術者に公知の方法に従って進行させることで本発明に従う組成物を調製した。「本発明の生成物」は、本発明に記述する有効成分に相当する。

本発明の生成物を水中油エマルジョン型の化粧品または製薬学的製剤で使用。

本発明の生成物を油中水型の配合で使用

本発明の生成物をシャンプーまたはシャワーゲル型の配合で使用

本発明の生成物を口紅型の配合および他の無水製品で使用

本発明の生成物を水性ゲル（アイライン、痩身剤など)の配合で使用

本発明の生成物を３成分乳液型の配合で使用

本発明の生成物を含有させた製薬学的製剤の調製

本発明の生成物を含有させた調製物が化粧品で受け入れられるか否かの評価
実施例５ｃに従って得た化合物をウサギの皮膚および目で評価し、ラットに１回経口投与することで異常な毒性が存在しないことを試験しかつモルモットを用いて感作効力を試験することで毒物学的試験を実施した。

ウサギにおける主な皮膚刺激の評価：
実施例５ｃに記述した調製物を「皮膚に対する急性刺激／腐食効果」の研究に関するＯＥＣＤ指示が推奨する方法に従って３匹のウサギの皮膚に０．５ｍｌの量で希釈無しに塗布する。

２１．０２．８２のＪＯＲＦ（Ｆｒｅｎｃｈ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）の中に公開された１．２．１９８２時点の指示で定義される判断基準に従って生成物を分類分けする。

この試験の結果により、本発明の生成物は皮膚に刺激を与えないとして分類分けされると結論付ける。

ウサギの目の刺激に関する評価
「目に対する急性刺激／腐食効果」の検定に関して１９８７年の２月２４日付けのＯＥＣＤ指示番号４０５が推奨する方法に従って３匹のウサギの目に上述した調製物を混ぜ物無しに０．１ｍｌの量で１回差した。

この試験の結果により、前記調製物は混ぜ物無しまたは希釈無しで用いた時に９１／３２６ＥＥＣ指示の意味で目を刺激しないと見なすことができると結論付ける。
ラットに１回経口投与することによる異常な毒性が無いことに関する試験：
前記調製物を５匹のオスラットおよび５匹のメスラットに１９８７年２月２４日時点のＯＥＣＤ指示番号４０１が推奨しかつ化粧品に適応した手順に従って体重１ｋｇ当たり５ｇの用量で１回経口投与した。

測定ＤＬ０およびＤＬ５０は５，０００ｍｇ／ｋｇ以上であった。従って、この試験を受けさせた調製物は摂取による危険のない調製物であると分類分けされる。
モルモットにおける皮膚感作効力の評価：
前記調製物にＭａｇｎｕｓｓｏｎおよびＫｌｉｇｍａｎｎが記述した極大化試験、即ちＯＥＣＤのガイドライン番号４０６に従うプロトコルを受けさせた。

前記調製物は皮膚接触による感作を起こさないと分類分けされる。

図１は、ＦＧＦ−２がいろいろな温度で示す安定性の時間過程を時間の関数として示すグラフである。 図２は、ＦＧＦ−２がヘパリンの存在下でいろいろな温度で示す安定性を示すグラフである。 図３は、皮膚のＧＡＧによるＦＧＦ−２の保護を示すグラフである。 図４は、プロテオグリカンによるＦＧＦ−２の保護を示すグラフである。 変質していないＦＧＦ−２、変質したＦＧＦ−２およびＦＧＦ−２＋ヘパリンの存在下で線維芽細胞の増殖について用量依存的に測定した結果を示すグラフである。 図５の試験において、ヘパリンの代わりに抽出物５ｃを用いたときの、試験結果を示すグラフである。 抽出物５ｃが皮膚を貫通した後にＦＧＦ−２を保護することを検定した試験結果を示すグラフである。 「若い」および「年老いた」皮膚における加水分解物中のＦＧＦ−２濃度の測定結果を示すグラフである。

Claims (13)

1. 有効成分としてのハイビスカス・アベルモスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）の種子から得られた水抽出物と、許容され得る賦形剤を含んでなる、ＦＧＦ−２分解に関連する少なくとも１種の皮膚の変質を防ぐかまたは抑制するための製薬学的または化粧品組成物。
2. 請求項１に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、抽出物が溶液の重量基準で、乾燥状態の種子の１から１０重量％から得られた溶液状態にある、ことを特徴とする、製薬学的または化粧品組成物。
3. 請求項１または２に記載の製薬学的組成物であって、有効成分が前記製薬学的組成物の総重量を基準にして０．００１から２０重量％の範囲である、製薬学的組成物。
4. 請求項１または２に記載の化粧品組成物であって、植物抽出物が前記組成物の総重量を基準にして０．００１から２０重量％の範囲である、化粧品組成物。
5. 請求項４に記載の化粧品組成物であって、植物抽出物が全組成物の０．０１から１０重量％を占める、化粧品組成物。
6. 請求項１または２に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、ＦＧＦ−２の分解に関連する少なくとも１種の皮膚の変質を防ぐかまたは抑制することが、細胞外マトリックスの再構築、真皮マトリックスの再構築、皮膚修復の助長、真皮の保全の維持、表皮分化の改善および表皮回復の補強、ならびにこれらのいずれかの組み合わせよりなる群から選択される皮膚の改変をもたらす、製薬学的または化粧品組成物。
7. 請求項６に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、ＦＧＦ−２の分解に関連する皮膚の変質が、表皮および／または真皮−表皮結合部、および／または真皮細胞外マトリックス、および／または下皮組織、および／または皮膚血管壁レベルにおいて起こる、製薬学的または化粧品組成物。
8. 請求項６または７に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、ＦＧＦ−２の分解が熱分解である、製薬学的または化粧品組成物。
9. 請求項１または２に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、皮膚細胞の刺激、および／または少なくとも１種のマトリックス成分の合成の増加、および／またはミクロフィブリルの少なくとも１種の特定の蛋白質の合成の増加、および／または少なくとも１種のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の合成の増加をせしめるためのものである、製薬学的または化粧品組成物。
10. 請求項９に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、皮膚細胞の刺激が線維芽細胞及び／またはメラニン細胞の増殖をもたらす、製薬学的または化粧品組成物。
11. 請求項９または１０に記載の製薬学的または化粧品組成物であって、マトリックス成分が少なくとも１種のコラーゲンである、製薬学的または化粧品組成物。
12. 請求項９〜１１のいずれかに記載の製薬学的または化粧品組成物であって、ミクロフィブリルの特定の蛋白質がフィブリリン１もしくは２および／またはフィブリン３もしくは５である、製薬学的または化粧品組成物。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の製薬学的または化粧品組成物であって、該組成物がヒトに局所投与の目的で使用される、製薬学的または化粧品組成物。