DE102007024679B4 - Verwendung von kosmetisch aktiven Wirkstoffen zum Schützen von FGF-2 - Google Patents

Abstract

Verwendung einer Substanz, die weder ein sulfatiertes Glykosaminoglykan noch ein strukturelles Analogon eines sulfatierten Glykosaminoglykan ist und FGF-2 als natürlicher Wirkstoff in einer kosmetischen oder dermatologischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung schützt, zur Vorbeugung oder Behandlung wenigstens einer Hautveränderung, die mit dem Abbau von FGF-2 verbunden ist.

Description

• Die Erfindung betrifft die Entwicklung von natürlichen Wirkstoffen für eine kosmetische, dermakosmetische oder pharmazeutische Anwendung, um gegen die Degradation wenigstens eines Wachstumsfaktors zu kämpfen.
• Die Erfindung betrifft insbesondere den Schutz vor der Degradation des Fibroblast Growth Factor (Fibroblastenwachstumsfaktor; FGF-2 oder basischer FGF oder FGF-β).
• Die vorliegende Erfindung betrifft besonders die Verwendung von natürlichen Wirkstoffen, welche die Qualität der Dermis vorbeugend unterstützen, begrenzen oder verbessern, insbesondere wenn diese die Wirkungen des Alters erleidet, besonders bei einem Menschen.
• STAND DER TECHNIK
• Zahlreiche Wachstumsfaktoren greifen auf dem Kutanniveau ein, und insbesondere der FGF-2, der ein breites Aktivitätsspektrum besitzt: insbesondere die Proliferation der Fibroblasten, womit die Synthese der Makromoleküle der Matrix ermöglicht wird, die für die Integrität der Haut essentiell sind. FGF-2 wird in der Haut von Proteoglykanen mit Heparansulfat geschützt. In den 90er-Jahren haben Feige & Baird (Médecine/Sciences, 1992; 8: 805–10) die enge Beziehung zwischen Wachstumsfaktoren und Proteoglykanen der extrazellulären Matrix beschrieben, wobei sie ferner ein Reservoirphänomen erläuterten, diese Wechselwirkung schützte die Wachstumsfaktoren gegen die Proteolyse. Daraus ergibt sich eine größere Stabilität der Wachstumsfaktoren (eine verlängerte in vivo Halbwertszeit), die ihnen damit erlaubt, ihre Funktionen bestens zu erfüllen.
• FGF-2 und Proteoglykane
• FGF-2 gehört zu einer Familie aus derzeit gezählten 23 verschiedenen FGF. FGF-2 stellt sich in mehreren Isoformen dar. Bei Wirbeltieren sind fünf Isoformen mit Molekulargewichten von 18; 22; 22,5; 24 und 34 kDa zu finden. Lediglich die Form mit 18 kDa wird außerhalb der Zellen erfaßt, die anderen sind im Inneren der Zelle und genauer im Kern eingeschlossen. FGF-2 ist ein allgegenwärtiges Protein, das auf physiologischer Ebene eine sehr wichtige Rolle spielt; FGF-2 ist in die embryonale Entwicklung, Angiogenese, neuronale Differentiation und u. a. die Gewebereparatur miteinbegriffen. Es ist nämlich in den meisten Geweben mit besonders gezielter Verteilung auf Höhe deren Basalmembran anwesend. Obwohl FGF-2 im Organismus in einem solchen Anteil vorliegt, daß es gereinigt und charakterisiert werden kann, ist seine Messenger-RNS nicht feststellbar. Diese Tatsache und die Eigenart, daß es innig an die Basalmembran der Gewebe gebunden verteilt ist, läßt vermuten, daß es mit einer Anfangsrate produziert und dann bei der Entwicklung durch die Zellen freigesetzt wird, um in der extrazellulären Matrix gelagert zu werden (die Basalmembran erfährt im Verlauf dieses Prozesses eine intensive Umgestaltung, welche die lokale Freisetzung von FGF-2 erlaubt). Diese Lagerung würde nötigenfalls eine Freisetzung von FGF-2 im ausgewachsenen Zustand erlauben, um an der Gewebereparatur teilzunehmen und differenzierte Funktionen aufrechtzuerhalten. Mit dem Alter würde der Vorrat an FGF-2 abnehmen, womit also nicht mehr maximale Aktivitätsbedingungen gewährleistet wären.
• Die Proteoglykane (PG) bilden potentielle Reservoire der extrazellulären Form von FGF-2 mit 18 kDa in der extrazellulären Matrix.
• Proteoglykane sind Moleküle mit extrazellulärer, membranärer oder intrazellulärer Lokalisation. Sie bestehen aus einer Eiweißkette, die ”Kernprotein” heißt, auf welche variable Glykosaminoglykane (GAG) gepfropft sind. Die hauptsächlichen GAG sind Heparansulfat (HS); Heparin (HP); Chondroitinsulfat (CS); Dermatansulfat (DS), Isomer von Chondroitinsulfat und Keratansulfat (KS).
• Die Proteoglykane mit Heparansulfat (HSPG) sind in der Literatur als assoziiert mit einer ziemlich starken Affinität für FGF-2 beschrieben worden, wobei sie es vor verschiedenen Degradationen schützen und ihm als Reservoir dienen. Es wurde die spezifische Bindung von FGF-2 an ein spezielles GAG festgestellt: Heparansulfat. Es wurde eine Hemmung der Bindung von FGF-2 an der extrazellulären Matrix von Endothelzellen in Kultur in Anwesenheit von Heparin oder von Heparansulfat, aber nicht in Anwesenheit von Chondroitinsulfat, Keratansulfat oder Hyaluronsäure gezeigt. Darüber hinaus wurde eine Abwesenheit einer Bindung von FGF-2 an der extrazellulären Matrix aufgedeckt, das mit Heparitinase (spezifisches Enzym von Heparin und Heparansulfat), aber nicht mit Chondroitinase ABC (spezifisches Enzym von Chondroitinsulfat, Keratansulfat und Hyaluronsäure) vorbehandelt wurde. Alle diese Ergebnisse beweisen das Vorhandensein einer spezifischen Relation zwischen FGF-2 und Heparansulfat der extrazellulären Matrix, eine Relation, die mit anderen GAG nicht zu finden ist.
• Auf struktureller Ebene haben Studien zu dieser Wechselwirkung enthüllt, daß die minimale Sequenz, die an der Heparansulfatkette nötig ist, um FGF-2 zu binden, ein Pentasaccharid ist, das wenigstens einen sulfatierten C₂-Iduronsäurerest und wenigstens eine N-Sulfatgruppe enthält. Darüber hinaus erlaubt die Anwesenheit eines Bindungsorts mit Heparansulfat an FGF-2 diese Wechselwirkung. Dieser Ort findet sich auf Höhe von zwei β-Faltblättern (Blätter β10 und β11), die mehrere basische Aminosäurereste enthalten. An FGF-2 findet sich auch ein deutlicher Ort zur Bindung an ihre biologischen Rezeptoren: der FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor). Die Wechselwirkung des FGF mit seinem Signalisationsrezeptor impliziert eine Dimerisation dieses Rezeptors und die Anwesenheit von Heparansulfat als Korezeptor. Das Modell der Reaktion auf FGF-2 stellt die Bildung von binären Komplexen FGF-2/HSPG, dann die augenblickliche Assoziation von FGFR vor, die zur Bildung eines ternären Komplexes führt, der eine Dimerisation erfahren wird, um eine biologische Aktivität in vivo über die Proteinkinase des Rezeptors zu ergeben (IBRAHIMI & coll., Biochemistry, 2004, 43, 4724 – 4730). Dieses Modell wurde darüber hinaus durch die Entdeckung eines Orts zur Bindung an Heparin-/Heparansulfat an dem FGFR gestützt.
• Mehrere Proteoglykane mit Heparansulfat können FGF-2 binden, wobei diese Proteoglykane entweder an die Oberfläche der Zellen, frei in der extrazellulären Matrix oder an der Basalmembran gebunden sein können. Vier von ihnen sind in der Literatur verzeichnet. Es handelt sich um β-Glykan, Proteoglykan mit membranärem Heparansulfat, das indessen eine stärkere Affinität für TGF-β (Transforming Growth Factor-β; Transformierender Wachstumsfaktor-β) besitzt; Glypikan, Proteoglykan mit Heparansulfat, das mit der Zellmembran durch eine Glykosylphosphoinositol-Bindung verbunden ist; Syndekan, Proteoglykan mit transmembranärem Heparansulfat, das die höchste Affinität für FGF-2 aufweist; und Perlekan, Proteoglykan mit Heparansulfat der Matrix.
• Degradation von FGF-2 und Schutz
• FGF-2 ist empfindlich für die Proteolyse und kann rasch abgebaut werden, sogar bei physiologischer Temperatur. Die Bedingungen der Degradation von FGF-2 sind in der Literatur in Abwesenheit und in Gegenwart von Heparin (natürliches hochgradig sulfatiertes GAG) untersucht und beschrieben worden, das die Referenzkontrolle für seine sehr starke Affinität für FGF-2 bildet.
• TARDIEU & coll. haben 1992 (Tardieu et coll. Journal of cellular Physiology, 150: 194–203; (1992)) das Verhalten von (saurem) FGF-1 und FGF-2 gegenüber einer pH-Änderung untersucht. Drei Bedingungen wurden getestet, mit oder ohne vorheriger Zugabe von Heparin: pH 2, pH 7 und pH 9. Die Degradation von FGF wurde in einem Fibroblastproliferationsmodell durch Inkorporation eines radioaktiven Elements untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß FGF-2 bei saurem pH und bei basischem pH deaktiviert wird, aber daß die Anwesenheit von Heparin erlaubt, eine Aktivität von FGF-2 ähnlich (sogar etwas schwächer) als diejenige zu bewahren, die bei neutralem pH beobachtet wird.
• Die Autoren haben auch die thermische Degradation von FGF-1 und 2 in diesem gleichen Modell untersucht. Lösungen von FGF werden, in Anwesenheit von Heparin oder nicht, bei 0°C, 20°C, 37°C, 60°C und 90°C während verschiedener Zeiten inkubiert: 1 h, 24 h, 7, 14, 30 und 60 Tage. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität von FGF-2 von der Temperatur abhängt. Wird diese erhöht, dann wird eine Verminderung der Aktivität von FGF-2 hervorgerufen. Insbesondere wird bei 60°C und 90°C keinerlei Aktivität erfaßt, und zwar selbst in Anwesenheit von Heparan. Dagegen erlaubt für die anderen untersuchten Temperaturen Heparin einen zeitlichen Schutz der Aktivität von FGF-2.
• Schließlich wurde die enzymatische Degradation von FGF-1 und 2 gegenüber Trypsin und Chymotrypsin untersucht. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C von Lösungen von FGF, in Anwesenheit von Heparin oder nicht, wird eine Gelelektrophorese mit 18% Polyacrylamid durchgeführt, um das nicht abgebaute FGF zu visualisieren. Die Inkubationszeit erlaubt, das gesamte in den Proben vorhandene FGF abzubauen, ob mit Trypsin oder Chymotrypsin. Dagegen erlaubt die Anwesenheit von Heparin, die dem FGF-2 entsprechende Bande mit 18 kDa wiederzufinden, was einen totalen Schutz des FGF-2 durch Heparin bedeutet.
• Ebenso wurde gezeigt, daß die GAG die aktive Konformation von FGF-2 stabilisieren, wobei sie ihn gegen die saure oder auch thermische Denaturierung schützen und dabei die spezifische Wechselwirkung mit spezifischen Zellrezeptoren erhöhen. In Anwesenheit von Heparin sind die FGF stabiler bei der Lagerung und beständiger gegenüber denaturierenden oder proteolytischen Bedingungen.
• Unter Berücksichtigung der wichtigen Rolle von FGF-2 in der Therapeutik, bei der Vernarbung und der Gewebereparatur und seiner Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Formen von Streß wie der Temperatur und der enzymatischen Proteolyse haben Teams die Wirkungen einer zusätzlichen Zufuhr von FGF-2 oder auch den Schutz von FGF-2 durch natürliche oder synthetische Moleküle untersucht.
• Yamanaka beschreibt 2005 (Basic fibroblast growth factor treatment for skin ulcerations in scleroderma, cutis, 2005; 76: 373–376) die topische Verwendung von rekombinantem FGF-2 zur Behandlung von Hautgeschwüren. FGF-2 stimuliert die Rezeptoren am FGF der Fibroblasten und induziert eine Aktivierung der Fibroblasten und die vaskuläre Proliferation. Während des Reparaturprozesses wirkte während der Restrukturierung FGF-2 auch auf die Proliferation der Keratinozyten.
• Derivate von Dextran wurden synthetisiert (Tardieu, 1992, oben zitiert), um die Aktivität von FGF-2 zu potentialisieren (mitogene Aktivität der Fibroblasten), wobei sie es gegen Wärme, Denaturierung am pH und enzymatische Degradation schützten (Trypsin und Chymotrypsin). Diese Derivate weisen einen größeren Schutz von FGF-2 als Heparin auf, womit man Verbindungen haben kann, die eine Alternative zur Verwendung von Heparin darstellen, das eine starke gerinnungshemmende Aktivität aufweist. Sie bilden Stabilisatoren, Potentialisatoren und schützen die Matrix für pharmazeutische Formulierungen, die auf die Gewebereparatur wirken. Darüber hinaus haben Franck et al. 2004 (J. Biomater Sci. Polymer Edn. Vol. 15. Nr. 11, S. 1463–1480 (2004)) gezeigt, daß andere Derivate von Dextranen in Fibroblastenkultur die Proliferation der Zellen erhöhen und die Wirkung des Wachstumsfaktors auf das Zellwachstum fördern können.
• Schließlich nennen Sylvia Colliec-Loualt et al., (Exopolysaccharides produced by bacteria isolated from deep-sea hydrothermal vents: new agents with therapeutic potential, Pathologie Biologie, 52, 127–130 (2004)) die Verwendung eines speziellen Exopolysaccharids, das durch ein Bakterium neosynthetisiert ist, und das als Implantat zur Knochenergänzung in einem experimentellen Modell bei der Ratte verwendet worden ist. Nach 14 Tagen zeigen die Tiere eine komplette Vernarbung mit keiner beobachteten Entzündungsreaktion. Dieses Ergebnis wurde erklärt durch die Wechselwirkung des Exopolysacchariden mit löslichen Mittlern, darunter FGF-2; was erlauben würde, die proliferative Aktivität von FGF-2 zu erhöhen und so das Vernarbungssystem zu fördern. Dieses Exopolysaccharid wird zur Zahnvernarbung verwendet.
• Die Haut: FGF-2, Proteoglykane und Alterung
• In der Haut findet sich FGF-2 auf der Ebene der Epidermis, der Dermis-Epidermis-Verbindung (JDE), der Dermis, der Hypodermis und der Kapillaren; es besitzt ein weites Aktivitätsspektrum. Es gewährleistet die Proliferation der Fibroblasten inmitten der Dermis und erlaubt ihnen so, die Makromoleküle der Matrix zu synthetisieren, die essentiell für die Integrität der Haut sind, aber es geht auch um andere Zellen der Haut. Die Proliferation von Melanozyten wird nämlich durch dieses FGF-2 kontrolliert, das auch einen Initiator der Bildung der Kapillaren bildet. Auf dem Niveau der Fibroblasten erhöht FGF-2 außer ihrer Proliferation auch den Gehalt an Messenger-RNS der Gene, die für Hyaluronan-Synthase codieren, und steigert so die Produktion von Hyaluronan, dem hauptsächlichen GAG der Dermis.
• Bei Verletzungen ist der FGF-2 ein wichtiger Akteur des Vernarbungsphänomens. Es wirkt auf dem Niveau der Fibroblasten, immer noch ihre Proliferation erhöhend, aber auch auf die Keratinozyten, um die Expression der Collagenase-1 zu hemmen und damit der Haut zu erlauben, sich rascher wieder aufzubauen. Diese Wirkung bei der Vernarbung geschieht nicht mit Heparansulfat als Transporter/Reservoir, sondern mit Dermatansulfat. Die Expression von FGF-2 wird dann hauptsächlich von den Keratinozyten, den Makrophagen und den Fibroblasten durchgeführt. Die Halbwertszeit von FGF-2 in vitro wurde auf etwa 24 Stunden bei 37°C und neutralem pH beziffert (Sommer & Rifkin, Journal of cellular physiology 138: 215–330 (1989)). So bildet FGF-2 wegen der zahlreichen Funktionen, die es erfüllt, ein wichtiges Cytokin der Haut.
• Die Proteoglykane der Haut und ihre Verteilung wurden untersucht. Die hauptsächlichen GAG, deren Fähigkeit zur Wechselwirkung mit FGF-2 aufgedeckt wurde, finden sich in der Haut. Die quantitative und qualitative Verteilung der GAG wurde wie folgt bestimmt: Hyaluronsäure (31%), Chondroitinsulfat (25%) Keratansulfat (24%), Dermatansulfat (20%) und schließlich Heparansulfat (18%). Das in der Dermis enthaltene Heparansulfat erlaubt eine Lagerung des anwesenden FGF-2.
• Im Laufe der Alterung erfährt die Haut zahlreiche physiologische Modifizierungen. Außer den Falten, welche die sichtbarsten Zeichen bilden, kommt es zu tiefgreifenden strukturellen Änderungen. Insbesondere die Dermis verkümmert, insbesondere infolge einer Reduzierung der Anzahl von Fibroblasten und ihres Synthesevermögens, die Modifizierungen der Makromoleküle der extrazellulären Matrix mit sich bringt. Es wird eine Verminderung der Synthese der Glykosaminoglykane festgestellt, die ebenfalls eine Umorganisation der anwesenden Proteoglykane impliziert. Untersuchungen an Fibroblasten in Kultur erlaubten zu zeigen, daß die Synthese von Hyaluronsäure im Laufe der Alterung stark abnahm, während diejenige von Keratan- und Chondroitinsulfat zunahm. Was Dermatan- und Heparansulfat angeht, so würde ihre Synthese immer weiter abnehmen. Diese Verminderung würde nicht mehr erlauben, das endogene Potential von FGF-2 zu speichern und damit zu schützen.
• AUFGABE DER ERFINDUNG
• Kein Dokument aus dem Stand der Technik strebte danach, einen Wachstumsfaktor, insbesondere FGF-2, gegen seine Degradation oder Denaturierung zu schützen, insbesondere durch Eingriff auf dem Niveau der Haut.
• So liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, das neue technische Problem zu lösen, das darin besteht, die Schutzwirkung der Proteoglykane mit Heparansulfat durch die Entwicklung von natürlichen Wirkstoffen zu vervollständigen, die die Wirkung von Heparansulfat nachahmen, um den endogenen Vorrat an FGF-2 zu schützen, insbesondere auf dem Niveau der Haut und besonders auf dem Niveau der Dermis, und die insbesondere in der Lage sind, die Hautbarriere zu durchqueren, um ihr Ziel zu erreichen. Eine weitere Aufgabe ist die Lieferung von natürlichen Wirkstoffen, welche die endogene Menge von FGF-2 schützen, wobei sie es gleichzeitig für die Erneuerung der extrazellulären Matrix und insbesondere der Dermis-Matrix verfügbar machen.
• Die Aufgabe der Erfindung liegt insbesondere darin, das technische Problem zu lösen, das in der Lieferung von natürlichen Wirkstoffen besteht, die FGF-2 vor seiner Degradation oder Denaturierung schützen, durch Eingriff in den verschiedenen Geweben und insbesondere auf dem Niveau der Haut, insbesondere, um kosmetische, dermokosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen zu liefern, die dazu bestimmt sind, die extrazelluläre Matrix und besonders die Dermis durch Umstrukturierung der Dermis-Matrix umzustrukturieren, die Hydratation der Haut zu verbessern, die Reparatur der Haut zu fördern, die Integrität der Dermis aufrechtzuerhalten, die Proliferation der Melanozyten zu verbessern, die epidermische Differentiation zu verstärken oder die Erneuerung der Epidermis zu verstärken, insbesondere beim Menschen.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt insbesondere darin, das neue Problem zu lösen, das in der Lieferung eines natürlichen Wirkstoff pflanzlichen Ursprungs besteht, um diese oben erwähnten technischen Probleme zu lösen. Die natürlichen Wirkstoffe, welche die Lösung dieser technischen Probleme erlauben, dürfen insbesondere weder toxisch noch reizerzeugend gegenüber der Haut sein.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt also auch darin, natürliche Wirkstoffe zu liefern, welche die erwähnten technischen Probleme auf dem Gebiet der Kosmetik, der Dermokosmetik oder der Pharmazie lösen, insbesondere für eine topische Anwendung beim Menschen.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt auch darin, das neue technische Problem zu lösen, das im Bereitstellen eines Screeningverfahrens von natürlichen Wirkstoffen besteht, das erlaubt, die oben erwähnten Aufgaben zu erreichen. Dieses Screeningverfahren muß insbesondere erlauben, daß eine große Anzahl von natürlichen Wirkstoffen gleichzeitig auf reproduzierbare und zuverlässige Weise gescreent wird.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Zur Identifizierung der natürlichen Wirkstoffe, welche die oben erwähnten technischen Probleme lösen, haben die Erfinder ein Screeningsmodell in vitro entwickelt, das erlaubt, eine Aktivität zum Schutz von FGF-2 an einer großen Anzahl von zu screenenden Substanzen festzustellen, insbesondere gegenüber einer thermischen Degradation von FGF-2.
• Durch den Schutz von FGF-2 spielen diese natürlichen Wirkstoffe eine wichtige Rolle, wobei sie die Integrität der extrazellulären Matrix und insbesondere der Dermis-Matrix durch die Erneuerung der Zellpopulation der Fibroblasten gewährleisten. Sie bilden also natürliche Wirkstoffe erster Wahl, um wirksam gegen die Degradation von FGF-2 zu kämpfen und unter anderem gegen die Hautalterung zu kämpfen.
• Nach einem ersten Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Substanz, die weder ein sulfatiertes Glykosaminoglykan (sulfatiertes GAG) noch ein strukturelles Analogon eines sulfatierten GAG ist und FGF-2 als natürlicher Wirkstoff in einer kosmetischen oder dermokosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung schützt, um wenigstens einer Hautveränderung in Verbindung mit der Degradation von FGF-2 vorzubeugen oder dagegen zu kämpfen.
• Bevorzugt ist die FGF-2 schützende Substanz ein pflanzlicher Extrakt und weist weder sulfatiertes GAG noch ein strukturelles Analogon zu einem sulfatierten GAG auf.
• Dabei ist die Substanz vorteilhaft aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus einem Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette, einem Extrakt von Rebokza, einem Extrakt von Gouqizi-Beeren, einem Banha-Extrakt, einem Lessonia-Extrakt, einem Senfmehl-Extrakt, einem Wooyin-Extrakt, einem Gersten-Extrakt oder einer der Kombinationen, die sich aus der Assoziation von wenigstens zwei der aufgezählten Extrakte ergibt.
• Vorteilhaft wird FGF-2 auf dem Niveau der menschlichen Haut und bevorzugt auf dem Niveau der JDE und/oder der Dermis und/oder der Hypodermis und/oder der Epidermis und/oder der Hautblutgefäße geschützt.
• Vorteilhaft greifen die Hautveränderungen in Verbindung mit der Degradation von FGF-2 auf dem Niveau der menschlichen Haut und bevorzugt auf dem Niveau der JDE und/oder der Dermis und/oder der Hypodermis und/oder der Epidermis und/oder der Wand der Hautblutgefäße ein.
• Vorteilhaft ist die Substanz ein wäßriger oder hydroalkoholischer Extrakt in Lösung, der ausgehend von 1 bis 10% einer Pflanze oder eines Pflanzenteils in trockenem Zustand bezüglich des Gewichts der Gesamtlösung erhalten ist. Bevorzugt ist der wäßrige Extrakt ein hydroglykolischer Extrakt.
• Insbesondere ergibt sich die Degradation des Wachstumsfaktors aus wenigstens einer Degradation, insbesondere einer thermischen Degradation, die insbesondere bei physiologischer Temperatur oder durch Exponierung an Wärme und/oder einer enzymatischen Degradation entsteht, insbesondere durch Cathepsin G.
• Vorteilhaft wird die Substanz oder Zusammensetzung verwendet, um die Proliferation von Zellen der Haut zu stimulieren, insbesondere die Proliferation der Fibroblasten und/oder der Melanozyten, und/oder die Synthese wenigstens einer Matrixkomponente, insbesondere eines Collagen-Typs, und/oder wenigstens eines spezifischen Proteins der Mikrofibrillen wie Fibrillin 1 oder 2 und/oder Fibulin 3 und 5 und/oder wenigstens ein Glykosaminoglykan (GAG), insbesondere eines sulfatierten GAG.
• Nach einer speziellen Ausführungsform wird die Substanz oder Zusammensetzung verwendet, um eine Pflege durchzuführen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die darin besteht, daß die extrazelluläre Matrix restrukturiert wird, und insbesondere diejenige der Dermis, der JDE, der Wand der Hautblutgefäße, der Hypodermis, der Epidermis und insbesondere der Dermis durch die Restrukturierung der Dermis-Matrix, die Hydratation der Haut verbessert wird, die Reparatur der Haut gefördert wird, die Integrität der Dermis aufrechterhalten wird, die epidermische Differentiation verbessert wird, und die Erneuerung der Epidermis verstärkt wird, sowie eine der Kombinationen dieser Pflegen.
• Diese verschiedenen Verwendungen zielen insbesondere darauf ab, Hautveränderungen in Verbindung mit der Degradation von FGF-2 vorzubeugen oder dagegen zu kämpfen.
• Vorteilhaft wird die Substanz oder Zusammensetzung verwendet, um gegen die Alterung der Haut zu kämpfen, insbesondere bei einem Menschen.
• Vorteilhaft ist die Konzentration der Substanz eine wirksame Konzentration für den Schutz von FGF-2, insbesondere durch topische Anwendung, und liegt insbesondere zwischen 0,01 und 10 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung.
• Die Zusammensetzung ist insbesondere eine kosmetische, dermokosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere für den Menschen.
• Die Substanz nach der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt ein pflanzlicher Extrakt, der FGF-2 gegen seine Degradation schützt, und insbesondere ein wäßriger oder hydroalkoholischer, bevorzugt hydroglykolischer Extrakt.
• Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz ein wäßriger oder hydroalkoholischer Extrakt von Hibiscus Abelmoschus, der ausgehend von dem Samen von Hibiscus Abelmoschus erhalten ist.
• Nach einem zweiten Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung eine Substanz für die Herstellung einer insbesondere kosmetischen, pharmazeutischen oder dermokosmetischen Zusammensetzung, um FGF-2 gegen seine Degradation zu schützen, insbesondere bei den verschiedenen, oben aufgelisteten Verwendungen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft noch ein Verfahren zur kosmetischen, pharmazeutischen oder dermokosmetischen Pflege, das eine oben definierte Zusammensetzung nach einer der Ausführungsformen verwendet, um insbesondere eine Pflege durchzuführen, die mit wenigstens einer der verschiedenen, oben aufgelisteten Verwendungen in Verbindung steht.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung ermöglicht, einen Schutz von FGF-2 durch die Proteoglykane dieser gleichen Matrix zu erhalten.
• Man versteht unter ”Schutz von FGF-2” den Schutz von FGF-2 gegen seine Degradation oder seine Denaturierung. Diese Degradation oder Denaturierung tritt allgemein in Form einer Lysis aufgrund von Umweltbedingungen ein, wie einer enzymatischen oder thermischen Lysis. Die Degradation oder Denaturierung kann aufgrund der Verminderung des durch die Proteoglykane gewährleisteten Schutzes eintreten.
• Das Screeningverfahren nach der vorliegenden Erfindung hat es ermöglicht, verschiedene natürliche Wirkstoffe zu screenen, die aus Pflanzen extrahiert sind. Kein pflanzlicher Extrakt wurde so beschrieben, daß er FGF-2 vor seiner Degradation auf dem Niveau der Haut schützt, insbesondere beim Menschen, da nur Substanzen verwendet worden sind, deren Struktur Heparansulfat nahekommt.
• Es wurde ein besonders wirksamer natürlicher Wirkstoff identifiziert, von dem nicht erwartet worden war, daß er FGF-2 gegen thermische Degradation schützt; es handelt sich um einen wäßrigen Extrakt, der ausgehend vom Samen einer Pflanze erhalten ist, die zu der Familie Malvaceae gehört, insbesondere zur Gattung Hibiscus und noch spezieller Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette.
• Hibiscus Abelmoschus war insbesondere in Form eines ausgehend von der ganzen Pflanze erhaltenen wäßrigen Extrakts bekannt, lediglich wegen seiner dünner machenden Eigenschaften in der Kosmetik und genauer zum Kampf gegen Zellulitis ( US5705170 ).
• Andere Extrakte mit der für die vorliegende Erfindung gewünschten Aktivität konnten selektiert werden. Ihre Aktivität ist besonders unerwartet, insbesondere was den Schutz von FGF-2 angeht. Die Extrakte sind insbesondere ein wäßriger Extrakt von Lycium chinense oder Gouqizi-Beeren, erhalten ausgehend von dehydrierten Beeren, ein wäßriger Extrakt von Pinelliae ternata oder Banha, erhalten ausgehend von der Knolle, ein wäßriger Extrakt von Raphanus sativus oder Rbokza, erhalten ausgehend vom Samen, ein Extrakt von Brassica juncea oder Senf, erhalten ausgehend vom Samen, ein wäßriger Extrakt von Coicis semen oder Woolyn, erhalten ausgehend vom Samen, ein Extrakt von Hordeum vulgare oder Gerste, erhalten ausgehend vom Samen, ein Extrakt von Sesamum indicum oder goldenem Sesam, erhalten ausgehend vom Samen, und ein ganzer Algenextrakt von Lessonia sp oder Lessonia.
• Diese Extrakte sind indessen nicht nur auf wäßrige Extrakte beschränkt. So deckt die vorliegende Erfindung auch jedes polare Lösungsmittel ab, das erlaubt, im wesentlichen alle aktiven Verbindungen in einem wäßrigen Extrakt zu erhalten, um die gewünschten Eigenschaften im Rahmen der vorliegenden Erfindung beizubringen.
• Nach von den vorliegenden Erfindern durchgeführten Versuchen ermöglichen hydroglykolische Extrakte, die gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Unter den hydroglykolischen Extrakten ist ein Extraktionslösungsmittel vom Typ Wasser/Glykol bevorzugt. Insbesondere ist ein Gemisch Wasser/Butylenglykol bevorzugt.
• Die Verhältnisse des Gemisches Wasser/Alkohol können variieren, wie der Fachmann weiß. Die Verhältnisse Wasser/Alkohol variieren allgemein von 10/90 bis 90/10 und z. B. von 50/50 zu 85/15.
• Bevorzugt wird bei der vorliegenden Erfindung als natürlicher Wirkstoff ein Extrakt in Lösung verwendet, der ausgehend von 1 bis 10% einer Lösung einer Pflanze oder eines Pflanzenteils im trockenen Zustand bezüglich des Gewichts der gesamten Lösung erhalten ist.
• Die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung weist vorteilhaft von 0,001% bis 20%, bevorzugt von 0,01 bis 10% des natürlichen Wirkstoffs nach der vorliegenden Erfindung an Gewicht von der Gesamtzusammensetzung auf. Die Zusammensetzung kann topisch aufgebracht oder auf oralem Weg verabreicht werden.
• Das Screeningverfahren einer potentiell aktiven Substanz zum Schutz von FGF-2, was seine Degradation beim Menschen angeht, umfaßt insbesondere:
• a) das Inkontaktbringen einer potentiell wirksamen Substanz und von FGF-2 bei einer Temperatur von etwa 45°C während eines Zeitraums von etwa 2 h,
• b) die Auswahl der Substanzen, die FGF-2 gegen seine Degradation um wenigstens 50%, bevorzugt 65% schützen.
• Vorteilhaft umfaßt das Screeningverfahren einen zusätzlichen Schritt zum Test der transkutanen Durchdringung, um eine Wirksubstanz auszuwählen, welche die Hautbarriere durchquert.
• Nach einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Screeningverfahren für Wirksubstanzen, die von Gewächsen stammen.
• Vorteilhaft betrifft die vorliegende Erfindung das Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche die Durchführung des Screeningverfahrens umfaßt, gefolgt von einem Schritt des Mischens der ausgewählten Wirksubstanz mit einem Exzipienten zur Herstellung der Zusammensetzung.
• Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich für den Fachmann nach der Lektüre der erläuternden Beschreibung, die Bezug auf Beispiele nimmt, die nur zur Veranschaulichung angegeben sind und in keinster Weise den Umfang der Erfindung einschränken können.
• Die Beispiele bilden einen integralen Teil der vorliegenden Erfindung, und jedes Merkmal, das bezüglich eines beliebigen Standes der Technik ausgehend von der Beschreibung in ihrer Gesamtheit einschließlich der Beispiele als neu erscheint, ist integraler Teil der Erfindung in seiner Funktion und Allgemeinheit.
• So hat jedes Beispiel eine allgemeine Bedeutung.
• Andererseits sind in den Beispielen alle Prozentangaben als Gewicht angegeben, falls nicht anders angegeben, und die Temperatur ist in Grad Celsius ausgedrückt, falls nicht anders angegeben, und der Druck ist Atmosphärendruck, falls nicht anders angegeben.
• BEISPIELE
• Beispiel 1: Untersuchung der thermischen Degradation von FGF-2
• Tardieu et al. haben 1992 die thermische Degradation von FGF-2 in einem Fibroblast-Proliferationsmodell durch Inkorporation eines radioaktiven Elements untersucht. Die vorliegenden Erfinder haben eine Methode entwickelt, die die Untersuchung der Stabilität von FGF-2 erlaubt: diese Quantifizierungsmethode, die in großem Maßstab verwendet werden kann, ermöglicht die Durchführung eines Screenings von natürlichen Wirkstoffen, was mit der von Tardieu beschriebenen Methode nicht möglich gewesen wäre.
• Eine Lösung von 5 ng/ml FGF-2 in Puffer PBS 10 mM–0,1% BSA und 0,1% Methylparaben wird vorbereitet.
• Diese Lösung wird auf verschiedene Temperaturen gesetzt: 4°C, 20°C, 37°C, 50°C und 80°C, in Anwesenheit von 500 μg/ml Heparin oder nicht.
• Dosierungen von FGF-2 durch einen kommerziellen ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)-Kit (R&D system, Frankreich) werden zu verschiedenen Zeiten durchgeführt (T = 0,3 h, 24 h und 48 h), so daß eine Degradationskinetik für jede Untersuchungstemperatur erstellt wird.
• Die Ergebnisse sind in einer Prozentangabe von FGF-2 bezüglich der Zeit T = 0 angegeben. Die Experimente werden dreifach durchgeführt (n = 3). Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 und 2 dargestellt.
• FGF-2 ist gegenüber den Temperaturbedingungen empfindlich, denen er unterworfen ist.
• 1 zeigt die Entwicklung der Stabilität von FGF-2 in Abhängigkeit von der Zeit bei verschiedenen Temperaturen. Bei 4°C gelagertes FGF-2 ist über einen Zeitraum von 48 h relativ stabil, da 20% von FGF-2 bei dieser Temperatur abgebaut sind. Mit der Erhöhung der Temperatur nehmen die Prozentangaben von Degradationen zu: nach 3 h bei 37°C erfährt FGF-2 65% Degradation und 80% bei 50°C. Schließlich wird nach 3 h bei 80°C eine totale Degradation von FGF-2 beobachtet, die an einer Denaturierung der Proteine bei dieser Temperatur liegt.
• Schließlich, je länger die Zeit ist, und je stärker die beobachtete Degradation ist, sind nach 24 h bei 37°C 80% von FGF-2 abgebaut.
• 2 stellt die Stabilität von FGF-2 bei verschiedenen Temperaturen in Anwesenheit von Heparin dar. 2 zeigt, daß diese Degradation durch die Anwesenheit von Heparin mit 0,05% angehalten wird, welches die Positivkontrolles des Experimentes ist und es durch seine starke Affinität mit FGF-2 stabilisiert. Heparin ist ein hoch sulfatiertes Polysaccharid, das für seine sehr starke Affinität mit FGF-2 bekannt ist.
• Dieser Schutz ist bei 80°C nicht wirksam, denn Heparin wird bei dieser Temperatur ebenfalls denaturiert.
• Auf überraschende Weise greift die Degradation von FGF-2 bei etwa 50°C über einen kurzen Zeitraum ein. Eine Temperatur nahe bei 45°C ist aus praktischen Gründen ausgewählt und bildet einen Wahlparameter, um ein Streß-Modell zum Screenen der natürlichen Wirkstoffe zu realisieren. Die Positivkontrolles des Experimentes ist bevorzugt durch Heparin gebildet.
• Beispiel 2: In vitro-Modell zur Auswahl eines Wirkstoffs, der FGF-2 gegenüber thermischer Degradation schützt.
• Die bei etwa 50°C beobachtete Degradation von FGF-2 ist besonders interessant, denn ein kurzer Zeitraum ermöglicht eine Degradation von FGF-2 um etwa 80%, womit eine große Anzahl von Versuchen durchgeführt werden kann. Aus diesem Grund wurde beschlossen, ein Screening mit einem Streß von 2 h 15 min bei 45°C durchzuführen und die Kapazität einer großen Anzahl von Wirkstoffen zu untersuchen, FGF-2 gegenüber dieser thermischen Degradation zu schützen.
• Das angewandte Screeningmodell ist folgendes:
  180 μl einer Lösung von 4,5 ng/ml FGF-2, die in PBS-Puffer mit 0,1% BSA vorbereitet wurde, werden in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt. 20 μl destilliertes Wasser oder 0,05% Heparin oder eine Lösung, die verschiedene natürliche Wirkstoffextrakte von verschiedenen zu testenden Gewächsen enthält, werden zugegeben. Die Platte wird mit Hilfe eines Plattenschüttlers geschüttelt, dann mit einem Klebeband überdeckt und bei 45°C während 2 h 15 min in einen Wärmeschrank gesetzt. Am Ende der Inkubationszeit wird die Platte herausgenommen, dann wird eine Dosierung von FGF-2 durch den ELISA-Kit hergestellt.
• Eine Kontrollplatte, die nur FGF-2 und destilliertes Wasser enthält und die unter den gleichen Bedingungen behandelt wurde, wird bei Umgebungstemperatur gelassen.
• Die Ergebnisse sind in einer Prozentangabe zum Schutz von FGF-2 bezüglich des nicht gestreßten oder nicht abgebauten FGF-2 ausgedrückt.
• Beispiel 3: Validierung des Modells durch die GAG und Proteoglykane der Haut.
• Versuche wurden mit kommerziell erhältlichen GAG und PG durchgeführt, um das Modell zu validieren.
• Lösungen von GAG mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt: Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Hyaluronsäure werden solubilisiert und dann bei 0,1%–0,01%–0,001% getestet.
• Das als Positivkontrolle verwendete Heparin wird bei 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001% und 0,00001% getestet.
• Die getesteten Proteoglykane sind Glypican-3 und Decorin, getestet bei 0,1%, 0,01%, 0,001%.
• Das im Beispiel 2 beschriebene Streß-Protokoll wird angewandt, wobei die 20 μl Wasser durch 20 μl einer entsprechenden Lösung von GAG oder PG substituiert sind. Die getesteten GAG und PG erfahren also eine zusätzliche Verdünnung auf 1/10.
• 3 veranschaulicht die Untersuchung des Schutzes von FGF-2 durch die GAG der Haut.
• Die in 3 erhaltenen Ergebnisse bestätigen die Daten der Literatur, nämlich: Heparansulfat schützt FGF-2 wie Dermatansulfat, und dies bei jeder getesteten Konzentration. Dermatansulfat ist nämlich der hauptsächliche Förderer der Aktivität von FGF-2 beim Prozeß der Vernarbung. Hyaluronan ermöglicht unabhängig von seinem Molekulargewicht auf keinen Fall den Schutz von FGF-2. Was Chondroitinsulfat angeht, so hängt der Schutz, den es beibringt, von seiner Dosis ab, erreicht indessen nicht 100%.
• Der Test von 2 Proteoglykanen, 4 (Untersuchung des Schutzes von FGF-2 durch die PG), Glypican-3 und Decorin hat die Daten aus der Literatur bestätigt; nämlich, daß Glypican-3, das Heparansulfatketten besitzt, FGF dosis-abhängig schützt, während sich Decorin (Verbindung von Ketten von Chondroitinsulfat und Dermatansulfat) als unwirksam erweist.
• Diese Untersuchung stellt fest, daß der Schutz von FGF-2 von der Struktur der GAG abhängt. Die Wechselwirkung von Heparansulfat mit FG-2 ist gut validiert. Diese Wechselwirkung wird bestätigt, wenn PG, das die Ketten von Heparansulfat trägt, in dem Modell getestet wird.
• Diese Untersuchung hat erlaubt, unser Screeningmodell durch die Bestätigung der Ergebnisse aus der Literatur zu validieren.
• Beispiel 4: Screening der natürlichen Wirkstoffe
• Das Screening wurde nach Beispiel 2 ausgehend von einer Bücherei aus 2000 pflanzlichen Extrakten und charakterisierten Molekülen durchgeführt. Diese Verbindungen, pflanzliche Extrakte, Seealgen oder charakterisierten Moleküle, solubilisiert, werden rein oder mit 10% oder 1% in dem in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionsmedium getestet.
• Die Ergebnisse der wirksamsten natürlichen Wirkstoffe sind in der folgenden Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 1: Beim Screening erhaltene Ergebnisse

  Getesteter natürlicher Wirkstoff	Erhaltener Schutz (%) für den natürlichen Wirkstoff	Erhaltener Schutz (%) für den natürlichen Wirkstoff
  Gattungsbegriff	bei 10%	bei 1%
  Schalottenextrakt	95,07	1,2
  Sojamehlextrakt	86,85	67,66
  Urucum-Extrakt	1q03,5	29,8
  Extrakt von weißem Senf	110,5	17,39
  Extrakt der Bärlapppflanze	71	11,27
  Lupinenmehlextrakt	116,39	65,77
  Kartoffelextrakt	73	16,5
  Jioh-Extrakt	70,9	23,18
  Knoblauchextrakt	95,99	13,92
  Extrakt von Angelika souche radicante	72,5	7,31
  Extrakt von Mungobohne	76,78	2,42
  Extrakt von Ligusticum Chuanxiong	70,53	38,15
  Karottenextrakt	83,93	1,65
  Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette	135,1	87,53
  Pastinak-Extrakt	92,89	23,15
  Erbsenextrakt	74,33	0
  Kartoffelextrakt	88,96	3,61
  Orangenextrakt	70	2,83
  Extrakt von süßem Pfeffer	87,35	28,44
  Extrakt von Rebozka	142,5	77,34
  Extrakt von Meergurke	69,2
  Extrakt von Gouqizi-Beeren	154,4	68,59
  Banha-Extrakt	129,5	65,64
  Lessonia-Extrakt	53,3	61,79
  Senfmehlextrakt	110,1	56,85
  Wooyin-Extrakt	106,1	56,18
  Gerstenextrakt	79,7	53,81
  Sesamextrakt	124,4	52,73
  Extrakt von duftendem Kalmus	55,6	49,34
  Hongsan-Extrakt	102,3	44,58
  Extrakt von duftendem Kalmus	77,7	43,24
  Luteolin-Extrakt	67,7	43,17
  Bryone-Extrakt	81	40,4
  Extrakt von Mounwhaja	102	39,56
  Mandelextrakt	99,5	38,53
  Extrakt von Ligusticum Chuanxiong	70,5	38,15
  Extrakt von Chunnansung	108,4	37,7
  Kürbisextrakt	85,7	37,5
  Extrakt von Goborn	71,1	37,8
  Extrakt von Bangpung	117,9	36
  Extrakt von Ammoniumacrylat	54,9
  Extrakt von Hesongja	81,9	33,3
  Leinextrakt	93,3	32,6
  Petersilextrakt	97,4	30
  Extrakt von blauem Mohnkern	70,33	8,8
  Extrakt von Boksin	75,69	27,56
  Extrakt von Sanyak	63,05	16,78
  Extrakt von gelbem Leinkern	88,56	28,4
  Extrakt von Perphyra Tenera	38,35	29,77
  Extrakt von Lithotheminium	53,78	26,6

• Die obigen Extrakte werden bevorzugt durch Mazeration eines Teils der Pflanze in einem Wasser-Alkohol-Gemisch erhalten, bevorzugt Wasser/Glykol von 100/0 bis 0/100 (v/v). Die Verdünnung wird dann in diesem Lösungsmittel oder einem Gemisch von Lösungsmitteln durchgeführt.
• Bestimmte getestete Wirkstoffe weisen eine starke Schutzaktivität auf, die darüber hinaus dosis-abhängig ist.
• Beispiel 5 Extrakt von Hibiscus Abelmoschus (Ambrette)
• 5a – Ein hydroalkoholischer Extrakt von Ambrette wird ausgehend von gemahlenen Kernen mit 5% (p/p) in Ethanol mit Rückfluß hergestellt. Die Extraktion wird während einer Stunde durchgeführt, dann wird die Lösung filtriert, das Ethanol beseitigt, und das Ergebnis wird mit 5% (p/p) in einem Gemisch Wasser/Glykol (75/25) solubilisiert, dann an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• 5b – Ein hydroglykolischer Extrakt von Ambrette wird in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) bevorzugt ausgehend von gemahlenen Kernen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert. Dabei bedeutet BG Butylenglykol.
• 5c – Ein wäßriger Extrakt von Ambrette wird in Wasser bevorzugt ausgehend von gemahlenen Samen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Stunde bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 6: Extrakt von Gouqizi-Beeren
• Ein Extrakt von Gouqizi-Beeren wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von dehydrierten ganzen Beeren mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 7: Banha-Extrakt
• Ein Banha-Extrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von Knollen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 8: Rebokza-Extrakt
• Ein Rebokza-Extrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von Samen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 9: Lessonia-Extrakt
• Ein Lessonia-Extrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von der ganzen Alge mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 10: Senfextrakt
• Ein Senfextrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von dem Samen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 11: Wooyin-Extrakt
• Ein Wooyin-Extrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von dem Samen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 12: Gerstenextrakt
• Ein Gerstenextrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend von dem Samen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Beispiel 13: Sesamextrakt
• Ein Sesamextrakt wird bevorzugt in einem Gemisch Wasser (75%)/BG (25%) ausgehend vom Samen mit 5% (p/p) hergestellt. Die Mazeration wird während einer Nacht bei 4°C durchgeführt, dann wird die Lösung an Keramikfiltern mit unterschiedlichen Ausschlußschwellen ultrafiltriert und schließlich mit 0,45 μm filtriert.
• Jeder Extrakt (Beispiele 5 bis 13) ist teilweise konserviert worden. Das eventuelle Konservierungsmittel, das bevorzugt aus einem Gemisch aus Caprylylglykol, Phenoxyethanol, Hexylenglykol mit 1% besteht, wird am Schluß in Gegenwart von Xanthan oder nicht hinzugefügt.
• Beispiel 14: Auswahl der natürlichen Wirkstoffe oder pflanzlichen Extrakte
• Die wirksamsten Extrakte werden ausgewählt und mit verschiedenen Konzentrationen nach dem Screening von Beispiel 2 getestet. Die verwendeten natürlichen Wirkstoffe sind die Extrakte der Beispiele 5 bis 13 und werden unter Verwendung eines Lösungsmittels (oder eines Gemisches von Lösungsmittel) verdünnt, das für die Extraktion gedient hat. Ein getesteter Konzentrationsbereich zwischen 0,1% und 10% in diesem Lösungsmittel, um die Spezifizität dieser natürlichen Wirkstoffe gegenüber der thermischen Degradation von FGF-2 zu untersuchen. Die. Dosierungen werden dreifach durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 verzeichnet: Tabelle 2: Erhaltene Dosis-Wirkungen an den beim Screening ausgewählten Prinzipien oder Wirkstoffen

  Natürlicher Wirkstoff	Schutz von FGF-2 (in %) in Abhängigkeit von der Konzentration an natürlichem Wirkstoff
  	0,1%	1%	2%	3%	5%	10%
  Extrakt von Hibiscus Abelmosch us (Ambrette)	84,7 ± 6,03	87,5 ± 4,16	99,6 ± 3,17	110,9 ± 4,9	123,6 ± 1,48	130,8 ± 2,49
  Rebokza-Extrakt	8,5 ± 1,6	72,3 ± 5,64	99,9 ± 5,47	106,6 ± 3,21	123,8 ± 1,43	129,4 ± 0,89
  Extrakt von Gouqizi-Beeren	7,7 ± 0,5	29,5 ± 3,47	38 ± 4,14	52 ± 2,17	75 ± 3.05	109,4 ± 6,34
  Banha-Extrakt	8 ± 1,46	52,5 ± 4,1	76,6 ± 2,57	85,5 ± 2,49	91 ± 2,82	98,9 ± 0,75
  Extrakt von Lessonia sp	13,2 ± 1,63	36 ± 5,49	50,8 ± 3,16	53,27 ± 3,04	53,67 ± 4,49	52,15 ± 0,84
  Extrakt von Senföl Codex	14,7 ± 2,86	88,7 ± 8,06	104,9 ± 5,01	111,3 ± 2,93	119 ± 1,2	118 ± 2,8
  Wooyin-Extrakt	9,4 ± 0,95	56,4 ± 2,97	69,2 ± 0,88	80,6 ± 2,43	92,9 ± 4,39	102,4 ± 1,85
  Gerstenextrakt	10,7 ± 0,95	47,4 ± 1,86	60,8 ± 2,31	70,2 ± 0,59	82,5 ± 0,4	97,8 ± 1,09
  Sesamextrakt	2,3 ± 1,06	215 ± 0,43	48,4 ± 1,71	55,7 ± 19,44	74,8 ± 0,54	94,8 ± 1,7

• Die Extrakte sind sehr wirksam und weisen alle eine dosis-abhängige Aktivität auf, die also eine Aktivitätsspezifizität jedes Wirkstoffs an dem gegebenen Ziel zum Ausdruck bringt.
• Der Extrakt von Hibiscus Abelmoschus (Ambrette) weist die stärkste Aktivität auf und bildet damit einen natürlichen Wirkstoff zur Wahl beim Schutz des Wachstumsfaktors FGF-2.
• In den Beispielen 15 bis 21 ist die Konzentration an natürlichem Wirkstoff (Extrakt 5c) in Volumenprozentangaben (v/v) in Wasser.
• Beispiel 15: Untersuchung des Schutzes von FGF-2 durch den wäßrigen Extrakt von Hibiscus Abelmoschus (Ambrette), der nach dem Beispiel 5c (Extrakt 5c) vorbereitet wurde.
• Eine Untersuchung des Schutzes von FGF-2 durch den Extrakt 5c ist an 2 industriellen Chargen durchgeführt worden. Der Schutz wurde gegenüber einem Streß nach den Bedingungen von Beispiel 2 untersucht.
• Die von dem mit 0,01% getesteten Heparin in dem endgültigen Reaktionsmedium nach vorheriger Verdünnung in Wasser gebildete Positivkontrolle schützt mit 105,52% ±3,04.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 verzeichnet: Tabelle 3: Schutz von FGF-2 bei 45°C durch zwei industrielle Chargen des Extrakts 5c

  	Schutz von FGF-2 (in %) in Abhängigkeit von der Konzentration an natürlichem Wirkstoff
  Extrakt 5c	0,1%	0,5%	1%	2%	3%
  Los 1	4,78 ± 3,89	46,47 ± 1,85	81,01 ± 4,53	107,83 ± 2,53	120,76 ± 2,61
  Los 2	4,38 ± 2,3	42,04 ± 2,76	69,6 ± 3,56	101,81 ± 4,02	118,67 ± 4,12

• Der Extrakt 5c schützt FGF 2 auf dosis-abhängige Weise mit einer starken Aktivität für eine Konzentration von 1% natürlichem Wirkstoff in Wasser. Die an den zwei industriellen Chargen erhaltenen Ergebnisse sind im wesentlichen identisch.
• Es war unerläßlich zu verifizieren, daß der Extrakt 5c FGF-2 bei physiologischer Temperatur, d. h. 37°C schützen kann. Deshalb hat eine Untersuchung darin bestanden, FGF-2 nach 24 h bei 37°C in Abwesenheit oder in Anwesenheit von wachsenden Konzentrationen des Extrakts 5c zu dosieren.
• Die von dem Heparin mit 0,01% gebildete Positivkontrolle schützt mit 110,53% ±3,20.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 verzeichnet: Tabelle 4: Schutz von FGF-2 bei 37°C durch zwei industrielle Chargen des Extrakts 5c

  	Schutz von FGF-2 (in %) in Abhängigkeit von der Konzentration an natürlichem Wirkstoff
  Extrakt 5c	0,01%	0,1%	0,25%	0,5%	0,75%	1%
  Los 1	8,37 ± 4,2	17,81 ± 3,04	51,02 ± 4,75	82,62 ± 1,98	108,39 ± 4,18	110,9 ± 13,28
  Los 2	2,12 ± 1,17	20,56 ± 2,29	55,49 ± 2,61	91,06 ± 0,87	110,64 ± 2,45	122,87 ± 5,75

• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Extrakt 5c FGF-2 bei physiologischer Temperatur und auf dosis-abhängige Weise schützt. Der Extrakt 5c schützt FGF-2 bei dieser Temperatur besser, er wird weniger abgebaut als bei 45°C.
• Beispiel 16: betrifft die Untersuchung der Zytotoxizität des Extrakts 5c auf Fibroblasten in Monoschicht durch eine Dosierung mit PNPP
• Das Ziel lag darin, die Zytotoxizität des Extrakts 5c auf normale menschliche Fibroblasten zu untersuchen.
• Diese Dosierung basiert auf der Umwandlung von p-Nitrophenylphosphat (PNPP) zu p-Nitrophenol durch die intrazellulären sauren Phosphatasen der lebensfähigen Zellen.
• Die Absorbtion von p-Nitrophenol bei 405 nm ist direkt proportional zu der Anzahl von lebensfähigen Zellen, die in den Kulturvertiefungen enthalten sind.
• War die Konfluenz der normalen menschlichen Fibroblasten erreicht, wurden die Kulturmedien durch 200 μl/Vertiefung zugegebenem Medium oder nicht (Kontrolle) des Extrakts 5c in wachsenden Konzentrationen ersetzt: 0,1; 0,5; 1; 2; 3 und 5%.
• Die Zellen wurden während 48 Stunden im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert.
• Nach der Inkubation und Beseitigung der Kulturmedien wurden die Zellen zweimal mit PBS (Phosphate Buffered Saline) gespült und dann in Anwesenheit von 200 μl eines Puffers gebracht, der 0,1 M Natriumacetat (pH 8), 0,1% Triton X-100 und 5 mM p-Nitrophenylphosphat enthielt (Sigma, Frankreich). Nach zwei Stunden Inkubation bei 37°C in einer Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, wurde die Reaktion durch Zusatz von 20 μl 1N NaOH gestoppt. Die Absorbtion der Reaktionsmedien bei 405 nm wurde dann mit Hilfe eines Plattenlesers bestimmt (Victor² V, Perkin Elmer, Finnland).
• Die nicht enzymatische Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat wurde bei jedem Experiment an Vertiefungen bestimmt, die keine Zellen enthalten (”weiß”). Alle Messungen wurden sechsfach durchgeführt (n = 6).
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 verzeichnet: Tabelle 5: Untersuchung der Zytotoxizität an normalen menschlichen Fibroblasten

  Konzentration an Extrakt 5c (%)	Prozentsatz von lebensfähigen Zellen bezüglich der Negativkontrolle
  0,1	85,9
  0,5	88,7
  1	88,8
  2	87,5
  3	89,8
  5	85,5

• Der Extrakt 5c ist im ganzen getesteten Konzentrationsbereich nicht zytotoxisch.
• Beispiel 17: Untersuchung der Proliferation von Fibroblasten durch von dem Extrakt 5c geschützten FGF-2
• Die Aufgabe dieser Studie lag darin zu verifizieren, daß von dem Extrakt geschütztes FGF-2 die Proliferation von normalen menschlichen Fibroblasten stimuliert.
• Eine Lösung von FGF-2 wird sofort vorbereitet (= FGF-2 nicht abgebaut); eine Lösung von FGF-2 wird 24 h bei 37°C in Abwesenheit (= FGF-2 abgebaut) und in Anwesenheit von Heparin (= FGF-2 + Heparin bei 37°C) mit 0,01% gesetzt.
• Jede Lösung von FGF-2 wird derart verdünnt, daß auf die Zellen die folgenden Endkonzentrationen an FGF-2 aufgebracht sind: 0,1, 0,25, 0,5, 0,75 und 1 ng/ml.
• Normale menschliche Dermis-Fibroblasten werden mit geringer Dichte in Platten mit 6 Vertiefungen eingesetzt. Die werden dann in Medium in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Anwesenheit von FGF-2 mit verschiedenen Konzentrationen kultiviert.
• Nach 48 h wird die Aktivität der intrazellulären sauren Phosphatasen (PNPP) dosiert, womit die Wirkung der behandelten Lösungen von FGF-2 (oder nicht) auf die Zellproliferation evaluiert werden kann.
• Die Ergebnisse sind in Proliferationsprozentsatz bezüglich der Kontrollvertiefung, d. h. der nicht behandelten Vertiefung angegeben.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle und 5 dargestellt: Tabelle 6: Untersuchung der Proliferation (ausgedrückt in % bezüglich der nicht behandelten Vertiefung), die nach der Behandlung durch verschiedene Konzentrationen an nicht abgebautem FGF-2, verschiedenen Kombinationen an abgebautem FGF-2 und verschiedenen Konzentrationen an FGF-2 + Heparin bei 37°C erhalten ist.

  Konzentration an FGF-2 (ng/ml)	Nicht abgebautes FGF-2	Abgebautes FGF-2	FGF-2 + Heparin bei 37°C
  0,1	116,7 ± 0,012	96,2 ± 0,014 P = 0,006**	129,3 ± 0,009
  0,25	138,7 ± 0,005	111 ± 0,006 P < 0,001***	154,8 ± 0,001
  0,5	148,5 ± 0,007	123,7 ± 0,005 P < 0,001***	146,8 ± 0,007
  0,75	163,2 ± 0,005	132,5 ± 0,004 P < 0,001***	149,8 ± 0,016
  1	160 ± 0,003	146,4 ± 0,01 P = 0,003	148,1 ± 0,006

• 5 stellt eine Untersuchung der Proliferation von Fibroblasten in Anwesenheit von nicht abgebautem FGF-2, abgebautem FGF-2 und FGF-2 + Heparin bei 37°C dar.
• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß (nicht abgebautes) FGF-2 die Proliferation von normalen menschlichen Fibroblasten in Kultur stimuliert, und zwar auf dosis-abhängige Weise.
• Bei 37°C abgebautes FGF-2 stimuliert die Proliferation, aber viel schwächer als nicht abgebautes FGF-2 bei 37°C. Für jede getestete Konzentration ist nämlich die Proliferation in Anwesenheit von abgebautem FGF-2 viel schwächer als die mit nicht abgebautem FGF-2 erhaltene.
• Dieses Beispiel zeigt die Relevanz der Entwicklung eines Wirkstoffs, der in der Lage ist, FGF-2 gegen die Matrix zu schützen, die bei physiologischer Temperatur abbaut und nicht mehr ihre Rolle der Erneuerung der Dermis-Zellen spielen kann.
• Indem es FGF-2 gegen den thermischen Abbau schützt ermöglicht das mit 0,01% verwendete Heparin dem FGF-2, seine biologischen Eigenschaften zu bewahren, da die Proliferation aufrechterhalten wird, sogar selbst über derjenigen, die mit der sofort vorbereiteten FGF-2-Lösung erhalten wird; bis zur Konzentration von 0,5 ng/ml.
• Die sehr starke Stimulation in Anwesenheit von Heparin, die bei geringen Mengen von FGF-2 beobachtet wird, wird nicht mit größeren Mengen von FGF-2 beobachtet.
• Das gleiche Experiment wurde durchgeführt, indem Heparin durch den Extrakt 5c ersetzt wurde. Die Lösung von FGF-2, die in Anwesenheit von 0,5% des Extrakts 5c gebracht ist, wird 24 h auf 37°C gesetzt. Die Lösung wird dann derart verdünnt, daß 0,5 ng/ml FGF-2 in die die Fibroblasten enthaltenden Vertiefungen aufgebracht werden.
• Die am Schluß auf die Zellen aufgebrachte Konzentration an Extrakt 5c liegt bei 0,0025%. Es wurde vorher verifiziert, daß diese Konzentration an Extrakt 5c nicht in der Lage war, eine Stimulation der Proliferation der Fibroblasten zu induzieren. Dies bedeutet, daß die beobachtete Proliferation eben an dem Schutz von FGF-2 durch den Extrakt liegt (vgl. Tabelle 8).
• Die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt in Prozentsatz der Proliferation bezüglich der nicht behandelten Kontrolle, sind in der folgenden Tabelle 7 dargestellt: Tabelle 7: Untersuchung der Proliferation (in Prozent) der Fibroblasten, die in Anwesenheit von nicht abgebautem FGF-2 mit 0,5 ng/ml, abgebautem FGF-2 mit 0,5 ng/ml und FGF-2 + Extrakt 5c 0,5% bei 37°C erhalten ist.

  Konzentration an FGF-2	Nicht abgebautes FGF-2	Abgebautes FGF-2	FGF-2 + Extrakt 5c bei 37°C
  0,5 ng/ml	148,5% ± 0,007	123,7% ± 0,005 P < 0,001***	143,8% ± 0,007 ns bezüglich nicht-gestreßtem FGF-2

• 6 stellt die Untersuchung der Proliferation der Fibroblasten in Anwesenheit von nicht abgebautem FGF-2 mit 0,5 ng/ml, abgebautem FGF-2 mit 0,5 ng/ml und FGF-2 + Extrakt 5c mit 0,5% bei 37°C dar.
• Die Co-Inkubation von FGF-2 und dem Extrakt 5c bei 37°C ermöglicht, FGF-2 zu schützen, das seine Fähigkeiten behält, die Proliferation von normalen menschlichen Fibroblasten in Kultur zu stimulieren. Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen den Erhalt einer Fibroblast-Proliferation, die sich statistisch nicht von derjenigen unterscheidet, die in Anwesenheit von sofort vorbereitetem FGF-2 erhalten wird.
• Eine Untersuchung der Proliferation von normalen menschlichen Fibroblasten in Anwesenheit von wachsenden Konzentrationen des Extrakts 5c wurde während 48 h bei 37° durchgeführt.
• Die Fibroblasten werden in Gegenwart des Extrakts 5c mit verschiedenen Konzentrationen 0,0025%, 0,01%, 0,25%, 0,5%, 1% und 2% eingesetzt. Nach 48 h wird eine Dosierung der sauren Phosphatasen (Dosierung mit PNPP) bei 405 nm durchgeführt, dann wird die Proliferation bezüglich der Negativkontrolle (= nicht behandelte Zellen) (in %) berechnet. Jede Bedingung wird n = 6 getestet.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 8 verzeichnet: Tabelle 8: Untersuchung der Proliferation von Fibroblasten in Anwesenheit des Extrakts 5c

  Konzentration an Extrakt 5c (%)	Proliferation (in %) gegenüber Negativkontrolle
  0,0025	100
  0,01	99
  0,25	107
  0,5	114
  1	111
  2	122*

  * signifikant: Einweganalyse der Varianz/Dunnett
• Die von 10% Serum gebildete Kontrolle ermöglicht, die Proliferation auf signifikante Weise zu stimulieren, was das Experiment validiert (T+ = +126·Proliferation).
• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Extrakt 5c die Proliferation der normalen menschlichen Fibroblasten in Kultur nicht stimuliert.
• Beispiel 18: Einfluß des Schutzes der Wachstumsfaktoren auf die Collagensynthese
• Normale menschliche Fibroblasten, die von einem Spender im Alter von 52 stammen, wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit Medium während 24 h kultiviert (zusammengesetzt aus DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 2 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin –50 μg/ml Streptomycin, 10% fötales Kalbsserum). Nach Inkubation wurden die Zellen während 48 h durch Produkte behandelt, die aus 20 μg/ml Vitamin C (Positivkontrolle) und 2% und 1% Extrakt 5c gebildet waren. Eine Kontrolle wurde parallel nur mit Medium durchgeführt.
• Nach 24 h Kontakt wird radioaktives Prolin (3H-Prolin) dem Medium zugegeben.
• Am Ende des Experiments wurden die Überstände für die Dosierung der Inkorporation des radioaktiven Prolins in die intrazellulären Proteine eingesammelt.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 9 präsentiert: Tabelle 9: Untersuchung der Stimulation der Synthese von Collagen durch den Extrakt 5c

  Produkte	Cpm	Sd	n	% control	p
  Kontrolle	5981	829	6	100	-
  Vitamin C-20 μg/ml	10185	287	3	170	P < 0,01
  Extrakt 5c 2%	7342	273	3	123	P < 001
  Extrakt 5c 1%	7056	783	3	118	P < 0,01

  Cpm: Körper pro Minuten	n: Versuchsnummer
  Sd: Standardabweichung	p: Signifikativitätsschwellenwert

• Der mit 2% und 1% getestete Extrakt 5c war in der Lage, die Synthese von Collagen in normalen menschlichen Fibroblasten zu stimulieren, und zwar signifikant.
• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Schutz der Wachstumsfaktoren des Mediums und der durch die Fibroblasten synthetisierten in vitro ermöglicht, die Collagen-Synthese zu stimulieren.
• Beispiel 19: Einfluß des Schutzes der Wachstumsfaktoren auf die Synthese der gesamten GAG und der sulfatierten GAG
• Das Ziel dieser Untersuchung lag darin, ob der Schutz der Wachstumsfaktoren durch den Extrakt 5c an Kulturen von monolagigen Fibroblasten es ermöglichte, die Synthese der gesamten GAG durch eine radioaktive Methode zu stimulieren.
• Normale menschliche Fibroblasten, die von einem Spender im Alter von 52 stammen, wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit Medium während 24 h kultiviert (zusammengesetzt aus DMEM, 2 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin-50 μg/ml Streptomycin, 10% fötales Kalbsserum). Nach Inkubation wurden die Zellen während 72 h durch Produkte behandelt, die aus 20 μg/ml Vitamin C (Positivkontrolle) und 2% und 1% Extrakt 5c gebildet waren. Eine Kontrolle wurde parallel nur mit Medium durchgeführt.
• Nach 48 h Kontakt wird radioaktives Glucosamin (D-(6-³H)-Glucosamin) dem Medium zugegeben.
• Am Ende des Experiments wurden die Überstände für die Dosierung der Inkorporation des radioaktiven Glucosamins in die intrazellulären Proteine eingesammelt. Die Dosierung der Proteine wird mit einem kommerziellen Kit durchgeführt (BioRad 500-0116).
• Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 10 präsentiert: Tabelle 10: Untersuchung der Stimulation der Synthese der gesamten GAG durch den Extrakt 5c

  Produkte	Activität (cpm)	Proteine (mg/ml)	Verhältnis (Akt./Prot.)	% Kontrolle	p
  Kontrolle	1059	3,579	296	100	-
  TGF-β10 ng/ml	2590	3,650	709	240	P < 0,01
  Extrakt 5c 2%	4173	3,058	1365	461	P < 0,01
  Extrakt 5c 1%	1787	3,396	526	178	P < 0,01

• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der auf normale menschliche Fibroblasten mit 2% und 1% angewandte Extrakt 5c in der Lage war, die Synthese der gesamten GAG mit einer Dosis-Wirkung und stärker als die positive Referenzkontrolle zu stimulieren (10 ng/ml TGF-β).
• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Schutz der Wachstumsfaktoren des Mediums und der durch die Fibroblasten synthetisierten es ermöglicht, die Synthese der gesamten GAG in vitro zu stimulieren.
• Auf die gleiche Weise wird eine Untersuchung zur Inkorporation von ³⁵S-Sulfat durchgeführt, um die sulfatierten GAG zu quantifizieren. Das angewandte Protokoll ist das gleiche wie bei den gesamten GAG, abgesehen von der Beschaffenheit des radioaktiven Vorläufers. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 11 verzeichnet: Tabelle 11: Untersuchung der Stimulation der Synthese der sulfatierten GAG durch den Extrakt 5c

  Produkte	Activität (cpm)	Proteine (mg/ml)	Verhältnis (Akt./Prot.)	% Kontrolle	p
  Kontrolle	3028	3,579	846	100	-
  TGF-β10 ng/ml	5442	3,650	1491	176	P < 0,01
  Extrakt 5c 2%	5586	3,058	1827	216	P < 0,01
  Extrakt 5c 1%	4300	3,396	1266	150	P < 0,01

• Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Extrakt 5c ermöglicht, auf sehr signifikante und dosis-abhängige Weise die Synthese der sulfatierten GAG zu stimulieren.
• Dies bedeutet, daß der Extrakt 5c außer der von dem Extrakt 5c gegenüber FGF-2 gespielten Mimik-Rolle in der Lage ist, durch Schutz der Wachstumsfaktoren die Synthese der sulfatierten GAG zu stimulieren, und damit ermöglicht, den Schutz von FGF-2 zu verstärken, da eben diese sulfatierten GAG mit Heparansulfat FGF-2 schützen.
• Beispiel 20: Untersuchung der Schutzaktivität von FGF-2 durch den Extrakt 5c nach transkutaner Permeation
• Die Aufgabe lag darin, sicherzustellen, daß der Extrakt 5c seine Eigenschaften des Schutzes des Wachstumsfaktors nach dem Durchdringen der Haut bewahrte. Eine reine Lösung des Extrakts 5c wurde an der Oberfläche von Hautexplantaten abgesetzt, die an Franz-Zellen angebracht waren.
• Nach 24 h Inkubation wurden die in den Aufnahmeabteilen der Zellen enthaltenen Medien wiedergewonnen und lyophilisiert. Die Lyophilisate wurden dann derart in destilliertem Wasser gelöst, daß sie zum Schluß in dem beim Beispiel 15 beschriebenen Modell mit einem thermischen Streß bei 37°C während 24 h getestet wurden.
• 7 stellt die Untersuchung des Schutzes von FGF-2 durch den Extrakt 5c nach dem Durchgang durch die Haut dar.
• Die erhaltenen Ergebnisse (99,96% Schutz) zeigen, daß der Extrakt 5c seine Schutzeigenschaften integral bewahrt hat, da das erhaltene Ergebnis mit demjenigen identisch ist, das in Tabelle 4 von Beispiel 15 erhalten wurde.
• Die Ergebnisse zeigen, daß der Extrakt 5c nach dem Durchdringen der Hautgewebe in der Lage ist, Wachstumsfaktoren zu schützen und damit integer bleibt, um sein Ziel zu erreichen.
• Beispiel 21: Untersuchung des Schutzes von FGF-2 gegenüber enzymatischer Degradation
• Das Ziel dieser Untersuchung lag darin, die Degradation von FGF-2 durch Proteinasen zu quantifizieren, die auf Höhe der Dermis der menschlichen Haut anwesend waren. Diese Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Degradation der extrazellulären Matrix.
• Insbesondere Cathepsin G, das bei einer Entzündung eingreift und in der extrazellulären Umgebung abgesondert wird. Es haftet wegen seines basischen Charakters stark an den Zellflächen der Matrix. Cathepsin G ist auch gegen Collagen aktiv, aber auch gegenüber dem Kernprotein der Proteoglykane und Glykoproteine der Matrix.
• Aus diesem Grund wurde eine Untersuchung der Degradation von FGF-2 durch Cathepsin G durchgeführt. Eine Degradationskinetik wurde in 100 mM Hepes-Puffer, pH 7, mit 0,1% BSA durchgeführt. Cathepsin G wurde in die Vertiefungen der Platte mit einer Konzentration von 0,02 U pro Vertiefung mit einer Lösung von FGF-2 mit 2 ng/Vertiefung zugegeben. Die Platte wird bei 37°C inkubiert, dann wird bei 15, 30, 60, 90 und 120 Minuten eine Entnahme vorgenommen, um den verbleibenden FGF-2 zu dosieren.
• Die Kontrolle (100%) wird durch eine sofortige Dosierung von FGF-2 realisiert. Parallel dazu wird eine Kontrollösung ohne Enzym auf 37°C gesetzt, um die thermische Degradation zu den verschiedenen Zeiten zu untersuchen, so daß man sich von dieser Degradation aufgrund der Temperatur befreit und den Teil quantifiziert, der alleine an der enzymatischen Degradation liegt.
• Die erhaltenen Mengen an FGF-2 (pg/ml) sind in der folgenden Tabelle 12 beschrieben: Tabelle 12: Untersuchung der Degradation von FGF-2 durch Cathepsin G

  Zeit (Minuten)	Konzentration an FGF-2 Kontrolle Temperatur	Konzentration von FGF-2 in Anwesenheit von Cathepsin G (Degradation %)
  0	391,8 ± 3,64	339,05 ± 7,43 (13,29%)
  15	324,99 ± 1,7	296,61 ± (8,95%)
  30	291,83 ± 2,4	248,04 ± 1,97 (14,77%)
  60	280,64 ± 3,23	203,67 ± 1,13 (27,5%)
  90	259,81 ± 4,9	141,94 ± 5,14 (45,55%)
  120	241,67 ± 1,97	131,36 ± 2,49 (45,6%)

• Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen, zu zeigen, daß mit der Zeit die Degradation von FGF-2 erhöht wird. Das Enzym läßt FGF-2 sehr signifikant bei 90 Minuten abbauen.
• Deshalb wird diese Zeit ausgewählt, um den Schutz von FGF-2 in Anwesenheit von Cathepsin G durch den Extrakt 5c zu untersuchen.
• Dem oben beschriebenen Reaktionsmedium (Beispiel 21) werden unterschiedliche Konzentrationen des Extrakts 5c zugegeben, nämlich: 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5% und 1%.
• Nach 90 Minuten bei 37°C werden die Konzentrationen an FGF-2 evaluiert und die Prozentsätze von verbleibendem FGF-2 sowie die Prozentsätze des Schutzes von FGF-2 berechnet. Für jede getestete Konzentration wird die Dosierung in n = 9 realisiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 13 beschrieben: Tabelle 13: Untersuchung des Schutzes von FGF-2, abgebaut durch Cathepsin G, durch den Extrakt 5c

  Versuche	Konzentration an FGF-2 (pg/ml)	Verbleibender FGF-2 (%)	Schutz des FGF-2 (%)
  Kontrolle (100%)	455,23	100	-
  Abgebaute Kontrolle (Enzym)	288,11	63,29	0
  Extrakt 5c 0,01%	336,93	74,01	29,21
  Extrakt 5c 0,05%	344,65	75,71	33,83
  Extrakt 5c 0,1%	409,08	89,86	72,38
  Extrakt 5c 0,5%	414,02	90,95	75,33
  Extrakt 5c 1%	406,58	89,31	70,89

• Der Extrakt 5c ist in der Lage, FGF-2 gegenüber der enzymatischen Degradation auf dosis-abhängige Weise zu schützen.
• Diese in vitro-Untersuchung ermöglicht nachzuweisen, daß die Anwendung des Extrakts 5c die Wachstumsfaktoren vor der proteolytischen Degradation schützen kann, die von den Enzymen der extrazellulären Matrix ausgeübt wird. Dies verstärkt nur das Interesse an der Verwendung des Extrakts 5c in der Kosmetik.
• Beispiel 22: Nachweis des Gehalts von FGF-2 mit dem Alter
• Das Ziel dieser Untersuchung lag darin, die Konzentration an FGF-2 in einer sogenannten ”jungen” und einer sogenannten ”alten” Haut zu untersuchen, um eine Relation zwischen dem Alter und dem Verlust des Gehalts an FGF-2 herzustellen, der hauptsächlich an der Modifizierung der GAG durch die Haut liegt.
• Biopsien von Haut, die von sogenannten jungen Spendern (21, 30, 31 und 38 Jahre) und von sogenannten alten Spendern (50, 55, 57 und 58 Jahre) stammen, wurden entnommen und nach dem Mahlen in einem PBS-Puffer, pH 7, mit 0,1% Triton X-100 extrahiert, um eine Dosierung von FGF-2 durch einen kommerziellen ELISA-Kit (R&D system, DFB50) durchzuführen. Die Konzentration an FGF-2 wird auf den DNA-Gehalt bezogen, die durch ein kommerzielles Picogreen-Kit gemessen wird.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind in 8 dargestellt:
• 8 stellt eine Untersuchung der Hydrolysate von sogenannter ”junger” und ”alter” Haut dar.
• Die Ergebnisse zeigen eine Differenz des Gehalts von FGF-2 zwischen der jungen Haut und der alten Haut. Darüber hinaus ist diese Differenz statistisch signifikant (p = 0,046).
• Dieses Beispiel ermöglicht, zu zeigen, daß die Verwendung eines Wirkstoffs als Beschützer von Wachstumsfaktoren und insbesondere von FGF-2 ermöglicht, gegen die Wirkungen in Verbindung mit der Hautalterung zu kämpfen.
• Beispiel 23: Formulierung der Produkte der Erfindung
• Man geht nach den dem Fachmann bekannten Methoden vor, um die verschiedenen Teile A, B, C, D, E oder F zusammenzumischen, um eine Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung herzustellen. Die ”Produkte der Erfindung” stellen die in der vorliegenden Erfindung erwähnten natürlichen Wirkstoffe dar.
• Verwendung der Produkte der Erfindung in kosmetischen oder pharmazeutischen Verbindungen vom Typ Emulsion Öl in Wasser. Formulierung 23A:

  A	Wasser	qsp 100
  	Butylenglykol	2
  	Glyzerin	3
  	Natriumhydroxycetylphosphat,
  	Isopropylhydroxycetylether	2
  B	Glycolstearat SE	14
  	Triisononaoin	5
  	Octylcocoat	6
  C	Butylenglykol	2
  	Methylparaben, Ethylparaben,
  	Propylparaben,
  	pH eingestellt auf 5,5
  D	Produkte der Erfindung	0,01–10%

  Formulierung 23B:

  A	Wasser	qsp 100
  	Butylenglykol	2
  	Glyzerin	3
  	Polyacrylamide, Isoparaffin,
  	Laureth-7	2,8
  B	Butylenglykol	2
  	Methylparaben,
  	Ethylparaben, Propylparaben;	2
  	Phenoxyethanol,
  	Methylparaben,
  	Propylparaben, Butylparaben,
  	Ethylparaben	0,5
  	Butylenglykol
  D	Produkte der Erfindung	0,01–10%

  Formulierung 23C:

  A	Carbomer	0,50
  	Propylenglykol	3
  	Glyzerin	5
  	Wasser	qsp 100
  B	Octylcocoat	5
  	Bisbolol	0,30
  	Dimethicone	0,30
  C	Natriumhydroxid	1,60
  D	Phenoxyethanol	0,50
  	Methylparaben,
  	Propylparaben, Butylparaben,
  	Ethylparaben
  E	Parfüm	0,30
  F	Produkte der Erfindung	0,01–10%

  Beispiel 24 der Erfindung Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung vom Typ Wasser in Öl

  A	PEG30-Dipolyhydroxystearate	3
  	Caprinsäure-Triglyceride 3
  	Cetearyloctanoat	4
  	Dibutyladipat	3
  	Traubenkernöl	1,5
  	Jojobaöl	1,5
  	Phenoxyethanol,	0,5
  	Methylparaben,
  	Propylparaben, Butylparaben,
  	Ethylparaben
  B	Glyzerin	3
  	Butylenglykol	3
  	Magnesiumsulfat	0,5
  	EDTA	0,05
  	Wasser	qsp 100
  C	Cyclomethicone	1
  	Dimethicone	1
  D	Parfüm	0,3
  E	Produkte der Erfindung	0,01–10%

  Beispiel 25 der Erfindung Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung vom Typ Shampoo oder Duschgel

  A	Xantham-Gummi	0,8
  	Wasser	qsp 100
  B	Butylenglykol,	0,5
  	Methylparaben,
  	Ethylparaben, Propylparaben,
  	Phenoxyethanol	0,5
  	Methylparaben,
  	Propylparaben, Butylparaben,
  	Ethylparaben
  C	Zitronensäure	0,8
  D	Natriumlaurethsulfat	40,0
  E	Produkt der Erfindung	0,01–10%

  Beispiel 26 der Erfindung Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung vom Typ Lippenstift und andere wasserfreie Produkte

  A	Mineral Wax	17,0
  	Isostearylisostearat	31,5
  	Propylenglykoldipelargonat	2,6
  	Propylenglykolisostearate	1,7
  	PEG8-Bienenwachs	3,0
  	Hydriertes Palmenkernöl	3,4
  	Glycerides,
  	Hydrierte Palmölglyceride
  	Lanolinöl	3,4
  	Sesamöl	1,7
  	Cetyllactat	1,7
  	Mineralöl, Lanolinalkohol	3,0
  B	Castoröl	qsp 100
  	Titandioxid	3,9
  	Cl 115850:1	0,616
  	Cl 45410:1	0,256
  	Cl 19140:1	0,048
  	Cl 77491	2,048
  C	Produkte der Erfindung	0,01–5

  Beispiel 27 der Erfindung Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung von wäßrigen Gels (Eyeliner, Schlankmacher usw.)

  A	Wasser	qsp 100
  	Carbomer	0,5
  	Butylenglykol	15
  	Phenoxyethanol, Methylparaben,	0,5
  	Propylparaben, Butylparaben
  	Ethylparaben
  B	Produkte der Erfindung	0,01–10%

  Beispiel 28 der Erfindung Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung vom Typ Dreifach-Emulsion Primäremulsion W1/O

  A	PEG30-Dipolyhydroxystearat	4
  	Caprinsäure-Triglyceride	7,5
  	Isohexadecane	15
  	PPG-15 Stearylether	7,5
  B	Wasser	65,3
  C	Phenoxyethanol
  	Methylparaben
  	Propylparaben, Butylparaben
  	Ethylparaben

  Sekundäremulsion W1/O/W2

  A	Primäremulsion	60
  B	Poloxamer 407	2
  	Phenoxyethanol,
  	Methylparaben,
  	Propylparaben, 2-bromo-
  	2-Nitropropan-1,3-diol	0,3
  	Wasser	qsp 100
  C	Carbomer	15
  D	Triethanolamin	PH 6,0–6,5

  Beispiel 29 der Erfindung Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen, die das Produkt der Erfndung enthalten Formulierung 29a: Herstellung von Tabletten

  A	Exzipienten	in g pro Tablette
  	Lactose	0,359
  	Saccharose	0,240
  B	Produkte der Erfindung*	0,001–0,1

  *Das Produkt ist z. B. nach dem in Beispiel 5c beschriebenen Extraktionsverfahren erhalten, gefolgt von einem Trocknungsschritt. Formulierung 29b: Herstellung einer Salbe

  A	Exzipienten
  	Polyethylen niedriger Dichte	5,5
  	Flüssiges Paraffin	qsp 100
  B	Produkte der Erfindung*	0,001–0,1

  *Das Produkt ist z. B. nach dem in Beispiel 5c beschriebenen Extraktionsverfahren erhalten, gefolgt von einem Trocknungsschritt. Formulierung 29c: Herstellung einer injizierbaren Formel

  A	Exzipient
  	isotonische Salzöösung	5 ml
  B	Produkte der Erfindung	0,001–0,1 g

  *Das Produkt ist z. B. nach dem in Beispiel 5c beschriebenen Extraktionsverfahren erhalten, gefolgt von einem Trocknungsschritt.
• Beispiel 30: Evaluierung der kosmetischen Akzeptanz eines Präparats, welches das Produkt der Erfindung enthält
• Die toxikologischen Versuche wurden an der nach dem Beispiel 5c erhaltenen Zusammensetzung durch eine Kutan- und Okularevaluierung beim Kaninchen, durch die Untersuchung der Abwesenheit von anormaler Toxizität durch einmalige orale Verabreichung bei der Ratte und durch die Untersuchung des sensibilisierenden Vermögens am Meerschweinchen durchgeführt.
• Auswertung der primären Hautreizung beim Kaninchen:
• Die im Beispiel 5c beschriebenen Präparate werden ohne Verdünnung mit der Dosis von 0,5 ml auf die Haut von drei Kaninchen aufgebracht, und zwar nach der von der OECD-Richtlinie empfohlenen Methode bezüglich der Untersuchung ”der akuten reizerzeugenden/ätzenden Wirkung auf die Haut”.
• Die Produkte sind nach den Kriterien klassifiziert, die durch die Verordnung vom 1.2.1982 definiert sind, veröffentlicht im ”Journal Officiel Lois et Decrets” vom 21.02.82.
• Die Ergebnisse dieser Versuche haben den Schluß erlaubt, daß die Produkte der Erfindung als nicht reizerregend für die Haut klassifiziert sind.
• Evaluierung der Hautreizung beim Kaninchen:
• Die oben beschriebenen Präparate wurden ein einziges Mal mit 0,1 ml in die Augen von drei Kaninchen geträufelt, und zwar nach der von der OECD-Richtlinie Nr. 405 vom 24. Februar 1987 empfohlenen Methode bezüglich der Untersuchung ”der akuten reizerzeugenden/ätzenden Wirkung auf die Haut”.
• Die Ergebnisse dieses Tests lassen den Schluß zu, daß die Präparate im Sinne der Richtlinie EWG 91/326 als nicht reizerregend für die Augen gelten können, und zwar in reiner Verwendung oder ohne Verdünnung.
• Versuch zur Abwesenheit von anormaler Toxizität durch einmalige orale Verabreichung bei der Ratte:
• Die beschriebenen Präparate wurden auf einmal auf oralem Weg mit der Dosis von 5 g/Kg Körpergewicht 5 männlichen und 5 weiblichen Ratten nach einem Protokoll verabreicht, das an die OECD-Richtlinie Nr. 401 vom 24. Februar 1987 angelehnt und an kosmetische Produkte angepaßt ist.
• Die DL₀ und DL₅₀ werden als über 5000 mg/Kg angesehen. Die getesteten Präparate sind also nicht unter den zum Einnehmen gefährlichen Präparaten klassifiziert.
• Evaluierung des Hautsensibilisierungspotentials beim Meerschweinchen:
• Die beschriebenen Präparate werden dem von Magnusson und Kligmann beschriebenen Maximierungstest unterzogen, einem Protokoll in Einklang mit der OECD-Richtlinie Nr. 406.
• Die Präparate sind als nicht sensibilisierend durch Kontakt mit der Haut klassifiziert.

Claims (21)

1. Verwendung einer Substanz, die weder ein sulfatiertes Glykosaminoglykan noch ein strukturelles Analogon eines sulfatierten Glykosaminoglykan ist und FGF-2 als natürlicher Wirkstoff in einer kosmetischen oder dermatologischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung schützt, zur Vorbeugung oder Behandlung wenigstens einer Hautveränderung, die mit dem Abbau von FGF-2 verbunden ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein pflanzlicher Extrakt ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pflanzliche Extrakt ein wäßriger oder hydroalkoholischer oder hydroglykolischer Extrakt von Hibiscus Abelmoschus ist, der ausgehend von dem Samen von Hibiscus Abelmoschus erhalten ist.
4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pflanzliche Extrakt ein Extrakt von Hibiscus Abelmoschus ist, der erhalten ist durch Mazerieren aus Samen von Hibiscus Abelmoschus in Wasser oder einem Wasser-Glykol-Gemisch.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus einem Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette, einem Extrakt von Rebokza, einem Extrakt von Gouqizi-Beeren, einem Banha-Extrakt, einem Lessonia-Extrakt, einem Senfmehl-Extrakt, einem Wooyin-Extrakt, einem Gersten-Extrakt, einem Sesam-Extrakt oder einer der Kombinationen, die sich aus der Assoziation von wenigstens zwei der aufgezählten Extrakte ergibt.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Vorbeugung oder Behandlung einer Hautveränderung, die verbunden ist mit der Degradation von FGF-2 auf dem Niveau der Epidermis und/oder der Dermis-Epidermis-Verbindung und/oder der dermischen extrazellulären Matrix und/oder der Hypodermis und/oder der Hautblutgefäße.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein wäßriger oder hydroalkoholischer Extrakt ist, bevorzugt in Lösung, der ausgehend von 1 bis 10% einer Pflanze oder eines Pflanzenteils in trockenem Zustand bezüglich des Gewichts der Lösung erhalten ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Degradation des Wachstumsfaktors die Folge wenigstens einer Degradation ist, welche Degradation(en) eine thermische Degradation, die insbesondere bei physiologischer Temperatur oder durch Exponierung an Wärme und/oder eine enzymatischen Degradation, insbesondere durch Cathepsin G umfaßt (umfassen).
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz verwendet wird, um die Proliferation von Zellen der Haut zu stimulieren, insbesondere die Proliferation der Fibroblasten und/oder der Melanozyten, und/oder die Synthese wenigstens einer Matrixkomponente zu erhöhen, insbesondere wenigstens eines Collagen-Typs, und/oder wenigstens eines spezifischen Proteins der Mikrofibrillen wie Fibrillin 1 oder Fibrillin 2 und/oder Fibulin 3 oder Fibulin 5 und/oder wenigstens eines Glykosaminoglykans, insbesondere eines sulfatierten Glykosaminoglykans.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz verwendet wird, um eine aus Restrukturierung der extrazellulären Matrix und insbesondere der Dermis durch die Restrukturierung der Dermis-Matrix, aus Hydratationsverbesserung der Haut aus Förderung der Hautausbesserung, aus Dermisintegritätserhaltung, aus Verbesserung der Epidermisdifferentiation, und aus Verstärkung der Epidermiserneuerung gewählte Pflege, sowie einer Kombinationen dieser Pflegen durchgeführt wird.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz verwendet wird, um gegen die Alterung der Haut zu kämpfen, insbesondere bei einem Menschen.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit einer wirksamen Konzentration für den Schutz des Wachstumsfaktors verwendet wird, insbesondere durch topische Anwendung oder durch orale Verabreichung, und insbesondere mit einer Konzentration zwischen 0,01 und 10 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine kosmetische, dermokosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere für den Menschen ist.
14. Verfahren zur Siebung einer potentiell aktiven Substanz zum Schutz von FGF-2, was seine Degradation beim Menschen angeht, wobei das Verfahren umfaßt: a) das Inkontaktbringen einer potentiell aktiven Substanz und von FGF-2 bei einer Temperatur von etwa 45°C während eines Zeitraums von etwa 2 h, b) die Auswahl der Substanzen, die FGF-2 gegen seine Degradation um wenigstens 50%, bevorzugt 65% schützen.
15. Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt ein wäßriger Extrakt, ein hydroalkoholischer Extrakt oder ein hydroglykolischer Extrakt des Samens von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette ist.
16. Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt eine Schutzwirkung des Wachstumsfaktors FGF-2 aufweist.
17. Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß er erhalten ist durch Mazerieren in Wasser oder einem Wasser-Alkohol-Gemisch von gemahlenen Samen von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette.
18. Extrakt von Hibiscus Abelmoschus oder Ambrette nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß er erhalten ist aus 1 bis 10% von Samen im trockenen Zustand im Verhältnis zum Gewicht der gesamten Lösung.
19. Pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung, umfassend einen Extrakt nach einem der Ansprüche 15 bis 18.
20. Pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine topische Anwendung oder eine orale Verabreichung vorgesehen ist.
21. Pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt in einer Konzentration vorliegt, die zwischen 0,001 und 20 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung, vorzugsweise zwischen 0,01 und 10 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung liegt.

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