Hintergrund der Erfindung
(a) Bereich der Erfindung
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung der Hautalterung, welche Paeoniflorin enthält, welches als aktiver Bestandteil zum bedeutsamen Hemmen und Verbessern der inneren Hautalterung, zum bedeutsamen Hemmen und Verbessern von DNA-Schädigung und durch UV-Strahlen verursachter Hautfaltenbildung und zum Verbessern von existierenden Falten wirksam ist.
(b) Beschreibung der verwandten Technik
[0002] Die menschliche Haut ist ein wichtiges Gewebe, welches als Barriere wirkt zum Schützen des menschlichen Körpers von der äusseren Umwelt. Menschen machen im Leben eine Hautalterung durch. Die Hautalterung kann als innere Alterung und als Photoalterung klassifiziert werden. Die innere Alterung wird durch innere, typischerweise genetische Faktoren des Körpers verursacht.
Diese kennzeichnet sich durch Falten und ausgedehnte Haut. Die Photoalterung wird durch wiederholte Einwirkung von UV-Strahlen gemeinsam mit der inneren Alterung verursacht. Eine an UV-Strahlen ausgesetzte Haut wird spröde, tief und dick gefaltet und weist unregelmässige Hyperpigmentation, Ausdehnung der Blutgefässe, Störung der Hornbildung, anormales Wachstum der Hornschicht, Veränderung der elastischen Fasern der Dermis und Akkumulation von Abbauprodukten auf. Im Weiteren beschleunigen UV-Strahlen die Zersetzung des Kollagens und anderer elastischen Proteinen in der Dermis, welche die Hautschäden verschlimmern und in schwerwiegenden Fällen zu Hautkrebs führen. Zusätzlich verursachen UV-Strahlen Falten, unelastische Haut, trockene Haut, Verminderung des Hautglanzes, spröde Haut, Fleckchen, Kapillarrisse, Hautverfärbung etc. (J.
Pathol., 1997, 180; 80-89).
[0003] Die Hautalterung wird von folgenden Veränderungen begleitet. Die Verbindung der alternden Haut zur Dermis wird gespannt. Das Stratum granulosum und das Stratum spinosum werden dünn. Der Kollagen- und Elasthingehalt vermindert sich. Die Anordnung der Zellschichten wird chaotisch. Die Anzahl von Melanozyten, Langerhans'schen Zellen und Mastzellen vermindert sich. Diese Phänomene können durch Beobachten der Zellhistologie (Optisches Mikroskop: OM, Elektronenmikroskop: EM, Aging skin, herausgegeben von J.L. Leveque & P.G. Agache, 1993, NY) bestätigt werden. Im Weiteren erfährt alternde Haut gewisse Musteränderungen in der Biochemie, Enzymhistologie etc.
Insbesondere vermindert sich die enzymatische Stoffwechselaktivität der Haut, die Aktivität der oxidationsreduzierenden Enzymsysteme wird geschwächt (SOD, GSH-Px) und oxidationsgeschädigte Produkte (MDA, freie Radikale etc.) erhöhen sich. Diese bestätigen solche Alterungstheorien als falsche Katastrophentheorie und freie Radikaltheorie.
[0004] Bisher konzentrierte sich die Forschung der Hautalterung hauptsächlich auf die Photoalterung, und die Forschung bezüglich der inneren Alterung war ungenügend. Die Anti-UV-Strahlen, welche entwickelt worden sind, um der Photoalterung vorzubeugen, stellen viele Probleme dar, zum Beispiel den Stabilitätsmangel.
[0005] Paeoniflorin (C23H28O11; M.W. 480.45) ist einer der Hauptbestandteile der Wurzel der Peonie-Familie. Es ist eine farblose kristalline Substanz und wird auch Peonie Saponin genannt.
Es ist für seine Wirksamkeit zum Ausdehnen von Blutgefässen, Bekämpfen von Entzündungen und Überempfindlichkeit und Fördern der Immunaktivität bekannt.
[0006] Die koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2005-0 017 066 beschrieb eine Zusammensetzung zur Hautpflege enthaltend Resveratrol, welches von der Peonie abgeleitet ist. Die koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2003-0 004 486 beschrieb eine kosmetische Zusammensetzung zum Vorbeugen der Alterung, die einen Extrakt der Peonierinde und einen Seidenbaumextrakt enthält. Die koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2002-0 044 266 beschrieb eine kosmetische Zusammensetzung zum Hautschutz, welche einen zusammengesetzten Kräuterextrakt aus weisser Peonie etc. enthält.
Es wurde jedoch bisher keine Forschung bezüglich der Wirkung von Paeoniflorin auf die Vorbeugung der Hautalterung und deren Verbesserung ausgeführt.
Zusammenfassung der Erfindung
[0007] Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Vorlegen eines Mittels zur Behandlung der Hautalterung, welche Paeoniflorin umfasst, welches fähig ist, als aktiver Bestandteil sicher und wirksam die Hautalterung zu verbessern.
[0008] Ein anderes Ziel der Erfindung ist das Vorlegen einer kosmetischen Zusammensetzung und/ oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche Paeoniflorin als aktiven Bestandteil enthält.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungen
[0009] Um diese Ziele zu erreichen, beschreibt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Behandlung der Hautalterung,
welche Paeoniflorin als aktiven Bestandteil enthält.
[0010] Die Erfindung betrifft ebenfalls eine kosmetische Zusammensetzung zum Vorbeugen der Hautalterung, welche 0.001-10.0 Gew.-% Paeoniflorin, bezogen auf das Trockengewicht, enthält.
[0011] Die Erfindung betrifft im Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Vorbeugen der Hautalterung, welche 0.001-10.0 Gew.-% Paeoniflorin, bezogen auf das Trockengewicht, enthält.
[0012] Da Paeoniflorin die Aktivität und die Leistungsfähigkeit der Hautzellen verbessert, die Synthese von Kollagenfasern vereinfacht und somit zur Festigkeit und Dehnbarkeit des Hautgewebes beiträgt, die Produktion von Lipidperoxiden vermindert und somit innere Hautalterung bedeutend verhindert, DNA-Schädigung und durch UV-Strahlen verursachter Hautfaltung vorbeugt und wirksam existierende Falten verbessert, kann eine kosmetische Zusammensetzung,
welche Paeoniflorin enthält, ein sehr wirksames Mittel zur Behandlung der Hautalterung sein.
[0013] Im Weiteren wird die vorliegende Erfindung detailliert beschrieben.
[0014] Die vorliegenden Erfinder haben diese Erfindung noch vervollständigt durch das Entdecken, dass Paeoniflorin, welches für den menschlichen Körper sicher ist, nicht nur innere Hautalterung, sondern auch durch UV-Strahlen verursachte Photoalterung der Haut vorbeugt und verbessert.
[0015] Wenn Paeoniflorin in Form einer Salbe oder Lotion für externe Applikation auf die Haut einer haarlosen Maus aufgetragen wird, verbessert es die Aktivität und die Leistungsfähigkeit der Hautzellen, fördert die Synthese von Kollagenfasern, womit es zur Festigkeit und Dehnbarkeit des Hautgewebes beiträgt, vermindert die Produktion von Lipidperoxiden, womit es die innere Hautalterung bedeutsam verhindert,
bewirkt das bedeutsame Vorbeugen von DNA-Schädigung und durch UV-Strahlen verursachte Hautfaltung und das wirksame Verbessern von existierenden Falten. Es ist auch sicher und weist keine Nebenwirkungen auf.
[0016] Paeoniflorin kann durch jegliche bekannte Methode erworben oder gereinigt und abgetrennt werden. In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wurde Paeoniflorin direkt aus der Wurzel der chinesischen Peonie isoliert.
Der Reinigungsvorgang von Paeoniflorin umfasst die Stufen: (a) Zufügen von 1-10 äquivalenten Volumen Ethanol oder einer 50-95% wässrigen Ethanol-Lösung zur Wurzel der chinesischen Peonie (Paeonia lactiflora Pallas) für die Extraktion; (b) Konzentrieren des Extrakts, Entfernen des verbleibenden Ethanols und Zufügen von Wasser in dieser Menge; (c) Zufügen von Ethylether in gleichem Volumen zur resultierenden Suspension zur Phasentrennung und Abtrennen der Wasserschicht; (d) Konzentrieren der Wasserschicht, Giessen in eine Silicagel-Kolonne und Ausführen einer Chromatographie mit einer Mischung von Chloroform und Aceton;
(e) Giessen des Elutionsmittels in eine octadecylsilylierte Silicagel Kolonne und das Ausführen einer Chromatographie mit einer Mischung von Trifluoressigsäure und Methanol; und (f) Abtrennen des Elutionsmittels und Ausführen einer Destillation unter reduziertem Druck, um Paeoniflorin zu erhalten. Dieser Vorgang kann durch den Fachmann leicht ausgeführt werden. Eine teilweise Veränderung oder Substitution darin gehört in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
[0017] Das Mittel zur Behandlung der Hautalterung gemäss der vorliegenden Erfindung kann Paeoniflorin alleine enthalten. Abhängig von der Zubereitungsform und der Applikationsmethode kann es jedoch ein weiteres pharmazeutisch erhältliches Excipients enthalten. In diesem Fall ist das Paeoniflorin in 0.001-10.0 Gew.-%, vorzugsweise in 0.01-1.0 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht, enthalten.
Wenn der Gehalt des aktiven Bestandteils unter 0.001 Gew.-% liegt, kann kein offensichtlicher Schutz gegen Hautalterung oder eine Verbesserungswirkung erwartet werden. Andernfalls, wenn es mehr als 10.0 Gew.-% enthält, wird die Wirkung nicht erhöht trotz dem erhöhten Gehalt, so dass dies unökonomisch sein kann. Wie auch immer, es ist wünschenswert, den Gehalt des aktiven Bestandteils abhängig von der Applikationsmethode und dem Zweck der Verwendung des Mittels zur Behandlung der Hautalterung anzupassen. Das pharmazeutische erhältliche Excipients kann Glycerin, Stärke, Laktose, Wasser, ein Alkohol, Propylenglykol, Salizylsäure, Dihydroessigsäure oder/und physiologische Salze sein, ist jedoch nicht auf diese limitiert.
[0018] Das Mittel zur Behandlung der Hautalterung der vorliegenden Erfindung kann oral oder nicht oral verabreicht werden.
Vorzugsweise wird sie nicht oral verabreicht, beispielsweise perkutan. Es wird in einer geeigneten Zubereitungsform zubereitet, je nachdem wie es verabreicht werden soll. Beispielsweise kann es in Pflaster, Granulaten, Lotionen, Puder, Sirupe, Flüssigkeiten oder Lösungen, Aerosol, Salben, flüssige Extrakte, Emulsionen, Suspensionen, Infusionen, Tabletten, Spritzen, Kapseln, Pillen etc., vorbereitet werden, ist jedoch nicht auf diese limitiert.
[0019] Vorzugsweise ist die Verabreichungsdosis des Mittels zur Behandlung der Hautalterung der vorliegenden Erfindung unter Berücksichtigung des Zwecks der Verwendung, des Körperteils, auf welchem es angewendet werden soll, der Verabreichungsmethode, des Alters, Geschlechts und der körperlichen Bedingungen des Patienten, der Aufnahmefähigkeit des aktiven Bestandteils im Körper, der Proportion der Inaktivität,
der kompatiblen Medikamente, und so weiter, festgesetzt. Zum Beispiel, eine Dosis von 0.01 mg/kg (Körpergewicht) bis 500 mg/kg (Körpergewicht), bezogen auf den aktiven Bestandteil, kann pro Tag verabreicht werden.
[0020] Das Mittel zur Behandlung der Hautalterung der vorliegenden Erfindung kann auch als kosmetische Zusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden. Auf diese Weise legt die vorliegende Erfindung eine kosmetische Zusammensetzung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Vorbeugen der Hautalterung vor, welche Paeoniflorin als aktiven Bestandteil enthält.
[0021] Die kosmetische Zusammensetzung oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann 0.001-10.0 Gew.-%, vorzugsweise 0.01-1.0 Gew.-% Paeoniflorin, bezogen auf das Trockengewicht, enthalten.
Wie auch immer, es ist wünschenswert, den Gehalt entsprechend der Zubereitungsform oder dem Gehalt der anderen Bestandteile anzupassen. Wenn der Gehalt an Paeoniflorin in der kosmetischen Zusammensetzung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung unter 0.001% liegt, ist es schwierig, eine praktische Vorbeugung oder Verbesserung der Hautalterung zu erwarten. Andernfalls, wenn es mehr als 10.0 Gew.-% enthält, ist die Menge an Paeoniflorin überhöht bezüglich seiner Wirkung und somit unökonomisch. Die kosmetische Zusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung kann herkömmliche kosmetische Bestandteile oder jegliche pharmazeutisch erhältliche Bestandteile enthalten, wie beispielsweise ein Excipients, ein Verdünnungsmittel etc., zusätzlich zum Paeoniflorin.
Zum Beispiel kann es Diethylsebakat, Spermaceti, Vaseline, Polyoxyethylenoleyl Etherphosphat, Natriumbenzoat, Stearinsäure, Cetanol, Sorbitan Monostearat, Mineralöl, Triocatnoat, Triethanolamin, Carbomer, Glycerin, Propylenglykol, gereinigtes Wasser, Ethanol, Polyoxyethylen-gehärtetes Rizinusöl, Methyl-p-oxybenzoat, 1,3-Butylenglykol, Natriumhyaluronat etc. enthalten.
[0022] Die kosmetische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden für Basiskosmetik, Make-up-Kosmetik, Körperkosmetik, Haarkosmetik, Kopfhautkosmetik, Rasierkosmetik oder Mundkosmetik. Beispiele für die Basiskosmetik sind Creme, Essenz, Packung, Massagecreme, Emulsion etc. Beispiele für Make-up-Kosmetik sind Grundschminke, Make-up-Basis, Lippenstift, Lidschatten, Eyeliner, Maskara, Augenbrauenstift etc.
Beispiele für Körperkosmetik sind Seife, Flüssigreiniger, Badzubereitung, Sonnenschutzcreme, Sonnenöl etc. Beispiele für Haarkosmetik sind Haarwaschmittel, Spülung, Haarbehandlung, Haarschaum, Haarflüssigkeit, Pomade, Haarfärbemittel, Haarbleicher, Farbspülung etc. Beispiele für Kopfhautkosmetik sind Haartonikum, Kopfhautbehandlung etc. Beispiele für Rasierkosmetik sind Aftershave Lotion, Rasiercreme etc. Beispiele für Mundkosmetik sind Zahnpasta, Mundspülung etc.
[0023] Im Weiteren wird die vorliegende Erfindung detailliert beschrieben mit Bezugnahme auf Beispiele.
Die folgenden Beispiele dienen jedoch nur zum Verständnis der vorliegenden Erfindung und limitieren die vorliegende Erfindung keinesfalls.
Beispiele
<Zubereitungsbeispiel 1> Abtrennen und Reinigen von Paeoniflorin
[0024] Die Wurzel der chinesischen Peonie (Paeonia lactiflora Pallas) wurde pulverisiert und 5 äquivalente Volumen eines Extraktions-Lösungsmittels, enthaltend 75% Ethanol und Wasser, wurden der pulverisierten Wurzel zugefügt. Die Extraktion wurde drei Mal durchgeführt, jeweils während 3 Stunden, und dann wurde der Extrakt konzentriert. Das übrige Ethanol wurde aus dem Konzentrat entfernt und Wasser in gleichem Volumen wurde zugefügt. Die Mischung wurde erwärmt, um sie aufzulösen. Anschliessend wurde Ethylether in gleichem Volumen zugefügt zum dreimaligen Abtrennen der Lösung. Die Wasserschicht wurde konzentriert.
Das Konzentrat wurde in einer 200-300 Maschensieb (mesh) Silicagel-Kolonne eingeführt. Eine mobile Phase enthaltend Chloroform und Aceton (4:1) wird zum Abtrennen des Konzentrats verwendet. Das Elutionsmittel wurde konzentriert und getrocknet. Das erhaltene trockene Produkt enthält ungefähr 70% Paeoniflorin. Es wurde in Wasser suspendiert und in eine 10 mm (Durchmesser) X 250 mm (Länge), 4 Microm Kolonne gefüllt mit octadecylsilyliertem Silicagel eingeführt. Eine Mischungslösung enthaltend 0.5% TFA (Trifluoressigsäure) und Methanol (Volumenproportion = 75 : 25) wurde als mobile Phase verwendet. Der Nachweis von Paeoniflorin wurde mit einem UV Detektor (230 nm) durchgeführt. Die mobile Phase wurde in einer Menge von 2.5 ml/Min. zugeführt. Die nach 18 und 20 Minuten nachgewiesene Hauptspitze wurde wiederholt abgetrennt.
Die erhaltene Abtrennung wurde unter vermindertem Druck destilliert, um Paeoniflorin zu erhalten.
[0025] Das erhaltene Paeoniflorin wurde mit einem LCQ Massenspektrometer (Finnigan, U.S.) und einem NMR Spektrometer (Bruker) analysiert.
[0026] Die folgende Tabelle 1 zeigt die Resultate der Massenanalyse und die folgende Tabelle 2 zeigt die Resultate der NMR Analyse. Die Struktur des Paeoniflorins wurde aus diesen Resultaten identifiziert (Formel 1, C23H28O11).
[Tabelle 1]
[0027]
<tb>Probe<sep>[M+Na]+<sep>Geschätztes
Molekulargewicht<sep>Bemerkungen
<tb>Paeoniflorin<sep>503<sep>480<sep>983 = [2M+Na]+
[Tabelle 2]
[0028]
<tb><sep>Klassifizierung<sep><1>H<sep><13>C
<tb>1<sep>Q<sep>-<sep>89.3
<tb>2<sep>CH2<sep>2.48, 1.95<sep>23.3
<tb>3<sep>CH<sep>2.59<sep>43.9
<tb>4<sep>Q<sep>-<sep>106.3
<tb>5<sep>CH2<sep>2.19, 1.82<sep>44.4
<tb>6<sep>Q<sep>-<sep>87.2
<tb>7<sep>Q<sep>-<sep>71.6
<tb>8<sep>CH3<sep>1.36<sep>19.6
<tb>10<sep>CH2<sep>1.64, 1.53<sep>102.2
<tb>12<sep>CH2<sep>1.51, 1.40<sep>62.8
<tb>1 ¾<sep>Q<sep>-<sep>131.1
<tb>2 ¾<sep>CH * 2<sep>8.04<sep>130.6
<tb>3 ¾<sep>CH * 2<sep>7.47<sep>129.6
<tb>4 ¾<sep>CH<sep>7.60<sep>134.4
<tb>1 ¾ ¾<sep>CH<sep>4.53<sep>100.1
<tb>2 ¾ ¾<sep>CH<sep>3.37-3.18<sep>77.8
<tb>3 ¾ ¾<sep>CH<sep>3.37-3.18<sep>77.9
<tb>4 ¾ ¾<sep>CH<sep>3.37-3.18<sep>72.1
<tb>5 ¾ ¾<sep>CH<sep>3.37-3.18<sep>74.9
<tb>6 ¾ ¾<sep>CH<sep>3.85, 3.61<sep>61.7
[0029]
<EMI ID=1.0>
[0030] Eine HPLC Analyse des erhaltenen Paeoniflorins weist einen Reinheitsgrad von mindestens 99% nach.
<Testbeispiel 1> Wirkung auf einen Fibroblasten
[0031] Die Wirkung von Paeoniflorin auf die Zellaktivität wurde getestet.
[0032] Keratinozyten und Fibroblasten befinden sich hauptsächlich in der Dermis und der Epidermis und spielen eine Rolle in Schlüsselfunktionen der Epidermis und der Dermis. Deshalb werden Keratinozyten und Fibroblasten als Testzellen in der Forschung der Zellen Physiotoxikologie und Anti-Alterung verwendet.
[0033] Hautgewebe wurde von einer 3 Tage oder weniger alten Rotmaus genommen. Hypodermisches Gewebe wurde entnommen und die Haut wurde mit 0.25% Trypsin während 12 Stunden behandelt. Die Haut wurde in Epidermis und Dermis getrennt.
Die Epidermis wurde zu 75% Konfluenz in einem Epidermis Nährboden (K-SFM) kultiviert. Die Dermis wurde weiter mit Trypsin bei 37 deg. C während 2 Stunden behandelt. Fibroblasten wurden aus der Dermis entnommen und zu 75% Konfluenz kultiviert in einem DMEM Nährboden, enthaltend 10% Serum.
[0034] Das im Zubereitungsbeispiel 1 hergestellte Paeoniflorin wurde in den kultivierten Keratinozyten und Fibroblasten aufgelöst und zu 0.0004 M behandelt. Die Zählung der Zellen wurde durch MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)] Analyse gemessen zur Ermittlung der Zellaktivität. Eine unbehandelte Gruppe und eine mit 0.002 M Vitamin C behandelte Gruppe wurden als Kontrollgruppen getestet. Die Wirkung von Paeoniflorin auf die Fibroblasten ist unten in Tabelle 3 angegeben.
[Tabelle 3]
[0035]
<tb><sep>Steigerung der Zellaktivität (%)
<tb>Unbehandelt<sep>0
<tb>0.0004 M Paeoniflorin<sep>25.7
<tb>0.002 M Vitamin C<sep>14.4Wie in Tabelle 3 ersichtlich, fördert Paeoniflorin die Zellproliferation der Fibroblasten bedeutsam.
<Testbeispiel 2> Vorbeugung von Hautzellabsterben und -alterung
[0036] Der Zustand des Zellwachstums und der Zelldivision wurde durch spezifisch angefärbte DNA-Zellen bestätigt.
[0037] beta -Gal ist ein Material für das spezifische Markieren von alternden Hautzellen. Junge Zellen und Zellen in der Ruhephase bleiben unberührt und nur die alten Zellen werden spezifisch gefärbt. Kultivierte Keratinozyten und Fibroblasten wurden jeweils mit einer minimalen Menge an X-Gal behandelt und verfärbt bei 37 deg. C während 24 Stunden. Alte Hautzellen wurden in 2-4 Stunden dunkelblau gefärbt und gaben das beste Resultat in 12-16 Stunden (siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 9363-7).
Anschliessend wurden die verfärbten Zellen (alte Zellen), lebenden Zellen und toten Zelle mit einem Flusszytometer gezählt. Die Resultate sind unten in Tabelle 4 angegeben. In Tabelle 4 bezieht sich "leer" auf die Kontrollgruppe, die keine Zellen enthält.
[Tabelle 4]
[0038]
<tb>Zellen<sep>Behandlung
(M)<sep>Zellwachstumsrate<sep>Zellabsterberate<sep>Zellalterungsrate
<tb>Keratinozyten<sep>Leer<sep>-<sep>-<sep>-
<tb>Paeoniflorin
0.0005 M<sep>55.3%<sep>12.3%<sep>24.7%
<tb>Vitamin E
0.0004 M<sep>23.3%<sep>10.5%<sep>20.1%
<tb>Fibroblasten<sep>Leer<sep>-<sep>-<sep>-
<tb>Paeoniflorin
0.0005 M<sep>18.4%<sep>11.5%<sep>17.2%
<tb>Vitamin E
0.0004 M<sep>9.96%<sep>15.4%<sep>22.8%
[0039] Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, wurde bestätigt, dass Paeoniflorin die Zellabsterberate und die Zellalterungsrate von Keratinozyten und Fibroblasten vermindert. Insbesondere wurde bestätigt, dass Paeoniflorin die Zellwachstumsrate stärker verbessert als Vitamin E. Dadurch wurde aufgezeigt, dass Paeoniflorin besser ist als Vitamin E zum Vorbeugen der Alterung der Hautzellen.
<Testbeispiel 3> Änderungen im Gehalt von Lipidperoxiden und Kollagen
[0040] Die Produktion von Lipidperoxiden und die Änderung des Kollagengehalts wurden für Tierhaut gemessen, um die Wirkung von Paeoniflorin auf die Hautalterung zu bestätigen.
1) Zubereitung einer Probe
[0041] 10 g Stearinsäure (C18H36O2), 70 ml Wasser und 20 ml Glycerol, jedes auf 80 deg. C erwärmt, wurden homogen gemischt.
Nach ungefähr 1 Minute Rühren wurden 3 (Gew.-Vol.)% Paeoniflorin oder Vitamin E (positive Kontrollgruppe) zugefügt. Nach Hinzufügen von 0.1 (Gew.-Vol.)% Methylparaben, wurde während 1 Minute gerührt. 1 ml KOH wurde langsam zugefügt. Nachdem eine erhebliche Emulgierung durchgeführt wurde, wurde gerührt, bis die Temperatur ungefähr 50 deg. C erreichte.
2) Testen
[0042] Guinea Schweine wurden in Gruppen geteilt, jede Gruppe umfasste 3 Männchen und 3 Weibchen. Eine Zone von 3 X 3 cm<2> wurde auf dem Rücken von jedem Guinea Schwein rasiert. Bei jedem Guinea Schwein wurde die linke Seite mit der oben zubereiteten Probe behandelt und die rechte Seite wurde behandelt wie eine negative Kontrollgruppe und eine positive Kontrollgruppe. Die Applikation wurde täglich um 8.00 Uhr und 16.00 Uhr angebracht.
Die Applikation wurde während 30 Tagen ausgeführt, mit jeweils ungefähr 5 mg/cm<2>. Am 31. Tag wurde Haut vom Rücken jedes Tieres entnommen. Subkutanes Fettgewebe wurde entfernt und der Gehalt an Kollagen und Lipidperoxid wurde mit einem Elektronenmikroskop und einem optischen Mikroskop gemessen.
3) Resultat
a) Beobachtung mit blossem Auge
[0043] Die mit der Probe behandelten Gruppen zeigten eine bedeutsame sichtbare Verbesserung, wie beispielsweise eine weiche und glänzende Haut. Die Wirkung war ausserordentlich im Vergleich mit der positiven mit Vitamin E behandelten Kontrollgruppe.
Im Gegensatz zeigten die leere Kontrollgruppe und die negative Kontrollgruppe, welche nicht mit Paeoniflorin behandelt wurden, keine sichtbare Verbesserung.
b) Historische Beobachtung - Kollagengehalt
[0044] Rückenhautgewebe wurde mit Paraffin durchtränkt und mit HE (Hämatoxylin - Eosin) gefärbt. Die Veränderung des Hautgewebes wurde beobachtet. Der Kollagengehalt der Haut wurde ermittelt durch Zugabe von 6 N Hydrochlorsäure zur Haut und Messen des HYP (Hydroxyprolin) Gehalts gemäss der Chloramin-T Oxidationsmethode.
[0045] Die Gruppe, auf welcher Paeoniflorin angewendet wurde, wies keine bedeutsame Veränderung der Epidermis auf, es wurde jedoch eine Erhöhung der kollagenen Faserbündel in der Dermis beobachtet. Die Tabelle 5 unten zeigt die Wirkung von Paeoniflorin auf die kollagenen Faserbündel in der Dermis.
Daraus ist ersichtlich, dass Paeoniflorin den Kollagengehalt in der Dermis erhöht und damit die Hautdehnbarkeit verbessert.
[Tabelle 5]
[0046]
<tb>Probe<sep>Erhöhung des Kollagengehalts
in der Dermis (%)<sep>Erhöhung der kollagenen
Faserbündel (%)
<tb>Leer<sep>-<sep>-
<tb>Paeoniflorin<sep>35.92*<sep>18.1*
<tb>Vitamin E<sep>29.86*<sep>10.4*
<tb>*im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, P < 0.05
[0047] Eine Ausdehnung des RER (raues Endoplasmatisches Retikulum) und ein Erhöhen der Mitochondrien wurden ebenfalls in der Dermis beobachtet, womit bestätigt wird, dass Paeoniflorin die Aktivität und Leistungsfähigkeit der Hautzellen verbessert.
c) Histologische Beobachtung - Lipidperoxidgehalt
[0048] SOD (Superoxid Dismutase) und GSH-Px (gesamte Glutathion-Peroxidase) sind wichtige Antioxidationsenzyme in lebenden Organismen. Sie spielen eine wichtige Rolle im gasförmigen Oxidations- und Antioxidationsgleichgewicht. Da sie antioxidative Wirkungen durch das Entfernen von freien Radikalen von Sauerstoff ergeben, kann die Aktivität von SOD und GSH-Px durch die Leistungsfähigkeit, die freien Radikale von Sauerstoff im Körper zu entfernen, interpretiert werden.
MDA (Malondialdehyd) ist eine Art von Lipidperoxiden.
[0049] MDA wurde unter Verwendung von Thiobarbotursäure ermittelt. Die Gehalte von GSH-Px und SOD wurden jeweils durch DNTB (5,5 ¾-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure) und die Nitratreduktionsmethoden gemessen. Die Resultate sind in Tabelle 6 unten gezeigt.
[Vergleich 1]
[0050] Gehalt = (Absorptionsvermögen der behandelten Gruppe Absorptionsvermögen der leeren Gruppe) / (Absorptionsvermögen der leeren Gruppe) X 100
[Tabelle 6]
[0051]
<tb>Probe<sep>MDA<sep>SOD<sep>GSH-Px
<tb>Leer<sep>-<sep>-<sep>-
<tb>Paeoniflorin<sep>29.57*<sep>8.58*<sep>29.51*
<tb>Vitamin E<sep>26.71*<sep>7.17*<sep>28.60*
[0052] Wie aus Tabelle 6 ersichtlich, verbessert Paeoniflorin die Aktivität von SOD und GSH-Px im Hautgewebe und hemmt die Produktion von Lipidperoxiden.
<Testbeispiel 4> Vorbeugen von durch UV-Strahlen verursachter DNA-Schädigung
[0053] Die Vorbeugungswirkung von Paeoniflorin, zubereitet im Zubereitungsbeispiel 1, auf durch UV-Strahlung verursachte DNA-Schädigung wurde für normale menschliche Hautkeratinozyten ermittelt.
[0054] Kultivierte normale menschliche Keratinozyten wurden während 12 Stunden mit Paeoniflorin in Konzentrationen behandelt. Der Nährboden wurde entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. 60 mJ UVB wurden gestrahlt und die DNA-Schädigung der Zellen wurde überprüft.
Wenn der DNA-Strang einen Bruch innerhalb des Zellkerns aufweist, so wird ein verlängerter Schweif zur positiven Elektrode während der Elektrophorese gezeigt. Somit können DNA-Schäden leicht durch Elektrophorese detektiert werden. Der Mittelwert des Schweifmoments von 50 wahllos ausgewählten Zellen wurde als Kontrollwert verwendet. Der Schweifmoment von mit Paeoniflorin behandelten Zellen wurde gemittelt. Der Kontrollwert und der resultierende Testwert wurden im Vergleich 2 unten verglichen, um die Vorbeugungswirkung von Paeoniflorin auf durch UV-Strahlen verursacht DNA-Schädigung zu berechnen.
[Vergleich 2]
[0055] Vorbeugungswirkung (%) = (Kontrollwert-Testwert) / (Kontrollwert) X 100
[Tabelle 7]
[0056]
<tb>Konzentration von Paeoniflorin<sep>Durchschnittlicher Schweifmoment
(n = 50)<sep>Vorbeugungswirkung (%)
<tb>Negative Kontrollgruppe<sep>0.790 +- 0.662<sep>-
<tb>UV-bestrahlte<sep>9.566 +- 2.828<sep>-
<tb>positive Kontrollgruppe<sep><sep>
<tb>0.0001%<sep>7.951 +- 1.887<sep>16.9
<tb>0.001%<sep>7.710 +- 2.161<sep>19.4
<tb>0.01%<sep>7.409 +- 2.395<sep>22.6
<tb>0.1%<sep>7.320 +- 2.534<sep>23.5
[0057] Tabelle 7 zeigt die Vorbeugungswirkung von Paeoniflorin auf durch UV-Strahlen verursachte DNA-Schädigung. Paeoniflorin zeigt eine Vorbeugungswirkung auf DNA-Schädigung von mindestens 16.9% im Behandlungskonzentrationsbereich von 0.0001% bis 0.1%.
<Testbeispiel 5> Vorbeugung von durch UV-Strahlen verursachter DNA-Schädigung (in vivo)
[0058] Die Vorbeugung durch Paeoniflorin auf durch UV-Strahlen verursachte DNA-Schädigung wurde in Tierversuchen bestätigt.
[0059] Paeoniflorin, in 80% Ethanol gelöst, wurde auf den Rücken von haarlosen Mäusen aufgetragen. Nach 6 Tagen wurde 1 J UVB gestrahlt. Die Hautzellen wurden entnommen und die DNA-Schädigung wurde gemessen.
Die Resultate sind in der Tabelle 8 unten angegeben.
[Tabelle 8]
[0060]
<tb>Konzentration von Paeoniflorin<sep>Durchschnittlicher Schweifmoment
(n =50)<sep>Vorbeugungswirkung (%)
<tb>Negative<sep>2.752 +- 2.720<sep>-
<tb>Negative Kontrollgruppe<sep>2.752 +- 2.720<sep>-
<tb>UV-bestrahlte positive Kontrollgruppe<sep>25.348 +- 6.049<sep>-
<tb>1%<sep>18.363 +- 5.463<sep>27.5
<tb>0.1%<sep>18.930 +- 5.969<sep>25.3
<tb>0.01%<sep>14.968 +- 5.883<sep>40.9
[0061] Wie aus Tabelle 8 ersichtlich, erhöht sich die Vorbeugungswirkung auf DNA-Schädigung mit der Erhöhung der Konzentration von Paeoniflorin. In Tierversuchen kann das Resultat jedoch möglicherweise nicht proportional zur Konzentration oberhalb einer gewissen Konzentration sein. Obwohl die Vorbeugungswirkung bis zu 0.01% proportional war, kann dies möglicherweise über 0.01% nicht der Fall sein.
[0062] Es wurde in den Tierversuchen bestätigt, dass Paeoniflorin wirksam DNA-Schädigung vorbeugt, welche durch UV-Strahlen verursacht wurden.
Dies beinhaltet, dass Paeoniflorin eine starke Vorbeugungswirkung auf DNA-Schädigung in lebenden Tieren sowie in kultivierten Zellen zeigen kann.
<Testbeispiel 6> Vorbeugung von durch UV-Strahlen verursachten Falten
[0063] Die Vorbeugungswirkung von wie im Zubereitungsbeispiel 1 zubereitetes Paeoniflorin auf durch UV-Strahlen verursachte Falten wurde wie folgt auf wurden auf haarlose Mäuse mit einem Solarstimulator bei 2MED (Minimale Erythema Dosis) gestrahlt. Die Bestrahlung wurde während 3 Tagen pro Woche, während 12 Wochen ausgeführt. Von der Gesamtmenge der 10 Mäuse wurde 0.2% Paeoniflorin, gelöst in 1,3-Butylenglykol, an die Probe -Behandlungsgruppe verabreicht und nur 1,3-Butylenglykol wurde der Kontrollgruppe verabreicht. Die Falten jeder Gruppe wurden 12 Wochen später verglichen.
Die Auswertung wurde mit drei Bewertungen ausgeführt: nicht verbessert im Vergleich zur Kontrollgruppe, leicht verbessert und bedeutsam verbessert. Die Resultate sind unten in Tabelle 9 gezeigt.
[Tabelle 9]
[0064]
<tb>Probe<sep>Nicht verbessert<sep>Leicht verbessert<sep>Bedeutsam verbessert
<tb>Kontrollgruppe<sep>9<sep>1<sep>0
<tb>Paeoniflorin (0.2%)<sep>0<sep>4<sep>6
[0065] Es wurde bestätigt, dass Paeoniflorin wirksam vor durch UV-Strahlen verursachter Faltung der Haut von lebenden haarlosen Mäusen vorbeugt.
<Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1> Zubereitung einer Hautsalbe
[0066] Eine Hautsalbe enthaltend Paeoniflorin wurde wie in Tabelle 10 zubereitet.
[Tabelle 10
[0067]
<tb>Zusammensetzung<sep>Gehalt (Gew.-%)
<tb><sep>Beispiel 1<sep>Vergleichsbeispiel 1
<tb>Paeoniflorin<sep>1.0<sep>-
<tb>Diethylsebakat<sep>8<sep>8
<tb>Spermaceti<sep>5<sep>5
<tb>Polyoxyethyleneoleyl<sep>6<sep>6
<tb>Etherphosphat <sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Natriumbenzoat<sep>bis 100<sep>bis 100
<tb>Vaseline<sep><sep>
<Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2> Zubereitung einer Creme
[0068] Eine kosmetische Creme enthaltend Paeoniflorin wurde wie in Tabelle 11 zubereitet.
Tabelle 11]
[0069]
<tb>Zusammensetzung<sep>Gehalt (Gew.-%)<sep>
<tb><sep>Beispiel 2<sep>Vergleichsbeispiel 2
<tb>Paeoniflorin<sep>0.5<sep>-
<tb>Stearinsäure<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Cetanol<sep>2.0<sep>2.0
<tb>PEG-20<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Sorbitanmonostearat<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Mineralöl<sep>10.0<sep>10.0
<tb>Triocatnoat<sep>5.0<sep>5.0
<tb>Triethanolamin<sep>0.5<sep>0.5
<tb>Carbomer<sep>0.2<sep>0.2
<tb>Glycerin<sep>5.0<sep>5.0
<tb>Propylenglykol<sep>3.0<sep>3.0
<tb>Antiseptikum<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Aroma<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Gereinigtes Wasser<sep>bis 100<sep>bis 100
<Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 3> Zubereitung einer pastösen Essenz
[0070] Eine pastöse Essenz enthaltend Paeoniflorin wurde wie in Tabelle 12 zubereitet.
[Tabelle 12]
[0071]
<tb>Zusammensetzung<sep>Gehalt (Gew.-%)
<tb><sep>Beispiel 3<sep>Vergleichsbeispiel 3
<tb>Paeoniflorin<sep>0.2<sep>-
<tb>Ethanol<sep>10.0<sep>10.0
<tb>Polyoxyethylen-gehärtetes<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Rizinusöl<sep><sep>
<tb>Methyl-p-oxybenzoat<sep>0.2<sep>0.2
<tb>Glycerin<sep>5.0<sep>5.0
<tb>1,3-Butylenglykol<sep>6.0<sep>6.0
<tb>Aroma<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Pigment<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Gereinigtes Wasser<sep>bis 100<sep>bis 100
<Beispiel 4 und Vergleichsbeispiel 4> Zubereitung einer Essenz
[0072] Eine Essenz enthaltend Paeoniflorin wurde wie in Tabelle 13 zubereitet.
[Tabelle 13]
[0073]
<tb>Zusammensetzung<sep>Gehalt (Gew.-%)
<tb><sep>Beispiel 4<sep>Vergleichsbeispiel 4
<tb>Paeoniflorin<sep>1<sep>-
<tb>Propylenglykol<sep>10.0<sep>10.0
<tb>Glycerin<sep>10.0<sep>10.0
<tb>Natrium Hyaluronat Lösung (1%)<sep>5.0<sep>15.0
<tb>Ethanol<sep>5.0<sep>5.0
<tb>Polyoxyethylen-gehärtetes<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Rizinusöl<sep><sep>
<tb>Methyl-p-oxybenzoat<sep>0.1<sep>0.1
<tb>Carbomer<sep>0.3<sep>0.3
<tb>Triethanolamin<sep>0.4<sep>0.4
<tb>Aroma<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Gereinigtes Wasser<sep>bis 100<sep>bis 100
<Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel 5> Zubereitung einer Packung
[0074] Eine Packung enthaltend Paeoniflorin wurde wie in Tabelle 14 zubereitet.
[Tabelle 14]
[0075]
<tb>Zusammensetzung<sep>Gehalt (Gew.-%)
<tb><sep>Beispiel 5<sep>Vergleichsbeispiel 5
<tb>Paeoniflorin<sep>0.3<sep>-
<tb>Glycerin<sep>5.0<sep>5.0
<tb>Propylenglykol<sep>4.0<sep>4.0
<tb>Polyvinylalkohol<sep>15.0<sep>15.0
<tb>Ethanol<sep>8.0<sep>8.0
<tb>Polyoxyethylen-gehärtet<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Rizinusöl<sep><sep>
<tb>Polyoxyethylen Ethyloleat<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Methyl-p-oxybenzoat<sep>0.2<sep>0.2
<tb>Aroma<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Pigment<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Gereinigtes Wasser<sep>bis 100<sep>bis 100
<Beispiel 6 und Vergleichsbeispiel 6> Zubereitung einer nährenden Essenz
[0076] Eine nährende Essenz enthaltend Paeoniflorin wurde wie in Tabelle 15 zubereitet.
[Tabelle 15]
[0077]
<tb>Zusammensetzung<sep>Gehalt (Gew.-%)
<tb><sep>Beispiel 6<sep>Vergleichsbeispiel 6
<tb>Paeoniflorin<sep>0.5<sep>-
<tb>Polyoxyethylen-gehärtetes<sep>1.0<sep>1.0
<tb>Rizinusöl<sep><sep>
<tb>Methyl-p-oxybenzoat<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Glycerin<sep>6.0<sep>6.0
<tb>1,3-Butyleneglykol<sep>5.0<sep>5.0
<tb>Carbomer<sep>0.2<sep>0.2
<tb>Triethanolamin<sep>0.3<sep>0.3
<tb>Propylenglykol<sep>5.0<sep>5.0
<tb>Ethanol<sep>3.2<sep>3.2
<tb>Carboxyvinylpolymer<sep>0.1<sep>0.1
<tb>Pigment<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Aroma<sep>adäquat<sep>adäquat
<tb>Gereinigtes Wasser<sep>bis 100<sep>bis 100
<Testbeispiel 7> Verbesserungswirkung auf die Faltung
[0078] Die Verbesserungswirkung auf die Faltung der Salben des Beispiels 1 und des Vergleichsbeispiels 1 und der Cremen des Beispiels 2 und des Vergleichbeispiels 2 wurde auf gesunden 35- bis 50-jährigen Frauen getestet.
[0079] 40 Frauen im Alter von 35 bis 50 Jahren wurden in zwei Gruppen von je 20 geteilt. In der ersten Gruppe wurde die Salbe des Beispiels 1 und des Vergleichbeispiels 1 auf der Hälfte jedes Gesichts aufgetragen. In der zweiten Gruppe wurden die Cremen des Beispiels 2 und des Vergleichbeispiels 2 auf der Hälfte jedes Gesichts aufgetragen. Die Applikation auf der linken oder rechten Seite des Gesichts wurde wahllos festgelegt. Weder die Forscher noch die Probandinnen wussten, welche Salbe oder Creme auf welcher Seite des Gesichts aufgetragen wurden.
Die Probandinnen haben die Testkosmetik während 8 Wochen, zweimal pro Tag nach der Gesichtswäsche aufgetragen.
[0080] 8 Wochen später wurde die Verbesserung der Faltung mit blossem Auge und mit Bildanalyse ausgewertet. Eine Verbesserung der Faltung und eine Verbesserung der Dehnbarkeit wurden mit blossem Auge beobachtet und als nicht verbessert, leicht verbessert oder bedeutsam verbessert beurteilt. Die Resultate sind in Tabelle 16 angegeben.
[Tabelle 16]
[0081]
<tb>Probe<sep>Nicht
verbessert<sep>Leicht
verbessert<sep>Bedeutsam
verbessert<sep>P
Wert
<tb>Vergleichsbeispiel 1<sep>13<sep>5<sep>2<sep>< 0.05
<tb>Beispiel 1<sep>4<sep>8<sep>8
<tb>Vergleichsbeispiel 2<sep>11<sep>6<sep>3<sep>< 0.05
<tb>Beispiel 2<sep>3<sep>8<sep>9
[0082] Eine Bildanalyse wurde ausgeführt durch den Vergleich von Bildern von Abdrucken, welche unter dem Auge vor und nach dem Test genommen wurden (Xantopren, Bayer). Die Dichte der Falten wurde mit 2-dimensionaler Bildanalyse gemessen. Die durchschnittliche Senkung der Faltendichte ist in Tabelle 17 angegeben.
[Tabelle 17]
[0083]
<tb>Probe<sep>Verminderung der Faltendichte (%)<sep>P Wert
<tb>Vergleichsbeispiel 1<sep>8%<sep>< 0.05
<tb>Beispiel 1<sep>43%
<tb>Vergleichsbeispiel 2<sep>7%<sep>< 0.05
<tb>Beispiel 2<sep>45%
[0084] Wie aus den Tabellen 16 und 17 ersichtlich ist, zeigen die Paeoniflorin enthaltende Salbe und kosmetische Creme eine Verbesserungswirkung der Faltung auf mindestens 16 von 20 Probandinnen in der Beobachtung mit blossem Auge. Sie zeigen eine erhöhte Wirkung der Faltenreduktion in der Bildanalyse ohne Nebenwirkungen. Auf diese Weise ist ersichtlich, dass Paeoniflorin hervorragend wirksam ist in der Verbesserung der Faltung, und gleichzeitig sicher ist.
[0085] Aus der obigen Beschreibung ist ersichtlich, dass Paeoniflorin die Aktivität und die Leistungsfähigkeit der Hautzellen erhöht und die Synthese von Kollagenfasern fördert, und somit zur Verbesserung der Festigkeit und der Dehnbarkeit des Hautgewebes beiträgt.
Im Weiteren reduziert es die Produktion von Lipidperoxiden, womit es der inneren Hautalterung bedeutsam vorbeugt, DNA-Schädigung und durch UV-Strahlen verursachter Hautfaltung bedeutsam vorbeugt und wirksam ist zum Verbessern von existierenden Falten. Folglich kann eine kosmetische Zusammensetzung, welche Paeoniflorin enthält, ein sehr nützliches Mittel zur Behandlung der Hautalterung werden.