JP6253220B2 - Apj活性化剤 - Google Patents
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Description
[1] オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスから成る群から選択される1又は複数の成分を含んで成るAPJ活性化剤。
[2] 皮膚に適用されることを特徴とする[1]に記載のAPJ活性化剤。
APJ発現細胞の培養
NIH3T3細胞にアペリン受容体APJを高発現させ、ハイグロマイシンで選択した安定株(大阪大学微生物病研究所高倉伸幸教授より供与)をcAMPルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクトし、これを以下のcAMPルシフェラーゼアッセイに用いた。培養は200 μg/mlのハイグロマイシンを含む10% FBS含有DMEM培地(Invirtogen)で行った。アッセイ前日に、96穴プレートに1ウェルあたり2.0×105個の細胞を播種し、10% FBSと200 μg/mlハイグロマイシンを含むDMEM培地で培養した。
一晩培養した後、培地をアスピレーターで除き、1ウェルあたり100 μlの添加剤を含まないDMEM培地に交換した。3時間後、GloSensorTM cAMP 試薬(Promega)を1ウェルあたり4 μlずつ添加し、遮光し2時間室温で平衡化した。その後、アペリン13(ペプチド研究所)を0.4 μg/mlとなるように添加剤を含まないDMEM培地で希釈し、これを1ウェルあたり50 μlずつ添加し(最終濃度は0.1 μg/ml)、室温で5 分間プレインキュベートした。更に、40 μMに調整したフォルスコリン(Sigma)を50 μlずつ添加し(最終濃度は10 μM)、15 分間処理した。その後、GloMaxTM 96 Microplate Luminometer(Promega)を用いて発光を測定した。また、上記と同様のルシフェラーゼアッセイを、アペリンと共にアペリン中和抗体である4G5(大阪大学より供与)を添加して行なった。この場合、5 μg/mlとなるように中和抗体を含まないDMEM培地で希釈し、1ウェルあたり50 μlずつ添加した(最終濃度0.5 μg/ml)。同様に、最終濃度が1.5、5、15及び50 μg/mlとなるような中和抗体を調製し、それぞれウェルに添加した。コントロールとして、アペリンを添加せずに、20 μMのフォルスコリンを1ウェルあたり100 μl添加した。
候補薬剤として、約250種の化粧品素材(株式会社資生堂)を用いて、実験1において確立したスクリーニング系によりアペリン様薬剤の選定を行った。
具体的には、候補薬剤を400 μg/mlに調製し、実験1のcAMPルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、1ウェルあたり50 μlずつ添加し(最終濃度100 μg/ml)、実験1と同様のアッセイを行った。
Claims (2)
- オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、及びウコンエキスから成る群から選択される1又は複数の成分を含んで成る、リンパ管機能を安定化するためのAPJ活性化剤。
- 皮膚に適用されることを特徴とする請求項1に記載のAPJ活性化剤。
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