JP5808769B2 - 皮下脂肪蓄積抑制剤 - Google Patents
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Description
ヒトは約60兆個の細胞から構成されているが、脂肪細胞の数は約300億個と推定されている。ヒトの脂肪細胞の平均直径は約60〜90ミクロンであり、白色脂肪組織の固定標本を観察しても、一様な大きさで単房性の脂肪滴をもつため、核は細胞膜に接触した形で平らに変形している。このような脂肪組織の形態は、肥満になると劇的に変化する。まず容易に観察されるのは、脂肪細胞サイズの増大である。肥満ヒトの場合、脂肪細胞は最大直径が140〜150ミクロンまでに肥大化する。この肥大化で体積が約3倍までになる(非特許文献1)。
[1] マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される1又は複数の成分を含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤。
[2] 皮膚に適用されることを特徴とする[1]に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤。
[3] [1]に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤を皮膚に適用することからなる、皮下脂肪の蓄積を解消又は予防するための美容学的方法。
[4] クロセチンを含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤。
[5] 経口摂取されることを特徴とする[4]に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤。
[6] マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される1又は複数の成分を含んで成るAPJ活性化剤。
[7] 皮膚に適用されることを特徴とする[6]に記載のAPJ活性化剤。
[8] クロセチンを含んで成るAPJ活性化剤。
[9] 経口摂取されることを特徴とする[8]に記載のAPJ活性化剤。
[10] APJ活性化剤からなる皮下脂肪蓄積抑制剤。
[11] APJ活性化剤からなる抗肥満剤。
[12] APJ活性化剤からなる抗浮腫剤。
APJ発現細胞の培養
NIH3T3細胞にアペリン受容体APJを高発現させ、ハイグロマイシンで選択した安定株(大阪大学微生物病研究所高倉伸幸教授より供与)をcAMPルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクトし、これを以下のcAMPルシフェラーゼアッセイに用いた。培養は200 μg/mlのハイグロマイシンを含む10% FBS含有DMEM培地(Invirtogen)で行った。アッセイ前日に、96穴プレートに1ウェルあたり2.0×105個の細胞を播種し、10% FBSと200 μg/mlハイグロマイシンを含むDMEM培地で培養した。
一晩培養した後、培地をアスピレーターで除き、1ウェルあたり100 μlの添加剤を含まないDMEM培地に交換した。3時間後、GloSensorTM cAMP 試薬(Promega)を1ウェルあたり4 μlずつ添加し、遮光し2時間室温で平衡化した。その後、アペリン13(ペプチド研究所)を0.4 μg/mlとなるように添加剤を含まないDMEM培地で希釈し、これを1ウェルあたり50 μlずつ添加し(最終濃度は0.1 μg/ml)、室温で5 分間プレインキュベートした。更に、40 μMに調整したフォルスコリン(Sigma)を50 μlずつ添加し(最終濃度は10 μM)、15 分間処理した。その後、GloMaxTM 96 Microplate Luminometer(Promega)を用いて発光を測定した。また、上記と同様のルシフェラーゼアッセイを、アペリンと共にアペリン中和抗体である4G5(大阪大学より供与)を添加して行なった。この場合、5 μg/mlとなるように中和抗体を含まないDMEM培地で希釈し、1ウェルあたり50 μlずつ添加した(最終濃度0.5 μg/ml)。同様に、最終濃度が1.5、5、15及び50 μg/mlとなるような中和抗体を調製し、それぞれウェルに添加した。コントロールとして、アペリンを添加せずに、20 μMのフォルスコリンを1ウェルあたり100 μl添加した。
候補薬剤として、約250種の化粧品素材(株式会社資生堂)を用いて、実験1において確立したスクリーニング系によりアペリン様薬剤の選定を行った。
具体的には、候補薬剤を400 μg/mlに調製し、実験1のcAMPルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、1ウェルあたり50 μlずつ添加し(最終濃度100 μg/ml)、実験1と同様のアッセイを行った。
リンパ管内皮細胞をフルオロブロックインサート(BDファルコン)に播種し、ポジティブコントロールとしてアペリン−13(ペプチド研究所)を最終濃度1000ng/ml、各薬剤を最終濃度0.1%となるようにEBM−2培地中に添加し、培養した。アペリン−13、及び各薬剤を添加した4時間後、10%緩衝ホルマリンにて細胞を固定した後、Hoechst33432(Molecular Probe)にて細胞核を染色した。その後、フルオロブロックインサートの下側のメンブレンに遊走した細胞数を計測した。結果を図3に示す。マツエキス及びキナエキスの添加により、アペリン−13で刺激した場合と同様、リンパ管内皮細胞の細胞遊走が促進されることが示され、マツエキス、キナエキスがAPJ受容体のリガンドとなるアペリン様の活性を持つことが示された。
サフランエキスの主成分であるクロセチンを用いて、実験1において確立したスクリーニング系によりアペリン様の活性を評価した。
具体的には、クロセチン(クロビットP:理研ビタミン(株))を800、400 μg/mlに調製し、実験1のcAMPルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、1ウェルあたり50 μlずつ添加し(最終濃度200、100 μg/ml)、実験1と同様のアッセイを行った。
図4に示されるとおり、クロセチンの添加により、cAMP濃度は濃度依存的に減少したことから、クロセチンは、リンパ管の安定化や脂肪蓄積の抑制といったアペリンと同様の機能を有する蓋然性が高いことが示された。
20代〜50代の被験者24人(男性11人、女性13人)により、クロセチンのむくみ改善効果を評価した。
むくみの評価は、各被験者の足(ふくらはぎまで)を一定量の水をはった水槽(水温約33℃、容量28kg)に入れ、溢れ出す水の体積により膝下体積を測定することによって行った。水量は、水槽の下に置いた計量器により毎回調整した。
上記評価系を用いて、1日目の朝(AM 10:00〜11:00)と夕方(PM 15:00〜16:30)に被験者の膝下体積を図り、変化率(%: 夕方の膝下体積 − 朝の膝下体積)を算出した。
2日目は、朝の膝下体積の測定後(AM 10:05〜11:05)、クロセチン(理研ビタミン株式会社)10mgを被験者に摂取させた。その後、夕方の膝下体積を図り、1日目と同様に変化率を算出した。
図5に示されるとおり、クロセチン摂取日(2日目)においては、未摂取日(1日目)と比較して、朝と夕方の膝下体積の変化率が有意に減少していることから、クロセチンの摂取によりむくみが改善されること解る。
30代の被験者3人(男性1人、女性2人)に、クロセチン(理研ビタミン株式会社)10mgを1日1回、13週間連続で摂取させた。
1週間おきに体重、体脂肪率、皮下脂肪率を体重体組成計(HBF-362、OMRON)を用いて測定し、摂取前からの変化量として算出した。なお、試験期間中の被験者の運動量及び食事量については特段の変化がないことを確認した。
図6〜8に示されるとおり、クロセチン摂取後の体重、体脂肪率、皮下脂肪率はいずれも摂取前と比較して有意に減少していることから、クロセチンの摂取により肥満が抑制されることが解る。
Claims (4)
- マツエキスを含んで成るAPJ活性化剤。
- リンパ管機能を正常化及び/又は安定化するための、請求項1に記載のAPJ活性化剤。
- 皮膚に適用されることを特徴とする請求項1又は2に記載のAPJ活性化剤。
- 浮腫を予防又は改善するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載のAPJ活性化剤。
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