WO2013146891A1 - 皮下脂肪蓄積抑制剤 - Google Patents

皮下脂肪蓄積抑制剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2013146891A1
WO2013146891A1 PCT/JP2013/059015 JP2013059015W WO2013146891A1 WO 2013146891 A1 WO2013146891 A1 WO 2013146891A1 JP 2013059015 W JP2013059015 W JP 2013059015W WO 2013146891 A1 WO2013146891 A1 WO 2013146891A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extract
apelin
subcutaneous fat
fat accumulation
apj
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/059015
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美加 澤根
健太朗 加治屋
Original Assignee
株式会社資生堂
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社資生堂 filed Critical 株式会社資生堂
Publication of WO2013146891A1 publication Critical patent/WO2013146891A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9755—Gymnosperms [Coniferophyta]
    • A61K8/9767—Pinaceae [Pine family], e.g. pine or cedar
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/13—Coniferophyta (gymnosperms)
    • A61K36/15—Pinaceae (Pine family), e.g. pine or cedar
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/30—Boraginaceae (Borage family), e.g. comfrey, lungwort or forget-me-not
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/74—Rubiaceae (Madder family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9794—Liliopsida [monocotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis

Definitions

  • the present invention relates to a subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising one or more components selected from the group consisting of pine extract, saffron extract, kina extract and comfrey extract, and an APJ activator comprising these components, Relates to a subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising crocetin and an APJ activator comprising the component.
  • fat cells are enlarged by an increase in size, and the number of fat cells is increased by the appearance of new fat cells. That is, obesity, which is an excess state of adipose tissue, is caused by both hypertrophy of individual adipocytes and increase in the number of adipocytes (hyperplasia).
  • Humans are composed of about 60 trillion cells, but the number of fat cells is estimated to be about 30 billion.
  • the average diameter of human adipocytes is approximately 60-90 microns, and even when a fixed specimen of white adipose tissue is observed, the nucleus is in contact with the cell membrane because it has uniform uniphasic lipid droplets. It is deformed flat in shape.
  • adipocyte size In obese humans, adipocytes enlarge to a maximum diameter of 140-150 microns. This enlargement increases the volume to about 3 times (Non-patent Document 1).
  • Obesity includes built-in fat type obesity and subcutaneous fat type obesity, both of which have the risk of leading to various diseases ranging from mild to severe, including hypertension, and are one of the symptoms that modern people suffer. .
  • Non-patent Document 2 mice with dilated lymphatic vessels and lymphatic dysfunction exhibit an obese phenotype, and the subcutaneous fat layer is significantly thicker than normal.
  • Apellin was extracted from bovine stomach cells in 1998 as a binding factor to APJ (also known as AGTRL1: Angiotensin receptor like 1), a seven-transmembrane G protein-coupled receptor that has long been an orphan receptor.
  • Human apelin has been reported to be expressed in various sites such as heart, lung, kidney, fat, stomach, brain, adrenal gland, and endothelium, and is a ligand of 36 amino acid apelin APJ receptor derived from 77 amino acid precursor protein.
  • Non-patent Document 3 The apelin cDNA ⁇ ⁇ ⁇ encodes 77 amino acids, but this precursor forms a long form (42-77 amino acids) and a short form (65-77 amino acids).
  • APJ is known to induce APJ activation. So far, APJ expression has been reported in the cardiovascular system and central nervous system, suggesting that it is involved in the regulation mechanism of body fluids, such as controlling myocardial contraction in the heart and vasopressin expression in the nervous system. It is coming. APJ is also a receptor that is attracting a lot of attention as a target for drug discovery from various viewpoints because it is involved in infection as a receptor for AIDS virus. APJ expression is expressed in vascular endothelial cells and mural cells in the vascular system, and the apelin / APJ system plays an essential role in vascular development in Xenopus gene knockdown experiments.
  • Non-patent Document 4 since the expression of this receptor is also observed in endothelial cells in mice and humans, it has been predicted to be involved in angiogenesis in mammals (Non-patent Document 4). In addition, it has been reported that apelin secreted when vascular endothelial cells are stimulated with Ang1 controls the diameter of blood vessels through analysis of apelin knockout mice and in vitro vasculature analysis (non-patent literature). 5). Furthermore, in recent years, it has become clear that apelin stabilizes the function of skin lymphatic vessels and suppresses the accumulation of subcutaneous fat (Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a novel drug effective for suppressing the accumulation of subcutaneous fat, or a novel drug that activates APJ, which is an apelin receptor.
  • APJ which is an apelin receptor
  • LEC human lymphatic endothelial cells
  • an apelin-like drug that is, a pine extract, a drug having the same function as apelin, Saffron extract, kina extract and comfrey extract, and crocetin, which is the main component of saffron extract, were selected.
  • this application encompasses the following inventions: [1] A subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising one or more components selected from the group consisting of pine extract, saffron extract, kina extract and comfrey extract. [2] The subcutaneous fat accumulation inhibitor according to [1], which is applied to skin. [3] A cosmetic method for eliminating or preventing subcutaneous fat accumulation, comprising applying the subcutaneous fat accumulation inhibitor according to [1] to the skin. [4] A subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising crocetin. [5] The subcutaneous fat accumulation inhibitor according to [4], which is taken orally. [6] An APJ activator comprising one or more components selected from the group consisting of pine extract, saffron extract, kina extract and comfrey extract.
  • APJ activator [7] The APJ activator according to [6], which is applied to skin. [8] An APJ activator comprising crocetin. [9] The APJ activator according to [8], which is taken orally. [10] A subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising an APJ activator. [11] An anti-obesity agent comprising an APJ activator. [12] An anti-edema agent comprising an APJ activator.
  • subcutaneous fat accumulation inhibitor or APJ activator By applying the subcutaneous fat accumulation inhibitor or APJ activator according to the present invention, it is possible to prevent or eliminate subcutaneous fat accumulation caused by destabilization of the structure of lymphatic vessels.
  • the APJ receptor is also referred to as AGTRL1 (angiotensin receptor-like 1), and is one of G protein-coupled receptors (GPCR) and consists of 380 amino acids. This transmembrane region shows 40-50% homology with the angiotensin (AT1) receptor.
  • the APJ receptor is coupled to a heterotrimeric G protein consisting of an ⁇ subunit (approximately 40-50 kDa), a ⁇ subunit (approximately 35 kDa), and a ⁇ subunit (approximately 10 kDa). Is known to be related to When the APJ receptor is not activated, the ⁇ , ⁇ , and ⁇ subunits are strongly bound.
  • APJ receptor is activated by the binding of apelin to the APJ receptor.
  • the exchange reaction between bound GDP and GTP occurs, and dissociates into GTP-bound ⁇ subunit and ⁇ subunit.
  • These subunits activate each target protein / enzyme and transmit a signal downstream.
  • GTP bound to the ⁇ subunit is decomposed by the GTPase activity of the ⁇ subunit to become GDP, and the GDP-bound ⁇ subunit binds to the ⁇ subunit to form an inactive trimer again.
  • Trimeric G proteins are classified into subfamilies such as Gs, Gi, Go, Gq, Gt, Golf, etc., based on the function of the ⁇ subunit and genetic differences.
  • Gs and Gi each increase or suppress the activity of adenylate cyclase
  • Go is involved in the signal transduction system of nerve tissue
  • Gq activates phospholipase C ⁇
  • Gt and Golf are photoreceptor cells (retina) and odor cells, respectively. Plays an important role in the signal transduction system.
  • the APJ receptor binds to apelin, the activity of adenylate cyclase is suppressed via the Gi pathway, resulting in a decrease in intracellular cAMP concentration.
  • the present inventor has established a screening method for an apelin-like drug using the apelin / APJ signal system. Specifically, screening for an apelin-like drug is performed by first seeding an isolated cell (for example, NIH-3T3 cell) transfected with a cAMP luciferase reporter vector in a 96-well plate as a primary screening, and then a candidate drug. After preincubation and activation of adenylate cyclase with forskolin, luminescence of luciferase was measured with a luminometer (for example, GloMax TM 96 Microplate Luminometer (Promega)), cAMP concentration with forskolin Select drugs that suppress the increase in concentration.
  • a luminometer for example, GloMax TM 96 Microplate Luminometer (Promega)
  • the drug selected in the primary screening and an apelin neutralizing antibody for example, 4G5 are combined.
  • an apelin neutralizing antibody for example, 4G5
  • a luciferase assay similar to the primary screening is performed.
  • the present inventor by the above screening method, pine extract, saffron extract, kina extract and comfrey extract activate APJ, which is an apelin receptor, and thus has a very high probability of having the same function as apelin. I got the knowledge. Accordingly, the present invention provides an APJ activator comprising one or more ingredients selected from the group consisting of pine extract, saffron extract, kina extract and comfrey extract.
  • the present inventor has found a surprising finding that apelin exhibits an action to suppress subcutaneous fat accumulation through normalization and stabilization of lymphatic vessel function. Accordingly, the present invention provides, in particular, a subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising one or more components selected from the group consisting of pine extract, saffron extract, kina extract and comfrey extract.
  • Pine extract is widely distributed in Siberia, Europe and Asia, and is also found in common vegetation in Japan.
  • An extract derived from a plant, and the root, leaves, bark, cones, whole plant, preferably bark, cones of the plant can be used as raw materials.
  • Pine extract contains polysaccharides and amino acids as components and is known to have a moisturizing action and a softening action.
  • Saffron extract is an extract derived from saffron (Crocus sativus L.), a perennial plant of the Iridaceae native to the Mediterranean coast and Asia Minor, and bulbs, roots, leaves, stems, flowers, styles, plants of the plant The whole, preferably the style, can be used as raw material. It is known that saffron extract contains carotenoid glycoside crocin, picrocrocin, crocetin and the like as components, and has blood circulation promoting action and skin cell activity action.
  • Kina extract is an extract derived from the Cinchona plant, which is an evergreen tree native to the tropics such as Africa and South America, and uses roots, leaves, bark, flowers, whole plants, preferably bark as raw materials. Can be used.
  • Kina extract contains quinidine, quinine, cinchonine and the like as components, and is known to have a moisturizing action and a blood circulation promoting action.
  • Comfrey extract is a plant derived from Symphytum ⁇ officinale, a perennial vegetation native to Europe and widely cultivated in Japan (Symphytum officinale), roots, leaves, stems, flowers, whole plants, Preferably, leaves can be used as a raw material.
  • Comfrey extract contains allantoin, tannin, vitamins and the like as components, and is known to have anti-inflammatory and moisturizing effects.
  • the above four types of plants are also cultivated in Japan and are available plants.
  • the extraction method of these plant extracts is not particularly limited, but an extraction method using a solvent is preferable.
  • the raw materials can be used as they are, but if the powder is crushed and shredded for extraction, extraction of the active ingredients can be performed with high extraction efficiency in a short time under mild conditions. It can be carried out.
  • the extraction temperature is not particularly limited, and may be appropriately set according to the size of the pulverized raw material, the type of solvent, and the like. Usually, it is set within the range from room temperature to the boiling point of the solvent.
  • the extraction time is not particularly limited, and may be appropriately set according to the size of the pulverized raw material, the type of solvent, the extraction temperature, and the like. Furthermore, at the time of extraction, stirring may be performed, it may stand still without stirring, and an ultrasonic wave may be added.
  • the plant extract can be extracted at room temperature or from 80 ° C. to 100 ° C. by immersing the raw material in a solvent. After filtering the extract obtained by the extraction treatment, it can be used as an active ingredient as it is or after concentration or drying as necessary. In this extraction process, the raw material may be chopped or crushed. In addition, raw raw materials or dried raw materials may be used, or roasted raw materials may be used.
  • the roasting method is not particularly limited, and examples thereof include a method of roasting at 80 ° C. to 120 ° C. for 0.5 hour to 2 hours.
  • the type of solvent used for extraction is not particularly limited, but water (including hot water), alcohol (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol) , Glycol (eg 1,3-butylene glycol, propylene glycol), glycerin, ketone (eg acetone, methyl ethyl ketone), ether (eg diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, propyl ether), acetonitrile, ester (eg ethyl acetate, butyl acetate)
  • An aliphatic hydrocarbon for example, hexane, heptane, liquid paraffin
  • an aromatic hydrocarbon for example, toluene, xylene
  • a halogenated hydrocarbon for example, chloroform
  • a mixed solvent of two or more of these is preferable.
  • the active ingredient is extracted from the raw material and dissolved in the solvent.
  • the solvent containing the extract may be used as it is, but may be used after standing for several days and aging. Furthermore, it may be used after adding conventional purification treatments such as sterilization, washing, filtration, decolorization, and deodorization. Further, it may be used after being concentrated or diluted if necessary. Furthermore, it may be used after volatilizing all of the solvent to form a solid (dried product), or the dried product may be redissolved in an arbitrary solvent.
  • crocetin which is the main component of saffron extract, can also function as an apelin-like drug by the above screening method. Therefore, as another aspect of the present invention, there is provided an APJ activator comprising crocetin, or a subcutaneous fat accumulation inhibitor comprising the component.
  • Crocetin has the following chemical structure It is known as a pigment component contained in gardenia fruits and saffron pistils. In Japan, it is widely used as a main ingredient of gardenia yellow, such as color adjustment of Chinese noodles, processed chestnut products, confectionery, beverages, side dishes. In recent years, it has been attracting attention as an active ingredient of herbal medicines. Antioxidant, anticarcinogenic, antiatherosclerotic, insulin resistance improving, neuroprotective, eye strain improving, blood flow improvement It is known to have an action, an anti-inflammatory action, a fatigue relieving action and the like. (Patent Document 3: Active satiety agent containing saffron), (Patent Document 4: Eye strain improvement agent of crocetin)
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator according to the present invention can be used as pharmaceuticals or cosmetics effective in preventing or eliminating accumulation of subcutaneous fat cells due to instability of the structure of lymphatic vessels.
  • diseases and symptoms associated with subcutaneous fat accumulation include obesity, cellulite, sagging (skin aging, decreased elasticity), edema (swelling), and the like.
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator of the present invention can prevent or improve the onset of such diseases and symptoms by suppressing subcutaneous fat accumulation.
  • when having symptoms of subcutaneous fat obesity it may progress to various diseases and syndromes ranging from mild to severe.
  • Examples include sleep apnea syndrome, frequent urination, alopecia, menstrual abnormalities, poor growth due to hormone decline, anemia, ovarian cancer, uterine cancer, breast cancer, infertility, cirrhosis, hemorrhoids, deep vein thrombosis, Examples include pulmonary embolism and venous thromboembolism.
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator of the present invention can also prevent or improve the onset of such diseases and syndromes.
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator according to the present invention can be appropriately determined in dosage, usage and dosage form according to the purpose of use.
  • the administration form of the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator of the present invention is not particularly limited, and may be oral, parenteral, external use and the like. Preferably, it is an external preparation or an oral preparation.
  • the dosage form include external preparations such as ointments, creams, emulsions, lotions, packs, bath preparations, parenteral preparations such as injections, drops, or suppositories, or tablets, powders, capsules, granules, Oral administration agents such as extract and syrup can be mentioned.
  • the blending amount of the apelin-like drug (pine extract, saffron extract, quina extract and / or comfrey extract) in the subcutaneous fat accumulation inhibitor or APJ activator of the present invention can be appropriately determined according to the use, but generally the total amount of the agent Among them, it is 0.00001 to 20.0 mass%, preferably 0.00001 to 10.0 mass%.
  • the blending amount is generally 0.00001 to 20.0% by mass, preferably 0.00001 to 10.0% by mass, based on the total amount of the agent.
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator of the present invention are used for, for example, ordinary foods and pharmaceuticals.
  • Excipients moisture-proofing agents, antiseptics, strengthening agents, thickeners, emulsifiers, antioxidants, sweeteners, acidulants, seasonings, coloring agents, fragrances, whitening agents usually used in cosmetics, moisturizing
  • An agent an oily component, an ultraviolet absorber, a surfactant, a thickener, an alcohol, a powder component, a colorant, an aqueous component, water, various skin nutrients, and the like can be appropriately blended as necessary.
  • auxiliary agents commonly used for external preparations for skin such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, polyphosphate Metal sequestering agents such as sodium, sodium metaphosphate, gluconic acid, caffeine, tannin, verapamil, tranexamic acid and its derivatives, licorice extract, grabrizine, hot water extract of karin fruit, various herbal medicines, tocopherol acetate, glycyrrhizic acid And its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, glucoside ascorbate, arbutin, kojic acid, etc., sugars such as glucose, fructose, mannose, sucrose, trehalose, retinoic acid, retinol , Retinol acetate, palmitic Vitamin A such as retinol may also be appropriately blended.
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor and APJ activator according to the present invention can also be used in cosmetic methods aimed at slimming.
  • the subcutaneous fat accumulation inhibitor or APJ activator according to the present invention is applied to a site where the subcutaneous fat accumulation is anxious, for example, cellulite (a fibrous tissue of fat) or edema.
  • cellulite a fibrous tissue of fat
  • edema a site where the subcutaneous fat accumulation is anxious
  • it can be left as it is or, for example, massage can be performed in accordance with the direction of the flow of lymphatic fluid to promote the flow of lymphatic fluid.
  • This part can be applied to all parts of the body such as the face, neck, limbs, and the like.
  • cAMP Luciferase Assay After overnight culture, the medium was removed with an aspirator and replaced with 100 ⁇ l per well of DMEM medium without additives. After 3 hours, GloSensor TM cAMP reagent (Promega) was added in an amount of 4 ⁇ l / well, equilibrated for 2 hours at room temperature. Apelin 13 (Peptide Institute) is then diluted with DMEM medium without additives to a concentration of 0.4 ⁇ g / ml, and 50 ⁇ l is added per well (final concentration is 0.1 ⁇ g / ml) at room temperature. For 5 minutes.
  • FIG. 1 The results of the cAMP luciferase assay are shown in FIG.
  • the cAMP concentration is decreased by apelin, while the decrease of the cAMP concentration is suppressed with the disappearance of the apelin activity by the apelin neutralizing antibody. That is, in the above-mentioned cAMP luciferase assay, first, a drug that decreases the cAMP concentration when a candidate drug is added instead of apelin (primary screening), then, apelin neutralization is selected from these drugs.
  • Agents that reduce cAMP concentration through activation of APJ, which is an apelin receptor, by further screening for agents that significantly suppress the decrease in cAMP concentration when added together with antibodies can be selected efficiently in a short time.
  • Experiment 2 Screening of apelin-like drugs About 250 types of cosmetic materials (Shiseido Co., Ltd.) were used as candidate drugs, and apelin-like drugs were selected by the screening system established in Experiment 1. Specifically, the candidate drug was prepared to 400 ⁇ g / ml, and 50 ⁇ l was added per well (final concentration 100 ⁇ g / ml) instead of apelin used in the cAMP luciferase assay in Experiment 1. A similar assay was performed.
  • pine extract, saffron extract, quina extract and comfrey extract significantly reduce intracellular cAMP concentration, and when added together with apelin neutralizing antibody (4G5), apelin activity disappears. Since the decrease in cAMP concentration was significantly suppressed, these plant extracts were shown to have the same function as apelin.
  • pine extract and quina extract were shown to promote cell migration of lymphatic endothelial cells, as in the case of stimulation with apelin-13, and pine extract and quina extract have apelin-like activity as a ligand of APJ receptor. It was shown that.
  • Experiment 4 Screening for crocetin as an apelin-like drug Using a crocetin which is the main component of saffron extract, apelin-like activity was evaluated by the screening system established in Experiment 1. Specifically, crocetin (Crobit P: Riken Vitamin Co., Ltd.) was prepared at 800 and 400 ⁇ g / ml, and 50 ⁇ l was added per well instead of apelin used in the cAMP luciferase assay in Experiment 1 ( The same assay as in Experiment 1 was performed at final concentrations of 200 and 100 ⁇ g / ml. As shown in FIG. 4, the addition of crocetin decreased the cAMP concentration in a concentration-dependent manner. Therefore, crocetin has a high probability of having the same functions as apelin for stabilizing lymphatic vessels and suppressing fat accumulation. Indicated.
  • the subject's knee volume was measured in the morning (AM 10: 00-11: 00) and evening (PM 15: 00-16: 30) on the first day, and the rate of change (%: evening below knee) Volume-morning knee volume) was calculated.
  • AM 10:05 to 11:05 10 mg of crocetin (RIKEN Vitamin Co., Ltd.) was ingested.
  • the volume below the knee in the evening was planned, and the rate of change was calculated in the same manner as on the first day.
  • the rate of change in the knee volume in the morning and evening significantly decreased compared to the non-intake day (day 1). It is understood that swelling is improved by taking crocetin.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　皮下脂肪の蓄積を抑制するのに有効な新規な薬剤を提供する。　本発明は、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤を提供する。

Description

皮下脂肪蓄積抑制剤
　本発明は、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤、及びこれらの成分を含んで成るAPJ活性化剤、更にはクロセチンを含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤、及び該成分を含んで成るAPJ活性化剤に関する。
　生体が余剰なエネルギーを蓄積していく、つまり肥満を呈する過程において、脂肪細胞はサイズの増大によって肥大化し、また新たな脂肪細胞の出現によって脂肪細胞数が増加する。すなわち脂肪組織の過剰状態である肥満は、個々の脂肪細胞の肥大化（hypertrophy）と脂肪細胞数の増加（hyperplasia）の両方に起因する。
　ヒトは約60兆個の細胞から構成されているが、脂肪細胞の数は約300億個と推定されている。ヒトの脂肪細胞の平均直径は約60～90ミクロンであり、白色脂肪組織の固定標本を観察しても、一様な大きさで単房性の脂肪滴をもつため、核は細胞膜に接触した形で平らに変形している。このような脂肪組織の形態は、肥満になると劇的に変化する。まず容易に観察されるのは、脂肪細胞サイズの増大である。肥満ヒトの場合、脂肪細胞は最大直径が140～150ミクロンまでに肥大化する。この肥大化で体積が約3倍までになる（非特許文献１）。
　肥満には内蔵脂肪型肥満と皮下脂肪型肥満とがあり、いずれも高血圧症などを含む軽度から重篤に至る様々な疾患につながる危険性を有し、現代人が悩まされる症状一つである。その解決法としては運動、食事制限、脂肪分・糖分摂取の制限、機能性食品の摂取など様々であり、より効率的な予防法・解消法が常に所望されている。
　リンパ管が拡張し、リンパ管機能異常を有するマウスは肥満の表現型を示し、しかもその皮下脂肪層は、正常なものに比べ、顕著に厚いことも知られている（非特許文献２）。
　アペリンは、1998年に、長らくオーファン受容体であった７回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体であるAPJ（別名、AGTRL1：Angiotensin receptor like 1）に対する結合因子として牛の胃の細胞抽出液から単離された分子である。ヒトアペリンは、心臓、肺、腎臓、脂肪、胃、脳、副腎、内皮など様々な部位での発現が報告されており、77アミノ酸の前駆タンパク質に由来する36アミノ酸から成るアペリンAPJ受容体のリガンドとして知られる（非特許文献３）。アペリンの cDNA は77アミノ酸をコードするが、この前駆体からロング・フォーム（42～77アミノ酸）とショート・フォーム（65～77アミノ酸）が形成される。どちらのアペリンもAPJの活性化を誘導することが知られている。これまで、心血管系や中枢神経系で、APJの発現が報告されてきており、心臓では心筋収縮作用、神経系ではバソプレシンの発現を制御するなど、体液の調節機構に関与することが示唆されてきている。また、APJはエイズウイルスの受容体として感染にも関与することから、種々の観点からの創薬のターゲットとしてにわかに注目を浴びつつある受容体である。APJの発現は、血管系においては、血管内皮細胞や壁細胞に発現するとされてきており、アフリカツメガエルを用いた遺伝子ノックダウンの実験にて、アペリン/APJシステムが血管発生に必須の役割を果たすことが示され、またマウスやヒトにおいても本受容体の発現が内皮細胞に認められることから、哺乳類においても血管形成に関与することが予想されてきた（非特許文献４）。また、アペリンのノックアウトマウスの解析や、試験管内での血管系解析を通して、血管内皮細胞がAng1で刺激を受けた際に分泌するアペリンが血管径を制御することが報告されている（非特許文献５）。さらに、近年、アペリンが、皮膚リンパ管の機能安定化し、皮下脂肪の蓄積を抑制することが明らかとなっている（特許文献１、特許文献２）。
特開２０１０－２０８９９１号公報 特開２０１２－０２０９４２号公報 特表２００９－５３４４５２号公報 特開２００７－２１５４６５号公報
増刊実験医学　Vol. 25, No.15 (2007), pp. 32-40 Nature Genetics 37(10) (2005), pp.1072-1081 Kawamata Y et al, (2001) Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. 2-3:162-171 実験医学　Vol. 26, No.9 (2008), pp. 1380-1383 Kidoya et al, (2008) Spatial and temporal role of the apelin/APJ system in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis. EMBO J 27: 522-534
　本発明の課題は、皮下脂肪の蓄積を抑制するのに有効な新規な薬剤、又はアペリンの受容体であるAPJを活性化する新規な薬剤を提供することにある。
　本発明者は、以前、ウエスタンブロッティング法によって、ヒトリンパ管内皮細胞（以下、LEC）においてアペリンの受容体であるAPJが発現していることを確認した。また、リガンド活性を有するアペリン13、及び36でLECに刺激を負荷したところ、LECによる管腔形成が観察されることも確認した。さらに、アペリンを表皮で高発現する遺伝子を導入したマウスに紫外線照射した場合には、野生型マウスと比較してリンパ管の透過性、及び拡張が有意に抑制されたことが確認された（特許文献１）。さらに、アペリンを表皮で高発現するマウスは、高脂肪の食餌を負荷したとしても、野生型に比べ、皮下脂肪蓄積量が有意に抑制されており、アペリンを欠損したマウスでは、高脂肪の食餌を負荷すると野生型に比べ、顕著な皮下脂肪の蓄積がみられることを確認した（特許文献２）。これらの結果は、アペリンがリンパ管機能の正常化・安定化を介して、皮下脂肪蓄積抑制作用を示すことを意味するものである。
　かかる知見に基づき、本発明者は、この度、アペリン/APJシグナル系を利用したスクリーニング方法を確立し、該スクリーニング方法を用いて、アペリン様薬剤、すなわちアペリンと同様の機能を有する薬剤として、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、ならびにサフランエキスの主成分であるクロセチンを選定した。
　したがって、本願は以下の発明を包含する：
［１］　マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤。
［２］　皮膚に適用されることを特徴とする［１］に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤。
［３］　［１］に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤を皮膚に適用することからなる、皮下脂肪の蓄積を解消又は予防するための美容学的方法。
［４］　クロセチンを含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤。
［５］　経口摂取されることを特徴とする［４］に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤。
［６］　マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成るAPJ活性化剤。
［７］　皮膚に適用されることを特徴とする［６］に記載のAPJ活性化剤。
［８］　クロセチンを含んで成るAPJ活性化剤。
［９］　経口摂取されることを特徴とする［８］に記載のAPJ活性化剤。
［１０］　APJ活性化剤からなる皮下脂肪蓄積抑制剤。
［１１］　APJ活性化剤からなる抗肥満剤。
［１２］　APJ活性化剤からなる抗浮腫剤。
　本発明に係る皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤を適用することにより、リンパ管の構造の不安定化を原因とする皮下脂肪の蓄積の予防・解消が可能となる。
アペリンによる細胞内cAMP濃度の減少、及びアペリン中和抗体による細胞内cAMP濃度の減少の抑制を示すグラフである。 アペリン様薬剤（マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキス）単独（棒グラフ左）、及びアペリン様薬剤＋アペリン中和抗体（棒グラフ右）を添加した場合における細胞内cAMP濃度上昇のコントロールであるフォルスコリン添加群に対する割合を示すグラフである。 アペリン及びアペリン様薬剤（マツエキス及びキナエキス）を添加した場合におけるリンパ管内皮細胞の細胞遊走の無添加時（コントロール）に対する割合を示すグラフである。 クロセチンによる細胞内cAMP濃度の濃度依存的な減少を示すグラフである。 クロセチンによる朝と夕方の膝下体積の変化率の減少を示すグラフである。 クロセチン摂取による体重変化量を示すグラフである。 クロセチン摂取による体脂肪変化量を示すグラフである。 クロセチン摂取による皮下脂肪変化量を示すグラフである。
　APJ受容体は、AGTRL1（アンジオテンシン受容体様１）とも称され、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の１つであり、380のアミノ酸から成る。この膜貫通領域は、アンジオテンシン（AT1）受容体と40～50％の相同性を示す。APJ受容体は、αサブユニット（約40～50kDa）、βサブユニット（約35kDa）及びγサブユニット（約10kDa）からなるヘテロ三量体Gタンパク質と共役しており、情報伝達（シグナル）カスケードに関連していることが知られている。APJ受容体が活性化していない状態ではα，β，γの各々のサブユニットは強く結合しているが、APJ受容体にアペリンが結合することにより、APJ受容体が活性化し、αサブユニットに結合しているGDPとGTPの交換反応がおこり、GTP結合型αサブユニットとβγサブユニットに解離する。これらのサブユニットは、各々の標的タンパク質・酵素を活性化し、シグナルを下流へと伝達する。その後、αサブユニットに結合したGTPは、αサブユニットのGTPase活性により分解されてGDPとなり、GDP結合型αサブユニットはβγサブユニットと結合し、不活性型の三量体を再び形成する。三量体Ｇタンパク質はαサブユニットの機能及び遺伝子の相違から、Gs、Gi、Go、Gq、Gt、Golf等のサブファミリーに分類されている。GsとGi はそれぞれアデニル酸シクラーゼの活性を亢進又は抑制し、Goは神経組織のシグナル伝達系に関係し、GqはホスホリパーゼCβを活性化し、そしてGtとGolfはそれぞれ視細胞（網膜）と臭細胞のシグナル伝達系に重要な役割を果たしている。APJ受容体がアペリンと結合した場合には、Gi経路を介してアデニル酸シクラーゼの活性が抑制されるため、その結果、細胞内のcAMP濃度が減少する。
　本発明者は、上記アペリン/APJシグナル系を利用し、アペリン様薬剤のスクリーニング方法を確立した。具体的には、アペリン様薬剤のスクリーニングは、まず、１次スクリーニングとして、cAMPルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクトした単離細胞（例えば、NIH-3T3細胞）を96ウェルプレートに播種し、そこに候補薬剤を添加してプレインキュベートし、フォルスコリンによりアデニル酸シクラーゼを活性化させた後、ルシフェラーゼの発光をルミノメーター（例えば、GloMaxTM 96 Microplate Luminometer（Promega））によりcAMP濃度を測定し、フォルスコリンによるcAMP濃度上昇を抑制した薬剤を選定とする。そして、次に、cAMP濃度の減少がAPJの活性化を介していることを確認するために、２次スクリーニングとして、１次スクリーニングで選定した薬剤とアペリン中和抗体（例えば、4G5）とを一緒に加え、１次スクリーニングと同様のルシフェラーゼアッセイを行う。その結果、中和抗体の添加により、cAMP濃度の減少が抑制され、80％以上、好ましくは90％以上、最も好ましくは100％までcAMP濃度の減少を回復する薬剤をアペリン様薬剤として選定することができる。
　本発明者は、この度、上記スクリーニング方法により、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスが、アペリンの受容体であるAPJを活性化させ、これにより、アペリンと同様の機能を有する蓋然性が極めて高いという知見を得た。したがって、本発明により、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成るAPJ活性化剤が提供される。
　さらに、本発明者は、上述のとおり、アペリンがリンパ管機能の正常化・安定化を介して、皮下脂肪蓄積抑制作用を示す、という驚くべき知見を見出している。したがって、本発明により、特に、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤が提供される。
　マツエキスは、シベリア、ヨーロッパ、アジアに広く分布し、日本でも一般的な植生として見られるクロマツ（Pinus thunbergii）、アカマツ（Pinus densiflora）、セイヨウアカマツ（Pinus sylvestis）などの常緑針葉樹であるマツ属（Pinus）植物に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、樹皮、球果、植物全体、好ましくは樹皮、球果を原材料として用いることができる。マツエキスは多糖類やアミノ酸等を成分として含み、保湿作用や柔軟作用を有することが知られている。
　サフランエキスは、地中海沿岸や小アジアを原産とするアヤメ科の多年草であるサフラン（Crocus sativus L.）に由来する抽出物であり、該植物の球根、根、葉、茎、花、花柱、植物全体、好ましくは花柱を原材料として用いることができる。サフランエキスはカロチノイド配糖体であるクロシン、ピクロクロシン、クロセチン等を成分として含み、血行促進作用や皮膚細胞活性作用を有することが知られている。
　キナエキスは、アフリカや南米などの熱帯を原産とする常緑樹であるキナ属（Cinchona）植物に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、樹皮、花、植物全体、好ましくは樹皮を原材料として用いることができる。キナエキスはキニジン、キニーネ、シンコニン等を成分として含み、保湿作用や血行促進作用を有することが知られている。
　コンフリーエキスは、ヨーロッパを原産とし、日本でも広く栽培されている多年生草木であるヒレハリソウ（英名：コンフリー）（Symphytum officinale）に由来する植物であり、根、葉、茎、花、植物全体、好ましくは葉を原材料として用いることができる。コンフリーエキスは、アラントイン、タンニン、ビタミン類等を成分として含み、消炎作用や保湿作用を有することが知られている。
　上記４種の植物は日本でも栽培されており、入手可能な植物である。
　これらの植物抽出物の抽出方法は特に限定されるものではないが、溶媒を用いた抽出法が好ましい。抽出を行う際には、上記原材料をそのまま使用することもできるが、粉末状に粉砕・細断して抽出に供した方が、穏和な条件で短時間に高い抽出効率で有効成分の抽出を行うことができる。
　抽出温度は特に限定されるものではなく、原材料の粉砕物の大きさや溶媒の種類等に応じて適宜設定すればよい。通常は、室温から溶媒の沸点までの範囲内で設定される。また、抽出時間も特に限定されるものではなく、原材料の粉砕物の大きさ、溶媒の種類、抽出温度等に応じて適宜設定すればよい。さらに、抽出時には、撹拌を行ってもよいし、撹拌せず静置してもよいし、超音波を加えてもよい。
　例えば、上記植物抽出物は、原材料を溶媒中に浸漬し、室温又は８０℃～１００℃にて抽出することができる。抽出処理により得られた抽出液をろ過後、そのまま又は必要に応じて濃縮若しくは乾固したものを、活性成分として使用することができる。なお、この抽出処理の際には、原材料は細断又は粉砕したものを用いてもよい。また、生の原材料又は乾燥した原材料を用いてもよいし、あるいは焙煎した原材料を用いてもよい。焙煎方法は特に限定されるものではないが、80℃～120℃で0.5時間～2時間焙煎する方法が挙げられる。
　抽出に使用される溶媒の種類は特に限定されるものではないが、水（熱水等を含む）、アルコール（例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール）、グリコール（例えば1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール）、グリセリン、ケトン（例えばアセトン、メチルエチルケトン）、エーテル（例えばジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル）、アセトニトリル、エステル（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル）、脂肪族炭化水素（例えばヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン）、芳香族炭化水素（例えばトルエン、キシレン）、ハロゲン化炭化水素（例えばクロロホルム）、又はこれらのうち２種以上の混合溶媒が好ましい。
　このような抽出操作により、原材料から有効成分が抽出され、溶媒に溶け込む。抽出物を含む溶媒は、そのまま使用してもよいが、数日静置して熟成させてから用いても良い。さらに滅菌、洗浄、濾過、脱色、脱臭等の慣用の精製処理を加えてから使用してもよい。また、必要により濃縮又は希釈してから使用してもよい。さらに、溶媒を全て揮発させて固体状（乾燥物）としてから使用してもよいし、該乾燥物を任意の溶媒に再溶解して使用してもよい。
　さらに、本発明者は、上記スクリーニング方法により、サフランエキスの主成分であるクロセチンもまたアペリン様薬剤として機能し得ることを見出した。したがって、本発明の別の態様として、クロセチンを含んで成るAPJ活性化剤、又は該成分を含んでなる皮下脂肪蓄積抑制剤が提供される。
　クロセチンは、以下の化学構造
を有するカロテノイドであり、クチナシの果実やサフランの雌しべに含まれる色素成分として知られている。日本国内では、クチナシ黄色素の主成分として、中華麺の色調調整、栗加工品、菓子、飲料、惣菜など幅広く利用されている。また、近年では、生薬の活性成分として着目されており、抗酸化作用、抗発ガン作用、抗アテローム性動脈硬化作用、インスリン抵抗性改善作用、神経保護作用、眼精疲労改善作用、血流改善作用、抗炎症作用、疲労緩和作用などを有することが知られている。（特許文献３：サフランを含む活性満腹剤）、（特許文献４：クロセチンの眼精疲労改善剤）
　本発明に係る皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤はリンパ管の構造の不安定化を原因とする皮下脂肪細胞の蓄積の予防・解消に有効な医薬品または化粧品として利用できる。皮下脂肪蓄積が伴う疾患、症状には例えば、肥満、セルライト、たるみ（皮膚老化、弾力低下）、浮腫（むくみ）などが挙げられる。本発明の皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤は皮下脂肪蓄積を抑えることで、このような疾患・症状の発症を予防・改善することができる。また、皮下脂肪型肥満の症状を抱える場合、軽度から重篤に至る様々な疾患・症候群に進行する場合がある。その例として、睡眠時無呼吸症候群、頻尿、無毛症、月経異常、ホルモン低下による発育不良、貧血、卵巣がん、子宮がん、乳がん、不妊症、肝硬変、痔、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓塞栓症などが挙げられる。本発明の皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤はこのような疾患・症候群の発症を予防・改善することもできる。
　本発明に係る皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤の投与形態は特に制限されるものではなく、経口、非経口、外用等であってよいが。好ましくは外用剤又は経口剤である。剤型としては、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤、注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤、又は錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤を挙げることができる。
　本発明の皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤中のアペリン様薬剤（マツエキス、サフランエキス、キナエキス及び／又はコンフリーエキス）の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には剤全量中、0.00001～20.0質量％、好ましくは0.00001～10.0質量％である。アペリン様薬剤がクロセチンである場合、その配合量は、一般には剤全量中、0.00001～20.0質量％、好ましくは0.00001～10.0質量％である。
　また、本発明の皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤には、アペリン様薬剤（マツエキス、サフランエキス、キナエキス及び／又はコンフリーエキス、あるいはクロセチン）以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
　さらに、本発明の皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸及びその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
　本発明に係る皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤は痩身を目的とする美容学的方法にも利用される。この美容学的方法は、例えば本発明に係る皮下脂肪蓄積抑制剤やAPJ活性化剤を皮下脂肪蓄積の気になる部位、例えばセルライト（脂肪の繊維組織）や浮腫を呈している部位に適用し、そのまま放置するか又は例えばリンパ管液の流れの方向に即してマッサージなどを施し、リンパ管液の流れを促進するなどして行うことができる。この方法の適用箇所には顔面、首、手足、など、全身のあらゆる部位が挙げられる。
　以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
実験１．アペリン様薬剤のスクリーニング系の確立
　APJ発現細胞の培養
　NIH3T3細胞にアペリン受容体APJを高発現させ、ハイグロマイシンで選択した安定株（大阪大学微生物病研究所高倉伸幸教授より供与）をcAMPルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクトし、これを以下のcAMPルシフェラーゼアッセイに用いた。培養は200 μg/mlのハイグロマイシンを含む10% FBS含有DMEM培地（Invirtogen）で行った。アッセイ前日に、96穴プレートに1ウェルあたり2.0×105個の細胞を播種し、10% FBSと200 μg/mlハイグロマイシンを含むDMEM培地で培養した。
　cAMPルシフェラーゼアッセイ
　一晩培養した後、培地をアスピレーターで除き、1ウェルあたり100 μlの添加剤を含まないDMEM培地に交換した。3時間後、GloSensorTM cAMP 試薬（Promega）を1ウェルあたり4 μlずつ添加し、遮光し2時間室温で平衡化した。その後、アペリン13（ペプチド研究所）を0.4 μg/mlとなるように添加剤を含まないDMEM培地で希釈し、これを１ウェルあたり50 μlずつ添加し（最終濃度は0.1 μg/ml）、室温で5 分間プレインキュベートした。更に、40 μMに調整したフォルスコリン（Sigma）を50 μlずつ添加し（最終濃度は10 μM）、15 分間処理した。その後、GloMaxTM 96 Microplate Luminometer（Promega）を用いて発光を測定した。また、上記と同様のルシフェラーゼアッセイを、アペリンと共にアペリン中和抗体である4G5（大阪大学より供与）を添加して行なった。この場合、5 μg/mlとなるように中和抗体を含まないDMEM培地で希釈し、1ウェルあたり50 μlずつ添加した（最終濃度0.5 μg/ml）。同様に、最終濃度が1.5、5、15及び50 μg/mlとなるような中和抗体を調製し、それぞれウェルに添加した。コントロールとして、アペリンを添加せずに、20 μMのフォルスコリンを１ウェルあたり100 μl添加した。
　上記cAMPルシフェラーゼアッセイの結果を図１に示す。図１からもわかるように、アペリンによってcAMP濃度が減少する一方、アペリン中和抗体によるアペリン活性の消失に伴いcAMP濃度の減少は抑制されている。すなわち、上記のcAMPルシフェラーゼアッセイにおいて、まず、アペリンの代わりに候補薬剤を添加した場合にcAMP濃度を減少させる薬剤を探索し（１次スクリーニング）、次に、これらの薬剤の中から、アペリン中和抗体と一緒に添加した場合にcAMP濃度の減少が有意に抑制される薬剤をさらに選別すること（２次スクリーニング）により、アペリン受容体であるAPJの活性化を介してcAMP濃度を減少させる薬剤（すなわちアペリン様薬剤）を短時間かつ効率的に選定することが可能となる。
実験２．アペリン様薬剤のスクリーニング
　候補薬剤として、約250種の化粧品素材（株式会社資生堂）を用いて、実験１において確立したスクリーニング系によりアペリン様薬剤の選定を行った。
　具体的には、候補薬剤を400 μg/mlに調製し、実験１のcAMPルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、1ウェルあたり50 μlずつ添加し（最終濃度100 μg/ml）、実験１と同様のアッセイを行った。
　図２に示されるとおり、マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスは、細胞内のcAMP濃度を有意に減少させ、またアペリン中和抗体（4G5）と共に添加した場合には、アペリン活性の消失によりcAMP濃度の減少が有意に抑制されていることから、これらの植物抽出物は、アペリンと同様の機能を有することが示された。
実験３：薬剤のアペリン様機能アッセイ（リンパ管内皮細胞の遊走能評価）
　リンパ管内皮細胞をフルオロブロックインサート（ＢＤファルコン）に播種し、ポジティブコントロールとしてアペリン－１３（ペプチド研究所）を最終濃度1000ng/ml、各薬剤を最終濃度0.1%となるようにＥＢＭ－２培地中に添加し、培養した。アペリン－１３、及び各薬剤を添加した４時間後、１０％緩衝ホルマリンにて細胞を固定した後、Hoechst33432（Molecular Probe）にて細胞核を染色した。その後、フルオロブロックインサートの下側のメンブレンに遊走した細胞数を計測した。結果を図３に示す。マツエキス及びキナエキスの添加により、アペリン－１３で刺激した場合と同様、リンパ管内皮細胞の細胞遊走が促進されることが示され、マツエキス、キナエキスがＡＰＪ受容体のリガンドとなるアペリン様の活性を持つことが示された。
実験４：アペリン様薬剤としてのクロセチンのスクリーニング
　サフランエキスの主成分であるクロセチンを用いて、実験１において確立したスクリーニング系によりアペリン様の活性を評価した。
　具体的には、クロセチン（クロビットP：理研ビタミン(株)）を800、400 μg/mlに調製し、実験１のcAMPルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、1ウェルあたり50 μlずつ添加し（最終濃度200、100 μg/ml）、実験１と同様のアッセイを行った。
　図４に示されるとおり、クロセチンの添加により、cAMP濃度は濃度依存的に減少したことから、クロセチンは、リンパ管の安定化や脂肪蓄積の抑制といったアペリンと同様の機能を有する蓋然性が高いことが示された。
実験５：クロセチンのむくみ改善効果
　20代～50代の被験者24人（男性11人、女性13人）により、クロセチンのむくみ改善効果を評価した。
　むくみの評価は、各被験者の足（ふくらはぎまで）を一定量の水をはった水槽（水温約33℃、容量28kg)に入れ、溢れ出す水の体積により膝下体積を測定することによって行った。水量は、水槽の下に置いた計量器により毎回調整した。
　上記評価系を用いて、1日目の朝（AM 10:00～11:00）と夕方（PM 15:00～16:30）に被験者の膝下体積を図り、変化率（％: 夕方の膝下体積 － 朝の膝下体積)を算出した。
　2日目は、朝の膝下体積の測定後（AM 10:05～11:05）、クロセチン（理研ビタミン株式会社）10mgを被験者に摂取させた。その後、夕方の膝下体積を図り、1日目と同様に変化率を算出した。
　図５に示されるとおり、クロセチン摂取日（2日目）においては、未摂取日（1日目）と比較して、朝と夕方の膝下体積の変化率が有意に減少していることから、クロセチンの摂取によりむくみが改善されること解る。
実験６：クロセチンの肥満抑制効果
　30代の被験者3人（男性1人、女性2人）に、クロセチン（理研ビタミン株式会社）10mgを1日1回、13週間連続で摂取させた。
　1週間おきに体重、体脂肪率、皮下脂肪率を体重体組成計（HBF-362、OMRON）を用いて測定し、摂取前からの変化量として算出した。なお、試験期間中の被験者の運動量及び食事量については特段の変化がないことを確認した。
　図６～８に示されるとおり、クロセチン摂取後の体重、体脂肪率、皮下脂肪率はいずれも摂取前と比較して有意に減少していることから、クロセチンの摂取により肥満が抑制されることが解る。

Claims (12)

  1. 　マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤。
  2. 　皮膚に適用されることを特徴とする請求項１に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤。
  3. 　請求項１に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤を皮膚に適用することからなる、皮下脂肪の蓄積を解消又は予防するための美容学的方法。
  4. 　クロセチンを含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤。
  5. 　経口摂取されることを特徴とする請求項４に記載の皮下脂肪蓄積抑制剤。
  6. 　マツエキス、サフランエキス、キナエキス及びコンフリーエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成るAPJ活性化剤。
  7. 　皮膚に適用されることを特徴とする請求項６に記載のAPJ活性化剤。
  8. 　クロセチンを含んで成るAPJ活性化剤。
  9. 　経口摂取されることを特徴とする請求項８に記載のAPJ活性化剤。
  10. 　APJ活性化剤からなる皮下脂肪蓄積抑制剤。
  11. 　APJ活性化剤からなる抗肥満剤。
  12. 　APJ活性化剤からなる抗浮腫剤。
PCT/JP2013/059015 2012-03-30 2013-03-27 皮下脂肪蓄積抑制剤 WO2013146891A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012081914 2012-03-30
JP2012-081914 2012-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013146891A1 true WO2013146891A1 (ja) 2013-10-03

Family

ID=49260140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/059015 WO2013146891A1 (ja) 2012-03-30 2013-03-27 皮下脂肪蓄積抑制剤

Country Status (3)

Country Link
JP (3) JP5808769B2 (ja)
TW (1) TW201345540A (ja)
WO (1) WO2013146891A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016187324A (ja) * 2015-03-30 2016-11-04 ポーラ化成工業株式会社 タルミ改善剤のスクリーニング法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6253220B2 (ja) * 2012-03-30 2017-12-27 株式会社 資生堂 Ａｐｊ活性化剤
JP7328793B2 (ja) * 2018-05-25 2023-08-17 ポーラ化成工業株式会社 低酸素条件下におけるｌｏｘ遺伝子の発現量を指標とするスクリーニング方法、並びにｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制剤、皮下脂肪細胞の線維化抑制剤及びたるみの改善又は予防剤
CN110538186A (zh) * 2019-09-05 2019-12-06 浙江工业大学 一种西红花苷-i在制备减少脂肪堆积药物中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004250445A (ja) * 2003-01-31 2004-09-09 Yakult Honsha Co Ltd グリケーション阻害剤及びその利用
JP2005060334A (ja) * 2003-08-19 2005-03-10 Okinawa Pref Gov リパーゼ阻害活性且つ抗酸化性を有する抗肥満剤
WO2005046706A1 (ja) * 2003-11-17 2005-05-26 Toyo Shinyaku Co., Ltd. 松樹皮抽出物を含む脂質代謝改善剤
JP2005194246A (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Ichimaru Pharcos Co Ltd ＮＦ−κＢ活性化抑制剤
KR100946641B1 (ko) * 2010-01-19 2010-03-09 연세대학교 산학협력단 신코닌을 유효성분으로 포함하는 비만, 이상지방혈증, 지방간 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 조성물
JP2010106001A (ja) * 2008-10-31 2010-05-13 Theravalues Corp Ｐｐａｒ活性化剤

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010208991A (ja) * 2009-03-10 2010-09-24 Shiseido Co Ltd リンパ管の安定化剤
JP2012020942A (ja) * 2010-07-12 2012-02-02 Shiseido Co Ltd アペリンを含んで成る皮下脂肪蓄積抑制剤
EP2692352A4 (en) * 2011-03-31 2014-12-24 Shiseido Co Ltd MEANS FOR SUPPRESSING HEADWALLS
JP2013067592A (ja) * 2011-09-26 2013-04-18 Riken Vitamin Co Ltd 経口皮膚保護剤

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004250445A (ja) * 2003-01-31 2004-09-09 Yakult Honsha Co Ltd グリケーション阻害剤及びその利用
JP2005060334A (ja) * 2003-08-19 2005-03-10 Okinawa Pref Gov リパーゼ阻害活性且つ抗酸化性を有する抗肥満剤
WO2005046706A1 (ja) * 2003-11-17 2005-05-26 Toyo Shinyaku Co., Ltd. 松樹皮抽出物を含む脂質代謝改善剤
JP2005194246A (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Ichimaru Pharcos Co Ltd ＮＦ−κＢ活性化抑制剤
JP2010106001A (ja) * 2008-10-31 2010-05-13 Theravalues Corp Ｐｐａｒ活性化剤
KR100946641B1 (ko) * 2010-01-19 2010-03-09 연세대학교 산학협력단 신코닌을 유효성분으로 포함하는 비만, 이상지방혈증, 지방간 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOL. PHARM. BULL., vol. 28, no. 11, 2005, pages 2106 - 2110 *
CIRCULATION, vol. 122, no. 2, 2010, pages E27 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016187324A (ja) * 2015-03-30 2016-11-04 ポーラ化成工業株式会社 タルミ改善剤のスクリーニング法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017082014A (ja) 2017-05-18
JP6111167B2 (ja) 2017-04-05
JP2013227359A (ja) 2013-11-07
TW201345540A (zh) 2013-11-16
JP2013227289A (ja) 2013-11-07
JP5808769B2 (ja) 2015-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11160840B2 (en) Composition for improvement of muscle function containing 3,5-dicaffeoylquinic acid or chrysanthemum extract
EP2692352A1 (en) Hot flash suppressant
KR101487935B1 (ko) 곰보배추의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, stat3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
JP2017082014A (ja) 皮下脂肪蓄積抑制剤
FR2966040A1 (fr) Composition amincissante et/ou de prevention des processus inflammatoires
EP3017822B1 (en) Composition for treating or preventing inflammatory skin disease, comprising, as active ingredient, immature citrus fruit extract, or synephrine or salt thereof
US20100111927A1 (en) Compositions Comprising Actinidia and Methods of Use Thereof
JP6253220B2 (ja) Ａｐｊ活性化剤
JP2022023067A (ja) ハマナスの花抽出物を有効成分として含むｉｌ－６媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物
JP5999957B2 (ja) Ａｐｊ活性化剤
JP2021526555A (ja) ダルマギク抽出物を含む筋肉疾患の予防、改善又は治療用、又は筋機能改善用組成物
JP2012116765A (ja) Ｃｇｒｐ応答性促進剤
JP5816426B2 (ja) Ｃｇｒｐ応答性抑制剤
JP2013209344A (ja) 皮下脂肪蓄積抑制剤
JP5730549B2 (ja) Ｃｇｒｐ応答性促進剤
KR20190031987A (ko) 산조인 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물
JP2013119534A (ja) アンジオテンシンｉｉ活性阻害剤
JP2012116763A (ja) Ｃｇｒｐ応答性促進剤
JP2006213648A (ja) 脂肪細胞の脂肪蓄積阻害剤
KR20230072665A (ko) 시트러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 환경호르몬에 의한 건강 이상 개선용 조성물
KR20220114210A (ko) 백수오 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 조성물
JP2023165670A (ja) 低分子コラーゲン及びロスマリン酸を含むしわ改善用組成物
JP2013116857A (ja) アンジオテンシンｉｉ活性阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13767969

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13767969

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1