KR20190031987A - 산조인 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물 - Google Patents
산조인 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산조인, 천초, 곽향 및 후박으로부터 추출된 천연물 복합오일을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항아토피 효능이 우수한 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 산조인, 천초, 곽향 및 후박의 천연물 복합오일을 유효성분으로 함유시킴으로써 항아토피 효능이 우수할 뿐만 아니라 부작용이 없는 등 장점이 많다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 산조인, 천초, 곽향 및 후박의 천연물 복합오일을 유효성분으로 함유시킴으로써 항아토피 효능이 우수할 뿐만 아니라 부작용이 없는 등 장점이 많다.
Description
본 발명은 산조인 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산조인, 천초, 후박 및 곽향으로부터 추출된 천연물 복합오일을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항아토피 효능이 우수한 약학 조성물이다.
“아토피(Atopy)”란 그리스어가 어원으로 “비정상적인 반응”“기묘한”“뜻을 알 수 없다.”는 의미이다. 말 그대로 다양한 원인이 복잡하게 뒤엉켜 발병하고 완화와 재발을 반복한다. 원인이 복잡하고 다양하다는 것은 그만큼 치료가 어렵다는 것을 뜻한다. 아토피는 아토피 소인을 가지고 있는 개인에서 피부, 호흡기 점막, 안점막, 장잠막 등에 나타나는 일련의 알레르기 증상을 말하며, 이러한 아토피 소인(알레르기 체질)은 유전되어 가족적으로 나타난다. 아토피 소인에 의한 알레르기 질환으로 알레르기 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며 이들 질환은 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있다.
현재까지 알려진 아토피 피부염 치료방법 중에서 스테로이드제나 항히스타민제는 장기간 사용시 부작용과 역치 값의 상승을 일으킴에 따라 이를 대체할 수 있는 새로운 요법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
이와 관련한 종래기술로서, 하기 특허문헌 0001에는 “초정 광천수, 붉나무추출물 및 그린머드를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료 및 개선용 조성물”이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 가려움증 및 염증 유발을 억제하고, 피부 알러지를 완화하며, 미백효과를 기대할 수 있도록 하여 아토피 피부염을 치료 및 개선한다고 하나, 본원 발명과 비교하여 구성성분이 전혀 다르고, 성분이 복잡한 차이가 있다.
또한 하기 특허문헌 0002에는 “아산 도고지역 온천수에 당귀, 황기, 산약, 포공영 및 비파엽의 추출물을 함유하는 아토피 치료 및 개선용 입욕제 조성물”이 개시되어 있다. 그러나 상기 기술은 부작용이 없으면서도 표피뿐만 아니라 진피까지 침투하여 독소를 제거하고 아토피 피부염을 치료 및 개선할 수 있다고 하나, 이 역시 본원 발명과 비교하여 구성성분이 전혀 다르고, 성분이 복잡한 차이가 있다.
또한 하기 특허문헌 0003에는 “탄산(H2CO3)의 농도가 2,913.1㎎/L이며, 중탄산(HCO3)의 농도가 305.2㎎/L인 것을 특징으로 하는 아토피 개선용 인공 탄산수”가 개시되어 있다. 그러나 상기 인공 탄산수는 지하수를 40℃로 데운 후에 탄산가스 주입장치를 통하여 지하수에 탄산가스를 넣고 나서 미네랄 팩을 통과시켜 얻은 것으로서, 주입장치 등 제조비용이 고가이고 사용이 불편한 단점이 있다.
또한 하기 특허문헌 0004에는 “산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물”이 개시되어 있으나, 이는 산조인 추출물이 스트레스 호르몬의 일종인 코티솔의 분리를 억제하는데 따른 수면시간의 연장을 통한 피부기능의 불균형을 개선하는 것으로 대상 질병 및 기전이 전혀 다른 것이다.
따라서, 본 발명자들은 산조인 등 한방재료로부터 추출된 복합오일을 사용하여 피부질환의 연구하던 중 아토피에 효과가 뛰어남을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 산조인, 천추, 곽향 및 후박으로부터 추출된 천연물 복합오일을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항아토피성이 우수한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 산조인 오일 30중량%, 천초 오일 30중량%, 곽향 오일 20중량%, 후박 오일 20중량%의 천연물 복합오일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항아토피성 약학 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 산조인, 천초, 곽향 및 후박의 천연물 복합오일을 유효성분으로 함유시킴으로써 항아토피성이 우수할 뿐만 아니라 부작용이 없는 장점이 있다.
또한 상기 천연물 복합오일은 추출 시에 용매 대신에 인체에 무해한 이산화탄소를 캐리어 가스로 사용하므로 피부에 대한 독성이 없으며, 초임계 추출법에 의하여 추출하므로 한약재가 가지는 유효성분을 파괴하지 않아, 수율이 높은 천연물 복합오일을 얻을 수 있다.
도 1은 NC/Nga 생쥐에서 피부발진 점수를 나타낸 그래프이다.
도 2는 NC/Nga 생쥐의 혈액 중 백혈구를 나타낸 그래프이다.
도 3은 NC/Nga 생쥐의 혈청 IgE 수준을 나타낸 그래프이다.
도 4는 NC/Nga 생쥐의 비장세포 사이토카인 수준을 나타낸 그래프이다.
도 5는 NC/Nga 생쥐의 등피부조직 내 총세포수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직에서 CD4+&CD8+ 및 CD11b+/Gr-1+ 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 7은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직에서 mRNA 유전자 발현을 나타낸 그래프이다.
도 8은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직을 적출하여 H&E 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 NC/Nga 생쥐의 등피부에 침윤된 비만세포를 관찰하기 위하여 Toluidin 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 NC/Nga 생쥐의 혈액 중 백혈구를 나타낸 그래프이다.
도 3은 NC/Nga 생쥐의 혈청 IgE 수준을 나타낸 그래프이다.
도 4는 NC/Nga 생쥐의 비장세포 사이토카인 수준을 나타낸 그래프이다.
도 5는 NC/Nga 생쥐의 등피부조직 내 총세포수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직에서 CD4+&CD8+ 및 CD11b+/Gr-1+ 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 7은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직에서 mRNA 유전자 발현을 나타낸 그래프이다.
도 8은 NC/Nga 생쥐의 등피부조직을 적출하여 H&E 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 NC/Nga 생쥐의 등피부에 침윤된 비만세포를 관찰하기 위하여 Toluidin 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
먼저, 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다.
본 발명에 의한 항아토피성 약학 조성물은 산조인 오일 30중량%, 천초 오일 30중량%, 곽향 오일 20중량%, 후박 오일 20중량%의 천연물 복합오일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 천연물 복합오일을 구성하기 위해 사용되는 한방 재료의 특징은 하기와 같다.
산조인(酸棗仁)은 갈매나무과의 멧대추의 씨를 말린 것이다. 예로부터 심(心)과 간(肝), 담(膽)을 보하고, 정신을 안정시키며 비(脾)의 기능을 돕고 땀나는 것을 멎게 한다. 또한 가슴이 답답한 것을 낫게 하고 뼈와 근육을 튼튼하게 하며, 물이나 알코올로 우려낸 액체는 진정(鎭靜), 최면(催眠) 작용을 나타내며 브롬나트륨과 협력 작용을 한다는 것이 밝혀졌다. 그 밖에 진통, 진경(鎭驚), 혈압 강하 작용도 실험에서 밝혀졌다. 혈허(血虛)로 가슴이 답답하고 잠을 이루지 못하는 데, 잘 놀라고 가슴이 울렁거리는 데, 땀이 잘 나는 데, 관절통, 고혈압증, 신경쇠약 등에 쓴다.
천초(草)는 덩굴성 다년생 초본으로서, 뿌리로 꼭두색(빨간색)을 물들이는 풀이라고 꼭두서니라고도 한다. 통경(通經), 지혈(止血), 소종(消腫), 양혈(養血)의 효능을 가지고 있으며, 적용질환은 관절염, 신경통, 간염, 황달, 월경불순, 자궁출혈, 토혈, 혈변, 만성기관지염 등이다.
후박(厚朴)은 목련과 식물인 후박나무의 줄기나 뿌리의 껍질을 말린 것이다. 비경(脾經), 위경(胃經)에 작용한다. 기의 순환을 촉진하고 복부가 창만한 것을 낫게 하며, 비위(脾胃)를 따뜻하게 하고 습사(濕邪)를 없애며 담(痰)을 삭인다. 약리 실험에서 항균 작용, 약한 이뇨 작용을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 비위(脾胃)의 한습사(寒濕邪)로 기가 막혀 헛배가 부르면서 그득한 데, 소화 장애, 구토, 설사, 위장염, 위경련, 기침이 나고 숨이 찬 데, 기관지염, 기관지 천식 등에 쓴다.
곽향(藿香)은 배초향(排草香)의 잎과 줄기로부터 만든 것이다. 비위에 습이 정체되어 복부창만, 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 설사 등을 치료한다. 소화장애를 동반한 감기, 여름철 식체(食滯)로 인한 구토, 설사, 구취, 옴이나 버짐 등에 효과가 있다. 약리작용으로 피부 진균, 대장균, 이질균, 폐렴균, 용혈성연쇄상구균 억제, 위액분비 촉진작용 등이 있다.
본 발명에서 산조인을 비롯한 천연물 복합오일은 수증기증류법, 냉침법, 유기용제법, 초임계추출법 등의 공지의 다양한 추출법에 의한 추출될 수 있으나, 바람직하게는 초임계추출법을 사용하면 여러 가지 장점이 있다.
초임계추출은 임계점 이상의 유체를 추출체로 사용한 추출법이다. 초임계 유체는 기체와 액체의 중간 정도의 물성을 가지고 있으며, 단순히 온도와 압력의 조절에 의하여 상변화 없이도 물질의 용해성을 변화시켜 많은 물질에 대하여 용해성이 우수한 특성을 가지고 있기 때문에 분리기술의 한 분야로 주목을 받고 있다. 특히, 이산화탄소(CO2)는 임계온도가 31.1℃이고, 임계압력이 73.8bar이므로 낮은 온도에서 추출이 가능하며, 이에 따라 추출된 유효성분의 열에 의한 손상을 막을 수 있어 추출 수율이 향상되며, 공정 중 에너지 비용도 현저히 줄일 수 있는 등 여러 가지 장점이 있기 때문에 초임계 유체용매로 사용되고 있다.
본 발명에서 천연물 복합오일을 추출하기 위한 건체(乾體) 시료를 수증기증류법을 사용하여 온도 110~120℃, 압력 14~17bar, 7~8시간 동안 추출하면, 각 오일의 회수율은 0.34~1.57%에 불과하다. 그러나 상기 초임계 추출법을 이용하게 되면 오일의 회수율은 기기조건을 적당히 조절하여 49~53℃ 온도, 345~365bar 압력, 이산화탄소 유량은 30g/min으로 셋팅한 후 8~12시간 동안 추출하는 것이 바람직하다. 이어서 얻어진 추출물에 용매로서 70% 주정 또는 케리어 오일에 녹인 다음 10㎛ 필터로 여과한다. 이렇게 하여 얻어진 추출 오일의 수율은 산조인 1.86중량%, 천초 2.16중량%, 곽향 0.54중량%, 후박 3.43중량%로서, 종래의 방법인 수증기증류법으로 추출하는 것보다 현저히 상승될 수 있다.
상기에서 얻은 각 오일은 적절한 비율로 혼합되어 천연물 복합오일을 제조할 수 있는데, 그 비율은 산조인 오일 30중량%, 천초 오일 30중량%, 곽향 오일 20중량%, 후박 오일 20중량%로 혼합하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 천연물 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물에서, 상기 천연물 복합오일은 항아토피성 약학 조성물에 대해 0.5 내지 3.0중량%의 비율로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1.0 내지 2.0중량%의 비율로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 복합오일의 함량이 0.5중량% 미만일 경우에는 항아토피의 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 3.0중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 더 이상 나타나지 않을 뿐만 아니라 향이 너무 강하고 경제적이지 못하여 사용하기 적합하지 않다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 천연물 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물에 포함되는 성분은 본 발명의 유효성분으로 사용되는 산조인, 천초, 곽향 및 후박의 복합오일 이외에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들이 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 천연물 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 본 발명의 상기 조성물 이외에도 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
상기 천연물 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물의 적절한 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
나아가 본 발명의 천연물 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물은 산조인 등 복합오일에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 천연물 복합오일을 포함하는 항아토피성 약학 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 바디크림, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 트리트먼트, 미용액, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 천연물 복합오일을 포함하는 조성물은 통증완화 식품 조성물으로 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 산조인 오일 등 천연물 복합오일 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 복합오일 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예> 천연물 복합오일의 제조
깨끗하게 세척 및 건조된 산조인, 천초, 곽향 및 후박을 각각 2㎏씩 준비하여 초임계추출기(일신오토클레이브 제품)에 투입한 후 360bar, 50℃에서 초임계 유체인 이산화탄소(CO2)를 흘려주면서 초임계 상태에서 9시간 동안 추출함으로써 산조인 오일 등 천연물 오일을 각각 제조하였다. 각 오일의 수율은 산조인 1.86%, 천초 2.16%, 곽향 0.54%, 후박 3.43%이었다.
상기에서 얻은 각 천연물 오일은 적절한 비율로 혼합되어 천연물 복합오일을 제조할 수 있는데, 그 비율은 산조인 오일 30중량%, 천초 오일 30중량%, 곽향 오일 20중량%, 후박 오일 20중량%로 혼합하는 것이 바람직하였다.
<제조예> 바디 크림의 제조
바디크림은 하기 [표 1] 성분표의 구성에 따라 제조하였다. 먼저, 수상과 유상을 계량하여 각각을 70~75℃까지 가열하고, 수상을 유화기를 이용하여 고르게 혼합한 후 유상을 가하여 유화시켰다. 이어서 안정제를 계량하여 투여하고, 유화기로 고르게 교반하면서 유화기의 속도를 감속하며 35~40℃까지 냉각하였다. 첨가제를 계량하여 4번에 투여한 후에 서서히 교반하여 첨가제가 고르게 분포하도록 한 다음, 감압조건에서 탈포시키고 약 3일간 실온에서 숙성시켜 바디크림을 제조하였다.
| 수상(중량%) | 유상(중량%) | ||
| 복합오일 | 1.00 | 복합오일 | 1.00 |
| 글리세린 | 10.00 | Lanette O | 2.00 |
| 실리콘유도체 | 0.20 | Olive M 1000 | 1.00 |
| Microcide-C | 0.20 | Tego care 450 | 2.00 |
| EDTA-2Na | 0.01 | Puresyn 4 | 2.00 |
| Keltrol F(1%) | 5.00 | TCG-M | 3.00 |
| Sepiplus 400 | 0.30 | DC 200/6cs | 2.50 |
| TEA | 0.10 | Lipex Shea | 1.00 |
| Di water | 나머지 | Vitamin E | 0.50 |
| D-P | 0.10 | ||
| BHT | 0.02 | ||
| TEA | 0.10 | ||
| Di Water | 나머지 | ||
<실험예>
1. 실험 재료의 준비
실험동물은 수컷으로 7주령의 20~22g NC/Nga 생쥐(SLC, Inc, Japan)를 중앙실험동물(주)에서 공급 받는다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료社 제품)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 밤낮주기 환경을 유지하며 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 그리고 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대전대학교 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee : IACUC)의 승인을 받는다.
2. 실험방법
가. 실험군 분류 및 약물처리
NC/Nga 생쥐에 아무 처리도 하지 않은 정상군(NC/Nga-Nr, Nr), 디니트로클로로벤젠(DNCB)을 2주간 도포한 대조군(DNCB-CTL), DNCB를 2주간 도포 후에 덱사메타손을 3㎎/㎏ 투여한 양성대조군(DNCB-Dex), DNCB를 2주간 도포 후에 실시예의 천연물 복합오일로 도포한 군(ZiJ-C-oil)으로 분류하였다. 양성 대조약물인 덱사메타손을 3㎎/㎏으로 12주령부터 15주령까지 3주간 매일 경구 투여하였으며, 실험군인 상기 천연물 복합오일은 12주령부터 15주령까지 매일 3주간 도포하였다.
나. 피부염 유발 및 평가
8주령의 NC/Nga 생쥐를 2주일 동안 적응시킨 후에 NC/Nga 생쥐의 등(귀 하단부에서부터 꼬리 상단부)을 제모하고 24시간 방치한 다음 1% DNCB가 들어 있는 아세톤 3 : 올리브오일 1의 200㎕를 제모 부위에 도포하고, 3일 후에 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일째부터는 1주일에 3회씩 3주간 0.2 % DNCB 용액 150㎕를 재차 도포(10주령 ∼13주령)하여 아토피 피부염을 유발시켰다.
NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법을 이용하였다. 육안평가 항목은 소양행동을 동반한 홍반(erythema/hemorrhage), 인설/가피(dryness/scarring), 부종(edema), 표피박탈/미란(excoriation/erosion), 태선화(lichenification)의 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타냈다. 각각의 항목은 없음 0, 약함 1, 중증도 2, 심함 3으로 채점하였으며 최소 0점에서, 최고 15점 사이의 점수를 측정하였다.
다. 혈액 중 백혈구 세포수 측정
최종 실험종료 후 EDTA가 처리된 튜브형 주사기로 심장 혈액 0.5ml를 채취한다. 전혈을 바이오톡스텍(주)(청주, 충청북도)에 의뢰하여 혈액 중 백혈구의 총세포수를 측정한다.
라. 채혈 및 IgE 측정
NC/Nga 생쥐의 눈에서 10주, 12주, 15주에 모세혈관을 이용하여 약 100㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6,500 rpm에서 20분간 원심분리한 후 30㎕의 혈청을 분리하였고, 혈청은 취하여 -70℃에 냉동 보관하였다. NC/Nga 생쥐의 혈청 내 IgE 농도 측정은 enzyme-linked immuno-sorbent assay로 IgE 수준을 측정하였다.
각 well에 혈청 5㎕(1/10 dilution)와 dilution buffer 45㎕를 혼합하여 각 well에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 세척 완충용액으로 세척한 다음 항체 biotin-IgE conjugated를 넣고 2시간 방치하였다. 다시 2회 수세한 후 완충용액으로 세척한 다음 항체 Avidin-HRP conjugeted 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100㎕의 stop 용액을 처리한 다음 ELISA leader 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
마. 비장세포에서 Th1/Th2 cytokine 발현 변화
NC/Nga 생쥐 실험 시작 8주 후(15주령)에 실험을 종료하고, 비장(spleen)을 적출하여 100mesh로 비장세포(splenocytes)를 분리하였다. 전날 CD3 mAb 1㎍/㎖을 96 well plate에 코팅하여 4℃ 냉장고에서 overnight한 다음 D-PBS로 2회 수세하였다. 분리한 비장세포는 ACK 용액으로 RBC를 제거한 후 DNCB extract가 코팅된 각각의 well에 5X105 세포 씩 5% FBS-DMEM 배양액에서 48시간 동안 배양한 다음 원심분리기 2,000rpm에서 3분간 원심분리한 후 200㎕의 배양 상층액을 얻었다. 혈청 내 IL-5 (BioSource, U.S.A.), 그리고 혈청 내 IL-13 (R&D system, U.S.A.)의 수준 측정은 ELISA로 측정하였다. 각 well에 배양 상층액 50㎕를 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 완충용액으로 세척한 다음 항체 biotin-IgE conjugated를 넣고 2시간 방치하였다. 다시 2회 수세한 후 완충용액으로 세척한 다음 항체 Avidin-HRP conjugated 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 다음 100㎕의 stop용액을 처리한 후 ELISA reader 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
바. ALN 및 등피부 조직에서 형광 유세포 분석
실험을 종료한 후 NC/Nga 생쥐에서 ALN(Axillary lymph node)을 적출하여 100 mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리(1,700rpm)하고, 2회 세척한 후 cell strainer (FALCON, U.S.A.)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 등피부 조직은 잘게 ?h핑한 후 collagenase 1㎎/㎖(in 2% FBS + RPMI 1640)를 넣고, 37℃ 진탕(180rpm, 20min) 배양기에서 배양한 후 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 분리한 ALN과 등피부 조직 침윤세포의 총 세포수를 측정한 다음, 모든 조직의 세포 등을 5X105 cells/㎖로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색을 실시하였다. 각각에 anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC, anti-CD23-FITC, anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1-PE, 그리고 anti-B220-PE를 넣고 30분간 얼음에서 반응시킨 다음 3회 이상 PBS로 수세한 후 유세포분석기의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD4+, CD8+, CD11b+Gr-1+, 그리고 B220+CD23+ 세포수를 백분율(%)로 분석한 후 총 세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대세포수를 산출하였다.
사. 등 피부조직에서 Quantitative Real-time PCR 분석
(1) NC/Nga 생쥐의 등 피부조직에서 RNA 분리
NC/Nga 생쥐의 등 피부조직을 적출하여 각각에 RNAzolB 500㎕를 넣고 용해될 때까지 분쇄기로 분쇄하였다. 이 조직분쇄 혼합 부유액에 클로로포름 50㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심분리한 다음 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-프로판올 200㎕와 동량 혼합한 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심분리한 후 80% 에탄올로 수세하고 3분간 진공펌프에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다. Quantitative Real-time PCR은 7500 Real-Time PCR system을 이용하여 수행하였다.
(2) 역전사-중합효소 연쇄반응
역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 총 RNA 2㎍을 DNase I(10U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시켰다. 이에 2.5㎕ 10mM dNTPs mix, 1㎕ random sequence hexanucleotides (25pmole/ 25㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor(20U/㎕), 1㎕ 100mM DTT, 4.5㎕ 5 ×RT buffer(250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT(200U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega, U.S.A.)를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용하였다.
(3) Quantitative Real-time RT-PCR
Quantitative Real-time RT-PCR은 7500 Real-time PCR system을 이용하여 수행하였으며 Mouse Olionucleotid의 염기배열은 다음 [표 2]와 같다.
| Gene | Primer | Sequence |
| GAPDH | Forward | 5' TGAAGCAGGCATCTGAGGG 3' |
| Reverse | 5' CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG 3' | |
| IL-4 | Forward | 5' -GGATGTAACGACAGCCCTCT-3‘ |
| Reverse | 5' -GTGTTCCTTGTTGCCGTAAG-3 ' | |
| IL-13 | Forward | 5' ATGCCCAACAAAGCAGAGAC 3' |
| Reverse | 5' TGAGAGAACCAGGGAGCTGT 3' | |
| TNF-α | Forward | 5' TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC 3' |
| Reverse | 5' GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG 3' | |
| TGF-β | Forward | 5' TGGAGCAACATGTGGAACTC 3' |
| Reverse | 5' CTGCCGTACAACTCCAGTGA 3' | |
| COX-2 | Forward | 5' GGGTGTCCCTTCACTTCTTTCA 3' |
| Reverse | 5' TGGGAGGCACTTGCATTGA 3' |
Cytokine 유전자 발현은 SYBRⓡ Green PCR Master mix를 사용하였고, internal standard는 GAPDH로 Taqman probe를 사용하였으며, 염기의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다. IL-5와 IL-13 mRNA 유전자 발현은 등피부 조직에서 관찰하였고 cDNA를 합성하여 분석하였다. Quantitative Real-time PCR의 조건은 pre-denaturation은 50℃에서 2분, 94℃에서 10분, 그리고 40 cycles을 95℃에서 9초, 60℃에서 1분 수행하였다. 양성대조군, DIDT(300㎎/㎏) 투여군, DIDT(100㎎/㎏) 투여군의 대조군은 internal standard로 GAPDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR은
y=x(1+e)n
x : starting quantity
y : yield
n : number of cycles
e : efficiency
로 계산하여 RQ(relative quantitative) 값을 측정하였다.
10) 조직염색 분석
등 쪽 목 부분의 피부를 떼어내어 10% 파라폼-알데히드에서 24시간 동안 포르말린에 고정하였다. 그 조직을 파라핀으로 포맷하였고, 5㎛ 두께로 block을 만들었다. 그 조직부분은 염증을 일으키는 표피, 진피, 각질세포, 호중구/호산구, 그 외 다른 세포와 부종을 식별하는 hematoxyline/eosin(H&E) 염색과 비만세포를 염색하는 toluidine blue 염색으로 비만세포의 침윤을 광학현미경(X200, Nikon, Japan)으로 관찰하였다.
3. 통계 처리
각 실험군 결과 값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001)
4. 실험결과
가. 피부발진 점수
NC/Nga 생쥐에 DNCB를 3주간 도포하고 최종 5주 후 등피부에 나타난 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 단계를 0, 1, 2, 3점으로 개체마다 평가 기록하였다. 피부발진 점수로 평가한 결과, 대조군의 피부발진 점수는 DNCB를 도포하지 않은 정상군(NC/Nga-Nr)에 비하여 4배 이상 증가를 나타내었고, 양성대조군인 덱사메타손 투여군(DNCB-Dex)은 대조군(DNCB-CTL)에 비해 3배 정도의 감소를 나타내었다. DNCB를 도포한 후 천연물 복합오일을 도포시킨 군(ZiJ-C-oil)은 대조군에 비해 약간의 감소를 나타내었다(도 1).
나. 혈액 분석
혈액 중 백혈구의 수를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 양성대조군은 대조군에 비해 증가하였다. 천연물 복합오일군(ZiJ-C-oil)은 대조군에 비해 유의성 있게 증가되었다(도 2). 피부발진 초기에는 백혈구의 수는 증가하였을 것이며, 염증반응이 지속적으로 진행되면서 병변부위로 이동했을 것이고, 시료처리 영향으로 천연물 복합오일은 백혈구의 수가 정상군과 동일한 수준으로 나타나는 것으로 사료된다.
다. 혈청 IgE에 미치는 영향
혈청 IgE를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 증가하였으며, 천연물 복합오일과 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다(도 3).
이와 같은 결과 천연물 복합오일로 인하여 알레르기 면역반응을 억제하여 B세포 분화과정에서 분비되어 염증반응을 유도하는 IgE 분비를 억제하는 것으로 사료된다.
라. 비장세포 cytokine 발현
비장세포를 분리하여 배양 상층액에서의 cytokine 발현을 측정한 결과, IL-4 생산량은 정상군에 비해 대조군에서 4배 이상 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 감소하였으며 천연물 복합오일군에서는 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다(도 4).
IFN-γ 생산량은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 특히 천연물 복합오일에서 유의성 있게 감소하였다(도 4).
IL-13 생산량은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군 및 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 4).
IL-5 생산량은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 그리고 천연물 복합오일군에서는 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 4).
아토피 피부염은 급성일 경우 Th2 세포가 발달하고, 심화되면 Th1 cytokine도 동시에 증가해 염증반응을 더욱 악화시키는데, 천연물 복합오일은 Th2 cytokines과 IFN-γ의 발현을 조절하여 피부염증반응을 억제한다고 사료된다.
마. ALN, 등피부 조직에서 형광 유세포 분석
(1) 총세포수 측정
실험 종료 후 15주령의 NC/Nga 생쥐를 에틸에테르로 마취한 다음 ALN, 비장, 그리고 등피부 부위를 적출하여 총세포수를 측정하였다.
ALN 세포 수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 5).
등피부조직의 세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 그리고 천연물 복합오일군도 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 5).
(2) 면역형광염색에 의한 세포 함량 변화
1) 등피부 조직에서 CD4+&CD8+, CD11b+/Gr-1+ 세포수
CD4+ Th세포의 총절대 세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다.
CD8+ c/s T세포의 총절대 세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 6).
CD11b+/Gr-1+ MSC의 총절대 세포수는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. 그리고 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다(도 6).
천연물 복합오일의 효과는 등피부 발진 부위로 CD4+ T세포, CD8+ T세포 그리고 CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor 세포의 침윤을 억제하여 면역반응을 제한하고, 피부질환이 심화되는 것을 조절할 수 있을 것이라고 판단된다.
바. 등피부 조직에서 mRNA 유전자 발현
실험 종료 후 등 피부조직에서 유전자 발현을 측정한 결과, COX-2 mRNA의 유전자 발현의 상대정량값(RQ)은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다(도 7).
TNF-α mRNA의 유전자 발현의 상대정량값(RQ)은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군도 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 7).
TGF-β1 mRNA의 유전자 발현의 상대정량값(RQ)은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군은 양성대조군에 비해 증가하는 것으로 나타났다. 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다(도 7).
IL-4 mRNA의 유전자 발현의 상대정량값(RQ)은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되 것으로 나타났다(도 7).
IL-13 mRNA의 유전자 발현의 상대정량값(RQ)은 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였으며, 천연물 복합오일군은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다(도 7).
이와 같은 결과는 천연물 복합오일이 아토피 피부염에서 발현되는 다양한 cytokine 유전자 발현을 억제함으로서 아토피 피부염의 염증반응을 호전시킬 수 있다고 판단된다.
사. 등피부 조직검사 및 분석
실험 종료 후 등피부를 절단하고 H&E 염색하여 분석한 결과, 정상군에 비하여 대조군의 상피조직이 부종으로 현저하게 확장되었고 백혈구의 침윤, 홍반, 부종, 혈종, 스켈링도 보이고 있다. 천연물 복합오일군은 대조군에 비하여 상피조직의 두께가 현저하게 줄었고, 백혈구의 침윤 및 홍반, 부종, 혈종, 스켈링 등은 보이지 않아 부종이 거의 사라진 것을 알 수 있다. 천연물 복합오일군은 대조군에 비하여 차이가 나타나지 않았다.
또한 등피부에 침윤된 비만세포를 관찰하기 위하여 toluidine blue 염색하여 분석한 결과, 정상군에 비하여 대조군의 비만세포가 현저하게 증가되었고, 천연물 복합오일군은 대조군에 비하여 비만세포가 거의 사라진 것을 알 수 있다. 산조인 복합 오일은 대조군에 비하여 차이를 나타나지 않았다(도 9).
DNCB를 등 피부에 도포하여 NC/Nga 쥐의 아토피 피부염을 유발했다. NC/Nga 피부 생검에서 hematoxylin과 eosin(H&E)로 염색했고, 광학현미경(?100)에서 표피가 두껍게 보인다(도 8). 양성대조군 및 천연물 복합오일군에서 표피의 비후 현상이 유의성 있게 감소하였다. DNCB 도포하여 NC/Nga 쥐의 아토피 피부염을 유발한 후, NC/Nga 피부 생검에서 toluidine bluestaining로 염색했고, 광학현미경에서 피부에 탈 과립된 비만세포가 보인다(도 9).
상기에서는 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 실시예 외의 많은 실시예들이 본 발명의 특허청구범위 내에 존재한다.
Claims (6)
- 산조인 오일 30중량%, 천초 오일 30중량%, 곽향 오일 20중량%, 후박 오일 20중량%의 천연물 복합오일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항아토피성 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 천연물 복합오일은 산조인, 천초, 곽향, 후박으로부터 이산화탄소(CO2)를 초임계 유체로 사용하는 초임계 추출법에 의하여 각각 추출된 후에 혼합되는 것을 특징으로 하는 항아토피성 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 추출은 49~53℃, 345~365bar에서 8~12시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 항아토피성 약학 조성물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 천연물 복합오일은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭으로부터 선택되는 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항아토피성 약학 조성물.
- 제 4항에 있어서,
상기 천연물 복합오일은 천연물 조성물 총량에 대하여 0.5~3.0중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 항아토피성 약학 조성물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 천연물 복합오일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 통증완화 식품 조성물.
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