KR101678226B1 - 면역 세포의 활성화 역치를 상승시키는 물질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미용 또는 제약 조성물, 특히 피부과용 조성물의 제조를 위한 유효 성분으로서 면역 세포의 활성화 역치를 증가시키는 활성 물질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 활성 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역 세포의 활성화 역치를 상승시키는 물질 {SUBSTANCES RAISING THE ACTIVATION THRESHOLD OF IMMUNE CELL}

본 발명은 피부 면역 세포 및/또는 점막 면역 세포의 활성화 역치를 증가시킬 의도의 미용 또는 제약 조성물의 제조를 위한 유효 성분의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 민감성 피부, 또는 잠시 민감성, 반응성 또는 과다반응성이 된 피부의 관리 및/또는 치료에 관한 것이다.

피부 자극 및 알레르기성 반응 (지연성 접촉성 과민증 또는 접촉성 알레르기 또는 접촉성 습진)은 선진국에서 건강 문제가 되었다. 원인은 예를 들어, 금속 염, 미용 및 위생 제품, 향수, 약물, 보존제, 소독제, 의류, 식물 등에서 발견되는 접촉 자극원 및 알레르겐의 개수만큼 다양하다. 이와 동일한 맥락에서, 민감성 또는 과다반응성 피부를 갖는다고 단언한 사람들의 수가 최근 수년간 크게 증가하였다. 이 숫자는 1980년대 인구의 30％에서 현재 약 60％로 상승하였다.

피부 민감성의 가장 중요한 원인 중 하나는 특히 각질층의 세포간 지질의 유전성/후천성 결핍에 의해 야기된 장벽 기능의 약화와 관련된다. 표피의 신경 종말의 변화, 신경전달물질의 축적, 또는 중추 신경계에서 정보 전달의 붕괴를 특징으로 하는 증가된 감각신경 활성이 또한 피부 민감성의 증가를 야기하는 인자이다. 피부 민감성의 세번째 추가 원인은 특히 표피 랑게르한스 세포 (LC)의 밀도의 측정가능한 증가를 포함하는 증가된 면역 민감성이고, 이는 가장 극한의 경우에 접촉성 두드러기, 접촉성 자극성 또는 알레르기성 피부염 또는 아토피성 피부염과 같은 병리를 초래할 수 있다.

민감성 피부 유형의 다형은 주관적 감각, 예컨대 자통, 작열감, 소양감, 긴장감, 및 객관적 피부 반응, 예컨대 발적, 가시 인설 및 피부의 비후에 의해 표시된다. 이들 추한 및/또는 불쾌한 소견, 특히 자극이 민감성 피부의 특징이다. 가장 극한의 경우, 자극 또는 심지어 알레르기성 반응이 또한 기재되어 있다.

미용학 및 제약학에서, 특히 염증 또는 자극 반응의 예방 및/또는 치료에 의해 모든 피부 유형의 민감성을 감소시키는 것은 공지된 관행이다. 구체적으로, 피부가 "민감성"이라고 말한 개인의 경우, 침습적 작용제 또는 자극원 상태에 노출 (심지어 미량)은 회피하는 것이 적절한 염증 또는 실질적인 자극 반응을 초래할 수 있는 추한 및/또는 불쾌한 피부 및/또는 점막 소견에 의해 표시될 수 있다. 민감성 피부에 대한 현재 치료법은 피부를 더 관용적으로 만드는 것, 즉 자극원 반응에 대한 더 낮은 자극과민성 역치를 특징으로 하는 민감성 피부 유형의 반응성 역치의 상승을 목적으로 한다. 이들 치료법은 피부를 "진정시키는" 생성물의 사용을 기초로 한다.

구성성분이 종종 최소량으로 감소된 특별한 "민감성-피부" 미용 제제, 및 민감성 또는 알레르기성 표피에 원칙적으로는 부적합한 물질이 여기에서 제외된다. 향수, 알코올, 염료, 안료, 보존제, 활성제 모두를 함유하지 않고 중성 pH를 갖는 보습 제품의 사용이 언급될 수 있다.

미량 원소 및 미네랄 염이 풍부한 용천수를 기재로 하는 수딩(Soothing) 또는 진정 생성물은 등장성과 같은 생리 염수 용액의 특성과 유사한 특성을 갖는다. 이들 생성물은 아욱, 귀리 및 수레국화와 같은 진정성 및 항염증성 식물 추출물로 풍부하게 될 수 있다.

천연 분자로 피부 장벽을 강화시킬 수 있는 능력을 갖는 보호 생성물은 상기 표피가 그의 보호 기능을 모두 회복하도록 표피의 수지질막을 재구성할 것이다. 피부 지질의 전구체인 세라마이드는 전형적으로 이러한 유형의 적용에서 사용된다. 막형성 효과를 갖는 사카라이드를 기재로 하는 생성물이 또한 과다반응성 피부의 관리를 위한 것으로 기재되어 있다.

신경미용 활성을 갖는 스트레스제거 생성물, 예컨대 β-엔도르핀-유사 생성물은 피부의 감각 신경 섬유 수용체에 작용한다. 이들 생성물은 일반적으로 항염증 신경매개인자, 예컨대 α-MSH (멜라닌세포-자극 호르몬)의 방출에 의해, 또는 내인성 항염증 인자, 예컨대 TNFα (종양 괴사 인자 알파), IL-1β(인터류킨 1 베타) 또는 PGE2 (프로스타글란딘 E2)의 억제에 의해 항염증 효과와 연결된다.

모든 피부 세포에 근본적으로 관여하는 피부 면역학적 구성성분은 주로 다음에 의해 구성된다:

- 항원-제시 세포 (AgPC)로서의 기능에 의해 피부의 면역 반응의 원인인, 피부 수지상 세포 ( DC ): 랑게르한스 세포 및 진피 DC (DDC);

- 각질세포가 구성하는 기본 피부 미세환경 (땀, 피지, 항미생물 펩티드, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인 등)에 의해 피부의 CD의 핵심 세포 파트너인 각질세포.

항원, 예를 들어 알레르겐, 병원체 및/또는 이물질에 의한 자극 도중, 피부 DC는 아래 기능을 갖는다:

- 항원의 포착 또는 포획;

- 피부 밖 및 림프 신경절의 방향으로 이동;

- 특이적 적응 면역을 개시하기 위한 림프구로의 항원 정보의 제시.

피부 DC는 또한 이웃 각질세포에 의해 전달되는 모든 내인성 신호를 통합해야 한다. 구체적으로, 임의의 자극 하에 및 그의 성질에 따라, 각질세포는 LC 및 DDC의 면역 기능에 영향을 주는 가용성 매개인자 (예컨대, 사이토카인 등)의 매우 광범위한 집합을 생성한다.

항원 포획 후, 피부 DC는 후속적으로 아래 표현형 및 기능적 변화를 겪는다:

- 항원의 포획은 LC 및 DDC의 활성화를 유도하며, 이는 그 후 "활성화된" 표현형을 획득한다. 이러한 활성화된 표현형은 DC에 의한 T 림프구의 활성화 역치에 직접 관여되는 공동-자극 분자 CD80 및 CD86의 강한 발현에 의해 나타난다. 클래스 II MHC (주조직적합성복합체)의 분자 및 특히 HLA-DR의 막 발현은 또한 DC의 표면에서 항원 펩티드의 제시에 의해 크게 증가된다.

- LC 및 DDC의 활성화는 또한 피부 밖 및 림프 신경절의 방향으로 DC의 이동에 필수적인 CCR7 수용체의 발현의 획득과 상관관계가 있다.

- 이들의 이동 도중, LC 및 DDC는 성숙 과정을 거치고, "성숙" DC 표현형을 획득한다. 림프구의 감작화 및 면역의 확립에 필수적인 이 성숙 상태는 마커 CD83 및 DC-LAMP의 발현에 의해 및 사이토카인을 분비하는 능력에 의해 나타난다.

<발명의 목적>

본 발명의 주요 목적은 개인의 면역 세포, 특히 피부 및/또는 점막 면역 세포의 활성화 역치를 증가시킬 수 있는 유효 성분을 제공하는 것이다. 이는 피부 및/또는 점막 민감성의 감소, 및/또는 피부 및/또는 점막 반응성의 감소, 및/또는 피부 및/또는 점막 관용성의 증가를 초래한다. 그러므로, 이는 미용 또는 제약, 피부과 치료 및/또는 관리의 맥락에서 명확히 관심이 있다.

본 발명의 목적은 또한 상기 언급된 활성을 갖는 물질을 스크리닝하기 위한, 피부 DC의 두 집단 (LC 및 DDC)의 반응을 고려한 스크리닝 모델을 제공하는 것이다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은 미용 조성물에서 개인의 면역 세포의 활성화 역치를 증가시키기 위한 활성제로서, 또는 바람직하게는 개인의 면역 세포의 활성화 역치를 증가시키기 위한 제약 조성물, 및 특히 피부과용 조성물의 제조를 위한, 포라덴드론 피페로이데스(Phoradendron piperoides)의 식물 추출물, 세스트룸 라티폴리움(Cestrum latifolium)의 식물 추출물, 스필란테스 올레라세아(Spilanthes oleracea)의 식물 추출물, 마프로우네아 구야넨시스(Maprounea guyanensis)의 식물 추출물, 세쿠리닌, 폴리오시딘 아세토니드, 8-옥소슈도팔마틴 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된 하나 이상의 유효 성분의 용도에 관한 것이다. 이러한 유효 성분은 유리하게는 개인의 피부 및/또는 점막의 적어도 일부의 민감성 및/또는 반응성의 감소를 가능하게 한다.

본 발명에서 용어 "감소"는 개인의 피부 및/또는 점막의 적어도 일부의 반응성의 적어도 부분적 저하 및/또는 제한을 의미한다.

유리하게는, 유효 성분은 피부 및/또는 점막 면역 반응을 감소시키고/거나 방지한다.

유리하게는, 유효 성분은 하나 이상의 유형의 면역 세포, 특히 수지상 세포의 활성을 감소시키고/거나 억제한다.

유리하게는, 유효 성분은 적어도 표피 랑게르한스 세포 (LC) 및/또는 진피 수지상 세포 (DDC)의 활성을 감소시킨다.

유리하게는, 유효 성분은 진정제와 조합된다.

본 발명에 따른 유효 성분은 면역 세포 및 특히 DC의 활성화 역치의 증가에 의해 면역 반응을 감소시키는 능력을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 유효 성분은 유리하게는 피부의 면역 능력에 대해 면역억제성이며, 이는 피부의 염증 경로와 근본적으로 상이하다. 현재 항염증성 생성물은 본질적으로 피부의 각질세포에 의해 분비되는 가용성 프로염증(pro-inflammatory) 인자 (사이토카인, 인터류킨 등)를 합성하는 능력을 감소시킨다. 본 발명에 따른 물질은 피부의 면역 반응과는 전혀 상이한 조절 경로를 표적으로 한다. 이들 작용 방식은 상보적일 수 있다.

개인의 면역 세포, 특히 DC의 활성화 역치는 활성화 마커 및 특히 활성화 마커 CD86의 발현에 의해 정의된다. 보통의 피부에서, 미성숙 및 비활성화된 DC는 본 발명자들이 이들 세포의 활성화 역치인 것으로 정의한 CD86의 발현의 기저 수준을 갖는다. 그러므로, 미성숙 및 비활성화된 DC 상의 활성화 마커, 특히 CD86의 발현의 감소는 면역 세포의 활성화 역치의 증가에 의해 반영된다.

본 발명은 오직 피부 면역 반응의 간접 경로, 및 특히 피부 환경에 의한 및 특히 각질세포에 의한 가용성 면역 매개인자 (사이토카인)의 분비에 작용하는 표준 항염증성 생성물과는 대조적으로 피부의 DC의 표적화, 즉 면역 반응의 표적화의 장점을 갖는다.

유리하게는, 본 발명에 따른 유효 성분은 피부에서 (i) 미성숙 수지상 세포에 의해 기저 수준에서 발현된 CD86; (ii) 활성화된 수지상 세포에 의해 발현된 CD40, CD54, CD80, HLA-DR, CCR7 또는 CD86; 및 (iii) 활성화된 및 성숙 수지상 세포에 의해 발현된 CD40, CD54, CD80, HLA-DR, CCR7, CD86, CD83 또는 DC-LAMP에서 선택된 하나 이상의 유형의 마커의 발현을 감소시켜, 특히 민감성 피부의 반응성을 감소시킨다.

본 발명은 면역 반응 촉발의 역치의 증가의 장점을 갖는 반면, 동시에 개인이 후속적 면역 반응을 필요로 하는 경우 (예를 들어, 피부의 박테리아 공격 도중, 또는 일반적으로 병원체 작용제, 고도로 침습적인 화학적 작용제 및/또는 외래 요소의 존재하에) 후속적 면역 반응에 대해 최소 효과를 갖는다. 다른 한편으로는, 피부에서 가용성 프로염증 매개인자의 합성을 감소시키는 항염증성 생성물은 피부의 DC의 후속적 반응을 고려하지 않는다. 그러므로, 항염증성 생성물의 표준 치료에서, 면역 반응이 차단되거나 매우 최소로 손상된다. 이는 명백하게 면역 반응 활성인자에 의한 공격을 받은 개인의 피부의 불량한 보호를 제공하는 결점을 갖는다.

그러므로, 유리하게는, 본 발명에 따른 유효 성분은 면역 반응, 및 특히 수지상 세포의 면역학적 기능을 실질적으로 억제하지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 유효 성분은 국소 적용후 유효 성분이 피부와 더이상 접촉하지 않는 경우, 기초 면역 활성, 및 특히 수지상 세포의 면역 활성의 부분적 회복을 허용한다.

본 발명에 따른 유효 성분은 임의의 피부 유형, 및 특히 민감성, 반응성 및/또는 과다반응성 피부, 및/또는 잠시 민감성이 된 피부, 특히 침습적 피부과용 치료, 예컨대 비타민 A 산 및/또는 침습적 작용제 및/또는 침습적 조건에 의한 치료에 의해 잠시 민감성이 된 피부를 갖는 개인을 위한 미용 관리 및/또는 미용 치료에 적합하다.

일반적으로, 민감성 피부는 침습적 작용제, 특히 환경 작용제, 예컨대 오염원, 기후 인자 (바람, 추위, 더위), UV 노출, 감성적 인자, 특히 스트레스 및/또는 화학적 작용제 (중금속, 세제, 미용 치료에 함유된 화합물, 예컨대 향수, 보존제, 알코올, pH 또는 AHA, 또는 피부과용 치료, 예컨대 비타민 A 산) 및/또는 침습적 조건, 특히 발한, 및 기계적 침습, 예컨대 제모, 면도 및 피부마사지(friction)를 더 이상 관용하지 않거나 거의 관용하지 않는 피부로서 정의될 수 있다. 민감성 피부 또는 잠시 민감성이 된 피부는 병리적 성질의 피부가 아니다. 그럼에도 불구하고, 이는 미감결핍 및/또는 불쾌한 피부 및/또는 점막 소견, 예컨대 자통, 작열감, 소양감, 긴장감, 발적, 가시 인설 또는 피부의 비후를 통해 침습적 작용제 및/또는 조건에 반응할 수 있다. 그러므로, "민감성 피부" 성질은 주관적 피부 감각으로 개인 그 자신에 의해 또는 객관적 피부 반응으로 피부과 전문의에 의해 추정될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 민감성 피부, 또는 잠시 민감성, 반응성 또는 과다반응성이 된 피부의 증가된 및/또는 과도한 반응을 방지하고/거나 감소시키기 위해, 피부의 DC의 활성화 및/또는 성숙의 수준을 제어하는 것을 허용한다.

한 구현 변이형태에 따라, 본 발명은 미감결핍 및/또는 불쾌한 피부 및/또는 점막 소견의 예방 및/또는 치료를 위한 유효 성분의 미용 용도를 포함한다. 그러므로 본 발명에 따른 유효 성분은 미용 관리 및/또는 미용 치료에 특히 적합하다. 이는 특히 침습적 작용제 및/또는 침습적 조건에 대항하여 진정 및/또는 항-자극 및/또는 보호 효과를 갖는 미용 조성물의 제조를 특히 허용한다.

그러므로, 본 발명은 당해 개인의 피부 및/또는 점막의 건강한 상태 (미용 관리 또는 치료) 또는 병리적 상태 (피부과용 또는 제약 관리 또는 치료)에 따른 두 가지 상이한 유형의 관리 및/또는 치료에 관한 것이다.

다른 구현 변이형태에 따라, 본 발명은 면역 반응의 활성화에 의해 야기된 병리의 예방 및/또는 치료를 위한, 제약 조성물, 특히 피부과용 조성물의 제조를 위한 유효 성분을 포함한다.

본 발명의 대상은 또한 국소 적용에 적합한 미용 비히클 중 0.001 중량％ 내지 10 중량％의 농도의 포라덴드론 피페로이데스의 식물 추출물, 세스트룸 라티폴리움의 식물 추출물 또는 스필란테스 올레라세아의 식물 추출물, 1×10^-7％ 내지 1％의 농도의 세쿠리닌, 폴리오시딘 아세토니드, 8-옥소슈도팔마틴 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 유효 성분을 포함하는 미용 조성물이다.

본 발명은 또한 국소 적용에 적합한 제약 및/또는 피부과용 비히클 중 포라덴드론 피페로이데스의 식물 추출물, 세스트룸 라티폴리움의 식물 추출물, 스필란테스 올레라세아의 식물 추출물, 세쿠리닌, 폴리오시딘 아세토니드, 8-옥소슈도팔마틴 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 유효 성분을 포함하는, 면역 반응, 특히 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키기 위한, 특히 피부 및/또는 점막의 반응성을 예방하고/거나 치료하기 위한 제약 및/또는 피부과용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 자극 또는 피부 및/또는 점막 알레르기성 반응, 특히 접촉성 반응, 지연성 접촉성 과민증, 접촉성 습진, 두드러기, 특히 접촉성 두드러기, 접촉성 자극성 또는 알레르기성 피부염 및/또는 아토피성 피부염을 예방하고/거나 치료하기 위한 제약 조성물, 및 특히 피부과용 조성물의 제조를 위한 하나 이상의 유효 성분의 용도에 관한 것이다.

유리하게는, 본 발명의 하나 이상의 유효 성분은 항염증제를 또한 포함하는 제약 조성물의 제조를 위해 사용된다.

한 바람직한 방식에 따라, 병리는 자극 또는 피부 및/또는 점막 알레르기성 반응, 특히 접촉성 반응, 지연성 접촉성 과민증, 접촉성 습진, 두드러기, 특히 접촉성 두드러기, 자극성 또는 알레르기성 접촉성 피부염 및/또는 아토피성 피부염이다. 두드러기는 특히 피부 및/또는 점막 소견을 야기하는 접촉성 두드러기 및/또는 식이성 두드러기이다.

바람직하게는, 제약 및/또는 피부과용 조성물은 자극 또는 피부 및/또는 점막 알레르기성 반응, 특히 접촉성 반응, 지연성 접촉성 과민증, 접촉성 습진, 두드러기, 특히 접촉성 두드러기, 자극성 또는 알레르기성 접촉성 피부염 및/또는 아토피성 피부염을 예방하고/거나 치료하기 위한 것이다.

피부 및/또는 점막의 면역 반응의 활성화는 하나 이상의 유형의 면역 세포, 및 특히 수지상 세포 (DC), 예를 들어 표피 랑게르한스 세포 (LC) 및/또는 진피 수지상 세포 (DDC)의 활성화를 특징으로 한다.

피부의 DC는 그의 특이적 마커를 특징으로 하며, LC 및 DDC는 랑게린 및 DC-SIGN을 각각 특이적으로 발현한다.

미성숙 수지상 세포는 활성화제 및/또는 성숙화제 (특히 TNFα 및/또는 LPS (지다당류) 유형)에 의한 활성화전 기본 표현형 상태에 의해 정의된다.

"활성화된" 수지상 세포는 활성화제 및/또는 성숙화제 (특히 TNFα 및/또는 LPS 유형)에 의해 유도된 것과 필적할만한 활성화된 표현형 상태에 의해 정의된다.

활성화제 및/또는 성숙화제, 즉, 하나 이상의 DC 마커의 발현을 증가시키는 작용제는 면역 반응을 촉발하는 DC에 대한 위험 신호이다. 이러한 작용제는 제한되지 않는다. 이들 작용제는 특히 하나 이상의 DC 마커의 발현을 증가시키기 위해 사용되거나 적용되는, 화학적 또는 생물학적 작용제, 예를 들어 LPS 또는 TNFα, 피부를 자극하는 파라미터, 예컨대 기체 스트림, 오염원, 15℃ 미만 또는 40℃ 초과의 온도이다.

본 발명은 특히 포유동물 및 특히 인간에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유효 성분은 식물 추출물 또는 특징화된 분자이다. 추출물은 유리하게는 포라덴드론 피페로이데스, 세스트룸 라티폴리움, 스필란테스 올레라세아, 마프로우네아 구야넨시스 및 이들의 임의의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 식물에서 유래된다. 바람직한 특징화된 분자는 세쿠리닌, 폴리오시딘 아세토니드 및 8-옥소슈도팔마틴으로 구성된 군에서 선택된다. 상기 언급된 유효 성분 중 2종 이상의 혼합물이 또한 본 발명에 의해 그의 임의의 부분에서 포함된다. 한 특히 이로운 방식에 따라, 유효 성분은 세스트룸 라티폴리움의 식물 추출물 및/또는 세쿠리닌이다.

본 발명에 따라 유용한 식물 추출물은 당분야의 표준 방법에 따라 얻는다.

식물에 따라, 100/0 내지 0/100 (v/v)의 용매 또는 용매들의 혼합물, 바람직하게는 극성 양성자성 용매, 및 유리하게는 물, 알코올, 글리콜, 폴리올, 물/알코올, 물/글리콜 또는 물/폴리올 혼합물 (예컨대 에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 또는 다른 글리콜, 예컨대 크실리톨 등과 혼합된 물)에서 뿌리, 근경, 줄기, 목피, 꽃, 과실, 눈, 종자 및 잎에서 선택된 식물의 적어도 일부를 (예를 들어 해리에 의해) 추출하는 것이 이롭다 (바람직하게는 1％ 내지 10％ (w/w)). 그 후, 얻어진 추출물은 활성 가용성 분획물 (조 추출물)을 회수하기 위해 바람직하게는 원심분리 및/또는 여과 및/또는 증류된다.

식물 추출물은 바람직하게는 용매, 예컨대 물, 알코올, 폴리올, 글리콜 또는 이들의 혼합물에서 용해된다. 본 발명에 따라, 식물 추출물은 바람직하게는 조성물의 중량에 대해 0.001 중량％ 내지 10 중량％, 유리하게는 0.01 중량％ 내지 5 중량％, 보다 특히 1 중량％의 농도에서 사용된다.

활성 물질은 예를 들어 동결-건조 또는 미립화에 의해 용매를 증발시켜 농축될 수 있다.

특징화된 분자 (유효 성분)는 유리하게는 극성 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 글리콜 또는 DMSO에서 용해에 의해 제조된다.

본 발명에 따라, 특징화된 분자는 바람직하게는 조성물의 총 중량에 대해 1×10^-7 중량％ 내지 1 중량％, 유리하게는 1×10^-5 중량％ 내지 1×10^-1 중량％, 특히 1×10^-1 중량％의 농도에서 사용된다.

바람직하게는, 조성물은 바람직하게는 국소로 적용되는 미용 또는 제약 조성물, 특히 피부과용 조성물이다.

예를 들어, 최종 미용 제제 중 유효 성분 0.5％ 내지 10％의 비율로, 및 피부 ㎠ 당 가공 미용 제품 1 mg의 적용 비율에서, 피부 ㎠ 당 적용되는 유효 성분의 양은 유리하게는 특징화된 분자의 경우 10^-13 g 내지 10^-12 g, 및 식물 기원의 유효 성분의 경우 10^-5 g 내지 10^-4 g (용매 중 0.001 중량％ 내지 10 중량％의 식물 추출물)이다.

본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 미용 또는 제약 조성물, 바람직하게는 피부과용 조성물의 형태로 사용된다.

조성물은 임의의 적합한 용매 및/또는 임의의 적합한 비히클 및/또는 임의의 적합한 부형제를, 임의로 다른 해당 화합물과 조합하여 함유할 수 있다.

결과로서, 이들 조성물을 위한 부형제는 예를 들어, 보존제, 유연제, 유화제, 계면활성제, 보습제, 증점제, 컨디셔닝제, 매티파잉제(mattifying agent), 안정화제, 항산화제, 텍스쳐화제, 윤기화제, 막형성제, 가용화제, 안료, 염료, 향수 및 선스크린으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 함유한다. 이들 부형제는 바람직하게는 아미노산 및 그의 유도체, 폴리글리세롤, 에스테르, 셀룰로스 중합체 및 유도체, 라놀린 유도체, 인지질, 락토페린, 락토퍼옥시다제, 수크로스-기재 안정화제, E 비타민 및 그의 유도체, 천연 및 합성 왁스, 식물성 오일, 트리글리세리드, 불검화 물질, 피토스테롤, 식물 에스테르, 실리콘 및 그의 유도체, 단백질 가수분해물, 호호바 오일 및 그의 유도체, 지용성/수용성 에스테르, 베타인, 아민 옥시드, 식물 추출물, 수크로스 에스테르, 이산화티타늄, 글리신 및 파라벤으로 구성된 군에서 선택되고, 보다 바람직하게는 부틸렌 글리콜, 스테아레트-2, 스테아레트-21, 글리콜-15 스테아릴 에테르, 세테아릴 알코올, 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 부틸렌 글리콜, 천연 토코페롤, 글리세린, 디히드록시세틸 나트륨 포스페이트, 이소프로필 히드록시세틸 에테르, 글리콜 스테아레이트, 트리이소노나노인, 옥틸 코코에이트, 폴리아크릴아미드, 이소파라핀, 라우레트-7, 카보머, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 비사볼롤, 디메티콘, 수산화나트륨, PEG-30 디폴리히드록시스테아레이트, 카프르/카프릴 트리글리세리드, 세테아릴 옥타노에이트, 디부틸 아디페이트, 포도씨유, 호호바 오일, 황산마그네슘, EDTA, 시클로메티콘, 크산탄 검, 시트르산, 나트륨 라우릴 술페이트, 미네랄 왁스 및 오일, 이소스테아릴 이소스테아레이트, 프로필렌 글리콜 디펠라르고네이트, 프로필렌 글리콜 이소스테아레이트, PEG-8, 밀랍, 수소화된 팜 커넬 오일 글리세리드, 수소화된 팜 오일 글리세리드, 라놀린 오일, 참기름, 세틸 락테이트, 라놀린 알코올, 피마자유, 이산화티타늄, 락토스, 사카로스, 저밀도 폴리에틸렌 및 등장성 염수 용액으로 구성된 군에서 선택된다.

유리하게는, 상기 언급된 조성물은 수성 또는 유성 용액, 수성 겔 또는 크림 또는 유성 겔 (특히 단지 또는 튜브 내), 특히 샤워젤 또는 샴푸; 우유; 에멀젼, 마이크로에멀젼 또는 나노에멀젼 (특히 수중유 또는 유중수 또는 다중 또는 실리콘-기재); 로션 (특히 유리, 플라스틱 또는 용량-계량 병 내에 또는 에어로졸로서); 앰풀; 액체 비누; 피부과용 바; 연고; 무스; 무수 생성물 (바람직하게는 액체, 페이스트 또는 고체, 예를 들어 스틱 형태, 특히 립스틱 또는 정제 형태의 고체임); 겔 캡슐; 시럽; 과립; 분말로 구성된 군에서 선택된 형태로 제제화된다.

본원에서 사용되는 용어 "국소 적용"은 특히 직접 적용에 의한 또는 기화에 의한 피부 및/또는 점막의 표면에 본 발명에 따른 조성물의 적용을 의미한다.

본 발명은 또한 경구 투여, 및 특히 건강기능성식품 적용을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "적합한 미용 또는 피부과용 비히클"은 조성물 또는 그의 구성성분이 어떠한 지나친 독성, 부접합성, 불안정성, 알레르기성 반응 또는 그의 등가물 없이 인간 피부와 접촉하여 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.

많은 미용상 활성인 성분이 피부의 건강 및/또는 물리적 외관의 개선에 대해 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 최선의 효과를 얻기 위한 미용 및/또는 피부과용 조성물의 제제화 방법을 알고 있다. 또한, 본 발명에 기재된 화합물은 서로 조합되는 경우 상승작용 효과를 가질 수 있다. 이들 조합이 또한 본 발명에 포함된다. 문헌 [CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992)]에는 국소 사용에 특히 적합한, 미용 및 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 다양한 미용 및 제약 성분이 기재되어 있다. 이들 부류의 성분의 예로는 아래 화합물들이 포함되나 이에 제한되지 않는다: 연마제, 흡착제, 미적 목적의 화합물, 예컨대 향수, 안료, 염료, 정유, 수렴제 등 (예를 들어: 정향유, 멘톨, 장뇌, 유칼리유, 유게놀, 멘틸 락테이트, 하멜리스 증류물), 항여드름제, 항응집제, 소포제, 항미생물제 (예를 들어: 요오도프로필 부틸카르바메이트), 항산화제, 결합제, 생물학적 첨가제, 완충제, 팽윤제, 킬레이트제, 첨가제, 살생물제, 변성제, 증점제 및 비타민, 및 그의 유도체 또는 등가물, 막형성 물질, 중합체, 불투명화제, pH 조절제, 환원제, 탈색제 또는 미백제 (예를 들어: 히드로퀴논, 코지산, 아스코르브산, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 또는 아스코르빌 글루코사민) 및 컨디셔닝제 (예를 들어: 습윤제).

특히, 피부의 민감성 상태를 가능한 한 완전히 개선시키기 위해, 아래와 같은 특성이 공지된 특징화된 분자 및 식물 추출물에서 선택된 1종 이상의 다른 활성제와 본 발명에 따른 유효 성분을 조합하는 것이 본 발명에 따라 특히 이롭다.

- 신경미용제,

- 외부 진통제,

- 피부 진정제, 특히 PLA2 억제제, 박테리아 기원의 엑소폴리사카라이드, 특히 미용 진정제, 예컨대 아에스쿨루스 히포카스타눔(Aesculus hippocastanum)의 추출물 (CAS 8053-39-2), 특허 제EP 0 987 010호에 기재된 알테로모나스 페르멘트(Alteromonas ferment)의 추출물, 특허 제FR2847267호에 기재된 활성 구성성분 및 특히 푸에라리아 로바타(Pueraria lobata) 뿌리의 추출물 및 출원인에 의해 명칭 인히파제(Inhipase)™로 시판되는 것,

- 창상 치유제, 예컨대 판테놀 및 그의 유도체, 예를 들어 에틸 판테놀, 알로에 베라, 판토텐산 및 그의 유도체, 알란토인, 비사볼롤 및 이칼륨 글리시리지네이트,

- 항염증제, 예컨대 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증성 약물, 특히 사이토카인 및 케모카인의 생성 억제제, 시클로옥시게나제의 억제제, 산화질소 (NO) 및 NOS 산화질소 신타제의 억제제. 언급될 수 있는 항염증성 생성물의 예로는 혈소판 활성화 인자 (PAF)에 대한 길항제 특성이 공지된, 징코 빌로바(Gingko biloba)의 추출물, 트리락톤 테르펜, 예컨대 징콜라이드, 특히 징콜라이드 B 및 빌로발라이드가 포함된다.

- 엘라스타제 억제제, 예컨대 하슬레아 오스트레아리아(Haslea ostrearia) 추출물, 예를 들어 출원인에 의해 시판되는 남조류 추출물™,

- 보습제 및/또는 항염증제, 예컨대 팔마리아 팔마테(Palmaria palmate) 추출물, 예를 들어 출원인에 의해 시판되는 바다 파슬리™ 생성물.

본 발명은 또한 민감성 피부 또는 잠시 민감성, 반응성 및/또는 과다반응성이 된 피부의 미용 관리 및/또는 치료용으로 공지된 다른 유효 성분과 조합하여 본 발명에 따른 유효 성분을 포함하는 미용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 상기 나열된 다양한 치료용 활성제를 이를 필요로 하는 개인에게 특히 국소 적용을 통해 투여하는 것을 포함하는, 치유적 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 이들 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

한 변이형태에 따라, 본 발명은

(i) 미성숙 또는 활성화된 수지상 세포 (DC)를 포함하는 배양 배지를 제조하고;

(ii) 피부 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키는 능력에 대해 스크리닝될 하나 이상의 물질과 DC를 포함하는 배지를 접촉하게 위치시키고;

(iii) DC 활성화 마커의 발현을 정량하기 위해 DC를 회수하고;

(iv) 피부 및/또는 점막 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키는 유효 성분을 선택하기 위해, 양성 대조, 예컨대 스테로이드성 항염증제, 바람직하게는 덱사메타손으로 얻은 DC 활성화 마커 발현의 값에 대해, 스크리닝될 물질과 접촉하여 위치된 DC의 활성화 마커의 발현의 값을 비교하는 것

을 포함하는, 피부 및/또는 점막 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시킬 수 있는 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

다른 변이형태에 따라, 본 발명은

(i) 미성숙 또는 활성화된 수지상 세포 (DC)를 포함하는 배양 배지를 제조하고;

(ii) 피부 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키는 능력에 대해 스크리닝될 하나 이상의 물질, 및 하나 이상의 DC 마커의 발현의 증가에 의한 면역 반응의 활성화에 대해 공지된 하나 이상의 작용제와, DC를 포함하는 배지를 접촉하게 위치시키고;

(iii) 스크리닝될 물질 또는 유효 성분으로 처리하고 상기 작용제에 의해 자극한 후 DC 활성화 마커의 발현을 정량하기 위해 DC를 회수하고;

(iv) 상기 작용제의 존재하에 피부 및/또는 점막 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키는 유효 성분을 선택하기 위해, 양성 대조, 예컨대 스테로이드성 항염증제, 바람직하게는 덱사메타손으로 얻은 DC 활성화 마커 발현의 값에 대해, 스크리닝될 물질 및 상기 작용제와 접촉하게 위치된 DC의 활성화 마커의 발현의 값을 비교하는 것

을 포함하는, 피부 및/또는 점막 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시킬 수 있는 유효 성분을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

하나 이상의 DC 마커의 발현의 증가를 위한 작용제는 LPS 및 TNFα의 혼합물과 같은 면역 세포의 반응의 자극에 대해 공지된 작용제일 수 있다.

유리하게는, 방법은 또한

(iiib) 어떠한 유효 성분 또는 스크리닝될 물질을 포함하지 않는 상기 배양 배지에서 단계 (iii)에서 회수된 DC의 일부를, 이들 세포가 기저 활성화 수준을 회복하는데 충분한 시간 동안 재배양하고;

(ivb) 피부 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키고 단계 (iiib) 후 면역 반응의 활성화를 허용하는 유효 성분을 선택하기 위해, 단계 (iiib) 후 DC 활성화 마커의 발현을 정량하는 것을 포함한다. 피부 수지상 세포의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키는 능력에 대해 스크리닝될 물질은 정량하는 것이 바람직한 DC 활성화 마커의 발현을 억제시키는 능력을 갖는 물질, 예를 들어 식물 기원의 물질 또는 특징화된 분자이다.

특징화된 분자는 화학 구조가 공지된 분자이다.

DC 활성화 마커는 바람직하게는 CD40, CD54, CD80, CD86, HLA-DR, CCR7 (MIP-3β (대식세포 염증성 단백질-3 베타) 케모카인 수용체임)에서 선택된다.

DC 성숙 마커는 바람직하게는 CD83 및 DC-LAMP에서 선택된다.

DC 활성화 마커의 발현을 정량하기 위해 임의의 방법이 사용될 수 있다. RT-PCR (특히 정량) 또는 유동 세포계수법 또는 ELISA 방법이 유리하게는 사용될 수 있다.

그러므로, DC 활성화 마커의 발현은 DC 활성화 마커의 단백질 발현 및 DC 활성화 마커의 유전자 발현 (mRNA) 양자 모두에 대한 것이다.

대조에 대한 유효 성분의 선택을 위한 DC 활성화 마커의 발현의 값의 비교는 양성 및 음성 대조 (바람직하게는 활성화제 및/또는 성숙화제, 예를 들어 LPS/TNFα 혼합물, 및 면역억제제, 예를 들어 덱사메타손임)에 의해 수행된다.

유리하게는, 스크리닝된 물질은 스크리닝 방법에 따라 LPS 50 ㎍/mL 및 TNFα 10 ng/mL에 의해 구성된 활성화제의 존재 또는 부재하에 LC 또는 DDC에 의해 발현된 CD86의 단백질 발현의 95％ 이하, 바람직하게는 70％ 미만의 LC 또는 DDC에 의해 발현된 CD86의 단백질 발현, 및/또는 LPS 50 ㎍/mL 및 TNFα 10 ng/mL에 의해 구성된 활성화제의 존재 또는 부재하에 LC 또는 DDC에 의해 발현된 CD86의 유전자 발현의 95％ 이하, 바람직하게는 75％ 미만의 LC 또는 DDC에 의해 발현된 CD86의 유전자 발현을 얻을 수 있게 하는 유효 성분 또는 활성 물질로서 고려된다.

다른 실시양태에 따라, 본 발명은 자극제 또는 잠재적 자극제와 조합된 본 발명에 따른 유효 성분의 국소적 용도, 바람직하게는 비치유적 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 유효 성분 및 피부 및/또는 점막과 접촉될 자극제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 자극제는 예를 들어 세제, 접촉성 침습적 작용제, 보존제, 특히 글리콜 유도체, 특히 펜틸렌 글리콜 유도체, 미용 자극제, 예컨대 AHA, 특히 글리콜산, 락트산 및 이들의 혼합물, 예컨대 레티놀 및 레티노이드 유도체, 특히 레틴알데히드, 레티노산, 예컨대 살리실산일 수 있고/거나, 미용 조성물에서 제한된 조건하에 허용되는 문헌 [EEC Directive 76/768]에 나열된 1종 또는 여러 구성성분, 특히 부록(Annex) 3에 나열된 구성성분과 조합될 수 있다.

다른 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 유효 성분은 1일 미용 관리 조성물에서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 하나 이상의 본 발명에 따른 유효 성분, 바람직하게는 세스트룸 라티폴리움 추출물이 효능 투여량으로 피부 및/또는 점막 상에, 가능하게는 미용 자극제와 조합하여 1일마다 적용되는 것인, 미용 관리 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은, 순수하게 예시적인 목적으로 제공되고 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안되는 실시예를 참고하여, 설명적 기재에 비추어 당업자에게 명백하게 될 것이다.

실시예는 본 발명의 중요한 부분을 형성하고, 실시예를 포함하여 그의 전체에서 취해진 기재로부터 임의의 선행 기술에 비해 신규한 것으로 보이는 임의의 특징은 그의 기능 및 그의 보편성에서 본 발명의 중요한 부분을 형성한다.

그러므로, 각 실시예는 포괄적인 범위를 갖는다.

또한, 실시예에서, 달리 명시되지 않는 한 모든 백분율은 중량 기준으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 온도는 섭씨도로 표시되고, 달리 명시되지 않는 한 압력은 대기압이다.

실시예

실시예 1: 피부 수지상 세포, LC 및 DDC의 제조

혈액 단핵구로부터 LC 및 DDC의 제조 공정을 2개의 연속적 단계로 수행하였다.

단계 1: 순환 말초 혈액으로부터 단핵구의 분리 공정

1명 이상의 인간 공여자의 순환 정맥 말초 혈액을 항응고제, 바람직하게는 리튬 헤파린의 존재하에 수집하였다.

순환 혈액으로부터 단핵구의 분리를 유리하게는 아래 프로토콜에 따라 수행할 수 있었다.

1/ 림프구 분리 배지에서 혈액을 원심분리한 후, 단핵 세포를 회수하고, 그 다음:

- 자성 비드에 커플링된 항체 칵테일, 예를 들어 항-CD3, 항-CD7, 항-CD16, 항-CD19, 항-CD56, 항-CD123, 항-글리코포린 A 항체로 표지하였다. 자기화된 컬럼을 통해 통과시킨 후, 오직 표지되지 않은 단핵구를 용리시키고, 회수하였다.

- 또는 자성 비드에 커플링된 단핵구에 대해 특이적인 항체, 예컨대 항-CD14 항체로 표지하였다. 자성 컬럼을 통해 통과시킨 후, 오직 표지된 단핵구만이 컬럼에 잔류하였다. 컬럼을 용리한 후, 표지된 단핵구를 회수하였다.

- 또는 플루오로크롬, 예컨대 피코에리트린에 커플링된 단핵구에 대해 특이적인 항체, 예컨대 항-CD16 항체로 표지하였다. 유동 세포계수법에 의해 세포를 분류한 후, 오직 표지된 단핵구만을 회수하였다.

2/ 당업자에게 익히 공지된 임의의 물리적 분리 공정의 수행에 의해 및 특히 침강 또는 원심분리에 의해 단핵구를 회수하고, 후속적 배양을 위한 추가 가공 없이 용리하였다.

3/ 수집된 혈액 100 mL 당 추출 수율은 약 1억5천만개 (± 2천만개) 단핵 세포였고, 그 중 4천만개 이하의 단핵구를 얻었다.

단계 2: 순환 말초 혈액으로부터 단핵구의 동결 공정

단계 1에서 얻은 단핵구를 mL 당 약 1천만개의 비율로 적합한 동결 배지, 예를 들어 90％ 소 태아 혈청 및 10％ DMSO (디메틸 술폭시드)를 포함하는 배지에서 유리하게는 -80℃ 내지 -196℃에서 동결하고, 바람직하게는 액체 질소에서 -196℃에서 저온동결할 수 있었다.

이 동결 단계는 유리하게는 공여자 풀(pool), 예를 들어 3명의 단핵구 공여자의 세포 혼합물의 제조를 허용하였다.

단계 3: 미성숙 LC 및 DDC를 얻기 위한 단리된 단핵구의 배양 공정

단계 1 및/또는 2에서 얻은 단핵구를 mL 당 약 1백만개의 비율로 한정된 또는 한정되지 않은 배양 배지에서, 바람직하게는 10％ 소 태아 혈청이 보충되고 아래 3종의 사이토카인을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 (37℃, 5％ CO₂) 배양하였다: GM-CSF (과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 200 ng/mL의 비율), TGFβ1 (형질변환 성장 인자 β1, 10 ng/mL의 비율) 및 IL-13 (인터류킨 13, 10 ng/mL의 비율).

배양 6째일에, 미성숙 LC 및 DDC가 동시에 생성되었고, 이들은 생체내 상동체와 표현형적으로 및 기능적으로 매우 유사하였다:

- 시험관내에서 생성된 수지상 세포의 40％ 이하는 세포내에서 랑게린을 발현하였고, 60％ 이하는 DC-SIGN을 발현하였고,

- 시험관내에서 생성된 LC 및 DDC는 기저 수준에서 공동-자극 분자 CD80 및 CD86을 발현하고 성숙 분자 CD83 및 DC-LAMP를 발현하지 않기 때문에 미성숙이었고,

- 48시간 동안 TNFα (유리하게는 10 ng/mL) 및 LPS (유리하게는 50 ㎍/mL)에 의한 자극 후, 분자 CD80 및 CD86의 발현의 증가에 의해 및 성숙 마커 CD83 및 DC-LAMP의 발현의 획득에 의해 입증된 바와 같이, LC 및 DDC는 활성화된 및 성숙 DC의 표현형을 획득하였다.

단계 4: 활성화된 LC 및 DDC를 얻기 위한 단리된 단핵구의 배양 공정

아래 3종의 사이토카인의 존재하에 실시예 1 및 단계 3에 기재된 바와 같이 세포를 배양하였다: GB-CSF (200 ng/mL의 비율), TGFβ1 (10 ng/mL의 비율) 및 TNFα (10 ng/mL의 비율).

24시간 동안 인큐베이션한 후, 활성화된 LC 및 DDC가 동시에 생성되었고, 이들은 생체내 상동체와 표현형적으로 및 기능적으로 매우 유사하였다:

- LC 및 DDC는 아래 분자들의 강한 발현을 나타내었다: 클래스 II MHC 분자인 HLA-DR, 공동-자극 분자인 CD80 및 CD86, 및 이동 수용체인 CCR7.

- LC 및 DDC는 또한 케모카인 MIP-3β에 대해 반응하여 높은 이동 능력을 나타내었다.

실시예 2: 미용 유효 성분의 제조

유효 성분은 상이한 기원을 가졌다 (예를 들어, 식물 기원 또는 특징화된 분자).

식물에 따라, 100/0 내지 0/100 (v/v)의 용매 또는 용매들의 혼합물, 바람직하게는 극성 양성자성 용매, 및 유리하게는 물, 알코올, 글리콜, 폴리올, 물/알코올, 물/글리콜 또는 물/폴리올 혼합물 (예컨대 에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 또는 다른 글리콜, 예컨대 크실리톨 등과 혼합된 물)에서 뿌리, 근경, 줄기, 목피, 꽃, 과실, 눈, 종자 및 잎에서 선택된 식물의 적어도 일부를 (예를 들어 해리에 의해) 추출하는 것이 이롭다 (바람직하게는 1％ 내지 10％ (w/w)). 그 후, 활성 가용성 분획물 (조 추출물)을 회수하기 위해 얻어진 추출물을 바람직하게는 원심분리 및/또는 여과 및/또는 증류하였다. 활성 물질은 유리하게는 용매, 예컨대 물, 알코올, 폴리올, 글리콜 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 물 중 식물 추출물이었다. 용매에 용해된 조 추출물 (유효 성분)을 바람직하게는 유효 성분의 총 중량에 대한 조 추출물의 0.001％ 내지 10％ (v/v), 유리하게는 0.01％ 내지 5％, 보다 특히 1％ (중량)의 농도에서 시험을 위해 사용하였다. 활성 물질을 용매의 증발, 예를 들어 동결-건조 또는 미립화에 의해 농축시킬 수 있었다.

특징화된 분자를 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 글리콜 또는 바람직하게는 DMSO에서 용해시켜 제조하고, 바람직하게는 유효 성분의 1×10^-7 중량％ 내지 1 중량％, 유리하게는 1×10^-5 중량％ 내지 1×10^-1 중량％, 특히 1×10^-1 중량％의 농도에서 시험하였다.

실시예 3: 미용 유효 성분을 스크리닝하기 위한 모델

활성제를 실시예 1에 따라 얻은 LC/DDC에 대해 시험하였다. 유효 성분을 실시예 1의 단계 3에서 얻은 "미성숙" LC/DDC에 대해 시험하는 경우, 이는 예방적 관리라고 지칭하였다. 활성제를 실시예 1의 단계 4에서 얻은 "활성화된" LC/DDC에 대해 시험하는 경우, 이는 치유적 관리라고 지칭하였다.

세포를 예를 들어 ㎠ 당 400,000개 세포의 비율로 한정된 또는 한정되지 않은 배양 배지에서, 바람직하게는 10％ 소 태아 혈청이 보충되고 아래 2종의 사이토카인을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 24-웰 플레이트에 접종하였다: GM-CSF (200 ng/mL의 비율) 및 TGFβ1 (10 ng/mL의 비율). 그 후, 유효 성분을 상기 배양 배지에 첨가하고, 아래 최종 농도에서 시험하였다:

- 식물 추출물의 경우, 배양 배지의 총 중량에 대한 유효 성분 0.001％ 내지 10％ (v/v), 유리하게는 0.01％ 내지 5％, 보다 특히 1％ (중량);

- 특징화된 분자의 경우, 배양 배지의 총 중량에 대한 특징화된 분자 (또는 화학적 분자) 1×10^-7％ 내지 1％ (v/v), 유리하게는 1×10^-5％ 내지 1×10^-1％, 특히 1×10^-1％ (중량).

유효 성분을 상기 배양 배지에서 37℃에서 5％ CO₂ 하에 48시간 이하 동안, 유리하게는 24시간 동안 인큐베이션하였다.

음성 대조는 배양 배지 단독, 또는 시험된 활성제의 농도와 등가인 농도에서 시험된 추출물의 추출 공정 중에 사용된 용매를 함유하는 배양 배지, 또는 주요 항염증성 글루코코르티코이드인 덱사메타손 (10^-8 M)을 함유하는 배양 배지였다. LC/DDC 활성화를 유도하기 위해 사용된 참조 양성 대조는 LPS (유리하게는 50 ㎍/mL) 및 TNFα (유리하게는 10 ng/mL)의 혼합물이었다.

실시예 4: 면역억제제 능력을 갖는 선택된 유효 성분

본 발명자들은 3종의 특징화된 분자 (세쿠리닌, 폴리오시딘 아세토니드 및 8-옥소슈도팔마틴) 및 또한 4종의 식물 추출물 (세스트룸 라티폴리움, 포라덴드론 피페로이데스, 마프로우네아 구야넨시스 및 스필란테스 올레라세아)을 선택하였으며, 이들은 각각 표 1 및 2에 표시하였다.

실시예 5: 미용 유효 성분의 세포독성의 시험

시험된 각 활성제에 대해, 활성제가 세포에 대한 세포독성 효과를 갖지 않고, 활성제의 효과가 유효 성분에 의해 유도된 치사성과 관련된 세포 스트레스의 결과가 아니란 것을 보여주기 위해 세포에 대해 세포 생존성 시험을 수행하였다. 유효 성분은 상기 활성제의 처리 후 세포 생존성이 75％ 미만인 경우 세포독성 효과를 가졌다.

실시예 1 및 단계 3에 기재된 바와 같이, LC/DDC를 P96-웰 플레이트에 200,000개 세포/웰의 비율로 및 실시예 3에 기재된 배양 배지에서 접종하였다. 유효 성분에 의한 세포의 처리는 실시예 3에 기재되어 있다.

상기 유효 성분에 의한 처리 후, 세포를 웰 당 염료 7-AAD (7-아미노악티노마이신 D) 5 ㎕로 접종하였다. 5분 동안 인큐베이션 후, 세포를 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.

불투과성인 막을 투과하지 않는 염료인 음성 7-AAD 또는 생존가능한 세포의 백분율로서 세포 생존성을 표시하였다. 이 분석 기술은 또한 7-AAD에 의해 양성으로 표지된 세포, 즉 활성제를 통해 세포독성 효과를 겪은 세포를 시각화하는 것을 가능하게 하였다.

음성 대조는 배양 배지 단독, 또는 시험된 활성제의 농도와 등가인 농도에서 시험된 추출물의 추출 공정 중에 사용된 용매를 함유하는 배양 배지였다. LC/DDC의 치사성을 유도하기 위해 사용된 참조 양성 대조는 4 μM 최종 농도의 캄프토테신이었다.

표 3은 본 발명에서 선택된 유효 성분에 대한 세포 생존성의 연구 결과를 나타낸다.

결론:

표 3에 기재된 미용 유효 성분은 LC/DDC에 대해 세포독성 효과를 나타내지 않았다. 상기 유효 성분에 의한 처리 후 LC/DDC의 세포 생존성은 거의 100％였다.

실시예 6: 미용 유효 성분의 면역억제 특성의 분석 - 분자 CD86의 단백질 발현의 연구

유효 성분의 면역억제제 잠재성의 평가는 상기 유효 성분, 예를 들어 공동-자극 분자 CD86로 처리된 LC/DDC에 대한 활성화 분자의 발현의 연구를 필요로 하였다.

유동 세포계수법은 상기 활성제로 처리되거나 또는 다르게 처리된 LC/DDC의 세포막 상의 CD86의 단백질 발현의 정량화를 가능하게 하였다.

유동 세포계수법에 의한 미용 유효 성분의 면역억제 특성의 연구를 아래 방법으로 진행하였다:

1/ 미성숙 LC/DDC를 실시예 1 및 단계 3에 기재된 바와 같이 생성시켰다.

2/ 세포를 P24-웰 플레이트에 400,000개 세포/㎠의 비율로 및 실시예 3에 기재된 배양 배지에서 접종하였다. 유효 성분에 의한 세포의 처리는 실시예 3에 기재되어 있다. 동시에, 용량/효과 상관관계를 확립하기 위해 감소하는 용량의 유효 성분으로 세포를 처리하였다: 특징화된 분자의 경우 10^-6 M 내지 5×10^-8 M, 및 식물 추출물의 경우 0.1％ 내지 0.005％.

3/ 활성제로 처리한 후, 세포를 회수한 다음, P96-웰 플레이트에 200,000개 세포/50 ㎕/웰의 비율로 표지 배지 (30％ RPMI, 68％ PBS 및 2％ FCS)에서 접종하였다.

4/ 그 후, 세포를 30분 동안 플루오로크롬, 예컨대 피코에리트린에 커플링된 항-CD86 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다 (유리하게는 10 ㎕의 항-CD86 항체/웰). 음성 표지 대조는 IgG1 대조 이소형에 상응하였다. 이러한 표지 단계 후, 세포를 상기 표지 완충액으로 헹군 후, 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.

5/ 표 4는 선택된 유효 성분의 면역억제 특성의 분석 결과를 나타낸다. 결과를 아래 방법으로 표시하였다: 활성제에 의해 처리되지 않은 대조는 분자 CD86의 100％ 발현이라고 하고, 시험은 유효 성분으로 처리 후 분자 CD86의 잔류 발현 (％)으로서 표시하였다. 음성 대조는 CD86의 발현을 감소시키는 특성을 갖는 덱사메타손으로 처리된 세포에 상응하였다. CD86의 잔류 발현과 반비례인 면역억제 수준을 또한 계산하였다.

결론:

표 4에 기재된 유효 성분은 공동-자극 분자 CD86의 단백질 발현을 감소시키는 능력을 가졌다. 그러므로, 상기 유효 성분은 LC/DDC의 활성화 역치를 증가시키는 능력을 가졌다. 다시 말해서, 면역억제 수준이 더 높고 1에 근접할수록, 활성제의 면역억제 효력이 더 컸다.

결론:

표 5 및 6에 기재된 유효 성분은 그의 최종 농도에 의존적인 면역억제 특성을 가졌다.

실시예 7: 미용 유효 성분의 면역억제 특성의 분석 - 분자 CD86을 코딩하는 메신저 RNA의 발현의 연구

정량적 RT-PCR은 상기 활성제로 처리된 또는 처리되지 않은 LC/DDC에서 단백질 CD86을 코딩하는 메신저 RNA의 발현을 정량하는 것을 가능하게 하였다.

정량적 RT-PCR에 의한 미용 유효 성분의 면역억제 특성의 연구를 아래 방법으로 진행하였다:

1/ 미성숙 LC/DDC를 실시예 1 및 단계 3에 기재된 바와 같이 생성시켰다.

2/ 세포를 P24-웰 플레이트에 400,000개 세포/㎠의 비율로 및 실시예 3에 기재된 배양 배지에서 접종하였다. 유효 성분에 의한 세포의 처리는 실시예 3에 기재되어 있다.

3/ 유효 성분으로 처리한 후, 세포를 회수하고, 예를 들어 pH 7.4 포스페이트 완충액으로 헹군 후 -80℃에서 동결건조에 의해 저장하였다.

4/ 세포의 총 RNA를 예를 들어 실리카 컬럼 상에서 96-웰 추출 키트를 사용하여 추출하고, 260 nm에서 96-웰 분광광도계에서 검정하였다 (순도 표시자: 280 nm에서 단백질의 검정). RNA를 예를 들어 5 ng/㎕로 희석하였다.

5/ 단계 1에서 정성적 RT-PCR을, 예를 들어 액틴 및 분자 CD86에 대한 유전자에 대해 96-웰 플레이트 상에서 최초 RNA 50 ng에 대해 수행하였다. 각 유전자에 대한 특정 프라이머는 하기 표 7에 특정되어 있고, 예를 들어 0.5 μM에서 사용하였다.

연구된 유전자에 대한 특정 프라이머

증폭 파라미터는 유리하게는 아래와 같았다: 실시간 RT-PCR 기술을 쿠안티 텍트(Quanti Tect) SYBR 그린 RT-PCR 키트 (퀴아젠(Qiagen), 프랑스)에 의해 메신저 RNA를 함유하는 웰 상에서 증폭 사이클을 수행하는 옵티콘(Opticon) 써모사이클러에서 수행하였다. 역전사 (RT)를 30분 동안 50℃에서 수행한 후, 15분 동안 95℃에서 수행하여, 역전사효소를 억제하고, 중합효소를 활성화하고, 얻은 상보적 DNA (cDNA)를 변성시켰다. 50 사이클의 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다 (95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초). 각 사이클 끝에, 증폭된 단편의 개수와 비례하는 형광을 판독하였다. 발현 수준은 액틴에 대한 각 유전자의 발현 비율로 정의하였다.

6/ 표 8은 선택된 유효 성분의 면역억제 특성의 분석 결과를 나타낸다. 결과는 아래 방법으로 표시하였다: 처리되지 않은 대조는 분자 CD86을 코딩하는 메신저 RNA의 100％ 발현이라고 하고, 시험은 음성 대조에서 얻은 것과 비교하여 변동 ％로서 CD86을 코딩하는 메신저 RNA의 발현 수준으로서 표시하였다.

결론:

표 7에 기재된 유효 성분은 공동-자극 분자 CD86을 코딩하는 메신저 RNA의 발현을 감소시키는 능력을 가졌다. 그러므로, 상기 유효 성분은 LC/DDC의 활성화 역치를 증가시키는 능력을 가졌다. 다시 말해서, 면역억제 수준이 더 높고 1에 근접할수록, 활성제의 면역억제 효력이 더 컸다.

실시예 8: 면역억제 유효 성분으로 처리된 LC/DDC의 위험 신호에 대해 반응하는 능력의 연구

유효 성분의 면역억제 잠재성의 평가는 또한 상기 유효 성분으로 처리된 경우 위험 신호, 예를 들어 박테리아 감염에 반응하는 LC/DDC의 능력의 연구를 필요로 하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 유효 성분으로 처리되고 동시에 위험 신호에 의해 활성화된 LC/DDC가 위험 신호의 인식 기능에서 여전히 능력이 있는가를 확인하였다. 이를 수행하기 위해, 본 발명자들은 유효 성분으로 처리되고 동시에 LPS 및 TNFα로 자극된 LC/DDC가 이러한 자극 후 공동-자극 분자 CD86을 과다발현할 수 있다는 것을 확인하였다.

유동 세포계수법 연구를 아래 방법으로 진행하였다:

1/ 미성숙 LC/DDC를 실시예 1 및 단계 3에 기재된 바와 같이 생성시켰다.

2/ 세포를 P24-웰 플레이트에 400,000개 세포/㎠의 비율로 및 실시예 3에 기재된 배양 배지에서 접종하였다. LPS (유리하게는 50 ㎍/mL) 및 TNFα (유리하게는 10 ㎍/mL)의 혼합물을 상기 배양 배지에 첨가하였다. 동시에, 세포를 실시예 3에 기재된 유효 성분으로 처리하였다.

3/ 유효 성분으로 처리되고 동시에 LPS 및 TNFα로 자극된 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 유동 세포계수법에 의해 분석하여, "처리 + 자극" 후 분자 CD86의 잔류 발현을 정량하였다.

4/ 표 9는 선택된 유효 성분으로 동시에 처리된 LC/DDC의 위험 신호에 대해 반응하는 능력의 분석 결과를 나타낸다. 결과는 아래 방법으로 표시하였다: 활성제로 처리되지 않고 LPS + TNFα로 자극되지 않은 대조는 분자 CD86의 100％ 발현이라고 하고, 시험은 "처리" 후, "처리 + 자극" 및 "자극" 후 분자 CD86의 잔류 발현으로서 표시하였다. 또한, 본 발명자들은 처리 + 자극 후 CD86의 잔류 발현에 비례하는, 위험 신호에 대해 반응하는 능력의 수준을 계산하였다.

결론:

유효 성분으로 처리되고 동시에 TNFα/LPS로 자극된 LC/DDC는 처리 + 자극 후 공동-자극 분자 CD86의 잔류 발현에 의해 입증된 바와 같이 이러한 위험 신호에 반응하는 능력을 가졌다. 그러므로, 상기 세포는 기저 상태에 근접한 위험 신호에 대해 반응하는 능력을 가졌다.

실시예 9: 면역억제제 유효 성분으로 처리한 후 LC/DDC의 위험 신호에 대해 반응하는 능력의 연구

실시예 8에서와 같이, 본 발명자들은 LC/DDC가 상기 유효 성분으로 먼저 처리된 경우 및 더이상 처리되지 않은 경우, 위험 신호, 예를 들어 박테리아 감염에 반응할 수 있는가를 확인하였다. 이를 수행하기 위해, 본 발명자들은 상기 유효 성분으로 처리된 후 LPS 및 TNFα로 자극된 (유효 성분의 부재하에) LC/DDC가 이러한 자극 후 공동-자극 분자 CD86을 과다발현할 수 있는가를 확인하였다.

유동 세포계수법 연구를 아래 방법으로 진행하였다:

1/ 미성숙 LC/DDC를 실시예 1 및 단계 3에 기재된 바와 같이 생성시켰다.

2/ 세포를 P24-웰 플레이트에 400,000개 세포/㎠의 비율로 및 실시예 3에 기재된 배양 배지에서 접종하였다. 유효 성분에 의한 세포의 처리는 실시예 3에 기재되어 있다.

3/ 그 후, 유효 성분으로 처리된 세포를 유효 성분 없이 및 실시예 3에 기재된 배양 배지에서 추가 48시간 동안 재배양하였다. LPS (유리하게는 50 ㎍/mL) 및 TNFα (유리하게는 10 ㎍/mL)의 혼합물을 상기 배양 배지에 첨가하였다. 그 후, 세포를 실시예 6에 기재된 유동 세포계수법에 의해 분석하여, "예비처리 + 자극" 후 분자 CD86의 잔류 발현을 정량하였다.

4/ 표 10은 선택된 유효 성분으로 먼저 처리되고 더이상 처리되지 않은 LC/DDC의 위험 신호에 대해 반응하는 능력의 분석 결과를 나타낸다. 결과는 아래 방법으로 표시하였다: 활성제로 처리되지 않고 LPS 및 TNFα로 자극되지 않은 대조는 분자 CD86의 100％ 발현이라고 하고, 시험은 "자극" 후 및 "예비처리 + 자극" 후 분자 CD86의 잔류 발현으로서 표시하였다. 또한, 본 발명자들은 예비처리 + 자극 후 CD86의 잔류 발현에 비례하는, 위험 신호에 대해 반응하는 능력의 수준을 계산하였다.

결론:

유효 성분으로 예비처리된 후 TNFα/LPS로 자극된 LC/DDC는 예비처리 + 자극 후 공동-자극 분자 CD86의 잔류 발현에 의해 입증된 바와 같이 이러한 위험 신호에 반응하는 능력을 가졌다. 그러므로, 상기 세포는 기저 상태에 근접한 위험 신호에 대해 반응하는 능력을 가졌다.

실시예 10: 수중유 에멀젼 유형의 미용 또는 제약 제제에서 본 발명의 생성물의 사용

제제 10a:

제제 10b:

제제 10c:

실시예 11: 유중수 유형의 제제에서 본 발명의 생성물의 사용

실시예 12: 샴푸 또는 샤워젤 유형의 제제에서 본 발명의 생성물의 사용

실시예 13: 립스틱 유형 및 다른 무수 생성물의 제제에서 본 발명의 생성물의 사용

실시예 14: 수성 겔 제제 (아이 컨투어, 슬리밍 등)에서 본 발명의 생성물의 사용

실시예 15: 삼중 에멀젼 유형의 제제에서 본 발명의 생성물의 사용

일차 에멀젼 W1/O:

이차 에멀젼 W1/O/W2:

실시예 16: 본 발명의 생성물을 함유하는 제약 제제의 제조

제제 16a: 정제의 제조

제제 16b: 연고의 제조

제제 16c: 주사가능한 제제의 제조

SEQUENCE LISTING <110> BASF BEAUTY CARE SOLUTIONS FRANCE SAS BECHETOILLE, NICOLAS (FOR US ONLY) ANDRE, VALERIE (FOR US ONLY) <120> Active substances that increase the activation threshold of immune cells <130> 1H197810/69PCT <150> FR0851694 <151> 2008-03-14 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> unknown <220> <223> artificial <400> 1 gtggggcgcc ccaggcacca 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> unknown <220> <223> artificial <400> 2 ctccttaatg tcacgcacga tttc 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> unknown <220> <223> artificial <400> 3 ctctttgtga tggccttcct gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> unknown <220> <223> artificial <400> 4 cctgtgggct ttttgtgatg ga 22

Claims (22)

1. 개인의 면역 세포의 활성화 역치를 증가시키기 위한, 세스트룸 라티폴리움(Cestrum latifolium)의 식물 추출물을 유효 성분으로서 포함하는 미용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 개인의 면역 반응의 활성화 역치를 증가시키기 위한 조성물.
3. 제1항에 있어서, 피부 면역 반응의 감소, 방지 또는 감소 및 방지를 위한 조성물.
4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유형의 면역 세포의 활성의 감소, 억제 또는 감소 및 방지를 위한 조성물.
5. 제1항에 있어서, 유효 성분이 세스트룸 라티폴리움 잎의 식물 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 표피 랑게르한스 세포 (LC) 및 진피 수지상 세포 중 적어도 하나의 활성의 감소를 위한 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 진정제와 조합된 조성물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 추출물의 양이 조성물의 0.001 중량％ 내지 10 중량％인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 추출물의 양이 조성물의 0.01 중량％ 내지 5 중량％인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피부에서 미성숙 수지상 세포에 의해 기저 수준에서 발현되는, CD86인 마커의 발현의 감소를 위한 조성물.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 민감성, 반응성, 과다반응성 또는 이들 특성이 조합된 모든 피부의 관리를 위한 조성물로서, 여기서 관리는 병리적 성질을 갖지 않는 피부에 대한 미용 관리인 조성물.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 비후, 자통, 작열감, 소양감, 긴장감 및 가시 인설의 감소, 방지 또는 감소 및 방지를 위한 조성물.
13. 국소 적용에 적합한 미용 비히클 중 0.001 중량％ 내지 10 중량％의 농도의 세스트룸 라티폴리움의 식물 추출물을 유효 성분으로서 포함하는 미용 조성물.
14. 제13항에 있어서, 유효 성분이 세스트룸 라티폴리움 잎의 식물 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제7항에 있어서, 식물 추출물의 양이 조성물의 0.01 중량％ 내지 5 중량％인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제7항에 있어서, 민감성, 반응성, 과다반응성 또는 이들 특성이 조합된 모든 피부의 관리를 위한 조성물로서, 여기서 관리는 병리적 성질을 갖지 않는 피부에 대한 미용 관리인 조성물.
17. 제7항에 있어서, 피부의 비후, 자통, 작열감, 소양감, 긴장감 및 가시 인설의 감소, 방지 또는 감소 및 방지를 위한 조성물.
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