TW201345540A

TW201345540A - 皮下脂肪堆積抑制劑

Info

Publication number: TW201345540A
Application number: TW102111583A
Authority: TW
Inventors: Mika Sawane; Kentaro Kajiya
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2013-11-16
Also published as: WO2013146891A1; JP5808769B2; JP2017082014A; JP2013227289A; JP2013227359A; JP6111167B2

Abstract

本發明提供一種對抑制皮下脂肪之堆積有效之新穎藥劑。本發明提供一種皮下脂肪堆積抑制劑，其係含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成。

Description

皮下脂肪堆積抑制劑

本發明係關於一種含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成的皮下脂肪堆積抑制劑、及含有該等成分而成之APJ活化劑，進而關於一種含有番紅花酸而成之皮下脂肪堆積抑制劑、及含有該成分而成之APJ活化劑。

於活體堆積剩餘能量即呈現肥胖之過程中，脂肪細胞因大小之增大而肥大化，又，由於新脂肪細胞之出現而脂肪細胞數增加。即脂肪組織之過剩狀態即肥胖之原因在於各個脂肪細胞之肥大化(hypertrophy)與脂肪細胞數之增加(hyperplasia)之兩者。

人係由約60兆個細胞構成，推測脂肪細胞之數為約300億個。人之脂肪細胞之平均直徑為約60~90微米，即便觀察白色脂肪組織之固定標本，由於具有一樣大小且為單房性之脂肪滴，因此核係以與細胞膜接觸之形式變形成扁平。若變肥胖，則此種脂肪組織之形態劇烈地發生變化。首先，容易觀察到的是脂肪細胞尺寸之增大。於肥胖人之情形時，脂肪細胞肥大化至最大直徑為140~150微米。由於該肥大化而體積變成約3倍(非專利文獻1)。

肥胖有內藏脂肪型肥胖與皮下脂肪型肥胖，均具有導致包含高血壓症等之自輕度至重症之各種疾病的危險性，為困擾現代人之症狀之一。作為其解決法，有運動，飲食限制，脂肪分、糖分攝取之限制，功能性食品之攝取等各種方法，業界常常期待更有效之預防法、消除法。

淋巴管擴張而具有淋巴管功能異常之小鼠顯示出肥胖之表型，而且亦可知其皮下脂肪層與正常者相比，顯著較厚(非專利文獻2)。

愛帕琳(Apelin)係於1998年作為對長時間為孤兒受體之七次跨膜型G蛋白偶聯型受體即APJ(別名，AGTRL1：Angiotensin receotor like 1(類血管緊張素受體1))的結合因子而自牛之胃之細胞提取液中單離的分子。報告有於心臟、肺、腎臟、脂肪、胃、腦、腎上腺、內皮等各種部位發現人愛帕琳，作為包括源自77胺基酸之前驅蛋白質之36胺基酸之愛帕琳APJ受體的配位子而為人所知(非專利文獻3)。愛帕琳之cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補脫氧核糖核酸)對77胺基酸編碼，但可根據其前驅物形成長式(Long Form)(42~77胺基酸)與短式(Short Form)(65~77胺基酸)。已知任一愛帕琳均會誘導APJ之活化。至今為止，報告有於心血管系統或中樞神經系統中發現APJ，並且暗示APJ於心臟中有心肌收縮作用，於神經系統中控制血管加壓素之發現等參與體液之調節機構。又，APJ作為艾滋病毒之受體亦參與感染，因此係作為根據各種觀點之藥物開發之目標而正突然受到注目之受體。業界認為APJ之發現於血管系統中係於血管內皮細胞或壁細胞中發現，於使用非洲爪蟾之基因表達降低之實驗中顯示出愛帕琳/APJ系統發揮血管產生所必需之作用，又，證實於小鼠或人身上亦於內皮細胞內發現該受體，因此可預想該受體於哺乳類體內亦參與血管形成(非專利文獻4)。又，報告有通過愛帕琳之基因剔除小鼠之分析或試驗管內之血管系統分析，血管內皮細胞於利用受到Ang1刺激時分泌之愛帕琳控制血管直徑(非專利文獻5)。進而，近年來，可知愛帕琳使皮膚淋巴管之功能穩定化，抑制皮下脂肪之堆積(專利文獻1、專利文獻2)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2010-208991號公報

[專利文獻2]日本專利特開2012-020942號公報

[專利文獻3]日本專利特表2009-534452號公報

[專利文獻4]日本專利特開2007-215465號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]增刊實驗醫學Vol. 25, No.15 (2007), pp. 32-40

[非專利文獻2]Nature Genetics 37 (10) (2005), pp. 1072-1081

[非專利文獻3]Kawamata Y et al, (2001) Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. 2-3: 162-171

[非專利文獻4]實驗醫學Vol. 26, No.9 (2008), pp. 1380-1383

[非專利文獻5]Kidoya et al, (2008) Spatial and temporal role of the apelin/APJ system in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis. EMBO J 27: 522-534

本發明之課題在於提供一種對抑制皮下脂肪之堆積有效的新穎藥劑或將作為愛帕琳之受體之APJ活化之新穎藥劑。

本發明者以前藉由西方轉浸法確認於人淋巴管內皮細胞(以下為LEC(Lymphatic Endothelial Cells，淋巴內皮細胞))中發現作為愛帕琳之受體之APJ。又，亦可確認用具有配位子活性之愛帕琳13、及36使LEC承擔刺激，結果亦觀察到藉由LEC之管腔形成。進而，於對導入有於表皮發現大量愛帕琳之基因之小鼠照射紫外線之情形時，確認可較野生型小鼠有意抑制淋巴管之透過性及擴張(專利文獻1)。進而，即便於表皮發現大量愛帕琳之小鼠承擔高脂肪之食餌，與野生型相比，亦可有意抑制皮下脂肪堆積量，於欠缺愛帕琳之小鼠中，確認若承擔高脂肪之食餌，則與野生型相比，可看到顯著之皮下脂肪之堆積(專利文獻2)。該等結果意指愛帕琳經由淋巴管功能之正常化、穩定化而顯示出皮下脂肪堆積抑制作用。

基於上述見解，本發明者此次確立利用愛帕琳/APJ訊號系統之篩選方法，使用該篩選方法，選定松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物以及番紅花萃取物之主成分即番紅花酸作為類愛帕琳藥劑即具有與愛帕琳同樣之功能藥劑。

因此，本申請案包含以下之發明：

[1]一種皮下脂肪堆積抑制劑，其係含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成。

[2]如[1]中記載之皮下脂肪堆積抑制劑，其係應用於皮膚上。

[3]一種用以消除或預防皮下脂肪之堆積之美容學方法，其包括將如[1]中記載之皮下脂肪堆積抑制劑應用於皮膚上。

[4]一種皮下脂肪堆積抑制劑，其係含有番紅花酸而成。

[5]如[4]中記載之皮下脂肪堆積抑制劑，其係經口服攝取。

[6]一種APJ活化劑，其係含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成。

[7]如[6]中記載之APJ活化劑，其係應用於皮膚上。

[8]一種APJ活化劑，其係含有番紅花酸而成。

[9]如[8]中記載之APJ活化劑，其係經口服攝取。

[10]一種皮下脂肪堆積抑制劑，其包括APJ活化劑。

[11]一種抗肥胖劑，其包括APJ活化劑。

[12]一種消腫劑，其包括APJ活化劑。

藉由應用本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑，可預防、消除引起淋巴管之結構之不穩定化的皮下脂肪之堆積。

圖1係表示藉由愛帕琳造成的細胞內cAMP(Cyclic Adenosine monophosphate，環磷酸腺苷)濃度減少、及藉由愛帕琳中和抗體造成之細胞內cAMP濃度減少之抑制的圖表。

圖2係表示單獨添加類愛帕琳藥劑(松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物)(條形圖左)、及添加類愛帕琳藥劑+愛帕琳中和抗體(條形圖右)之情形時之細胞內cAMP濃度上升相對於對照組即毛喉素添加群之比率的圖表。

圖3係表示添加愛帕琳及類愛帕琳藥劑(松樹萃取物及奎寧萃取物)之情形時之淋巴管內皮細胞的細胞移動相對於無添加時(對照組)之比率的圖表。

圖4係表示藉由番紅花酸造成之細胞內cAMP濃度之濃度依賴性減少的圖表。

圖5係表示藉由番紅花酸造成之早上與傍晚之膝下體積之變化率之減少的圖表。

圖6係表示藉由攝取番紅花酸造成之體重變化量之圖表。

圖7係表示藉由攝取番紅花酸造成之體脂肪變化量之圖表。

圖8係藉由攝取番紅花酸造成之皮下脂肪變化量之圖表。

APJ受體亦稱作AGTRL1(類血管緊張素受體1)，為G蛋白偶聯型受體(GPCR)之一，包括380個胺基酸。該跨膜區域顯示與血管緊張素 (AT1)受體40~50%之相同性。已知APJ受體與包括α次單元(約40~50kDa)、β次單元(約35kDa)及γ次單元(約10kDa)之異型三聚物G蛋白質偶聯，且與資訊傳遞(訊號)級聯有關聯。於APJ受體未活化之狀態下，雖然α、β、γ之各個次單元強烈地結合，但藉由愛帕琳與APJ受體結合，而APJ受體活化，引起結合於α次單元上之GDP(Guanosine Diphosphate，二磷酸鳥苷)與GTP(Guanosine Triohosphte，三磷酸鳥苷)之交換反應，而解離成GTP結合型α次單元與βγ次單元。該等次單元使各個目標蛋白質、酶活化，而將訊號向下游傳遞。其後，結合於α次單元上之GTP藉由α次單元之GTPase(Guanosine Triphosphatase，鳥苷三磷酸酶)活性而被分解形成GDP，GDP結合型α次單元與βγ次單元結合再形成鈍性型三聚物。三聚物G蛋白質根據α次單元之功能及基因之差異而分為Gs、Gi、Go、Gq、Gt、Golf等亞家族。Gs與Gi分別使腺苷酸環化酶之活性亢進或抑制腺苷酸環化酶之活性，Go與神經組織之訊號傳遞系統有關係，Gq將磷脂酶Cβ活化，而且Gt與Golf分別發揮對視細胞(視網膜)與嗅覺細胞之訊號傳遞系統較為重要之作用。於APJ受體與愛帕琳結合之情形時，可經由Gi路徑抑制腺苷酸環化酶之活性，因此，其結果是細胞內之cAMP濃度減少。

本發明者利用上述愛帕琳/APJ訊號系統確立類愛帕琳藥劑之篩選方法。具體而言，類愛帕琳藥劑之篩選係首先，作為1次篩選，將轉染cAMP螢光素酶報告基因載體之單離細胞(例如NIH-3T3細胞)播種至96孔板上，於其中添加候補藥劑進行預培養，藉由毛喉素使腺苷酸環化酶活化後，藉由照度計(例如GloMax^TM 96 Microplate Luminometer(Promega))對螢光素酶之發光測定cAMP濃度，選定抑制藉由毛喉素造成之cAMP濃度上升之藥劑。而且，其次，為了確認cAMP濃度之減少係經由APJ之活化，作為2次篩選，一起添加1次篩選中選定之藥劑與愛帕琳中和抗體(例如4G5)，進行與1次篩選相同之螢光素酶分析。其結果，藉由添加中和抗體，可抑制cAMP濃度之減少，可選定使cAMP濃度之減少恢復至80%以上、較佳為90%以上、最佳為100%之藥劑作為類愛帕琳藥劑。

本發明者此次藉由上述篩選方法獲得如下見解：松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物使作為愛帕琳之受體之APJ活化，藉此，具有與愛帕琳相同之功能之可能性極高。因此，根據本發明，可提供含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成的APJ活化劑。

進而，本發明者發現如下驚人之見解：如上所述，愛帕琳經由使淋巴管功能正常化、穩定化而顯示出皮下脂肪堆積抑制作用。因此，根據本發明，可提供尤其是含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成的皮下脂肪堆積抑制劑。

松樹萃取物廣泛分佈於西伯利亞、歐洲、亞洲，為源自於日本亦被視作通常之植被之黑松(Pinus thunbergii)、紅松(Pinus densiflora)、西洋紅松(Pinus sylvestis)等常綠針葉樹即松屬(Pinus)植物的萃取物，可使用該植物之根、葉、樹皮、球花、植物整體、較佳為樹皮、球花作為原材料。已知松樹萃取物含有多糖類或胺基酸等作為成分，且具有保濕作用或柔軟作用。

番紅花萃取物係源自原產於地中海沿岸或小亞細亞之鳶尾科多年草之番紅花(Crocus sativus L.)的萃取物，可使用該植物之球根、根、葉、莖、花、花柱、植物整體、較佳為花柱作為原材料。已知番紅花萃取物含有作為類胡蘿蔔素配糖體之藏紅花、藏紅花苦甙、番紅花酸等作為成分，且具有血液流通促進作用或皮膚細胞活性作用。

奎寧萃取物係源自原產於非洲或南美等熱帶之常綠樹之金雞納屬(Cinchona)植物的萃取物，可使用該植物之根、葉、樹皮、花、植物整體、較佳為樹皮作為原材料。已知奎寧萃取物含有奎尼丁、奎寧、辛可甯等作為成分，且具有保濕作用或血液流通促進作用。

康福利草萃取物原產於歐洲，為源自在日本亦廣泛栽培之多年生草木之康福利草(英名：comfrey)(Symphytum officinale)之植物，可使用根、葉、莖、花、植物整體、較佳為葉作為原材料。已知康福利草萃取物含有尿囊素、單寧、維生素類等作為成分，且具有消炎作用或保濕作用。

上述4種植物為可於日本栽培、可獲取之植物。

該等植物萃取物之萃取方法並無特別限定，較佳為使用溶劑之萃取法。於進行萃取時，亦可直接使用上述原材料，但粉碎、切碎成粉末狀而供於萃取者可於溫和之條件下短時間內以較高之萃取效率進行有效成分之萃取。

萃取溫度並無特別限定，只要視原材料之粉碎物之大小或溶劑之種類等適當設定即可。通常可於室溫至溶劑之沸點之範圍內進行設定。又，萃取時間亦無特別限定，只要視原材料之粉碎物之大小、溶劑之種類、萃取溫度等適當設定即可。進而，於萃取時，可進行攪拌，亦可不進行攪拌而靜置，亦可施加超音波。

例如上述植物萃取物可使原材料浸漬於溶劑中，於室溫或80℃~100℃下進行萃取。將藉由萃取處理所獲得之萃取液過濾後，可直接用作活性成分或使用將視需要濃縮或蒸發而成者作為活性成分。再者，該萃取處理時，原材料可使用經切碎或粉碎者。又，亦可使用未加工之原材料或經乾燥之原材料，或亦可使用經焙煎之原材料。焙煎方法並無特別限定，可列舉於80℃~120℃下焙煎0.5小時~2小時之方法。

萃取所使用之溶劑之種類並無特別限定，較佳為：水(包含熱水等)、醇(例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇)、二醇(例如1,3-丁二醇、丙二醇)、甘油、酮(例如丙酮、甲基乙基酮)、醚(例如二乙醚、二烷、四氫呋喃、丙醚)、乙腈、酯(例如乙酸乙酯、乙酸丁酯)、脂肪族烴(例如己烷、庚烷、液態石蠟)、芳香族烴(例如甲苯、二甲苯)、鹵代烴(例如氯仿)或該等中之兩種以上之混合溶劑。

藉由此種萃取操作自原材料中萃取有效成分，並溶解於溶劑中。含有萃取物之溶劑可直接使用，亦可靜置數日使其熟化後使用。進而亦可施加滅菌、洗淨、過濾、脫色、脫臭等慣用之純化處理後使用。又，視需要亦可進行濃縮或稀釋後使用。進而，亦可使溶劑全部揮發製成固體狀(乾燥物)後使用，亦可使該乾燥物再溶解於任意溶劑中而使用。

進而，本發明者發現，藉由上述篩選方法作為番紅花萃取物之主成分之番紅花酸另外亦可作為類愛帕琳藥劑而發揮功能。因此，作為本發明之另一態樣，可提供含有番紅花酸而成之APJ活化劑或含有該成分而成之皮下脂肪堆積抑制劑。

番紅花酸係具有以下之化學構造

之類胡蘿蔔素，作為梔子之果實或番紅花之雌蕊中所含之色素成分而為人所知。於日本國內，作為梔子黃色素之主成分，可廣泛使用中華面之色調調整、栗子加工品、點心、飲料、預加工食品等。又，近年來，已知作為天然藥之活性成分而受到關注，且具有抗氧化作用、抗致癌作用、抗動脈粥狀硬化作用、胰島素抗性改善作用、神經保護作用、視力衰弱改善作用、血流改善作用、抗炎症作用、疲勞緩和作用等。(專利文獻3：含有番紅花之活性飽腹劑)、(專利文獻4：番紅花酸之視力衰弱改善劑)

本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑可用作對預防、消除引起淋巴管之結構之不穩定化的皮下脂肪細胞之堆積有效之醫藥品或化妝品。皮下脂肪堆積所伴有之疾病、症狀例如可列舉：肥胖、脂肪團(Cellulite)、鬆弛(皮膚老化、彈力下降)、浮腫(水腫)等。本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑藉由抑制皮下脂肪堆積，可預防、改善此種疾病、症狀之發病。又，於存在皮下脂肪型肥胖之症狀之情形時，有發展成自輕度至嚴重之各種疾病、症候群之情形。作為其例，可列舉：睡眠呼吸暫停症候群、尿頻、無毛症、月經異常、由荷爾蒙下降引起之發育不良、貧血、卵巢癌、子宮癌、乳腺癌、不孕症、肝硬化、痔、深部靜脈血栓症、肺塞栓症、靜脈血栓栓塞症等。本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑亦可預防、改善此種疾病、症候群之發病。

本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑可配合其使用目的而適當決定用量、用法、劑型。例如本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑之投予形態並無特別限制，可為口服、非口服、外用等。較佳為外用劑或口服劑。作為劑型，例如可列舉：軟膏、乳霜、乳液、洗劑、面膜、浴用劑等外用劑；注射劑、點滴劑或坐劑等非口服劑；或錠劑、粉劑、膠囊劑、顆粒劑、浸膏劑、糖漿劑等口服劑。

本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑中之類愛帕琳藥劑(松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及/或康福利草萃取物)之調配量可視用途而適當決定，通常於劑總量中為0.00001~20.0質量%，較佳為0.00001~10.0質量%。於類愛帕琳藥劑為番紅花酸之情形時，其調配量通常於劑總量中為0.00001~20.0質量%，較佳為0.00001~ 10.0質量%。

又，於本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑中，除類愛帕琳藥劑(松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及/或康福利草萃取物、或番紅花酸)以外，例如視需要可適當調配通常之食品或醫藥品所使用之賦形劑、防濕劑、防腐劑、強化劑、增黏劑、乳化劑、抗氧化劑、甜味料、酸味料、調味料、著色料、香料等；化妝品等中通常所使用之美白劑、保濕劑、油性成分、紫外線吸收劑、界面活性劑、增黏劑、醇類、粉末成分、色劑、水性成分、水、各種皮膚營養劑等。

進而，於將本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑用作皮膚外用劑之情形時，亦可適當調配皮膚外用劑所慣用之助劑，例如：乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等金屬封阻劑；咖啡因、單寧、維拉帕米、傳明酸及其衍生物、甘草萃取物、光甘草啶、木瓜之果實之熱水萃取物、各種天然藥、乙酸維生素E酯、甘草酸及其衍生物或其鹽等藥劑；維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白劑；葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖類；視黃酸、視黃醇、乙酸視黃醇酯、棕櫚酸視黃醇酯等維生素A類等。

本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑亦可用於以瘦身為目的之美容學方法。該美容學方法例如可藉由以下方式而進行：將本發明之皮下脂肪堆積抑制劑或APJ活化劑應用於擔心皮下脂肪堆積之部位例如呈現脂肪團(脂肪之纖維組織)或浮腫之部位，直接放置或例如結合淋巴管液之流動方向實施按摩等，促進淋巴管液之流動等。該方法之應用部位可列舉：臉部、頭部、手足等全身之所有部位。

藉由以下之實施例對本發明進一步具體地進行說明。再者，本發明並不限定於此。

[實施例] 實驗1.類愛帕琳藥劑之篩選體系之確立

發現APJ之細胞之培養

於NIH3T3細胞中發現大量愛帕琳受體APJ，利用cAMP螢光素酶報告基因載體轉染用潮黴素選擇之穩定株(由大阪大學微生物病研究所高倉伸幸教授提供)，將其用於以下之cAMP螢光素酶分析。培養係於包含200μg/ml之潮黴素之含10% FBS(Fatal Bovine Serun，胎牛血清)之DMEM(Dulbecco's minimum essential medium，達爾伯克必需基本培養基)培養基(Invirtogen)中進行。於分析前一日，於96孔板上每一孔播種2.0×10⁵個細胞，而於含有10% FBS與200μg/ml潮黴素之DMEM培養基上進行培養。

cAMP螢光素酶分析

培養一晚後，利用吸出器將培養基去除，交換成每一孔不含100μl之添加劑之DMEM培養基。3小時後，每一孔添加4μl之GloSensor^TM cAMP試藥(Promega)，進行遮光並於室溫下2小時使其平衡化。其後，以成為0.4μg/ml之方式於不含添加劑之DMEM培養基中稀釋愛帕琳13(Peptide研究所)，每一孔添加50μl上述經稀釋之愛帕琳13(最終濃度為0.1μg/ml)，於室溫下進行5分鐘預培養。進而，添加50μl之調整為40μM之毛喉素(Sigma)(最終濃度為10μM)，並進行15分鐘處理。其後，使用GloMax^TM 96 Microplate Luminometer(Promega)對發光進行測定。又，添加愛帕琳與愛帕琳中和抗體即4G5(由大阪大學提供)進行與上述相同之螢光素酶分析。於該情形時，以成為5μg/ml之方式於不含中和抗體之DMEM培養基中進行稀釋，每一孔添加50μl(最終濃度0.5μg/ml)。同樣地，製備如最終濃度成為1.5、5、15及50μg/ml之中和抗體，分別添加至孔中。作為對照組，不添加愛帕琳而每一孔添加100μl之20μM之毛喉素。

將上述cAMP螢光素酶分析之結果示於圖1中。根據圖1可知，cAMP濃度因愛帕琳而減少，另一方面，伴隨藉由愛帕琳中和抗體造成之愛帕琳活性的消失可抑制cAMP濃度之減少。即，於上述cAMP螢光素酶分析中，首先，於添加候補藥劑替代愛帕琳之情形時，探索使cAMP濃度減少之藥劑(1次篩選)，其次，自該等藥劑中進而篩選於與愛帕琳中和抗體一起添加之情形時可有意抑制cAMP濃度之減少的藥劑(2次篩選)，藉此可短時間且有效率地選定經由愛帕琳受體即APJ之活化而使cAMP濃度減少之藥劑(即類愛帕琳藥劑)。

實驗2.類愛帕琳藥劑之篩選

作為候補藥劑，使用約250種化妝品原材料(資生堂股份有限公司)，藉由實驗1中確立之篩選體系進行類愛帕琳藥劑之選定。

具體而言，將候補藥劑製備成400μg/ml，替代實驗1之cAMP螢光素酶分析中所使用之愛帕琳，而每一孔添加50μl(最終濃度100μg/ml)，進行與實驗1相同之分析。

如圖2所示，松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物使細胞內之cAMP濃度有意減少，又，於與愛帕琳中和抗體(4G5)一併添加之情形時，藉由愛帕琳活性之消失可有意抑制cAMP濃度之減少，因此該等植物萃取物顯示出具有與愛帕琳相同之功能。

實驗3：藥劑之類愛帕琳功能分析(淋巴管內皮細胞之移動能力評價)

將淋巴管內皮細胞播種至Fluoroblok Insert(BD Falcon)，將作為陽性對照組之愛帕琳-13(Peptide研究所)，以最終濃度成為1000ng/ml之方式添加於EBM-2培養基中，並將各藥劑以最終濃度成為0.1%之方式添加於EBM-2培養基中，並進行培養。添加愛帕琳-13及各藥劑4小時後，利用10%緩衝福馬林將細胞固定後，利用Hoechst33432(Molecular Probe)對細胞核進行染色。其後，計算移動至Fluoroblok Insert之下側之薄片之細胞數。將結果示於圖3中。藉由添加松樹萃取物及奎寧萃取物，與利用愛帕琳-13進行刺激之情形相同，顯示出可促進淋巴管內皮細胞之細胞移動，顯示出松樹萃取物、奎寧萃取物具有成為APJ受體之配位子之類愛帕琳之活性。

實驗4：作為類愛帕琳藥劑之番紅花酸之篩選

使用番紅花萃取物之主成分即番紅花酸，藉由實驗1中確立之篩選體系對類愛帕琳之活性進行評價。

具體而言，將番紅花酸(Chrovit P：理研維生素(股))製備成800、400μg/ml，替代實驗1之cAMP螢光素酶分析中所使用之愛帕琳，而每一孔添加50μl番紅花酸(最終濃度為200、100μg/ml)，進行與實驗1相同之分析。

如圖4所示，藉由添加番紅花酸，而cAMP濃度會濃度依賴性地減少，因此顯示出番紅花酸具有使淋巴管穩定化或抑制脂肪堆積等與愛帕琳相同之功能的可能性較高。

實驗5：番紅花酸之水腫改善效果

藉由20歲~50歲之被試驗者24人(男性11人、女性13人)對番紅花酸之水腫改善效果進行評價。

水腫之評價係藉由如下操作而進行：將各被試驗者之足(至腿肚)放入盛有一定量水之水槽(水溫約33℃，容量28kg)中，藉由溢出之水之體積測定膝下體積。水量係每次藉由放置於水槽下之量具進行調整。

使用上述評價體系，於第1日之早上(AM 10：00~11：00)與傍晚(PM 15：00~16：30)測量被試驗者之膝下體積，算出變化率(%：傍晚之膝下體積-早上之膝下體積)。

第2日於測定早上之膝下體積後(AM 10：05~11：05)，使被試驗者攝取番紅花酸(理研維生素股份有限公司)10mg。其後，測量傍晚之膝下體積，以與第1日相同之方式算出變化率。

如圖5所示，於番紅花酸攝取日(第2日)，與未攝取日(第1日)相比，早上與傍晚之膝下體積之變化率有意減少，因此可理解為藉由攝取番紅花酸可改善水腫。

實驗6：番紅花酸之肥胖抑制效果

使30歲之被試驗者3人(男性1人、女性2人)一日攝取一次番紅花酸(理研維生素股份有限公司)10mg連續13週。

使用體重體組成計(HBF-362，OMRON)每隔1週測定一次體重、體脂肪率、皮下脂肪率，算出自攝取前起之變化量。再者，確認試驗期間之被試驗者之運動量及飲食量並無特別之變化。

如圖6~8所示，攝取番紅花酸後之體重、體脂肪率、皮下脂肪率與攝取前相比均有意減少，因此可知藉由攝取番紅花酸可抑制肥胖。

Claims

一種皮下脂肪堆積抑制劑，其係含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成。
如請求項1之皮下脂肪堆積抑制劑，其係應用於皮膚上。
一種用以消除或預防皮下脂肪堆積之美容學方法，其包括將如請求項1之皮下脂肪堆積抑制劑應用於皮膚上。
一種皮下脂肪堆積抑制劑，其係含有番紅花酸而成。
如請求項4之皮下脂肪堆積抑制劑，其係經口服攝取。
一種APJ活化劑，其係含有選自松樹萃取物、番紅花萃取物、奎寧萃取物及康福利草萃取物所組成之群中之一種或複數種成分而成。
如請求項6之APJ活化劑，其係應用於皮膚上。
一種APJ活化劑，其係含有番紅花酸而成。
如請求項8之APJ活化劑，其係經口服攝取。
一種皮下脂肪堆積抑制劑，其包括APJ活化劑。
一種抗肥胖劑，其包括APJ活化劑。
一種消腫劑，其包括APJ活化劑。