JP6696097B2 - タルミ改善剤のスクリーニング法 - Google Patents
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Description
タルミは、皮膚の真皮でのコラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリクスの変性により、弾力性が低下することが原因の1つと考えられており、コラーゲン産生促進作用又はコラゲナーゼ阻害作用を有する成分などがタルミ改善剤として提案されてきた。
また、化粧料等の皮膚外用剤を用いるスキンケアの他にも、顔面をマッサージすることによりタルミを整える手法も、個人で行うのに手軽であったり、エステサロン等で行うのに満足感が得られたりすることから人気がある。そのため、マッサージの際に用いるとより効果的な皮膚外用剤の需要もある。
本発明は、かかる状況に鑑み、マッサージ用皮膚外用剤に含有させるのに好適なタルミ改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング法を確立することを課題とする。
[1]マッサージ用皮膚外用剤に含有させるタルミ改善剤をスクリーニングする方法で
あって、皮下脂肪細胞の接着分子の活性を指標とすることを特徴とする方法。
[2]前記皮下脂肪細胞の接着分子の活性が、該接着分子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きい場合に、前記被験物質はタルミ改善作用を有すると判定する、[1]に記載の方法。
[3]前記被検物質を添加した細胞における前記発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における発現量の120%以上である場合に、前記被検物質はタルミ改善作用を有すると判定する、[2]に記載の方法。
[4]前記皮下脂肪細胞の接着分子が、インテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαV、及びインテグリンβ1から選択される、[1]〜[3]の何れかに記載の方法。
本発明における皮下脂肪細胞の接着分子とは、皮下脂肪細胞の細胞膜に存在し、皮下脂肪細胞どうしの接着又は皮下脂肪細胞と皮下脂肪細胞間にある基底膜との接着に関与するタンパク質をいう。このような接着分子としては、インテグリンスーパーファミリーのタンパク質(以降、単に「インテグリン」と記す場合もある)が好ましく挙げられ、具体的には、特に限定されるものではないが、インテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαV、及びインテグリンβ1からなる群が選択されることがより好ましい。本発明のスクリーニング方法においてその活性を指標とする皮下脂肪細胞の接着分子は、一種でもよいし、二種以上を組み合わせてもよい。スクリーニングの精度の観点から二種以上の皮下脂肪細胞の接着分子を組み合わせることが好ましい。
なお、本発明において「タルミ」は、皮膚の重力方向の変形であるタルミや、表情によるものとは異なる表面上認められる肌の変形を広く意味する語句である。
また、例えば、当該タンパク質の細胞膜上の量を、常法で、例えば抗体を用いる免疫学的手法等で測定して、遺伝子の発現量としてもよい。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない、具体的に皮下脂肪細胞の接着分子の発現量の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物又は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花、花蕾、果実等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、1,3−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される一種又は二種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物1質量部に対して、溶媒を1〜30質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び/又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
まず、皮下脂肪細胞に被検物質を添加し、24時間インキュベーションする。その後、該細胞からmRNAを抽出し、指標とする皮下脂肪細胞の接着分子であるタンパク質(インテグリン等)をコードする遺伝子の発現量を、該遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いてRT−PCRを行い、定量的に測定する。コントロールとして被検物質を添加しなかった細胞においても該遺伝子の発現量を測定する。被検物質を添加した細胞における該遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量(コントロール)に対して大きくなった場合、好ましくはコントロールに対して120%以上、より好ましくは135%以上、さらに好ましくは150%以上となった場合に、前記被検物質はタルミ改善作用を有すると判定する。該判定された物質は、マッサージ用皮膚外用剤に好適に含有し得るタルミ改善剤となり得る。
従来のタルミの予防又は改善用の皮膚外用剤は、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスの補充、産生促進、又は分解抑制によるものであったり、上皮や真皮の細胞の
接着をターゲットにするものであった。これに対して、本発明のスクリーニングによりタルミを改善する作用を有すると判定された物質(タルミ改善剤)は、皮下脂肪細胞の接着をターゲットとする新たな機序でタルミを改善する点、またマッサージとの併用で優れた効果を奏する点で、新たなアプローチによる有効な皮膚外用剤の配合成分となり得る。
本発明に係るマッサージ用皮膚外用剤の製造は、常法に従って前述の成分を処理・配合することにより、困難なく行うことができる。その剤型は、ローション剤型、乳化剤型、オイル剤型等特に限定されず、任意のものを採用できる。
以下の手順で、インテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαV、又はインテグリンβ1のmRNA発現量を指標として、タルミ改善剤をスクリーニングした。
ヒト皮下脂肪前駆細胞を、増殖培地とともに24穴マルチウェルプレートに播種した後、コンフルエントになるまで培養した。その後、分化培地に交換し、3日おきに分化培地を交換しながら10日間培養して、皮下脂肪細胞へと成熟化させた。そこへ被験物質として表2に示す植物抽出エキスを添加し(1μL/ウェル)、24時間培養した後に培地を除き、細胞をPBSで洗浄した。RNeasy Lipid Tissue Kit(QIAGEN社)のQIAzol Lysis Reagentを添加(1mL/ウェル)して細胞からmRNAを抽出し、Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Life Technologies社)によりcDNAとした。QuantiTect Primer Assayを用いてリアルタイムPCRを行い、インテグ
リンα5(ITGA5)、インテグリンα6(ITGA6)、インテグリンαV(ITGAV)、及びインテグリンβ1(ITGB1)の各mRNA量を測定した(n=3)。なお、プライマーは表1に記載のもの(QIAGEN社)を用いた。比較のため、被験物質を添加しない点以外は同様に培養した皮下脂肪細胞における上記因子のmRNA量(コントロール)も測定した。
以下の手順で、上記実施例においてインテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαV、又はインテグリンβ1のmRNA発現量を増加させることが認められた植物エキスについて、マッサージを併用して使用したときのタルミ改善効果を評価した。
表3の処方に従い、植物エキスを含有する皮膚外用剤を調製した。すなわち、イ、ロ、及びハをそれぞれ80℃で加熱溶解して、イにロを徐々に加え、さらにハを加え乳化した後、ホモミキサ−により乳化粒子を均一化し、冷却してクリームを得た。なお、温州ミカンエキスについては、インテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαV、及びインテグリンβ1のいずれのmRNA発現量も増加させない(コントロールに比して120
%未満)ことを予め確認した。
20〜59歳の女性被験者に、製剤1〜3又はプラセボ製剤を1日2回(朝晩)3gずつ、2週間連続で顔面全体に塗布してもらった。各製剤塗布群についてマッサージあり/なしの群をさらに設け、各群5名ずつとした。マッサージありの群では、製剤を顔面に広げた後に、肌を持ち上げるように1分間マッサージしながら塗布してもらった。
試験開始前及び試験開始2週間後に、被験者に肌のタルミ感の自覚をVAS(Visual Analog Scale)を用いて評価してもらった。すなわち、長さ10cmの直線の左端を「タルミ感がない」、右端を「これまでに経験した一番強いタルミ感」とし、試験開始前及び試験開始2週間後のそれぞれにおいて「現在のタルミ感」に当てはまる位置に、前記直線に交わるように線を引くことにより印をつけてもらった。前記直線の左端から印との交点までの距離を計測し、各群の被験者の測定値の平均を算出した。試験開始前及び試験開始2週間後の各群の平均値を一対の標本による平均の検定を用いて比較した。検定の有意水準は両側5%とした。
試験開始前と比べて改善実感が; ある:5点
ややある:4点
変化なし:3点
あまりない:2点
ない:1点
Claims (2)
- マッサージ用皮膚外用剤に含有させるタルミ改善剤をin vitroでスクリーニン
グする方法であって、皮下脂肪細胞の接着分子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の、成熟皮下脂肪細胞における発現量を指標とすることを特徴とし、
前記皮下脂肪細胞の接着分子が、インテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαV、及びインテグリンβ1から選択され、
被験物質を添加した成熟皮下脂肪細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった成熟皮下脂肪細胞における発現量と比較して大きい場合に、前記被験物質はタルミ改善作用を有すると判定する、方法。 - 前記被検物質を添加した成熟皮下脂肪細胞における前記発現量が、被検物質を添加しなかった成熟皮下脂肪細胞における発現量の120%以上である場合に、前記被検物質はタルミ改善作用を有すると判定する、請求項1に記載の方法。
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