JP7247100B2 - ハリ改善作用を有する物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、ハリ改善を目的とした美容、化粧及び食品の技術分野に関する。

皮膚のハリが失われると、シワやたるみの原因となり、見た目の年齢や外観に影響が大きいため、皮膚のハリを維持、改善することは、美容上の大きな課題である。皮膚のハリは、主に真皮層の厚さに起因している。加齢や、紫外線への曝露などによる真皮線維芽細胞の機能低下やマトリクスメタロプロテイナーゼの活性化により、コラーゲンやエラスチンをはじめとする弾性線維が減少することで、真皮層が菲薄化し、ハリが失われる。従来の美容方法では、ハリの改善を達成するために、真皮線維芽細胞の賦活化により弾性線維を増加させることに注力している。その結果、真皮線維芽細胞の賦活作用や、コラーゲン産生促進作用を有する成分が発見され、化粧料に応用されている。

これまでに、コラーゲンの産生促進させることで皮膚の加齢変化を予防・改善する天然物由来の成分としては、イソフラボン化合物、フィトステロールなどが報告され、またボタンボウフウ（特許文献１：WO 2013／099378）、ハクシジン（コノテガシワの種子を乾燥させたもの）（特許文献２：WO2012／057123）の抽出物、リュウキュウチク、オオイタビ及びツルナ（特許文献３：特開2011-195505）抽出物などの植物エキスを見出している。また、線維芽細胞において発現するインテグリンなどの接着分子を介して、線維芽細胞が細胞外マトリクスと相互作用し、かかる相互作用がハリに関与することが知られている（非特許文献１：J. Inv. Dermatology (2013) vol. 133, 899-906）。しかしながらこれまでの知見は、皮膚のハリとコラーゲンまたは線維芽細胞の接着分子との関係に着目するものであり、皮膚のハリと、血管内皮細胞における接着分子との関連については全く知られていない。

国際公開第２０１３／０９９３７８号公報 国際公開第２０１２／０５７１２３号公報 特開２０１１－１９５５０５号公報

J. Inv. Dermatology (2013) vol. 133, 899-906

これまで見出されてきたハリ改善剤やハリ改善のための手法とは異なる新たなメカニズムのハリ改善作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、生体においてより根源的なハリの原因を突き止めるために鋭意研究を行ったところ、驚くべきことに、皮膚のハリと、皮膚における毛細血管との関連を見出した。さらに、研究をすすめたところ、血管内皮細胞の細胞接着に関与するＶＥ-カドヘリン、及び血管細胞と細胞マトリクスとの接着に関与するインテグリンα５の発現が、ハリと関与することを見出し、本発明に至った。

具体的に、本発明は、下記の発明に関する：
[１] 血管内皮細胞における接着分子の遺伝子発現を指標とした、ハリ改善作用を有する物質のスクリーニング方法。
[２] 前記接着分子が、ＶＥ－カドヘリン又はインテグリンα５である、項目１に記載のスクリーニング方法。
[３] 候補薬剤を含む培地で血管内皮細胞を培養し、
血管内皮細胞における接着分子の遺伝子発現を測定し、
対照に比較して前記発現が増加した場合に、候補薬剤をハリ改善作用を有する物質として決定する
を含む、項目１又は２に記載のハリ改善作用を有する物質のスクリーニング方法。
[４] 前記対照が、候補薬剤が添加されない血管内皮細胞培養物における遺伝子発現である、項目１～３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
[５] 前記遺伝子発現が、血管内皮細胞におけるｍＲＮＡ量又はタンパク質量により決定される、項目１～４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
[６] ＶＥ－カドヘリン及びインテグリンα５からなる群から選ばれる少なくとも１の血管内皮細胞における接着分子の発現促進剤を含む、ハリ改善剤。
[７] 美容目的のハリ改善方法であって、ＶＥ－カドヘリン及びインテグリンα５からなる群から選ばれる少なくとも１の血管内皮細胞における接着分子の発現促進剤を適用することを含む、前記ハリ改善方法。
[８] 美容目的のハリ改善方法であって、３７～３９℃の温熱処置を皮膚に適用することを含む、前記ハリ改善方法。
[９] 前記温熱処理により、血管内皮細胞における接着分子の発現が促進される、項目８に記載のハリ改善方法。
[１０] 前記接着分子が、ＶＥ－カドヘリン又はインテグリンα５である、項目９に記載のハリ改善方法。

本発明のスクリーニング方法により、ハリ改善作用を有する物質を選択することができる。また、本発明のスクリーニング方法により選択されたハリ改善作用を有する物質は、ＶＥ－カドヘリン及びインテグリンα５からなる群から選ばれる少なくとも１の血管内皮細胞における接着分子の遺伝子発現を促進することで、ハリ改善作用を発揮し、シワ、たるみといった肌の問題を改善することができる。

図１は、ハリ指標と血管平均太さ（Ａ）、ハリ指標と血管密度（Ｂ）との関係をプロットしたグラフである。 図２は、ヒト線維芽細胞（ＨＦ）とコラーゲンゲルから作成された皮膚モデルと、ヒト線維芽細胞（ＨＦ）及びヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とコラーゲンゲルとから作成された皮膚モデルとにおいて、弾力を比較したグラフである。 図３Ａは、ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて作成された皮膚モデルにおいて、血管構造を標識した蛍光顕微鏡写真であり、また血管新生促進剤であるアンジオポエチン１を添加した場合を併せて示す。 図３Ｂ～Ｄは、図３Ａの蛍光顕微鏡写真において、血管の長さ（μｍ）、体積（μｍ³）、及び交差領域（μｍ²）を測定して、対照とアンジオポエチン１添加群とを比較したグラフである。図３Ｅは、ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて作成された皮膚モデルにおいて、アンジオポエチン１添加群において、弾力が増加したことを示すグラフである。 図４Ａは、皮膚モデルにおいて、ＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現をｓｉＲＮＡにより抑制した場合に、対照に比較して弾力が低下したことを示すグラフである。図４Ｂは、対照のヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて作成された皮膚モデルと、ＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現を抑制したヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて作成された皮膚モデルにおいて、血管構造を標識した蛍光顕微鏡写真である。 図４Ｃ～Ｅは、図４Ｂの蛍光顕微鏡写真において、血管の長さ（μｍ）（図４Ｃ）、体積（μｍ³）（図４Ｄ）、及び交差領域（μｍ²）（図４Ｅ）を測定して、対照と比較したグラフである。 図５Ａは、ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、インテグリンα３、５、及び６の遺伝子発現をそれぞれｓｉＲＮＡにより抑制した場合の弾力変化を示す。図５Ｂは、対照のヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と、インテグリンα５の遺伝子発現を抑制したヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて作成された皮膚モデルにおいて、血管構造を標識した蛍光顕微鏡写真である。 図５Ｃ～Ｅは、図５Ｂの蛍光顕微鏡写真において、血管の長さ（μｍ）（図５Ｃ）、体積（μｍ³）（図５Ｄ）、及び交差領域（μｍ²）（図５Ｅ）を測定して、対照と比較したグラフである。 図６Ａは、若齢被験者から得られた血管内皮細胞を用いて作成された皮膚モデルと、老齢被験者から得られた血管内皮細胞を用いて作成された皮膚モデルとにおいて弾力を比較したグラフである。図６Ｂ－Ｅは、若齢被験者から得られた血管内皮細胞と、老齢被験者から得られた血管内皮細胞とにおけるＶＥ－カドヘリン、インテグリンα３、インテグリンα５、及びインテグリンα６の遺伝子発現レベルを比較したグラフである。 図７は、ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現を指標としてスクリーニングされたハリ改善作用を有する候補物質である、シベリアニンジン、トウキンセンカ、ニクジュヨウエキスのＶＥ－カドヘリンに対する影響を示すグラフである。 図８は、インテグリンα５遺伝子発現を指標としてスクリーニングされたハリ改善作用を有する候補物質である、シベリアニンジン、酵母エキス、ニクジュヨウエキスのインテグリンα５に対する影響を示すグラフである。 図９は、シベリアニンジン摂取群における肌の弾力変化を示すグラフである。 図１０は、皮膚に対する温熱処理による皮膚のハリの変化を示すグラフである。 図１１は、血管内皮細胞の培養温度の違いによる、ＶＥ－カドヘリン及びインテグリンα５の発現量の変化を示すグラフである。

本発明は、血管内皮細胞における接着分子の遺伝子発現を指標とした、ハリ改善作用を有する物質又は処置のスクリーニング方法に関する。本発明において、細胞接着分子は、特に血管内皮細胞において発現される細胞接着分子が好ましい。そのような細胞接着分子のなかで、カドヘリン及びインテグリンが挙げられ、特にＶＥ－カドヘリン及びインテグリンα５が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法は、例えば以下の工程：
候補薬剤を含む培地で血管内皮細胞を培養し、
血管内皮細胞における接着分子の遺伝子発現を測定し、
対照に比較して前記発現が増加した場合に、候補薬剤をハリ改善作用を有する物質として決定する
を含む。ここで、対照は、候補薬剤が含まれない培地で培養している点で異なる場合の接着分子の遺伝子発現である。対照についての実験は、本発明のスクリーニング方法と並行して行われていてもよいし、予め行われていてもよい。

本発明のスクリーニング方法は、候補薬剤を含む培地で血管内皮細胞を培養する工程の前に、血管内皮細胞を培養する前培養工程を含んでもよい。また、候補薬剤を含む培地で血管内皮細胞を培養する工程の後に、候補薬剤を含まない培地でさらに培養する後培養工程を含んでもよい。候補薬剤を含む培地で血管内皮細胞を培養する工程は、前培養工程で得られた培養物に、候補薬剤又はその希釈液を直接添加して培養してもよいし、候補薬剤を含む培地に置換して培養が行われてもよい。

接着分子の遺伝子発現の測定は、血管内皮細胞における接着分子のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定することにより決定されうる。ｍＲＮＡ量の測定としては、定量的ＰＣＲやノーザンブロティングなど本技術分野に既知の手法を用いて行うことができる。タンパク質量についは、ウエスタンブロッティング、免疫染色、ＦＡＣＳなどの本技術分野に既知の任意の手法を用いて行うことができる。これらの手法において、接着分子に特異的に結合する抗体が使用される。

本発明において、ハリとは、皮膚、特に顔の皮膚における弾性を意味する。皮膚における弾力は、キュートメーターやダーマトルクメーターなどにより計測することができ、特にキュートメーターにより計測されるハリ指標により表される。皮膚におけるハリは、真皮層におけるコラーゲンやエラスチンなどの弾性線維量に影響される。本発明は、血管とハリ指標（Ｕｒ／Ｕｆ）との関連性を見出したことに基づいている（図１）。より具体的に血管の平均太さと、皮膚のハリ指標とは相関する。また血管密度とハリ指標とは相関する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験において、ヒト線維芽細胞（ＨＦ）を単独でコラーゲンゲル上で培養した場合に比較して、ヒト線維芽細胞とヒト臍帯血静脈内皮細胞とをコラーゲンゲル上で共培養した場合の方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの皮膚モデルにおいて高い弾力を有することが示されている（図２）。理論に限定されることを意図するものではないが、これらの結果から、皮膚における毛細血管の内皮細胞が、コラーゲンゲルとなんらかの作用をし、ハリに寄与することが考えられる。

血管内皮細胞は、血管の内膜を構成する細胞である。動脈や静脈は内膜、中膜、外膜の三層から構成されるが、毛細血管は、血管内皮細胞から構成される内膜のみで構成される。血管内皮細胞においては、主にＶＥ－カドヘリンという細胞接着分子の働きにより内皮細胞間が接着されており、またインテグリンの働きにより、細胞外マトリクスと血管内皮細胞が接着されている。血管内皮細胞としては、生体から取得された内皮細胞、及びその継代された細胞であってもよいし、株化された細胞であってもよく、また臍帯血静脈内皮細胞、及びその継代された細胞であってもよい。血管内皮細胞として、以下のものに限定されるものではないが、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＥＣ－１が用いられうる。

ＶＥ－カドヘリンは、カドヘリン５又はＣＤ１４４とも呼ばれる分子量約１４０ｋＤａのタンパク質であり、カドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質である。ＶＥ-カドヘリンは、内皮細胞に特異的であり、リンパ管内皮細胞及び血管内皮細胞において発現し、細胞膜に存在する。ＶＥ-カドヘリン分子は、血管内皮やリンパ管内皮の透過性に関与することが知られている。ＶＥ－カドヘリンの発現が増加することで、血管内皮細胞同士の接着性が高まり、血管内皮の安定性に寄与する。ＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現が抑制されると、皮膚モデルにおける弾力が弱くなることが示され（図４Ａ）、また皮膚モデルにおいて血管様の構造が形成しづらくなることも示された（図４Ｂ～Ｅ）。皮膚のハリは、年齢とともに低下することが知られているが（図６Ａ）、ＶＥ－カドヘリンの発現も加齢とともに低下することが示された（図６Ｂ）。理論に限定されることを意図するものではないが、技術常識及びこれらの実験結果から、ＶＥ－カドヘリンの発現が抑制されると毛細血管の安定性が失われ、毛細血管の量が減少することが示された。その結果としてコラーゲンなどの弾性線維の産生や成熟が妨げられると考えられる。ＶＥ－カドヘリンの発現を促進することで、毛細血管が安定化され、結果としてコラーゲンなどの弾性線維の産生や成熟を促進しうる。これにより、老化により減少したハリを改善しうる。

インテグリンは、細胞膜に存在する細胞膜タンパク質であり、細胞接着分子として機能する。インテグリンは、α鎖とβ鎖が会合するヘテロダイマーで存在し、αサブユニットとして少なくとも１８種類、βサブユニットとして８種類が確認されている。インテグリンα５は、主にインテグリンβ１と会合し、インテグリンα５β１を形成することが知られている。インテグリンα５β１は、ＶＬＡ－５、フィブロネクチン受容体とも呼ばれる。血管内皮細胞の細胞膜に発現されたインテグリンα５は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を構成するフィブロネクチンと結合する。細胞外マトリクスの主要成分であるコラーゲンは、フィブロネクチンやラミニンなどの分子と相互作用し高次構造をとっている。血管内皮細胞が、インテグリンα５を介してフィブロネクチンと結合することで、細胞外マトリクスの主要成分であるコラーゲンを毛細血管に引きつける様に収縮させることでコラーゲンを成熟させて、皮膚のハリに寄与しうる。インテグリンα５の発現が抑制されると、コラーゲンを含む皮膚モデルにおいて弾力が弱くなることが示された（図５Ａ）。また皮膚モデルにおいては、血管体積に対しては変化がないものの（図５Ｄ）、交差の数が減少するが（図５Ｅ）、血管の長さは増大した（図５Ｃ）。細胞外マトリクスとの相互作用が弱くなることで、血管の伸張がしやすくなった結果と考えられる。その一方で、血管内皮において発現するインテグリンα３やα６については、その発現抑制による弾力変化は見られなかった（図５Ａ）。皮膚のハリは、年齢とともに低下することが知られているが（図６Ａ）、内皮細胞において発現されるインテグリンのうち、インテグリンα５の発現も年齢とともに低下することが示された（図６Ｄ）一方で、インテグリンα３及びα６の発現量は年齢による発現量の変化が少なかった（図６Ｃ及びＥ）。理論に限定されることを意図するものではないが、技術常識及びこれらの実験結果から、インテグリンα５の発現が抑制されると、毛細血管と細胞外マトリクスとの間の相互作用が弱くなり、結果としてコラーゲンなどの弾性線維の産生や成熟が妨げられることが示された。インテグリンα５の発現を促進することで、毛細血管が細胞外マトリクスと相互作用し、結果としてコラーゲンなどの弾性線維の産生や成熟を促進しうる。これにより、老化により減少したハリを改善しうる。

本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされた、ハリ改善作用を有する物質は、ＶＥ－カドヘリン遺伝子の発現を指標とした場合、ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現促進剤ということもできる。ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現促進剤は、血管内皮細胞においてＶＥ－カドヘリン遺伝子の発現を促進できれば任意の物質であってよい。本発明のスクリーニング方法の１の態様は、血管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現を指標として、化粧品素材、食品素材、医薬品素材などの任意のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことである。このようにして決定されたハリ改善作用を有する物質として、シベリアニンジン、トウキンセンカ、ニクジュヨウから選ばれる植物体のエキスが挙げられる（図７）。これらの物質は、ＶＥ-カドヘリン遺伝子発現促進剤ということができる。

本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされた、ハリ改善作用を有する物質は、インテグリンα５遺伝子発現を指標とした場合、インテグリンα５遺伝子促進剤ということもできる。インテグリンα５遺伝子発現促進剤は、血管内皮細胞においてインテグリンα５遺伝子の発現を促進できれば任意の物質であってよい。本発明のスクリーニング方法の１の態様は、血管内皮細胞におけるインテグリンα５の遺伝子発現を指標として、化粧品素材、食品素材、医薬品素材などの任意のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことである。このようにして決定されたハリ改善作用を有する物質として、シベリアニンジン及びニクジュヨウから選ばれる植物体のエキス及び酵母エキスが挙げられる（図８）。これらの物質は、インテグリンα５遺伝子発現促進剤ということができる。

シベリアニンジン（Siberian Ginseng）とは、ロシア、中国、北海道などの地域に自生するウコギ科の植物であり、エゾウコギ（Eleutherococcus senticosus）とも呼ばれる。実、葉、茎、花、根などの植物体を薬用として用いることができ、特に根の根皮を生薬として用いられている。シベリアニンジンエキスは、シベリアニンジンの植物体、特に根の根皮を溶媒、例えば水や、プロピレングリコール、エタノールなどのアルコール類などにより抽出された抽出物のことをいう。シベリアニンジンエキスは、８週間の経口投与により、肌の弾力を改善することが示された（図９）。

トウキンセンカエキスは、キンセンカ（Calendula officinalis）の花の抽出物である。キンセンカは、南ヨーロッパ原産のキク科の植物である。トウキンセンカエキスは、キンセンカの花を溶媒、例えば水や、プロピレングリコール、エタノールなどのアルコール類などにより抽出された抽出物のことをいう。

ニクジュヨウエキスとは、ホンオニク（Cistanche salsa）の植物体の抽出物である。ホンオニクは、中国内陸から中央アジアを原産とするハマウツボ科の植物である。植物体のうち、茎、葉、花、根などが用いられるが、特に肉質茎を乾燥したものがニクジュヨウと呼ばれ、生薬として使用されている。ニクジュヨウエキスは、ニクジュヨウを溶媒、例えば水や、プロピレングリコール、エタノールなどのアルコール類などにより抽出された抽出物のことをいう。

酵母エキスとは、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母の抽出物である。酵母エキスは、酵母の細胞壁を酸処理、アルカリ処理、又は酵素処理などすることにより破壊することにより得られる。

本発明のスクリーニング方法により選択されたハリ改善作用を有する物質は、ハリ改善剤ともいうことができ、化粧料、医薬品、又は医薬部外品に配合されてもよいし、食品、例えばサプリメントなどの栄養補助食品に配合されてもよい。本発明のハリ改善作用を有する物質、すなわちＶＥ－カドヘリン遺伝子発現促進剤や、インテグリン遺伝子発現促進剤、ハリ改善剤は、任意の経路で投与されてもよいが、血管内皮細胞に作用することから、経口投与、経皮投与、経粘膜投与などの投与経路が好ましい。

以上で説明したとおり、血管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン遺伝子発現及び／又はインテグリンα５遺伝子発現の促進が、皮膚のハリ改善に寄与することが見出された。したがって、本発明の別の態様は、ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現及び／又はインテグリンα５遺伝子発現の促進による、皮膚のハリ改善に関する。より具体的に、血管内皮細胞における接着分子の発現促進剤を含む、ハリ改善剤に関する。ここで血管内皮細胞における接着分子は、ＶＥ－カドヘリン及び/又はインテグリンα５である。さらに別の態様では、ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現促進剤及び/又はインテグリンα５遺伝子発現促進剤を皮膚に適用することを含む、ハリ改善方法に関する。

また、ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現促進剤やインテグリンα５遺伝子発現促進剤によらない場合であっても、これらの遺伝子発現を促進することができれば、ハリ改善が達成されうる。したがって、本発明のさらなる態様では、ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現促進及び/又はインテグリンα５遺伝子発現促進を介したハリ改善方法にも関する。

ハリ改善方法として、温熱処置が挙げられる。皮膚の表面温度は、健常状態で約３１℃～３３℃である。したがって、温熱処置とは、皮膚に対し、表面温度以上の温度を与えることをいう。温熱処置の下限は、皮膚表面温度より高い温度を適用する観点から、３５℃、より好ましくは３７℃である。温熱処置の上限温度は、皮膚に対し火傷を引き起こさない観点から、４５℃未満であることが好ましく、更に好ましくは４２℃、より好ましくは３９℃である。温熱処置の時間は、ハリ改善効果を発揮する範囲で任意に選択することができるが、一例として１分～６０分の範囲が挙げられる。温熱処置時間の下限としては、ハリ改善効果を発揮する観点から１分、より好ましくは２分、さらに好ましくは３分が選択される。温熱処置時間の上限としては、処置の簡便性の観点から、６０分、より好ましくは３０分、さらに好ましくは１０分が選択される。皮膚に対し、３７℃～３９℃の温熱を５分間与えることにより、施術後においてハリが改善することが示された（図１０）。また、血管内皮細胞の細胞培養系において、温度を変化させることにより、ＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現及びインテグリンα５の遺伝子発現量が変化することが示された（図１１）。これらの結果により、皮膚に対する温熱処置が、血管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリンやインテグリンα５の発現を増加させることにより、ハリを改善しうることが示された。本発明のハリ改善方法の効果を確認するため、ＶＥ－カドヘリンやインテグリンα５の遺伝子発現を確認することもできる。

本明細書において、ハリ改善方法は、美容を目的とする美容方法に関しており、医師や医療関係者により行われる治療とは区別できる。このような美容方法は、個人的に行われてもよいし、美容室や、化粧品の販売店、エステサロンなどで行われてもよい。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

実施例１：皮膚における毛細血管の状態とハリ指標との関連
キュートメーター（４００ｍｂａｒ）を用いて、頬部位の皮膚のハリ指標Ｕｒ／Ｕｆを測定した（26歳～39歳の女15名）。また、アジア人の男女（20代～40代）より手術の余剰として採取した皮膚を購入（ILS-Bio社）し、頬部位の皮膚試料を採取し、ＩｍＰＡＣＴの技術を用い、ヒト皮膚切片を透明化した。一次抗体としてＰＢＳで１００倍希釈された抗ＣＤ３１ヒツジ抗体（：Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、二次抗体としてＰＢＳで２００倍希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ５９４標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。染色された皮膚試料をライトシート顕微鏡（カールツァイス社）において観察した。画像解析ソフト（Imaris）を用いて、血管の平均太さ（μｍ）及び血管密度（％）を測定し、予め測定された皮膚のハリ指標Ｕｒ／Ｕｆに対してプロットしたヒストグラムを得た（図１）。ハリ指標と、血管平均太さ及び血管密度とは、それぞれ相関した。

実施例２：皮膚モデルと弾力との関連
６ウェルプレートのうちの３つのウェルを使って皮膚モデルを下記の方法で作製した。氷上で５０ｍＬチューブに０．３％コラーゲン１６．７ｍＬ入れ、１０．６ｍＬのＤＭＥＭ（－）培地を撹拌しながらゆっくり入れることにより、コラーゲンゲルを調製した。次にヒト線維芽細胞（ＨＦ）を、ＤＭＥＭ（－）培地中で１０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、０．５％ＦＢＳを添加したＥＢＭ２培地中で１０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。ＨＦ群においては、調製されたＨＦ培養物を２ｍｌ分取し、そしてＨＦ－ＨＵＶＥＣ群においては調製されたＨＦ培養物及びＨＵＶＥＣ培養物それぞれ２ｍｌ分取した。６ｍＬの０．５％ＦＢＳ添加 ＥＢＭ２培地と混合して１０ｍＬの細胞液を調製した。調製した細胞液１０ｍｌとコラーゲンゲル溶液１０ｍＬを氷上でよく撹拌し、６ウェルプレートのウェルに、１ウェルあたり６ｍｌを入れた。５％加湿雰囲気下において３７℃で一晩振とうさせた後、３７℃で５日間静置して、ＨＦ皮膚モデル及びＨＦ－ＨＵＶＥＣ皮膚モデルを作成した。ＨＦ－ＨＵＶＥＣ皮膚モデルでは、ＨＵＶＥＣ細胞が血管の形状をとることが観察された（データ未掲載）。これらの皮膚モデルにおいてレオメーター（ＰＨＹＳＩＣＡ ＭＣＲ３００）を用いＰＰ１２のジグで弾力を測定した（図２）。ＨＦ皮膚モデルの弾力と、ＨＦ－ＨＵＶＥＣ皮膚モデルの弾力とでは、有意差があった（ｐ＜0.05）。

実施例３：皮膚モデルにおける血管と、ハリとの関連
実施例２のＨＦ－ＨＵＶＥＣ皮膚モデルの調製の際に、（振とう培養前から毎日）にアンジオポエチン１（Ang1）を500ng/mlの濃度で培地に添加した。皮膚モデルにおいて、血管内皮細胞を認識する抗ＣＤ３１ヒツジ抗体（R&D systems）と、二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識抗ヒツジ抗体（Invitrogen）を用いて血管内皮細胞を可視化し、蛍光顕微鏡により観察した。皮膚モデル作製前にPKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit（Sigma）を用いて線維芽細胞を可視化し、蛍光顕微鏡により観察した。アンジオポエチン１の添加により、血管様の形状が増加することが観察された（図３Ａ）。画像解析ソフト（Imaris）を用いて、血管の長さ（μｍ）（図３Ｂ）、体積（μｍ³）（図３Ｃ）、及び交差領域（μｍ²）（図３Ｄ）を測定したところ、アンジオポエチン１の添加により、血管様構造の体積が増大した（図３Ｃ）（^*：ｐ＜０．０５）。また、レオメーター（ＰＨＹＳＩＣＡ ＭＣＲ３００）を用いＰＰ１２のジグで弾力を測定したところ、アンジオポエチン１の添加により皮膚のハリが増大した（図３Ｅ）（^*：ｐ＜０．０５）。アンジオポエチン１は、血管新生作用を有するため、その作用により皮膚モデルにおいて、血管体積を増大できるものと考えられる。

実施例４：血管内皮細胞の遺伝子発現抑制
ＨＵＶＥＣ細胞において、ｓｉＲＮＡを用いて、ＶＥ－カドヘリン（cad)、インテグリンα３（ｉｎｔａ３）、インテグリンα５（ｉｎｔａ５）、及びインテグリンα６（ｉｎｔａ６）の遺伝子発現を抑制した。ｓｉＲＮＡとして、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｉＲＮＡ、ＣＤＨ５ （ＩＤ：ｓ２７８０、ｓ２７８１、ｓ２７８２）、ＩＴＧＡ３（ＩＤ：ｓ７５４１、ｓ７５４２、ｓ７５４３）、ＩＴＧＡ５（ＩＤ：ｓ７５４７、ｓ７５４８．ｓ７５４９）、ＩＴＧＡ６（ＩＤ：ｓ７４９２、ｓ７４９３、ｓ７４９４）を使用した。ＨＵＶＥＣ細胞を１０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。各細胞を沈殿させ、培地を吸い取った後にキットの溶液１００μＬを加え混合した。混合された細胞に上述のｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）をそれぞれ各１μＬずつ加えて全量を４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ（Ｌｏｎｚａ）のキュベットに移した。ＣＥＬＬ ＴＹＰＥをＨＵＶＥＣにセットし４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒスタートさせて遺伝子導入を行った。遺伝子導入が終わった各キュベットにＥＢＭ２（＋）培地を５００μＬ加え、あらかじめＥＢＭ２（＋）培地を１０ｍＬ入れておいた１０ｃｍシャーレにキュベットの内容物の全量を加えた。３７℃で一晩静置し、翌日この細胞を使って実施例２と同様にして皮膚モデルを作製した。各ｓｉＲＮＡを導入された細胞について、定量的ＰＣＲを行い、目的の遺伝子発現が抑制されていることを確認した（データ未掲載）。

ｓｉＲＮＡを導入して、カドヘリン、インテグリンα３、インテグリンα５、及びインテグリンα６がそれぞれ発現抑制された皮膚モデルにおいて、レオメーター（ＰＨＹＳＩＣＡ ＭＣＲ３００）を用いＰＰ１２のジグで弾力を測定した。ｓｉＣｏｎｔを用いた対照と比較して、ＶＥ－カドヘリンに対するｓｉＲＮＡを用いた場合、及びインテグリンα５に対するｓｉＲＮＡを用いた場合において、有意に弾力が低下した（図４Ａ及び５Ａ）。

これらの皮膚モデルにおいて、一次抗体として抗ＣＤ３１ヒツジ抗体（R&D systems）を用い、そして二次抗体としてAlexaFluor594標識抗ヒツジ抗体（Invitrogen）を用いて血管内皮細胞を可視化した（図４Ｂ及び５Ｂ）。ＶＥ－カドヘリン及びインテグリンα５の発現を抑制した場合の皮膚モデルにおいて、血管の構造に変化が見られた。画像解析ソフト（Imaris）を用いて、血管の長さ（μｍ）、体積（μｍ³）、及び交差領域（μｍ²）を測定したところ、ＶＥ－カドヘリン発現を抑制した場合には、全ての点で対照に比較して有意に減少した（図４Ｃ～Ｅ）（^*：ｐ＜0.05、^**：ｐ＜0.01）。インテグリンα５の発現を抑制した場合には、血管の長さ（μｍ）が対照に比較して有意に増加した一方で、交差領域（μｍ²）は対照に比較して有意に減少した（図５Ｃ、Ｅ）（^*：ｐ＜0.05）。

実施例５：皮膚モデルにおける年齢の影響
HUVEC細胞の代わりに、若齢被験者（０歳）の血管内皮細胞、老齢被験者（５０歳）の血管内皮細胞を用いて、実施例２と同様にして皮膚モデルを作成した。作成された皮膚モデルにおいて、レオメーター（ＰＨＹＳＩＣＡ ＭＣＲ３００）を用いＰＰ１２のジグで弾力を測定した（図６Ａ）。若齢被験者の皮膚モデルの弾力と、老齢被験者の皮膚モデルの弾力とでは、有意差があった（^*：ｐ＜0.05）。

若齢被験者（0歳）の血管内皮細胞、老齢被験者（50歳）の血管内皮細胞を６ウェルプレートに２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、一晩静置し、翌日ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をｎａｎｏ ｄｒｏｐで測定し、ＲＮａｃｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで１００ｎｇ／ｍｌに調製した。調製したＲＮＡはＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って下記の遺伝子についてのプライマー（Applied Biosystems社）を用いてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０II）で定量した。内部標準としてβ-アクチン（b-actin: Cat# Hs01060665_g1 ）を用いたところ、若齢被験者由来の細胞と老齢被験者由来の細胞とでは、ＶＥ－カドヘリン（VE-Cadherin：Cat# Hs00170986_m1）及びインテグリンα５（Integrin alpha5: Cat# Hs01547673_m1）の発現量において有意差が見られた（図６Ｂ及びＤ：＊：P＜0.05）一方で、インテグリンα３（Integrin alpha3: Cat# Hs01076879_m1）及びインテグリンα６（Integrin alpha6: Cat# Hs01041011_m1）の発現量において有意差が見られなかった（図６Ｃ及びＥ）。

実施例６：ＶＥ－カドヘリン遺伝子発現を指標としたハリ改善作用を有する物質のスクリーニング方法
ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、０．５％ＦＢＳを添加したＥＢＭ２培地中で１０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、５％ＣＯ₂加湿雰囲気下において３７℃で培養した。候補薬剤として、化粧品素材ライブラリーを用いた。候補薬剤を添加し、６時間培養を行った。培養後、培地を取り除き、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をｎａｎｏ ｄｒｏｐで測定し、ＲＮａｃｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで１００ｎｇ／ｍｌに調製した。調製したＲＮＡはＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って、ＶＥ－カドヘリン遺伝子についてのプライマーを用いてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０II）で定量した。

候補薬剤として、シベリアニンジンエキス、トウキンセンカエキス、ニクジュヨウエキスを用いた場合に、対照に比較してＶＥ－カドヘリン遺伝子の発現が有意に増加した（ｐ＜０．０５：図７）。これらのエキスを、ハリ改善作用を有する物質として選択した。

実施例７：インテグリンα５遺伝子発現を指標としたハリ改善作用を有する物質のスクリーニング方法
ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、０．５％ＦＢＳを添加したＥＢＭ２培地中で１０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、５％CO₂加湿雰囲気下において３７℃で培養した。候補薬剤を添加し、６時間培養を行った。培養後、培地を取り除き、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をｎａｎｏ ｄｒｏｐで測定し、ＲＮａｃｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで１００ｎｇ／ｍｌに調製した。調製したＲＮＡはＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って、インテグリンα５遺伝子についてのプライマーを用いてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ）で定量した。

候補薬剤として、シベリアニンジンエキス、酵母エキス、ニクジュヨウエキスを用いた場合に、対照に比較してインテグリンα５遺伝子の発現が有意に増加した（ｐ＜０．０５：図８）。これらのエキスを、ハリ改善作用を有する物質として選択した。

実施例８：ハリ改善作用を有する物質の摂取によるハリ改善効果
血管内皮細胞において、ＶＥ－カドヘリン遺伝子及びインテグリンα５遺伝子発現を促進する作用を有するシベリアニンジンのハリ改善作用を調べるため、２０名の３０代女性において、シベリアニンジンエキスの８週間摂取試験を行った。試験開始時、４週後、及び８週後において、頬の弾力をキュートメーターＭＰＡ５８０（インテグラル社）により測定したところ、８週後において肌弾力が有意に増加した（ｐ＜０．０５：図９）。

実施例９：温熱刺激によるハリ改善作用
健常女性（１４名）の頬に対し、Ｅｙｅｒｏｎ ＆ Ｌｉｐｒｏｎを３９℃で５分間適用した。適用前後において、頬の皮膚の弾力をキュートメーターMPA580（インテグラル社）により測定した（図１０）。適用前後で、有意に皮膚の弾力が改善した（ｐ＜０．０５）。

実施例１０：温熱刺激による遺伝子発現変化
ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、０．５％ＦＢＳを添加したＥＢＭ２培地中で１０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。細胞を播種後、５％ＣＯ₂加湿雰囲気下において、２９℃、３３℃、及び３７℃の温度に分けて培養を行った。１日間培養後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をｎａｎｏ ｄｒｏｐで測定し、ＲＮａｃｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで１００ｎｇ／ｍｌに調製した。調製したＲＮＡはＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って、インテグリンα５遺伝子及びＶＥ－カドヘリンについてのプライマーを用いてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０II）で定量した（図１１）。ＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現量は、２９℃～３７℃まで温度が高くなるにつれて増加した。インテグリンα５の遺伝子発現量は、２９℃と３３℃との間では変化がなかったものの、３７℃において遺伝子発現量が高かった。

Claims (2)

1. 血管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン又はインテグリンα５の遺伝子発現を指標とした、ハリ改善作用を有する物質のスクリーニング方法であって、以下の（１）乃至（３）の工程：
   （１） 候補薬剤を含む培地で血管内皮細胞を培養し、血管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン又はインテグリンα５の遺伝子発現を測定する工程；
   （２） 候補薬剤が添加されない培地で血管内皮細胞を培養し、血管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン又はインテグリンα５の遺伝子発現を測定する工程、
   （３） 前記（２）の工程で測定された遺伝子発現に比較して、前記（１）の工程で測定された遺伝子発現が増加した場合に、前記候補薬剤を、ハリ改善作用を有する物質として決定する工程
   を含む、前記スクリーニング方法。
2. 前記遺伝子発現が、血管内皮細胞におけるｍＲＮＡ量又はタンパク質量により決定される、請求項１に記載のスクリーニング方法。

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