JP2018512440A - 皮膚細胞に対する若返り活性および／または創傷治癒活性を有する無細胞植物細胞培養懸濁液上清 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は皮膚細胞に対する若返り活性および／または創傷治癒活性を有する無細胞植物細胞培養懸濁上清に関する。【解決手段】本発明は、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清（馴化培地）または当該無細胞上清の画分であって、当該無細胞上清または当該画分は、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子および植物転写因子等のペプチドを含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない、無細胞上清または当該無細胞上清の画分に関する。本発明はさらに、当該上清の画分および皮膚の若返りを促進する化粧用途に関する。【選択図】図３ａ

Description

本発明は、植物細胞培養懸濁馴化培地に由来する組成物、および局所用の薬学的組成物および化粧用組成物に使用されるこれらの培地を得る方法、より詳細には、皮膚の老化プロセスおよび／または皮膚の創傷治癒に対応する局所用組成物に関する。

植物抽出物は、それらから誘導可能な活性成分ゆえに有用な組成物の調製のために製剤および化粧品において広く使用されている。特定の溶媒または混合物を用いた抽出プロセスが標準化されているが、それらは費用のかかるプロセスであり、植物中の化合物の特定の画分（抽出プロセスで使用される溶媒と相溶性がある、すなわち混和性のもの）のみを得ることができる。さらに、植物からの抽出は、植物が利用可能であることを意味し、乾燥した貯蔵植物または植物の一部からも一部の化合物を抽出することができるが、他の場合では、所望のまたは目的の化合物または化合物群が新鮮な材料のみに存在する場合、または新鮮な材料において適切な形態でのみ存在する場合、所望のまたは目的の化合物または化合物群を確実に得るために新鮮な植物が必要とされる。したがって、化粧品に使用する植物抽出物または植物の一部は、とりわけ、季節による制限、種の保護、限られた貯蔵能力、栽培上の問題、および異なる起源の異なる供給元に起因する種類の非均質性といった欠点を示唆する。

この理由から、植物化合物を使用する化粧品および製剤における現在の話題は、目的の化合物を製造するための植物細胞培養の使用に関する。植物細胞培養は、植物のさまざまな部分（葉、果実、茎、根、苗条など）からの細胞の単離を可能にし、単離された植物細胞は分化全能性に達するまで細胞脱分化に供される。これらの脱分化した全能細胞は、細胞が目的の１つまたは複数の化合物を産生するように刺激または特定のストレス条件に付すことができる。植物細胞培養技術を用いて作業することは、季節および供給元とは無関係な、目的の化合物の標準化された継続的な生産という利点を意味する。

植物細胞培養懸濁液またはその抽出物（通常、懸濁液中の植物細胞の溶解に由来する）の使用を開示している多くの文献がある。これらの例としては、リポソームに封入した全培地ブロスにおいてＵｔｔｗｉｌｅｒ Ｓｐａｅｔｌａｕｂｅｒ（スイス起源のリンゴの品種）の細胞溶解物を含み、皮膚幹細胞の増殖、保護および活性化を促進し、さらに毛嚢を保護するのに有用な化粧用皮膚科学的組成物を開示している特許文献１が挙げられる。

同様に、特許文献２は、水溶性馴化培地およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）の細胞内部の水溶性化合物を含む化粧用組成物を開示している。この組成物は、ヒトの皮膚細胞に局所的に適用された場合、若い、より具体的には内因性および外因性老化した哺乳類の皮膚細胞においてＤＮＡ遺伝子プロモータのメチル化を調節することができ、したがって、皮膚をより若く健康な状態にするのに適している。

特許文献３は、脱分化を経ないナス科植物の形成層由来の先天的に未分化の幹細胞を開示している。これらの幹細胞および細胞の増殖を先に支えた（previously supported）馴化培地は、化粧用組成物中の抗薬剤（ａｎｔｉ−ａｇｅｎｔ）活性成分として提案されている。著者らは、脱分化プロセス中に染色体に起こり得る重大な変化を回避するために、形成層から誘導／単離した幹細胞を用いることを提案している。興味深い結果が、ストレスを受けたヒト線維芽細胞のモデルで培地を除去した後の幹細胞のＤＭＳＯ抽出物により示される。他方で、培地の１０％希釈を用いた結果も示されているが、培地のこの１０％希釈用の溶媒は言及されていないため、十分には開示されていない。したがって、この興味深い結果は、幹細胞から培養培地を希釈するために使用され、線維芽細胞を増殖させるために使用される想定されるＤＭＥＭ培地からの栄養素の供給の結果であり得る。

興味深いとはいえ、細胞培養懸濁液溶解物（すなわち、異なる培地に再懸濁し、細胞を破壊するためにさらに均質化された培地からの細胞画分）およびこれらの細胞の抽出物を得ることによって、植物細胞カクテル化合物全体ではなく細胞内に存在する化合物の一部の回収のみが可能になる。これらの組成物は、コラーゲンおよびプロコラーゲン合成に実際の効果を示し、例えば、抗しわ皮膚治療薬、瘢痕形成治療剤および／または皮膚創傷治癒剤として有用である。

他方では、いくつかの利点を提供し、細胞をあらかじめ増殖させた培地中で維持された細胞溶解物またはあらかじめ培地から単離された細胞溶解物は、タンパク質および細胞内部からの他の成分による毒性を避けるために、用量の細かな調整を必要とするであろう。

米国特許出願公開第２０１４／０７２６１９号明細書 国際公開第２０１２／１３０７８３号明細書 欧州特許第２４３６７５９号明細書

これらすべての理由から、植物細胞培養に由来する代替的な組成物および化合物であって、植物細胞培養溶解物と同じ方法で化粧品または製剤、より詳細には、化粧品または治療的適応症において使用され得、容易かつ賃借可能（ｒｅｎｔａｂｌｅ）な方法で得られる組成物および化合物が必要とされている。

本発明者らは、植物の脱分化した細胞培養懸濁液中の細胞全体を除去して得られる無細胞上清が実際に化合物のカクテルを含み、これらの植物細胞の増殖を支持（support）する上清に含まれる他の細胞外生成物と相乗的に作用することを試験し、立証した。これらの無細胞上清は、驚くべきことに、損傷したまたは古い動物細胞、特に哺乳類の真皮（線維芽細胞）および表皮（ケラチノサイト）細胞を再生する目的に役立つ。加えて、これらの上清のいくつかの画分は、細胞間のシグナル伝達化合物（以下参照）として植物において一般に作用し、植物防御、成長および発達に関与する小さなシグナル伝達ポリペプチドとも呼ばれるいわゆるペプチド植物成長因子に富んでいる。

無細胞上清のこれらのペプチド画分は、無細胞上清およびペプチド自体よりも高い効果を生じさえする。さらに、本明細書に開示されるように、無細胞上清およびその任意の画分を得る方法は、化学合成と比較して、環境に優しく、容易であり、かつ高価ではない。これらのペプチド植物成長因子の大部分は、通常、植物または植物の部分に対して直接行われる抽出プロセスでは回収されないことにも留意されたい。これらのペプチド植物成長因子は、その固有のシグナル伝達機能ゆえに一般に細胞外の化合物であることから、多くの場合細胞内よりも細胞外に存在するため、細胞培養溶解物に対する抽出プロセスからでも回収することができない。当該溶解物は、培地から細胞を分離し、特定の溶媒で抽出しながら溶解させることによって得られる。

したがって、第１の態様では、本発明は、皮膚治療のための薬剤として使用するための脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または当該無細胞上清の画分であって、当該無細胞上清または当該画分は、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、当該無細胞上清または画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物を有しておらず、また膜および／または細胞壁を有していない、無細胞上清または画分に関する。無細胞上清または画分は、動物の皮膚細胞の修復剤および／または再生剤としての使用のためのものである。

したがって、本発明は、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清である皮膚への局所使用のための薬剤、または皮膚における（医療または化粧用の）局所使用のための当該無細胞上清の画分を提供する。

懸濁培地における脱分化した植物細胞は、創傷または損傷した組織（カルス）の場合に植物に実際に現れるであろう細胞であるため、植物防御、成長および発達に関与するいわゆる小さなシグナル伝達ポリペプチドを合成する（Ｒｙａｎら、「Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２００２年、Ｓ２５１〜Ｓ２６４別冊参照）。これらのペプチドは、分化または細胞増殖を促進するために、細胞間の適切な通信ネットワークを促進するための細胞外シグナル伝達物質として作用するようである。換言すれば、植物の再生および損傷した植物組織の瘢痕形成に関与する植物化合物（ペプチド）である。本発明の上清またはその任意の画分は、特に、ペプチド性のこれらのいわゆる植物成長因子（ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ等の動物ペプチド成長因子と同様）を含む。

特に、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清、または当該無細胞上清の画分は、真皮細胞および表皮細胞の再生に使用するためのものである。より詳細には、それらは、皮膚の真皮層の老化線維芽細胞の再生に使用するためのものである。老化線維芽細胞については、以下のパラメータ、すなわち、β−ガラクトシダーゼの細胞発現（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）との酵素反応による染色で測定される）、形態学的変化（顕微鏡での視覚化によって測定したときに分散しているよりもむしろ円形の細胞）、顕微鏡での視覚化によって測定された複製指数（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）、および活性酸素種の産生のうちの少なくとも１つによって定義される表現型を有するものと理解されるべきである。インビトロ分析では、老化線維芽細胞は、培地において少なくとも２０回継代された細胞であると考えられる。

ヒト線維芽細胞における老化（複製老化）のマーカーとしてのβ−ガラクトシダーゼの使用は、Ｇｏｂｅｒｄｈａｎらの文献「Ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、１９９５年、Ｖｏｌ．９２、ｐｐ．：９３６３〜９３６７に広く詳述される。

したがって、ペプチド植物成長因子および／または植物転写因子を含有する無細胞上清またはその画分は、皮膚細胞（すなわち、線維芽細胞）における老化を回復させることにより、皮膚の修復剤および／または再生剤としての使用のためのものである。皮膚細胞（すなわち、線維芽細胞）における老化表現型を回復させるこの能力により、４〜３００アミノ酸長のペプチドを有する無細胞上清または任意の画分は、通常深いしわ、および表情線を表す年老いた動物の皮膚、特に老人の皮膚の治療に有用なものとなる。これにより、無細胞上清または任意の画分が皮膚の早期老化の治療および／または予防にも使用可能なものとなる。皮膚の早期老化（一般に光老化としても知られている）は、早期の、すなわち２０〜５０歳のヒトのしわ、変化した色素沈着、および肌の色調の喪失を含む皮膚の外観によって定義される特定の光老化である。光老化した皮膚は、結合組織のコラーゲン性細胞外マトリックスの顕著な変化と、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの分解を担う酵素であるメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）の発現増加を示す。皮膚の早期老化はさまざまな原因によって起こるプロセスであるが、遺伝子的素因に加えて、蓄積されたＵＶおよびＩＲ放射線、有毒物質摂取（喫煙）およびストレスを含む環境要因がこの障害の真の原因であると証明されている。

以下の実施例に示すように、ペプチド植物成長因子および／または植物転写因子（少なくとも４〜３００アミノ酸長のペプチド）を含む無細胞上清またはその画分は、他の従来技術の組成物がもはや有効でなくても、上記の状態すべての治療に有効であり、これは、これらの状態に関連する症状が、これらの従来技術の組成物では改善されず、本発明の無細胞上清またはその画分で改善されることを意味する。

「老化を回復させる」とは、本発明の意味において、細胞におけるマーカーまたは若い細胞の適切な機能の促進を意味する。すなわち、特に、健康な若い細胞に関連するタンパク質につながる遺伝子の発現または抑制のパターンの促進である。当業者が細胞を老化しているまたは幼若であるとして分類することを可能にするマーカー（酵素、転写因子、クロマチン領域、表皮細胞の核タンパク質および基底膜のタンパク質）の例としては、非限定的な例として、Ｋｉ６７タンパク質、ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）タンパク質、ヒストンγＨ２ＡＸ、細胞老化特異的ヘテロクロマチン構造（ＳＡＨＦ）、酵素である細胞老化特異的β−ガラクトシダーゼ（Ｓｅｎ−β−Ｇａｌ）、ＤＮＡ修復タンパク質Ｋｕ７０およびＫｕ８０、核タンパク質ＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ）、ペルオキシレドキシン４（Ｐｒｘ ＩＶまたはＰＲＸ４）酵素、構造タンパク質インテグリンβ１、インテグリンβ４、ラミニンＢ３／５、ケラチン１５、酵素キノンレダクターゼおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ならびに細胞ストレスマーカーである熱ショックタンパク質およびＳ−プロテオソームが挙げられる。

本発明者らの知見によれば、ペプチド植物成長因子および／または植物転写因子を含む植物無細胞上清またはその画分が、動物の皮膚細胞で使用され、古い皮膚のモデルに対して効果が証明されたのは初めてである。したがって、本発明は、植物の組織再生または分化プロセスにおいて植物が一般に使用する活性成分を含み、動物の皮膚細胞に安全かつ効果的に適用することができる活性成分を含む組成物を有することを最終目的として、当該活性成分を容易に回収する方法を想定している。

細胞質の内部含有物を有しておらず、また細胞膜および／または細胞壁を有していないこれらの上清は、ここでは馴化栄養培地または馴化培地または馴化細胞培地と呼ばれる。本発明者らは、血液を遠心分離して、遠心分離機の受け皿の底に血液細胞（赤血球、単核細胞および血小板）を集め、液体上清（血漿、血清）を上部に集めた場合に得られる血漿または血清に当該上清が類似していると提案する。したがって、本発明の無細胞上清は、脱分化した植物細胞が増殖し、消費されなかった培養培地中に最初に存在する化合物の量だけでなく、脱分化した植物細胞を培地に放出する他の化合物も含む。したがって、動物細胞、特に哺乳類、さらに詳細にはヒトの真皮細胞および／または表皮細胞の再生を促進するために、脱分化した細胞を含まず、これらのペプチド植物成長因子および／または転写因子を含むこれらの馴化培地またはその画分の使用が提案される。

植物成長因子または植物転写因子または植物エピジェネティック因子である４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む当該無細胞上清の画分は、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含み、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清から得ることができる「単離された」組成物（または単離された画分）として定義することもできる。特に、そのような組成物の単離は、少なくともタンパク質分離プロセスによってペプチド植物成長因子を含む当該上清から液体を分離または回収することを含み、当該タンパク質分離プロセスは、クロマトグラフィー（固相抽出（ＳＰＥ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、およびそれらのカスケード状の組み合わせから選択される）、ろ過（特にタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）による）、タンパク質沈殿のうちの少なくとも１つおよびそれらの組み合わせを含む。このようにして得たペプチド植物成長因子および／または植物転写因子および／またはエピジェネティック因子を含むこれらの組成物は、特に、上記で明らかにした動物の皮膚細胞の修復剤および／または再生剤としての使用のためのものである。

本発明はまた、特定の植物種の植物細胞懸濁培地に由来する、またはこれから得られ、かつ上に開示された効果を有するこれらの無細胞上清の特に新しい画分を提供する。

したがって、本発明は、第２の態様として、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来の脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清の画分であって、
− ４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、前記画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有しておらず、
（ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖をサポートする馴化培地を得ることと、
（ｂ） 細胞を溶解させることなく馴化培地から植物細胞全体を取り除き、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
（ｃ） 固相抽出クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、無細胞上清の画分を得ることと
を含む方法によって得られる、画分を有する。

以下の実施例から導かれるように、ペプチド性の植物成長因子および／または転写因子および／またはエピジェネティック因子（４〜３００アミノ酸長）を含む上清またはその任意の画分は両方とも、ヒトの古い線維芽細胞培地（１２〜１３回、さらには２０回よりも多く継代した培地由来のもの）における老化プロセスを回復することができ、したがって、細胞の「老化状態」を示す異なる細胞マーカーに従って細胞の若返りを促進する。

上記で定義したこれらの無細胞上清またはその画分の使用は、哺乳類の皮膚（真皮細胞および／または表皮細胞）に適用した場合に毒性が低いかまたはない組成物を使用するという利点を意味する。これは、細胞の内部またはさらには膜からの免疫原性化合物の存在がないためである。さらに、これらの上清または画分組成物は、細胞溶解物由来の組成物ほど複雑ではなく、したがって、懸濁液の全成分に対する活性化合物（ペプチド植物成長因子、転写因子またはエピジェネティック因子）の割合は、植物細胞懸濁液溶解物よりも高い。このように、目的のペプチドは、組成物が目的のペプチドを自然に多く含むという意味で、直接精製される。さらに、細胞懸濁溶解物からの植物抽出物または溶媒抽出物に関連して、本発明の上清の使用は、抽出物中に存在し得、抽出物の固有の複雑さおよび非活性であるが皮膚損傷性である化合物（皮膚でアレルギー反応を引き起こす化合物等）を分離することが難しいために、常に回収される毒性化合物の存在なしにペプチドがより高い割合で容易に回収できるという利点もある。

このように、本発明の別の態様は、有効量の上記に定義した脱分化した植物細胞懸濁培地の上清の無細胞画分を含む皮膚局所用組成物であり、当該画分は、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤（または添加物、excipients）または担体と共に、ペプチド植物成長因子、ペプチド植物転写因子、エピジェネティック因子およびこれらの混合物から選択される、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む。

本発明は、さらに、化粧品における使用のための、特に真皮細胞および表皮細胞の老化状態を回復させるため再生に使用するための脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清または当該無細胞上清の画分に関する。

本発明による使用のための、本発明の無細胞上清またはその任意の画分は、脱分化した植物細胞を培養することによって得ることができることもまた、注目に値する。この脱分化した植物細胞は、容易に得られ、化粧品または製剤中の活性特性を持つ特定の二次代謝産物の産生に広く使用されてきた。さらに、細胞を含まないこの馴化培地（細胞質含有物ならびに膜および／または細胞壁）は、対照および参照組成物との関連で低用量でさえ明らかな効果を有する化合物のカクテルを含む。馴化培地（無細胞上清）中の化合物の例としては、とりわけ下記に記載するものの中でも、アミノ酸、脂質、炭化水素、抗酸化化合物、いくつかの分泌された二次代謝産物（主にフェノール、フラボノイド、フェノール、アルカロイドおよびフィトステロール）、４〜３００アミノ酸長のペプチドが挙げられる。いずれの理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、細胞培養を支持した上清中に見出される化合物の相乗的挙動に起因する驚くべき若返り効果（老化回復）を提案する。当該化合物は、損傷を受けた植物組織または増殖もしくは再生を担う植物細胞の細胞外マトリックスに見出される実際の化合物と最も似ている。本発明は、まったく異なる生物、植物および動物が実際に再生／修復／分化組織プロセスに際して同様に作用するという証拠を仮定しているが、これは、植物由来の細胞外空間からのこうしたペプチドまたは成分が、動物細胞に対して動物由来の同等のペプチド／成分（特に血漿のもの）が起こすのと同様の効果を起こすからである。

図１は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）の培地の無細胞上清（凍結乾燥サンプル０１、０２および０３）およびペプチド性の化合物のみを含む無細胞上清の２つの固相抽出（ＳＰＥ０１、０２）画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の画像である。タンパク質バンドは、クマシーブルー染色によって検出される。 図２は、ＨＤＦにおけるペルオキシレドキシン４（ＰＲＸ４）の百分率（％）での濃度を示すグラフである。ペルオキシレドキシン４は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）において増加したマーカーであり、老化表現型をより若い表現型へと回復させる。ペルオキシレドキシン４は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。それぞれ濃度を左側の棒で示すエラグ酸（９５％超、純粋な分子と命名）の組成物、それぞれ濃度を真ん中の棒で示すザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の（４０％のエラグ酸）抽出物（４０％のエラグ酸を含有、ＰＲＣＦと命名）、およびそれぞれ濃度を右側の棒で示すザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）細胞溶解物（０．４％のエラグ酸を含有）を試験した。ＨＤＦに対する各サンプルの試験濃度は、Ｃ１（０．００１９μｇ／ｍＬ）、Ｃ２（０．００３７５μｇ／ｍＬ）、およびＣ３（０．００７５μｇ／ｍＬ）であった。ＰＲＣＦ（細胞因子が豊富な血漿由来）は、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の乾燥細胞溶解物から生じ、培地中に存在し、かつ懸濁液中の細胞によって消費されない培地中に存在する物質の中でも、ペプチド植物成長因子およびペプチド植物転写因子（両方とも、以下では単純に細胞因子と呼ぶ）だけでなく、細胞質の含有物、細胞膜および細胞壁断片も含む。 図３ａは、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）（パネルＡ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（パネルＢ）からのいくつかの組成物を用いた処理後のＨＤＦ中のペルオキシレドキシン４濃度を示す。ＴＥは植物の通常の抽出物であり、対照は老化線維芽細胞中のＰＲＸ４であり（１００％とみなされる）、ＰＲＣＦはニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）の場合はグリセリン中の細胞溶解物に対応し、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の場合は乾燥細胞溶解物に対応する。ＳＳＰＦ１は、各植物の凍結乾燥された無細胞上清に対応し、ＳＳＰ−Ｆ２は、３０ｋＤａ以下の分子量を有するペプチドを含むＳＰＥ画分に対応する。ＰＭ（純粋な分子由来）はエラグ酸（陽性対照）である。ＰＡＰＲ１は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）切断の修復に関与する酵素であり、ＤＮＡ損傷による老化に関与すると考えられているので、ＨＤＦにおける老化回復試験に役立つ別のマーカーである。 図３ｂは、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）（パネルＣ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（パネルＤ）からのいくつかの組成物を用いた処理後のＨＤＦ中の、ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）濃度を示す。ＴＥは植物の通常の抽出物であり、対照は老化線維芽細胞中のＰＲＸ４であり（１００％とみなされる）、ＰＲＣＦはニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）の場合はグリセリン中の細胞溶解物に対応し、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の場合は乾燥細胞溶解物に対応する。ＳＳＰＦ１は、各植物の凍結乾燥された無細胞上清に対応し、ＳＳＰ−Ｆ２は、３０ｋＤａ以下の分子量を有するペプチドを含むＳＰＥ画分に対応する。ＰＭ（純粋な分子由来）はエラグ酸（陽性対照）である。ＰＡＰＲ１は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）切断の修復に関与する酵素であり、ＤＮＡ損傷による老化に関与すると考えられているので、ＨＤＦにおける老化回復試験に役立つ別のマーカーである。 図４は、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｉａｔｉｃａ）の細胞懸濁培地の凍結乾燥された無細胞上清を用いて８日間処理する前および後の、古いＨＤＦ（上に開示したように、２０回を超える継代）の培地の写真である。 図５は、ＨＤＦ（２０回を超える継代）における細胞生存率（細胞染色による最終数／初期数として測定した生細胞の％）を示すグラフである。図１と同じ濃度（Ｃ１〜Ｃ３）の各種の細胞溶解物（ＰＲＣＦ）を用いたニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）（パネルＡ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（パネルＢ）の抽出物をパネルで比較する。 図６は、実施例２に関する、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（パネルＡ）由来およびニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）（パネルＢ）由来のいくつかの組成物で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）におけるＫｉ６７タンパク質の発現（Ｙ軸におけるＫｉ６７濃度（％））を示す棒グラフである。エラグ酸は陽性対照（ＰＭ、純粋な分子由来）であり、ＰＲＣＦは、各植物の細胞溶解物であり、ＴＥは、各植物の通常の抽出物であり、ＳＳＰ−Ｆ１は無細胞上清であり、ＳＳＰ−Ｆ２は、３０ｋＤａ以下の分子量を有するペプチドを含む無細胞上清の画分であり、対照または参照値は、未処理老化線維芽細胞中のＫｉ６７タンパク質であった（１００％とみなされる）。 図７は、これもまた実施例２に関する、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（パネルＡ）由来およびニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）（パネルＢ）由来のいくつかの組成物で処理したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）におけるＳｅｎ−β−Ｇａｌ濃度（Ｙ軸におけるＳｅｎ−β−Ｇａｌレベル（％）の発現を示す棒グラフである。エラグ酸は陽性対照（ＰＭ；純粋な分子由来）であり、ＰＲＣＦは、各植物の細胞溶解物であり、ＴＥは、各植物の通常の抽出物であり、ＳＳＰ−Ｆ１は無細胞上清であり、ＳＳＰ−Ｆ２は、３０ｋＤａ以下の分子量を有するペプチドを含む無細胞上清の画分であり、対照または参照値は、未処理老化線維芽細胞中のＳｅｎ−β−Ｇａｌ濃度であった（正規化後０％とみなされる）。 図８は、実施例３に関連して、いくつかの組成物で処理した場合の毛嚢真皮乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）の増殖指数（％）のグラフである。Ｃｔｒｌ ＢＭは、増殖指数の１００％値と一致する基礎対照（未処理ＨＦＤＰＣ）を意味する。ＦＧＦは線維芽細胞成長因子を意味し、ＶＥＧＦは血管内皮成長因子を意味し、Ｃ１およびＣ２は、表２に示すように試験した種の異なる濃度の無細胞上清に対応する。植物種の名称は表２にも示すように略記した。Ｙ軸における増殖指数は百分率（％）である。 図９Ａは、実施例５に関連するものであり、いくつかの組成物の治癒面積（μｍ^２）を示したものである。表６に示すように、ＢＣは基礎対照を意味し；Ｃｔｒｌ＋は、陽性対照（特にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および組織成長因子−β１（ＴＧＦ−β１））であり、Ｃ１およびＣ２は、試験した種の無細胞上清画分（３ｋＤａまたは３０ｋＤａろ過）それぞれの異なる濃度に対応する。植物種の名称も表６に示されるように略記されている。４Ａａ、４ＡａＳ１および４ＡａＳ２は、それぞれ、配列番号１、２および３のペプチドである。 図９Ｂは、実施例５に関連するものであり、４８時間の治療後の基礎対照に対する創傷治癒増加率を示したものである。表６に示すように、ＢＣは基礎対照を意味し；Ｃｔｒｌ＋は、陽性対照（特にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および組織成長因子−β１（ＴＧＦ−β１））であり、Ｃ１およびＣ２は、試験した種の無細胞上清画分（３ｋＤａまたは３０ｋＤａろ過）それぞれの異なる濃度に対応する。植物種の名称も表６に示されるように略記されている。４Ａａ、４ＡａＳ１および４ＡａＳ２は、それぞれ、配列番号１、２および３のペプチドである。

本出願において本明細書で使用されるすべての用語は、特に指示しない限り、当該技術分野で知られている通常の意味で理解されるものとする。本出願で使用される特定の用語の他のより具体的な定義は、以下に述べるものであり、明確に規定された定義がより広い定義を与えない限り、明細書および特許請求の範囲全体を通して一様に適用されることが意図される。

用語「ペプチド植物成長因子」は、最近発見され、４〜３００個のアミノ酸配列を含む植物防御、成長および発達に関与するいわゆるシグナル伝達ポリペプチドを包含する（上記のＲｙａｎら、および以下のＣｚｙｚｅｗｉｃｚら参照）。ペプチドに関して、植物転写因子は、それらが由来する植物において、茎分裂組織の形成、幹細胞維持および体細胞分化のレギュレータとして作用する４〜３００アミノ酸長のペプチドも包含する。

「脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清」という表現は、単純に、任意の目的（二次代謝産物の産生、バイオマス生産等）の培養培地中で懸濁状態での増殖または培養中に脱分化した植物細胞を含む液体を意味する。無細胞上清は、植物細胞の溶解から放出された細胞質内含有物およびその破壊から生じる植物細胞の任意の部分（膜断片、細胞壁断片等）は含まない。無細胞上清は、消費されていない最初の培養培地の成分の中でもとりわけ、植物細胞によって細胞外培地に分泌された化合物をさらに含む。これらの化合物にペプチド植物成長因子がある。無細胞上清は、馴化栄養培地もしくは馴化培地または馴化細胞培地とも呼ばれる（本明細書では区別なく使用される）。無細胞上清が「細胞溶解による細胞質性細胞内含有物を有しておらず、また膜および／または細胞壁を有さない」と言われる場合、微量のいくらかの膜および／または細胞壁ならびに細胞質成分（核成分、オルガネラ等）は、培養プロセス中に時折生じる単離された細胞の自発的破壊のため存在し得ると理解されたい。

「４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清の画分」とは、本発明の意味では、最初に回収された無細胞上清の一部（特に液体部分）であると理解されるべきであるが、この部分はペプチドの回収を可能にする手段、例えばクロマトグラフィー技術、篩過またはタンパク質沈殿によって精製された。

「修復剤および／または再生剤」とは、４〜３００アミノ酸長のペプチドを有する上清およびその任意の画分が、（創傷により、老化により）損傷したまだ生存可能な皮膚組織を回復させる能力、ならびに（ここでも例えば、創傷において）新たな組織を生成するための前駆皮膚細胞からの細胞分裂を促進する能力を有することであると理解すべきである。

無細胞上清またはその画分の「有効量」とは、その適用後に治療効果または美容効果を提供する活性成分（少なくとも当該上清または画分のペプチド植物成長因子）の量を指す。

「薬学的に許容される」という用語は、医療用途の組成物を調製するための製薬技術での使用に適した賦形剤または担体を指す。

本明細書において同じ意味で用いられる「美容的に許容される」または「皮膚科学的に許容される」という用語とは、とりわけ過度の毒性、配合禁忌、不安定性、アレルギー反応なしにヒトの皮膚と接触させて使用するのに適した賦形剤（または添加物、excipients）または担体を指す。

「皮膚局所用組成物」は、従来の意味では、それが適用され、例えば、いくつかの皮膚疾患の治療におけるように、それを必要とする対象の皮膚または粘膜の所定の領域に効果を及ぼす組成物を意味すると理解されるべきである。局所投与は、全身的効果ではなく局所的効果を提供することを意図している。局所用組成物とは、組成物が異なる皮膚層（表皮、真皮）または粘膜層に到達し得るという事実とは独立して、皮膚、頭皮、および粘膜表面に適用されることを意味する。本発明の組成物は、口腔粘膜、生殖器粘膜、および肛門粘膜を含む皮膚、頭皮および粘膜表面上での局所使用に適している。

第１の態様では、本発明は、皮膚治療のための薬剤として使用するための脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または当該無細胞上清の画分であって、当該無細胞上清または当該画分は、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物を有しておらず、また膜および／または細胞壁を有していない、無細胞上清または画分に関する。

特定の実施形態において、それらは、瘢痕形成皮膚用剤としての使用および／または皮膚創傷治癒剤としての使用および／または皮膚若返り剤としての使用のためのものである。これらのすべての効果は、真皮細胞および表皮細胞における老化を回復させる無細胞上清またはその画分の能力に起因する。したがって、５〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清またはその任意の画分は、皮膚（真皮細胞および／または表皮細胞）の老化を介して起こり、皮膚の早期老化、皮膚の瘢痕形成、皮膚創傷治癒およびこれらの障害の組み合わせからなる群から選択される、疾患または状態の予防および／または治療に用いるためのものである。別の特定の実施形態では、それらは、皮膚の早期老化および光老化から選択される状態または疾患の治療で使用するためのものであり、当該状態は、細かいおよび粗いしわ、不規則でまだらな色素沈着、褐色のしみ、ざらつき、黄変、くも状静脈と呼ばれる小さく表面的な血管または毛細管拡張症、およびこれらすべての状態の組み合わせを含む。

これはまた、真皮細胞および／または表皮細胞の老化により生じる疾患または状態の予防および／または治療のための薬剤の調製のための、ペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子から選択される、特にペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子から選択される、４〜３００アミノ酸長のペプチドを両方ともが含む、脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清またはその画分の皮膚局所用途として処方され得る。これはまた、ペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子から選択される、特にペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子から選択される、４〜３００アミノ酸長のペプチドを両方ともが含む、有効量の脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清またはその画分を、このような治療を必要とする哺乳類に投与することを含む、真皮細胞および／または表皮細胞の老化により生じる疾患または状態の予防および／または治療のための方法にさらに関する。

言い換えると、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または当該無細胞上清の画分は、局所用皮膚治療剤として用いるためのものであり、治療剤は皮膚瘢痕形成剤および／または皮膚創傷治癒剤としてのものであり、当該無細胞上清または当該画分は、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、当該無細胞上清または当該画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない。

実施例に示すように、ペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子、特に植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子を含む本発明の植物無細胞上清およびその画分の両方が培養された老化線維芽細胞に適用されたとき、２０回を超える継代を重ねた線維芽細胞における細胞老化は、より若い表現型へと回復する。最初の老化線維芽細胞の老化表現型またはより若い表現型は、ペルオキシレドキシン４およびポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼの発現レベルによって決定された。

第１の態様の別の特定の実施形態では、薬剤として使用するための無細胞上清または当該無細胞上清の画分は、４〜３００アミノ酸長、より具体的には５〜３００アミノ酸長、さらにより具体的には４〜７０アミノ酸長、特に５〜７０アミノ酸長のペプチド植物成長因子を含む。別の特定の実施形態では、それらは、４〜２５アミノ酸長、さらにより具体的には５〜２５アミノ酸長のペプチド植物成長因子を含む。ペプチドの長さ（植物転写因子であるペプチドでさえも）は、植物細胞膜および植物細胞壁を通る転座を条件付けるパラメータである。

この第１の態様のさらに別の特定の実施形態において、脱分化した植物細胞培養懸濁液は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来である。より詳細には、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、およびオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）からなる群から選択される植物由来である。別の特定の実施形態において、脱分化した植物細胞培養懸濁液は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）からなる群から選択される植物由来である。

別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、ペプチド植物成長因子は、ファイトスルフォカイン−α（ＰＳＫ−α）、ファイトスルフォカイン−β（ＰＳＫ−β）、硫酸化チロシン−１を含む植物ペプチド（ＰＳＹ１）、ＲＡＬＦ（Ｒａｐｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、管状要素分化抑制因子（Ｔｒａｃｈｅａｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＤＩＦ）、Ｃｌａｖａｔａ−３（ＣＬＶ３）、ＣＬＥ（Ｃｌａｖａｔａ−Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、ＴＰＤ１（Ｔａｐｅｔｕｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ−１）、表皮パターン形成因子−１（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ−１、ＥＰＦ１）、花の器官脱離欠損（Ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ａｂｓｃｉｓｓｉｏｎ、ＩＤＡ）、ＥＳＲ（Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、Ｐｏｌａｒｉｓペプチド（ＰＬＳ）、根分裂組織成長因子（ＲＧＦ）、ＥＣ１（Ｅｇｇ Ｃｅｌｌ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＥＰ（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、初期ノジュリン４０（Ｅａｒｌｙ Ｎｏｄｕｌｉｎ ４０、ＥＮＯＤ４０）、システミン、ＳＣＲ（Ｓ−ｌｏｃｕｓ Ｃｙｓｔｅｉｎ Ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびこれらの混合物（これらすべての、２つのみ、３つのみ、４つのみ、または列挙したペプチドをすべて含むまでの３つ以上の組み合わせを意味する）からなる群から選択される。

ペプチド植物成長因子以外のペプチドは、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または当該無細胞上清の画分の特定の実施形態にも存在する。これらのペプチドは、特にＷＩＮＤ（Ｗｏｕｎｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、Ｗｕｓｃｈｅｌ（ＷＵＳ）、ＴＣＰ（Ｔｅｏｓｉｎｔｅ Ｂｒａｎｃｈｅｄ１／Ｃｙｃｌｏｉｄｅａ／Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）、および根分裂組織維持のための転写因子（ＰＬＥＴＨＯＲＡ）、およびこれらの混合物等のペプチド植物転写因子である。これらの転写因子は、茎分裂組織形成、幹細胞維持および体細胞分化を調節する。

これらのペプチド植物成長因子およびペプチド植物転写因子はすべて、例えば、Ｃｚｙｚｅｗｉｃｚら、「Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ ａ ｂｏｔｔｌｅ：ｓｍａｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｕｔｐｕｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、２０１３年、ｖｏｌ．ｎｏ．６４（１７）、ｐｐ．：５２８１〜５２９６に開示されている。

エピジェネティック因子として通常知られている微量の他の化合物もまた、培養中のいくつかの細胞の残存破壊（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）のために（上記のように）、無細胞上清または当該無細胞上清の画分に含まれ、これは核および細胞質の含有量を最小限に抑えながらではあるが培養培地中で維持する。これらの植物エピジェネティック因子の例は、ＮＡメチル化プロセスに関与するクロモメチラーゼ（ＣＭＴ）、ドメイン再編成メチルトランスフェラーゼ（ＤＲＭ）、メチルトランスフェラーゼ（ＭＥＴ）、およびいくつかのオーキシン；クロマチンの脱凝縮およびリモデリングに関与する、ＣＨＰファミリーのクロマチンリモデリング因子ＰＩＣＫＬＥ（ＣＨＤタンパク質の名前は、配列相同性のある３つのドメインの存在、すなわち、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｒドメイン（クロモドメイン）、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２ ＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼドメイン（モチーフはＤＮＡ結合ドメインに対して配列相同性を有する）、およびクロマチンリモデリング因子ＤＤＭ１（Ｄｅｃｒｅａｓｅ Ｉｎ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−１から）に由来する）；ヒストンのリモデリングに関与する、ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼクリプトナイト（ＫＹＰ）；小ＲＮＡ分子；ならびにこれらすべてのタンパク質および化合物の混合物からなる群から選択される。エピジェネティック因子は、遺伝子の発現またはサイレンシングを制御するＤＮＡのための細胞中の標識を制御する、特にペプチド性の生体分子として理解されるべきである。

上記で示すように、本発明による使用のための無細胞上清は、細胞から培地に分泌される、ペプチド植物成長因子、植物転写因子および場合により植物エピジェネティック因子以外の化合物をさらに含む。実際、この無細胞上清（すなわち、馴化培地）は、細胞によって消費されなかった最初の培養培地の化合物および培養培地中で増殖する間にこれらの植物細胞によって分泌された化合物を含む。したがって、本発明による無細胞上清は、特定の実施形態において、
− 培地の残留化合物、例えば、タンパク質、脂質（例えば、脂肪酸、リン脂質、およびグリセリド）、ポリアルコール（例えば、ソルビトールおよびマンニトール）、オーキシン、糖タンパク質および糖脂質、ビタミン、抗酸化活性を有する化合物（ＮＡＤＨ）、無機塩、ならびに炭化水素（例えば、グルコースおよびフルクトースのような単糖類、スクロースのような二糖類、オリゴ糖および多糖類）、ならびに
− 場合により、細胞が培地にもたらしたであろう二次代謝産物（例えば、フラボノイド、フェノール、アルカロイド、フィトステロール、およびテルペノイド（植物カロチノイドを含む））をさらに含む。

脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清（またはその任意の画分）において、炭化水素は、それらが培地に懸濁した細胞によって消費されたため、少量で存在することに留意すべきである。実際、残留している炭化水素濃度は、以下に開示されるように、細胞密度とともに、または細胞密度とは独立して、培地の増殖をモニタするために通常使用される。当業者であれば、細胞懸濁培地の増殖をモニタする方法を知っている。

場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせた別の特定の実施形態では、皮膚治療のための薬剤として使用するための無細胞上清またはその画分は、当該無細胞上清またはその画分が、
（ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖を支持する馴化培地を得ることと、
（ｂ） 細胞を溶解させることなく馴化培地から植物細胞全体を取り除き、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
（ｃ） 場合により、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、無細胞上清の画分を得ることと
を含む方法によって得ることができるものである。

さらなる特定の実施形態では、無細胞上清は、ステップ（ａ）において液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を１０〜１２日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖を支持する馴化培地を得ることを含む方法によって得ることができる。

示されるように、馴化培地（無細胞上清）を得るためのステップ（ａ）を行う代替的な方法は、培養培地中の炭化水素（例えばスクロース）の、細胞消費により時間とともに減少する濃度を制御することによる。懸濁培地における脱分化した植物細胞の増殖を制御する別の代替的な方法は、培地中の細胞密度（細胞数／培地ｍＬ）を求めることによる。したがって、第１の態様の別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、無細胞上清は脱分化した植物細胞懸濁培地を支持するものであり、細胞密度（懸濁培地の体積単位あたりの細胞数として表される）は、１×１０^５細胞／懸濁培地ｍＬ〜１×１０^７細胞／懸濁培地ｍＬ、より詳細には１×１０^６細胞／懸濁培地ｍＬから３×１０^６細胞／懸濁培地ｍＬである。

別の特定の実施形態では、薬剤として使用するための、上で示したような無細胞上清は、ステップ（ａ）の前に、インビトロでオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、およびこれらの混合物から選択される植物成長調節剤を含む脱分化培地に植物細胞を供することによって、植物組織から植物細胞を脱分化させるステップを含む方法によって得られる。

馴化培地から植物細胞を溶解させることなく植物細胞全体を除去するための特定の方法の中でも、重力、遠心分離（特に４０００〜４６００ｒｐｍ）、細胞を保持するためのメッシュまたはフィルタによるろ過および上清の回収、ならびに固体（細胞）沈殿による細胞の沈降が含まれる。

第１の態様の別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、無細胞上清または画分は、上記に開示され、ステップ（ｂ）の後に、無細胞上清を凍結乾燥して凍結乾燥上清を得ることを含む方法によって得られるものである。さらなる特定の実施形態では、この凍結乾燥無細胞上清を１０〜３０倍に濃縮する。凍結乾燥上清の濃縮は、例えば、凍結乾燥上清全体を、凍結乾燥される前の初期無細胞上清体積よりも少ない体積の溶媒溶液（一般に緩衝液）に再懸濁させることによって達成することができる。

本発明の第１の態様の他の特定の実施形態は、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、局所的皮膚治療のための薬剤として使用するための無細胞上清を含み、脱分化した植物細胞懸濁培地は、二次代謝産物の産生を増強するための誘導プロセスを用いることによりストレス条件に供する。特定の誘導プロセスとしては、酵母細胞壁、菌糸壁、真菌胞子、多糖類（例えば、アルギン酸塩、ペクチンおよびキトサン）、オリゴ糖、シクロデキストリン、ペプチドおよびタンパク質（例えば、グルタチオン、セルラーゼ、エリシチン、ペクチナーゼ、およびタンパク質キナーゼ）、低分子量有機酸（例えば、酢酸、吉草酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、およびリンゴ酸）、揮発性物質、ジャスモン酸化合物（例えば、ジャスモン酸メチル）、サリチル酸塩から選択される生物的エリシターを用いた誘導が挙げられる。他の特定の誘導プロセスとしては、ＵＶ照射、ＩＲ照射、オゾン処理、マイクロ波、超音波、温度、浸透ストレス（高塩分）、酸化還元環境、可視光波長、無機塩、概日リズム障害プロセス、および光周期から選択される非生物エリシターを用いた誘導が挙げられる。

真皮（線維芽細胞）細胞および表皮（ケラチノサイト）細胞への影響ゆえに、４〜３００アミノ酸のペプチドを含む無細胞上清またはその画分を皮膚に（局所的に）適用すると、皮膚の外観全体が改善する。したがって、化粧用途、特に皮膚に対する若返り効果がさらに推測される。したがって、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または当該無細胞上清の画分の局所用皮膚若返り剤としての使用もまた、本発明の一部であり、当該無細胞上清または当該画分は４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、当該無細胞上清または当該画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない。

特に、化粧用途とは、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来の脱分化した植物細胞培養懸濁液を使用することを意味する。より詳細には、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、およびオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）からなる群から選択される植物由来のものである。

より詳細には、本発明による使用において、無細胞上清またはその画分は、
（ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖を支持する馴化培地を得ることと、
（ｂ） 細胞を溶解させることなく馴化培地から植物細胞全体を取り除き、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、および混合物から選択されるペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
（ｃ） 場合により、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、無細胞上清の画分を得ることと
を含む方法によって得ることができる。

化粧用若返り剤として使用される場合の無細胞上清またはその画分は、特に、ステップ（ｂ）の後に無細胞上清を凍結乾燥して、凍結乾燥上清を得ることを含む方法によって得ることができる。加えて、これらの無細胞上清またはその画分は、得られた凍結乾燥無細胞上清を１００〜５００倍にさらに濃縮することによって得ることができる。医療用途に関して上記で示されるように、脱分化した植物細胞懸濁培地は、１×１０^５細胞／懸濁培地ｍｌ〜１×１０^７細胞／懸濁培地ｍＬの、懸濁培地の体積単位あたりの細胞数として表される細胞密度で培養される。さらに、場合により、脱分化した植物細胞懸濁培地は、誘導プロセスを用いることによりストレス条件に供する。

無細胞上清の画分が局所用皮膚若返り剤として使用される場合、当該画分は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来の脱分化した植物細胞培養懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清由来のものである。当該画分は、
４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有しておらず、
（ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖を支持する馴化培地を得ることと、
（ｂ） 細胞を溶解させることなく馴化培地から植物細胞全体を取り除き、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
（ｃ） 固相抽出クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、無細胞上清の画分を得ることと
を含む方法によって得ることができる。

上記で明らかになったように、本発明は、さらに、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来の脱分化した植物細胞培養懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清の画分を目的として有している。より詳細には、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、およびオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）からなる群から選択される植物由来のものである。当該画分は、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を含んでいない。

上で定義した方法によって得られるこの無細胞画分の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、固相抽出（ＳＰＥと略される）クロマトグラフィーにより実行される。より詳細には、ＳＰＥは、３０ｋＤａ未満の分子量を有する無細胞上清からのペプチドの回収を可能にする。これらのペプチドの中には、ペプチド植物成長因子、エピジェネティック因子、および植物転写因子がある。

ＳＰＥによって、または開示された上記のような別のタンパク質分離プロセスと組み合わせたＳＰＥによっても得られる上清の他の特定の無細胞画分としては、１０ｋＤａ未満またはさらには３ｋＤａ未満の分子量を有するペプチドを含む画分が挙げられる。１１０Ｄａのアミノ酸あたりの中央分子量値を考慮すると、ＳＰＥによって得ることができる本発明のこれらの画分は、３０〜３００アミノ酸長のペプチドを含む。

タンパク質分離技術の組み合わせによって、異なるサイズ（アミノ酸長）のペプチドを含む画分を無細胞上清から単離することができる。したがって、特定の画分は、４〜１０００アミノ酸長、５〜１０００アミノ酸長、他は５〜５０アミノ酸長、または４〜３００アミノ酸長、または５〜３００アミノ酸長、または４〜１００アミノ酸長、または５〜１００アミノ酸長、または４〜３０アミノ酸長、または５〜３０アミノ酸長のペプチドを有する。

本発明の画分の別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、ろ過技術はタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である。この技術は、細孔サイズに従って試験サンプルを分画するために、さまざまなサイズの細孔（分子量カット）を有するフィルタを使用する。ＴＦＦは、フィード流の大部分がフィルタ内ではなくフィルタの表面を接線方向に移動するため、その名が付けられている。ＴＦＦの主な利点は、ろ過ケーク（フィルタを覆う可能性がある）がろ過プロセス中に大体が洗い流され、フィルタユニットが動作可能な時間が長くなることである。これは、バッチ式デッドエンドろ過とは異なり、連続的なプロセスであり得る。フィルタは、酢酸セルロースまたはポリエーテルスルホンから作られてよい。

特定の実施形態では、画分は、ファイトスルフォカイン−α（ＰＳＫ−α）、ファイトスルフォカイン−β（ＰＳＫ−β）、硫酸化チロシン−１を含む植物ペプチド（ＰＳＹ１）、ＲＡＬＦ（Ｒａｐｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、管状要素分化抑制因子（ＴＤＩＦ）、Ｃｌａｖａｔａ−３（ＣＬＶ３）、ＣＬＥ（Ｃｌａｖａｔａ−Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、ＴＰＤ１（Ｔａｐｅｔｕｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ−１）、表皮パターン形成因子−１（ＥＰＦ１）、花の器官脱離欠損（ＩＤＡ）、ＥＳＲ（Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、Ｐｏｌａｒｉｓペプチド（ＰＬＳ）、根分裂組織成長因子（ＲＧＦ）、ＥＣ１（Ｅｇｇ Ｃｅｌｌ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＥＰ（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、初期ノジュリン４０（ＥＮＯＤ４０）、システミン、ＳＣＲ（Ｓ−ｌｏｃｕｓ Ｃｙｓｔｅｉｎ Ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびこれらの混合物（これらすべての、２つのみ、３つのみ、４つのみ、または列挙したペプチドをすべて含むまでの３つ以上の組み合わせを意味する）からなる群から選択されるペプチド植物成長因子を含む。本発明の画分の別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、ペプチド植物転写因子は、特にＷＩＮＤ（Ｗｏｕｎｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）転写因子、Ｗｕｓｃｈｅｌ（ＷＵＳ）転写因子、ＴＣＰ（Ｔｅｏｓｉｎｔｅ Ｂｒａｎｃｈｅｄ１／Ｃｙｃｌｏｉｄｅａ／Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）、および根分裂組織維持のための転写因子（ＰＬＥＴＨＯＲＡ）、およびこれらの混合物から選択される。本発明の画分の別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、エピジェネティック因子は、ＮＡメチル化プロセスに関与するクロモメチラーゼ（ＣＭＴ）、ドメイン再編成メチルトランスフェラーゼ（ＤＲＭ）、メチルトランスフェラーゼ（ＭＥＴ）、およびいくつかのオーキシン；クロマチンの脱凝縮およびリモデリングに関与する、ＣＨＰファミリーのクロマチンリモデリング因子ＰＩＣＫＬＥ（ＣＨＤタンパク質の名前は、配列相同性のある３つのドメインの存在、すなわち、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｒドメイン（クロモドメイン）、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２ ＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼドメイン（モチーフはＤＮＡ結合ドメインに対して配列相同性を有する）、およびクロマチンリモデリング因子ＤＤＭ１（Ｄｅｃｒｅａｓｅ Ｉｎ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−１から）に由来する）；ヒストンのリモデリングに関与する、ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼクリプトナイト（ＫＹＰ）；小ＲＮＡ分子；ならびにこれらすべてのタンパク質および化合物の混合物からなる群から選択される。

本発明による使用のための脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清およびその任意の画分は両方とも、特定の実施形態において、凍結乾燥組成物として提供される。別の特定の実施形態では、これらは液状である。

本発明は、有効量の上記に定義した脱分化した植物細胞懸濁培地の上清のこれら無細胞画分のいずれかを含む皮膚局所用組成物を包含し、当該画分は、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体と共に、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、ペプチド植物転写因子、植物エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含む。

本発明の皮膚局所用組成物は皮膚のケアのために使用できる。したがって、本発明は、皮膚ケア剤として上記に定義したようにペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子を含む、脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清または当該無細胞上清の画分の局所使用も包含する。皮膚ケアは、真皮細胞および／または表皮細胞の老化を回復させることによって、以下の症状、すなわち、皮膚のざらつき、かさつき、乾燥、つっぱり感、あかぎれ、弾力性、およびかゆみのうち少なくとも１つを改善することを含む。皮膚ケアは、特に皮膚の早期老化および光老化のためのものである。

別の特定の実施形態では、場合により上記または下記の任意の実施形態と組み合わせて、局所用組成物は薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体としてグリセリンを含む。別の特定の実施形態において、局所用の薬学的または美容的な賦形剤または担体は、皮膚保護回復剤、水和剤、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、防腐剤、ビヒクル、およびこれらの混合物からなる群から選択される。

本発明はまた、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）またはニンジン属の植物の脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清または当該無細胞上清の画分も包含し、当該上清および画分は、４〜３００アミノ酸長、特に５〜３００アミノ酸長のペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子を含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない。ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）またはニンジン属の植物のこれらの上清および画分は、化粧品および薬剤としての使用するためのものである。特定の実施形態では、それらは、皮膚の真皮細胞および表皮細胞の老化状態を回復させる化粧品における、または薬剤として使用するためのものである。したがって、それらは、皮膚の早期老化および光老化から選択される状態または疾患の治療に用いるためのものであり、当該状態は、細かいおよび粗いしわ、不規則でまだらな色素沈着、褐色のしみ、ざらつき、黄変、くも状静脈と呼ばれる小さく表面的な血管または毛細管拡張症、およびこれらすべての状態の組み合わせを含む。特に、それらは線維芽細胞の老化を回復させるために使用するものである。特定の実施形態において、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）またはニンジン属の植物のこれらの上清または画分は、任意の植物細胞培養で上記に開示したように得ることができる。ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）またはニンジン属の植物のこれらの上清および画分は、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体と一緒に、有効量で皮膚局所用組成物に含まれ得る。

本発明はまた、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）またはツボクサ属の植物の脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清または当該無細胞上清の画分も包含し、当該上清および画分は、４〜３００アミノ酸長、特に５〜３００アミノ酸長のペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子を含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない。ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）またはツボクサ属の植物のこれらの上清および画分は、化粧品および薬剤としての使用するためのものである。特定の実施形態では、皮膚の真皮細胞および表皮細胞の老化状態を回復させる化粧品における、または薬剤として使用するためのものである。したがって、それらは、皮膚の早期老化および光老化から選択される状態または疾患の治療に用いるためのものであり、当該状態は、細かいおよび粗いしわ、不規則でまだらな色素沈着、褐色のしみ、ざらつき、黄変、くも状静脈と呼ばれる小さく表面的な血管または毛細管拡張症、およびこれらすべての状態の組み合わせを含む。特に、線維芽細胞の老化を回復させるためである。特定の実施形態において、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）またはツボクサ属の植物のこれらの上清または画分は、任意の植物細胞培養で上記に開示したように得ることができる。ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）またはツボクサ属の植物のこれらの上清および画分は、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤（または添加物、excipients）または担体と一緒に、有効量で局所用の薬学的または美容的組成物に含まれ得る。

本発明はまた、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）またはザクロ属の植物の脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清または当該無細胞上清の画分も包含し、当該上清および画分は、４〜３００アミノ酸長、特に５〜３００アミノ酸長のペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子を含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない。ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）またはザクロ属の植物のこれらの上清および画分は、化粧品および薬剤としての使用するためのものである。特定の実施形態では、皮膚の真皮細胞および表皮細胞の老化状態を回復させる化粧品における、または薬剤として使用するためのものである。したがって、それらは、皮膚の早期老化および光老化から選択される状態または疾患の治療に用いるためのものであり、当該状態は、細かいおよび粗いしわ、不規則でまだらな色素沈着、褐色のしみ、ざらつき、黄変、くも状静脈と呼ばれる小さく表面的な血管または毛細管拡張症、およびこれらすべての状態の組み合わせを含む。特に、線維芽細胞の老化を回復させるためである。特定の実施形態において、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）またはザクロ属の植物のこれらの上清または画分は、任意の植物細胞培養で上記に開示したように得ることができる。ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）またはザクロ属の植物のこれらの上清および画分は、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体と一緒に、有効量で局所用の薬学的または美容的組成物に含まれ得る。

本発明はまた、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）またはワタ属の植物の脱分化した植物細胞懸濁培地の無細胞上清または当該無細胞上清の画分も包含し、当該上清および画分は、４〜３００アミノ酸長、特に５〜３００アミノ酸長のペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子を含み、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）またはワタ属の植物のこれらの上清および画分は、化粧品および薬剤としての使用するためのものである。特定の実施形態では、皮膚の真皮細胞および表皮細胞の老化状態を回復させる化粧品における、または薬剤として使用するためのものである。したがって、それらは、皮膚の早期老化および光老化から選択される状態または疾患の治療に用いるためのものであり、当該状態は、細かいおよび粗いしわ、不規則でまだらな色素沈着、褐色のしみ、ざらつき、黄変、くも状静脈と呼ばれる小さく表面的な血管または毛細管拡張症、およびこれらすべての状態の組み合わせを含む。特に、線維芽細胞の老化を回復させるためである。特定の実施形態において、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）またはワタ属の植物のこれらの上清および画分は、任意の植物細胞培養で上記に開示したように得ることができる。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）またはワタ属の植物のこれらの上清および画分は、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体と一緒に、有効量で局所用の薬学的または美容的組成物に含まれ得る。

本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語およびその活用形は、他の技術的特徴、添加剤、成分またはステップを排除することを意図しない。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の場合を包含する。本発明のさらなる目的、利点、および特徴は、本明細書を検討することにより当業者に明らかになるか、または本発明の実践によって習得されるであろう。以下の実施例は説明のために提供され、本発明を限定することを意図したものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態および好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを包含する。

＜実施例１：古い皮膚のモデル（ダルベッコ培地中で２０回を超えて継代したヒト皮膚線維芽細胞）に対する４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清およびその画分のアッセイ＞
＜１．１ 無細胞上清を得る方法＞
ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）およびツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）からの細胞懸濁培地を、２００ｍｌで増殖させた細胞懸濁液の接種材料から得た。接種材料（培地の全体積に対して１／５の接種材料）を、２０〜３０ｇ／Ｌのスクロース（例えば、３０ｇ）およびホルモン（ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）については１〜３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ；ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）については０．２ｍｆｇ／Ｌの酢酸ナフタレン（ＡＮＡ）および１ｍｇ／Ｌのカイネチン；およびツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）については２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄおよび０．１ｍｇ／ＬのＢＡＰ）を補充した８００ｍＬのＭＳ液体培地を含む２０００ｍＬフラスコに接種し、２５℃の暗所で１００ｒｐｍの回転式振とう機に入れた。細胞培地を１２日間増殖させ、１０分間、４６００ｒｐｍでの遠心分離によりそれらを清澄化し（すなわち、細胞を除去して溶解を回避する）、馴化培地を得た。この馴化培地をさらに試験した。

４００ｍＬの３つのサンプルを凍結乾燥（ｌｙｏｐｏｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）のためにビーカーに分け、−８０℃で冷凍し、一晩凍結乾燥した。

凍結乾燥された生成物を４００ｍＬから２０ｍＬになるまで生理食塩水緩衝液中で濃縮し、この体積のうち１ｍＬを分析のために取り出した（以下参照）。したがって、最初に凍結乾燥された生成物は、ＨＤＦで試験した時点で２０倍に濃縮されたものであった。

＜１．２．ペプチド植物成長因子および／またはペプチド植物転写因子および／またはエピジェネティック因子（細胞因子）を含む馴化培地（ＣＭ）の画分＞
分画の前に、１．１のＣＭ（無細胞上清）それぞれを、ペプチドサイズスペクトルを求める（タンパク質フィンガープリンティングとしても知られている）ために分析した。したがって、タンパク質の状態を変性させる電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を各ＣＭを用いて実行した。これにより、各植物種の無細胞上清中に存在するおおよそのタンパク質およびペプチド類の分子量を可視化できる。

所望の分子量範囲を有するペプチドを含む無細胞上清の画分を回収するために、クロマトグラフィー技術を行った。

この目的のために、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢカートリッジ（ＨＰＬＣ水中にて１カラム体積（ＣＶ）のトリフルオロ酢酸０．１％（ＴＦＡ）、ＨＰＬＣアセトニトリル（Acenonitrile、ＡＣＮ）中にて１ＣＶのＴＦＡ０．１％、およびＨＰＬＣ水中にて１ＣＶのＴＦＡ０．１％を用いて前もってコンディショニングした）での固相抽出（ＳＰＥ）のために４００ｍＬのサンプルを使用した。投入、ＦＴ、洗浄からの残留体積を維持した。

ＳＰＥはタンパク質およびペプチドのみをＣＭから回収することを可能にし、３０ｋＤａ超のタンパク質（３０ｋＤａ膜効率と同様）を既に除外していたため、０〜３０ｋＤａの範囲の分子量（５〜３００アミノ酸長のペプチドを含む画分）を有するペプチド（植物成長因子および植物転写因子およびエピジェネティック因子）を含む、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の馴化培地の画分が回収された。

ＳＰＥの溶出は、ＨＰＬＣ ＡＣＮ中の１ＣＶのＴＦＡ０．１％で行い、６５℃で２時間乾燥させた。

すべての画分および乾燥中間生成物を一晩＋４℃に保った。

ＳＰＥからの乾燥生成物を２ｍＬの生理食塩水緩衝液に再懸濁した。このようにして、画分を２００倍に濃縮した。次に、次の表１のデータに従って、総タンパク量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分析した（図１は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の馴化培地およびＳＰＥ画分についての各電気泳動レーンのクマシーブルーペプチドバンドも示す）。

実験データ１．１および１．２のいずれにおいてもタンパク質分離を行うための材料は以下である。

＜材料＞
・ ＨＰＬＣ水中のＴＦＡ０．１％
・ ＨＰＬＣ ＡＣＮ中のＴＦＡ０．１％
・ ＯＡＳＩＳ ＨＬＢカートリッジ
・ Ｂｉｏｒａｄタンパク質定量キット
・ トリスグリシン４〜１２％ＰＡＧＥゲル
・ トリスグリシンサンプル緩衝液２ｘプラスＤＴＴ
・ トリスグリシンランニング緩衝液１ｘ
・ 生理食塩水緩衝液（リンゲル液またはリン酸緩衝液）

＜装置＞
・ 遠心分離器
・ 真空システム
・ 冷凍器（−８０℃）
・ 凍結乾燥装置
・ 電気泳動システム
・ プレートリーダ

タンパク質分析は、Ｂｉｏｒａｄタンパク質定量キット（使用されたプロトコルは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒａｄ．ｃｏｍ／ｗｅｂｒｏｏｔ／ｗｅｂ／ｐｄｆ／ｌｓｒ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＿９００４．ｐｄｆに基づくＢｉｏ Ｒａｄによって推奨されたものである）およびＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を用いて行い、各サンプル中の総タンパク質濃度を求めた。

＜１．３．古い皮膚のモデル（ダルベッコ中で２０回を超えて継代したヒト皮膚線維芽細胞；複製老化）に対する無細胞上清およびその画分の試験＞
無細胞上清およびその画分の効果を試験するために、古いヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の培地を使用した。

＜細胞モデル＞
若いドナー（０〜３歳）の手術からの余剰である包皮サンプルから正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を得、外植片増殖および増殖する細胞の酵素解離の標準的方法を用いて確立した。細胞を増殖培地（ＧＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）；２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ社）；および抗生物質（１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、Ｌｏｎｚａ社）を補充したダルベッコの１ｇ／Ｌグルコース培地）中に播種し、増殖させた。ルーチンの継代培養および初代培地の増殖のために、細胞をＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて回収し、ノイバウエル計算板で計数した後、新しい細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、７５ｃｍ^２）に播種した。

次に、老化ＨＤＦを得るために、初代培地をルーチンの継代培養方法を用いて、８０〜９０％のコンフルエンスになる度に継代培養を繰り返した。行った実験すべてにおいて、老化ＨＤＦは継代／継代培養２２〜２６回で使用された。これらの細胞は事前特性決定され、形態学的および構造的変化（細胞サイズの増加、細長い紡錘形状から扁平で不規則な形状への変化、膜の剛性および不規則性の増大、液胞数の増加）、増殖指数の低下（６０時間超の倍加時間）およびβ−Ｇａｌ陽性染色によりはっきりと老化表現型を示した。幼若ＨＤＦは、実施された実験すべてにおいて３〜５回の継代で使用された。

＜有効性の研究＞
細胞培養条件：幼若ＨＤＦおよび老化ＨＤＦを、増殖培地中で２５，０００細胞／ウェル（６．２５×１０^３細胞／ｃｍ^２）の密度で細胞培養１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、次いで２４〜４８時間、細胞培養標準条件（３７℃、５％ＣＯ_２および９０％ＲＨ）にて培養した。

＜試験化合物の調製＞
試験生成物を、それぞれの適用の直前に、
維持培地（１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）；
２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ社）；および、
抗生物質（１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｌｏｎｚａ社）；
を補充したダルベッコの１ｇ／Ｌグルコース培地）中で希釈することにより、所定の最終濃度で調製した。

＜細胞の処理＞
細胞を試験生成物を用いて８日間処理し、２〜３日ごとに適用した（総適用回数：３）。

＜試験対照＞
１） 維持培地における未処理老化ＨＤＦ：治療期間中、維持培地で培養された細胞。２〜３日ごとに培地を除去した。この状態が評価された異なるマーカー／タンパク質の細胞基底レベルを示す基準である。

２） 増殖培地における未処理老化ＨＤＦ：治療期間中、増殖培地で培養された細胞。２〜３日ごとに培地を除去した。この状態は、培地補充物として使用されるウシ胎仔血清中で成長因子、補助因子およびタンパク質の効果を示すため、内部陽性対照である。

３） 維持培地における未処理幼若ＨＤＦ：治療期間中、維持培地で培養された幼若ＨＤＦ。２〜３日ごとに培地を除去した。この実験条件は、維持培地（低濃度のウシ胎仔血清を含む培地）における若い細胞の評価された異なるマーカー／タンパク質の濃度を示す。

４） 増殖培地における未処理幼若ＨＤＦ：治療期間中、増殖培地で培養された幼若ＨＤＦ。２〜３日ごとに培地を除去した。この実験条件は、最適な培養条件における若い細胞の評価された異なるマーカー／タンパク質の最大濃度を示す。

第１に、本発明の有効組成物の供給源を説明するために、本発明者らはアッセイを行ったところ、細胞懸濁培地および誘導体（細胞溶解物）が活性化合物の強力な供給源であることを示した。これを行うために、いくつかの濃度のいくつかの活性組成物を用いてＨＤＦ（複製老化、すなわち２０回を超える継代による老化線維芽細胞）について試験した。試験組成物およびデータを図２に示す。簡単に説明すると、組成物は、それぞれ濃度を左側の棒で示すエラグ酸（９５％超、純粋な分子と命名）、それぞれ濃度を真ん中の棒で示すザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の（４０％エラグ酸）抽出物（４０％のエラグ酸を含有、ＰＲＣＦと命名）、およびそれぞれ濃度を右側の棒で示すザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）細胞溶解物（０．４％のエラグ酸を含有）であった。

このデータは、ペルオキシレドキシン４の百分率（％）での濃度を示すグラフである。ペルオキシレドキシン４は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）において増加したマーカーであり、老化表現型をより若い表現型に戻す。ペルオキシレドキシン４は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。

図２は、ＰＲＣＦが、各試験濃度（Ｃ１〜Ｃ３）においての抽出物よりも高い程度で老化の回復を促進することを示す。これはまた、植物の脱分化／再生に有用であり、また動物細胞に対して活性である化合物のカクテルを含有する細胞溶解物の可能性を引き出す。動物細胞（ＨＤＦ）に対するこれらのＰＣＲＦ（細胞溶解物）の安全な適用性は、図５から見てとれ、図５ではＨＤＦ（２０回を超える継代）の細胞生存率（生細胞の％）が示される。同じ濃度（Ｃ１〜Ｃ３；Ｃ１（０．００１９μｇ／ｍＬ）、Ｃ２（０．００３７５μｇ／ｍＬ）、およびＣ３（０．００７５μｇ／ｍＬ））の各種の細胞溶解物（ＰＲＣＦ）を用いたニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）（パネルＡ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（パネルＢ）の抽出物を比較する。ＰＲＣＦは比較抽出物よりも毒性が小さかった。さらに、１００％を超える細胞生存を促進する細胞溶解物は、細胞増殖作用を促進するものとして読み取ることもできる。

次に、１．１の上記開示のように得られたニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の無細胞上清（凍結乾燥馴化培地）および１．２のＳＰＥ画分を試験した。老化線維芽細胞における若返りを促進する能力を試験するために、ペルオキシレドキシン４およびＰＡＲＰを分析した（ＥＬＩＳＡアッセイ）。

図３は、１．１および１．２で調製したニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）およびザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の無細胞上清（ＳＳＰ−Ｆ１）および画分（ＳＳＰ−Ｆ２）で（上記で開示したように）処理した後の、線維芽細胞培地において観察されたＰＲＸ４（パネルＡおよびＢ）およびＰＡＲＰ（パネルＣおよびＤ）の濃度を示す。それらはさらに、各植物の細胞溶解物（各図Ａ〜ＣのＰＲＣＦ）および各植物種の抽出物と比較される。

データは、無細胞上清からのＳＰＥによって得られたペプチド画分が最良の老化回復（若返り効果）を達成したことをはっきりと示している。試験したサンプルはすべて、それらに含まれる活性化合物の濃度に関して同等であった。さらに、無細胞上清（凍結乾燥無細胞上清、ＳＳＰ−Ｆ１）からのデータは、細胞溶解物（ＰＲＣＦ）のデータと同等またはそれ以上の効果を生じたが、さほど複雑でない混合物ゆえに毒性の問題は小さい。

それらは、植物細胞懸濁培地の増殖を支持する無細胞上清（馴化培地）を用いて古い皮膚細胞の老化回復を達成することができることを最初に示しているため、実に興味深いデータである。第２に、この効果は、これらの無細胞上清に含まれるペプチド植物成長因子および／または植物転写因子および／またはエピジェネティック因子の精製によって増強することができる。液体から凍結乾燥および再懸濁までの無細胞上清の処理および／またはクロマトグラフィー（特にＳＰＥ）によるペプチドの回収により、当該無細胞上清またはそこに含まれる任意のペプチドは、１０〜５００倍に濃縮されることに留意されたい。したがって、従来の抽出プロセスに関連する高いコストを回避しながら、あまり複雑ではない組成物を、非常に効果的かつ環境にやさしいプロセスによって高収率で得ることができると考えられる。さらに、これらの無細胞上清およびその画分の使用は、通常廃棄される植物細胞懸濁培地の一部の再度の価値付け（ｒｅ−ｖａｌｏｒｉｓａｔｉｏｎ）を意味する。

さらに、両方とも４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む植物細胞培養の無細胞上清およびその画分の効果を巨視的に説明するために、図４は、１．１で開示したようにして得られたツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）細胞懸濁培地の凍結乾燥無細胞上清を用いて８日間処理する前と後に撮った（上記開示の）古いＨＤＦの培地の写真を示す。

写真は、線維芽細胞および細胞外マトリックスの組織化の減少および散在する細胞ではなく円形細胞を特徴とする老化表現型がわずか８日間でより大きな細胞密度および細胞外マトリックスの組織化ならびに細胞の散在した形態を特徴とする若い表現型へと回復することを示している。

これらのデータはすべて、４〜３００アミノ酸長または５〜３００アミノ酸長のペプチドに富む無細胞上清およびその画分が、古い皮膚細胞に関与する皮膚状態（例えば光老化した皮膚または皮膚の早期老化）の治療に使用するのに有効な活性組成物であると結論づける。

＜実施例２：古い皮膚のモデル（ダルベッコ中で２０回を超えて継代したヒト皮膚線維芽細胞；複製老化）に対する無細胞上清およびその画分の追加試験＞
実施例１（１．３）と同じスキームに従って、実施例１．３の老化ＨＤＦのモデルに対するＫｉ６７タンパク質および老化関連β−ガラクトシダーゼ（Ｓｅｎ−β−Ｇａｌ）の濃度を決定した。試験した生成物は、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）およびニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）の上述された通常の抽出物、すなわち、各植物の細胞溶解物（本明細書ではＰＲＣＦと命名）；ペプチドを含み、実施例１．２で開示したようにして得た無細胞上清（ＳＳＰ−Ｆ１、すなわち馴化培地）および画分（ＳＳＰ−Ｆ２）であった。エラグ酸は陽性対照（ＰＭ；純粋な分子由来）であり、対照または参照値は、老化線維芽細胞におけるＫｉ６７タンパク質およびＳｅｎ−β−Ｇａｌの濃度であった（Ｋｉ６７については１００％、β−Ｇａｌでは０％と考えられる）。

老化細胞では、Ｋｉ６７タンパク質は減少し、Ｓｅｎ−β−Ｇａｌは増加する。したがって、無細胞上清（ＳＳＰ−Ｆ１、すなわち馴化培地）および画分（ＳＳＰ−Ｆ２）によりＫｉ６７タンパク質濃度が上昇した場合、これは若返りを促進することを意味する。逆に、無細胞上清（ＳＳＰ−Ｆ１、すなわち馴化培地）および画分（ＳＳＰ−Ｆ２）により、Ｓｅｎ−β−Ｇａｌが対照と比較して減少する場合、これは細胞の若返りを促進することを意味する。

Ｋｉ６７タンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡ試験（（ヒトＫＩ−６７タンパク質ＥＬＩＳＡキット、ＹＨ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、参照番号ＹＨＢ１７９９ＨＵ−９６Ｔ）により測定し、Ｓｅｎ−β−Ｇａｌの濃度をＥＬＩＳＡ（濃度についてはヒトＧＬＢ（ガラクトシダーゼベータ）Ｅｌｉｓａキット、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、参照番号Ｅ−ＥＬ−Ｈ０９９１、培地の細胞化学分析および顕微鏡分析については老化検出キット、Ａｂｃａｍ、参照番号ａｂ６５３５）により測定した。

結果を図６（Ｋｉ６７濃度）および図７（Ｓｅｎ−β−Ｇａｌ濃度）に示す。図６（パネルＡ）は、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）のデータを示し、図６（パネルＢ）はニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）のデータを示す。図７（パネルＡ）はザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）のデータを示し、図７（パネルＢ）はニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）のデータを示す。

両方の種において、ペプチドを含む無細胞上清（ＳＳＰ−Ｆ１）および画分（ＳＳＰ−Ｆ２）は、対照参照と比較した各マーカーの濃度から導かれる通り、老化線維芽細胞の若返りを促進した。特に、画分（ＳＳＰ−Ｆ２）は、試験した通常の抽出物よりも高く有意性のある水準で若返りを促進した。

＜実施例３：毛嚢真皮乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）のヒト線維芽細胞の増殖アッセイ＞
さらに、増殖アッセイをヒト毛嚢乳頭細胞（ＣＥＬＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ；側頭部頭皮からの正常なヒト毛嚢、単一ドナー：５４歳白人男性、参照番号６０２−０５ａ、ロット２９２２）に対して行った。

次の表２は、試験材料および対照を示す：

培養培地は、増殖補充物キット（相対組成：ウシ胎児血清、成長因子および抗生物質、適用：６％ｖ／ｖ）を補充した乳頭細胞基礎培地であった。

無細胞上清（Ｐｒｅ−ｐｒｅ−ＬｙｏＰ３とも名付けられる）は、特に次のようにして得た。

ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、およびツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）について実施例１．１に示したようにすべての種で得られた培地の上清を４℃で４６００ｒｐｍで、または３０分間遠心分離した。得られた生成物のＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）を行った。このプロセスは、フラックスステップ、平衡化、ろ過、ダイアフィルトレーション、および最終の衛生化ステップを含んでいた。このプロセスの間に、２．５ｌのＰＢＳ、２．５Ｌの２０％エタノール、およびＮａＯＨ １Ｎを使用した。その後、逆相精製（ＲＰ）を行った（オリゴ精製）。精製は９つのステップ、すなわち、５カラム体積（ＣＶ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％水溶液の添加、５ＣＶのＣＡＮ ＴＦＡ０．１％の添加、５ＣＶのＴＦＡ０．１％水溶液の包含（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）および０．１％を達成するまでのＴＦＡの添加を含んでいた。次にサンプルをロードし、収集し、１ＣＶのＴＦＡ０．１％水溶液を用いて洗浄した。溶出物をＴＦＡ０．１％を用いて２５−５０−５−１００％のＣＡＮで分画した。生成物を蒸発させ、ＲＰ Ａに再懸濁した。この精製の終わりに、あらかじめ馴化した培地２（プレ無細胞上清）を得た。

このあらかじめ馴化した培地２は、ＣＥＸ（陽イオン交換クロマトグラフィー）およびＡＥＸ（Ｅｍｐｈａｚｅハイブリッド精製器）を用いて精製した。プロセスは１６ステップ、すなわち、５ＣＶのＣＥＸ Ａ（酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ４．５）、５ＣＶのＣＥＸ Ｂ（酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ｐＨ４．５）、および５ＣＶのＣＥＸ Ａの添加を含んでいた。さらに、ＣＥＸ Ａを用いた１：５希釈およびｐＨ４．５への調節、ならびにそのようなサンプルのロード、サンプルの収集、１ＣＶのＣＥＸ Ａを用いた洗浄、および１２５ｍＭ−２５０ｍＭ−５００ｍＭ−１ＭのＣＥＸ Ｂによる分画溶出も行った。溶出は、５ＣＶのＡＥＸ Ａ（グリシン５０ｍＭ、ｐＨ９）、５ＣＶのＡＥＸ Ｂ（グリシン５０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ｐＨ９）、および５ＣＶのＡＥＸのＡを受け取った。ＡＥＸ Ａ中の１：５希釈およびｐＨ９への調整、ならびにサンプルのロード、サンプルの収集、１ＣＶのＣＥＸ Ａを用いた洗浄、および１２５ｍＭ−２５０ｍＭ−５００ｍＭ−１ＭのＡＥＸ Ｂによる分画溶出を行った。最終的な無細胞懸濁液（Ｐｒｅ−ｐｒｅ−ＬｙｏＰ ３と名付けられた）を得た。次いで、これを凍結乾燥し、所望の濃度で使用するために再懸濁した。

増殖を評価して、増殖指数（％）を決定した。細胞ＤＮＡ複製を、処理した細胞のＤＮＡに取り込まれたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）により定量化した。ＢｒｄＵアッセイは、細胞周期のＳ期の間に細胞がＢｒｄＵを取り込む能力に基づいて細胞増殖を測定することを可能にする。分裂している細胞は、抗体および免疫細胞化学的検出によってさらに検出されるＢｒｄＵを取り込んだ。

細胞を９６ウェルプレート中でコンフルエントで播種した。細胞培地が安定し同調した後、試験生成物を（表２に示す最終濃度で）添加した。その後、ＢｒｄＵを培地に添加し、ＨＦＤＰＣを完全にＢｒｄＵを取り込むまで３７℃でインキュベートした。ＢｒｄＵ量は、処理した培地の細胞分裂数、すなわち、増殖に比例した。

データを図８に示す。図８では、増殖指数の１００％の値に一致する基礎対照（未処理ＨＦＤＰＣ）に対する増殖の百分率として計算されているＨＦＤＰＣの増殖指数（％）が示される。

図８で見ることができるように、培地で培養した未処理細胞を参照または基礎対照とすると、本発明の無細胞上清は細胞増殖を促進した。いくつかの種について、３０ｋＤａ以下の分子量を有するペプチドを含む無細胞上清は、増殖指数が陽性対照よりもはるかに高かった。そうでない場合、増殖指数は陽性対照と同じ程度であった。

ミノキシジルのデータは、この化合物が毛嚢真皮乳頭の増殖に関わる脱毛治療として通常使用されるために加えられた。無細胞上清のいくつかは、ミノキシジルに匹敵する効果を有することに注意すべきである。

＜実施例４：インビボ若返り（老化防止）アッセイ＞
実施例１で明らかになったようにして得られ、下記（表３）に示すように調合されるツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）の馴化培地を、実際の皮膚における若返り効果（または老化防止効果）を促進し得るかどうかを判断するためにインビボで試験した。

この目的で、４０人の女性ボランティア（５１歳以上）が採用され、先に光線性損傷の存在について明らかにした。生成物の有効性は、画像解析によるＶＩＳＩＡならびに臨床効果および認識される効果による客観的分析を用いて、抗しわおよび抗腫脹治療の観点から判断された。ＶＩＳＩＡ定量化パラメータは、しみ、しわ、質感、毛穴、ＵＶスポット、褐色斑点、赤色の領域およびポルフィリンであった。

＜表４ ＶＩＳＩＡ詳細＞

皮膚の平滑度、皮膚の明るさ、「より輝く皮膚」、皮膚の再生、しわの少ない皮膚、完全な滑らかさの皮膚、腫脹の軽減（抗腫脹）といったパラメータも（臨床的有効性および認識される有効性として）試験された。

バイオメトリック測定は、２ｍｍの開口部を有するプローブを備えた機器Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ ５８０（ＣＫｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ、ドイツ）を用いて各部位において行われ、各回の皮膚の硬さ（ｓｋｉｎ ｆｉｒｍｎｅｓｓ）および弾力性を評価した。３秒間の吸引、続いて２００ｍｂａｒの圧力での３秒間の弛緩を１０サイクル行ってそれぞれ測定した。

ボランティアは、試験の少なくとも２４時間前に試験対象の皮膚の領域に保湿剤または化粧品を一切使用しないことが求められた。その領域はまず、ベースライン評価のために室内試験で３０分間適当な状態にし（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、ｔ＝０を表す写真をデジタル画像で撮影した。試験のために、顔の半分を処置し、残りの半分にはプラセボを投与した。眼域の領域を定め、試験生成物の適用回数に応じて治療の対照として保持した。

画像は、治療の開始後２８日目および治療の開始後５６日目に撮影した。

また、２０人のボランティア（２０〜２５歳）がｔ＝０の場合のみ参照群として用いられた。

結果の統計的処理は、テューキー法を用いてＰｒｉｓｍ ４．０ソフトウェアを用いて行った。

すべてのボランティア（５１歳以上）において、ＶＩＳＩＡおよびＣｕｔｏｍｅｔｅｒのパラメータはすべて、若い皮膚に似ており改善した。

Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（皮膚の変形対時間を決定する）に関連して、以下のパラメータを決定した。
− Ｕｅパラメータ（皮膚の硬さ）：パラメータの低下は皮膚の硬さの増大を示す。
− ＣＦパラメータ（皮膚の硬さ係数）；ＣＦｔｉ＝Ｕｅ（ｔ０）／Ｕｅ（ｔｉ）（式中、ｔは試験時間である）
− 皮膚弾力性パラメータ（Ｕｒ／Ｕｆ；式中、Ｕｒは中間収縮率であり、Ｕｆは皮膚全体の変形である）；Ｕｒ／Ｕｆの増加は皮膚弾力性の増加を示す。
− 皮膚弾力性係数（ＣＥ）；ＣＥｔｉ＝（Ｕｒ／Ｕｆ）ｔｉ／（Ｕｒ／Ｕｆ）ｔ０

次の表５は、プラセボおよび試験化合物を用いて得られる結果を示す。

＜表５ Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ結果＞

ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｉａｔｉｃａ）のクリームは、試験初期の結果を有意に改善した。
− Ｕｅパラメータ（皮膚の硬さ）：Ｕｅは２８日目に１５．９％、５６日目に１８．８％減少し、２８日目にボランティアの８６．４％、５６日目には９０％において顔の皮膚の硬さが増した。
− 皮膚弾力性：Ｕｒ／Ｕｆは２８日目に６．８％、５６日目に７．８％増加し、２８日目にボランティアの８１．８％、５６日目には８６．４％において顔の弾力性が増した。

したがって、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）クリームは、ｔ＝０に対して、２８日目および５６日目で皮膚の硬さおよび弾力性を増加させた。５６日目で、その差は徐々に大きくなり、プラセボに対して有意であった。

＜実施例５：ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）に対する５〜３００アミノ酸（約３〜３０ＫＤａ）長のペプチドを含む馴化培地（ＣＭ）の画分を用いた創傷治癒試験（またはスクラッチ試験）＞
ヒト歯肉線維芽細胞を２４ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。２ｍｍ幅のスクラッチを単層培地に対して行った。次いで、培養培地中に試験生成物を加え、瘢痕形成プロセスの後に位相差顕微鏡法を行った。この目的で、スクラッチ前の試験の初期（Ｔ＝０時間）および処置後（１２時間および７２時間）に写真を撮影した。瘢痕形成プロセスは、各時点における創傷面積の減少を定量化することによって評価した。

次の表６は、試験した生成物および対照の特徴を示す。

＜表６ 創傷治癒試験でアッセイしたサンプル＞

無細胞植物細胞培養上清の画分の入手を実施例１（１．２）に示したように実施した。以下に詳述するように、０〜３ｋＤａおよび０〜３０ｋＤａのペプチドを含む画分の特定の分離が特に達成された。

ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、およびツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）について実施例１．１に示したように得られたすべての種の培地上清を４℃で４６００ｒｐｍで、または３０分間遠心分離した。得られた生成物のＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）を行った。このプロセスは、フラックスステップ、平衡化、ろ過、ダイアフィルトレーションおよび最終の衛生化ステップを含んでいた。このプロセスの間に、２．５ＬのＰＢＳ、２．５Ｌの２０％エタノールおよびＮａＯＨ １Ｎを使用した。その後、逆相精製（ＲＰ）および最終ろ過を行った。ＲＰについては、精製は９つのステップ、すなわち、５カラム体積（ＣＶ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％水溶液の添加、５ＣＶのＣＡＮ ＴＦＡ０．１％の添加、５ＣＶのＴＦＡ０．１％水溶液の包含および０．１％を達成するまでのＴＦＡの添加を含んでいた。次いで、サンプルをＲＰ Ａにロードし、１００％ＣＡＮで溶出させ、最後のステップは生理食塩水緩衝液中での再懸濁であった。最終ろ過は、３ｋＤａまたは３０ｋＤａのＡｍｉｃｒｏ Ｕｌｔｒａ フィルタを用いて行った。

＜材料＞
ＲＰ Ａ：ＴＦＡ０．１％水溶液
ＲＰ Ｂ：ＣＡＮ ＴＦＡ０．１％
ＣＥＸ Ａ：酢酸ナトリウム５０ｍＭ ｐＨ４．５
ＣＥＸ Ｂ：酢酸ナトリウム５０ｍＭ ｐＨ４．５
ＡＥＸ Ａ：グリシン５０ｍＭ、ｐＨ９
ＡＥＸ Ｂ：グリシン５０ｍＭ、ＮａＣｌ １Ｍ、ｐＨ９

試験されたペプチドは、ＣＨ_３−Ｃ（Ｏ）−ＹＩＹＴ−ＮＨ_２（配列番号１）、Ｘａａ_１が硫酸化Ｙ（サルフェート基、ＳＯ_３Ｈ）であるＣＨ_３−Ｃ（Ｏ）−Ｘａａ１ＩＹＴ−ＮＨ_２（配列番号２）、およびＸａａ_１が硫酸化ＹであるＣＨ_３−Ｃ（Ｏ）−ＹＩＸａａ_２Ｔ−ＮＨ_２（配列番号３）に対応していた。それらは、懸濁した植物細胞の馴化培地から単離された、ファイトスルフォカイン−β（ＰＳＫ−β）と名付けられた４アミノ酸ペプチドに似た合成ペプチドである（Ｍａｔｓｕｂａｙａｓｈｉら、「Ｐｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ，ｓｕｌｐｈａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９６年、ｖｏｌ．ｎｏ．９３、ｐｐ．：７６２３〜７６２７参照）。

アッセイされたペプチド配列は、Ｒｉｎｋアミド樹脂でのＦｍｏｃベースの保護スキームを使用する固相方法によって組み立てた。Ｔｙｒ（Ｙ）残基の側鎖はｔ−ブチル基で保護されていた。Ｎ末端のフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（Ｆｍｏｃ）基の脱保護を、２０％ピペリジンジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を用いて５分間行った。合成はＰｒｅｌｕｄｅ自動合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国アリゾナ州トゥーソン）で行った。鎖の組み立て後、ペプチド樹脂を９０％トリフルオロ酢酸−５％トリイソプロピルシラン−５％水で１時間処理し、対応する濾液を３倍量の冷却したエチルエーテルで処理してペプチドを沈殿させた。遠心分離後、上清を注意深く除去し、ペレット（ペプチドを含む）を酢酸水溶液（５％ｖ／ｖ）に再溶解し、凍結乾燥した。粗生成物の精製は、水／アセトニトリル勾配（共に０．０５％トリフルオロ酢酸を含む）を用いた分取逆相ＨＰＬＣによって行った。精製されたペプチドはＨＰＬＣによると均一（９５％超）であり、エレクトロスプレー質量分析法により予想される分子量を有していた。

試験終了時（５日間の処置）のデータを図９Ａに示す。図９Ａでは、創傷治癒の潜在能力を、植物の試験した画分それぞれまたはアッセイしたペプチドそれぞれに対する治癒面積（μｍ^２）として描写した。

図９Ｂは、４８時間の処置後の基礎対照に対する創傷治癒増加率（百分率％）を描写している。

結果は三重反復試験から導かれる。瘢痕形成面積の値（または瘢痕形成％）は平均値である。

この図９（図９Ａ、図９Ｂ）から、試験したすべての画分が基礎対照よりも効果的であり、陽性対照またはそれ以上の効果を提供することが直接推測される。このデータは、３〜３０ｋＤａの濃縮されたペプチドを有する馴化培地の画分が実際の創傷治癒促進剤であることを認めるものである。一方で、試験したペプチドも所望の効果をもたらし、ペプチド自体が画分の効果に寄与することを証明した。

完全なものにするために、さまざまな本発明の態様を以下の番号付けした項目に記載する。

＜項目１＞
薬剤として使用するための脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または当該無細胞上清の画分であって、当該無細胞上清または当該画分は、５〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、当該無細胞上清または当該画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物を有しておらず、また膜および／または細胞壁を有していない、無細胞上清または無細胞上清の画分。

＜項目２＞
薬剤は、瘢痕形成皮膚用剤としての使用および／または皮膚創傷治癒剤としての使用および／または皮膚若返り剤としての使用のためのものである、項目１に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目３＞
脱分化した植物細胞培養懸濁液は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来である、項目１〜２のいずれか１つに記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目４＞
当該上清または当該無細胞上清の画分は、ファイトスルフォカイン−α（ＰＳＫ−α）、ファイトスルフォカイン−β（ＰＳＫ−β）、硫酸化チロシン−１を含む植物ペプチド（ＰＳＹ１）、ＲＡＬＦ（Ｒａｐｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、管状要素分化抑制因子（ＴＤＩＦ）、Ｃｌａｖａｔａ−３（ＣＬＶ３）、ＣＬＥ（Ｃｌａｖａｔａ−Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、ＴＰＤ１（Ｔａｐｅｔｕｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ−１）、表皮パターン形成因子−１（ＥＰＦ１）、花の器官脱離欠損（ＩＤＡ）、ＥＳＲ（Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、Ｐｏｌａｒｉｓペプチド（ＰＬＳ）、根分裂組織成長因子（ＲＧＦ）、ＥＣ１（Ｅｇｇ Ｃｅｌｌ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＥＰ（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、初期ノジュリン４０（ＥＮＯＤ４０）、システミン、ＳＣＲ（Ｓ−ｌｏｃｕｓ Ｃｙｓｔｅｉｎ Ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびこれらの混合物からなる群から選択される植物ペプチド成長因子を含む、項目１〜３のいずれか１つに記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目５＞
無細胞上清またはその画分は、
（ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖を支持する馴化培地を得ることと、
（ｂ） 細胞を溶解させることなく馴化培地から植物細胞全体を取り除き、５〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、および混合物から選択されるペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
（ｃ） 場合により、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、無細胞上清の画分を得ることと
を含む方法によって得ることができる、項目１〜４のいずれか１つに記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目６＞
無細胞上清またはその画分は、ステップ（ｂ）の後に無細胞上清を凍結乾燥して、凍結乾燥上清を得ることを含む方法によって得ることができる、項目５に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目７＞
無細胞上清またはその画分は、得られた凍結乾燥無細胞上清をさらに１００〜５００倍濃縮することによって得ることができる、項目６に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目８＞
脱分化した植物細胞懸濁培地は、１・１０５細胞／懸濁培地ｍｌ〜１・１０７細胞／懸濁培地ｍｌの、懸濁培地の体積単位あたりの細胞数として表される細胞密度で培養される、項目１〜７のいずれか１つに記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目９＞
脱分化した植物細胞懸濁培地は、誘導プロセスを用いることによりストレス条件に供される、項目１〜８のいずれか１つに記載の使用するための無細胞上清またはその画分。

＜項目１０＞
ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来の脱分化した植物細胞培養懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清の画分であって、
− ５〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有しておらず、
（ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、脱分化した植物細胞の増殖を支持する馴化培地を得ることと、
（ｂ） 細胞を溶解させることなく馴化培地から植物細胞全体を取り除き、５〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
（ｃ） 固相抽出クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、無細胞上清の画分を得ることと
を含む方法によって得ることができる、画分。

＜項目１１＞
ステップ（ｃ）は固相抽出クロマトグラフィーによって実行される、項目１０に記載の無細胞画分。

＜項目１２＞
１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体を一緒に含む、有効量の項目１０〜１１のいずれか１つに定義される脱分化した植物細胞懸濁培地の上清の無細胞画分を含む皮膚局所用組成物。

＜項目１３＞
局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤のうち少なくとも１つとしてグリセリンを含む、項目１２に記載の皮膚局所用組成物。

＜参考文献＞
・ 米国特許出願公開第２０１４／０７２６１９号明細書
・ 国際公開第２０１２／１３０７８３号明細書
・ 欧州特許第２４３６７５９号明細書
・ Ｒｙａｎら， “Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ”， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｓ２５１−Ｓ２６４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （２００２）
・ Ｃｚｙｚｅｗｉｃｚら，“Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ ａ ｂｏｔｔｌｅ： ｓｍａｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｕｔｐｕｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ， ｖｏｌ． ｎｏ． ６４（１７）， ｐｐ．： ５２８１−５２９６ （２０１３）
・ Ｇｏｂｅｒｄｈａｎら， “Ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ”， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ， Ｖｏｌ Ｎｏ． ９２， ｐｐ．： ９３６３−９３６７ （１９９５）
・ Ｍａｔｓｕｂａｙａｓｈｉら， “Ｐｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ, ｓｕｌｐｈａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． ｎｏ． ９３， ｐｐ．： ７６２３−７６２７ （１９９６）

Claims (15)

1. 皮膚治療のための薬剤として使用するための、脱分化した植物細胞懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清または前記無細胞上清の画分であって、
   前記無細胞上清または前記画分は、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、
   前記無細胞上清または前記画分は、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない、無細胞上清またはその画分。
2. 前記無細胞上清または前記画分は、５〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、前記無細胞上清または前記画分は、細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有していない、請求項１に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
3. 前記薬剤は、瘢痕形成皮膚用剤としての使用および／または皮膚創傷治癒剤としての使用および／または皮膚若返り剤としての使用のためのものである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
4. 前記脱分化した植物細胞培養懸濁液は、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
5. 前記上清または前記無細胞上清の画分は、ファイトスルフォカイン−α（ＰＳＫ−α）、ファイトスルフォカイン−β（ＰＳＫ−β）、硫酸化チロシン−１を含む植物ペプチド（ＰＳＹ１）、ＲＡＬＦ（Ｒａｐｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）、管状要素分化抑制因子（ＴＤＩＦ）、Ｃｌａｖａｔａ−３（ＣＬＶ３）、ＣＬＥ（Ｃｌａｖａｔａ−Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、ＴＰＤ１（Ｔａｐｅｔｕｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ−１）、表皮パターン形成因子−１（ＥＰＦ１）、花の器官脱離欠損（ＩＤＡ）、ＥＳＲ（Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ）、Ｐｏｌａｒｉｓペプチド（ＰＬＳ）、根分裂組織成長因子（ＲＧＦ）、ＥＣ１（Ｅｇｇ Ｃｅｌｌ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＥＰ（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、初期ノジュリン４０（ＥＮＯＤ４０）、システミン、ＳＣＲ（Ｓ−ｌｏｃｕｓ Ｃｙｓｔｅｉｎ Ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびこれらの混合物からなる群から選択される植物ペプチド成長因子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
6. 前記無細胞上清またはその画分は、
   （ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、前記脱分化した植物細胞の増殖をサポートする馴化培地を得ることと、
   （ｂ） 前記細胞を溶解させることなく前記馴化培地から植物細胞全体を取り除き、４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびそれらの混合物から選択されるペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
   （ｃ） 場合により、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、前記無細胞上清の画分を得ることと
   を含む方法によって得ることができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
7. 前記無細胞上清またはその画分は、ステップ（ｂ）の後に前記無細胞上清を凍結乾燥して、凍結乾燥上清を得ることを含む方法によって得ることができる、請求項６に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
8. 前記無細胞上清またはその画分は、前記得られた凍結乾燥無細胞上清をさらに１００〜５００倍濃縮することによって得ることができる、請求項７に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
9. 前記脱分化した植物細胞懸濁培地は、１×１０^５細胞／懸濁培地ｍＬ〜１×１０^７細胞／懸濁培地ｍＬの、懸濁培地の体積単位あたりの細胞数として表される細胞密度で培養される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
10. 前記脱分化した植物細胞懸濁培地は、誘導プロセスを用いることによりストレス条件に供される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用するための無細胞上清またはその画分。
11. ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、Ｓａｒｃｏｃａｐｎｏｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、Ｌｉｔｈｏｐｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｕｎｃａｔｅｌｌａ、アルニカ（Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）、ヤエヤマアオキ（Ｍｏｒｉｎｄａ ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）、ヒレハリソウ（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、およびカメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される植物由来の脱分化した植物細胞培養懸濁培地の増殖を先にサポートした無細胞上清の画分であって、
    − ４〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、エピジェネティック因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、前記画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有しておらず、
    （ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の前記脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、前記脱分化した植物細胞の増殖をサポートする馴化培地を得ることと、
    （ｂ） 前記細胞を溶解させることなく前記馴化培地から植物細胞全体を取り除き、４〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
    （ｃ） 固相抽出クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、前記無細胞上清の画分を得ることと
    を含む方法によって得ることができる、画分。
12. 前記画分は、
    − ５〜３００アミノ酸長の、ペプチド植物成長因子、植物転写因子、およびこれらの混合物から選択されるペプチドを含み、前記画分は細胞溶解による細胞質性細胞内含有物ならびに膜および／または細胞壁を有しておらず、
    （ａ） 液体栄養培養培地中で脆いカルス由来の前記脱分化した植物細胞を５〜１５日間増殖させ、前記脱分化した植物細胞の増殖をサポートする馴化培地を得ることと、
    （ｂ） 前記細胞を溶解させることなく前記馴化培地から植物細胞全体を取り除き、５〜３００アミノ酸長のペプチドを含む無細胞上清を得ることと、
    （ｃ） 固相抽出クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、タンパク質沈殿、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される分離技術を用いてタンパク質分離プロセスを実行し、前記無細胞上清の画分を得ることと
    を含む方法によって得ることができる、請求項１１に記載の無細胞画分。
13. ステップ（ｃ）は固相抽出クロマトグラフィーによって実行される、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の無細胞画分。
14. 請求項１１〜１３のいずれか一項に定義される脱分化した植物細胞懸濁培地の上清の無細胞画分の有効量と、１つまたは複数の適切な局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤または担体とを一緒に含む、皮膚局所用組成物。
15. 局所用の薬学的にまたは美容的に許容される賦形剤のうち少なくとも１つとしてグリセリンを含む、請求項１４に記載の皮膚局所用組成物。