DE19817177A1

DE19817177A1 - Pflanzliche Polysaccharide mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

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Publication number: DE19817177A1
Application number: DE1998117177
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Barz; Hildebert Wagner; Klaus Leonhardt; Holger Ott
Original assignee: LOHMANN RUDOLF LOMAPHARM
Current assignee: LOHMANN RUDOLF LOMAPHARM
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1998-04-17
Publication date: 1999-10-21

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit immunstimulierender Wirkung aus immunstimulierenden Pflanzen über Zellkulturen dieser Pflanzen und spezielle Aufarbeitung des Kulturüberstandes, die Polysaccharide selbst sowie deren Verwendung in Arzneimittelzubereitungen.

Description

Das immunstimulierende therapeutische Konzept ist in der Medizin seit langem bekannt. All gemein versteht man darunter die Injektion von Substanzen, die selbst nur eine geringe bzw. überhaupt keine antigene Wirkung aufweisen, die jedoch in der Lage sind, auf unspezifische oder auch spezifische Art und Weise die körpereigenen Abwehrmechanismen zu induzieren. Nach heutigen Erkenntnissen ist eine Vielzahl von Stoffen in der Lage, die Immunabwehr zu stimulieren wobei insbesondere verschiedene Mineralien, pflanzliche Öle, Mykobakterien so wie auch eine Reihe von pflanzlichen Inhaltsstoffen zu nennen sind. Der gesamte Komplex der Immunstimulierung wird ausführlich beschrieben, z. B. in Cheded L. et al., Immunstimu lation, Springer-Verlag Heidelberg, New York, 1980.

In der Medizin ergeben sich als bevorzugte Anwendungsgebiete für Immunstimulationen vor allem die Therapie von Mischinfektionen, chronischen, persistierenden, chemotherapiere sistenten, bakteriellen und viralen Infektionen, die Prophylaxe von opportunistischen Infekt ionen von Risikopatienten, die Therapie der malignen Erkrankungen, und in gewissem Um fang auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Gleichfalls können Immunstimula tionen bei der Zytostatikatherapie zur teilweisen Kompensation der damit verbundenen Immunsuppression eingesetzt werden.

Auf natürlichem Wege erfolgt die Immunstimulation des Organismus nach antigener Reaktion auf Mikroorganismen. Hierbei werden vor allem Makrophagen und Granulozyten als unspezi fisches zelluläres Abwehrsystem des Körpers aktiviert. In einem Zusammenspiel von spezi fischer und unspezifischer Immunabwehr werden gegen diese Mikroorganismen Makrophagen und Granulozyten durch von T-Zellen sezernierte Lymphokine aktiviert und dadurch in ihrer unspezifischen Abwehrkapazität erheblich gesteigert. Ein solches von T-Lymphozyten im Rahmen von Immunreaktionen produziertes Lymphokin ist das Interferon Gamma, das außer ordentlich effektiv Makrophagen zur Zerstörung von Mikroorganismen aller Art aktivieren kann. Sowohl in-vitro als auch in-vivo kann Interferon Gamma das Abwehrpotential von Makrophagen ganz entscheidend steigern. Allerdings wirkt Interferon Gamma nicht nur auf die Zellen der unspezifischen Abwehr, sondern auch auf eine Vielzahl anderer Körperzellen. Es kann dadurch unter Umständen zu unerwünschten Begleitwirkungen kommen. Makropha gen werden durch bakterielle Pyrogene aktiviert, die bei den bakteriellen Endotoxinen einzu reihen sind. Sie werden von zahlreichen gramnegativen Bakterien wie Pseudomonaden, Sal monellen und Coli-Bakterien produziert und sind dort zu etwa 90% an die Zellwand gebun den. Chemisch stellen sie Lipopolysaccharide dar. Man kann bei genauer Untersuchung 3 Abschnitte unterscheiden. Das Lipid A, die Kernzone und 0-spezifische Seitenketten. Das Lipid A. besteht aus einem Glukosamindisaccharid, dessen Hydroxygruppe mit C12-C16 Fettsäuren verestert ist. Dieser Teil bestimmt die hydrophoben Eigenschaften. Nach außen hin folgt die R-Kernzone, ein Trisaccharid, das auch mit Phosphoethanolamin verknüpft ist. An die Kernzone schließen sich unspezifische Seitenketten an. Sie bestehen aus langen Ketten sich wiederholender Oligosaccharide. Diese enthalten Zuckerbausteine in einer Zusammen setzung, die von Stamm zu Stamm verschieden ist. Die äußeren Heteropolysaccharidketten sind stammspezifisch und repräsentieren die somatischen 0-Antigene.

In der EP 0 225 496 werden Polysaccharide mit immunstimulierender Wirkung beschrieben, die ein mittleres Molekulargewicht von 10 000 mit einem Bereich von 5 000 bis 15 000 haben und folgende Grundstruktur aufweisen:

Polysaccharide mit immunstimulierender Wirkung mit einem mittleren Molekulargewicht von 25 000 mit einem Bereich von 20 000-30 000 und folgender Grundstruktur:

sowie Polysaccharide mit immunstimulierender Wirkung, einem mittleren Molekulargewicht in 0,2 M Phosphatpuffer 110 000, einem Bereich von 100 000-120 000 beschrieben, deren Grundstruktur im wesentlichen aus folgenden Teilen aufgebaut ist:

a) ein Arabinogalact-Anteil der Formel

b) ein Rhamnogalacturonan-Anteil der Formel

c) ein Arabinan-Anteil der Formel

In der oben genannten EP 0 225 496 wird auch ein Verfahren zur Herstellung der genannten Polysaccharide beschrieben, bei dem pflanzliche Zellkulturen als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei als besonderer Vorteil der Verwendung von Zellkulturen angegeben wird, daß die gewünschten Produkte in ständig gleichbleibender chemischer Zusammensetzung und Ausbeute erhalten werden.

Bei der großtechnischen Durchführung dieses Verfahrens hat sich gezeigt, daß die ge wünschten Produkte nicht in allen Fällen eine gleichbleibende biologische Aktivität auf weisen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewinnung der oben genannten pflanzlichen Polysaccharide mit immunstimulierender Wirkung mit Hilfe eines modifizierten technischen Verfahrens, das eine gleichbleibende biologische Aktivität und Ausbeute sicherstellt.

Erfindungsgemäß wird ein spezielles Verfahren zur Aufarbeitung und Reindarstellung aus Pflanzen stammenden Substanzen-zur Herstellung dieser Polysaccharide vorgeschlagen. Das Prinzip dieses Verfahrens basiert auf der Tatsache, daß die Synthese von Makromolekülen (hier Polysaccharide) bei in Suspension befindlichen pflanzlichen Zellkulturen nicht im Ge webe, sondern in der Nährlösung stattfindet.

Überraschend wurde nun ein einfaches Verfahren entdeckt, mit welchem reproduzierbar bio logisch aktives Polysaccharid-Material hergestellt werden kann. Das Verfahren entspricht den in den Ansprüchen gegebenen Definitionen und umfaßt die dort spezifizierten Schritte. Allge mein werden in einem ersten Verfahrensschritt die Pflanzenzellen von der verbrauchten Nährlösung getrennt, in der sich die aktiven Polysaccharide befinden. Zur weiteren Aufreini gung werden die zellfreien Kulturüberstände der Pflanzenzellkulturen nach Filtration, Zentri fugation und Dialyse einer mehrstufigen chromatographischen Aufreinigung an verschiedenen Säulenmaterialien unterzogen.

Die verwendeten Pflanzenzellkulturen können abgeleitet werden von Polysaccharide produ zierenden Zellkulturen aller Echinacea-Arten und Pflanzen, die als immunstimulierend be kannt sind, insbesondere Arnica montana, Calendula officinalis, Eupatorium Arten, Achyro cline saturoeioides und andere Compositen Pflanzen.

Im folgenden wird beispielhaft ein Verfahren zum Anlegen pflanzlicher Zellkulturen, abge leitet von Echinacea purpurea und anschließend ein Verfahren zur Gewinnung von immun stimulierenden Polysacchariden aus diesen Zellkulturen beschrieben.

Als Ausgangsmaterial zum Anlegen der Zellkulturen verwendet man Pflanzenteile wie Keim linge, Blatt-, Blüten-, Stengel- oder Wurzelteile, z. B. aus Echinacea purpurea- oder Echina cea angustifolia-Beständen, die man auf festen Nährboden zunächst zur Kallusbildung anregt.

Zu diesem Zweck implantiert man Keimlinge, Blatt-, Blüten-, Stengel- und Wurzelteile von Echinacea purpurea beispielsweise in agarhaltiges Linsmaier-Skoog-Medium (Linsmaier, E.M., F. Skoog, Physiol. Plant, 18, 100 (1965)) und inkubiert das Medium für 14 bis 28 Tage bei 24°C unter Zusatz von Auxinen, z. B. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure. Qualitativ können die Auxine variiert werden. Wie in "Handbook of Plant Culture" angegeben (Edirors: David A. Evans, William R, Sharp, Philipp V. Ammirato und Aysuyuki Yamada, Vol. 1, Macmillian Publishing Co., A Division of Macmillian, Inc. New York), können auch andere Nährmedien verwendet werden, um Kallus- und Zellkulturen herzustellen.

Nachdem sich der erste Kallus nach etwa 14 Tagen gebildet hat, wird dieser in ein flüssiges Nährmedium übertragen. Diese Zellkulturen sind Suspensionskulturen, wobei diese in 1 l oder 1,5 1 Erlenmeyer-Kolben mit ca. 250 bzw. 1000 ml flüssigem Nährmedium gefüllt und bei 100 Upm geschüttelt werden. Nach 14 Tagen Inkubation bei 22-28°C filtriert man die Suspension ab. Die zellfreie Nährlösung wird einer verkürzten Aufbereitung (vgl. EP 0 255 496) unterworfen und die biologische Aktivität durch TNF Tests und andere Verfahren ge prüft. Sodann wird durch Veränderung der Kulturbedingungen geprüft, ob die für die Aus bildung der Aktivität verantwortlichen Keime in Reinkultur vorhanden sind. Dazu werden der Nährlösung Supplemente hinzugefügt und weitere Parameter wie pH-Wert und Belüftungsrate geändert.

Kulturansatz

Die in Schüttelkolben gezogenen Kulturen werden steril in ein Impfgefäß (Patentschrift DE 39 35 050) überführt und dienen als Inokulum für die Anzucht im größeren Maßstab.

Nährlösung

Die Nährlösung wird in situ in den Fermentern zubereitet oder über eine kontinuierliche Sterilisationsanlage den leer sterilisierten Fermentern zugeführt. Als Kulturmedium für die Echinacea purpurea-Zellkulturen wurde das Ls-Medium nach LINSMAIER und SKOOG (1965) verwendet. Es wurden jedoch anstelle der Phytohormone Indol-3-Essigsäure (IAA) und Kinetin (wie im Original-Kulturmedium) die Hormone 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 1-Naphtylessigsäure (NAA) eingesetzt. Demineralisiertes Wasser dient als Lösungsmittel. Die Nährlösung wird durch Zugabe von Säure/Lauge auf einen pH-Wert von 5-7,5 eingestellt. Die Zusammensetzung des Nährmediums ist im Anhang angegeben.

Beimpfen

Das Überführen des Inokulum wird mittels steriler Druckluft vollzogen bei einer Druckdifferenz von 0,3-1,3 bar. Die Inokulummengen sind in einem Verhältnis von 5-30% von der Nährlösung gewählt.

Fermentation

Der Fermenter wird in den Bereichen von 25-80% seines Bruttovolumens gefüllt und mit einem Überlagerungsdruck von 0,4-1,4 bar beaufschlagt. Sämtliche Absperrorgane sowie Rührwerksdurchführungen entsprechen den Anforderungen an Sterilität. Die Durchmischung erfolgt mittels eines scherkraftarmen Rührwerks im Bereich von < 0-100 Upm vorzugs weise 10-100 Upm. Die Belüftung wird durch einen Düsenring in Bodennähe erreicht. Die Parameter für Belüftung werden entsprechend dem O₂-Bedarf (0-60% pO₂) der Zellen geregelt und haben im Mittel eine Belüftungsrate von 0,15 vvm. Die Temperatur wird während der Wachstumsphase in dem Bereich von 22-36°C stabil gehalten.

Ernte

Bei einem Trockengewicht von 15-25% werden Zellen und Nährlösung durch einen Separator getrennt, und es erfolgt dann die Aufreinigung des Filtrats.

A. Isolierung der Polysaccharide aus dem Zellkulturmedium

Alle im folgenden beschriebenen Arbeiten werden, wenn nicht anders angegeben, bei 4-8°C ausgeführt.

a) Isolierung der Polysaccharid-Rohfraktion

Die Zellen und zellulären Bestandteile von insgesamt 20 l Zellsuspensionskulturen werden abfiltriert und der Rückstand mit 5 l destilliertem Wasser nachgewaschen.

Der zelluläre Rückstand wird zur Gewichtsbestimmung tiefgefroren und lyophilisiert. Die vereinigten Filtrate (20 l) werden in Portionen zu je 3 l unter ständigem Rühren mit dem dreifachen Volumen Ethanol (95%) versetzt. Die über Nacht gebildeten Niederschläge werden zunächst durch vorsichtiges Abdekantieren, anschließend durch Abzentrifugieren von den überstehenden Lösungen abgetrennt (10 000 Upm, 30 min.). Die vereinigten Zentrifugate werden in 4 l destilliertem Wasser gelöst, unter Eiskühlung langsam mit 15%-iger Trichlor essigsäure zur Endkonzentration von 7,5% versetzt und nach einer Stunde abzentrifugiert. Der gallertige Niederschlag wird verworfen, der klare Überstand portioniert und mit dem 3-fachen Vol. Ethanol (95%) ausgefällt. Die gebildeten Niederschläge werden nach 12 Stunden abzentrifugiert, vereinigt und in 1/20 des ursprünglich eingesetzten Volumens Natriumacetatlösung (2%) aufgenommen. Die Lösung wird 8 Stunden bei 4°C gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wird nun mit dem 1-fachen Vol. Ethanol (95%) versetzt, 12 Stunden stehengelassen, der gebildete Niederschlag abzentrifugiert, in 1/10 Vol. destillier tem Wasser aufgenommen, zwei Tage gegen entmineralisiertes Wasser dialysiert und an schließend lyophilisiert (1 : 1 Fällung).

Der Überstand der letzten 1 : 1 Fällung mit Ethanol wird mit dem 1,5-fachen Volumen Ethanol (95%) versetzt und 48 Stunden stehengelassen. Anschließend wird der Niederschlag abzentrifugiert, in destilliertem Wasser gelöst, 48 Stunden dialysiert und gefriergetrocknet (1 : 4 Fällung). Man erhält folgende Ausbeuten:
1 : 1 Fällung: 2 g, ca. 1%, bezogen auf die gefriergetrockneten Zellbestandteile. 1 : 4 Fällung: 1 g, ca. 0,5%, bezogen auf die gefriergetrockneten Zellbestandteile. Lypholisierter Zellrückstand: 270 g.

b) Nachfolgend wird zur Isolierung der Polysaccharid-Rohfraktion ein verkürztes Verfahren unter Weglassung der Trichloressigsäurefällung beschrieben

Die Zellbestandteile von insgesamt 10 l Zellsuspensionskulturen werden abfiltriert und der Rückstand mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Die zellulären Rückstände werden wiederum zur Gewichtsbestimmung lyophilisiert (ca. 120 g lyophilisiertes Zellmaterial) und die vereinigten Filtrate portionsweise mit dem dreifachen Volumen Ethanol (95%) versetzt. Die gebildeten Niederschläge werden zunächst durch vorsichtiges Abdekantieren, anschließ end durch Abzentrifugieren (10 000 Upm, 30 min.) von den überstehenden Lösungen abge trennt. Die vereinigten Zentrifugate werden in destilliertem Wasser gelöst, unlösliche Be standteile abzentrifugiert (10 000 Upm, 30 min.) und die überstehende Lösung mit dem ein fachen Volumen Ethanol (95%) versetzt. Die gebildeten Niederschläge werden nach 12 Stunden abzentrifugiert, anschließend das Zentrifugat in destilliertem Wasser gelöst, die Lö sung 48 Stunden gegen entmineralisiertes Wasser dialysiert und dann lyophiliert. Der Über stand dieser 1 : 1 Fällung wird mit dem 1,5-fachen Vol. Ethanol (95%) versetzt, der gebildete Niederschlag nach 48 Stunden abzentrifugiert (10 000 Upm, 30 min.), dann in destilliertem Wasser gelöst, 48 Stunden gegen entmineralisiertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert (1 : 4 Fällung). Man erhält folgende Ausbeuten:
1 : 1 Fällung: 1,5 g, ca. 1,2%, bezogen auf das lyophilisierte Zellmaterial 1 : 4 Fällung: 0,7 g, ca. 0,5%, bezogen auf das lyophilisierte Zellmaterial Lyophilisierter Zellrückstand: 120 g.

c) Weiteres Verfahren zur Isolierung der Polysaccharid-Rohfraktion

Die Zellen aus 10 l Zellsuspensionskulturen werden über Glasfilternutschen (Por. 2) abge saugt. Das Kulturmedium ca. 9 l wird durch Zentrifugation (z. B. 20 min bei 4000 Upm, Megafuge 1.OR, Heraeus Instr.) weiter gereinigt. Der Überstand wird bei 4°C für 48 Stun den gegen Wasser für Injektionszwecke Ph.Eur. (A. dest.) dialysiert (z. B. Visking Dialyse Schlauch, Ausschlußgrenze 12-14 kDa, Fa. Serva). Das Dialysat wird abermals bei 4000 Upm zentrifugiert und der Überstand lyophilisiert. Man erhält so ein Rohpolysaccharid in einer Ausbeute von ca. 1 g pro 1 der Zellsuspensionskultur.

B. Gewinnung eines neutralen Polysaccharides A und dreier weiterer Polysaccharide (B-D) aus der 1 : 1 Fällung a) Vortrennung

Man beschickt eine Anionenaustauschsäule, beispielsweise eine DEAE-Sepharose® CL-6 B-Säule in Acetatform mit einer wässrigen Lösung der 1 : 1 Fällung. Im Wassereluat wird ein Neutralpolysaccharid A mit positiver optischer Drehung erhalten. Die Elution der sauren Polysaccharidfraktionen erfolgt durch einen NaCl-Gradienten von 0-0,75 M.

Bei einer NaCl-Konzentration von ca. 0,2 M wird ein Polysaccharid (B) mit negativer op tischer Aktivität eluiert, bei einer Salzkonzentration von ca. 0,4 M werden zwei weitere rechtsdrehende Polysaccharidfraktionen (C, D), erhalten.

b) Reinigung des neutralen Polysaccharides A über Anionenaustauschchromatographie und Gelfiltration.

Zur Abtrennung noch vorhandener saurer Polysaccharidanteile wird die im Beispiel a) erhal tene Polysaccharidfraktion A zunächst einer Anionenaustauschchromatographie, bspw. über DEAE-Sepharose® CL-6 B und DEAE-Trisacryl® M, unterworfen. Beide Säulen werden mit H₂O eluiert. Die auf diese Weise gereinigte Neutralfraktion A wird anschließend durch Gel filtration über Sephacryl® S 400 weiter gereinigt. Dadurch gelingt es, niedermolekulare Be standteile ohne optische Aktivitäten vom rechtsdrehenden Polysaccharid abzutrennen. Das ge reinigte Polysaccharid A wird auf Einheitlichkeit geprüft und das Molekulargewicht be stimmt.

Man erhält folgende Ausbeute: ca. 0,07% bezogen auf 100 g lyophilisiertes Zellmaterial.

C. Gewinnung der Polysaccharide E und F aus der 1 : 4 Fällung a) Vortrennung

Durch Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose® CL-6 B erhält man im Wassereluat ein Polysaccharid (E) mit positiver optischer Drehung. Nach Blution mit einer NaCl-Konzentration von ca. 0,2 M wird ein saures Polysaccharid mit negativer Drehung (Polysaccharid F) erhalten.

b) Reinigung der Polysaccharidfraktionen E und F

Polysaccharid E wird durch Gelfiltration, beispielsweise über Ultrogel® AcA mit 0,2 M NaCl-Lösung als Elutionsmittel gereinigt. Man findet das Polysaccharid E im Ausschlußvo lumen der Säule, die Begleitsubstanzen mit niedrigerem Molekulargewicht ohne optische Ak tivität findet man im Fraktionierbereich bzw. im Gesamtvolumen. Die saure Polysaccharid fraktion F wird einer zweiten Anionenaustauschchromatographie, beispielsweise über DEAE-Trisacryl® M, unterworfen. Eluiert man mit reinem Wasser, so findet man im Eluat nur geringe Spuren. Das Polysaccharid F wird bei einer NaCl-Konzentration von 0,2 M als relativ symmetrischer Peak eluiert. Beide Polysaccharide werden anschließend einer weiteren Gelfiltration über Sephacryl® S 400 mit 0,2 M NaCl-Lösung als Elutionsmittel unterworfen.

Man erhält folgende Ausbeuten:
Polysaccharid E 0,18%
Polysaccharid F 0,14%
jeweils bezogen auf 100 g lyophilisiertes Zellmaterial.

b) Technische Verfahren zur reproduzierbaren Gewinnung von Polysacchariden mit bio logischer Aktivität 1. Gelchromatographie an Superose® 12

Die Rohpolysaccharid-Fraktionen (s. Teil A unter a, b und c) werden in Natriumphos phat-Puffer (0,05 M; pH 7,0) in einer Konzentration von etwa 40 mg/ml gelöst und zur Ab trennung unlöslicher Bestandteile zentrifugiert, filtriert und auf die Säule gegeben (Superose® 12 HR 10/30, Pharmacia; Detektion: RI und UV, isokratisch, Flußrate: 0,4 ml/min)nm.

Das Säuleneluat wird im Bereich des Hauptpeaks (Retentionszeit ca. 20 bis 30 min) gesam melt, dialysiert und gefriergetrocknet. Man erhält so ein angereichertes Zwischenprodukt mit einer Ausbeute entsprechend etwa 30% des Rohpolysaccharids. Es handelt sich um ein Ge misch der Polysaccharide E und F.

Zur Trennung der Polysaccharide E und F wird die angereicherte Fraktion erneut einer HPGP-Chromatographie an Superose® 12 unterworfen. Die Durchführung erfolgt analog der ersten Auftrennung, wobei lediglich bidest. Wasser als Laufmittel eingesetzt wird. Die Eluate im Bereich des Hauptpeaks (Retentionszeit ca. 14 bis 24 min.) und des Nebenpeaks (Reten tionszeit ca. 30 bis 40 min.) werden getrennt gesammelt und gefriergetrocknet. Man erhält so die reinen Polysaccharide F (Arabinogalactan, Hauptpeak) und E (Xyloglucan, Nebenpeak).

2. Gelchromatographie an Superdex® oder Sephacryl®

Alternativ zur chromatographischen Trennung an Superose® 12 können in analoger Weise die Materialien Superdex® und Sephacryl® eingesetzt werden.

3. Reinigung durch Lektinaffinitätschromatographie 3.1. Herstellung des Affinitätsgels

30 ml gewaschenes Sepharose 4 B (Pharmacia) werden in 0, 1 M NaHCO₃ bei einem pH von 10,8 + 0 2 mit 3 g fein zerkleinertem Bromcyan unter gutem Rühren bei 3-5°C aktiviert. Nach Abklingen der Reaktion (ca. 15 min.) wird die aktivierte Sepharose 4 B auf einer Glas fritte abgesaugt und bis zum vollständigen Verschwinden des charakteristischen BrCN Ge ruchs mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen.

100 mg reines Rizinuslektin (RCA 1) aus eigener Präparation wurden in ca. 50 ml PBS-Puff er (pH 7,4) gelöst und zu der aktivierten Sepharose hinzugefügt.

Das Material kann so bei 4°C gelagert werden. Im nächsten Schritt werden die noch vor handenen überschüssigen aktivierten Bindungsstellen mit 0,1 M Ethanolamin, pH 7,4, 1 Stunde desaktiviert. Schließlich wird das fertige Affinitätsgel mit 0,2 M Lactose gewaschen, um überschüssiges, nicht kovalent gebundenes Rizinuslektin zu entfernen.

3.2. Affinitätschromatographie

Das Rizinuslektin-Affinitätsgel wird in eine Chromatographiesäule (Pharmacia K 16/40) ein gefüllt und mit etwa dem fünffachen Säulenvolumen PBS-Puffer (phosphate-buffered saline = PBS) pH 7,4 gewaschen. 10 mg der Rohpolysaccharidfraktion werden in 1-10 ml, vor zugsweise 5 ml PBS gelöst und mit einer Flußrate von 1-20 ml/h, vorzugsweise 10 ml/h auf die Affinitätssäule aufgetragen. Das ungebundene Material wird anschließend mit PBS von der Säule gewaschen. Die Elution der gebundenen galactosehaltigen Polymeren erfolgte mit 0,2 M Lactose in PBS. Zur Entfernung der Lactose wurde die eluierte Fraktion anschließend mehrmals gegen destilliertes Wasser oder verdünnten Puffer dialysiert. Das Dialysat kann an schließend lyophilisiert werden.

E. Struktur der isolierten Polysaccharide a) Polysaccharid A und E 1. Molekulargewichtsbestimmung

Die Molekulargewichtsbestimmung der Polysaccharide A und E erfolgte durch Gelchromato graphie über Sephacryl® S 400 mit Wasser, bzw. 0,2 M NaCl-Lösung als Eluierungsmittel, so wie mittels HPLC.

Verwendetes HPLC-System:

a) µ-Porasil-Gpc-60 + µ-Bondagel E 125
b) µ-Bondagel E 125 + 5-Bondagel E 500 Fa. Waters

Puffersysteme: 0,2 M bzw. 0,5 M Phosphatpuffer pH = 6,0
Vergleichssubstanzen: Dextran T 10, T 40, T 70, T 110, T 500, T 2000.

Mit diesen Methoden wurde ein mittleres Molekulargewicht des Polysaccharids E mit 10 000 (Bereich: 5-15 000) und des Polysaccharids A mit 25 000 (Bereich 20-30 000) bestimmt.

2. Struktur

Beide Polysaccharide stellen Fuco-galacto-xylo-glucane dar, die aus Fucose, Galactose, Xylose und Glucose im Verhältnis von 0,1 : 0,4 : 1 : 1,5 aufgebaut sind.

Die Hauptketten der Polysaccharide bestehen aus (1→4)-β-verknüpften Glucoseeinheiten, die zu ca. 65% in Position C-6 verzweigt sind.

Die Seitenketten sind relativ unterschiedlich zusammengesetzt und haben eine maximale Kettenlänge von 3 Zuckereinheiten. Im einfachsten Falle ist die terminale Xylose direkt am C-6 des Glucangerüstes gebunden. Daneben sind aber auch Galactose-(1→2)-Xylose-, Fucose- (1→2)-Galactose -(1→2)-Xylose und Galactose-(1→2)-Galactose-(1→2)-Xylose Seitenketten vorhanden. Aufgrund der isolierten Oligosaccharide kann man annehmen, daß die Polysaccaride größtenteils aus sich wiederholenden Einheiten von Hepta- und Dekasacchariden aufgebaut sind.

Sowohl das Polysaccharid A als auch das Polysaccharid B sind zu ca. 8% acetyliert.

Grundstruktur der Polysaccharide A und E

b) Grundstruktur des Polysaccharids F

1. Wie im Beispiel a) beschrieben, wurde das mittlere Molekulargewicht des Polysaccharids F je nach verwendetem Puffersystem mit 75.000 mit einem Bereich von 65 000-85 000 (0,5 M Phosphatpuffer pH 6,0) bzw. 110.000 mit einem Bereich von 100 000-120 000 (0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0) bestimmt.

Polysaccharid F stellt ein saures Arabinogalactan dar. Das Grundgerüst baut sich aus (1→3)-β-verknüpften Galactose-Ketten auf, die über ein Rhamnogalacturonan miteinander verknüpft sind.

Jede zweite Galactose-Einheit der (1→3)-β-Galactan-Kette ist über das C-6-Atom mit (1→6)-β-Galactose-Seitenketten verknüpft. Diese wiederum sind zu fast 70% in Position C-3 mit terminaler Arabinose verknüpft.

Zusätzlich zu diesen Polysaccharid-Bestandteilen konnten noch längere, stark verzweigte (1→5)-α-Arabinan-Ketten nachgewiesen werden. Dieser Arabinanteil kann am Arabinogalact ananteil oder am Rhamnogalacturonan gebunden sein.

Struktur des Arabinogalactanteils des Polysaccharids F

Grundstruktur für den Rhamnogalacturonan-Teil des Polysaccharids F

Grundstruktur des Arabinanteils des Polysaccharids F

F. Pharmakologische Wirkung der isolierten Polysaccharide

Da es bislang keine spezifischen Testmethoden zur Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung von Substanzen gibt, verwendet man bis heute primär solche in-vitro- und in-vivo- Verfahren, die den Einfluß von Verbindungen oder Pflanzenextrakten auf den Funktionszu stand und die Leistungsfähigkeit des mononuklearen Systems sowie die Stimulierbarkeit von T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.

a) Granulozyten-Test nach Brandt:
(Brandt, L., Scand. J. Naematol. (Suppl.) 2 (1967).

Im Granulozyten-Test nach Brandt wird im in-vitro-Versuch die Zahl von phagozytierten Hefezellen oder Bakterien durch eine Granulozytenfraktion, die aus Humanserum gewonnen wurde, unter dem Mikroskop bestimmt. Man mißt die prozentuelle Steigerung der Phagozytose durch bestimmte Polysaccharidfraktionen.

Tabelle 1

Prozentuale Steigerung der Phagozytose durch einzelne Polysaccharidfraktionen im Granulozytentest nach BRANDT

b) ein weiterer Test zur Bestimmung der Wirkung von immunstimulierenden Substanzen ist die sogenannte Carbon-Clearance-Methode. Bei dieser Methode wird spektrophoto metrisch die Eliminationsrate von Kohlepartikeln aus dem Blut von Tieren gemessen. Diese Eliminationsrate stellt ein Maß für die Phagozytoseaktivität dar (Biozzi, G., Benacerraf, B., Halpern, B. N., Br. J. Exp. Pathol. 34, 441(1953)).

In der folgenden Tabelle 2 ist der Einfluß der Polysaccaridfraktionen aus der Zellkultur auf die Carbon-Clearance bei Mäusen dargestellt.

Tabelle 2

Einfluß von Polysaccharidfraktionen aus der Zellkultur auf die Carbon-Clearance bei Mäusen

Verabreichung von jeweils einmal 10 mg Substanz/kg Maus

In den immunologischen Untersuchungen zeigte das 1 : 1 Fällungsprodukt aus dem Nährme dium im Granulozytentest deutlich höhere Phagozytoseraten als das 1 : 4 Fallungsprodukt. Derselbe Aktivitätsunterschied konnte auch bei den aus dem 1 : 1 bzw. 1 : 4 Fällungsprodukt isolierten Einzelkomponenten festgestellt werden.

Polysaccharide A

Das aus der 1 : 1 Fällung mit Ethanol isolierte Polysaccharid A zeigte im Gegensatz zu Poly saccharid E aus der 1 : 4 Fällung, übereinstimmend im Granulozyten- und Carbon-Clear ance-Test, deutlich höhere immunstimulierende Aktivität.

Polysaccharid F

Das Polysaccharid F erwies sich wie andere geprüfte Arabinogalactane in den verwendeten Testsystemen als nur mäßig aktiv, zeigte dagegen im TNF-Test (Tumor-Nekrosis-Faktor- Test) eine deutliche Wirkung.

c) Makrophagenaktivierung zu direkten Zytotoxizität gegen Tumorzellen, bestimmt nach Stimpl, M., Proksch, A., Wagner, H. und Lohmann-Matthes, M.L., Infection and Immunity 46, 845 (1984).

Polysaccharid A aktivierte in diesem Versuch 2 × 10⁵ Maus-Peritonealmakrophagen zu voll ständiger Zytotoxizität gegen P 815 Tumorzellen bis zu einer Verdünnung von 6 bis 50 µg pro 2×10⁵ Makrophagen.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide können entweder getrennt als Reinsubstanz oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht werden, wenngleich es im allgemein en bevorzugt ist, die Verbindungen in einer Kombination zu verabreichen. Vorzugsweise liegt die Arzneimittelkombination in Form einer Formulierung vor, die

(1) die erfindungsgemäßen Polysaccharide entweder allein oder in Kombination miteinander enthält und
(2) eines oder mehrere dafür geeignete Bindemittel, Trägermaterialien und/oder weitere Hilfsstoffe und
(3) gegebenenfalls weitere therapeutische Wirkstoffe aufweist.

Die Trägermaterialien, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe müssen pharmazeutisch und pharma kologisch verträglich sein, so daß sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung bzw. Zubereitung vereinbar sind und keine nachteilige Wirkung auf den behandelten Organismus ausüben.

Die Formulierungen schließen jene ein, die für die orale oder parenterale (einschließlich sub kutane, intradermale, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung geeignet sind, wenn gleich der am besten geeignete Verabreichungsweg vom Zustand des Patienten abhängt.

Die Formulierungen können als Einzeldosierung vorliegen. Die Herstellung der Formulier ungen erfolgt unter Anwendung von an sich auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Methoden. Alle Methoden schließen den Schritt ein, die erfindungsgemäßen Polysaccharide (d. h. die Wirkstoffe) mit dem Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff, wobei letz tere einen zusätzlichen Bestandteil darstellen, zu vermischen bzw. zu vereinigen. Im allge meinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, daß man die Wirkstoffe mit den flüssigen Trägermaterialien oder den feinteiligen Trägermaterialien oder beiden innig ver mischt und dann erforderlichenfalls das erhaltene Produkt in die gewünschte Verabreichungs form bringt. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die für die orale Verabreichung ge eignet sind, können in Form von diskreten Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes enthalten, sowie in Form von Pulvern oder Granulaten, in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit, oder in Form einer flüssigen Öl-in-Wasser-Emul sion oder einer flüssigen Wasser-in-Öl-Emulsion vorliegen.

Die Wirkstoffe können auch in Form eines Bolus oder einer Paste vorliegen.

Die Tabletten kann man durch Pressen oder Verformen herstellen, wobei man gegebenenfalls eines oder mehrere der üblichen Hilfsmittel zugibt.

Die für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen schließen sterile Injektions lösungen in wässrigen oder nicht wässrigen Medien, die Antioxidantien, Puffer, Bakteri stostatika und gelöste Materialien, die die Formulierung im Hinblick auf den menschlichen Organismus isotonisch machen, ein. Weiter können die erfindungsgemäßen Polysaccharide in Form von sterilen Suspensionen in wässrigen oder nicht wässrigen Medien, die Suspensions mittel und Verdickungsmittel enthalten können, vorliegen. Die Formulierungen können als Einzel- oder Mehrfach-Dosis vorliegen, beispielsweise in Form von Ampullen oder dicht ver schlossenen Fläschchen und können auch in lyophilisierter Form gelagert werden, so daß es lediglich erforderlich ist, bei notwendiger Verabreichung steriles flüssiges Trägermaterial, beispielsweise für Injektionszwecke geeignetes Wasser, unmittelbar vor Verwendung zuzu geben. Die unmittelbar vor der Verabreichung bereiteten Injektionslösungen und Suspen sionen können aus sterilen Pulver, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art bereitet werden.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können neben den vorhin genannten Bestandteilen an dere für die in Rede stehenden Formulierungen geeignete Bestandteile enthalten. So können beispielsweise die auf oralem Weg zu verabreichenden pharmazeutischen Zubereitungen Aromastoffe enthalten.

Die zur Applikation geeigneten Mengen der Wirkstoffe variieren in Abhängigkeit vom jeweiligen Therapiegebiet. Im allgemeinen beträgt die Wirkstoffkonzentration in einer Einzel dosisformulierung 5 bis 95% der gesamten Formulierung. Dies entspricht bei einer einmali gen Applikation 1 bis 50 mg pro kg Körpergewicht. Diese Dosierung kann jedoch in Ab hängigkeit der eingesetzten Applikation, des Patientenzustandes und des Therapiegebietes in breiten Grenzen variiert werden.

Anhang Zusammensetzung des LS-Kulturmediums

Nährsalze

Organische Substanzen

Phytohormone

Kohlenstoffquelle

Der pH-Wert wurde mit Na-OH-Lösung auf 6,0 eingestellt und das Kulturmedium bei 121°C 20 min autoklaviert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit immunstimulierender Wir kung, die

1.1 ein mittleres Molekulargewicht von 10.000 D mit einem Bereich von 5.000 D bis 15.000 D
1.2 ein mittleres Molekulargewicht von 25.000 D mit einem Bereich von 20.000 D bis 30.000 D und
1.3 ein mittleres Molekulargewicht von 110.000 D mit einem Bereich von 100.000 D bis 120.000 D in 0,2 M Phosphatpuffer haben, wobei die Polysaccharide 1.1. und 1.2. folgende Grundstruktur
und das Polysaccharid 1.3. eine Grundstruktur im wesentlichen aus folgenden Teilen aufweist:
einen Arabinogalaktananteil der Formel:
einen Rhamnogalakturonanteil der Formel:
und einen Arabinananteil der Formel:
bei dem man
a) Pflanzenteile einer als immunstimulierend bekannten Pflanze zur Kallusbildung anregt und aus dem gebildeten Kallus Primärzellen für eine Zellsuspension nach an sich bekannten Methoden gewinnt,
b) die Zellsuspensionskulturen nach 12 bis 20 Tagen bei 22°C bis 28°C abfiltert,
c) aus dem Filtrat ein Rohpolysaccharid gewinnt und
d) gegebenenfalls das Rohpolysaccharid einer mehrstufigen chromatographischen Aufreinigung unterzieht, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rohpolysaccharid gewinnt, in dem man
e) dem Zellkultur-Überstand mit dem 2-4-fachen, vorzugsweise 3-fachen Volumen Ethanol versetzt,
f) den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugation abtrennt, anschließend in destil liertem Wasser aufnimmt,
g) wahlweise mit 15%-iger Trichloressigsäure zu einer Endkonzentration von 7,5% versetzt, stehen läßt, anschließend zentrifugiert,
h) den nach der Zentrifugation erhaltenen Überstand mit dem 3-6-fachen, vorzugs weise 4-fachen Volumen Ethanol versetzt, den gebildeten Niederschlag nach 12 Stunden Standzeit zentrifugiert, anschließend in 2%-iger Natriumacetatlösung aufnimmt, diese Lösung für 8 Stunden rührt und anschließend filtriert,
i) das Filtrat mit dem 0,5-1,5-fachen, vorzugsweise 1-fachen Volumen Ethanol ver setzt, 12 Stunden stehen läßt, den gebildeten Niederschlag abzentrifugiert und in 1/8 bis 1/10 des ursprünglichen Volumens destilliertem Wasser aufnimmt, 2 Tage gegen entmineralisiertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert,
j) den Überstand der ersten Alkohol-Fällung mit dem 1,5-2,5-fachen, vorzugsweise 2-fachen Volumen Ethanol versetzt, die Lösung für 48 Stunden stehen läßt, den Niederschlag abzentrifugiert, in destilliertem Wasser löst, die Lösung 48 Stunden gegen entmineralisiertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf der Stufe e) zur Ausfällung der Polysaccharide Aceton, Ammoniumsulfat, Cetyltrimethylam moniumbromid, CaCl₂ oder Fehling'sche Lösung verwendet.

3. Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, bei dem das Rohpolysaccharid gewonnen wird, in dem man

a) das von den Zellen abfiltrierte Kulturmedium durch Zentrifugation bei 4000 rpm reinigt,
b) den Überstand gegen Wasser für Injektionszwecke dialysiert,
c) das Dialysat bei 4000 rpm zentrifugiert und
d) den Überstand lyophilisiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Kulturmedium in Schritt b) mit Hilfe einer Glasfilternutsche von den Zellen getrennt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Rohpolysaccharid weiter aufgereinigt wird, in dem man

a) das Rohpolysaccharid-Lyophilisat in Natriumphosphat-Puffer löst, zentri fugiert und filtriert,
b) das Filtrat einer Säulenchromatographie an Superose®, Superdex® oder Sephacryl® unterwirft und
c) das Säuleneluat im Bereich des Hauptpeaks sammelt, dialysiert und lyo philisiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man das in Schritt c) gesammelte Eluat erneut den Schritten a), b) und c) unterwirft, wobei in Schritt c) die Eluate im Bereich des Haupt- und Nebenpeaks getrennt gesammelt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Rohpolysaccharid weiter aufgereinigt wird, in dem man

a) das Rohpolysaccharid-Lyophilisat in PBS löst,
b) auf eine Rizinuslektin-Affinitätsgel-Säule aufträgt,
c) das ungebundene Material mit PBS eluiert,
d) das gebundene Material mit 0,2 M Lactose-Lösung in PBS eluiert und
e) zur Entfernung der Lactose dialysiert und anschließend wahlweise lyophi lisiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Rizinuslektin-Affinitätsgel ein Sepharo se 4 B-Gel ist, an das reines Rizinuslektin mittels BrCN-Kupplung konjugiert wurde.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkultur aus einer Echinacea-Art ausgewählt ist.

10. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoffe Polysaccharide hergestellt nach den Ansprüchen 1 bis 8 neben üblichen pharma zeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen enthält.

11. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 10 zur Verwendung in der Human therapie als Immunmediator oder Immunmodulator.

12. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 10 oder 11 zur Verwendung in der Humantherapie zur Aktivierung und/oder Freisetzung des Tumor-Nekrosis- Faktors aus den kompetenten Zellen.

13. Polysaccharide mit immunstimmulierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach einem der Verfahren 1 bis 8 erhältlich sind.

14. Polysaccharide nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Erhal tung immunstimmulierender Aktivität einer Pyrosorbbehandlung zur Entfernung freier Pyrogene unterzogen werden.