DE2518474A1

DE2518474A1 - Mitogenes mittel, verfahren zu seiner herstellung und diese mittel enthaltende arzneimittel und biologische reagenzien

Info

Publication number: DE2518474A1
Application number: DE19752518474
Authority: DE
Inventors: Geb Chosson Arlette Adam; Constantin Bona; Louis Chedid; Geb Sfartz Rita Ciorbaru; Geb Rousselot Chantal Damais; Edgar Lederer; Jean-Francois Petit
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1974-04-25
Filing date: 1975-04-25
Publication date: 1975-11-20
Also published as: GB1509222A; FR2268531A1; FR2268531B1; US4042678A

Description

Die Erfindung betrifft ein mitogenes Mittel, Verfahren zu seiner Herstellung und dieses Mittel enthaltende Arzneimittel und biologische Reagenzien.

Die Erfindung betrifft insbesondere lösliche Mittel mit mitogenen Eigenschaften. Aufgrund dieser Eigenschaften besitzen diese Mittel als biologische Reagenzien für die Forschung und die Diagnose einen großen Wert. Sie bewirken, wenn sie an Menschen oder Tiere verabreicht werden, eine nicht spezifische Reizung der Lymphozyten B, was eine Steigerung der Antikörper zur Folge hat, die gegen eine große Kategorie von Antigenen wirken. Weiterhin begünstigen sie die Entwicklung der Stammzellen, so daß ihre Ver-

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Wendung zur Heilbehandlung von Krankheiten ins Auge gefaßt werden kann, die eine Folge eines Mangels von immunkompetenten und hämatopoetischen Zellen sind.

Es sind bereits Mittel beschrieben worden, die in der Lage sind, in vitro Lymphozytenkulturen sowie Stammzellen zu stimulieren. Es handelt sich im wesentlichen um Lipopolysaccharide oder bakterielle Endotoxine, die die Stammzellen stimulieren und eine mitogene in vitro-Wirkung in Bezug auf Lymphozyten B der Milz der Maus ausüben. Sie sind jedoch bei Lymphozyten B einer Vielzahl von anderen Tierarten, insbesondere des Kaninchens, des Affen und des Menschen, nicht aktiv. Andererseits verbietet ihre extreme Toxizität jede therapeutische Anwendung dieser Lippolysaccharide (die im folgenden abgekürzt auch als L.P.S. bezeichnet werden) beim Menschen oder beim Tier.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, Mittel zu schaffen, die gleichzeitig in vivo aktiv und von toxischen Wirkungen frei sind und in der Lage sind, für therapeutische Anwendungszwecke einerseits und für nicht-therapeutische Anwendungszwecke andererseits eingesetzt zu werden.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß man ausgehend von Zellen von Nocardia nicht-toxische Mittel bereiten kann, die gleichzeitig eine mitogene Wirkung, eine Adjuvanswirkung und eine stimulierende Wirkung auf die hämatopoetischen Zellen ausüben. Weiterhin hat sich diese nicht-spezifische mitogene Wirkung nicht nur an der Maus gezeigt, sondern auch bei anderen Tieren und dem Menschen. Insbesondere hat sich gezeigt, daß man Präparate mit mitogener Wirkung erhalten kann, wenn man auf Nocardia-Zellen bekannte Verfahren zur Extraktion von wasserlöslichen Mitteln, die eine nicht-spezifische immunostimulierende Wirkung besitzen, anwendet, derart, wie sie in der deutschen Patentanmeldung P 22 56 838.3 vom 20. November 1972 beschrieben sind.

Ganz allgemein erhält man ein rohes Präparat mit einer mitogenen Wirkung, wenn man die aus einer Nocardiae-Kultur isolierten ZeI-

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len in einer wässrigen Lösung mit sämtlichen Mitteln behandelt, die dazu geeignet sind, die Zellwände aufzubrechen, insbesondere durch Anwendung einer mindestens teilweisen Lyse des Materials, wobei die nach der Abtrennung der Bakterien anfallende wässrige Lösung das rohe mitogene Präparat darstellt.

Vorteilhafterweise erhält man gereinigte Präparate durch Filtrieren dieser rohen Präparate über ein Molekularsieb und durch Gewinnen jener Fraktionen, die das mitogene Mittel enthalten. Es handelt sich im allgemeinen um Fraktionen, die auch Peptidoglykanfragmente enthalten. Beispielsweise ist festgestellt worden, daß die unter Anwendung von Extraktionsverfahren, wie sie in der obengenannten deutschen Patentanmeldung beschrieben sind, erhaltenen immunostimulierenden Mittel ein derartiges mitogenes Mittel enthalten.

Es sei in Erinnerung gerufen, daß das in der genannten Patentanmeldung beschriebene Verfahren, insbesondere wenn es auf Nocardia-Zellen angewandt wird, im wesentlichen darin besteht, daß man diese Zellen züchtet, die Zellen des gezüchteten Stammes gewinnt, sie aufbricht, die aufgebrochenen Zellwände gewinnt, beispielsweise durch differentielles Zentrifugieren, die Wachse, freien Lipide, Proteine und die Nukleinsäuren abtrennt und entfernt, das von Lipiden befreite und aus den Zellwänden gewonnene Material mit einem murolytischen Enzym, wie Lysozym, in wässrigem Medium digeriert, den festen Rückstand abtrennt und eine wässrige Fraktion gewinnt, die nicht spezifisch wirkende immunologische Mittel mit Adjuvanswirkung enthält.

Gemäß dem ebenfalls in der genannten Patentanmeldung beschriebenen perfektionierten und bevorzugten Verfahren werden die gewonnenen gezüchteten Zellen direkt mit zur Entfernung von Lipiden geeigneten Lösungsmitteln behandelt, ohne daß zuvor ein Aufbrechen der Zellen bewirkt wird, wonach die von Lipiden befreiten Zellen direkt der Einwirkung des murolytischen Enzyms unterzogen werden. Wie im Fall des in der obigen Patentanmeldung beschriebenen Verfahrens erhält man, wenn man von Nocardiae-Zellen ausgeht, eine wäss-

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rige Fraktion, die ein wasserlösliches immunostimulierendes Mittel enthält, das gefriergetrocknet werden kann.

Gemäß der ersten Variante des oben beschriebenen Verfahrens kann man die folgenden Techniken anwenden, um die Wachse, die freien Lipide, die Proteine und die Nukleinsäuren abzutrennen und zu entfernen. Vorzugsweise beseitigt man die störenden Proteine durch Behandeln des Materials der zerbrochenen Zellwände mit proteolytischen Enzymen, wie Trypsin und Chymotrypsin, während man die Nukleinsäuren durch Behandeln des Materials mit Desoxyribonuklease oder DNA und die freien Lipide und die Wachse durch Behandeln dieses Materials mit neutralen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Aceton, Alkohol, Chloroform oder Mischungen derartiger Lösungsmittel entfernt, wozu man vorteilhafterweise am Rückfluß arbeitet, beispielsweise in einer Soxhlet- oder Kumagawa-Extrahiervorrichtung.

Natürlich kann man auch im Rahmen des oben beschriebenen perferktionierten Verfahrens in gleicher Weise die Lipide aus den vollständigen Zellen entfernen.

Die von Lipiden befreiten Zellwände und/oder (in Abhängigkeit von dem angewandten Extraktionsverfahren) die vollständigen Zellen werden anschließend gewaschen und in Wasser oder einer wässrigen Lösung suspendiert, wonach der pH-Wert dieser Lösung auf einen Wert eingestellt wird, der für die anschließend mit dem murolytischen Enzym durchgeführte Digerierungsbehandlung optimale Bedingungen schafft. Wenn man als Enzym Lysozym einsetzt, so stellt man den pH-Wert vorteilhafterweise auf einen Wert von 6,2 bis 6,3 ein. In diesem letzteren Fall verwendet man mit Vorteil einen 0,1m-Ammoniumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2, der, neben der Tatsache, daß er dem Lysozym optimale Bedingungen liefert, anschließend vollständig entfernt werden kann, insbesondere durch Gefriertrocknen.

Es versteht sich von selbst, daß der eine optimale Wirksamkeit des ausgewählten Enzyms ermöglichende pH-Wert in an sich bekannter

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Weise in Abhängigkeit von der Art des ausgewählten murolytischen Enzyms und gegebenenfalls auch in Abhängigkeit von der Art des Substrats variieren kann. Gewünschtenfalls kann dieser pH-Wert, ebenso wie die Temperatur, bei der das Digerieren am besten abläuft, experimentell bestimmt werden.

Das erhaltene wasserlösliche immunostimulierende Mittel kann in vorteilhafter Weise dadurch gereinigt werden, daß man insbesondere das gefriergetrocknete Mittel, beispielsweise mit Hilfe von verdünnter Essigsäure, in eine wässrige Lösung überführt, die ein Filtrieren des Materials über ein Molekularsieb erlaubt. Vorteilhafterweise verwendet man Molekularsiebe auf der Basis von vernetzten Dextranen, die im Handel unter der Bezeichnung Sephadex erhältlich sind, insbesondere verwendet man Sephadex G75 und G50.

Man gewinnt jene Fraktionen, die eine mitogene Wirkung entfalten. Es handelt sich in der Mehrzahl der Fälle um jene Fraktionen, die auch freie oder chemisch gebundene Peptidoglykanfragmente enthalten.

Es ist bekannt, daß von anderen Autoren andere Verfahren beschrieben wurden, mit denen man ausgehend von Mykobakterien ähnliche wasserlösliche Mittel erhält. In diesem Zusammenhang seien die Veröffentlichungen von D.Migliore und T.Jolles, FEBS Letters, (1972) Seiten 301 bis 304 und von I.J.Hiu, Nature New Biology, 238 (1972) Seiten 241 bis 242 genannt. Die in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren sind natürlich auch auf Nocardia-Zellen anwendbar.

Die Adjuvanswirkung dieser Präparate wurde unter anderem in diesen Präparaten enthaltenen löslichen Fragmenten der Peptidoglykane zugeschrieben, die in dem Aufbau der Zellwände der ursprünglich eingesetzten Bakterien vorhanden sind.

Erfindungsgemäß hat sich gezeigt, daß die aus Nocardiae gewonnenen wasserlöslichen Präparate auch ein mitogenes Mittel enthalten,

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das sich von den obengenannten Peptxdoglykanfragmenten unterscheidet. Es ist ferner gefunden worden, daß die aus Nocardiae gewonnenen Präparate andere Adjuvantien enthalten, die nicht durch Peptidoglykanfragmente gestellt zu sein scheinen.

Diese Mittel sind Gegenstand der Erfindung. Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zum Extrahieren dieser Mittel aus den wasserlöslichen Präparaten der oben beschriebenen Art. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines mitogenen Mittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Nocardiae züchtet, die Zellen gewinnt, sie einer Behandlung zum Aufbrechen der Zellwände unterzieht, insbesondere durch eine Lyse, mindestens zum Teil die wässrige Fraktion gewinnt, die in dieser wässrigen Fraktion enthaltenen Peptidoglykanfragmente abtrennt und die das mitogene Mittel enthaltende verbleibende Fraktion gewinnt.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die Anwendung der fraglichen, aus Nocardiae-Kulturen gewonnenen wasserlöslichen Präparate für therapeutische und nicht-therapeutische Zwecke.

Bei den erfindungsgemäßen Produkten handelt es sich um jene Materialien, die man ausgehend von diesen wasserlöslichen Präparaten oder ausgehend von durch Reinigen dieser wasserlöslichen Präparate, insbesondere durch Filtrieren über ein Molekularsieb, wozu man vorzugsweise ein Molekularsieb des Typs Sephadex verwendet, nach einer im wesentlichen vollständigen Abtrennung der ursprünglich in diesem Präparat oder der Fraktion vorhandenen Peptidoglykanfragmente erhält.

Eines der erfindungsgemäßen Verfahren, das auf die wasserlöslichen Präparate der fraglichen Art, die aus Nocardiae extrahiert sind, oder auf gereinigte, insbesondere durch Filtration über einem Molekularsieb, Fraktionen der letzteren Produkte angewandt wird, besteht im wesentlichen darin, daß man die freien oder chemisch gebundenen Peptidoglykanfragmente abtrennt und die verbleibenden Produkte gewinnt, die das erfindungsgemäße mitogene Mittel enthalten.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens extrahiert man die das mitogene Mittel enthaltenden Fraktionen durch Waschen der von Lipiden befreiten Nocardiae mit Wasser, wobei die Waschwässer das mitogene Mittel enthalten.

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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens führt man eine Gefriertrocknung der fraglichen wasserlöslichen Präparate oder der daraus gewonnenen gereinigten Fraktionen durch, suspendiert das gefriergetrocknete Material in konzentrierter Essigsäure, vorzugsweise reiner Essigsäure oder einer wässrigen Lösung von Essigsäure, die mindestens 70%, vorzugsweise mehr als 90% Essigsäure enthält, und trennt die gelöste Fraktion von der nichtgelösten Fraktion ab, wozu man insbesondere zentrifugiert, wonach man die gelöste Fraktion verwirft und die nichtgelöste Fraktion gewinnt. Die in konzentrierter Essigsäure unlösliche Fraktion, die jedoch ohne weiteres in Wasser gelöst werden kann, enthält das erfindungsgemäße mitogene Mittel. Es ist in vitro und in vivo bei vielen Tierarten und insbesondere beim Menschen aktiv.

Weiterhin behandelt man die obengenannten wasserlöslichen Präparage vorzugsweise durch Extrahieren mit Lösungsmitteln, um die Entfernung der Lipide zu vervollständigen, bevor man die Materialien gefriertrocknet und in Essigsäure aufnimmt.

Es ist weiterhin auf die bemerkenswerte Tatsache hinzuweisen, daß das mitogene wasserlösliche Produkt in Abwesenheit jeglichen öligen Trägers aktiv ist. Es kann somit in Form von wässrigen Lösungen eingesetzt werden. Weiterhin ist das Produkt nicht toxisch.

Weitere Gegenstände, Vorteile und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von mehreren, aus Nocardiae-Kulturen, insbesondere aus Nocardia opaca, Nocardia corallina und Nocardia rubra (von anderen Autoren auch als Corynebacterium rubrum bezeichnet), gewonnenen mitogenen Mitteln.

Im folgenden seien die Züchtungsbedingungen der in den Beispielen verwendeten Stämme und die Methoden der Gewinnung der aktiven Fraktionen beschrieben.

Die Zellen der drei Nocardiae-Stämme werden in einer Fermentiereinrichtung mit einem Fassungsvermögen von 20 1 (Biolafitte, Maisons-Lafitte) gezüchtet.

Die Zellen von Nocardia opaca, Stamm Pasteur ATCC 21953, werden während 2 Tagen bei 30°C in einem Medium gezüchtet, das 0,2% Hefeextrakt (Difco), 0,4% Fleischextrakt (Difco), 2% Bactopepton

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(Difco) und 0,5% NaCl enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist.

Die Zellen von Nocardia corallina, Stamm ATCC 999, werden während 24 Stunden bei 34°C in einem Medium gezüchtet, das 0,4% Fleischextratk (Difco), 2% Bactopepton (Difco) und 0,5% NaCl enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist.

Die Zellen von Nocardia rubra, Stamm ATCC 14898, werden während 5 Tagen in einem Medium gezüchtet, das 2,5% "Heart Infusion Broth" (Difco), 10 ml Glycerin pro Liter und 0,25 g Na₃HPO₄' 12H₂O pro Liter enthält und einen pH-Wert von 7,4 bis 7,6 aufweist.

Die Zellen werden in einer Soxhlet-Extraktionsvorrichtung nacheinander mit Aceton, Äthanol, Äther, Chloroform, Methanol und einer Chloroform/Methanol-Mischung (87/13, Volumen/Volumen) extrahiert und dann in Aceton suspendiert, dekantiert und getrocknet. Die Zellen werden anschließend in einer Wassermenge, die dem lOOfachen ihres Gewichts entspricht, extrahiert, indem man sie mit Hilfe einer Zerkleinerungsvorrichtung des Typs Potter mit Teflonkolben suspendiert, wonach man die überstehende Flüssigkeit durch Abzentrifugieren (während 1 Stunde bei 27 500 g und 4⁰C) gewinnt und gefriertrocknet. Der gefriergetrocknete Extrakt wirkt gleichzeitig als Adjuvans und mitogen. Die Zellen werden anschließend mit 0,1m Ammoniumacetatlösung (pH = 6,2) in einer Menge, die dem lOOfachen ihres Gewichts entspricht, extrahiert. Schließlich werden sie in dem lOOfachen ihres Gewichts einer 0,1m Ammoniumacetatlösung (pH = 6,2), die 0,01% aus Hühnereiweiß gewonnenes Lysozym ( Industrie biologique francaise, 93-Gennevilliers) enthält, suspendiert, wonach man einige Tropfen Toluol zusetzt, um Kontaminationen zu verhindern, und dann während 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die Suspension wird anschließend zentrifugiert und die Zellen werden unter den gleichen Bedingungen erneut inkubiert. Die beiden Extrakte werden vermischt und gefriergetrocknet, dann wieder mit Wasser aufgenommen und.mehrfach gefriergetrocknet, um das Ammoniumacetat zu entfernen. Das dabei erhaltene Produkt wird als "roher Lysozymextrakt" bezeichnet.

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Die "rohen Lysozymextrakte" der drei Stämme werden durch mehrfache Extraktion bei Raumtemperatur von Lipiden befreit, indem man einmal mit Äther und dreimal mit einer Chloroform/Methanol-Mischung (2/1, Volumen/Volumen) extrahiert. Anschließend nimmt man die Materialien mit Äther auf und trocknet sie.

Dann trägt man 400 mg des von Lipiden befreiten Extrakts auf eine mit vernetztem Dextran (Sephadex G75) gefüllte Säule (Höhe = 80 cm, Durchmesser =2,5 cm), die mit 0,1m Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht worden ist, auf und eluiert mit der gleichen Lösung. In dem Abstrom der Säule bestimmt man die folgenden Produkte: Neutralzucker (nach der Orein-Methode), Aminosäuren (durch Bestimmen mit Ninhydrin nach der alkalischen Hydrolyse) und die Aminozucker (nach der sauren Hydrolyse nach der Methode von Elson Morgan). In dieser Weise kann man die von Lipiden befreiten Lysozymfiltrate im Fall von Nocardia opaca in drei Fraktionen und im Fall der beiden anderen Stämme in vier Fraktionen auftrennen, die in der Reihenfolge ihrer Elution als Fraktionen K, L und M bzw. K, L, M und N bezeichnet werden.

Mit Ausnahme der aus Nocardia rubra gewonnenen Fraktion N, die nur schwach mitogen wirkt, zeigen die anderen Fraktionen eine mitogene Wirkung und eine Adjuvanswirkung.

Zur Trennung der mitogenen Wirkung und der Adjuvanswirkung wird die aus Nocardia opaca gewonnene Fraktion K nach der zuvor durchgeführten Gefriertrocknung einer sauren Fraktionierung unterzogen. Sie wird in konzentrierter Essigsäure suspendiert und in einer gekühlten Zentrifuge (während 1 Stunden bei 48000 g) zentrifugiert, wobei man einen Bodensatz und eine überstehende Flüssigkeit erhält. Der Bodensatz wird mehrfach durch Suspendieren und Zentrifugieren in Essigsäure gewaschen. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten und der Bodensatz werden schließlich gefriergetrocknet, wobei man zwei Fraktionen erhält, die jeweils eine Adjuvanswirkung entfalten, während lediglich der Bodensatz eine mitogene Wirkung besitzt. Das Material kann in Wasser wieder aufgelöst werden.

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Die in konzentrierter Essigsäure lösliche nicht-mitogene Fraktion wird im folgenden als "Fraktion P" bezeichnet, während die aus dem genannten Bodensatz gewonnene mitogene Fraktion "Fraktion Q" genannt wird. Die aus Nocardia opaca gewonnene Fraktion K wird im folgenden abgekürzt als"NWSM" (das heißt der Abkürzung für "Nocardia Water Soluble Mitogen") bezeichnet, wobei in einigen Fällen auch auf "die überstehende Flüssigkeit" und "den Bodensatz" Bezug genommen ist, womit die Fraktionen P bzw. Q gemeint sind, wobei diese Ausdrücke die Zustände beschreiben, in denen die Materialien bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurden, insbesondere bei dem Suspendieren der aus Nocardia opaca gewonnenen Fraktion K (oder NWSM) in konzentrierter Essigsäure.

In der folgenden Tabelle I sind die Analysenergebnisse der Fraktionen P und Q zusammengestellt.

Tabelle I

Fraktion	Neutralzucker %	Aminozucker %	Aminosäuren %
Bodensatz	19-25 Galactose, Glucose	10-12 Glucosamin, Spuren von Muramin- säure	45-48
Überstehende Flüssigkeit	37-40 Galactose, Glucose, Spuren von Rihose	32-35 Glucosamin, Muramin- säure	18-20

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Bei allen untersuchten Fraktionen, mit Ausnahme der aus Nocardia rubra gewonnenen Fraktion N und der aus Nocardia opaca gewonnenen Fraktion Q, läßt die Anwesenheit von Diaminopimelinsäure (DAP), eines spezifischen Bestandteils des Peptidoglykans, darauf schließen, daß es die Fragmente dieses Makromoleküls sind, die dem Produkt seine Adjuvanswirkung verleihen. Die aus Nocardia rubra gewonnene Fraktion N zeichnet sich ebenfalls durch eine Adjuvanswirkung aus, was aus den im folgenden angegebenen Ergebnissen der pharmakologischen Untersuchungen hervorgeht. Die Abwesenheit von Diaminopimelinsäure zeigt, daß Nocardia rubra ein Adjuvans bildet, dessen chemische Struktur einer anderen Molekülart angehört.

Pharmakologische in vitro- und in vivo-Eigenschaften der untersuchten Fraktionen.

Im folgenden sind die Ergebnisse von pharmakologischen Untersuchungen angegeben, die mit Hilfe der untersuchten Fraktionen durchgeführt wurden. In Bezug auf die mitogene Wirkung gewisser Produkte wird auf die beigefügten Zeichnungen hingewiesen.

In der Fig. 1 sind Kurven angegeben, die die Stimulierung von Mäusemilzzellen verdeutlichen, die mit unterschiedlichen Dosierungen des mitogenen Extrakts von Nocardia opaca einerseits und von Lipopolysacchariden (LPS) von S.enteridis andererseits verursacht wurden;

die Fig. 2 verdeutlicht anhand von Kurven die vergleichende Stimulierung der Milzzellen des Kaninchens im Fall der gleichen mitogenen Extrakte;

die Fig. 3 gibt Kurven wieder, die für die Stimulierung der Milzlymphozyten der Maus durch gewisse der oben angegebenen und aus unterschiedlichen Nocardiae-Zellen gewonnenen Fraktionen repräsentativ sind;

die Fig. 4 verdeutlicht anhand von Kurven die mitogene Wirkung der Fraktion NWSM (die aus Nocardia opaca gewonnene Fraktion K) und der "überstehenden Fraktionen von* NWSM" (Fraktion P) und des

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"Bodensatzes von NWSM" (Fraktion Q).

I) Verdeutlichung der Adjuvanswirkung der verschiedenen untersuchten Fraktionen.

Man injiziert weiblichen Meerschweinchen des Stammes Hartley mit einem Gewicht von 300 bis 350 g in den Fußsohlenballen einer jeden Hinterpfote eine Wasser-in-öl-Emulsion, die gleiche Teile einer Ovalbuminlösung (50 mg/ml isotonischer Lösung) und entweder des kompletten Freund"sehen Adjuvans (ACF) oder des unvollständigen Freund¹sehen Adjuvans (AIF), die (mit Ausnahme des Kontrollpräparats) die zu untersuchenden Fraktionen in den in der folgenden Tabelle II angegebenen Dosierungen enthält.

Die Adjuvanswirkung wird unter Einhaltung der folgenden Bedingungen bewertet:

1. In den 21 Tagen nach der Injektion entnommenen Seren bestimmt man den Antikörpergehalt, ausgedrückt in Mikrogramm des am Äguivalenzpunkt ausgefällten Antigen/Antikörper-Niederschlags pro Milliliter Serum;

2. man bestimmt die verzögerte Hypersensibilität gegenüber Ovalbumin (in Dosierungen von 10 und 100 μg) bei anderen Tieren durch eine Hautreaktion 4 Wochen nach der Injektion. Diese Reaktion wird als Durchmesser des Erythems (E), der Induratio (I) und der Nekrose (N) in Millimeter 48 Stunden nach der Ovalbumininjektion angegeben.

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Tabelle II

litter suchte Fraktionen	N.opaca	Dosis ^g/Tier)	Antikörpergehalt der Tiere in μg/Iΐll	B	C	660	A bis E	Mittel	Verzögerte Empfindlichkeit auf Ovalbumindosierungen von	100 μg
AIF	Bodensatz Q	0	Ai	560	700	2800	E		10 μg	12 I
M.butyricum (ACF)	Überstehen de Flüs sigkeit P	50	900	4800	3600	3200	480	660	8 I	19/6
N.opaca K	N.rubra K	Il	2880	4720	6200	3620 \	3000	3416	13 I	21/4
L	L	Il	6700	4100	4050	2700		5205	8 I	15/3
	M	■1	5200	2900	3100			4270	9 I	20/5
N		4100			3660		3400	8 I
N.corallina K	Il		3920	3680	6000				18/4
L	Il	1680	4800	5120	3300		3235	8 I	18/6
M	Il	4000	5880	2700	3300		4980	7 I	21/4
N	Il	4800	3900	5400	5520	6600	4656	12 I	19/7
Il	5700	5400	2820	3600	4080	4476	8 I	21/5
Il	5700	2700	4000	2700	4500	4778	11 I	17/6
■ 1	3000	5460	4800	5400	3060	3272	9 I	18/7
Il	5400	5340	4620	5220	4500	4572	6 I	12/5
Il	4500	4200	5160	3060	4500	4716	I ⁷ ^τ	17/6
Il	4740	2100	4200	4560	4588	10 I	16/5
3300		3600	3252	9 I

Aus der obigen Tabelle II geht hervor, daß sämtliche Fraktionen, einschließlich der aus Nocarida rubra gewonnenen Fraktion N und der Fraktion Q (Bodensatz) eine Adjuvanswirkung besitzen.

II) Nachweis der mitogenen Wirkung der wasserlöslichen Nocardiae-Extrakte.

Nichtspezifische Stimulierung der aus dem Knochenmark gewonnenen Lymphozytenzeilen B: Nachweis dieser Wirkung in Bezug auf MiIzlymphozyten der Maus, des Kaninchens, des Affens und des Menschen.

Lymphozytenkultur.

Man trennt die Lymphozyten aus der Milz der Maus, des Kaninchens, des Affen und des Menschen ab und züchtet sie nach der Technik von C.Bona, Trebiciavsky, A.Anteunis, C.Heuclin und R.Robineaux (Eur.J.Imm., 2, (1972) 434). Im Fall des Kaninchens, des Affen oder des Menschen züchtet man 1,5 χ 10 Lymphozyten in 1 ml Eagle-Medium, das man mit 10% (zuvor dekomplementiertem) autologem Serum in den ersten beiden Fällen oder eines Pools Humanserum AB versetzt hat. Im Fall der Maus züchtet man eine gleiche Anzahl von Zellen in 1 ml RPMI (Eutroph), das man mit 5% Kalbsfötusserum (Flow Labs) versetzt hat. Die Zellen werden in einem Inkubator unter einer Luftmischung, die 5% CO₂ enthält, während 2 Tagen im Fall der Maus, während 3 Tagen im Fall des Kaninchens und während 5 Tagen im Fall des Affen und des Menschen gezüchtet.

Die Lymphozytenkulturen werden mit variablen Dosierungen des nach dem Verfahren der genannten Patentanmeldung aus Nocardiae extrahierten wasserlöslichen Mittels

mit Adjuvanswirkung stimuliert. Bei gewissen Untersuchungen werden Tuberkuline von N. tuberculosis bovis oder M.smegmatis als Vergleichsmaterialien verwendet (Lipopolysaccharide, LPS), die bekannte mitogene Produkte für die Lymphozyten B der Milz der Maus darstellen.

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Einführung von Tritium-Thymidin.

24 Stunden vor der Gewinnung der Zellen versetzt man die Kultur mit 1 μθ± H-Thymidin (1 Ci/mMol, Saclay, Frankreich). Nach Ablauf der Inkubation setzt man eine um den Faktor 100 größere Menge nicht-radioaktiven Thymidins zu. Nach dem Zentrifugieren bei 45Og während 10 Minuten entfernt man die überstehenden Flüssigkeiten, fällt den Bodensatz mit Trichloressigsäure aus und suspendiert ihn erneut unter Anwendung klassischer Verfahren, bevor man ihn in einem Scintillationszähler bestimmt.

A) Mitogene Wirkung eines wasserlöslichen Extraktes von.

Nocardia opaca auf Lymphozyten der Milz der Maus und des Kaninchens.

Wie aus der folgenden Tabelle III hervorgeht, steigert der Nocardia-Extrakt, ebenso wie die Lipopolysaccharide (LPS), die Aufnahme des Tritium-Thymidins durch die Lymphozyten der Milz der Maus, während das Tuberkulin ohne Wirkung ist.

Tabelle III

Vergleich der mitogenen Wirkung des Nocardia-Extrakts mit derjenigen von Tuberkulin und von Lipopolysacchariden (LPS)

Stimulanz, ,zugesetzt zu 1,5 χ 10⁶ Zellen von:	Dosis (μ<3)	Anzahl der unter suchten Mäuse	Stimula tions- index (D	Signifikanz des Stimu lationsindex (2) p. <0,01 p,<0,05 N.S.	1	5
Tuberkulin (M. tuberculis bovis)	25	6	1,86+O,6	0	2	1
Extrakt von Nocardia	10	14	22,1+10,4	11	0	0
opaca	50	2	38,2	2	0 1	0 1
Lipopolysaccharide (S.minnesota)	10 50	3 11	12,2+.3,1 22,54+.3,9	3 9

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Fortsetzung Tabelle III

(1) Mittel ΐ Standardabweichung.

(2) Die Signifikanz des Stimulationsindex (Verhältnis der Radioaktivität der stimulierten Zellen zu derjenigen der Vergleichszellen) wurde für jedes Tier gemäß dem Student-Test berechnet.

Der Vergleich des Dosis-Effekts des Nocardia-Extrakts und des Endotoxins bestätigt, daß mit dem Nocardia-Extrakt eine stärkere Stimulierung erreicht wird (Fig. 1). Die Kurven a und b der Fig. 1 sind repräsentativ für die Veränderungen des Stimulationsindex, den man mit dem Extrakt von Nocardia opaca einerseits und mit Lipopolysacchariden (LPS) andererseits in Abhängigkeit der entsprechenden Dosierungen ^g) erhält. Andererseits und im Gegensatz zu dem, was man für die Polysaccharide feststellt (Kurve c) stimuliert das aus Nocardia gewonnene mitogene Mittel (Kurve c) die Aufnahme des Thymidins durch die Lymphozyten des Kaninchens (Fig. 2) .

B) Art der für das mitogene Mittel empfindlichen Lymphozyten.

Andere Untersuchungen haben gezeigt, daß die mitogene Wirkung von Nocardia im Bereich der Lymphozyten B auftritt. Tatsächlich kann man eine Stimulierung der Lymphozyten von "nackten" Mäusen, die von Geburt auf keine Thymusdrüse aufweisen, zeigen, während dieses Produkt keine Wirkung gegen die Thymozyten oder Lymphozyten der Thymusdrüse zeigen (Tabelle IV).

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Tabelle IV

Mitogene Wirkung des Nocardia-Extrakts und des Tuberkulins auf Mäuse-Lymphozyten

Stimulierende Dosis, zugesetzt zu 1,5 χ 10⁶ Zellen	Lymphoide AKR ₍₁₎ (20) ^U'	Milzzellen Nackt (8)	Thymozyten AKR (9)
NWSM 50 μg Tuberkulin 25 μg	17,98⁽²⁾ + 3,3* 1/45 t 0,21 NS	17,92 + 3,32* 1,84 + 0,47 NS	1,1 ί 0,2 NS 1,1 ί 0,3 NS

(1) Anzahl der individuell untersuchten Mäuse,

(2) Mittelwert des Stimulationsindex + Standardabweichung, * p= 0,01,

NS =■ nichtsignifikant.

Die mit Tritiumthymidin und mit dem Elektronenmikroskop erhaltenen Ergebnisse bestätigen, daß dieses Präparat selektiv eine Population von Lymphozyten B stimuliert, die cortisonempfindlich sind.

C) Identifizierung der mitogenen Wirkung von Extrakten, die aus zwei anderen Bakterienstämmen gewonnen wurden.

Die folgenden Untersuchungen zeigen, daß man die Lymphozyten von Mäusen auch mit Extrakten aus Nocardia rubra und Nocardia corallina (Fig. 3) stimulieren kann. Die Fig. 3 gibt repräsentative Kurven für die Veränderungen der mitogenen Wirkung in Abhängigkeit von der angewandten Dosis wieder, wobei diese Werte durch die Auszählung der Radioaktivität (Impulse pro Minute) der Fraktionen K von Nocardia opaca (Kurve e), von Nocardia corallina (Kurve f) und von Nocardia rubra (Kurve g) und der Fraktion N von Nocardia rubra (Kurve h) erhalten wurden.

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Aus der Fig. 3 ist zu ersehen:

a) Daß von den drei untersuchten Fraktionen K die aus C.rubrum (oder Nocardia rubra) und insbesondere Nocardia opaca gewonnenen Fraktionen die mit der stärksten Wirkung sind. Obwohl die Wirkung der aus.Nocardia corallina gewonnenen Fraktion K weniger aktiv ist, ist sie signifikant;

b) daß die Fraktion N von C.rubrum weniger aktiv ist als die Fraktion K.

D) Isolierung der mitogenen Fraktion von Nocardia opaca.

Die folgenden Untersuchungen zeigen, daß man die Adj uvanswirkung der Nocardia von der mitogenen Wirkung trennen kann. Bei dieser Untersuchung werden die überstehenden Flüssigkeiten (Kurve i der Fig. 4) und der Bodensatz (Kurve j), die man aus der Fraktion K (oder NWSM) gewonnen hat, im Vergleich zu der gleichen, jedoch nicht zentrxfugxerten Fraktion (Kurve k) untersucht. Wie aus der Fig. 4 zu ersehen ist, die die Veränderungen der Radioaktivität in Abhängigkeit von der Dosierung wiedergibt, ist der Bodensatz stark aktiv, wobei seine Aktivität derjenigen der nichtzentrifugierten Fraktion ähnlich ist. Im Gegensatz dazu zeigt die überstehende Flüssigkeit zwar eine Adjuvanswirkung, jedoch keine mitogene Wirkung. Diese Effekte ergeben sich auch bei der Untersuchung an den Lymphozyten der Kaninchenmilz. Weiterhin ist beim Kaninchen festzustellen, daß diese Stimulierung die Synthese der Immunoglobuline und die Aufspaltung der kleinen Lymphozyten in Plasmozyten erhöht.

E) Mitogene Wirkung der Extrakte auf die Lymphozyten der Milz von Affen oder Menschen.

Die mitogene Wirkung von 100 pg der durch Filtrieren des Nocardia-Extrakts gewonnenen Fraktion K läßt sich auch an der Milz von Affen (Papio papio) nachweisen. Bei diesen Untersuchungen zeigt sich die Wirkung auch im Fall des beim Zentrifugieren der Fraktion K gewonnenen Bodensatzes. Bei den mit Tuberkulin inkubierten

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Kontroll-Lymphozyten beobachtet man keine Steigerung der Aufnahme des Tritium-Thymidins.Der Nocardia-Extrakt stimuliert die Keimumwandlung der Milzlymphozyten des Menschen.

III) Nachweis der in vitro- und in vivo-Stimulierung von Markstammzellen.

Die Fraktion NWSM wird zur Bestimmung folgender Eigenschaften verwendet:

a) Seiner Fähigkeit, die CFU-Bildung (Colony Forming Unit) zu stimulieren, das heißt die Wucherung der Stammzellen zu stimulieren. Zu diesem Zweck werden unterschiedliche Konzentrationen der Fraktion NWSM mit 10 Zellen des Knochenmarks der Mäuse Cn-yBI in Gegenwart von Mäuseserum inkubiert, das normalerweise eine große Menge CSF (Colony Stimulating Factor) enthält. Bei dieser Untersuchung wird als CSF-Quelle auch Humanurin eingesetzt.

b) Die Fähigkeit, die Bildung und/oder die Freisetzung von CSF in dem Blut der Maus zu induzieren. Bei dieser Untersuchung wird die Fraktion NWSM auf intraperitonealem Wege injiziert. Das nach bestimmten Zeitintervallen gewonnene Mäuseserum wird dazu verwendet, die Wucherung der Stammzellen zu stimulieren.

Technik

a) Man inkubiert unterschiedliche Dosierungen der Fraktion NWSM

(0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 μg) mit 10 Knochenmarkzellen während 7 Tagen in dem von McNeill et al (Immunology, 18 (1970) 39) beschriebenen Medium.

b) Durch Injizieren verabreicht man den Mäusen unterschiedliche Dosierungen der Fraktion NWSM und des als CSF-Quelle verwendeten Serums. In dem Fall, da das Serum zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wird (30 Minuten bis 12 Stunden nach der Injektion),werden die Mäuse mit 100 μg des Produkts behandelt.

c) Man inkubiert 10 Markzellen in 1 ml des Mediums MEM, das man mit 0,8% Methylcellulose, 20% Kalbsfötusserum und 20% Mäuseserum als CSF-Quelle versetzt hat. Die Auszählung der

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Kolonien erfolgt 7 Tage später.

Ergebnisse.

1. Stimulierung der Koloniebildung durch die Fraktion NWSM:

Die Fraktion NWSM induziert,wenn sie mit Knochenmarkzellen in dem Metcalf-Medium ohne normales Mäuseserum inkubiert wird, nicht die Bildung von Kolonien, die sich von denjenigen der Kontrollen unterscheiden (1,5 ί 0,9).

In Gegenwart von Mäuseserum als CSF-Serum nimmt die Anzahl der Kolonien beträchtlich zu. Die optimalen Konzentrationen der Fraktion NWSM liegen zwischen 1 Nanogramm und 1 Mikrogramm.

2. Stimulierung der CSF-Bildung bei der Maus C₅₇BI.

a) Optimale Dosis: Man injiziert die Fraktion NWSM in unterschiedlichen Dosierungen (logarithmische Verdünnung von 1 Nanogramm bis 100 Mikrogramm) an Mäuse des Stammes C,-₇B1 und entnimmt das Blut 6 Stunden später. Das erhaltene Serum wird auf 1/4 verdünnt. Man beobachtet eine lineare Steigerung der Zahl der Kolonien, wobei das Maximum und das Plateau zwischen 10 und

100 μg liegen.

b) Verdünnung des CSF: Man injiziert den Mäusen 100 μ% der Fraktion NWSM und gewinnt das Serum 6 Stunden später. Die Zellen werden mit Serum inkubiert, das von 1/4 bis 1/64 variiert. Man beobachtet eine maximale Wirkung bis zu einer Verdünnung des Serums bis zu 1/16.

c) Kinetik des Auftretens von CSF nach der Injektion der Fraktion NWSM: Man injiziert Mäusen 100 μg der Fraktion NWSM und entnimmt das BLut nach Ablauf unterschiedlicher Zeitintervalle.

Bei dem Serum, das man bis zu 6 Stunden entnommen hat, beobachtet man eine lineare Steigerung der Anzahl der Kolonien. Nach 24 Stunden entnommen stimuliert es eine kleinere Anzahl von

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Kolonien und nach 48 Stunden zeigt sich keine Wirkung mehr.

d) Man beobachtet eine ähnliche Wirkung, wenn man den Bodensatz oder die überstehende Flüssigkeit der Fraktion K von Nocardia opaca oder die Fraktion K von C.rubrum einsetzt.

Der Nachweis der verschiedenen biologischen Wirkungen von wasserlöslichen Extrakten aus Nocardia erlaubt die Anwendung der Produkte für folgende Zwecke:

1. Hinsichtlich der nicht-spezifischen mitogenen Wirkung des Extraktes und insbesondere des Bodensatzes der Fraktion A:

a) Als biologisches, wasserlösliches und nicht-toxisches Reagens, das für Forschungszwecke ein großes Interesse findet, da man mit ihm die Stimulierung der Lymphozyten B bei verschiedenen Tierarten, darunter Affen und Menschen, nachweisen kann.

Hierzu sei in Erinnerung gerufen, daß die Lipopolysaccharide (Endotoxine von gramnegativen Bakterien) toxisch sind und, obwohl sie die Lymphozyten der Maus stimulieren, ohne Wirkung sind bei dem Kaninchen, dem Affen und dem Menschen.

b) Als biologisches Arzneimittel. Man kann dieses Produkt als Diagnosemittel zur Bestimmung von Immunschwächen betreffend die Antikörper bildenden Zellen, ausgehend von den Zellen lymphähnlicher Organe, verwenden.

c) Als Mittel zur vorbeugenden Behandlung: Nach der Injektion des Produktes beobachtet man bei den behandelten Tieren eine nicht-spezifische globale Stimulierung, die eine Steigerung der Antikörper, die gegen eine große Kategorie von Antigenen wirken, zur Folge hat.

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2. In Bezug auf die Fähigkeit, die Bildung der Stammzellen zu stimulieren, ist zu sagen, daß man die Produkte zur Heilbehandlung von Mangelerkrankungen des Knochenmarks verwenden kann, die durch Unfälle hervorgerufen (beispielsweise durch Bestrahlung) oder erblichen Ursprungs (beispielsweise Myelosklerose) sind.

Da das mitogene wasserlösliche Produkt ohne Zugabe von öligen Trägern eingesetzt werden kann und nicht-toxisch ist, ist es ein besonders interessantes therapeutisches Mittel.

Es wird vorzugsweise durch Injektion verabreicht,und zwar in Kombination mit injizierbaren, sterilen, flüssigen Trägern, wie einer isotonischen Salzlösung oder Glucoselösung.

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Claims

Patentansprüche

(Ty Verfahren zur Herstellung eines mitogenen Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardiae züchtet, die Zellen gewinnt, sie einer Behandlung zum Aufbrechen der Zellwände unterzieht, insbesondere durch eine Lyse, mindestens zum Teil die wässrige Fraktion gewinnt, die in dieser wässrigen Fraktion enthaltenen Peptidoglykanfragmente abtrennt und die das mitogene Mittel enthaltende verbleibende Fraktion gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des gezüchteten Stammes gewinnt, sie mit zur Entfernung von Lipiden geeigneten Lösungsmitteln behandelt, die von Lipiden befreiten Zellen der Einwirkung eines murolytischen Enzyms, wie Lysozym, in wässrigem Medium unterwirft, die wässrige Fraktion gewinnt, die in dieser wässrigen Fraktion enthaltenen Peptidoglykanfragmente abtrennt und die das mitogene Mittel enthaltende verbleibende Fraktion gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardiae züchtet, die Zellen des gezüchteten Stammes gewinnt, die Zellen aufbricht, die aufgebrochenen Zellwände insbesondere durch dxfferentielles Zentrifugieren oder in analoger Weise gewinnt, die Wachse, freien Lipide, Proteine und Nukleinsäuren abtrennt und entfernt, das von Lipiden befreite und von den Zellwänden stammende Material mit einem murolytischen Enzym, wie Lysozym, in einem wässrigen Medium digeriert, die wässrige Fraktion gewinnt, die in dieser wässrigen Fraktion enthaltenen Peptidoglykanfragmente abtrennt und die das mitogene Mittel enthaltende verbleibende Fraktion gewinnt.

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4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennz e ich η et, daß man die nach dem Digerieren in Gegenwart des murolytischen Enzyms gewonnene wässrige Fraktion vor der Abtrennung der Peptidoglykanfragmente aus dem erhaltenen Filtrat durch Filtrieren über ein Molekularsieb reinigt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennz eichnet, daß man die Peptidoglykanfragmente durch Gefriertrocknen der nach dem Digerieren der von Lipiden befreiten Zellen mit dem murolytischen Enzym gewonnene Fraktion, Suspendieren des gefriergetrockneten Materials in konzentrierter Essigsäure und Gewinnen der in diesem Mittel nicht-gelösten Fraktion, die das mitogene Mittel enthält, abtrennt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn-

z e i c h ne t, daß man die Fraktion oder das Filtrat, die bzw. das man der Gefriertrocknung unterzieht, zuvor mit einem Lösungsmittel extrahiert, um die Entfernung der Lipide zu vervollständigen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,dadurch gekennz eichnet, daß man als Mikroorganismen des Stammes Nocardiae Nocardia opaca, Nocardia corallina und/oder Nocardia rubra einsetzt.
8. Mittel, erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis
9. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Mittel nach Anspruch 8 als Wirkstoff und einem üblichen pharmazeutischen Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff besteht.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9,dadurch gekennz eichnet, daß es in Form einer Lösung in einer injizierbaren sterilen Flüssigkeit vorliegt.

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11. Biologisches Reangens, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Mittel nach Anspruch 8 enthält.
12. Biologisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem Verfahren erhältlich ist, das darin besteht, daß man Nocardiae züchtet, die Zellen des gezüchteten Stammes gewinnt, entweder die Zellen als solche oder ihre Zellwände nach einem vorhergehenden Aufbrechen der Zellen und Gewinnen der Zellwände von Lipiden befreit, das von Lipiden befreite Material der Einwirkung eines murolytischen Enzyms, wie Lysozym, in einem wässrigen Medium unterwirft und die das biologische Reagens darstellende wässrige Fraktion gegebenenfalls nach der Reinigung über einem Molekularsieb gewinnt.
13. Biologisches Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennz eichnet, daß es aus Nocardia opaca, Nocardia corallina oder Nocardia rubra gewonnen wurde.

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