DE4447677C2 - Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen

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Description

Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her­ stellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen.
Beschreibung des Standes der Technik
Pseudomonas Aeruginosa ist ein bewegliches gramnegatives Stäbchen, ungefähr 0,5 µm × 1,5 bis 3,0 µm, mit einer einzigen Geißel, das weitverbreitet in der Erde, in Wasser, Abwasser und im menschlichen Darm vorkommt (Mol. Microbiol. 4, 1069 bis 1075, 1990). Pseudomonas Aeruginosa ist ein pathogener Stamm, der hartnäckige Infektionen wie Sepsis (Septikämie), generalisierte Infektion, chronische Infektion der Atemwege, cystische Fibrose der Pankreas, etc. hervorruft. Die durch Pseudomonas Aeruginosa verursachte Sepsis ist eine Krankheit, die entweder vom Eindrin­ gen des Mikroorganismus selbst oder der Absonderung seiner toxi­ schen Substanzen in das Blut von Patienten hervorgerufen wird, die aufgrund von chirurgischen Eingriffen, Fleischwunden, Trau­ mata und dergleichen eine verringerte Widerstandsfähigkeit auf­ weisen. Die Anwesenheit des Toxins verursacht Schock mit hohem Fieber, erniedrigtem Blutdruck und andere Symptome, die schließ­ lich zum Tode führen können. Da Pseudomonas Aeruginosa außerdem bei Harnwegsinfektionen gefunden wurde, hat das Interesse an Pseudomonas Aeruginosa stark zugenommen. Demnach wird die Ent­ wicklung eines Medikaments/von Medikamenten, das/die in der Lage ist/sind, Pseudomonas Aeruginosa wirksam vorzubeugen oder hart­ näckige eitrige Krankheiten wie durch Pseudomonas Aeruginosa verursachte Sepsis oder Harnwegsinfekte zu behandeln, dringend benötigt. Allerdings sind Pseudomonas Aeruginosa-Stämme gegen die meisten Antibiotika resistent und ein effektives vorbeugen­ des oder behandelndes Mittel für Pseudomonas Aeruginosa-Infek­ tionen ist bis heute nicht entwickelt worden. Daher hat die Vi­ rulenz der Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen im Verlauf der Zeit zugenommen.
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme können auf verschiedene Weise klassifiziert werden. Ein solches Klassifizierungssystem ordnet die Stämme in sieben (7) Typen gemäß dem Fischer-Immuntyp ein. Ein weiteres System basiert auf der O-Antigengruppe, wie von Te­ rada vorgeschlagen wurde. Ein weiteres System ist das Klassi­ fizierungssystem nach dem internationalen Antigentypschema (IATS). In Hinsicht auf die Klassifizierungssystem sind die Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, die am häufigsten bei mit Pseudo­ monas Aeruginosa infizierten Patienten gefunden werden: 5/2a, 2c, 3, 7/3a, 3c, 1/4a, 4b, 6/5a, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /11 und 3,7/3d, 3e-Typen nach dem Fisher-Immuntyp/O-Se­ rumtyp, wobei 3, 7, 2 und 1-Typen des Fisher-Immuntyps (ent­ sprechend 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a und 4b des O-Serumtyps) hauptsächlich vorhanden sind.
Ein Verfahren zur Behandlung von Pseudomonas Aeruginosa-In­ fektionen neutralisiert die Pseudomonas Aeruginosa-Toxine mit Antitoxinen. Allerdings ist das Antitoxin ein therapeutisches Mittel, das nur für Patienten nutzbringend ist, die bereits an Sepsis leiden, und es hat keine prophylaktische Wirkung. Außer­ dem ist das derzeit verfügbare Antitoxin sehr teuer und sein Nutzen ist beschränkt. Zusätzlich ist der bedeutendste Nachteil, der mit der Verwendung des Antitoxins verbunden ist, die relativ niedrige Heilungsrate und die begleitenden schwerwiegenden Ne­ benwirkungen.
Ein untersuchtes Verfahren zum Vermeiden der Nachteile, die mit dem Antitoxin verbunden ist, verwendet ein allgemeines Anti­ gen zur Vorbeugung und Behandlung von Pseudomonas Aeruginosa-In­ fektionen. Untersuchte Verfahren zur Gewinnung des allgemeinen Antigens können allgemein in zwei Gruppen klassifiziert werden. Das erste Verfahren betrifft die Verwendung eines allgemeinen Antigens, das aus Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen mit unter­ schiedlichen Immuntypen abgetrennt und gereinigt worden ist, als prophylaktisches Impfserumantigen gegen Pseudomonas Aeruginosa-In­ fektionen [Japan, J. Exp. Med. 45, 355 bis 359, 1975]. Das zweite Verfahren betrifft die Verwendung einer allgemeinen Anti­ genmasse, die durch Verwendung einer gentechnologischen Technik hergestellt worden ist, bei der ein genetischer Code für das ge­ wünschte Antigen isoliert und in einen geeigneten Vektor einge­ setzt wird, um einen rekombinierten Vektor zu erhalten, und dann wird der geeignete Wirt mit dem resultierenden rekombinierten Vektor transformiert und bebrütet, um das gewünschte Antigen zu exprimieren.
Obgleich die Entwicklung eines prophylaktischen Antigens unter Verwendung eines allgemeinen Antigens theoretisch eine sehr wirksame Methode ist, zeigt der Fortschritt von Untersu­ chungen, die diese Methode betreffen, daß diese Methode viele Probleme aufweist, die ungelöst bleiben. Der Hauptnachteil ist, daß das allgemeine Antigen nicht allen Sorten von Pseudomonas Aeruginosa mit unterschiedlichen Immuntypen vorbeugen kann und seine Wirksamkeit daher extrem niedrig ist. Eine solche niedrige Wirksamkeit legt nahe, daß die Anwesenheit eines weiteren unbe­ kannten größeren Antigens zusätzlich zu dem allgemeinen Antigen eine wirksame prophylaktische Wirkung hervorzurufen vermag.
Ein weiteres Verfahren zur Behandlung der Pseudomonas Aeru­ ginosa-Infektion ist die Verabreichung von Antibiotika oder Che­ motherapeutika mit Breitbandselektivität für die Pseudomonas Ae­ ruginosa-Stämme. Da es allerdings zahlreiche Pseudomonas Aerugi­ nosa-Stämme gibt und sie allgemein ein sehr hohes Ausmaß an Arzneimittelbeständigkeit haben, beherbergen viele Patienten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, die nicht wirksam mit Antibiotika behandelt werden können.
Zusätzlich ist ein Verfahren unter Verwendung von therapeu­ tischem Immunglobulin entwickelt worden. Allerdings zeigt dieses Immunglobulin wenig oder keine therapeutische Wirkung auf alle Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen und ist daher nur für sehr begrenzte Typen von Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen verwendet worden. Dies liegt hauptsächlich daran, daß das Immunglobulin nach einem Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikör­ pers für einen bestimmten Mikroorganismus hergestellt worden ist und daher nicht allgemein auf die zahlreichen Pseudomonas Aeru­ ginosa-Stämmen wirken kann.
Es sind Versuche unternommen worden, mit monoklonalen Anti­ körpern von Mäusen [J. Inf. Dis. 152, 1290 bis 1299, 1985] oder menschlichen monoklonalen Antikörpern [FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263 bis 268, 1990] ein preiswertes Therapeutikum gegen Pseu­ domonas Aeruginosa zu entwickeln. Hier können Zellinien ausge­ wählt werden, um die wirksamsten neutralisierenden Antikörper aus einer Zellreihe mittels Zellfusionstechnik herzustellen, und dann kann eine Zellinie als Ausgangsmaterialien verwendet wer­ den, um den gewünschten Antikörper im industriellen Maßstab her­ zustellen. Diese Methode zielt auf die Behandlung der Pseudomo­ nas Aeruginosa-Infektion über Antikörperproduktion, aber nicht mit prophylaktischen Impfseren. Zusätzlich hat diese Methoden einen Nachteil, da, weil alle Infektionen durch unterschiedliche Pseudomonas Aeruginosa-Stämme mit unterschiedlichen serologi­ schen und immunologischen Typen hervorgerufen werden, sie nicht alle mit nur einer Sorte monoklonalem Antikörper behandelt wer­ den können. Das bedeutet, daß die Therapie mit monoklonalen An­ tikörpern nicht verwendet werden kann, um alle der Pseudomonas Aeruginosa-infizierten Patienten zu behandeln.
Um die wirksame Behandlung nach dieser Methode zu verbrei­ tern, ist die gleichzeitige Verabreichung mehrerer Sorten von Antikörpern auf Basis ihrer ermittelten Kreuzreaktivität ent­ wickelt worden. Hierbei wird Pseudomonas Aeruginosa-infizierten Patienten Blut abgenommen und untersucht, um den serologischen und/oder immunologischen Typ der infizierenden Pseudomonas Aeru­ ginosa-Stämme zu identifizieren. Die geeigneten monoklonalen An­ tikörper des identifizierten Typs werden dem Patienten verab­ reicht. Allerdings erfordert diese Methode viel Zeit und ist da­ her bei Patienten nicht möglich, deren Zustand sofortige Behand­ lung nötig macht.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Zellwandprotei­ nen, die aus Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden sind, vorgeschlagen worden [siehe Vaccine, Band 7, "Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas Aeruginosa vaccine", 1989 [(Experimentelle Untersuchungen zur vorbeugenden Wirksamkeit eines Pseudomonas Aeruginosa-Impfserums)]. Aller­ dings verwendet das in der obigen Druckschrift vorgeschlagene Verfahren vier Sorten von allgemeinen Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ men, d. h. NN 170 041, NN 170 015, NN 868 und NN 170 046, die nicht abgeschwächt sind und daher tritt ein Problem in bezug auf die Toxizitäten der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme selbst auf. Da außerdem bei der Herstellung eines Impfserums mit Proteinkompo­ nente aus solchen Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen Zellen zerstört werden können, geben sie in das Medium fremde Nukleinsäuren und toxische hochmolekulare Substanzen und Lipopolysaccharide (LPS) ab, die im Cytoplasma vorhanden sind. Die Substanzen werden dann als Verunreinigungen in das resultierende Impfserum eingebracht, was die Sorgfalt erhöht, die bei der Verabreichung des Impfse­ rums erforderlich ist, und möglicherweise seine Verwendung ein­ schränkt.
Offenbarung der Erfindung
Somit haben die Erfinder intensive Forschungsarbeiten durchgeführt, um ein Mittel zu finden, das in der Lage ist, ef­ fektiv Antikörper gegen Pseudomonas Aeruginosa zu stimulieren und eine gute immunogene (d. h. antigene) Aktivität mit extrem geringem Risiko aufgrund von inhärenten Toxizitäten der Pseudo­ monas Aeruginosa-Stämme selbst zeigt. Daraus resultierend be­ stätigen die Erfinder, daß, wenn aus Pseudomonas Aeruginosa-in­ fizierten Patienten isolierte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme ge­ mäß ihrer Immuntypen in sieben (7) Spezies klassifiziert werden und dann jeder reine Stamm abgeschwächt wird, indem der Organis­ mus mehrfach durch einen geeigneten tierischen Wirt geleitet wird, neue, sichere und abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ me erhalten werden können. Diese Stämme haben Zellwandpro­ teine, die nicht nur zur Herstellung eines Impfserums zur Pro­ phylaxe gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen brauchbar sind, sondern die auch als Antikörperstimulator verwendet werden kön­ nen, um Immunglobuline für Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen im Tierkörper zu produzieren. Die resultierenden Immunglobuline zeigen eine hervorragende therapeutische Wirkung auf verschiede­ ne Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen einschließlich schwerer Fälle.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver­ fahren zur Herstellung des Impfserums zu liefern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her­ stellung eines Impfserums zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas Aeruginosa-Infektion. Das Impfserum wird hergestellt, indem Zellwandproteine in im wesentlichen reinem Zustand aus jedem der sieben (7) Typen von sicheren Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen wie unten beschrieben abgetrennt werden und die abgetrennten Zell­ wandproteine weiter gereinigt werden und dann vorzugsweise die gereinigten Zellwandproteine, die aus mindestens 3 Typen der ab­ geschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme abgeleitet sind, kom­ biniert werden. Vorzugsweise werden äquivalente Mengen von jedem der 3 Typen zur Herstellung des erfindungsgemäßen Impfserums verwendet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Zum umfassenderen Verständnis der Beschaffenheit und der Aufgabe der Erfindung soll auf die folgende detaillierte Be­ schreibung im Zusammenhang mit den angefügten Zeichnungen bezug genommen werden, in denen
Fig. 1 das Resultat eines SDS-Blatts (SDS-PAGE) von gerei­ nigten Zellwandproteinen zeigt, die erfindungsgemäß aus abge­ schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden sind, und
Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Gewichts­ veränderung bei männlichen Mäusen zeigt, in die Zellwandprotein von erfindungsgemäß abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ men intravenös injiziert wurde.
Die beste Ausführungsform der Erfindung
Fisher-Devlin-Typen von Pseudomonas Aeruginosa werden in sieben Typen eingeordnet, Typ 1 bis Typ 7. In der vorliegenden Erfindung sind Pseudomonas Aeruginosa-Stämme mit Fisher-Immunty­ pen 1 bis 7 als Stämme für die Abschwächung aufgrund der Tatsa­ che, daß sie im Blut von einem größeren Anteil, d. h. 90 bis 90% oder mehr, von mit Pseudomonas Aeruginosa infizierten Pa­ tienten nachgewiesen worden sind, ausgewählt worden. Insbeson­ dere sind unter den sieben (7) Pseudomonas Aeruginosa-Typen Typ 1 und Typ 3 die am häufigsten nachgewiesenen Stämme bei mit Pseudomonas Aeruginosa infizierten Patienten. Allerdings kann die Lehre der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um gegen beliebige der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme Schutz oder Behand­ lung zu liefern.
Sicher abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme können erhalten werden, indem jeder der sieben Typen von Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen in einem reinen Zustand aus dem Blut von Pa­ tienten isoliert werden, an denen die Pseudomonas Aeruginosa-In­ fektion festgestellt worden ist, und dann die isolierten Stämme durch wiederholte Reinigungsverfahren abgeschwächt werden. Die so erhaltenen sicheren abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ me sind alle sieben (7) Typen und werden als CFCPA 10 142 (Fishertyp 1), CFCPA 20215 (Fishertyp 2), CFCPA 30 720 (Fishertyp 3), CFCPA 40 057 (Fishertyp 4), CFCPA 50 243 (Fishertyp 5), CFCPA 60 534 (Fishertyp 6) beziehungsweise CFCPA 70 018 (Fishertyp 7) bezeichnet. Hier ist CFCPA ein Akronym für "Cheil Food and Che­ mical Pseudomonas Aeruginosa", das aus Cheil Food and Chemicals Inc., wo die Erfinder der vorliegenden Erfindung beschäftigt sind, und dem Namen des betreffenden Stammes Pseudomonas Aerugi­ nosa zusammengesetzt ist.
Die durch wiederholte Reinigungsverfahren wie oben be­ schrieben erhaltenen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ me haben Phenotypen und mikrobiologische Eigenschaften, die mit denen der entsprechenden Mutterstämme im wesentlichen identisch sind, zeigen aber neue Eigenschaften, die zur Herstellung eines Impfserum-Antigens zur Prophylaxe gegen Pseudomonas Aeruginosa-In­ fektion brauchbar sind, anstatt eine Pathogenität zu zeigen, die in den Mutterstämmen vor der Abschwächung vorhanden ist. Demnach werden die erfindungsgemäßen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme als neue Mikroorganismusstämme betrachtet. Da­ her wurden diese Stämme am Korean Culture Center of Microorga­ nisms in der Korean Federation of Culture Collections, nachfol­ gend KCCM, als Internationale Aufbewahrungsbehörde nach dem Bu­ dapester Vertrag vom 12. Mai 1993 unter den Zugangsnummern KCCM 10 029 für CFCPA 10 142, KCCM 10 030 für CFCPA 20 215, KCCM 10 031 für CFCPA 30 720, KCCM 10 032 für CFCPA 40 057, KCCM 10 033 für CFCPA 50 243, KCCM 10 034 für CFCPA 60 534 und KCCM 10 035 für CFCPA 70 018 hinterlegt.
Die Reinigungsverfahren zur Herstellung der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme werden wiederholt durchgeführt, im allgemeinen bis die Stämme die gewünschten LD50-Werte zeigen. Ob­ gleich die Anzahl der Reinigungsverfahren oder -stufen in Abhän­ gigkeit von der Geschicklichkeit des Technikers, der Toxizität der Mutterstämme und dergleichen variiert, wird die Reinigungs­ stufe vorzugsweise 3 bis 7 Mal durchgeführt, z. B. bis die LD50 des Pseudomonas Aeruginosa mindestens 2 × 107 Zellen ist. Der LD50-Wert der so erhaltenen neuen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme bei Mäusen ist vorzugsweise 2 × 107 Zellen oder mehr.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Impfserum zum Immuni­ sieren gegen die Pseudomonas Aeruginosa-Infektion, das herge­ stellt wird, indem Zellwandproteine bei einem reinen Stamm aus jedem der erfindungsgemäßen, neuen, abgeschwächten, wie oben erhaltenen Pseudomonas Aeruginosa-Stämme abgetrennt wird und dann die abgetrennten Zellwandproteine weiter gereinigt werden und die so erhaltenen gereinigten Zellwandproteine in einem be­ stimmten Mischungsverhältnis, vorzugsweise in äquivalenten Men­ gen der Zellwandproteine aus jedem der gewünschten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, für den die Immunisierung bewirkt werden soll, kombiniert werden. Das bedeutet, daß die für jeden Stamm verwendete Menge ausreichen ist, um die Immunisierung gegen die­ sen Stamm in einem speziellen Wirtstyp zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Her­ stellung von Impfseren zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeru­ ginosa, bei dem in den folgenden Schritten
  • a) reine isolierte Zellen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen zubereitet werden;
  • b) die Mikroorganismuszellen mit einem organischen Lösungsmit­ tel behandelt werden, um die Zellen zu inaktivieren und Lipidkomponenten zu entfernen;
  • c) die so behandelten Mikroorganismuszellen einer Extraktion unterzogen werden, um ein Zellwandprotein zu erhalten;
  • d) der erhaltene Extrakt einer Fraktionierung und Reinigung durch Ultrafiltration und/oder Ultrazentrifugierung unter­ zogen wird, um eine spezielle Proteinfraktion auszuwählen;
  • e) die ausgewählte Proteinfraktion zurückgewonnen wird und
  • f) unter Verwendung der ausgewählten Proteinfraktion ein Impf­ serum zubereitet wird,
wobei der Schritt c) unter ausreichend milden Bedingungen ausge­ führt wird, so daß die Zellwände der Mikroorganismen nicht zer­ stört werden, wodurch ein Extrakt erhalten wird, der keine zyto­ plasmatischen Proteine enthält, wobei in Schritt d) die ausge­ wählte spezielle Proteinfraktion ein Molekulargewicht von 10 000 bis 100 000 und kein Lipopolysaccharid aufweist.
Das Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Impf­ seren wie oben beschrieben kann wie folgt zusammengefaßt werden.
Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Zell­ wandproteinen aus abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen und zur Herstellung von Impf­ seren
Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Zell­ wandproteinen aus abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen und zur Herstellung von Impf­ seren
Nachfolgend werden die erfindungsgemäßen Impfserumszusam­ mensetzungen spezifischer in bezug auf deren Herstellungsver­ fahren erläutert.
Zur Herstellung von Impfseren zur erfindungsgemäßen Prophy­ laxe gegen Pseudomonas Aeruginosa werden in der ersten Stufe sieben Typen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Typen, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018, jeweils in einem Fermenter von geeigneter Größe bebrütet. Als für diesen Zweck geeignetes Kulturmedium ist tryptische Sojanährlösung oder vorzugsweise ein spezielles Medium wie nachfolgend beschrieben zum Bebrüten von Pseudomonas Aeruginosa wie oben beschrieben geeignet.
Dieses spezielle Medium schließt Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgSO4 (0,5 g/l), CaCO3 (5 g/l), KH2PO4 (1 g/l), FeSO4 (5 mg/l), CuSO4 (5 mg/l) und ZnSO4 (5 mg/l) ein. Dieses spezielle Medium ist von den vorliegenden Erfindern zum Bebrüten von Pseu­ domonas Aeruginosa-Stämmen einzigartig geschaffen worden und ist neu. Demnach ist dieses spezielle Medium in den Bereich der vor­ liegenden Erfindung mit eingeschlossen. Wenn Pseudomonas Aerugi­ nosa-Stämme in dem speziellen Medium gezüchtet werden, ist die Ausbeute an Bakterienmasse mindestens 30% höher als das Wachs­ tum der Bakterienmasse, die in tryptischer Sojanährlösung ge­ züchtet wurde, bezogen auf das Gewicht der trockenen Bakterien­ masse. Daher ist die Verwendung eines solchen speziellen Mediums eine bevorzugte Ausführungsform.
Bei dieser Bebrütungsstufe der Bakterienmasse sind die op­ timalen Kulturbedingungen eine Temperatur von 37°C, eine Belüf­ tungsrate von 1 VVM (Volumen/Volumen Minute) und ein Impfvolumen von 5% V/V der Kulturmediumlösung, wobei das Bebrüten mit einer Rührgeschwindigkeit von 100 UpM während der ersten beiden Stun­ den und nachfolgend mit 600 UpM während der folgenden 10 bis 20 Stunden, vorzugsweise 12 bis 16 Stunden, durchgeführt wird.
Nach der Beendigung des Bebrütens werden in der zweiten Stufe die ausgefällten Bakterienzellen mittels Zentrifugieren oder dergleichen von der Kulturlösung abgetrennt. Die abgetrenn­ ten Bakterienzellen werden in der dritten Stufe mit einem orga­ nischen Lösungsmittel behandelt, um den Mikroorganismus zu des­ aktivieren und gleichzeitig Lipidkomponenten von der Zellwand zu entfernen. In der dritten Stufe ist das organische Lösungsmittel vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Chloroform, Ethanol, Butanol, etc., und am meisten bevorzugt ist das organische Lösungsmittel Aceton.
Nachfolgend umfaßt die vierte Stufe die wiederholte Extrak­ tion der Zellwandproteine, d. h. 5 bis 6 Extraktionen, wobei die Zellen selbst nicht derart zerstört werden, daß ihre Zellinhalte verloren sind. Zu diesem Zweck werden die Mikroorganismuszellen in einer Lösung wie Phosphat-Pufferlösung, Tris-Pufferlösung und dergleichen, vorzugsweise in phosphat-Pufferlösung zurückgehal­ ten und werden mit einem Mischer oder Homogenisierer behandelt, um die Zellwandproteine zu extrahieren. Die Extraktion wird vor­ zugsweise durch Rühren mit 100 bis 2000 UpM bei 4°C durchge­ führt. Zusätzlich sollten in der vierten Stufe spezielle Vor­ sichtsmaßnahmen ergriffen werden, um die Zerstörung der Zellen zu vermeiden, so daß die erwünschten Zellwandproteine getrennt von den toxischen Proteinen gehalten werden können, die im Cyto­ plasma vorhanden sind. Daher ist es während des Extraktionsver­ fahrens notwendig, kontinuierlich zu bestimmen, ob Zellen zer­ stört worden sind oder nicht, indem die Anwesenheit von Laktat-De­ hydrogenase oder Hexokinase als Marker-Enzym des Cytoplasmas bestimmt wird.
Nachfolgend werden die Zellwandproteine der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, die in der überstehenden Flüssig­ keit nach den obigen Verfahren erhalten werden, fraktioniert, indem sie der ersten und zweiten Ultrafiltration unterworfen werden, um nur die Proteine mit Molekulargewichten zwischen 10 000 und 100 000 zu erhalten. In dieser Stufe ist es sehr wichtig, daß das Molekulargewicht der resultierenden Zellwand­ proteine im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt. Der Grund liegt darin, daß das Molekulargewicht von Zellwandproteinen mit weniger als 10 000 nicht die gewünschte prophylaktische Wirkung liefert, wie durch Tierversuche festgestellt wurde, während ein Molekulargewicht höher als 100 000 aufgrund der Anwesenheit von hochmolekularen Lipopolysacchariden (LPS) toxische Effekte ver­ ursachen kann.
Die abgetrennten Zellwandproteine aus jedem der sieben Ty­ pen von abgeschwächtem Pseudomonas Aeruginosa mit Molekularge­ wichten zwischen 10 000 und 100 000 werden jeweils durch Ultra­ zentrifugation weiter gereinigt, um alle möglicherweise vorhan­ denen geringen Mengen an Lipopolysaccharid, die vorhanden sein mögen, zu entfernen. Dann wird eine Stufe zur Entfernung aller bakteriellen Substanzen durchgeführt, um schließlich die Zell­ wandproteine von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen zu erhalten, die nicht pathogen sind und die eine ausreichende Reinheit zur Verwendung als Impfserum zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas Aeruginosa-Infektion haben.
Die aus den sieben Typen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen erhaltenen Zellwandproteine werden dann in einem bestimmten Verhältnis kombiniert, um das Impfserum zu formulieren. Bei Berücksichtigung der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit der Pseudomonas Aeruginosa-Mutterstämme vor der Abschwächung soll die Kombination der Zellwandproteine so vor­ genommen werden, indem Zellwandproteine, die aus mindestens drei (3) Typen, insbesondere vier (4) Typen oder mehr und am meisten bevorzugt allen sieben (7) Typen der Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ me erhalten worden sind, gemischt werden. Obwohl das Misch­ verhältnis mit den Typen der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, aus denen die zu kombinierenden Zellwandproteine erhalten worden sind, variiert, werden die Zellwandproteine vorzugsweise im Ver­ hältnis äquivalenter Mengen gemischt.
Beispielsweise sind die bevorzugten Impfserumzusammenset­ zungen solche, die aus CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60534 in einem Mischverhältnis von 1 : 1 : 1,5 : 0,5, 1 : 1 : 1 : 1 oder 0,5 : 1,5 : 1,5 : 0,5 erhalten worden sind, oder einem Impfserum, das alle aus CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018 in einem Mischverhält­ nis von im wesentlichen äquivalenten Mengen erhaltenen Zellwand­ proteine enthält. Die geringste Menge der Zellwandproteinmi­ schung aus jedem der in dem Impfserum vorhandenen Pseudomonas Aeruginosa-Stämme ist die Mindestmenge, die ausreichend ist, um Immunisierung in dem vorgesehenen Wirt/Patienten zu stimulieren.
Gewünschtenfalls kann das Impfserum zur Prophylaxe gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektion zusätzlich zu den wie oben er­ haltenen Zellwandproteinkomponenten pharmazeutisch zulässige Arzneimittel träger, beispielsweise Calciumhydroxid, Calcium­ phosphat, ISCOM (immunstimulierender Komplex), SAF-1 (Syntex Adjuvant Formulation-1 [Syntex Hilfsstoffformulierung]), SAFm (modified Syntex Adjuvant Formulation [modifizierte Syntex Hilfsstofformulierung]) und ähnliche Arzneimittelträger, die Fachleuten bekannt sind, einschließen.
Zur Verwendung als prophylaktisches Impfserum gegen Pseudo­ monas Aeruginosa-Infektion variiert die zu verabreichende Dosis mit dem Geschlecht, Alter, Gewicht, Gesundheitszustand, etc. der Subjekte, die Pseudomonas Aeruginosa ausgesetzt sein mögen, be­ trägt aber allgemein 0,5 bis 2,5 mg der Mischung aus Zellwand­ proteinen aus jedem der abgeschwächten Stämme. Diese Menge wird allgemein aus einer Bakterienmasse von 0,1 g bis 0,5 g Trocken­ gewicht erhalten (entsprechend 0,5 g bis 2,5 g Naßgewicht). Der bevorzugte Verabreichungsweg ist durch intramuskuläre Injektion.
Das aus dem abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stamm er­ haltene Zellwandprotein kann auch als Antikörperstimulanz ver­ wendet werden, um Immunglobulin in Versuchstieren zu stimulie­ ren. Daher entsteht ein therapeutisches Mittel zur Behandlung einer Pseudomonas Aeruginosa-Infektion, das ein Immunglobulin enthält, das durch Injektion des Zellwandproteins in reinem Zustand, das durch Abtrennung und Reinigung wie oben erwähnt erhalten worden ist, in ein Versuchstier, um die Produktion eines Immunglobulins gegen Pseudomonas Aeruginosa zu stimulie­ ren, produziert worden ist.
Spezifisch ist das abgetrennte und gereinigte Zellwandpro­ tein, das gemäß dem Verfahren wie spezifisch oben illustriert aus abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen erhalten wor­ den ist, ein Antigen, das verwendet wird, um Versuchstiere wie Schaf, Kaninchen, etc., zu inokulieren (zu beimpfen), um die Bildung des betreffenden Antikörpers zu stimulieren. Das Blut wird aus den Versuchstieren gesammelt und dann wird das Serum abgetrennt. Das abgetrennte Serum wird in bekannter Weise behan­ delt, um das gewünschte Immunglobulin in gereinigtem Zustand zu erhalten. Zu diesem Zweck kann die Abtrennung und Reinigung des Immunglobulins aus dem abgetrennten Serum nach dem Verfahren durchgeführt werden, das aus dem relevanten technischen Umfeld wohlbekannt ist [siehe Practical Immunogy, 3. Ausgabe, (1989), Seiten 292 bis 294], indem beispielsweise das abgetrennte Serum mit destilliertem Wasser gemischt wird, die Mischung zu DEAE-Cellulose (Diethylaminoethylcellulose) gegeben wird, um das Immunglobulin absorbieren zu lassen, die überstehende Flüssig­ keit entfernt wird und dann die DEAE-Cellulose, die das Immun­ globulin absorbiert hat, mehrfach mit Phosphat-Pufferlösung gewaschen wird, um das gereinigte Immunglobulin zu erhalten.
Das in dem therapeutischen Mittel zur Behandlung der Pseu­ domonas Aeruginosa-Infektion verwendete Immunglobulin wird er­ halten, indem ein Versuchstier mit einer Mischung immunisiert wird, die aus verschiedenen abgeschwächten Pseudomonas Aerugino­ sa-Stämmen abgetrennte Zellwandproteine in einem bestimmten Ver­ hältnis enthält. Zu diesem Zweck kann ein kombiniertes Immunglo­ bulin verwendet werden, das erhalten wird, indem ein Versuchs­ tier mit einer Mischung immunisiert wird, die aus jedem der Zellwandproteine, die aus jedem der sieben (7) Typen von Pseudo­ monas Aeruginosa-Stämmen erhalten worden sind, in einem bestimm­ ten Verhältnis, vorzugsweise im Verhältnis äquivalenter Mengen, zusammengesetzt ist. Wenn allerdings die Kreuzreaktivität von jedem der Immunglobuline berücksichtigt wird, liefern die Im­ munglobuline, die durch Immunisieren eines Versuchstiers mit einer Mischung, die aus Zellwandproteinen, die aus jedem der 4 Typen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen wie folgt CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534 zusammengesetzt ist, in einem Verhältnis von 1 : 1 : 1 : 1 erhalten worden ist, eine beträchtliche therapeutische Wirkung auf Infek­ tionen, die durch alle der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme mit den Fishertypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 hervorgerufen worden sind. Dies ist das bevorzugte kombinierte Immunglobulin als therapeu­ tisches Mittel zur Behandlung einer durch Pseudomonas Aeruginosa hervorgerufenen Krankheit.
Das Immunglobulin für Pseudomonas Aeruginosa kann in ly­ ophilisierter Form oder in einer flüssigen Form zu pharmazeu­ tischen Zusammensetzungen formuliert werden und kann, falls erforderlich, zusätzlich pharmazeutisch verträgliche Träger, beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel, isotone Mittel und dergleichen enthalten. Die pharmazeutisch zulässigen Träger, die verwendet werden können, schließen vorzugsweise Mannit, Laktose, Saccharose, Humanalbumin etc. im Fall von ly­ ophilisierten Zubereitungen und physiologische Kochsalzlösung, Wasser zur Injektion, Phosphat-Pufferlösung, Aluminiumhydroxid, etc. im Fall von flüssigen Zubereitungen ein.
Die Dosierung des Immunglobulins variiert in Abhängigkeit von Alter, Körpergewicht, Geschlecht und allgemeinem Gesund­ heitszustand des Subjekts, der Schwere der Pseudomonas Aerugino­ sa-Infektion und den Komponenten des verabreichten kombinierten Immunglobulins. Das Immunglobulin wird allgemein in einer Menge von 0,1 mg bis 100 mg, vorzugsweise 1 mg bis 100 mg pro Tag pro kg Körpergewicht einem Erwachsenen intravenös verabreicht.
Beispiel 1 Isolierung des Pseudomonas Aeruginosa-Stammes aus mit Pseudomonas Aeruginosa infizierten Patienten und seine Identifizierung
Aus jeder der 260 verschiedenen Blutproben, die von mit Pseudomonas Aeruginosa infizierten Patienten genommen wurden, wurde eine aliquote Menge von etwa 1 bis 5 ml aseptisch gesam­ melt und eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachdem das Blut über Nacht im Kühlschrank bei 4°C gelagert worden war, wurde es mit 1500 × g (g:gravity) 10 Minuten bei 4°C zentrifu­ giert, um die festen Bestandteile zu entfernen und ein überste­ hendes Serum zu erhalten. Das erhaltene Serum wurde mit Phos­ phat-Pufferlösung (NaH2PO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter) in einem Verhältnis von 1 : 10 (Serum zu Lö­ sung) verdünnt und dann auf einer Kulturschale mit tryptischem Sojanährmedium mit zugesetzten 1,0 bis 1,5% Agar, das zuvor hergestellt worden war, ausgestrichen. Die Kulturschale wurden 12 Stunden oder länger unter aeroben Bedingungen in einem Inku­ bator bebrütet, der auf einer konstanten Temperatur von 37°C gehalten wurde. Die so erhaltenen Kulturen wurden auf frische Kulturschalen überführt und dann wurden die gewünschten Mikroor­ ganismen mittels eines bekannten Isolationsverfahrens für Mikro­ organismen in reinem Zustand isoliert [siehe Thomas D. Brock und Michael T. Madigan, Biology of Microorganisms (1988), 5. Auf­ lage, Seiten 32 bis 33, Prentive Hall, Englewood Cliffs, New Jersey].
Die isolierten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, ihre serolo­ gischen und immunologischen Charakteristika sind bereits offen­ bart worden (siehe Bergey's Manual) und ihre Identifizierung kann unter Verwendung eines kommerziellen Analysesets gemäß dem in J. Gen. Microbiol., 130, 631 bis 644, 1984, beschriebenen analytischen Verfahren durchgeführt werden. Jeder Pseudomonas Aeruginosa-Stamm wurde in ein Teströhrchen inokuliert, das 5 ml tryptisches Sojanährmedium enthielt, und wurde dann bei 37°C unter aeroben Bedingungen bebrütet, um die Konzentration an Bak­ terienmasse so einzustellen, daß die Absorption auf ungefähr 2,0 oder mehr bei sichtbarem Licht von 650 nm gehalten wurde.
Eine aliquote Menge von 1 ml wurde dieser Kulturlösung aseptisch entnommen und mit 6000 × g bei 4°C 10 Minuten lang zen­ trifugiert. Die überstehende Kulturlösung wurde entfernt und die ausgefällten Mikroorganismen wurden suspendiert, indem die glei­ che Menge sterilisierter Kochsalzlösung zugegeben wurde. 15 µl von jedem Testserum, das in dem Set und Kontrollserum (normalem Kaninchenserum) enthalten war, wurden jeder Mulde einer 96-Mul­ den-Mikroschale zugesetzt und mit 15 µl der oben erhaltenen Mi­ kroorganismensuspension gemischt, um zu bestimmen, ob die Agglu­ tinierung innerhalb von 10 bis 30 Minuten auftrat. Bei dieser Untersuchung kann die Identifizierung der isolierten Mikroorga­ nismen leicht erreicht werden, da der Mikroorganismusstamm in einer Mulde mit positiver Agglutinierung einen Serotyp aufweist, der mit dem des ihm zugesetzten Serums identisch ist.
Beispiel 2 Auswahl der abgeschwächten Pseudomonas Aerugino­ sa-Stämme aus jedem der isolierten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme
Um die Pseudomonas Aeruginosa-Stämme abzuschwächen, um si­ chere Mikroorganismen zur Verwendung bei der Herstellung eines Impfserums zu erhalten, wurde ein Stamm für jeden der Pseudomo­ nas Aeruginosa-Stämme mit unterschiedlichen Immuntypen ausge­ wählt und dann durch wiederholte Reinigungen abgeschwächt.
Bei diesem Verfahren wurde zur Kontrolle ein toxischer Pseudomonas Aeruginosa-Stamm GN 11 189 ausgewählt (Episome In­ stitute, Japan), der eine Lethalitätsrate von 100% innerhalb von 3 Tagen nach intravenöser (oder intraperitonaler) Injektion von 2,0 × 106 Zellen GN 11 189 bei einer männlichen ICR-Maus mit einem Gewicht von 20 bis 25 g zeigte.
Jeder Stamm der oben ausgewählten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ me mit einem unterschiedlichen Immuntyp wurde in flüssigem tryptischen Sojanährmedium unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert und dann mit 6000 × g bei 4°C 10 Minuten lang zentrifugiert. Der erhaltene Zellniederschlag wurde in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, wieder unter den gleichen Bedingungen wie oben zentrifugiert und dann mit fri­ scher physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um den Zellgehalt auf 5×105, 5×106, 5×107 und 5×108 Zellen pro ml einzustellen. Jede Zellverdünnung wurde intravenös (oder intraperitoneal) einer Gruppe verabreicht, die aus 10 ICR-Mäusen bestand. Der Kontroll­ gruppe wurde der GN 11 189 Stamm in einer Menge von 2,0×106 Zellen pro Kontrolltier verabreicht. An dem Punkt, wo die Lethalität innerhalb der Kontrollgruppe innerhalb von 3 Tagen 100% betrug, wurden Pseudomonas Aeruginosa-Stämme aseptisch aus ICR Mäusen bzw. einer ICR-Maus isoliert, die mit der höchsten Zellkonzen­ tration überlebte. Die isolierten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurden wieder auf tryptischem Soja-Agar-Schalenmedium ausgestri­ chen. Nach der Reinisolierungsmethode für Mikroorganismen wie oben erwähnt wurde jeder Mikroorganismusstamm in reinem Zustand isoliert.
Alle sieben (7) Sorten der ersten abgeschwächten Mikroorga­ nismen wurden wiederholt durch ICR-Mäuse geleitet, etwa 3 bis 7 Mal nach dem oben beschriebenen Verfahren, bis die gewünschte LD50 von mindestens 2,0×107 Zellen für jeden Mikroorganismusstamm erreicht worden war. Der Sicherheitswert für jeden am Ende abge­ schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stamm, der als LD50 ausgedrückt wird, ist in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.
Sicherheitswerte für erfindungsgemäß ausgewählte abge­ schwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme
Sicherheitswerte für erfindungsgemäß ausgewählte abge­ schwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme
Alle sieben (7) Arten von Mikroorganismen wie oben erwähnt zeigten den LD50-Wert von mindestens 2,0×107 Zellen. Demnach kann identifiziert werden, daß die abgeschwächten Mikroorganismen ausgewählt worden waren.
Beispiel 3 Identifizierung des abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stammes
Sterilisiertes Cetrimid 10% (Gew./Vol.) wurde einem flüs­ sigen Nährmedium (pH-Wert 7,2 bis 7,4), das durch Dampfsterili­ sieren für 15 Minuten bei 121°C in einem Autoklaven hergestellt war, bis zu einer Endkonzentration von 0,3% (V/V) zugesetzt. Eine aliquote Menge von 10 ml des so erhaltenen Mediums wurde aseptisch entnommen und dann in ein Teströhrchen eingebracht, zu dem ein Tropfen von jedem gemäß dem obigen Beispiel 2 in reinem Zustand isolierten, abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stamm inokuliert wurde, und dann wurde die Impfkultur 12 bis 16 Stun­ den 30 bis 37°C unterworfen. Aus dem Teströhrchen, in dem die Zucht der Mikroorganismen stattfand, wurden 0,5 ml Kulturlösung entnommen, auf einer Schale mit Cetrimid-Agar-Medium als Pseudo­ monas Aeruginosa-Isolierungsmedium ausgestrichen und dann wurde die Platte bebrütet. Die zuerst durch Pigmentbildung als Pseudo­ monas Aeruginosa identifizierte Kolonie wurde zum Nachweis von Fluoreszein auf ein Pseudomonas Aeruginosa-Agarmedium überführt und bebrütet (Proteose Pepton Nr. 3 (Oxoid) 2%, Glycerin (bide­ stilliert) 1%, KH2PO4 (wasserfrei) 0,15%, MgSO4.7H2O 0,15%, Agar 1,5% (Gew./Vol.), pH-Wert 7,2), und dann auf ein Pseudomo­ nas Aeruginosa-Agarmedium zum Nachweis von Pyocyanin (Pepton (Difco) 2%, Glycerin (bidestilliert) 1%, KH2PO4 (wasserfrei) 0,15%, MgCl2 (wasserfrei) 0,14%, Agar 1,5% (Gew./Vol.), pH-Wert 7,2), und wurde dann wieder auf morphologischen Test, Nähr­ stoffanforderungen und Oxidasetest untersucht, um die Anwesen­ heit des Pseudomonas Aeruginosa-Stammes nachzuweisen. Die Typen der ausgewählten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurden nach dem IATS-Klassifikationssystem unter Verwendung des Pseudomonas Aeruginosa-Antigensets (hergestellt von Difco Laboratories, De­ troit, Michigan, USA) nachgewiesen und dann nach Fisher-Immuno-Se­ rotypen klassifiziert. Die Resultate sind in der folgenden Ta­ belle 3 beschrieben.
Kriterien zur Auswahl von Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ men und ihr Serotypbereich und Schutzbereich
Kriterien zur Auswahl von Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ men und ihr Serotypbereich und Schutzbereich
Beispiel 4 Physiologische Charakteristika von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen
  • (1) Jeder der sieben Sorten von Pseudomonas Aeruginosa-Stäm­ men, die gemäß Beispiel 2 abgeschwächt sind, und die Wachs­ tumsraten in Abhängigkeit von unterschiedlichen pH-Werten wurden bestimmt. Jeder Mikroorganismusstamm wurde in 50 ml tryptische Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,2 inokuliert und dann 12 bis 16 Stunden bei 37°C unter aeroben Bedingungen mit einer Durchmischungsgeschwindigkeit von 200 UpM vorbebrütet. Jeder vorbebrütete Bakterienmassenstamm wurde in 500 ml jeweils fri­ scher tryptischer Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 3,0, 5,0, 7,0 und 9,0 in der Endkonzentration von 1% (V/V) inokuliert und dann in Fermentern bei 37°C unter den gleichen Bedingungen wie oben bebrütet. Während dieses Zeitraums wurde eine Probe von jedem Kulturmedium in einem Intervall von 2 Stunden genommen und dann wurde die Konzentration der Bakterienmasse bestimmt, indem die Adsorption der Probe bei 600 nm mit einem Spektrometer ge­ messen wurde. Die hieraus erhaltenen Resultate sind in der fol­ genden Tabelle 4 beschrieben.
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit vom pH-Wert
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit vom pH-Wert
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, wuchsen die abgeschwäch­ ten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme nicht unter übermäßig sauren Bedingungen, beispielsweise bei einem pH-Wert von 3,0, zeigten aber im wesentlichen identische oder ähnliche Wachstumsraten un­ ter mittleren Bedingungen bei pH-Werten von 5,0 bis 9,000. Daher können erfindungsgemäß alle 7 Sorten von Mikroorganismen sehr gut innerhalb eines weiten pH-Wertbereichs gezüchtet werden.
  • (2) Gemäß dem gleichen Verfahren wie in (1) oben wurden die Wachstumsraten von Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen entsprechend den Temperaturvariationen bestimmt. Jede der 7 Sorten der abge­ schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurde in 50 ml trypti­ sche Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,0 inokuliert und dann 12 bis 16 Stunden unter aeroben Bedingungen bei 37°C mit einer Durchmischungsgeschwindigkeit von 200 UpM vorbebrütet. Je­ der vorbebrütete Bakterienmassenstamm wurde in 500 ml tryptische Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,0 inokuliert und dann in Fermentern bebrütet, die auf unterschiedlichen Temperaturen von 25°C, 30°C, 37°C und 42°C gehalten wurden. Während dieses Zeit­ raums wurde die Wachstumsrate in jedem Fermenter bestimmt, indem die Absorption der Kulturlösung bei 600 nm mit einem Spektrome­ ter gemessen wurde. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 5 beschrieben.
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit von Temperaturvariationen
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit von Temperaturvariationen
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, zeigten alle 7 Sorten der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme das beste Wachstum bei 37°C und zeigten auch gutes Wachstum bei 30°C, 25°C. Allerdings zeigte bei 42°C jeder der sieben Sorten der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme eine relativ langsame Wachstums­ rate relativ zu der Wachstumsrate bei anderen Temperaturen.
  • (3) Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Aus­ wirkung der Kohlenstoffquelle auf die Wachstumsrate der abge­ schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme zu bestimmen. Jeder der 7 Sorten der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurden in 50 ml tryptische Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,0 ino­ kuliert und dann 12 bis 16 Stunden unter aeroben Bedingungen mit einer Durchmischungsrate von 200 UpM bebrütet. Das Kulturme­ dium wurde dann mit 6000 × g bei 4°C 10 Minuten lang unter asepti­ schen Bedingungen zentrifugiert, um die Bakterienmasse zu ern­ ten, die dann in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert wurde. Jeweils 50 µl der oben erhaltenen Mikroorga­ nismussuspensionen wurde entsprechend in 5 ml M9-Medium (Na2HPO4.7H2O 12,8 g, KH2PO4 3 g, NaCl 0,5 g, NH4Cl 1 g), das unterschiedliche Kohlenstoffquellen enthielt (siehe unten) ino­ kuliert und dann 12 Stunden bebrütet. Dann wurde für jede Kul­ turlösung das Ausmaß des Mikroorganismuswachstums bestimmt, indem die Absorption bei 600 nm gemessen wurde.
Wachstumscharakteristika von abgeschwächten Pseu­ domonas Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle
Wachstumscharakteristika von abgeschwächten Pseu­ domonas Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle
Die Wachstumscharakteristika von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von den Kohlenstoffquellen zeigten ein Muster, das im wesentlichen ähnlich den Wachstums­ charakteristika von allgemeinen Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von den Kohlenstoffquellen ist (siehe Bergey's manual). Allerdings soll angemerkt werden, daß selbst, wenn von Pseudomonas Aeruginosa angegeben wird, daß er allgemein keine Mannose verwendet, erfindungsgemäß abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa etwas Wachstum in Mannose enthaltendem Medium zeig­ ten.
Wie aus dem obigen ersichtlich ist, können erfindungsgemäß abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme in einem konventio­ nellen Medium, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, an­ organische Verbindungen, Aminosäuren, Vitamine und andere Nähr­ stoffe enthält, unter aeroben Bedingungen bei ausgewählter Tem­ peratur, ausgewähltem pH-Wert, etc. bebrütet werden, um eine Bakterienmasse zu erhalten. Zellwandproteine aus der resultie­ renden Bakterienmasse werden zur Herstellung von Pseudomonas Aeruginosa-Impfseren verwendet.
Als Kohlenstoffquelle zum Bebrüten von abgeschwächten Pseu­ domonas Aeruginosa-Stämmen können verschiedene Kohlenhydrate wie Glukose, Mannit, Fruktose, etc., verschiedene organische Säuren wie Essigsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und dergleichen verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene orga­ nische und anorganische Ammoniumsalze, Pepton, Hefeextrakte, Ca­ seinhydrolysate und die anderen stickstoffhaltigen Substanzen verwendet werden. Als anorganische Verbindungen können Magnesi­ umsulfat, Calciumcarbonat, Eisen(II)sulfat, Kupfersulfat, Zink­ sulfat und Kaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat und dergleichen verwendet werden. Das Bebrüten wird vorzugsweise bei 25°C bis 37°C unter aeroben Bedingungen durchgeführt, bei­ spielsweise mit einer Schalenkultur oder einer Flüssigkultur wie einer Schüttelkultur oder Belüftungskreiselkultur. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise während des Bebrütungszeitraums auf einem Wert von 5 bis 9 gehalten. Vorzugsweise wird die Bak­ terienmasse, die durch Zentrifugieren einer Kulturlösung, die 12 bis 16 Stunden bebrütet wurde, erhalten wurde, als Ausgangsmate­ rial zur Herstellung von Impfseren wie nachfolgend beschrieben verwendet.
Beispiel 5 Bebrüten von abgeschwächten Pseudomonas Aerugino­ sa-Stämmen
  • (1) In einem 5 L-Fermenter wurde die gemäß Beispiel 2 erhal­ tene Bakterienmasse von Pseudomonas Aeruginosa zur Massenproduk­ tion wir folgt bebrütet. 2,5 L der Mediumlösung, die durch Auf­ lösen von 30 g tryptischer Sojanährlösung pro Liter destillier­ tem Wasser auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt wurden, wurden sterilisiert und dann in den 5 L Fermenter eingebracht. Die Be­ brütungsbedingungen waren: die Bebrütungsstemperatur war 37°C, Belüftungsrate war 1 VVM, Inokuliermenge war 5% (V/V) der gemäß Beispiel 2 erhaltenen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Bak­ terienmasse der Kulturlösung, und die Durchmischungsrate wurde während der ersten zwei Stunden auf 100 UpM gehalten und nach­ folgend wurde das Bebrüten 12 bis 16 Stunden mit der festgeleg­ ten Durchmischungsrate von 600 UpM fortgesetzt. Obwohl die Men­ gen der erhaltenen Bakterienmasse in Abhängigkeit von dem Typ des Pseudomonas Aeruginosa-Stammes etwas unterschiedlich waren, betrug die durchschnittliche Ausbeute ungefähr 8 g (Trockenge­ wicht) Bakterienmasse pro Liter Kulturlösung.
  • (2) Jeder der sieben Typen der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurde unter den gleichen Bebrütungsbedingungen wie in dem obigen (1) bebrütet, außer daß das Spezialmedium zur Kultur von Pseudomonas Aeruginosa, das aus Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgSO4 (0,5 g/l), CaCO3 (5 g/l) KH2PO4 (1 g/l), FeSO4 (5 mg/l), CuSO4 (5 mg/l) und ZnSO4 (5 mg/l) als Medium ver­ wendet wurde. Mit diesem Spezialmedium wurden ungefähr 10,4 bis 10,5 g (Trockengewicht) Bakterienmasse für jeden Mikroorganis­ musstamm erhalten. So kann die Verwendung dieses Spezialmediums die Ausbeute an Bakterienmasse liefern, die mindestens 30% (be­ zogen auf das Trockengewicht) höher als die in tryptischem Soja­ nährmedium ist.
Beispiel 6 Teilreinigung von Zellwandproteinen aus abge­ schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen
Zur Herstellung von Impfseren gegen Pseudomonas Aeruginosa wurden Zellwandproteine aus jedem der sieben Sorten der abge­ schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme teilweise gereinigt. Nachfolgend wird der Typ-3-Stamm, d. h. CFCPA 30 720 (KCCM 10 031) als typisches Beispiel verwendet. Allerdings können die anderen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme auch dem gleichen Verfahren wie dem folgenden Reinigungsverfahren unterworfen wer­ den, um die teilweise gereinigten Zellwandproteine zu erhalten.
2,5 l des Spezialmediums wie in Beispiel 4 (2) verwendet wurde in einem 5 L Fermenter eingebracht und dann 12 bis 16 Stunden bebrütet, während die gleichen Bebrütungsbedingungen wie oben aufrechterhalten wurden. Nach Beendigung des Bebrütens wur­ den 2,5 L der Kulturlösung mit 6000 × g bei 4°C 20 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Die ausgefällten Zellen wurden in einer Phosphat-Pufferlösung (Na2HPO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter, pH-Wert 7, 2) erneut suspendiert, erneut zentrifugiert und dann mit der gleichen Phosphat-Pufferlösung gewaschen. Zu 130 g der so erhaltenen Zellen wurden 3 Volumina (etwa 390 ml) Aceton, be­ zogen auf das Originalvolumen der nassen Zellen, gegeben und dann wurde die Mischung 12 Stunden oder länger bei 4°C stehen gelassen. Das Aceton wurde von den ausgefällten Zellen entfernt und 2 Volumina (etwa 260 ml) frisches Aceton, bezogen auf das Originalvolumen der nassen Zellen, wurden wieder zu dem Rück­ stand gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 bis 10 Minuten gerührt und dann bei 4°C 20 Minuten lang mit 8000 × g zentrifu­ giert. Das überstehende Aceton wurde entfernt und dem Rückstand wurde das gleiche Volumen an Aceton zugegeben. Die Mischung wur­ de nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben gerührt und zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Die ausgefällten Zellen wurden auf einer Schale bei Raumtemperatur getrocknet, um das Aceton zu entfernen. Die getrockneten Mikro­ organismen wurden erneut suspendiert, indem 250 ml der gleichen Phosphat-Pufferlösung wie oben zugegeben wurden, so daß die End­ konzentration auf 10% (V/V) eingestellt werden kann. Die resul­ tierende Mischung wurde in einem Homogenisierer mit der Ge­ schwindigkeit von 500 bis 1500 UpM 10 Minuten lang behandelt, während die Temperatur auf 4°C gehalten wurde, um Zellwandpro­ teine zu extrahieren. Die erhaltene Suspension wurde mit 8000 bis 10 000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die ausgefällten Zellen wurden abge­ trennt, erneut durch Zugabe des gleichen Volumens an Phosphat- Pufferlösung suspendiert und dann unter den gleichen Bedingungen wie bei der obigen ersten Extraktion einer zweiten Extraktion unterworfen, um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten.
Unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie bei dem er­ sten Extraktionsverfahren wurden die Zellwandproteine wiederholt 5 bis 6 Mal extrahiert, während darauf geachtet wurde, keine der Zellen zu zerstören (zu lysieren). Die Zerstörung der Zellen kann bestimmt werden, indem ein bestimmtes Protein als Marker der Cytoplasmasubstanz gemessen wird, d. h. Laktat-Dehydrogenase oder Hexokinase. Die extrahierten Überstände, von denen jeder getestet wurde, um sicherzustellen, daß die Zellwandproteine ohne Einbringung von Cytoplasmaproteinen, Laktat-Dehydrogenase und Hexokinase extrahiert sind, wurden gesammelt, gerührt und dann schließlich erneut mit 10000 × g bei 4°C 30 Minuten lang zentrifugiert, um eine klare überstehende Lösung zu erhalten. Die so erhaltene Proteinlösung war nur aus im wesentlichen rei­ nen Zellwandproteinen zusammengesetzt und wurde mit quantitati­ ver Proteinanalyse eingestellt, so daß die Proteinkonzentration auf einem Niveau von 1 mg/ml bis 2 mg/ml gehalten wurde. Außer­ dem wurde die Reinheit der Proteinlösung mittels Elektrophorese mit einem Konzentrationsgradienten von 10 bis 15% bestimmt. Als Resultat konnte identifiziert werden, daß die Anwesenheit der gewünschten Zellwandproteine mit dem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000 vorlag (siehe Fig. 1).
Beispiel 7 Reine Reinigung der rohen Proteine
Das folgende Verfahren wurde durchgeführt, um die rohe Zellwandproteinlösung in der Konzentration von 1 bis 2 mg/ml zu reinigen, damit sie nur die wirksamen Komponenten enthielt.
2 bis 2,5 L rohe Zellwandproteinlösung wurde zuerst einem Membranfilter zum Abtrennen des Molekulargewichtbereichs über 100 000 in dem Pellicon-Cassettensystem unterworfen, um Protein­ moleküle mit einem Molekulargewicht von über 100 000 zu entfer­ nen. Gemäß diesem Verfahren wurden Proteine mit einem Moleku­ largewicht unter 100 000 als Filtrat gewonnen und Proteine mit einem Molekulargewicht größer als 100 000 wurden kontinuierlich zirkuliert, um sie von den kleinen Molekülen mit einem Moleku­ largewicht unter 100 000 abzutrennen.
Als Resultat wurde die Proteinlösung um 10 bis 20% des Ausgangsvolumens konzentriert und wurde nachfolgend mit 20 bis 25 L (der zehnfachen Menge des Anfangsvolumens der Proteinlö­ sung) sterilisierter Phosphat-Pufferlösung (Na2HPO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter) gewaschen, um 90% oder mehr der Proteine mit einem Molekulargewicht unter 100 000 zu gewinnen. Die Proteine mit einem Molekulargewicht unter 100 000, die als Filtrat abgetrennt wurden, wurden in dem glei­ chen System einem Membranfilter zum Abtrennen des Molekularge­ wichts von 10 000 unterworfen, um Proteine mit einem Molekular­ gewicht von weniger als 10 000 und andere Verunreinigungen abzu­ trennen und gleichzeitig die Proteine mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 100 000 bis auf eine Konzentration von 1 mg/ml anzureichern.
Schließlich wurde der Überstand ultrazentrifugiert, um Li­ popolysaccharide (LPS) und mit der Zellwand verknüpfte Fragmente zu entfernen, die möglicherweise in dem oben erhaltenen Über­ stand in Spurenmengen vorhanden sind. Das Ultrazentrifugieren wurde 3 Stunden bei 4°C mit 180 000 × g bis 200 000 × g durchge­ führt. Nach Entfernung der Niederschläge wurde der erhaltene Überstand durch Filtration durch 0,2 µm-Filter sterilisiert, um 250 bis 260 mg Proteinzusammensetzung zur Verwendung in Impf­ seren zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas Aeruginosa-Infektion zu erhalten.
Beispiel 8 Reinigung von Zellwandproteinen aus abgeschwäch­ ten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen mit unter­ schiedlichen Immuntypen
Die verbleibenden sechs Sorten von erfindungsgemäß abge­ schwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018, wurden gemäß dem gleiche Verfahren behandelt, wie in Bei­ spiel 5, Beispiel 6 und Beispiel 7 zur Bebrütung und Reinigung von Mikroorganismen zur Herstellung der Impfserumzusammensetzung beschrieben ist. Die so erhaltenen fertigen Pseudomonas aerugi­ nosa-Impfserumzusammensetzungen zeigten das gleiche Bandspektrum wie das CFCPA 30 720 SDS-Blatt. Zusätzlich konnte als Resultat des Vergleichs mit Standard-Molekulargewichtmarker bestimmt wer­ den, daß alle in den Impfserumzusammensetzungen vorhandenen Pro­ teine das Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000 aufweisen (Fig. 1).
Beispiel 9 Über Kreuz schützender Kapazitätstest mit kom­ binierten Antigenen
Die von jedem abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stamm abgeleiteten Zellwandproteine wurden nach den Abtrenn- und Rei­ nigungsstufen gemäß den in den Beispiele-n 7 und 8 beschriebenen Verfahren 6 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen mit einem Gewicht von 23 bis 25 g in einer Menge von 0,2 mg/kg intraperitoneal verabreicht, um das Tier zu immunisieren. Jede Gruppe bestand aus 10 bis 15 Versuchstieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde 2 bis 3 Mäusen pro Gruppe Blut für den ELISA-Test entnom­ men (Enzyme-linked Immunosorbens-Test (Enzymverknüpfter Immuno­ sorbens-Test)). Den verbleibenden ICR-Mäusen wurde ein wilder Pseudomonas aeruginosa-Stamm entsprechend dem jeweiligen Immun­ typ in einer Menge von dem 10 bis 50 fachen des Anfangs-LD50-Werts für jeden in Tabelle 2 in Beispiel 2 aufgeführten Mikroor­ ganismusstamm injiziert. Die Schutzwirksamkeit gegen jeden Pseu­ domonas aeruginosa-Stamm wurde kontinuierlich eine Woche lang untersucht. Als Resultat zeigten alle Testgruppen eine Schutz­ wirkung gegen die entsprechenden Pseudomonas aeruginosa-Stämme und die ELISA-Ergebnisse von allen gesammelten Blutproben zeig­ ten auch gute positive Werte, die eine Verbesserung der Immun­ antworten anzeigen.
In der vorliegenden Erfindung wurden zur Herstellung von Impfseren, die in der Lage sind, eine allgemeine Schutzwirkung gegen Infektionen zu zeigen, die durch einen beliebigen Typ von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen hervorgerufen werden, vier Typen von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen (drei Typen von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, die am häufigsten bei Infek­ tionen des menschlichen Körpers nachgewiesen werden und ein Typ eines Pseudomonas aeruginosa-Stammes, der schwierig zu überwin­ den ist, wenn er beteiligt ist, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534) behandelt, um Zellwandproteine zu erhalten, die in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen kom­ biniert wurden und dann auf Kreuz-Schutzkapazität gegen jeden Immuntyp von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen untersucht wurden.
Aus den vier Typen von abgeschwächten Pseudomonas aerugino­ sa-Stämmen wie oben angegeben abgetrennte Zellwandproteine wur­ den in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen (1 : 1 : 1 : 1), bezo­ gen auf das Gewicht, kombiniert. Die kombinierten Zellwandpro­ teine wurden männlichen ICR-Mäusen intraperitoneal verabreicht, um die Versuchstiere zu immunisieren. Der Kontrollgruppe wurden 0,3 ml Phosphat-Pufferlösung (NaH2PO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter) verabreicht. Eine Woche nach der Immunisierung wurde jeder der Testgruppe, die mit Pseudomonas aeruginosa-Impfserum immunisiert worden war und der Kontroll­ gruppe, die mit Phosphat-Pufferlösung immunisiert worden war, peritoneal Pseudomonas aeruginosa in fünf (5) unterschiedlichen Konzentrationen gegeben, die in einer Zehnerreihe von 1×108 Zel­ len bis 1×104-Zellen verdünnt worden war, und nach einer Woche wurde die Anzahl der überlebenden Tiere gezählt, um den Wirksam­ keitsindex (EI) zu bestimmen. Die Resultate hiervon sind nach­ folgend in Tabelle 7 aufgeführt, in der der Wirksamkeitsindex als Wert von LD50 in der Testgruppe, geteilt durch die LD50 in der Kontrollgruppe, definiert ist. Wie aus Tabelle 7 ersichtlich hatte ein Impfserum, das aus Zellwandproteinen bestand, die aus 4 Sorten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen er­ halten worden waren, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534, einen El-Wert von 3,0 bis 18 oder mehr gegen jeden Immuntyp der Pseudomonas aeruginosa-Stämme. Daher es wird in Anbetracht dessen, daß Impfseren mit einem EI-Wert von minde­ stens 2 als eine gute immunologische Wirkung aufweisend angese­ hen werden, als ersichtlich betrachtet, daß das Impfserum eine gute Schutzwirkung gegen Infektionen aufweist, die von jedem beliebigen Typ der 7 Sorten von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen hervorgerufen werden.
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von vier (4) unterschiedlichen Spezies hergestellt ist, gegen jeden TIP von Mikroorganismen
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von vier (4) unterschiedlichen Spezies hergestellt ist, gegen jeden TIP von Mikroorganismen
Gemäß dem Verfahren wie oben erwähnt wird, außer daß die hergestellte Mischung von Zellwandproteinen aus 3 Typen von ab­ geschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen CFCPA 10 142, CFCPA 30 720 und CFCPA 20 215 (Gruppe I) abgeleitet war und die Mischung aus Zellwandproteinen aus allen 7 Typen der abgeschwächten Pseu­ domonas aeruginosa-Stämme hergestellt worden war, wobei alle der Zellwandproteine in einem Verhältnis äquivalenter Mengen vorhan­ den sind, anstelle der Mischung aus 4 Sorten Proteinen verwendet werden, die über Kreuz schützende Kapazität dieser beiden Sorten von Impfseren gegen Infektion von jedem Pseudomonas aeruginosa untersucht. Die Resultate hiervon sind in Tabelle 8 beschrieben.
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von drei (3) Typen (Gruppe I) oder 7 Typen (Gruppe II) abge­ schwächter Pseudomonas aeruginosa-Stämme hergestellt ist, gegen jeden Typ von Mikroorganismen
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von drei (3) Typen (Gruppe I) oder 7 Typen (Gruppe II) abge­ schwächter Pseudomonas aeruginosa-Stämme hergestellt ist, gegen jeden Typ von Mikroorganismen
Wie aus den obigen experimentellen Resultaten ersichtlich ist, zeigt dieses Impfserum eine hervorragende Schutzwirkung gegen jeden Immuntyp von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich mit nur einer Sorte allgemeinem Antigen, weil das Impfserum mit gemischten Proteinkomponenten aus Zellwandproteinen hergestellt ist, die aus mindestens drei (3) unterschiedlichen Sorten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen mit voneinander verschiedenen Immuntypen hergestellt sind. Das bedeutet daß, obwohl der Wirksamkeitsindex des erfindungsgemäßen Impfserums mit der Sorte und Anzahl der gewählten Mikroorganismen der abge­ schwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämme, Mischverhältnissen der daraus abgeleiteten Zellwandproteine, immunologischen Schemata und Verfahren, etc. variiert, bestätigt werden kann, daß das Impfserum gegen alle Pseudomonas aeruginosa-Stämme, die derzeit in Krankenhäusern und bei Patienten auftreten, wirksam ist.
Beispiel 10 Toxikologischer Test für Zellwandproteine
Zur Herstellung eines Komponentenimpfserums zur Prophylaxe gegen durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufene Infektion wur­ de die Sicherheit der Zellwandproteine selbst, die als Komponen­ tenserum verwendet werden sollen, sowie die Sicherheit der Mi­ kroorganismenstämme selbst, wie in Beispiel 2 beschrieben, si­ chergestellt werden. In diesem Beispiel wurden Zellwandproteine teilweise gereinigt und dann in einem Versuchstier, d. h. einer Maus, auf ihre Sicherheit untersucht. Spezifisch wurde jeder der abgeschwächten Mikroorganismen mit tryptischer Sojanährlösung als Kulturmedium in einem 5-L-Fermenter bebrütet und dann gemäß den in den Beispielen 5, 6 und 7 beschriebenen Verfahren behan­ delt. Die Überstände der aus den abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen extrahierten Zellwandproteine wurden zusammen gesammelt, wieder bei 4°C 30 Minuten lang mit 10000 × g zentrifu­ giert, um möglicherweise in der Lösung vorhandene feine Teilchen zu entfernen. Die resultierenden Zellwandproteine wurden durch einen Amicon-Membranfilter filtriert, um eine Mischung von Zell­ wandproteinen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000 zu erhalten, die auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml aufkonzentriert und dann mit einem 0,2 µm-Filter steri­ lisiert wurde, um eine Proteinquelle für toxikologische Unter­ suchungen zu erhalten.
Bei dem toxikologischen Test waren die verwendeten Ver­ suchstiere männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 22 g. Die Proteinquelle wurde der Versuchsgruppe intravenös in einer Menge von 20 mg/kg und 100 mg/kg injiziert. Der Kontroll­ gruppe wurde physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 25 ml/kg gegeben. Wie aus Tabelle 9 und der angefügten Fig. 2 er­ sichtlich ist, zeigte die Versuchsgruppe eine geringfügige Hem­ mung der Gewichtszunahme am ersten Tag nach der Verabreichung, zeigte aber am und nach dem zweiten Tag ein normales Wachstum und keine speziellen Symptome. Zusätzlich konnten selbst am 7. Tag und danach in keinem Organ spezifische Veränderung oder Symptome nachgewiesen werden.
Akuter toxikologischer Test für die Zellwandprotein­ quelle von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stäm­ men
Akuter toxikologischer Test für die Zellwandprotein­ quelle von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stäm­ men
Beispiel 11 Bestimmung der Antigenität der Zellwandproteine
Durch teilweise Reinigung von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 er­ haltene Zellwandproteine wurden als Antigen verwendet und wurden in einer Menge von 0,1 mg/kg oder 0,2 mg/kg intravenös in ICR-Mäuse injiziert, um die Versuchstiere zu immunisieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde eine bestimmte Menge Blut von jeder Maus der Mäusegruppe entnommen, das Serum wurde aus dem gesammelten Blut abgetrennt und die Bildung des Antikörpers wur­ de gemäß dem ELISA-Verfahren [J. Clin Microbiol. 15, 1054 bis 1058, 1982] bestimmt.
Zuerst wurden 100 µl des gemäß Beispiel 10 hergestellten Antigens, das in einem Beschichtungspuffer (0,05 M Carbonat-Puf­ ferlösung, die aus 2,85 g NaHCO3, 1,70 g Na2CO3 und 1 H2O zusammengesetzt war, pH-Wert 9,6) auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml eingestellt worden war, zu jeder Mulde einer 96-Mulden-Mi­ kroplatte gegeben und dann entweder 2 Stunden bei Raumtemperatur oder 12 bis 14 Stunden bei 4°C umgesetzt, damit das Protein an der Platte haftete.
Nach Entfernen der wäßrigen Lösung wurden 1% Rinderserum­ albumin (BSA, bovine serum albumin) zu jeder Plattenmulde gege­ ben und dann eine Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt, um den verbleibenden Anteil in den Mulden zu blockieren, der nicht an Protein gebunden war.
Bei diesem Test wurde Serum einer nicht-immunisierten Maus als Antikörper für die Kontrollgruppe verwendet. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Platte wiederum 5 bis 6 mal mit Phos­ phat-Pufferlösung (pH-Wert von 7,0 bis 7,2) gewaschen und 100 µl eines zweiten Antikörpers, d. h. Kaninchen-Antimaus-Ig-Peroxida­ se-Konjugat, zu jeder Mulde gegeben und bei Normaltemperatur eine Stunde reagieren gelassen.
Danach wurde die Platte 7 mal oder öfter mit der gleichen Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7,0 bis 7,2) kräftig gewaschen. Als Substrat wurden 50 µl ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, das auf eine Konzentration von 0,3 bis 0,4 mg/ml in Citrat-Phos­ phat-Pufferlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH-Wert 5,0) eingestellt war, zu jeder Mulde der Platte gegeben und 20 Minu­ ten in Abwesenheit von Licht umgesetzt. Dann wurden jeweils 50 µl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Umsetzung in jeder Mulde abzubrechen. Dann wurde für jede Reaktionslösung die Absorption bei 490 nm mit einem Spektrometer gemessen.
Bildung von Antikörper gegen Zellwandproteine von jedem Mikroorganismus (490 nm)
Bildung von Antikörper gegen Zellwandproteine von jedem Mikroorganismus (490 nm)
Wie aus Tabelle 10 ersichtlich ist, führt in der Versuchs­ gruppe die Verabreichung von 0,1 bis 0,2 mg/kg Antigen zu einer 2 bis 5 mal höheren Immunität als in der Kontrollgruppe.
Beispiel 12 Produktion von Immunglobulin für Pseudomonas aeruginosa
Die in Beispiel 7 erhaltene Proteinlösung wurde Kaninchen verabreicht, um das entsprechende Immunglobulin zu produzieren. Obwohl das aus dem abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stamm CFCPA 30 720 erhaltene Zellwandprotein als typisches Beispiel verwendet wurde, kann das gleiche Verfahren auf die anderen ab­ geschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämme angewendet werden.
0,5 bis 1 ml (die 100 bis 200 mg Zellwandprotein enthiel­ ten) der Zellwandproteinlösung, die in Beispiel 7 aus dem CFCPA-Stamm 30 720 erhalten worden war, wurden verwendet, um Albino­ kaninchen drei Mal in Intervallen von 7 Tagen zu inokulieren. Das Blut wurde in regelmäßigen Intervallen von jedem Kaninchen genommen und das Serum wurde abgetrennt. 100 ml des abgetrennten Kaninchenserums wurden mit 300 ml destilliertem Wasser gemischt und die Mischung wurde bei 4°C zu 500 g (Naßgewicht) DEAE-Cellu­ lose gegeben. Die resultierende Mischung wurde eine Stunde bei 4°C gründlich geschüttelt, stehen gelassen und danach wurde der Überstand abgetrennt und entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde drei Mal mit jeweils 200 ml 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (1,15 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4, 0,2 g KCl, 8,766 g NaCl pro Liter, pH-Wert 8,0) gewaschen, um 600 mg Immunglobulin IgG mit einer Reinheit von 96% oder mehr zu erhalten.
Beispiel 13 Therapeutische Wirkung des Immunglobulins auf die Pseudomonas aeruginosa-Infektion
Es wurden die therapeutischen Wirkungen auf die Pseudomonas aeruginosa-Infektion für Immunglobuline gegen Pseudomonas aeru­ ginosa-Stämme, die in Beispiel 12 oben erhalten wurden, gemäß der folgenden Weise untersucht. Nachfolgend wurden 10 Mäuse in jeder Gruppe verwendet.
1,0 bis 3,0×106 Zellen von jedem der pathogenen Pseudomonas aeruginosa-Stämme der Fisher-Immuntypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden in jede Maus intraperitoneal injiziert, um die Pseudomo­ nas aeruginosa-Infektion hervorzurufen. Innerhalb von 2 bis 6 Stunden nach der Injektion wurde das gereinigte Immunglobulin in einer Menge von 0,1 bis 2 mg pro Maus intravenös in jede Maus injiziert, um dessen therapeutische Wirkung zu untersuchen.
Der Kontrollgruppe wurden 0,5 ml physiologische Kochsalzlö­ sung zur Injektion anstelle des Immunglobulins injiziert. Bei diesem Test waren die verwendeten Immunglobuline CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534 oder eine Mischung die­ ser 4 Sorten von Immunglobulinen im Verhältnis äquivalenter Men­ gen.
Als Resultat zeigte die Kontrollgruppe, die nur physiologi­ sche Kochsalzlösung erhielt, eine Lethalitätsrate von 50% oder mehr innerhalb von 48 Stunden und 100% nach 72 Stunden. Die Versuchsgruppe, die das entsprechende Immunglobulin erhielt, zeigte hingegen eine Überlebensrate von 80% oder mehr nach 72 Stunden. Demnach konnte gezeigt werden, daß das Immunglobulin zur Behandlung der durch den pathogenen Pseudomonas aeruginosa-Stamm hervorgerufenen Infektion mit dem entsprechenden Fisher-Immun­ typ wirksam ist. Allerdings besaß kein einzelnes Immunglo­ bulin eine Wirkung auf eine Infektion, die durch pathogene Pseu­ domonas aeruginosa-Stämme mit den Fisher-Immuntypen 4 und 5 her­ vorgerufen wurde.
Andererseits zeigte die Mäusegruppe, die die Kombination aus 4 Sorten Immunglobulinen im Gewichtsverhältnis von 1 : 1 : 1 : 1 erhielt, aufgrund ihrer Kreuzreaktivität selbst auf die Fisher Typen 4 und 5 der Pseudomonas aeruginosa-Stämme eine hervorra­ gende therapeutische Wirkung. Demnach kann die kombinierte Im­ munglobulinzusammensetzung als therapeutisches Mittel verwendet werden, das gegen Infektionen wirksam ist, die von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen mit allen Fisher-Immuntypen hervorgerufen worden sind. Die Resultate dieses Experiments sind in den Ta­ bellen 11 und 12 zusammengefaßt.
Immunologische Schutzwirkung durch Verwendung von individuellen oder in Kombination verwendeten Immunglobulinen
Immunologische Schutzwirkung durch Verwendung von individuellen oder in Kombination verwendeten Immunglobulinen
Wechselseitige Beziehung von immunologischem Schutz von Immunglobulin gegen Pseudomonas aeru­ ginosa-Stämme
Wechselseitige Beziehung von immunologischem Schutz von Immunglobulin gegen Pseudomonas aeru­ ginosa-Stämme
Beispiel 14 Therapeutische Wirkung der kombinierten Immunglo­ buline auf die Pseudomonas aeruginosa-Infektion
4 Sorten in Beispiel 13 ausgewählter abgeschwächter Pseudo­ monas aeruginosa-Stämme, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534, wurden bebrütet und nach den gleichen Verfahren wie in den Beispielen 5, 6 und 7 extrahiert, um die kombinierte Zusammensetzung der Zellwandproteine zu erhalten, die dann drei Mal in Intervallen von einer Woche in einer Menge von 1,5 mg bis 2 mg gemäß der gleichen Weise wie in Beispiel 13 in Ziege inokuliert wurden, um die kombinierten Pseudomonas aeruginosa-Immunglobuline in einer größeren Menge zu erhalten, die gemäß dem bekannten Verfahren gereinigt wurde [siehe Practi­ cal Immunology, 3. Ausgabe (1989), Seiten 292 bis 294].
Um die immunologische Schutzwirkung und die therapeutische Wirkung des gereinigten und kombinierten Immunglobulins zu be­ stimmen, das zuvor aus pathogenem Pseudomonas aeruginosa der verschiedenen Fisher-Immuntypen erhalten wurde, wurden pathogene Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit jeden Immuntyp in eine Mäuse­ gruppe (sechs Gruppen, 20 Mäuse pro Gruppe), in die zuvor die kombinierte Immunglobulinzusammensetzung drei Mal injiziert wor­ den war, und in eine weitere Mäusegruppe (sechs Gruppen, 10 Mäu­ se pro Gruppe, die keine Immunglobulinzusammensetzung erhalten hatten) in einer Menge von 1,0 bis 3,0×106 Zellen pro Maus inoku­ liert, um die immunologischen Schutzwirkung des kombinierten Im­ munglobulins zu beobachten. Zusätzlich wurden in eine weitere Mäusegruppe (sechs Gruppen, 10 Mäuse pro Gruppe) zuerst ein pa­ thogener Pseudomonas aeruginosa-Stamm inokuliert und nach 2 bis 6 Stunden die oben erhaltene kombinierte Immunglobulinlösung in einer Menge von 0,1 bis 5 mg pro Maus mit einem Gewicht von 20 bis 25 g intravenös injiziert, um die therapeutische Wirkung der Immunglobulinzusammensetzung zu beobachten.
Als Ergebnis hiervon konnte gezeigt werden, daß die kom­ binierte Immunglobulinzusammensetzung eine immunologische Schutzwirkung von 80% oder mehr und eine therapeutische Wirkung von 75% oder mehr (bestimmt als Überlebensrate (%) nach 7 Ta­ gen) zeigten, während alle aus der Kontrollgruppe innerhalb von 3 Tagen gestorben waren.
Demnach kann bestimmt werden, daß die kombinierte Immunglo­ bulinzusammensetzung als nützliches medizinisches Mittel ver­ wendet werden kann, das sowohl eine hervorragende therapeutische Wirkung als auch eine immunologische Schutzwirkung zeigt.
Beispiel 15 Formulierung von Immunglobulinen
Die Kombination von Zellwandproteinen, die durch Bebrüten und Extrahieren von 4 Sorten abgeschwächter Pseudomonas aerugi­ nosa-Stämme, die in Beispiel 13 ausgewählt worden waren, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534, gemäß der gleichen Weise wie in den Beispielen 5, 6 und 7 erhalten worden waren, wurden männlicher Ziege in der gleichen Weise wie in Bei­ spiel 14 verabreicht, um das kombinierte Pseudomonas aeruginosa-Im­ munglobulin zu erhalten, das abgetrennt und gereinigt wurde und dann unter Verwendung verschiedener pharmazeutisch verträg­ licher Träger formuliert wurde, so daß 1 bis 100 mg Antikörper-Immun­ globulin pro kg Körpergewicht verabreicht werden können. Das formulierte Immunglobulin wurde mit Pseudomonas aeruginosa infizierter Maus verabreicht, um die Wirksamkeit des Immunglobu­ lins in Abhängigkeit von den für das Immunglobulin verwendeten Trägersorten zu bestimmen. Als Resultat hiervon zeigte im Fall der flüssigen Formulierung die Immunglobulinzubereitung mit phy­ siologischer Kochsalzlösung zur Injektion oder mit Phosphat-Puf­ ferlösung als Träger eine hohe Wirksamkeit, und im Fall der lyo­ philisierten Formulierung lieferte die Verwendung von Mannit, Saccharose oder Lactose als Träger die hohe Wirksamkeit der Im­ munglobulinzubereitung. Andererseits verringert in einer lyophi­ lisierten Formulierung die Verwendung von Humanalbumin zusammen mit Pseudomonas aeruginosa-Immunglobulin die Wirksamkeit des Im­ munglobulins, und im Fall der flüssigen Formulierung zeigt die Verwendung von Aluminiumhydroxid als pharmazeutischer Träger eine geringe Wirksamkeit. Die Testergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefaßt.
Wirksamkeit von Pseudomonas aeruginosa-Immunglo­ bulin in Abhängigkeit von pharmazeutischen Trä­ gern
Wirksamkeit von Pseudomonas aeruginosa-Immunglo­ bulin in Abhängigkeit von pharmazeutischen Trä­ gern
Beispiel 16 Wirksamkeit der formulierten Immunglobulinzusam­ mensetzung
Das mit einer Phosphat-Pufferlösung formulierte Immunglobu­ lin wie identifiziert, um die hohe Wirksamkeit des Testergebnis­ ses aus Beispiel 15 zu liefern, wurde untersucht, um die Wirk­ samkeit als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für eine sekundäre Hautinfektion bei Zerreißung, Verbrennung, Trauma und dergleichen zu bestimmen. Eine Maus erhielt eine Verbrennung ge­ mäß dem Verbrennungstestverfahren [siehe j. Infect. Dis. 131, 688 bis 691, 1975]. Die flüssige Zubereitung, die 0,5 bis 1 mg kombiniertes Pseudomonas aeruginosa-Immunglobulin auf 1 ml Phos­ phat-Pufferlösung enthielt, wurde zu einem Spray formuliert, das dann auf den verbrannten Teil der Maus in der Testgruppe auf ge­ bracht wurde, um dessen Wirkung im Vergleich mit dem der Kon­ trollgruppe ohne Behandlung mit dem immunglobulin-Spray zu be­ stimmen. Als Ergebnis dieses Versuchs zeigte die Mäusegruppe, die mit dem immunglobulin-Phosphat-Pufferlösung-Spray behandelt worden war, beträchtlich höhere Überlebensraten als die nicht behandelte Kontrollgruppe. Demnach kann gezeigt werden, daß die Immunglobulin gegen Pseudomonas aeruginosa enthaltenden Formu­ lierungen eine hervorragende Schutzwirkung und eine hervorragen­ de therapeutische Wirkung auf die Pseudomonas aeruginosa-Infek­ tion haben. Das Resultat dieses Experiments ist in der folgenden Tabelle 14 beschrieben.
Resultat des Verbrennungstests
Resultat des Verbrennungstests
Wie oben beschrieben wird jeder Pseudomonas aeruginosa-Stamm als sicher relativ zu den wilden oder pathogenen Spezies betrachtet. Zusätzlich können, da ihre Zellwandproteine eine hervorragende Sicherheit und über Kreuz schützende Eigenschaft und auch eine hervorragende Kapazität zur Bildung neutralisie­ render Antikörper zeigen, die Zellwandproteine nicht nur als Impfserum zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas aeruginosa-Infek­ tion, sondern auch als Antikörper-Stimulator in dem Versuchstier verwendet werden, um Immunglobulin herzustellen, das als thera­ peutisches Mittel für die Pseudomonas aeruginosa-Infektion ver­ wendet werden kann. So ist ersichtlich, daß die abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämme sehr nützliche Mikroorganismen zur Herstellung eines prophylaktischen Impfserums und eines thera­ peutischen Mittels gegen die Pseudomonas aeruginosa-Infektion sind.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisie­ rung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen, bei dem in den folgenden Schritten
  • a) reine isolierte Zellen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen zubereitet werden;
  • b) die Mikroorganismuszellen mit einem organischen Lö­ sungsmittel behandelt werden, um die Zellen zu inakti­ vieren und Lipidkomponenten zu entfernen;
  • c) die so behandelten Mikroorganismuszellen einer Extrak­ tion unterzogen werden, um ein Zellwandprotein zu erhalten;
  • d) der erhaltene Extrakt einer Fraktionierung und Reini­ gung durch Ultrafiltration und/oder Ultrazentrifugie­ rung unterzogen wird, um eine spezielle Proteinfrak­ tion auszuwählen;
  • e) die ausgewählte Proteinfraktion zurückgewonnen wird und
  • f) unter Verwendung der ausgewählten Proteinfraktion ein Impfserum zubereitet wird,
wobei der Schritt c) unter ausreichend milden Bedingungen ausgeführt wird, so daß die Zellwände der Mikroorganismen nicht zerstört werden, wodurch ein Extrakt erhalten wird, der keine zytoplasmatischen Proteine enthält, wobei in Schritt d) die ausgewählte spezielle Proteinfraktion ein Molekulargewicht von 10 000 bis 100 000 und kein Lipopolysaccharid aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) die in Schritt b) behandelten Mikroorganismus­ zellen in eine Pufferlösung gegeben werden, worauf die sich ergebende Mischung stehen gelassen und sanft gerührt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei 4°C mit einem Mischer oder Homogenisator gerührt wird, der mit 100 bis 2000 U/Min. betrieben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Phosphat-Pufferlösung und einer Tris-Pufferlösung.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß wäh­ rend oder nach dem Schritt c) der Extrakt dahingehend un­ tersucht wird, ob die Mikroorganismuszellen zerstört wur­ den, indem die Anwesenheit von Laktat-Dehydrogenase oder Hexokinase als Marker-Enzym des Cytoplasmas bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt a) verwendeten Stämme ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas Aeruginosa CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt b) verwendete organische Lösungsmittel ausge­ wählt wird aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Chloroform, Ethanol und Butanol.
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