DE4447677C2 - Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-InfektionenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her
stellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas
Aeruginosa-Infektionen.
Pseudomonas Aeruginosa ist ein bewegliches gramnegatives
Stäbchen, ungefähr 0,5 µm × 1,5 bis 3,0 µm, mit einer einzigen
Geißel, das weitverbreitet in der Erde, in Wasser, Abwasser und
im menschlichen Darm vorkommt (Mol. Microbiol. 4, 1069 bis 1075,
1990). Pseudomonas Aeruginosa ist ein pathogener Stamm, der
hartnäckige Infektionen wie Sepsis (Septikämie), generalisierte
Infektion, chronische Infektion der Atemwege, cystische Fibrose
der Pankreas, etc. hervorruft. Die durch Pseudomonas Aeruginosa
verursachte Sepsis ist eine Krankheit, die entweder vom Eindrin
gen des Mikroorganismus selbst oder der Absonderung seiner toxi
schen Substanzen in das Blut von Patienten hervorgerufen wird,
die aufgrund von chirurgischen Eingriffen, Fleischwunden, Trau
mata und dergleichen eine verringerte Widerstandsfähigkeit auf
weisen. Die Anwesenheit des Toxins verursacht Schock mit hohem
Fieber, erniedrigtem Blutdruck und andere Symptome, die schließ
lich zum Tode führen können. Da Pseudomonas Aeruginosa außerdem
bei Harnwegsinfektionen gefunden wurde, hat das Interesse an
Pseudomonas Aeruginosa stark zugenommen. Demnach wird die Ent
wicklung eines Medikaments/von Medikamenten, das/die in der Lage
ist/sind, Pseudomonas Aeruginosa wirksam vorzubeugen oder hart
näckige eitrige Krankheiten wie durch Pseudomonas Aeruginosa
verursachte Sepsis oder Harnwegsinfekte zu behandeln, dringend
benötigt. Allerdings sind Pseudomonas Aeruginosa-Stämme gegen
die meisten Antibiotika resistent und ein effektives vorbeugen
des oder behandelndes Mittel für Pseudomonas Aeruginosa-Infek
tionen ist bis heute nicht entwickelt worden. Daher hat die Vi
rulenz der Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen im Verlauf der
Zeit zugenommen.
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme können auf verschiedene Weise
klassifiziert werden. Ein solches Klassifizierungssystem ordnet
die Stämme in sieben (7) Typen gemäß dem Fischer-Immuntyp ein.
Ein weiteres System basiert auf der O-Antigengruppe, wie von Te
rada vorgeschlagen wurde. Ein weiteres System ist das Klassi
fizierungssystem nach dem internationalen Antigentypschema
(IATS). In Hinsicht auf die Klassifizierungssystem sind die
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, die am häufigsten bei mit Pseudo
monas Aeruginosa infizierten Patienten gefunden werden: 5/2a,
2c, 3, 7/3a, 3c, 1/4a, 4b, 6/5a, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a,
/13, /12, /11 und 3,7/3d, 3e-Typen nach dem Fisher-Immuntyp/O-Se
rumtyp, wobei 3, 7, 2 und 1-Typen des Fisher-Immuntyps (ent
sprechend 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a und 4b des O-Serumtyps)
hauptsächlich vorhanden sind.
Ein Verfahren zur Behandlung von Pseudomonas Aeruginosa-In
fektionen neutralisiert die Pseudomonas Aeruginosa-Toxine mit
Antitoxinen. Allerdings ist das Antitoxin ein therapeutisches
Mittel, das nur für Patienten nutzbringend ist, die bereits an
Sepsis leiden, und es hat keine prophylaktische Wirkung. Außer
dem ist das derzeit verfügbare Antitoxin sehr teuer und sein
Nutzen ist beschränkt. Zusätzlich ist der bedeutendste Nachteil,
der mit der Verwendung des Antitoxins verbunden ist, die relativ
niedrige Heilungsrate und die begleitenden schwerwiegenden Ne
benwirkungen.
Ein untersuchtes Verfahren zum Vermeiden der Nachteile, die
mit dem Antitoxin verbunden ist, verwendet ein allgemeines Anti
gen zur Vorbeugung und Behandlung von Pseudomonas Aeruginosa-In
fektionen. Untersuchte Verfahren zur Gewinnung des allgemeinen
Antigens können allgemein in zwei Gruppen klassifiziert werden.
Das erste Verfahren betrifft die Verwendung eines allgemeinen
Antigens, das aus Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen mit unter
schiedlichen Immuntypen abgetrennt und gereinigt worden ist, als
prophylaktisches Impfserumantigen gegen Pseudomonas Aeruginosa-In
fektionen [Japan, J. Exp. Med. 45, 355 bis 359, 1975]. Das
zweite Verfahren betrifft die Verwendung einer allgemeinen Anti
genmasse, die durch Verwendung einer gentechnologischen Technik
hergestellt worden ist, bei der ein genetischer Code für das ge
wünschte Antigen isoliert und in einen geeigneten Vektor einge
setzt wird, um einen rekombinierten Vektor zu erhalten, und dann
wird der geeignete Wirt mit dem resultierenden rekombinierten
Vektor transformiert und bebrütet, um das gewünschte Antigen zu
exprimieren.
Obgleich die Entwicklung eines prophylaktischen Antigens
unter Verwendung eines allgemeinen Antigens theoretisch eine
sehr wirksame Methode ist, zeigt der Fortschritt von Untersu
chungen, die diese Methode betreffen, daß diese Methode viele
Probleme aufweist, die ungelöst bleiben. Der Hauptnachteil ist,
daß das allgemeine Antigen nicht allen Sorten von Pseudomonas
Aeruginosa mit unterschiedlichen Immuntypen vorbeugen kann und
seine Wirksamkeit daher extrem niedrig ist. Eine solche niedrige
Wirksamkeit legt nahe, daß die Anwesenheit eines weiteren unbe
kannten größeren Antigens zusätzlich zu dem allgemeinen Antigen
eine wirksame prophylaktische Wirkung hervorzurufen vermag.
Ein weiteres Verfahren zur Behandlung der Pseudomonas Aeru
ginosa-Infektion ist die Verabreichung von Antibiotika oder Che
motherapeutika mit Breitbandselektivität für die Pseudomonas Ae
ruginosa-Stämme. Da es allerdings zahlreiche Pseudomonas Aerugi
nosa-Stämme gibt und sie allgemein ein sehr hohes Ausmaß an
Arzneimittelbeständigkeit haben, beherbergen viele Patienten
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, die nicht wirksam mit Antibiotika
behandelt werden können.
Zusätzlich ist ein Verfahren unter Verwendung von therapeu
tischem Immunglobulin entwickelt worden. Allerdings zeigt dieses
Immunglobulin wenig oder keine therapeutische Wirkung auf alle
Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen und ist daher nur für sehr
begrenzte Typen von Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen verwendet
worden. Dies liegt hauptsächlich daran, daß das Immunglobulin
nach einem Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Antikör
pers für einen bestimmten Mikroorganismus hergestellt worden ist
und daher nicht allgemein auf die zahlreichen Pseudomonas Aeru
ginosa-Stämmen wirken kann.
Es sind Versuche unternommen worden, mit monoklonalen Anti
körpern von Mäusen [J. Inf. Dis. 152, 1290 bis 1299, 1985] oder
menschlichen monoklonalen Antikörpern [FEMS Microbiol. Immunol.
64, 263 bis 268, 1990] ein preiswertes Therapeutikum gegen Pseu
domonas Aeruginosa zu entwickeln. Hier können Zellinien ausge
wählt werden, um die wirksamsten neutralisierenden Antikörper
aus einer Zellreihe mittels Zellfusionstechnik herzustellen, und
dann kann eine Zellinie als Ausgangsmaterialien verwendet wer
den, um den gewünschten Antikörper im industriellen Maßstab her
zustellen. Diese Methode zielt auf die Behandlung der Pseudomo
nas Aeruginosa-Infektion über Antikörperproduktion, aber nicht
mit prophylaktischen Impfseren. Zusätzlich hat diese Methoden
einen Nachteil, da, weil alle Infektionen durch unterschiedliche
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme mit unterschiedlichen serologi
schen und immunologischen Typen hervorgerufen werden, sie nicht
alle mit nur einer Sorte monoklonalem Antikörper behandelt wer
den können. Das bedeutet, daß die Therapie mit monoklonalen An
tikörpern nicht verwendet werden kann, um alle der Pseudomonas
Aeruginosa-infizierten Patienten zu behandeln.
Um die wirksame Behandlung nach dieser Methode zu verbrei
tern, ist die gleichzeitige Verabreichung mehrerer Sorten von
Antikörpern auf Basis ihrer ermittelten Kreuzreaktivität ent
wickelt worden. Hierbei wird Pseudomonas Aeruginosa-infizierten
Patienten Blut abgenommen und untersucht, um den serologischen
und/oder immunologischen Typ der infizierenden Pseudomonas Aeru
ginosa-Stämme zu identifizieren. Die geeigneten monoklonalen An
tikörper des identifizierten Typs werden dem Patienten verab
reicht. Allerdings erfordert diese Methode viel Zeit und ist da
her bei Patienten nicht möglich, deren Zustand sofortige Behand
lung nötig macht.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Zellwandprotei
nen, die aus Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden
sind, vorgeschlagen worden [siehe Vaccine, Band 7, "Experimental
studies on the protective efficacy of a Pseudomonas Aeruginosa
vaccine", 1989 [(Experimentelle Untersuchungen zur vorbeugenden
Wirksamkeit eines Pseudomonas Aeruginosa-Impfserums)]. Aller
dings verwendet das in der obigen Druckschrift vorgeschlagene
Verfahren vier Sorten von allgemeinen Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
men, d. h. NN 170 041, NN 170 015, NN 868 und NN 170 046, die
nicht abgeschwächt sind und daher tritt ein Problem in bezug auf
die Toxizitäten der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme selbst auf. Da
außerdem bei der Herstellung eines Impfserums mit Proteinkompo
nente aus solchen Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen Zellen zerstört
werden können, geben sie in das Medium fremde Nukleinsäuren und
toxische hochmolekulare Substanzen und Lipopolysaccharide (LPS)
ab, die im Cytoplasma vorhanden sind. Die Substanzen werden dann
als Verunreinigungen in das resultierende Impfserum eingebracht,
was die Sorgfalt erhöht, die bei der Verabreichung des Impfse
rums erforderlich ist, und möglicherweise seine Verwendung ein
schränkt.
Somit haben die Erfinder intensive Forschungsarbeiten
durchgeführt, um ein Mittel zu finden, das in der Lage ist, ef
fektiv Antikörper gegen Pseudomonas Aeruginosa zu stimulieren
und eine gute immunogene (d. h. antigene) Aktivität mit extrem
geringem Risiko aufgrund von inhärenten Toxizitäten der Pseudo
monas Aeruginosa-Stämme selbst zeigt. Daraus resultierend be
stätigen die Erfinder, daß, wenn aus Pseudomonas Aeruginosa-in
fizierten Patienten isolierte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme ge
mäß ihrer Immuntypen in sieben (7) Spezies klassifiziert werden
und dann jeder reine Stamm abgeschwächt wird, indem der Organis
mus mehrfach durch einen geeigneten tierischen Wirt geleitet
wird, neue, sichere und abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
me erhalten werden können. Diese Stämme haben Zellwandpro
teine, die nicht nur zur Herstellung eines Impfserums zur Pro
phylaxe gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen brauchbar sind,
sondern die auch als Antikörperstimulator verwendet werden kön
nen, um Immunglobuline für Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen im
Tierkörper zu produzieren. Die resultierenden Immunglobuline
zeigen eine hervorragende therapeutische Wirkung auf verschiede
ne Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen einschließlich schwerer
Fälle.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver
fahren zur Herstellung des Impfserums zu liefern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her
stellung eines Impfserums zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas
Aeruginosa-Infektion. Das Impfserum wird hergestellt, indem
Zellwandproteine in im wesentlichen reinem Zustand aus jedem der
sieben (7) Typen von sicheren Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen wie
unten beschrieben abgetrennt werden und die abgetrennten Zell
wandproteine weiter gereinigt werden und dann vorzugsweise die
gereinigten Zellwandproteine, die aus mindestens 3 Typen der ab
geschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme abgeleitet sind, kom
biniert werden. Vorzugsweise werden äquivalente Mengen von jedem
der 3 Typen zur Herstellung des erfindungsgemäßen Impfserums
verwendet.
Zum umfassenderen Verständnis der Beschaffenheit und der
Aufgabe der Erfindung soll auf die folgende detaillierte Be
schreibung im Zusammenhang mit den angefügten Zeichnungen bezug
genommen werden, in denen
Fig. 1 das Resultat eines SDS-Blatts (SDS-PAGE) von gerei
nigten Zellwandproteinen zeigt, die erfindungsgemäß aus abge
schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen abgetrennt worden
sind, und
Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Gewichts
veränderung bei männlichen Mäusen zeigt, in die Zellwandprotein
von erfindungsgemäß abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
men intravenös injiziert wurde.
Fisher-Devlin-Typen von Pseudomonas Aeruginosa werden in
sieben Typen eingeordnet, Typ 1 bis Typ 7. In der vorliegenden
Erfindung sind Pseudomonas Aeruginosa-Stämme mit Fisher-Immunty
pen 1 bis 7 als Stämme für die Abschwächung aufgrund der Tatsa
che, daß sie im Blut von einem größeren Anteil, d. h. 90 bis
90% oder mehr, von mit Pseudomonas Aeruginosa infizierten Pa
tienten nachgewiesen worden sind, ausgewählt worden. Insbeson
dere sind unter den sieben (7) Pseudomonas Aeruginosa-Typen Typ
1 und Typ 3 die am häufigsten nachgewiesenen Stämme bei mit
Pseudomonas Aeruginosa infizierten Patienten. Allerdings kann
die Lehre der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um gegen
beliebige der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme Schutz oder Behand
lung zu liefern.
Sicher abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme können
erhalten werden, indem jeder der sieben Typen von Pseudomonas
Aeruginosa-Stämmen in einem reinen Zustand aus dem Blut von Pa
tienten isoliert werden, an denen die Pseudomonas Aeruginosa-In
fektion festgestellt worden ist, und dann die isolierten Stämme
durch wiederholte Reinigungsverfahren abgeschwächt werden. Die
so erhaltenen sicheren abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
me sind alle sieben (7) Typen und werden als CFCPA 10 142
(Fishertyp 1), CFCPA 20215 (Fishertyp 2), CFCPA 30 720 (Fishertyp 3),
CFCPA 40 057 (Fishertyp 4), CFCPA 50 243 (Fishertyp 5), CFCPA 60 534
(Fishertyp 6) beziehungsweise CFCPA 70 018 (Fishertyp 7)
bezeichnet. Hier ist CFCPA ein Akronym für "Cheil Food and Che
mical Pseudomonas Aeruginosa", das aus Cheil Food and Chemicals
Inc., wo die Erfinder der vorliegenden Erfindung beschäftigt
sind, und dem Namen des betreffenden Stammes Pseudomonas Aerugi
nosa zusammengesetzt ist.
Die durch wiederholte Reinigungsverfahren wie oben be
schrieben erhaltenen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
me haben Phenotypen und mikrobiologische Eigenschaften, die mit
denen der entsprechenden Mutterstämme im wesentlichen identisch
sind, zeigen aber neue Eigenschaften, die zur Herstellung eines
Impfserum-Antigens zur Prophylaxe gegen Pseudomonas Aeruginosa-In
fektion brauchbar sind, anstatt eine Pathogenität zu zeigen,
die in den Mutterstämmen vor der Abschwächung vorhanden ist.
Demnach werden die erfindungsgemäßen abgeschwächten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämme als neue Mikroorganismusstämme betrachtet. Da
her wurden diese Stämme am Korean Culture Center of Microorga
nisms in der Korean Federation of Culture Collections, nachfol
gend KCCM, als Internationale Aufbewahrungsbehörde nach dem Bu
dapester Vertrag vom 12. Mai 1993 unter den Zugangsnummern KCCM 10 029
für CFCPA 10 142, KCCM 10 030 für CFCPA 20 215, KCCM 10 031
für CFCPA 30 720, KCCM 10 032 für CFCPA 40 057, KCCM 10 033 für
CFCPA 50 243, KCCM 10 034 für CFCPA 60 534 und KCCM 10 035 für CFCPA 70 018
hinterlegt.
Die Reinigungsverfahren zur Herstellung der abgeschwächten
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme werden wiederholt durchgeführt, im
allgemeinen bis die Stämme die gewünschten LD50-Werte zeigen. Ob
gleich die Anzahl der Reinigungsverfahren oder -stufen in Abhän
gigkeit von der Geschicklichkeit des Technikers, der Toxizität
der Mutterstämme und dergleichen variiert, wird die Reinigungs
stufe vorzugsweise 3 bis 7 Mal durchgeführt, z. B. bis die LD50
des Pseudomonas Aeruginosa mindestens 2 × 107 Zellen ist. Der
LD50-Wert der so erhaltenen neuen abgeschwächten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämme bei Mäusen ist vorzugsweise 2 × 107 Zellen oder
mehr.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Impfserum zum Immuni
sieren gegen die Pseudomonas Aeruginosa-Infektion, das herge
stellt wird, indem Zellwandproteine bei einem reinen Stamm aus
jedem der erfindungsgemäßen, neuen, abgeschwächten, wie oben
erhaltenen Pseudomonas Aeruginosa-Stämme abgetrennt wird und
dann die abgetrennten Zellwandproteine weiter gereinigt werden
und die so erhaltenen gereinigten Zellwandproteine in einem be
stimmten Mischungsverhältnis, vorzugsweise in äquivalenten Men
gen der Zellwandproteine aus jedem der gewünschten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämme, für den die Immunisierung bewirkt werden
soll, kombiniert werden. Das bedeutet, daß die für jeden Stamm
verwendete Menge ausreichen ist, um die Immunisierung gegen die
sen Stamm in einem speziellen Wirtstyp zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Her
stellung von Impfseren zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeru
ginosa, bei dem in den folgenden Schritten
- a) reine isolierte Zellen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen zubereitet werden;
- b) die Mikroorganismuszellen mit einem organischen Lösungsmit tel behandelt werden, um die Zellen zu inaktivieren und Lipidkomponenten zu entfernen;
- c) die so behandelten Mikroorganismuszellen einer Extraktion unterzogen werden, um ein Zellwandprotein zu erhalten;
- d) der erhaltene Extrakt einer Fraktionierung und Reinigung durch Ultrafiltration und/oder Ultrazentrifugierung unter zogen wird, um eine spezielle Proteinfraktion auszuwählen;
- e) die ausgewählte Proteinfraktion zurückgewonnen wird und
- f) unter Verwendung der ausgewählten Proteinfraktion ein Impf serum zubereitet wird,
wobei der Schritt c) unter ausreichend milden Bedingungen ausge
führt wird, so daß die Zellwände der Mikroorganismen nicht zer
stört werden, wodurch ein Extrakt erhalten wird, der keine zyto
plasmatischen Proteine enthält, wobei in Schritt d) die ausge
wählte spezielle Proteinfraktion ein Molekulargewicht von 10 000
bis 100 000 und kein Lipopolysaccharid aufweist.
Das Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Impf
seren wie oben beschrieben kann wie folgt zusammengefaßt werden.
Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Zell
wandproteinen aus abgeschwächten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämmen und zur Herstellung von Impf
seren
Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Zell
wandproteinen aus abgeschwächten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämmen und zur Herstellung von Impf
seren
Nachfolgend werden die erfindungsgemäßen Impfserumszusam
mensetzungen spezifischer in bezug auf deren Herstellungsver
fahren erläutert.
Zur Herstellung von Impfseren zur erfindungsgemäßen Prophy
laxe gegen Pseudomonas Aeruginosa werden in der ersten Stufe
sieben Typen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Typen,
d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243,
CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018, jeweils in einem Fermenter
von geeigneter Größe bebrütet. Als für diesen Zweck geeignetes
Kulturmedium ist tryptische Sojanährlösung oder vorzugsweise ein
spezielles Medium wie nachfolgend beschrieben zum Bebrüten von
Pseudomonas Aeruginosa wie oben beschrieben geeignet.
Dieses spezielle Medium schließt Glukose (30 g/l), Pepton
(15 g/l), MgSO4 (0,5 g/l), CaCO3 (5 g/l), KH2PO4 (1 g/l), FeSO4
(5 mg/l), CuSO4 (5 mg/l) und ZnSO4 (5 mg/l) ein. Dieses spezielle
Medium ist von den vorliegenden Erfindern zum Bebrüten von Pseu
domonas Aeruginosa-Stämmen einzigartig geschaffen worden und ist
neu. Demnach ist dieses spezielle Medium in den Bereich der vor
liegenden Erfindung mit eingeschlossen. Wenn Pseudomonas Aerugi
nosa-Stämme in dem speziellen Medium gezüchtet werden, ist die
Ausbeute an Bakterienmasse mindestens 30% höher als das Wachs
tum der Bakterienmasse, die in tryptischer Sojanährlösung ge
züchtet wurde, bezogen auf das Gewicht der trockenen Bakterien
masse. Daher ist die Verwendung eines solchen speziellen Mediums
eine bevorzugte Ausführungsform.
Bei dieser Bebrütungsstufe der Bakterienmasse sind die op
timalen Kulturbedingungen eine Temperatur von 37°C, eine Belüf
tungsrate von 1 VVM (Volumen/Volumen Minute) und ein Impfvolumen
von 5% V/V der Kulturmediumlösung, wobei das Bebrüten mit einer
Rührgeschwindigkeit von 100 UpM während der ersten beiden Stun
den und nachfolgend mit 600 UpM während der folgenden 10 bis
20 Stunden, vorzugsweise 12 bis 16 Stunden, durchgeführt wird.
Nach der Beendigung des Bebrütens werden in der zweiten
Stufe die ausgefällten Bakterienzellen mittels Zentrifugieren
oder dergleichen von der Kulturlösung abgetrennt. Die abgetrenn
ten Bakterienzellen werden in der dritten Stufe mit einem orga
nischen Lösungsmittel behandelt, um den Mikroorganismus zu des
aktivieren und gleichzeitig Lipidkomponenten von der Zellwand zu
entfernen. In der dritten Stufe ist das organische Lösungsmittel
vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aceton,
Chloroform, Ethanol, Butanol, etc., und am meisten bevorzugt ist
das organische Lösungsmittel Aceton.
Nachfolgend umfaßt die vierte Stufe die wiederholte Extrak
tion der Zellwandproteine, d. h. 5 bis 6 Extraktionen, wobei die
Zellen selbst nicht derart zerstört werden, daß ihre Zellinhalte
verloren sind. Zu diesem Zweck werden die Mikroorganismuszellen
in einer Lösung wie Phosphat-Pufferlösung, Tris-Pufferlösung und
dergleichen, vorzugsweise in phosphat-Pufferlösung zurückgehal
ten und werden mit einem Mischer oder Homogenisierer behandelt,
um die Zellwandproteine zu extrahieren. Die Extraktion wird vor
zugsweise durch Rühren mit 100 bis 2000 UpM bei 4°C durchge
führt. Zusätzlich sollten in der vierten Stufe spezielle Vor
sichtsmaßnahmen ergriffen werden, um die Zerstörung der Zellen
zu vermeiden, so daß die erwünschten Zellwandproteine getrennt
von den toxischen Proteinen gehalten werden können, die im Cyto
plasma vorhanden sind. Daher ist es während des Extraktionsver
fahrens notwendig, kontinuierlich zu bestimmen, ob Zellen zer
stört worden sind oder nicht, indem die Anwesenheit von Laktat-De
hydrogenase oder Hexokinase als Marker-Enzym des Cytoplasmas
bestimmt wird.
Nachfolgend werden die Zellwandproteine der abgeschwächten
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, die in der überstehenden Flüssig
keit nach den obigen Verfahren erhalten werden, fraktioniert,
indem sie der ersten und zweiten Ultrafiltration unterworfen
werden, um nur die Proteine mit Molekulargewichten zwischen
10 000 und 100 000 zu erhalten. In dieser Stufe ist es sehr
wichtig, daß das Molekulargewicht der resultierenden Zellwand
proteine im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt. Der Grund
liegt darin, daß das Molekulargewicht von Zellwandproteinen mit
weniger als 10 000 nicht die gewünschte prophylaktische Wirkung
liefert, wie durch Tierversuche festgestellt wurde, während ein
Molekulargewicht höher als 100 000 aufgrund der Anwesenheit von
hochmolekularen Lipopolysacchariden (LPS) toxische Effekte ver
ursachen kann.
Die abgetrennten Zellwandproteine aus jedem der sieben Ty
pen von abgeschwächtem Pseudomonas Aeruginosa mit Molekularge
wichten zwischen 10 000 und 100 000 werden jeweils durch Ultra
zentrifugation weiter gereinigt, um alle möglicherweise vorhan
denen geringen Mengen an Lipopolysaccharid, die vorhanden sein
mögen, zu entfernen. Dann wird eine Stufe zur Entfernung aller
bakteriellen Substanzen durchgeführt, um schließlich die Zell
wandproteine von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen
zu erhalten, die nicht pathogen sind und die eine ausreichende
Reinheit zur Verwendung als Impfserum zur Prophylaxe gegen die
Pseudomonas Aeruginosa-Infektion haben.
Die aus den sieben Typen von abgeschwächten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämmen erhaltenen Zellwandproteine werden dann in
einem bestimmten Verhältnis kombiniert, um das Impfserum zu
formulieren. Bei Berücksichtigung der Häufigkeit des Auftretens
der Krankheit der Pseudomonas Aeruginosa-Mutterstämme vor der
Abschwächung soll die Kombination der Zellwandproteine so vor
genommen werden, indem Zellwandproteine, die aus mindestens drei
(3) Typen, insbesondere vier (4) Typen oder mehr und am meisten
bevorzugt allen sieben (7) Typen der Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
me erhalten worden sind, gemischt werden. Obwohl das Misch
verhältnis mit den Typen der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, aus
denen die zu kombinierenden Zellwandproteine erhalten worden
sind, variiert, werden die Zellwandproteine vorzugsweise im Ver
hältnis äquivalenter Mengen gemischt.
Beispielsweise sind die bevorzugten Impfserumzusammenset
zungen solche, die aus CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und
CFCPA 60534 in einem Mischverhältnis von 1 : 1 : 1,5 : 0,5, 1 : 1 : 1 : 1
oder 0,5 : 1,5 : 1,5 : 0,5 erhalten worden sind, oder einem Impfserum,
das alle aus CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057,
CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018 in einem Mischverhält
nis von im wesentlichen äquivalenten Mengen erhaltenen Zellwand
proteine enthält. Die geringste Menge der Zellwandproteinmi
schung aus jedem der in dem Impfserum vorhandenen Pseudomonas
Aeruginosa-Stämme ist die Mindestmenge, die ausreichend ist, um
Immunisierung in dem vorgesehenen Wirt/Patienten zu stimulieren.
Gewünschtenfalls kann das Impfserum zur Prophylaxe gegen
Pseudomonas Aeruginosa-Infektion zusätzlich zu den wie oben er
haltenen Zellwandproteinkomponenten pharmazeutisch zulässige
Arzneimittel träger, beispielsweise Calciumhydroxid, Calcium
phosphat, ISCOM (immunstimulierender Komplex), SAF-1 (Syntex
Adjuvant Formulation-1 [Syntex Hilfsstoffformulierung]), SAFm
(modified Syntex Adjuvant Formulation [modifizierte Syntex
Hilfsstofformulierung]) und ähnliche Arzneimittelträger, die
Fachleuten bekannt sind, einschließen.
Zur Verwendung als prophylaktisches Impfserum gegen Pseudo
monas Aeruginosa-Infektion variiert die zu verabreichende Dosis
mit dem Geschlecht, Alter, Gewicht, Gesundheitszustand, etc. der
Subjekte, die Pseudomonas Aeruginosa ausgesetzt sein mögen, be
trägt aber allgemein 0,5 bis 2,5 mg der Mischung aus Zellwand
proteinen aus jedem der abgeschwächten Stämme. Diese Menge wird
allgemein aus einer Bakterienmasse von 0,1 g bis 0,5 g Trocken
gewicht erhalten (entsprechend 0,5 g bis 2,5 g Naßgewicht). Der
bevorzugte Verabreichungsweg ist durch intramuskuläre Injektion.
Das aus dem abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stamm er
haltene Zellwandprotein kann auch als Antikörperstimulanz ver
wendet werden, um Immunglobulin in Versuchstieren zu stimulie
ren. Daher entsteht ein therapeutisches Mittel zur Behandlung
einer Pseudomonas Aeruginosa-Infektion, das ein Immunglobulin
enthält, das durch Injektion des Zellwandproteins in reinem
Zustand, das durch Abtrennung und Reinigung wie oben erwähnt
erhalten worden ist, in ein Versuchstier, um die Produktion
eines Immunglobulins gegen Pseudomonas Aeruginosa zu stimulie
ren, produziert worden ist.
Spezifisch ist das abgetrennte und gereinigte Zellwandpro
tein, das gemäß dem Verfahren wie spezifisch oben illustriert
aus abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen erhalten wor
den ist, ein Antigen, das verwendet wird, um Versuchstiere wie
Schaf, Kaninchen, etc., zu inokulieren (zu beimpfen), um die
Bildung des betreffenden Antikörpers zu stimulieren. Das Blut
wird aus den Versuchstieren gesammelt und dann wird das Serum
abgetrennt. Das abgetrennte Serum wird in bekannter Weise behan
delt, um das gewünschte Immunglobulin in gereinigtem Zustand zu
erhalten. Zu diesem Zweck kann die Abtrennung und Reinigung des
Immunglobulins aus dem abgetrennten Serum nach dem Verfahren
durchgeführt werden, das aus dem relevanten technischen Umfeld
wohlbekannt ist [siehe Practical Immunogy, 3. Ausgabe, (1989),
Seiten 292 bis 294], indem beispielsweise das abgetrennte Serum
mit destilliertem Wasser gemischt wird, die Mischung zu
DEAE-Cellulose (Diethylaminoethylcellulose) gegeben wird, um das
Immunglobulin absorbieren zu lassen, die überstehende Flüssig
keit entfernt wird und dann die DEAE-Cellulose, die das Immun
globulin absorbiert hat, mehrfach mit Phosphat-Pufferlösung
gewaschen wird, um das gereinigte Immunglobulin zu erhalten.
Das in dem therapeutischen Mittel zur Behandlung der Pseu
domonas Aeruginosa-Infektion verwendete Immunglobulin wird er
halten, indem ein Versuchstier mit einer Mischung immunisiert
wird, die aus verschiedenen abgeschwächten Pseudomonas Aerugino
sa-Stämmen abgetrennte Zellwandproteine in einem bestimmten Ver
hältnis enthält. Zu diesem Zweck kann ein kombiniertes Immunglo
bulin verwendet werden, das erhalten wird, indem ein Versuchs
tier mit einer Mischung immunisiert wird, die aus jedem der
Zellwandproteine, die aus jedem der sieben (7) Typen von Pseudo
monas Aeruginosa-Stämmen erhalten worden sind, in einem bestimm
ten Verhältnis, vorzugsweise im Verhältnis äquivalenter Mengen,
zusammengesetzt ist. Wenn allerdings die Kreuzreaktivität von
jedem der Immunglobuline berücksichtigt wird, liefern die Im
munglobuline, die durch Immunisieren eines Versuchstiers mit
einer Mischung, die aus Zellwandproteinen, die aus jedem der
4 Typen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen wie
folgt CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534
zusammengesetzt ist, in einem Verhältnis von 1 : 1 : 1 : 1 erhalten
worden ist, eine beträchtliche therapeutische Wirkung auf Infek
tionen, die durch alle der Pseudomonas Aeruginosa-Stämme mit den
Fishertypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 hervorgerufen worden sind.
Dies ist das bevorzugte kombinierte Immunglobulin als therapeu
tisches Mittel zur Behandlung einer durch Pseudomonas Aeruginosa
hervorgerufenen Krankheit.
Das Immunglobulin für Pseudomonas Aeruginosa kann in ly
ophilisierter Form oder in einer flüssigen Form zu pharmazeu
tischen Zusammensetzungen formuliert werden und kann, falls
erforderlich, zusätzlich pharmazeutisch verträgliche Träger,
beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel, isotone
Mittel und dergleichen enthalten. Die pharmazeutisch zulässigen
Träger, die verwendet werden können, schließen vorzugsweise
Mannit, Laktose, Saccharose, Humanalbumin etc. im Fall von ly
ophilisierten Zubereitungen und physiologische Kochsalzlösung,
Wasser zur Injektion, Phosphat-Pufferlösung, Aluminiumhydroxid,
etc. im Fall von flüssigen Zubereitungen ein.
Die Dosierung des Immunglobulins variiert in Abhängigkeit
von Alter, Körpergewicht, Geschlecht und allgemeinem Gesund
heitszustand des Subjekts, der Schwere der Pseudomonas Aerugino
sa-Infektion und den Komponenten des verabreichten kombinierten
Immunglobulins. Das Immunglobulin wird allgemein in einer Menge
von 0,1 mg bis 100 mg, vorzugsweise 1 mg bis 100 mg pro Tag pro
kg Körpergewicht einem Erwachsenen intravenös verabreicht.
Aus jeder der 260 verschiedenen Blutproben, die von mit
Pseudomonas Aeruginosa infizierten Patienten genommen wurden,
wurde eine aliquote Menge von etwa 1 bis 5 ml aseptisch gesam
melt und eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachdem
das Blut über Nacht im Kühlschrank bei 4°C gelagert worden war,
wurde es mit 1500 × g (g:gravity) 10 Minuten bei 4°C zentrifu
giert, um die festen Bestandteile zu entfernen und ein überste
hendes Serum zu erhalten. Das erhaltene Serum wurde mit Phos
phat-Pufferlösung (NaH2PO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl
8,766 g pro Liter) in einem Verhältnis von 1 : 10 (Serum zu Lö
sung) verdünnt und dann auf einer Kulturschale mit tryptischem
Sojanährmedium mit zugesetzten 1,0 bis 1,5% Agar, das zuvor
hergestellt worden war, ausgestrichen. Die Kulturschale wurden
12 Stunden oder länger unter aeroben Bedingungen in einem Inku
bator bebrütet, der auf einer konstanten Temperatur von 37°C
gehalten wurde. Die so erhaltenen Kulturen wurden auf frische
Kulturschalen überführt und dann wurden die gewünschten Mikroor
ganismen mittels eines bekannten Isolationsverfahrens für Mikro
organismen in reinem Zustand isoliert [siehe Thomas D. Brock und
Michael T. Madigan, Biology of Microorganisms (1988), 5. Auf
lage, Seiten 32 bis 33, Prentive Hall, Englewood Cliffs, New
Jersey].
Die isolierten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme, ihre serolo
gischen und immunologischen Charakteristika sind bereits offen
bart worden (siehe Bergey's Manual) und ihre Identifizierung
kann unter Verwendung eines kommerziellen Analysesets gemäß dem
in J. Gen. Microbiol., 130, 631 bis 644, 1984, beschriebenen
analytischen Verfahren durchgeführt werden. Jeder Pseudomonas
Aeruginosa-Stamm wurde in ein Teströhrchen inokuliert, das 5 ml
tryptisches Sojanährmedium enthielt, und wurde dann bei 37°C
unter aeroben Bedingungen bebrütet, um die Konzentration an Bak
terienmasse so einzustellen, daß die Absorption auf ungefähr 2,0
oder mehr bei sichtbarem Licht von 650 nm gehalten wurde.
Eine aliquote Menge von 1 ml wurde dieser Kulturlösung
aseptisch entnommen und mit 6000 × g bei 4°C 10 Minuten lang zen
trifugiert. Die überstehende Kulturlösung wurde entfernt und die
ausgefällten Mikroorganismen wurden suspendiert, indem die glei
che Menge sterilisierter Kochsalzlösung zugegeben wurde. 15 µl
von jedem Testserum, das in dem Set und Kontrollserum (normalem
Kaninchenserum) enthalten war, wurden jeder Mulde einer 96-Mul
den-Mikroschale zugesetzt und mit 15 µl der oben erhaltenen Mi
kroorganismensuspension gemischt, um zu bestimmen, ob die Agglu
tinierung innerhalb von 10 bis 30 Minuten auftrat. Bei dieser
Untersuchung kann die Identifizierung der isolierten Mikroorga
nismen leicht erreicht werden, da der Mikroorganismusstamm in
einer Mulde mit positiver Agglutinierung einen Serotyp aufweist,
der mit dem des ihm zugesetzten Serums identisch ist.
Um die Pseudomonas Aeruginosa-Stämme abzuschwächen, um si
chere Mikroorganismen zur Verwendung bei der Herstellung eines
Impfserums zu erhalten, wurde ein Stamm für jeden der Pseudomo
nas Aeruginosa-Stämme mit unterschiedlichen Immuntypen ausge
wählt und dann durch wiederholte Reinigungen abgeschwächt.
Bei diesem Verfahren wurde zur Kontrolle ein toxischer
Pseudomonas Aeruginosa-Stamm GN 11 189 ausgewählt (Episome In
stitute, Japan), der eine Lethalitätsrate von 100% innerhalb
von 3 Tagen nach intravenöser (oder intraperitonaler) Injektion
von 2,0 × 106 Zellen GN 11 189 bei einer männlichen ICR-Maus mit
einem Gewicht von 20 bis 25 g zeigte.
Jeder Stamm der oben ausgewählten Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
me mit einem unterschiedlichen Immuntyp wurde in flüssigem
tryptischen Sojanährmedium unter den gleichen Bedingungen wie in
Beispiel 1 kultiviert und dann mit 6000 × g bei 4°C 10 Minuten
lang zentrifugiert. Der erhaltene Zellniederschlag wurde in 10 ml
physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, wieder unter den
gleichen Bedingungen wie oben zentrifugiert und dann mit fri
scher physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um den Zellgehalt
auf 5×105, 5×106, 5×107 und 5×108 Zellen pro ml einzustellen. Jede
Zellverdünnung wurde intravenös (oder intraperitoneal) einer
Gruppe verabreicht, die aus 10 ICR-Mäusen bestand. Der Kontroll
gruppe wurde der GN 11 189 Stamm in einer Menge von 2,0×106 Zellen
pro Kontrolltier verabreicht. An dem Punkt, wo die Lethalität
innerhalb der Kontrollgruppe innerhalb von 3 Tagen 100% betrug,
wurden Pseudomonas Aeruginosa-Stämme aseptisch aus ICR Mäusen
bzw. einer ICR-Maus isoliert, die mit der höchsten Zellkonzen
tration überlebte. Die isolierten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme
wurden wieder auf tryptischem Soja-Agar-Schalenmedium ausgestri
chen. Nach der Reinisolierungsmethode für Mikroorganismen wie
oben erwähnt wurde jeder Mikroorganismusstamm in reinem Zustand
isoliert.
Alle sieben (7) Sorten der ersten abgeschwächten Mikroorga
nismen wurden wiederholt durch ICR-Mäuse geleitet, etwa 3 bis 7 Mal
nach dem oben beschriebenen Verfahren, bis die gewünschte
LD50 von mindestens 2,0×107 Zellen für jeden Mikroorganismusstamm
erreicht worden war. Der Sicherheitswert für jeden am Ende abge
schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stamm, der als LD50 ausgedrückt
wird, ist in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.
Sicherheitswerte für erfindungsgemäß ausgewählte abge
schwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme
Sicherheitswerte für erfindungsgemäß ausgewählte abge
schwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme
Alle sieben (7) Arten von Mikroorganismen wie oben erwähnt
zeigten den LD50-Wert von mindestens 2,0×107 Zellen. Demnach kann
identifiziert werden, daß die abgeschwächten Mikroorganismen
ausgewählt worden waren.
Sterilisiertes Cetrimid 10% (Gew./Vol.) wurde einem flüs
sigen Nährmedium (pH-Wert 7,2 bis 7,4), das durch Dampfsterili
sieren für 15 Minuten bei 121°C in einem Autoklaven hergestellt
war, bis zu einer Endkonzentration von 0,3% (V/V) zugesetzt.
Eine aliquote Menge von 10 ml des so erhaltenen Mediums wurde
aseptisch entnommen und dann in ein Teströhrchen eingebracht, zu
dem ein Tropfen von jedem gemäß dem obigen Beispiel 2 in reinem
Zustand isolierten, abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stamm
inokuliert wurde, und dann wurde die Impfkultur 12 bis 16 Stun
den 30 bis 37°C unterworfen. Aus dem Teströhrchen, in dem die
Zucht der Mikroorganismen stattfand, wurden 0,5 ml Kulturlösung
entnommen, auf einer Schale mit Cetrimid-Agar-Medium als Pseudo
monas Aeruginosa-Isolierungsmedium ausgestrichen und dann wurde
die Platte bebrütet. Die zuerst durch Pigmentbildung als Pseudo
monas Aeruginosa identifizierte Kolonie wurde zum Nachweis von
Fluoreszein auf ein Pseudomonas Aeruginosa-Agarmedium überführt
und bebrütet (Proteose Pepton Nr. 3 (Oxoid) 2%, Glycerin (bide
stilliert) 1%, KH2PO4 (wasserfrei) 0,15%, MgSO4.7H2O 0,15%,
Agar 1,5% (Gew./Vol.), pH-Wert 7,2), und dann auf ein Pseudomo
nas Aeruginosa-Agarmedium zum Nachweis von Pyocyanin (Pepton
(Difco) 2%, Glycerin (bidestilliert) 1%, KH2PO4 (wasserfrei)
0,15%, MgCl2 (wasserfrei) 0,14%, Agar 1,5% (Gew./Vol.),
pH-Wert 7,2), und wurde dann wieder auf morphologischen Test, Nähr
stoffanforderungen und Oxidasetest untersucht, um die Anwesen
heit des Pseudomonas Aeruginosa-Stammes nachzuweisen. Die Typen
der ausgewählten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurden nach dem
IATS-Klassifikationssystem unter Verwendung des Pseudomonas
Aeruginosa-Antigensets (hergestellt von Difco Laboratories, De
troit, Michigan, USA) nachgewiesen und dann nach Fisher-Immuno-Se
rotypen klassifiziert. Die Resultate sind in der folgenden Ta
belle 3 beschrieben.
Kriterien zur Auswahl von Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
men und ihr Serotypbereich und Schutzbereich
Kriterien zur Auswahl von Pseudomonas Aeruginosa-Stäm
men und ihr Serotypbereich und Schutzbereich
- (1) Jeder der sieben Sorten von Pseudomonas Aeruginosa-Stäm men, die gemäß Beispiel 2 abgeschwächt sind, und die Wachs tumsraten in Abhängigkeit von unterschiedlichen pH-Werten wurden bestimmt. Jeder Mikroorganismusstamm wurde in 50 ml tryptische Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,2 inokuliert und dann 12 bis 16 Stunden bei 37°C unter aeroben Bedingungen mit einer Durchmischungsgeschwindigkeit von 200 UpM vorbebrütet. Jeder vorbebrütete Bakterienmassenstamm wurde in 500 ml jeweils fri scher tryptischer Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 3,0, 5,0, 7,0 und 9,0 in der Endkonzentration von 1% (V/V) inokuliert und dann in Fermentern bei 37°C unter den gleichen Bedingungen wie oben bebrütet. Während dieses Zeitraums wurde eine Probe von jedem Kulturmedium in einem Intervall von 2 Stunden genommen und dann wurde die Konzentration der Bakterienmasse bestimmt, indem die Adsorption der Probe bei 600 nm mit einem Spektrometer ge messen wurde. Die hieraus erhaltenen Resultate sind in der fol genden Tabelle 4 beschrieben.
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit vom
pH-Wert
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit vom
pH-Wert
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, wuchsen die abgeschwäch
ten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme nicht unter übermäßig sauren
Bedingungen, beispielsweise bei einem pH-Wert von 3,0, zeigten
aber im wesentlichen identische oder ähnliche Wachstumsraten un
ter mittleren Bedingungen bei pH-Werten von 5,0 bis 9,000. Daher
können erfindungsgemäß alle 7 Sorten von Mikroorganismen sehr
gut innerhalb eines weiten pH-Wertbereichs gezüchtet werden.
- (2) Gemäß dem gleichen Verfahren wie in (1) oben wurden die Wachstumsraten von Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen entsprechend den Temperaturvariationen bestimmt. Jede der 7 Sorten der abge schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurde in 50 ml trypti sche Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,0 inokuliert und dann 12 bis 16 Stunden unter aeroben Bedingungen bei 37°C mit einer Durchmischungsgeschwindigkeit von 200 UpM vorbebrütet. Je der vorbebrütete Bakterienmassenstamm wurde in 500 ml tryptische Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,0 inokuliert und dann in Fermentern bebrütet, die auf unterschiedlichen Temperaturen von 25°C, 30°C, 37°C und 42°C gehalten wurden. Während dieses Zeit raums wurde die Wachstumsrate in jedem Fermenter bestimmt, indem die Absorption der Kulturlösung bei 600 nm mit einem Spektrome ter gemessen wurde. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 5 beschrieben.
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit von
Temperaturvariationen
Mikroorganismenwachstumsraten in Abhängigkeit von
Temperaturvariationen
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, zeigten alle 7 Sorten
der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme das beste
Wachstum bei 37°C und zeigten auch gutes Wachstum bei 30°C,
25°C. Allerdings zeigte bei 42°C jeder der sieben Sorten der
Pseudomonas Aeruginosa-Stämme eine relativ langsame Wachstums
rate relativ zu der Wachstumsrate bei anderen Temperaturen.
- (3) Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Aus wirkung der Kohlenstoffquelle auf die Wachstumsrate der abge schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme zu bestimmen. Jeder der 7 Sorten der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurden in 50 ml tryptische Sojanährlösung mit einem pH-Wert von 7,0 ino kuliert und dann 12 bis 16 Stunden unter aeroben Bedingungen mit einer Durchmischungsrate von 200 UpM bebrütet. Das Kulturme dium wurde dann mit 6000 × g bei 4°C 10 Minuten lang unter asepti schen Bedingungen zentrifugiert, um die Bakterienmasse zu ern ten, die dann in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert wurde. Jeweils 50 µl der oben erhaltenen Mikroorga nismussuspensionen wurde entsprechend in 5 ml M9-Medium (Na2HPO4.7H2O 12,8 g, KH2PO4 3 g, NaCl 0,5 g, NH4Cl 1 g), das unterschiedliche Kohlenstoffquellen enthielt (siehe unten) ino kuliert und dann 12 Stunden bebrütet. Dann wurde für jede Kul turlösung das Ausmaß des Mikroorganismuswachstums bestimmt, indem die Absorption bei 600 nm gemessen wurde.
Wachstumscharakteristika von abgeschwächten Pseu
domonas Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von
der Kohlenstoffquelle
Wachstumscharakteristika von abgeschwächten Pseu
domonas Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von
der Kohlenstoffquelle
Die Wachstumscharakteristika von abgeschwächten Pseudomonas
Aeruginosa-Stämmen in Abhängigkeit von den Kohlenstoffquellen
zeigten ein Muster, das im wesentlichen ähnlich den Wachstums
charakteristika von allgemeinen Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen
in Abhängigkeit von den Kohlenstoffquellen ist (siehe Bergey's
manual). Allerdings soll angemerkt werden, daß selbst, wenn von
Pseudomonas Aeruginosa angegeben wird, daß er allgemein keine
Mannose verwendet, erfindungsgemäß abgeschwächte Pseudomonas
Aeruginosa etwas Wachstum in Mannose enthaltendem Medium zeig
ten.
Wie aus dem obigen ersichtlich ist, können erfindungsgemäß
abgeschwächte Pseudomonas Aeruginosa-Stämme in einem konventio
nellen Medium, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, an
organische Verbindungen, Aminosäuren, Vitamine und andere Nähr
stoffe enthält, unter aeroben Bedingungen bei ausgewählter Tem
peratur, ausgewähltem pH-Wert, etc. bebrütet werden, um eine
Bakterienmasse zu erhalten. Zellwandproteine aus der resultie
renden Bakterienmasse werden zur Herstellung von Pseudomonas
Aeruginosa-Impfseren verwendet.
Als Kohlenstoffquelle zum Bebrüten von abgeschwächten Pseu
domonas Aeruginosa-Stämmen können verschiedene Kohlenhydrate wie
Glukose, Mannit, Fruktose, etc., verschiedene organische Säuren
wie Essigsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und dergleichen
verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene orga
nische und anorganische Ammoniumsalze, Pepton, Hefeextrakte, Ca
seinhydrolysate und die anderen stickstoffhaltigen Substanzen
verwendet werden. Als anorganische Verbindungen können Magnesi
umsulfat, Calciumcarbonat, Eisen(II)sulfat, Kupfersulfat, Zink
sulfat und Kaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat
und dergleichen verwendet werden. Das Bebrüten wird vorzugsweise
bei 25°C bis 37°C unter aeroben Bedingungen durchgeführt, bei
spielsweise mit einer Schalenkultur oder einer Flüssigkultur wie
einer Schüttelkultur oder Belüftungskreiselkultur. Der pH-Wert
des Mediums wird vorzugsweise während des Bebrütungszeitraums
auf einem Wert von 5 bis 9 gehalten. Vorzugsweise wird die Bak
terienmasse, die durch Zentrifugieren einer Kulturlösung, die 12
bis 16 Stunden bebrütet wurde, erhalten wurde, als Ausgangsmate
rial zur Herstellung von Impfseren wie nachfolgend beschrieben
verwendet.
- (1) In einem 5 L-Fermenter wurde die gemäß Beispiel 2 erhal tene Bakterienmasse von Pseudomonas Aeruginosa zur Massenproduk tion wir folgt bebrütet. 2,5 L der Mediumlösung, die durch Auf lösen von 30 g tryptischer Sojanährlösung pro Liter destillier tem Wasser auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt wurden, wurden sterilisiert und dann in den 5 L Fermenter eingebracht. Die Be brütungsbedingungen waren: die Bebrütungsstemperatur war 37°C, Belüftungsrate war 1 VVM, Inokuliermenge war 5% (V/V) der gemäß Beispiel 2 erhaltenen abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Bak terienmasse der Kulturlösung, und die Durchmischungsrate wurde während der ersten zwei Stunden auf 100 UpM gehalten und nach folgend wurde das Bebrüten 12 bis 16 Stunden mit der festgeleg ten Durchmischungsrate von 600 UpM fortgesetzt. Obwohl die Men gen der erhaltenen Bakterienmasse in Abhängigkeit von dem Typ des Pseudomonas Aeruginosa-Stammes etwas unterschiedlich waren, betrug die durchschnittliche Ausbeute ungefähr 8 g (Trockenge wicht) Bakterienmasse pro Liter Kulturlösung.
- (2) Jeder der sieben Typen der abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme wurde unter den gleichen Bebrütungsbedingungen wie in dem obigen (1) bebrütet, außer daß das Spezialmedium zur Kultur von Pseudomonas Aeruginosa, das aus Glukose (30 g/l), Pepton (15 g/l), MgSO4 (0,5 g/l), CaCO3 (5 g/l) KH2PO4 (1 g/l), FeSO4 (5 mg/l), CuSO4 (5 mg/l) und ZnSO4 (5 mg/l) als Medium ver wendet wurde. Mit diesem Spezialmedium wurden ungefähr 10,4 bis 10,5 g (Trockengewicht) Bakterienmasse für jeden Mikroorganis musstamm erhalten. So kann die Verwendung dieses Spezialmediums die Ausbeute an Bakterienmasse liefern, die mindestens 30% (be zogen auf das Trockengewicht) höher als die in tryptischem Soja nährmedium ist.
Zur Herstellung von Impfseren gegen Pseudomonas Aeruginosa
wurden Zellwandproteine aus jedem der sieben Sorten der abge
schwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme teilweise gereinigt.
Nachfolgend wird der Typ-3-Stamm, d. h. CFCPA 30 720 (KCCM 10 031)
als typisches Beispiel verwendet. Allerdings können die anderen
abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämme auch dem gleichen
Verfahren wie dem folgenden Reinigungsverfahren unterworfen wer
den, um die teilweise gereinigten Zellwandproteine zu erhalten.
2,5 l des Spezialmediums wie in Beispiel 4 (2) verwendet
wurde in einem 5 L Fermenter eingebracht und dann 12 bis 16
Stunden bebrütet, während die gleichen Bebrütungsbedingungen wie
oben aufrechterhalten wurden. Nach Beendigung des Bebrütens wur
den 2,5 L der Kulturlösung mit 6000 × g bei 4°C 20 Minuten lang
zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Die
ausgefällten Zellen wurden in einer Phosphat-Pufferlösung
(Na2HPO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter,
pH-Wert 7, 2) erneut suspendiert, erneut zentrifugiert und dann
mit der gleichen Phosphat-Pufferlösung gewaschen. Zu 130 g der
so erhaltenen Zellen wurden 3 Volumina (etwa 390 ml) Aceton, be
zogen auf das Originalvolumen der nassen Zellen, gegeben und
dann wurde die Mischung 12 Stunden oder länger bei 4°C stehen
gelassen. Das Aceton wurde von den ausgefällten Zellen entfernt
und 2 Volumina (etwa 260 ml) frisches Aceton, bezogen auf das
Originalvolumen der nassen Zellen, wurden wieder zu dem Rück
stand gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 bis 10 Minuten
gerührt und dann bei 4°C 20 Minuten lang mit 8000 × g zentrifu
giert. Das überstehende Aceton wurde entfernt und dem Rückstand
wurde das gleiche Volumen an Aceton zugegeben. Die Mischung wur
de nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben gerührt und
zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Die
ausgefällten Zellen wurden auf einer Schale bei Raumtemperatur
getrocknet, um das Aceton zu entfernen. Die getrockneten Mikro
organismen wurden erneut suspendiert, indem 250 ml der gleichen
Phosphat-Pufferlösung wie oben zugegeben wurden, so daß die End
konzentration auf 10% (V/V) eingestellt werden kann. Die resul
tierende Mischung wurde in einem Homogenisierer mit der Ge
schwindigkeit von 500 bis 1500 UpM 10 Minuten lang behandelt,
während die Temperatur auf 4°C gehalten wurde, um Zellwandpro
teine zu extrahieren. Die erhaltene Suspension wurde mit 8000
bis 10 000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende
Flüssigkeit zu erhalten. Die ausgefällten Zellen wurden abge
trennt, erneut durch Zugabe des gleichen Volumens an Phosphat-
Pufferlösung suspendiert und dann unter den gleichen Bedingungen
wie bei der obigen ersten Extraktion einer zweiten Extraktion
unterworfen, um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten.
Unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie bei dem er
sten Extraktionsverfahren wurden die Zellwandproteine wiederholt
5 bis 6 Mal extrahiert, während darauf geachtet wurde, keine der
Zellen zu zerstören (zu lysieren). Die Zerstörung der Zellen
kann bestimmt werden, indem ein bestimmtes Protein als Marker
der Cytoplasmasubstanz gemessen wird, d. h. Laktat-Dehydrogenase
oder Hexokinase. Die extrahierten Überstände, von denen jeder
getestet wurde, um sicherzustellen, daß die Zellwandproteine
ohne Einbringung von Cytoplasmaproteinen, Laktat-Dehydrogenase
und Hexokinase extrahiert sind, wurden gesammelt, gerührt und
dann schließlich erneut mit 10000 × g bei 4°C 30 Minuten lang
zentrifugiert, um eine klare überstehende Lösung zu erhalten.
Die so erhaltene Proteinlösung war nur aus im wesentlichen rei
nen Zellwandproteinen zusammengesetzt und wurde mit quantitati
ver Proteinanalyse eingestellt, so daß die Proteinkonzentration
auf einem Niveau von 1 mg/ml bis 2 mg/ml gehalten wurde. Außer
dem wurde die Reinheit der Proteinlösung mittels Elektrophorese
mit einem Konzentrationsgradienten von 10 bis 15% bestimmt. Als
Resultat konnte identifiziert werden, daß die Anwesenheit der
gewünschten Zellwandproteine mit dem Molekulargewicht im Bereich
von 10 000 bis 100 000 vorlag (siehe Fig. 1).
Das folgende Verfahren wurde durchgeführt, um die rohe
Zellwandproteinlösung in der Konzentration von 1 bis 2 mg/ml zu
reinigen, damit sie nur die wirksamen Komponenten enthielt.
2 bis 2,5 L rohe Zellwandproteinlösung wurde zuerst einem
Membranfilter zum Abtrennen des Molekulargewichtbereichs über
100 000 in dem Pellicon-Cassettensystem unterworfen, um Protein
moleküle mit einem Molekulargewicht von über 100 000 zu entfer
nen. Gemäß diesem Verfahren wurden Proteine mit einem Moleku
largewicht unter 100 000 als Filtrat gewonnen und Proteine mit
einem Molekulargewicht größer als 100 000 wurden kontinuierlich
zirkuliert, um sie von den kleinen Molekülen mit einem Moleku
largewicht unter 100 000 abzutrennen.
Als Resultat wurde die Proteinlösung um 10 bis 20% des
Ausgangsvolumens konzentriert und wurde nachfolgend mit 20 bis
25 L (der zehnfachen Menge des Anfangsvolumens der Proteinlö
sung) sterilisierter Phosphat-Pufferlösung (Na2HPO4 1,15 g, KCl
0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter) gewaschen, um 90%
oder mehr der Proteine mit einem Molekulargewicht unter 100 000
zu gewinnen. Die Proteine mit einem Molekulargewicht unter
100 000, die als Filtrat abgetrennt wurden, wurden in dem glei
chen System einem Membranfilter zum Abtrennen des Molekularge
wichts von 10 000 unterworfen, um Proteine mit einem Molekular
gewicht von weniger als 10 000 und andere Verunreinigungen abzu
trennen und gleichzeitig die Proteine mit einem Molekulargewicht
von 10 000 bis 100 000 bis auf eine Konzentration von 1 mg/ml
anzureichern.
Schließlich wurde der Überstand ultrazentrifugiert, um Li
popolysaccharide (LPS) und mit der Zellwand verknüpfte Fragmente
zu entfernen, die möglicherweise in dem oben erhaltenen Über
stand in Spurenmengen vorhanden sind. Das Ultrazentrifugieren
wurde 3 Stunden bei 4°C mit 180 000 × g bis 200 000 × g durchge
führt. Nach Entfernung der Niederschläge wurde der erhaltene
Überstand durch Filtration durch 0,2 µm-Filter sterilisiert, um
250 bis 260 mg Proteinzusammensetzung zur Verwendung in Impf
seren zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas Aeruginosa-Infektion
zu erhalten.
Die verbleibenden sechs Sorten von erfindungsgemäß abge
schwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, d. h. CFCPA 10 142,
CFCPA 20 215, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243, CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018,
wurden gemäß dem gleiche Verfahren behandelt, wie in Bei
spiel 5, Beispiel 6 und Beispiel 7 zur Bebrütung und Reinigung
von Mikroorganismen zur Herstellung der Impfserumzusammensetzung
beschrieben ist. Die so erhaltenen fertigen Pseudomonas aerugi
nosa-Impfserumzusammensetzungen zeigten das gleiche Bandspektrum
wie das CFCPA 30 720 SDS-Blatt. Zusätzlich konnte als Resultat
des Vergleichs mit Standard-Molekulargewichtmarker bestimmt wer
den, daß alle in den Impfserumzusammensetzungen vorhandenen Pro
teine das Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000
aufweisen (Fig. 1).
Die von jedem abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stamm
abgeleiteten Zellwandproteine wurden nach den Abtrenn- und Rei
nigungsstufen gemäß den in den Beispiele-n 7 und 8 beschriebenen
Verfahren 6 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen mit einem Gewicht
von 23 bis 25 g in einer Menge von 0,2 mg/kg intraperitoneal
verabreicht, um das Tier zu immunisieren. Jede Gruppe bestand
aus 10 bis 15 Versuchstieren. Eine Woche nach der Immunisierung
wurde 2 bis 3 Mäusen pro Gruppe Blut für den ELISA-Test entnom
men (Enzyme-linked Immunosorbens-Test (Enzymverknüpfter Immuno
sorbens-Test)). Den verbleibenden ICR-Mäusen wurde ein wilder
Pseudomonas aeruginosa-Stamm entsprechend dem jeweiligen Immun
typ in einer Menge von dem 10 bis 50 fachen des Anfangs-LD50-Werts
für jeden in Tabelle 2 in Beispiel 2 aufgeführten Mikroor
ganismusstamm injiziert. Die Schutzwirksamkeit gegen jeden Pseu
domonas aeruginosa-Stamm wurde kontinuierlich eine Woche lang
untersucht. Als Resultat zeigten alle Testgruppen eine Schutz
wirkung gegen die entsprechenden Pseudomonas aeruginosa-Stämme
und die ELISA-Ergebnisse von allen gesammelten Blutproben zeig
ten auch gute positive Werte, die eine Verbesserung der Immun
antworten anzeigen.
In der vorliegenden Erfindung wurden zur Herstellung von
Impfseren, die in der Lage sind, eine allgemeine Schutzwirkung
gegen Infektionen zu zeigen, die durch einen beliebigen Typ von
Pseudomonas aeruginosa-Stämmen hervorgerufen werden, vier Typen
von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen (drei Typen
von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen, die am häufigsten bei Infek
tionen des menschlichen Körpers nachgewiesen werden und ein Typ
eines Pseudomonas aeruginosa-Stammes, der schwierig zu überwin
den ist, wenn er beteiligt ist, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215,
CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534) behandelt, um Zellwandproteine zu
erhalten, die in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen kom
biniert wurden und dann auf Kreuz-Schutzkapazität gegen jeden
Immuntyp von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen untersucht wurden.
Aus den vier Typen von abgeschwächten Pseudomonas aerugino
sa-Stämmen wie oben angegeben abgetrennte Zellwandproteine wur
den in einem Verhältnis von äquivalenten Mengen (1 : 1 : 1 : 1), bezo
gen auf das Gewicht, kombiniert. Die kombinierten Zellwandpro
teine wurden männlichen ICR-Mäusen intraperitoneal verabreicht,
um die Versuchstiere zu immunisieren. Der Kontrollgruppe wurden
0,3 ml Phosphat-Pufferlösung (NaH2PO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4
0,2 g, NaCl 8,766 g pro Liter) verabreicht. Eine Woche nach der
Immunisierung wurde jeder der Testgruppe, die mit Pseudomonas
aeruginosa-Impfserum immunisiert worden war und der Kontroll
gruppe, die mit Phosphat-Pufferlösung immunisiert worden war,
peritoneal Pseudomonas aeruginosa in fünf (5) unterschiedlichen
Konzentrationen gegeben, die in einer Zehnerreihe von 1×108 Zel
len bis 1×104-Zellen verdünnt worden war, und nach einer Woche
wurde die Anzahl der überlebenden Tiere gezählt, um den Wirksam
keitsindex (EI) zu bestimmen. Die Resultate hiervon sind nach
folgend in Tabelle 7 aufgeführt, in der der Wirksamkeitsindex
als Wert von LD50 in der Testgruppe, geteilt durch die LD50 in der
Kontrollgruppe, definiert ist. Wie aus Tabelle 7 ersichtlich
hatte ein Impfserum, das aus Zellwandproteinen bestand, die aus
4 Sorten von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen er
halten worden waren, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720
und CFCPA 60 534, einen El-Wert von 3,0 bis 18 oder mehr gegen
jeden Immuntyp der Pseudomonas aeruginosa-Stämme. Daher es wird
in Anbetracht dessen, daß Impfseren mit einem EI-Wert von minde
stens 2 als eine gute immunologische Wirkung aufweisend angese
hen werden, als ersichtlich betrachtet, daß das Impfserum eine
gute Schutzwirkung gegen Infektionen aufweist, die von jedem
beliebigen Typ der 7 Sorten von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen
hervorgerufen werden.
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas
aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von vier
(4) unterschiedlichen Spezies hergestellt ist, gegen
jeden TIP von Mikroorganismen
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas
aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von vier
(4) unterschiedlichen Spezies hergestellt ist, gegen
jeden TIP von Mikroorganismen
Gemäß dem Verfahren wie oben erwähnt wird, außer daß die
hergestellte Mischung von Zellwandproteinen aus 3 Typen von ab
geschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen CFCPA 10 142, CFCPA 30 720
und CFCPA 20 215 (Gruppe I) abgeleitet war und die Mischung
aus Zellwandproteinen aus allen 7 Typen der abgeschwächten Pseu
domonas aeruginosa-Stämme hergestellt worden war, wobei alle der
Zellwandproteine in einem Verhältnis äquivalenter Mengen vorhan
den sind, anstelle der Mischung aus 4 Sorten Proteinen verwendet
werden, die über Kreuz schützende Kapazität dieser beiden Sorten
von Impfseren gegen Infektion von jedem Pseudomonas aeruginosa
untersucht. Die Resultate hiervon sind in Tabelle 8 beschrieben.
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas
aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von drei
(3) Typen (Gruppe I) oder 7 Typen (Gruppe II) abge
schwächter Pseudomonas aeruginosa-Stämme hergestellt
ist, gegen jeden Typ von Mikroorganismen
Über Kreuz schützender Kapazitätstest für Pseudomonas
aeruginosa-Impfserum, das unter Verwendung von drei
(3) Typen (Gruppe I) oder 7 Typen (Gruppe II) abge
schwächter Pseudomonas aeruginosa-Stämme hergestellt
ist, gegen jeden Typ von Mikroorganismen
Wie aus den obigen experimentellen Resultaten ersichtlich
ist, zeigt dieses Impfserum eine hervorragende Schutzwirkung
gegen jeden Immuntyp von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich mit
nur einer Sorte allgemeinem Antigen, weil das Impfserum mit
gemischten Proteinkomponenten aus Zellwandproteinen hergestellt
ist, die aus mindestens drei (3) unterschiedlichen Sorten von
abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämmen mit voneinander
verschiedenen Immuntypen hergestellt sind. Das bedeutet daß,
obwohl der Wirksamkeitsindex des erfindungsgemäßen Impfserums
mit der Sorte und Anzahl der gewählten Mikroorganismen der abge
schwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämme, Mischverhältnissen der
daraus abgeleiteten Zellwandproteine, immunologischen Schemata
und Verfahren, etc. variiert, bestätigt werden kann, daß das
Impfserum gegen alle Pseudomonas aeruginosa-Stämme, die derzeit
in Krankenhäusern und bei Patienten auftreten, wirksam ist.
Zur Herstellung eines Komponentenimpfserums zur Prophylaxe
gegen durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufene Infektion wur
de die Sicherheit der Zellwandproteine selbst, die als Komponen
tenserum verwendet werden sollen, sowie die Sicherheit der Mi
kroorganismenstämme selbst, wie in Beispiel 2 beschrieben, si
chergestellt werden. In diesem Beispiel wurden Zellwandproteine
teilweise gereinigt und dann in einem Versuchstier, d. h. einer
Maus, auf ihre Sicherheit untersucht. Spezifisch wurde jeder der
abgeschwächten Mikroorganismen mit tryptischer Sojanährlösung
als Kulturmedium in einem 5-L-Fermenter bebrütet und dann gemäß
den in den Beispielen 5, 6 und 7 beschriebenen Verfahren behan
delt. Die Überstände der aus den abgeschwächten Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen extrahierten Zellwandproteine wurden zusammen
gesammelt, wieder bei 4°C 30 Minuten lang mit 10000 × g zentrifu
giert, um möglicherweise in der Lösung vorhandene feine Teilchen
zu entfernen. Die resultierenden Zellwandproteine wurden durch
einen Amicon-Membranfilter filtriert, um eine Mischung von Zell
wandproteinen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000
bis 100 000 zu erhalten, die auf eine Proteinkonzentration von
1 mg/ml aufkonzentriert und dann mit einem 0,2 µm-Filter steri
lisiert wurde, um eine Proteinquelle für toxikologische Unter
suchungen zu erhalten.
Bei dem toxikologischen Test waren die verwendeten Ver
suchstiere männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis
22 g. Die Proteinquelle wurde der Versuchsgruppe intravenös in
einer Menge von 20 mg/kg und 100 mg/kg injiziert. Der Kontroll
gruppe wurde physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 25 ml/kg
gegeben. Wie aus Tabelle 9 und der angefügten Fig. 2 er
sichtlich ist, zeigte die Versuchsgruppe eine geringfügige Hem
mung der Gewichtszunahme am ersten Tag nach der Verabreichung,
zeigte aber am und nach dem zweiten Tag ein normales Wachstum
und keine speziellen Symptome. Zusätzlich konnten selbst am
7. Tag und danach in keinem Organ spezifische Veränderung oder
Symptome nachgewiesen werden.
Akuter toxikologischer Test für die Zellwandprotein
quelle von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stäm
men
Akuter toxikologischer Test für die Zellwandprotein
quelle von abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stäm
men
Durch teilweise Reinigung von abgeschwächten Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 er
haltene Zellwandproteine wurden als Antigen verwendet und wurden
in einer Menge von 0,1 mg/kg oder 0,2 mg/kg intravenös in
ICR-Mäuse injiziert, um die Versuchstiere zu immunisieren. Eine
Woche nach der Immunisierung wurde eine bestimmte Menge Blut von
jeder Maus der Mäusegruppe entnommen, das Serum wurde aus dem
gesammelten Blut abgetrennt und die Bildung des Antikörpers wur
de gemäß dem ELISA-Verfahren [J. Clin Microbiol. 15, 1054 bis
1058, 1982] bestimmt.
Zuerst wurden 100 µl des gemäß Beispiel 10 hergestellten
Antigens, das in einem Beschichtungspuffer (0,05 M Carbonat-Puf
ferlösung, die aus 2,85 g NaHCO3, 1,70 g Na2CO3 und 1 H2O
zusammengesetzt war, pH-Wert 9,6) auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml
eingestellt worden war, zu jeder Mulde einer 96-Mulden-Mi
kroplatte gegeben und dann entweder 2 Stunden bei Raumtemperatur
oder 12 bis 14 Stunden bei 4°C umgesetzt, damit das Protein an
der Platte haftete.
Nach Entfernen der wäßrigen Lösung wurden 1% Rinderserum
albumin (BSA, bovine serum albumin) zu jeder Plattenmulde gege
ben und dann eine Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt, um den
verbleibenden Anteil in den Mulden zu blockieren, der nicht an
Protein gebunden war.
Bei diesem Test wurde Serum einer nicht-immunisierten Maus
als Antikörper für die Kontrollgruppe verwendet. Nach Beendigung
der Umsetzung wurde die Platte wiederum 5 bis 6 mal mit Phos
phat-Pufferlösung (pH-Wert von 7,0 bis 7,2) gewaschen und 100 µl
eines zweiten Antikörpers, d. h. Kaninchen-Antimaus-Ig-Peroxida
se-Konjugat, zu jeder Mulde gegeben und bei Normaltemperatur
eine Stunde reagieren gelassen.
Danach wurde die Platte 7 mal oder öfter mit der gleichen
Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7,0 bis 7,2) kräftig gewaschen.
Als Substrat wurden 50 µl ortho-Phenylendiamindihydrochlorid,
das auf eine Konzentration von 0,3 bis 0,4 mg/ml in Citrat-Phos
phat-Pufferlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH-Wert 5,0)
eingestellt war, zu jeder Mulde der Platte gegeben und 20 Minu
ten in Abwesenheit von Licht umgesetzt. Dann wurden jeweils 50 µl
1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Umsetzung in jeder Mulde
abzubrechen. Dann wurde für jede Reaktionslösung die Absorption
bei 490 nm mit einem Spektrometer gemessen.
Bildung von Antikörper gegen Zellwandproteine von
jedem Mikroorganismus (490 nm)
Bildung von Antikörper gegen Zellwandproteine von
jedem Mikroorganismus (490 nm)
Wie aus Tabelle 10 ersichtlich ist, führt in der Versuchs
gruppe die Verabreichung von 0,1 bis 0,2 mg/kg Antigen zu einer
2 bis 5 mal höheren Immunität als in der Kontrollgruppe.
Die in Beispiel 7 erhaltene Proteinlösung wurde Kaninchen
verabreicht, um das entsprechende Immunglobulin zu produzieren.
Obwohl das aus dem abgeschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stamm
CFCPA 30 720 erhaltene Zellwandprotein als typisches Beispiel
verwendet wurde, kann das gleiche Verfahren auf die anderen ab
geschwächten Pseudomonas aeruginosa-Stämme angewendet werden.
0,5 bis 1 ml (die 100 bis 200 mg Zellwandprotein enthiel
ten) der Zellwandproteinlösung, die in Beispiel 7 aus dem
CFCPA-Stamm 30 720 erhalten worden war, wurden verwendet, um Albino
kaninchen drei Mal in Intervallen von 7 Tagen zu inokulieren.
Das Blut wurde in regelmäßigen Intervallen von jedem Kaninchen
genommen und das Serum wurde abgetrennt. 100 ml des abgetrennten
Kaninchenserums wurden mit 300 ml destilliertem Wasser gemischt
und die Mischung wurde bei 4°C zu 500 g (Naßgewicht) DEAE-Cellu
lose gegeben. Die resultierende Mischung wurde eine Stunde bei
4°C gründlich geschüttelt, stehen gelassen und danach wurde der
Überstand abgetrennt und entfernt. Der verbleibende Rückstand
wurde drei Mal mit jeweils 200 ml 0,01 M Phosphat-Pufferlösung
(1,15 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4, 0,2 g KCl, 8,766 g NaCl pro Liter,
pH-Wert 8,0) gewaschen, um 600 mg Immunglobulin IgG mit einer
Reinheit von 96% oder mehr zu erhalten.
Es wurden die therapeutischen Wirkungen auf die Pseudomonas
aeruginosa-Infektion für Immunglobuline gegen Pseudomonas aeru
ginosa-Stämme, die in Beispiel 12 oben erhalten wurden, gemäß
der folgenden Weise untersucht. Nachfolgend wurden 10 Mäuse in
jeder Gruppe verwendet.
1,0 bis 3,0×106 Zellen von jedem der pathogenen Pseudomonas
aeruginosa-Stämme der Fisher-Immuntypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7
wurden in jede Maus intraperitoneal injiziert, um die Pseudomo
nas aeruginosa-Infektion hervorzurufen. Innerhalb von 2 bis 6
Stunden nach der Injektion wurde das gereinigte Immunglobulin in
einer Menge von 0,1 bis 2 mg pro Maus intravenös in jede Maus
injiziert, um dessen therapeutische Wirkung zu untersuchen.
Der Kontrollgruppe wurden 0,5 ml physiologische Kochsalzlö
sung zur Injektion anstelle des Immunglobulins injiziert. Bei
diesem Test waren die verwendeten Immunglobuline CFCPA 10 142,
CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534 oder eine Mischung die
ser 4 Sorten von Immunglobulinen im Verhältnis äquivalenter Men
gen.
Als Resultat zeigte die Kontrollgruppe, die nur physiologi
sche Kochsalzlösung erhielt, eine Lethalitätsrate von 50% oder
mehr innerhalb von 48 Stunden und 100% nach 72 Stunden. Die
Versuchsgruppe, die das entsprechende Immunglobulin erhielt,
zeigte hingegen eine Überlebensrate von 80% oder mehr nach
72 Stunden. Demnach konnte gezeigt werden, daß das Immunglobulin
zur Behandlung der durch den pathogenen Pseudomonas aeruginosa-Stamm
hervorgerufenen Infektion mit dem entsprechenden Fisher-Immun
typ wirksam ist. Allerdings besaß kein einzelnes Immunglo
bulin eine Wirkung auf eine Infektion, die durch pathogene Pseu
domonas aeruginosa-Stämme mit den Fisher-Immuntypen 4 und 5 her
vorgerufen wurde.
Andererseits zeigte die Mäusegruppe, die die Kombination
aus 4 Sorten Immunglobulinen im Gewichtsverhältnis von 1 : 1 : 1 : 1
erhielt, aufgrund ihrer Kreuzreaktivität selbst auf die Fisher
Typen 4 und 5 der Pseudomonas aeruginosa-Stämme eine hervorra
gende therapeutische Wirkung. Demnach kann die kombinierte Im
munglobulinzusammensetzung als therapeutisches Mittel verwendet
werden, das gegen Infektionen wirksam ist, die von Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen mit allen Fisher-Immuntypen hervorgerufen
worden sind. Die Resultate dieses Experiments sind in den Ta
bellen 11 und 12 zusammengefaßt.
Immunologische Schutzwirkung durch Verwendung von
individuellen oder in Kombination verwendeten
Immunglobulinen
Immunologische Schutzwirkung durch Verwendung von
individuellen oder in Kombination verwendeten
Immunglobulinen
Wechselseitige Beziehung von immunologischem
Schutz von Immunglobulin gegen Pseudomonas aeru
ginosa-Stämme
Wechselseitige Beziehung von immunologischem
Schutz von Immunglobulin gegen Pseudomonas aeru
ginosa-Stämme
4 Sorten in Beispiel 13 ausgewählter abgeschwächter Pseudo
monas aeruginosa-Stämme, d. h. CFCPA 10 142, CFCPA 20 215,
CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534, wurden bebrütet und nach den gleichen
Verfahren wie in den Beispielen 5, 6 und 7 extrahiert, um die
kombinierte Zusammensetzung der Zellwandproteine zu erhalten,
die dann drei Mal in Intervallen von einer Woche in einer Menge
von 1,5 mg bis 2 mg gemäß der gleichen Weise wie in Beispiel 13
in Ziege inokuliert wurden, um die kombinierten Pseudomonas
aeruginosa-Immunglobuline in einer größeren Menge zu erhalten,
die gemäß dem bekannten Verfahren gereinigt wurde [siehe Practi
cal Immunology, 3. Ausgabe (1989), Seiten 292 bis 294].
Um die immunologische Schutzwirkung und die therapeutische
Wirkung des gereinigten und kombinierten Immunglobulins zu be
stimmen, das zuvor aus pathogenem Pseudomonas aeruginosa der
verschiedenen Fisher-Immuntypen erhalten wurde, wurden pathogene
Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit jeden Immuntyp in eine Mäuse
gruppe (sechs Gruppen, 20 Mäuse pro Gruppe), in die zuvor die
kombinierte Immunglobulinzusammensetzung drei Mal injiziert wor
den war, und in eine weitere Mäusegruppe (sechs Gruppen, 10 Mäu
se pro Gruppe, die keine Immunglobulinzusammensetzung erhalten
hatten) in einer Menge von 1,0 bis 3,0×106 Zellen pro Maus inoku
liert, um die immunologischen Schutzwirkung des kombinierten Im
munglobulins zu beobachten. Zusätzlich wurden in eine weitere
Mäusegruppe (sechs Gruppen, 10 Mäuse pro Gruppe) zuerst ein pa
thogener Pseudomonas aeruginosa-Stamm inokuliert und nach 2 bis
6 Stunden die oben erhaltene kombinierte Immunglobulinlösung in
einer Menge von 0,1 bis 5 mg pro Maus mit einem Gewicht von 20
bis 25 g intravenös injiziert, um die therapeutische Wirkung der
Immunglobulinzusammensetzung zu beobachten.
Als Ergebnis hiervon konnte gezeigt werden, daß die kom
binierte Immunglobulinzusammensetzung eine immunologische
Schutzwirkung von 80% oder mehr und eine therapeutische Wirkung
von 75% oder mehr (bestimmt als Überlebensrate (%) nach 7 Ta
gen) zeigten, während alle aus der Kontrollgruppe innerhalb von
3 Tagen gestorben waren.
Demnach kann bestimmt werden, daß die kombinierte Immunglo
bulinzusammensetzung als nützliches medizinisches Mittel ver
wendet werden kann, das sowohl eine hervorragende therapeutische
Wirkung als auch eine immunologische Schutzwirkung zeigt.
Die Kombination von Zellwandproteinen, die durch Bebrüten
und Extrahieren von 4 Sorten abgeschwächter Pseudomonas aerugi
nosa-Stämme, die in Beispiel 13 ausgewählt worden waren, d. h.
CFCPA 10 142, CFCPA 20 215, CFCPA 30 720 und CFCPA 60 534, gemäß der
gleichen Weise wie in den Beispielen 5, 6 und 7 erhalten worden
waren, wurden männlicher Ziege in der gleichen Weise wie in Bei
spiel 14 verabreicht, um das kombinierte Pseudomonas aeruginosa-Im
munglobulin zu erhalten, das abgetrennt und gereinigt wurde
und dann unter Verwendung verschiedener pharmazeutisch verträg
licher Träger formuliert wurde, so daß 1 bis 100 mg Antikörper-Immun
globulin pro kg Körpergewicht verabreicht werden können.
Das formulierte Immunglobulin wurde mit Pseudomonas aeruginosa
infizierter Maus verabreicht, um die Wirksamkeit des Immunglobu
lins in Abhängigkeit von den für das Immunglobulin verwendeten
Trägersorten zu bestimmen. Als Resultat hiervon zeigte im Fall
der flüssigen Formulierung die Immunglobulinzubereitung mit phy
siologischer Kochsalzlösung zur Injektion oder mit Phosphat-Puf
ferlösung als Träger eine hohe Wirksamkeit, und im Fall der lyo
philisierten Formulierung lieferte die Verwendung von Mannit,
Saccharose oder Lactose als Träger die hohe Wirksamkeit der Im
munglobulinzubereitung. Andererseits verringert in einer lyophi
lisierten Formulierung die Verwendung von Humanalbumin zusammen
mit Pseudomonas aeruginosa-Immunglobulin die Wirksamkeit des Im
munglobulins, und im Fall der flüssigen Formulierung zeigt die
Verwendung von Aluminiumhydroxid als pharmazeutischer Träger
eine geringe Wirksamkeit. Die Testergebnisse sind in Tabelle 13
zusammengefaßt.
Wirksamkeit von Pseudomonas aeruginosa-Immunglo
bulin in Abhängigkeit von pharmazeutischen Trä
gern
Wirksamkeit von Pseudomonas aeruginosa-Immunglo
bulin in Abhängigkeit von pharmazeutischen Trä
gern
Das mit einer Phosphat-Pufferlösung formulierte Immunglobu
lin wie identifiziert, um die hohe Wirksamkeit des Testergebnis
ses aus Beispiel 15 zu liefern, wurde untersucht, um die Wirk
samkeit als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für eine
sekundäre Hautinfektion bei Zerreißung, Verbrennung, Trauma und
dergleichen zu bestimmen. Eine Maus erhielt eine Verbrennung ge
mäß dem Verbrennungstestverfahren [siehe j. Infect. Dis. 131,
688 bis 691, 1975]. Die flüssige Zubereitung, die 0,5 bis 1 mg
kombiniertes Pseudomonas aeruginosa-Immunglobulin auf 1 ml Phos
phat-Pufferlösung enthielt, wurde zu einem Spray formuliert, das
dann auf den verbrannten Teil der Maus in der Testgruppe auf ge
bracht wurde, um dessen Wirkung im Vergleich mit dem der Kon
trollgruppe ohne Behandlung mit dem immunglobulin-Spray zu be
stimmen. Als Ergebnis dieses Versuchs zeigte die Mäusegruppe,
die mit dem immunglobulin-Phosphat-Pufferlösung-Spray behandelt
worden war, beträchtlich höhere Überlebensraten als die nicht
behandelte Kontrollgruppe. Demnach kann gezeigt werden, daß die
Immunglobulin gegen Pseudomonas aeruginosa enthaltenden Formu
lierungen eine hervorragende Schutzwirkung und eine hervorragen
de therapeutische Wirkung auf die Pseudomonas aeruginosa-Infek
tion haben. Das Resultat dieses Experiments ist in der folgenden
Tabelle 14 beschrieben.
Resultat des Verbrennungstests
Resultat des Verbrennungstests
Wie oben beschrieben wird jeder Pseudomonas aeruginosa-Stamm
als sicher relativ zu den wilden oder pathogenen Spezies
betrachtet. Zusätzlich können, da ihre Zellwandproteine eine
hervorragende Sicherheit und über Kreuz schützende Eigenschaft
und auch eine hervorragende Kapazität zur Bildung neutralisie
render Antikörper zeigen, die Zellwandproteine nicht nur als
Impfserum zur Prophylaxe gegen die Pseudomonas aeruginosa-Infek
tion, sondern auch als Antikörper-Stimulator in dem Versuchstier
verwendet werden, um Immunglobulin herzustellen, das als thera
peutisches Mittel für die Pseudomonas aeruginosa-Infektion ver
wendet werden kann. So ist ersichtlich, daß die abgeschwächten
Pseudomonas aeruginosa-Stämme sehr nützliche Mikroorganismen zur
Herstellung eines prophylaktischen Impfserums und eines thera
peutischen Mittels gegen die Pseudomonas aeruginosa-Infektion
sind.
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisie
rung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen, bei dem in
den folgenden Schritten
- a) reine isolierte Zellen von abgeschwächten Pseudomonas Aeruginosa-Stämmen zubereitet werden;
- b) die Mikroorganismuszellen mit einem organischen Lö sungsmittel behandelt werden, um die Zellen zu inakti vieren und Lipidkomponenten zu entfernen;
- c) die so behandelten Mikroorganismuszellen einer Extrak tion unterzogen werden, um ein Zellwandprotein zu erhalten;
- d) der erhaltene Extrakt einer Fraktionierung und Reini gung durch Ultrafiltration und/oder Ultrazentrifugie rung unterzogen wird, um eine spezielle Proteinfrak tion auszuwählen;
- e) die ausgewählte Proteinfraktion zurückgewonnen wird und
- f) unter Verwendung der ausgewählten Proteinfraktion ein Impfserum zubereitet wird,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in
Schritt c) die in Schritt b) behandelten Mikroorganismus
zellen in eine Pufferlösung gegeben werden, worauf die sich
ergebende Mischung stehen gelassen und sanft gerührt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei
4°C mit einem Mischer oder Homogenisator gerührt wird, der
mit 100 bis 2000 U/Min. betrieben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Pufferlösung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus
einer Phosphat-Pufferlösung und einer Tris-Pufferlösung.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß wäh
rend oder nach dem Schritt c) der Extrakt dahingehend un
tersucht wird, ob die Mikroorganismuszellen zerstört wur
den, indem die Anwesenheit von Laktat-Dehydrogenase oder
Hexokinase als Marker-Enzym des Cytoplasmas bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
in Schritt a) verwendeten Stämme ausgewählt werden aus der
Gruppe bestehend aus Pseudomonas Aeruginosa CFCPA 10 142,
CFCPA 20 215, CFCPA 30 720, CFCPA 40 057, CFCPA 50 243,
CFCPA 60 534 und CFCPA 70 018.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
in Schritt b) verwendete organische Lösungsmittel ausge
wählt wird aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Chloroform,
Ethanol und Butanol.
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CN114763544A (zh) * | 2021-01-15 | 2022-07-19 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种铜绿假单胞菌高产蛋白菌株的生物诱变方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3816260A (en) * | 1971-03-29 | 1974-06-11 | Kikkoman Shoyu Co Ltd | Bacterial cellwall lytic enzyme and process for producing the same |
US3928565A (en) * | 1971-10-19 | 1975-12-23 | Yuzuru Homma | Pharmaceutical preparation of pseudomonas aeruginosa bacterial component possessing anti-tumor and anti-infection properties |
US3987164A (en) * | 1970-10-20 | 1976-10-19 | Yuzuru Homma | Method for prevention of pseudomonas aeruginosa infections |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3829616C2 (de) * | 1988-09-01 | 1996-08-29 | Behringwerke Ag | Lipoprotein I (OMPI) von Pseudomonas aeruginosa |
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1994
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Patent Citations (3)
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US3816260A (en) * | 1971-03-29 | 1974-06-11 | Kikkoman Shoyu Co Ltd | Bacterial cellwall lytic enzyme and process for producing the same |
US3928565A (en) * | 1971-10-19 | 1975-12-23 | Yuzuru Homma | Pharmaceutical preparation of pseudomonas aeruginosa bacterial component possessing anti-tumor and anti-infection properties |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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