SE507114C2 - Nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar - Google Patents
Nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarInfo
- Publication number
- SE507114C2 SE507114C2 SE9500418A SE9500418A SE507114C2 SE 507114 C2 SE507114 C2 SE 507114C2 SE 9500418 A SE9500418 A SE 9500418A SE 9500418 A SE9500418 A SE 9500418A SE 507114 C2 SE507114 C2 SE 507114C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- pseudomonas aeruginosa
- cfcpa
- strains
- kccm
- cell wall
- Prior art date
Links
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 208
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 119
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 59
- 208000032536 Pseudomonas Infections Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 45
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 9
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims description 4
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 claims 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 claims 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 claims 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 107
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 15
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 21
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 13
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 10
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 9
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N pyocyanin Chemical compound CN1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CC=CC2=O YNCMLFHHXWETLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101000957351 Homo sapiens Myc-associated zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 208000034693 Laceration Diseases 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100038750 Myc-associated zinc finger protein Human genes 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108700027479 Syntex adjuvant formulation Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N aldehydo-D-xylose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-aminopropionic acid Natural products NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 229960002798 cetrimide Drugs 0.000 description 1
- 239000001982 cetrimide agar Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910000336 copper(I) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- WIVXEZIMDUGYRW-UHFFFAOYSA-L copper(i) sulfate Chemical compound [Cu+].[Cu+].[O-]S([O-])(=O)=O WIVXEZIMDUGYRW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N ketorolac tromethamine Chemical class OCC(N)(CO)CO.OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
507114 2 sätt. Ett sådant klassificeringssystem klassificerar stammarna i sju (7) typer enligt Fisher immunotyp. Ett annat system är baserat på 0-antigengruppen enligt förslag av Terada. Ytter- ligare ett annat system är klassificeringssystemet enligt Inter- national Antigenic Typing Scheme (IATS). Vad gäller klassifice- ringssystem är de Pseudomonas aeruginosa stammar som oftast förekommer hos Pseudomonas aeruginosa infekterade patienter: 5/2a, 2c, 3, 7/3a, 3c, 1/4a, 4b, 6/Sa, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /ll och 3,7/3d, 3e typer enligt Fisher immuno- typ/0-serotyp, med 3, 7, 2 och 1 typer som Fisher immunotyp (motsvarande 3a, 3c, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a och 4b som 0-serotyp) som i huvudsak finns närvarande.
Ett sätt att behandla Pseudomonas aeruginosa infektioner neutraliserar Pseudomonas aeruginosa toxiner med antitoxiner.
Antitoxinet är emellertid ett terapeutiskt medel som endast hjälper på patienter som redan lider av septicemi och har in- gen profylaktisk effekt. Vidare är det antitoxin som för när- varande finns tillgängligt mycket dyrbart och användningen därav är begränsad. Vidare är den mest betydande olägenheten som åtföljer användningen av antitoxinet den relativt låga botningsgraden och åtföljande allvarliga bieffekter.
En metod som undersökes i syfte att undvika de nackdelar som är förknippade med antitoxinet använder ett gemensamt antigen för att förhindra och behandla Pseudomonas aeruginosa infektio- ner. Metoder som undersökes för att erhålla det gemensamma anti- genet kan generellt klassificeras i två grupper. Den första me- toden avser användning av ett gemensamt antigen som separeras och renas från Pseudomonas aeruginosa stammar med olika immuno- typer som ett profylaktiskt vaccinantigen mot Pseudomonas aeru- ginosa infektioner [Japan, J. Exp. Med. 45, 355-359, 1975]. Den andra metoden avser användning av gemensam antigenmassa som bil- dats genom användning av genteknik varvid en gen som kodar för det önskade antigenet isoleras och införes i en lämplig vektor för framställning av en rekombinant vektor och därefter omvand- las den lämpliga värden med den bildade rekominanta vektorn och inkuberas för att uttrycka det önskade antigenet. Även om utvecklingen av ett profylaktiskt vaccin som ut- nyttjar ett gemensamt antigen i teorin är en mycket effektiv metod tyder för närvarande fortskridandet av undersökningen 507114 3 avseende denna metod på att denna metod har många problem som ännu ej kunnat lösas. Den största olägenheten är att det gemen- samma antigenet inte kan förhindra alla typer av Pseudomonas aeruginosa som har olika immunotyper och att dess effektivitet därför är extremt låg. En sådan låg effektivitet tyder på att förekomsten av ett annat okänt större antigen, förutom det gemensamma antigenet kan framkalla en effektiv profylaktisk effekt.
En annan metod för behandling av Pseudomonas aeruginosa infektion är administration av antibiotika eller kemoterapeu- tiska medel med en bredpektrad selektivitet för Pseudomonas aeruginosa stammen. Eftersom det finns ett flertal Pseudomonas aeruginosa stammar och dessa i allmänhet har en mycket hög grad av läkemedelsresistens har emellertid många patienter dukat under för Pseudomonas aeruginosa stammar som ej kan behandlas effektivt med antibiotika.
Vidare har en metod som utnyttjar terapeutiskt immunoglobu- lin utvecklats. Sådant immunoglobulin uppvisar emellertid föga eller ingen terapeutisk effekt på samtliga Pseudomonas aerugi- nosa infektioner och har således endast använts för mycket be- gränsade typer av Pseudomonas aeruginosa infektioner. Detta be- ror huvudsakligen på att immunoglobulinet framställts enligt en metod för framställning av en polyklonal antikropp mot en viss mikroorganism och därför inte kan fungera gemensamt på de många Pseudomonas aeruginosa stammarna.
Försök har gjorts att utveckla ett billigt terapeutiskt me- del med musmonoklonala antikroppar [J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985] eller humana monoklonala antikroppar [FEMS Microbiol. Im- munol. 64, 263-268, 1990] mot Pseudomonas aeruginosa. Här kan cell-linjer selekteras att producera de mest effektiva neutrali- serande antikropparna från en cellbank med cellfusionsteknik och därefter kan en cell-linje användas som utgångsmaterial för framställning av den önskade antikroppen i industriell skala.
Denna metod syftar emellertid till behandling av Pseudomonas aeruginosa infektion genom antikroppsproduktion och inte till profylaktiska vacciner. Vidare har denna metod olägenheten att eftersom alla infektioner orsakas av olika Pseudomonas aerugi- nosa stammar med olika serologiska och immunologiska typer, de ej alla kan behandlas med endast en typ av monoklonal antikropp. 507114 4 Dvs monoklonal antikroppsterapi kan inte utnyttjas effektivt för behandling av samtliga Pseudomonas aeruginosa infekterade patienter.
För att bredda den effektiva behandlingen enligt denna metod har man utvecklat en samtidig administration av flera typer av antikroppar på basis av den undersökta korsreaktiviteten därav.
Härvid uppsamlas blod från Pseudomonas aeruginosa infekterade patienter och undersökes i syfte att identifiera den serologiska och/eller immunologiska typen av de infekterande Pseudomonas ae- ruginosa stammarna. Därefter administreras monoklonala antikrop- par som är lämpliga för den identifierade typen till patienten.
Denna metod kräver emellertid mycket tid och är därför ej möjlig att använda på patienter vars tillstånd kräver omedelbar behand- ling.
Tidigare har användning av cellväggproteiner separerade från Pseudomonas aeruginosa stammar som antigen för ett vaccin före- slagits [se Vaccine, Vol. 7, “Experimental studies on the pro- tective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine", 1989].
Den metod som föreslagits i ovanstående referens utnyttjar dock fyra (4) typer av allmänna Pseudomonas aeruginosa stammar, näm- ligen NN 170041, NN 170015, NN 868 och NN 170046 som ej är för- svagade och därför föreligger ett problem vad gäller toxiciteten av Pseudomonas aeruginosa stammarna i sig. Eftersom vidare, vid framställning av ett proteinkomponentvaccin från sådana Pseudo- monas aeruginosa stammar, celler kan förstöras som till mediet frigör främmande nukleinsyror och toxiska högmolekulära sub- stanser, lipopolysackarider (LPS), som finns närvarande i cyto- plasman. Dessa substanser införlivas då i det bildade vaccinet som föroreningar vilket medför att ökad försiktighet krävs vid administration av vaccinet och eventuellt en begränsning av användningen därav. s av en Föreliggande uppfinnare har ägnat mycket forskning åt att hitta ett sätt att effektivt inducera antikroppar mot_Pseudo- monas aeruginosa och uppnå god immunogen (dvs antigen) aktivitet med extremt låg risk som härrör från konstitutiv toxicitet från Pseudomonas aeruginosa stammarna i sig. Föreliggande uppfinnare har även kunnat bekräfta att då Pseudomonas aeruginosa stammar 5Û7 114 5 isolerade från Pseudomonas aeruginosa infekterade patienter klassificeras i sju (7) arter baserade på immunotyp och därefter varje ren stam_försvagas genom att organismen flera gånger brin- gas att passera genom en lämplig djurvärd nya, säkra och försva- gade Pseudomonas aeruginosa stammar kan erhållas. Dessa stammar har cellväggproteiner som inte endast är användbara för fram- ställning av ett vaccin för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektioner, utan som också kan användas som antikroppinduce- rande medel för framställning av immunoglobuliner mot Pseudo- monas aeruginosa infektion i djurkroppen. Erhållna immunoglobu- liner uppvisar överlägsen terapeutisk effekt mot olika Pseudo- monas aeruginosa infektioner, inklusive allvarliga fall, enligt föreliggande uppfinning.
Ett syfte med föreliggande uppfinning är därför att åstad- komma en ny och säker, försvagad Pseudomqnas aeruginosa stam med cellväggproteiner som uppvisar antigenicitet utan toxiciteten av själva Pseudomonas aeruginosastammen.
Ytterligare ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett vaccin som inducerar ett immunsvar som för- hindrar efterföljande sjukdom orsakad av Pseudomonas aeruginosa i en patient som erhåller vaccinet.
Ytterligare ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla en metod för framställning av vaccinet.
Ytterligare ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett terapeutiskt medel för behandling av Pseudomonas aeruginosa infektion som omfattar minst ett immuno- globulin för Pseudomonas aeruginosa stammen.
Ytterligare ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla en metod för framställning av immunoglobulinet.
Ovan har några av de mest relevanta syftena med förelig- gande uppfinning skisserats. Dessa syften bör konstrueras så att de endast åskådliggör några av de mest relevanta känneteck- nen och användningarna av uppfinningen. Många andra fördelaktiga resultat kan uppnås genom tillämpning av den beskrivna uppfin- ningen på olika sätt eller genom modifiering av uppfinningen inom ramen för beskrivningen. Andra syften och en grundligare förståelse av uppfinningen kan följaktligen uppnås genom hän- visning till sammanfattningen av uppfinningen och den detalje- rade beskrivningen som beskriver den föredragna utföringsformen 507 114 6 förutom omfattningen av uppfinningen som definieras av kraven tillsammans med bifogade ritningar. §ammanfattning av uppfinningen En utföringsform av föreliggande uppfinning avser nya, säkra och effektiva försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar med cellväggproteiner som ger antigenicitet utan toxiciteten av Pseudomonas aeruginosa stammen i sig. Speciellt avser förelig- gande uppfinning säkra försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar som erhållits genom isolering av Pseudomonas aeruginosa stammar från patienter infekterade med Pseudomonas aeruginosa, klassifi- cering av de isolerade mikroorganismstammarna i sju typer av arter enligt Fisher-Devlin immunotyp, selektion av en enda rep- resentativ stam för varje immunotyp, rening av den utvalda stammen genom upprepade injektion/isolering/âterinjektion-steg i försöksdjur och selektering av den mest försvagade stammen, för var och en av sju typer av Pseudomonas aeruginosa stammar.
Ytterigare en utföringsform av föreliggande uppfinning avser ett nytt vaccin och ett förfarande för framställning av vaccinet för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektion. Vaccinet framställes genom separering av cellväggproteiner i ett väsent- ligen rent tillstånd från var och en av sju (7) typer av säkra försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar som beskrivits ovan och vidare rening av de separerade cellväggproteinerna och därefter, lämpligen, sammanslagning av de renade cellvägg- proteinerna som härrör från minst 3 typer av försvagade Pseudo- monas aeruginosa stammar. Lämpligen användes ekvivalenta mängder av cellväggproteiner från var och en av de 3 typer som användes för framställning av vaccinet enligt föreliggande uppfinning.
En annan utföringsform av föreliggande uppfinning är ett te- rapeutiskt medel för Pseudomonas aeruginosa infektion, som inne- håller minst ett immunoglobulin som producerats genom odling av minst en säker försvagad Pseudomonas aeruginosa stam, separering av cellväggproteinet, rening av det separerade cellväggprotei- net och efterföljande injektion av det rena cellväggproteinet som ett antikroppsinducerande medel i försöksdjur för att in- ducera immunoglobulinet, samt en metod för framställning av det terapeutiska medlet.
De mest relevanta och viktiga kännetecknen för föreliggande 5Û7 114 7 uppfinning har angivits ovan för att den detaljerade beskriv- ningen av uppfinningen som följer skall kunna förstås bättre och detta bidrag till tekniken uppskattas till fullo. Ytterligare kännetecken för uppfinningen som beskrives i det följande utgör föremål för kraven enligt uppfinningen. Fackmannen inser att idén och den specifika utföringsform som beskrives här lätt kan utnyttjas som grund för att modifiera eller konstruera andra strukturer för att utföra samma syften som föreliggande upp- finning. Fackmannen inser vidare att sådana ekvivalenta kon- struktioner inte avviker från innebörden och omfattningen av uppfinningen som den anges i kraven.
Kor; beskrivning av ritningarna För att noggrant kunna förstå naturen och föremålen för upp- finningen hänvisas till följande detaljerade beskrivning samt bifogade ritningar på vilka: Fig. 1 visar resultatet av SDS-PAGE av renade cellväggpro- teiner som separerats från försvagade Pseudomonas aeruginosa- stammar enligt föreliggande uppfinning; Fig. 2 är ett diagram som visar viktändringen i hanmöss vari cellväggproteinet av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar enligt uppfinningen injekterats intravenöst. gästa sätt att utföra uppfinningen Fisher-Devlin immunotyper av Pseudomonas aeruginosa klassas i sju typer, typ 1 till typ 7. I föreliggande uppfinning väljes Pseudomonas aeruginosa stammar med Fisher immunotyp 1 till 7 som stammar för försvagning, baserat på det faktum att de kan påvi- sas i blod från huvuddelen, dvs 90-95% eller fler, av med Pseu- domonas aeruginosa infekterade patienter. Speciellt är bland de sju (7) typerna av Pseudomonas aeruginosa typ 1 och typ 3 de mest frekvent påvisade stammarna i Pseudomonas aeruginosa infekterade patienter. Vad som anges i föreliggande uppfinning kan emellertid användas mot varje stam av Pseudomonas aeruginosa för att ge skydd eller behandling.
Säkra försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar enligt före- liggande uppfinning kan erhållas genom isolering av var och en av sju (7) typer av Pseudomonas aeruginosa stammar i rent till- stånd från blod från patienter som fastställts ha Pseudomonas 507114 8 aeruginosa infektion och efterföljande försvagning av de isole- rade stammarna genom upprepade reningsförfaranden. De så erhåll- na säkra försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna är alla sju (7) typer och betecknas CFCPA 10142 (Fisher typ 1), CFCPA 20215 (Fisher typ 2), cFcPA 30720 (Fisher typ s) , cFcPA 40057 (Fisher typ 4), cFcPA 50243 (Fisher typ s), cFcPA 60534 (Fisher typ 6) respektive CFCPA 70018 (Fisher typ 7). CFCPA är här en akronym för "Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa", som är sammansatt av Cheil Food and Chemicals Inc., där uppfinnarna enligt föreliggande uppfinning är anställda, och namnet på stammen i fråga, Pseudomonas aeruginosa.
De försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar som erhållits genom upprepade reningsförfaranden som beskrivits ovan har feno- typer och mikrobiologiska egenskaper som väsentligen är iden- tiska med desamma för motsvarande moderstammar, men uppvisar nya egenskaper som är användbara för framställning av ett vaccinan- tigen för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektion snarare än en eventuell patogenicitet som föreligger hos moderstammarna före försvagning. De försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna enligt föreliggande uppfinning betraktas följaktligen som nya mikroorganismstammar. Dessa stammar har därför deponerats vid Korean Culture Center of Microorganisms i the Korean Federation of Culture Collections, i det följande KCCM, som internationellt deponeringsinstitut enligt Budapestkonventionen den 12 maj 1993 under accessionsnumren KCCM 10029 för CFCPA 10142, KCCM 10030 för CFCPA 20215, KCCM 10031 för CFCPA 30720, KCCM 10032 för CFCPA 40057, KCCM 10033 för CFCPA 50243, KCCM 10034 för CFCPA 60534 och KCCH 10035 för CFCPA 70018.
Reningsförfarandena för framställning av de försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna utföres upprepade gånger tills stammarna uppvisar önskade LD50-värden. Även om antalet renings- förfaranden eller steg varierar beroende på teknikerns skicklig- het, toxiciteten av moderstammen och liknande utföres renings- steget lämpligen 3 till 7 gånger, t ex tills LD5° för Pseudomonas aeruginosa är minst 2 x 107 celler. LDSO-nivån hos så erhållna nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar enligt föreliggan- de uppfinning är i mus lämpligen 2,0 x 107 celler eller mer.
Enligt föreliggande uppfinning erhålles ett vaccin för immunisering mot Pseudomonas aeruginosa infektion och som fram- 507 114 9 ställes genom separering av cellväggproteiner i rent tillstånd från var och en av de nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna enligt föreliggande uppfinning som erhållits ovan och efterföljande fortsatt rening av de separerade cellväggprotei- nerna, och kombination av så erhållna renade cellväggproteiner i ett visst blandningsförhållande, lämpligen i ekvivalenta mäng- der cellväggproteiner från var och en av de önskade Pseudomonas aeruginosa stammarna som man söker immunisering emot. Detta innebär att den mängd som användes för varje stam är densamma som är tillräcklig för att inducera immunisering mot denna stam i en speciell värdtyp.
Föreliggande uppfinning tillhandahåller vidare en metod för framställning av vacciner för immunisering mot Pseudomonas aeru- ginosa, som kännetecknas av att försvagade Pseudomonas aerugi- nosa stammar inkuberas i fermentatorer under bibehållande av op- timala tillväxtbetingelser för erhållande av en massa av Pseudo- monas aeruginosa stam. Den erhållna massan av mikroorganismer behandlas enligt en serie procedurer som omfattar extraktion av cellväggproteiner genom behandling med organiskt lösningsmedel, fraktionering baserad på molekylvikt, ultracentrifugering, så att önskade cellväggproteiner erhålles. Erhållna cellväggpro- teiner från den sju (7) typerna av försvagade Pseudomonas aeru- ginosa stammar slås samman med varandra med en lämplig samman- sättning i önskat förhållande, lämpligen i ekvivalenta mängder.
Metoden för framställning av vacciner enligt föreliggande uppfinning som beskrivits ovan kan sammanfattas enligt följande. 507 114 10 Tabell 1. förfaranden för separering och rening av cellväggproteiner från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar och för fran- ställning av vacciner Odling av sju (7) typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar L Separering av mikroorganismceller Separerade celler + organiskt lösningsmedel i Extraktion av cellväggproteiner i Första fraktionering genom molekylvikt (ultrafiltrering) W Andra fraktionering genom molekylvikt (ultrafiltrering) I Ultracentrifugering (180.000 g) i Separerade cellväggproteiner (molekylvikt 10.000 << 100.000) Pseudomonas aeruginosa vaccin I det följande kommer vaccinkompositionerna enligt före- liggande uppfinning att förklaras närmare under hänvisning till metoden för framställning därav.
För framställning av vacciner för profylax mot Pseudomonas aeruginosa enligt föreliggande uppfinning inkuberas i det första steget sju (7) typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stam- mar, nämligen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 Och CFCPA 70018 Søm var Och en inkuberas i en fermentor av lämplig storlek. Som odlingsmedium för detta syfte lämpar sig tryptisk sojabuljong eller, före- 507 114 11 trädesvis, ett specialmedium som beskrives nedan, för inkube- ring av Pseudomonas aeruginosa såsom beskrivits ovan.
Specialmediet omfattar glukos (30 g/l), pepton (15 g/1), MgS04 (0,5 g/l), CaCO3 (S g/1), KHZPO4 (lg/1), FeSO¿ (5 mg/l), CuS04 (5 mg/l) och ZnS04 (5 mg/1). Detta specialmedium är unikt utformat av föreliggande uppfinnare för odling av Pseudomonas aeruginosa stammar och är nytt. Detta specialmedium ligger följaktligen inom ramen för föreliggande uppfinning. Då Pseudo- monas aeruginosa stammar odlas i specialmediet blir utbytet av bakteriemassan minst 30% högre än den bakteriemassa som odlas i tryptisk sojabuljong baserat på vikten av torr bakteriemassa.
Användning av ett sådant specialmedium utgör därför en före- dragen utföringsform.
I ett sådant bakteriemasseinkubationssteg är de optimala odlingsbetingelserna: temperatur 37°C, luftningshastighet 1 vvm (volym/volym.minut) och ympvolym 5% v/v av odlingsmedie- lösningen, och inkubationen utföres med omröringshastigheten 100 varv/min i först 2 timmar och därefter vid 600 varv/min i 20 timmar, lämpligen i 12 till 16 timmar.
Då inkubationen avslutats separeras i det andra steget de utfällda bakteriecellerna från odlingslösningen med hjälp av centrifugering eller liknande. De separerade bakteriecellerna behandlas i det tredje steget med ett organiskt lösningsmedel för att inaktivera mikroorganismerna och samtidigt avlägsna cellvägglipidkomponenter. I det tredje steget väljes det or- - ganiska lösningsmedlet lämpligen ur den grupp som består av aceton, kloroform, etanol, butanol etc., varvid aceton före- drages.
Därefter omfattar det fjärde steget en upprepad extraktion av cellväggproteiner, nämligen 5-6 extraktioner, under det att cellerna i sig ej förstöres så att cellinnehållet går förlorat.
För detta syfte bibehålles mikroorganismcellerna i en lösning som fosfatbuffertlösning, trisbuffertlösning och liknande, lämpligen i fosfatbuffertlösning, och agiteras med en blandare eller homogenisator så att cellväggproteinerna extra-heras.
Extraktionen utföres lämpligen genom omröring vid 100 till 2.000 varv/min vid 4°C. Dessutom bör i det fjärde steget speciella försiktighetshetsåtgärder vidtagas för att förhindra förstöring av cellerna så att de önskade cellväggproteinerna kan hållas 507 114 12 åtskilda från de toxiska proteiner som finns närvarande i cyto- plasman. Under extraktionsförfarandet blir det således nödvän- digt att kontinuerligt bestämma om cellerna förstöres eller ej genom bestämning av förekomsten av laktatdehydrogenas eller hexokinas som ett cytoplasmiskt markörenzym.
Därefter fraktioneras cellväggproteinerna i de försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna som erhållits i en supernatant enligt ovanstående förfarande genom att dessa utsättes för en första och andra ultrafiltrering för erhållande av enbart pro- teiner med en molekylvikt mellan 10.000 och 100.000. I detta steg är det mycket viktigt att en molekylvikt av erhållna cell- väggproteiner ligger i området 10.000 till 100.000. Skälet för detta är att en molekylvikt av cellväggproteiner som understiger 10.000 ej ger den önskade profylaktiska effekten bestämd genom djurförsök, under det att en molekylvikt högre än 100.000 kan orsaka toxiska effekter som beror på närvaro av högmolekylära lipopolysackarider (LPS).
De separerade cellväggproteinerna från var och en av sju (7) typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa med en molekylvikt mellan 10.000 och 100.000 renas vidare genom ultracentrifugering för avlägsnande av eventuella mindre lipopolysackarider som kan finnas närvarande. Därefter utföres ett steg för att avlägsna eventuella bakteriella substanser så att man slutligen erhåller cellväggproteiner från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar som är icke-patogena och som har tillräcklig renhet för att kunna användas som ett vaccin för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektion.
De cellväggproteiner som erhålles från de sju (7) typerna av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar slås därefter samman i ett visst förhållande för formulering av vaccinet. Då man beak- tar frekvensen av förekomst av sjukdom från moderstammarna av Pseudomonas aeruginosa före försvagning bör kombinationen av cellväggproteiner göras genom blandning av cellväggproteiner som erhållits från minst tre (3) typer, hellre fyra (4) typer eller mer, och helst samtliga sju typer av Pseudomonas aeruginosa stammar. Även om blandningsförhållandet varierar med typen av Pseudomonas aeruginosa stammar från vilka cellväggproteinerna som skall slås samman erhållits blandas cellväggproteinerna lämpligen i ett förhållande av ekvivalenta mängder. 507 114 13 Föredragna vaccinkompositioner enligt föreliggande upp- finning är exempelvis sådana som innehåller cellväggproteiner ernånlna från cFcPA 10142, cFcPA 20215, cFcPA 30720 och cFcPA 60534 i ett blandningsförhållande av 1:1:1,5:0,5; 1:1:1:1 eller 0,5:1,5:1,5:0,5 eller ett vaccin som innehåller samtliga cell- Väggproteiner från CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 Och CFCPA 70018 i ett bland- ningsförhållande av väsentligen ekvivalenta mängder. Den minsta mängden cellväggproteinblandning från var och en av de stammar av Pseudomonas aeruginosa som finns närvarande i vaccinet är den minsta mängd som är tillräcklig för att inducera immunisering i den avsedda värden/patienten.
Om så önskas kan vaccinet för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektion enligt föreliggande uppfinning, förutom cellväggproteinkomponenterna som erhållits enligt ovan, inne- hålla farmaceutiskt godtagbara hjälpämnen, t ex kalciumhydroxid, kalciumfosfat, ISCOM (immunostimulerande komplex), SAF-1 (Syntex adjuvansformulering-1) SAFm (modifierad Syntex adjuvansformule- ring) och liknande hjälpämnen som är kända för fackmannen.
För användning som ett profylaktiskt vaccin mot Pseudomo- nas aeruginosa infektion varierar den dos som skall administre- ras med kön, ålder, vikt, hälsotillstånd etc, hos de individer som kan exponeras för Pseudomonas aeruginosa, men är i allmänhet 0,5 till 2,5 mg av blandningen av cellväggproteiner från var och en av de försvagade stammarna. Denna mängd erhålles i allmänhet från en bakteriemassa med en torrvikt av 0,1 g till 0,5 g (mot- svarande en våtvikt av 0,5 till 2,5 g). Det föredragna admini- strationssättet är genom intramuskulär injektion.
Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning kan det cellväggprotein som erhålles i rent tillstånd från den försvaga- de Pseudomonas aeruginosa stammen enligt föreliggande uppfinning också användas som en antikroppinducerande substans för att in- ducera immunoglobulin i försöksdjur. Föreliggande uppfinning tillhandahåller därför ett terapeutiskt medel för behandling av Pseudomonas aeruginosa infektion, som innehåller ett immunoglo- bulin producerat genom injektion av cellväggprotein i ett rent tillstånd som erhållits genom separering och rening såsom an- givits ovan, i ett försöksdjur för att inducera produktion av ett immunoglobulin och Pseudomonas aeruginosa. 507 114 14 Speciellt är det separerade och renade cellväggprotein som erhållits enligt förfaranden som åskådliggjorts specifikt ovan, från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar enligt förelig- gande uppfinning ett antigen som användes för att ympa försöks- djur, såsom får, kanin, etc, för att inducera bildande av den besläktade antikroppen. Blod uppsamlas från försöksdjuret och därefter separeras serumet. Det serum som separerats behandlas på känt sätt så att man erhåller det önskade immunoglobulinet i renat tillstånd. För detta ändamål kan separering och rening av immunoglobuliner från det separerade serumet utföras enligt me- toder som är välkända inom området [se Practical Immunology, 3:e uppl. (1989), 292-294], till exempel genom blandning av det separerade serumet med destillerat vatten, tillsats av bland- ningen till DEAE-cellulosa (dietylaminoetylcellulosa) så att immunoglobulinet får absorberas, avlägsnande av supernatanten och efterföljande tvättning av ímmunoglobulinabsorberad DEAE- cellulosa flera gånger med fosfatbuffertlösning så att man erhåller ett renat immunoglobulin.
Det immunoglobulin som användes i det terapeutiska medlet för behandling av Pseudomonas aeruginosa infektion erhålles genom immunisering av ett försöksdjur med en blandning som innehåller cellväggproteiner separerade från olika försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar i ett visst förhållande. I detta syfte kan man använda ett kombinerat immunoglobulin som erhållits genom immunisering av försöksdjuret med en blandning som består av vart och ett av cellväggproteiner erhållna från var och en av de sju (7) typerna av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar i ett visst förhållande, lämpligen i ett förhållande av ekviva- lenta mängder. Då korsreaktiviteten för vart och ett av immuno- globulinerna beaktas ger emellertid de immunoglobuliner som erhållits genom immunisering av ett försöksdjur med en blandning som består av cellväggproteiner separerade från var och en av 4 typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar enligt föl- jande: CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 och CFCPA 60534 och i ett förhållande av 1:1:1:1 en betydande terapeutisk effekt på infektioner orsakade av samtliga Pseudomonas aeruginosa stammar med Fisher typ 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7. Detta är det föredragna kombinerade immunoglobulin terapeutiska medlet för behandling av en sjukdom orsakad av Pseudomonas aeruginosa. 507 114 15 Immunoglobulinet för Pseudomonas aeruginosa enligt före- liggande uppfinnng kan formuleras till farmaceutiska komposi- tioner i lyofiliserad form eller i flytande form och, om så er- fordras, dessutom innehålla farmaceutiskt godtagbara bärare, till exempel stabilisatorer, konserveringsmedel, isotonimedel och liknande. De farmaceutiskt godtagbara bärare som kan an- vändas omfattar lämpligen till exempel mannitol, laktos, sacka- ros, humant albumin etc. vad gäller lyofiliserade preparat och fysiologisk salin, vatten för injektion, fosfatbuffertlösning, aluminiumhydroxid etc vad gäller flytande preparat.
Immunoglobulindosen varierar beroende på ålder, kroppsvikt, kön och allmänt hälsotillstånd hos individen, allvarligheten av Pseudomonas aeruginosa infektionen och komponenterna i det kom- binerade immunoglobulin som administreras. Immunoglobulinet ad- ministreras i allmänhet i en mängd av 0,1 mg till 1.000 mg, lämpligen 1 mg till 100 mg, per dag per kg kroppsvikt till en vuxen via intravenös väg.
Föreliggande uppfinning kommer att åskådliggöras närmare med hjälp av följande exempel men är ej på något sätt begränsad till exemplen.
Exempel 1: Isolering av Pseudomonaa aeruginosa stam från Pseudomonaa aeruginosa infekterade patienter och identifiering därav Från var och en av 260 olika blodprover tagna från patienter infekterade med Pseudomonas aeruginosa uppsamlades ca 1 till 5 ml portioner aseptiskt och fick stå i en timme vid rumstempera- tur. Efter att blodet förvarats över natten i kylskåp vid 4°C centrifugerades det med 1500 x g (g=gravitet) i 10 minuter vid 4°C för avlägsnande av fasta substanser och för erhållande av ett supernatant serum. Det ovan erhållna serumet späddes med fosfatbuffertlösning (NaH2P04 1,15 g, KCl 0,2 g, KHZPO4 0,2 g, Nacl 8,766 g per liter) i ett förhållande av 1:10 (serum till lösning) och spreds därefter på en tryptisk sojabuljongodlings- platta under tillsats av 1,0 till 1,5 % agar, som tidigare fram- ställts. Odlingsplattan inkuberades i 12 timmar eller mer i en inkubator som hölls vid en konstant temperatur av 37°C under aeroba betingelser. De så erhållna kulturerna överfördes till nya odlingsplattor och därefter isolerades de önskade mikro- 507114 16 organismerna i rent tillstånd med hjälp av en känd renisole- ringsmetod för mikroorganismer [se Thomas D. Brock och Michael T. Madigan, Biology of Microorganisms (1988), 5:e uppl. sid 32-33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey].
För de isolerade Pseudomonas aeruginosa stammarna har den serologiska och immunologiska karaktäriseringen redan beskrivits (se Bergey's Manual) och identifiering därav kan göras med hjälp av ett kommersiellt analys-kit enligt den analytiska metod som beskrivits i J. Gen. Microbiol. 130, 631-644, 1984. Varje Pseu- domonas aeruginosa stam ympades i ett provrör som innehöll 5 ml tryptisk sojabuljong och inkuberades därefter vid 37°C under aeroba betingelser för inställning av koncentrationen av bakte- riemassan så att denna hålles vid en absorbans av ca 2,0 eller mer under synligt ljus av 650 nm.
En portion på 1 ml togs aseptiskt från denna odlingslösning och centrifugerades med 6.000 x g vid 4°C i 10 minuter. Den överstående odlingslösningen avlägsnades och den utfällda mikro- organismen suspenderades genom tillsats av samma mängd sterili- serad salin. 15 pl av varje testserum som fanns i "kiten" och kontrollserum (normalt kaninserum) sattes till varje brunn i en 96-brunnars mikroplatta och blandades med 15 pl mikroorganism- suspension som erhållits ovan för bestämning av om agglutination sker inom 10 till 30 minuter. I denna undersökning kan eftersom mikroorganismstammen i en brunn med positiv agglutination av en serotyp som är identisk med densamma för serum som satts där- till, identifieringen av de isolerade mikroorganismerna lätt ske.
Exempel 2: Selektion av försvagade Pseudomonaa aeruginosa stammar från varje isolerad Pseudomonas aeruginosa stam För att försvaga Pseudomonas aeruginosa stammar så att man erhåller säkra mikroorganismer för användning vid framställning av ett vaccin selekterades en stam för var och en av Pseudomonas aeruginosa stammarna med olika immunotyper och försvagades där- efter genom upprepade reningar.
Vid detta förfarande selekterades kontrollen för en toxisk Pseudomonas aeruginosa stam GN 11189 (Episome Institute, Japan), som uppvisar en letalitetsgrad av 100% inom 3 dagar efter intra- 507 114 17 venös (eller intraperitoneal) injektion av 2,0 x 105 celler GN 11189 i en ICR-hanmus med en vikt av 20 till 25 g.
Varje stam av de ovan utvalda Pseudomonas aeruginosa stam- marna som har en åtskild immunotyp odlades i flytande tryptisk sojabuljong under samma betingelser som i exempel 1 och centri- fugerades därefter med 6.000 x g vid 4°C i 10 minuter. Den er- hållna cellfällningen suspenderades i 10 ml fysiologisk salin, centrifugerades ånyo under samma betingelser som ovan och späd- des därefter med färsk fysiologisk salin för inställning av cellhalten på 5 x 105, 5 x 105, 5 x 107 och 5 x 108 celler per ml. Varje cellspädning administrerades till en grupp som omfat- tade 10 ICR-möss på intravenös (eller intraperitoneal) väg. Till kontrollgruppen administrerades GN 11189-stammen i en mängd av 2,0 x 105 celler per kontrolldjur. Vid den punkt där dödligheten inom 3 dagar i kontrollgruppen är 100% isolerades Pseudomonas aeruginosa stammarna aseptiskt från ICR-möss/mus som överlevt den högsta cellkoncentrationen. De isolerade Pseudomonas aeru- ginosa stammarna spreds ånyo ut på ett medium av tryptisk soja- agar platta. Efter den ovan angivna renisoleringsmetoden av mikroorganismer isolerades varje mikroorganismstam i rent till- stånd.
Samtliga sju typer av de först försvagade mikroorganismerna bringades upprepade gånger att passera igenom ICR-möss ca 3 till 7 gånger enligt den metod som beskrivits ovan tills önskat LDSO på minst 2,0 x 107 celler erhölls för varje stam av mikroorga- nismer. Säkerhetsvärdet för varje slutligt försvagad Pseudomonas aeruginosa stam, uttryckt som LD5°, anges i följande tabell 2. 5Û7 114 18 Tabell 2 Bäkerhetsvärden för försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar utvalda enligt föreliggande uppfinning H Utvalda P. Fisher- Ursprung- Slutligt aeruginosa- Devlin ligt LDSO stammar immuno- LD50 tYP cFcPA 10142 1 < 1,5 x 106 7,6 x 107 cFcPA 20215 2 < 1,4 x 106 2,7 x 107 cFcPA 30720 3 < 2,0 x 106 2,5 x 106 Test' cFcPA 40057 4 < 3,7 x 106 4,5 x 107 stam cFcPA 50243 5 < 5,0 x 106 3,0 x 107 cFcPA 60534 5 < 1,5 x 106 2,0 x 107 cFcPA 70018 7 < 3,8 x 106 2,7 x 107 Kontroll- GN 11189 - - 2,0 x 106 stam *I -«~--» s--- Samtliga sju typer av mikroorganismer som angivits ovan uppvisade ett LD50-värde av minst 2,0 x 107 celler. Man kunde följaktligen fastställa att de försvagade mikroorganismerna selekterats.
Exempel 3: Identifiering av försvagade Pseudemonas aeruginosa stammar Steriliserad cetrimid 10% (vikt/volym) sattes till ett flytande näringsmedium (pH 7,2-7,4), som preparerats genom ångsterilisering i en autoklav vid 121°C i 15 minuter till en slutlig koncentration av 0,3% (volym/volym). En 10 ml portion av det så erhållna mediet togs aseptiskt och infördes därefter i ett provrör, vartill sattes en droppe av var och en av de för- svagade Pseudomonas aeruginosa stammarna som isolerats i rent tillstånd enligt exempel 2 ovan som en ymp och odlades därefter vid 30 til 37°C i 12 till 16 timmar. Från provröret vari mikro- 507 114 19 organismen växer togs 0,5 ml av odlingslösningen, spreds ut på en platta av cetrimidagarmedíum som Pseudomonas aeruginosa isoleringsmedium varefter plattan inkuberades. Den koloni som först identifierades som Pseudomonas aeruginosa genom pigment- bildning överfördes och inkuberades på ett Pseudomonas aerugi- nosa agarmedium för detektering av fluorescin (Proteospepton nr 3 (oxoid) 2%, glycerol (bidestillerad) 1%, K2HPO4 (vattenfritt) 0,15%, MgS04.7H2O 0,15%, agar 1,5% (vikt/volym), pH 7,2) och därefter ett Pseudomonas aeruginosa agarmedium för detektion av pyocyanin (pepton (Difco) 2%, glycerol (bidestillerad) 1%, KZSO4 (vattenfritt) 1%, MgCl2 (vattenfri) 0,14%, agar 1,5% (vikt/ volym) pH 7,2) och undersöktes därefter ånyo med avseende på morfologiskt test, näringskrav och oxidastest för bestämning av förekomsten av Pseudomonas aeruginosa stammen. Typerna av de utvalda Pseudomonas aeruginosa stammarna bestämdes enligt IATS klassificeringssystem med hjälp av ett Pseudomonas aeruginosa antigenkit (framställt av Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) och klassades därefter genom Fisher immunoserotyp. Resulta- ten därav beskrives i följande tabell 3. 507 114 20 Tabell 3 Kriterier för solcktion av Pseudononas aøruginosa stanar och aorotyp och akyddsomridc därav Test Testresultat Växt på isolationsmedium Växer Växt på Pseudomonas aeruginosa Växer medium för detektion Morfologiska kännetecken Båda ändarna är runda och (mikroskop) det finns ett enda polärt flagellum Gramfärgning Gramnegativ Oxidasreaktion Positivt svar (+) eller positivt-negativt svar (+) Antigen-antikropp reaktion (först selekterade stammar) CFCPA 20215 Skyddar mot Fisher typ 3 och 7 som Fisher immunotyp 2 (O-serotyp 7) CFCPA 60534 Skyddar mot Fisher typ 3 och 7 som Fisher immunotyp 6 (0-serotyp 5) CFCPA 10142 Skyddar mot Fisher typ 2 och 1 som Fisher immunotyp 1 (O-serotyp 4) CFCPA 30720, Skyddar Fishertyp 6 som CFCPA 30721 Fisher immunotyp 3 (0-serotyp 3) 507 114 21 Exempel 4: Fysiologiska egenskaper hos försvagade Pseudomonas aoruginosa stamar (1) För var och en av de sju försvagade typerna av Pseudo- monas aeruginosa stammar enligt exempel 2, bestämdes tillväxt- hastigheten beroende på olika pH-värden. Varje mikroorganism- stam ympades med 50 ml tryptisk sojabuljong med ett pH-värde av 7,2 och förinkuberades därefter vid 37°C i 12 till 16 timmar under aeroba betingelser med en omröringshastighet av 200 varv/ min. Varje förinkuberad bakteriemassestam ympades i 500 ml var- dera färsk tryptisk sojabuljong av pH 3,0, pH 5,0, pH 7,0 och pH 9,0 i en slutkoncentration av 1% (volym/volym) och inkubera- des därefter i fermentatorer vid 37°C under samma betingelser som ovan. Under denna period erhölls ett prov från varje od- lingsmedium vid ett intervall av 2 timmar och därefter bestäm- des koncentrationen av bakteriemassan genom mätning av absor- bansen av provet vid 600 nm med hjälp av spektrofotometer. Re- sultaten därav beskrives i följande tabell 4.
Tlbßll 4 Hikroorganism tillväxthastighet beroende på pl-värde ====-============================ Stammar pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0 CFCPA 10142 - +++ +++ +++ CFCPA 20215 - +++ +++ +++ CFCPA 30720 - +++ +++ ++ CFCPA 40057 - +++ +++ ++ CFCPA 50243 - +++ +++ ++ CFCPA 60534 - +++ +++ ++ CFCPA 70018 - +++ +++ +++ ================= + Växt, - Ingen växt 507 114 22 Som framgår av tabell 4 växte de försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna enligt föreliggande uppfinning ej under alltför sura betingelser, exempelvis vid pH 3,0, men uppvisade väsentligen samma eller liknande tillväxtgrad under medelhöga betingelser vid pH 5,0 till pH 9,0. Enligt föreliggande upp- finning kan därför samtliga sju typer av mikroorganismer växa mycket bra inom ett brett pH-område. (2) Enligt samma metod som under (1) ovan bestämdes till- växthastigheten för Pseudomonas aeruginosa stammar beroende på temperaturvariationer. Var och en av de sju typerna av försvaga- de Pseudomonas aeruginosa stammar ympades i 50 ml tryptisk soja- buljong vid ett pH-värde av 7,0 och förinkuberades därefter i 12 till 16 timmar vid 37°C under aeroba betingelser med en omrö- ringshastighet av 200 varv/min. Var och en av de förinkuberade stammarna ympades i 500 ml tryptisk sojabuljong vid ett pH-värde av 7,0 och ympades därefter i fermentatorer, som hölls vid olika temperatur av 25°C, 30°C, 37°C och 42°C, under samma betingelser som ovan. Under denna period bestämdes tillväxthastigheten i varje fermentor genom mätning av absorbansen av odlingslösningen vid 600 ml med hjälp av spektrofotometer. Resultaten beskrives i tabell 5. 507 114 23 Tabell 5.
Tillväxthastighet för mikroorganismer beroende på temperaturvariationer ====== Stammar 25°C 30°C 37°C 42°C CFCPA 10142 + +++ +++ + CFCPA 20215 + +++ +++ + u CFCPA 30720 ++ +++ +++ + n H CFCPA 40057 + ++ +++ + CFCPA 50243 + ++ +++ + CFCPA 6 05 3 4 ++ +++ +++ + CFCPA 70018 + ++ +++ + " + Växt, - Ingen växt Som framgår av tabell 5 uppvisade samtliga sju typer av för- svagade Pseudomonas aeruginosa stammar den bästa tillväxten vid 37°C och uppvisade också god tillväxt vid 30°C, 25°C. Vid 42°C uppvisade emellertid var och en av de 7 typerna av Pseudomonas aeruginosa stammarna en relativt långsam tillväxthastighet i förhållande till tillväxthastigheten vid de andra temperatu- rerna. (3) Följande försök utfördes för att bestämma effekten av kolkällan på tillväxthastigheten hos försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar. Var och en av de sju typerna av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar ympades i 50 ml tryptisk sojabul- jong vid ett pH-värde av 7,0 och inkuberades därefter vid 37°C i 12 till 16 timmar under aeroba betingelser med en omröringshas- tighet av 200 varv/min. Odlingsmediet centrifugerades därefter med 6.000 x g vid 4°C i 10 minuter under aseptiska betingelser för att skörda bakteriemassan som därefter resuspenderades i 10 ml fysiologisk salin. Vardera 50 pl av de ovan erhållna mikro- organismsuspensionerna ympades till 5 ml M9 medium (Na2HPO4 . 7H20 12,8 g, KHZPO4 3 g, NaCl 0,5 g, NH4Cl 1 g) som innehöll 507 114 24 olika kolklllbr (se nedan) och inkuberades därefter i 12 tim- mar. Därefter bestämdes för varje odlingslösning graden av mikroorganismtillväxt genom mätning av absorbansen vid 600 nm.
Tabell 6 Tillväxtegenskaper hos försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar beroende på kolkälla = P. aeruginosa crcpa crcvn crcpn crcPA crcrn crcPA crcra stammar 10142 20215 30720 40057 50243 60534 70018 Kol- källa Glukos +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ Xylos - - - - _ _ _ Hannitol ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ Galaktos - - 2 - 1 _ _ Sorbitol - - - - - - _ Inoaitol - - - - - - _ Maltoa - - - - - - _ Sackaros - - - - - - - Arabinos - - - - - - _ Hannos - i i - t 1 - ß-alanin +++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ + Växt, - Ingen växt Tillväxtegenskaperna för försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar beroende på kolkälla uppvisade ett mönster som väsent- ligen liknade tillväxtegenskaperna hos allmänna Pseudomonas aeruginosa stammar beroende på kolkälla (se Bergey's Manual).
Det bör dock märkas att även om Pseudomonas aeruginosa har rap- porterats generellt inte använda mannos uppvisade försvagad Pseudomonas aeruginosa enligt föreliggande uppfinning en viss tillväxt i mannoshaltigt medium.
Som framgår av ovanstående kan försvagade Pseudomonas ae- 507114 25 ruginosa stammar enligt föreliggande uppfinning inkuberas i ett konventionellt medium som innehåller en kolkälla, kvävekälla, oorganiska föreningar, aminosyror, vitaminer och andra närings- ämnen under aeroba betingelser vid utvald temperatur, pH, etc för erhållande av en bakteriemassa. Cellväggproteiner från den erhållna bakteriemassan användes för framställning av Pseudo- monas aeruginosa vacciner.
Som kolkälla för inkubering av försvagade Pseudomonas aeru- ginosa stammar kan användas olika kolhydrater såsom glukos, man- nitol, fruktos etc, olika organiska syror såsom ättiksyra, pyro- druvsyra, mjölksyra och liknande. För kvävekällan kan olika or- ganiska och oorganiska ammoniumsalter, pepton, jästextrakt, ka- seinhydrolysater och andra kvävehaltiga substanser användas. Som oorganiska föreningar kan användas magnesiumsulfat, kalciumkar- bonat, järn(II)sulfat, koppar(I)su1fat, zinksulfat och kalium- vätefosfat och kaliumdivätefosfat och liknande. Inkubationen utföres lämpligen vid 25 till 37°C under aeroba betingelser exempelvis genom en plattodling av en flytande kultur såsom en skak-kultur eller en luftningsspinnkultur. Mediets pH-värde hålles lämpligen vid pH 5 till 9 under inkubationsperioden.
Den bakteriemassa som erhålles genom centrifugering av odlings- lösningen som inkuberats i 12 till 16 timmar användes lämpligen som utgångsmaterial för framställning av vacciner som beskrives i det följande.
Exempel 5: Inkubaring av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar (I) I en fermentor på 5 l inkuberades bakteriemassan av Pseudomonas aeruginosa som erhållits enligt exempel 2 för mass- framställning enligt följande. 2,5 l av lösningsmedlet som er- hållits genom upplösning av 30 g tryptisk sojabuljong per 1 l destillerat vatten ställdes på pH 7,2, steriliserades och in- fördes därefter i fermentorn på 5 l. Inkubationsbetingelserna var: inkubationstemperatur 37°C; luftningshastighet 1 vvm; ympmängd 5% (v/v) bakteriemassa av försvagad Pseudomonas aeru- ginosa erhållen från exempel 2 för odlingslösning; och omrör- ingshastigheten hölls vid 100 varv/min under de första två timmarna varefter inkubationen fortsatte i 12 - 16 timmar vid den fasta omröringshastigheten 600 varv/min. Även om mängden 507114 26 erhållen bakteriemassa var något annorlunda beroende på typen av Pseudomonas aeruginosa stam var det genomsnittliga utbytet ca 8 g (torrvikt) bakteriell massa per liter odlingslösning. (2) Var och en av sju typer av försvagade Pseudomonas aeru- ginosa stammar inkuberades under samma inkubationsbetingelser som ovan under (1), förutom att det speciella mediet för odling av Pseudomonas aeruginosa som består av glukos (30 g/l), pepton (15 g/l), MgSO4 (0,5 g/l), CaC03 (5 g/l), KHZPO4 (1 g/l), FeS04 (5 mg/1), CuSO4 (5 mg/l) och ZnS04 (5 mg/l) användes som medium.
Med detta specialmedium erhölls ca 10,4 g till 10,5 g (torrvikt) bakteriemassa för varje mikroorganismstam. Användning av detta speciella medium kan ge ett utbyte av bakteriemassa som är minst 30% (baserad på torrvikten) högre än i tryptisk sojabuljong.
Exempel 6: Partiell rening av oellväggproteiner från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar För framställning av vacciner mot Pseudomonas aeruginosa, renades cellväggproteiner från var och en av sju typer av för- svagade Pseudomonas aeruginosa stammar. I det följande användes typ 3 stammen, dvs CFCPA 30720 (KCCM 10031) som ett typiskt exempel. De andra försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna kan emellertid också underkastas samma metod som följande re- ningsmetod för framställning av partiellt renade cellvägg- proteiner. 2,5 1 av det specialmedium som användes i Exempel 4(2) ovan infördes i en 5 l fermentor och inkuberades därefter i 12- 16 timmar under bibehållande av samma inkubationsbetingelser som ovan. När inkubationen avslutats centrifugerades 2,5 l av od- lingslösningen vid 6.000 x g vid 4°C i 20 minuter för att av- lägsna supernatanten. De utfällda cellerna resuspenderades i fosfatbuffertlösning (Na2HP04 1,15 g, KCI 0,2 g, KHZPO4 0,2 g, NaCl 8,766 g, per liter, pH 7,2) vid 4°C, centrifugerades ånyo och tvättades sedan i samma fosfatbuffertlösning. Till 130 g av de så erhållna cellerna sattes 3 volymer (ca 390 ml) aceton i förhållande till den ursprungliga volymen våta celler och bland- ningen fick stå vid 4°C i 12 timmar eller mer. Aceton avlägsna- des från de utfällda cellerna och två volymer (ca 260 ml) ny aceton i förhållande till den ursprungliga våtcellvolymen sat- 507 114 27 tes ånyo till återstoden. Den erhållna blandningen omrördes i 5 till 10 minuter och centrifugerades därefter med 8.000 x g vid 4°C i 20 minuter. Den överstående acetonen avlägsnades och till återstoden sattes samma volym aceton. Blandningen omrördes och centrifugerades på samma sätt som beskrivits ovan för att av- lägsna supernatanten. De utfällda cellerna torkades på en platta vid rumstemperatur för att avlägsna aceton. De torkade mikro- organismerna resuspenderades genom tillsats av 250 ml av samma fosfatbuffertlösning som ovan så att den slutliga koncentratio- nen kan ställas på 10% (v/v). Den erhållna blandningen behand- lades med en homogenisator vid en hastighet av 500 till 1500 varv/min i 10 minuter under det att temperaturen hölls vid 4°C för extraktion av cellväggproteiner. Den erhållna suspensionen centrifugerades med 8.000 till 10.000 x g i 30 minuter för er- hållande av supernatanten. De utfällda cellerna separerades, suspenderades ånyo genom tillsats av samma volym fosfatbuffert- lösning och utsattes därefter för en andra extraktion under samma betingelser som den ovanstående första extraktionen för erhållande av supernatanten.
Genom användning av samma betingelser som vid den första extraktionsmetoden extraherades cellväggproteinerna upprepade gånger 5 till 6 gånger varvid tillsågs att man inte förstörde (lyserade) några av cellerna. Förstöringen av celler kan bestäm- mas genom mätning av ett specifikt protein som en cytoplasmisk markörsubstans, nämligen laktatdehydrogenas eller hexokinas. De extraherade supernatanterna, som var och en testades för att kontrollera att cellväggproteinerna extraherats utan införli- vande av cytoplasmiska proteiner, laktatdehydrogenas och hexo- kinas, uppsamlades, omrördes och återcentrifugerades slutligen vid 10.000 x g vid 4°C i 30 minuter för erhållande av en klar supernatant. Den så erhållna proteinlösningen var enbart samman- satt av väsentligen rena cellväggproteiner och ställdes med en kvantitativ proteinanalys så att proteinkoncentrationen bibe- hölls vid en nivå av 1 mg/ml till 2 mg/ml. Vidare bestämdes renheten av proteinlösningen med hjälp av en elektrofores med en 10 till 15%-ig koncentrationsgradient. Som resultat kunde fast- ställas att önskade cellväggproteiner med en molekylvikt varie- rande från 10.000 till 100.000 fanns närvarande (se figur 1). 507 114 28 Exempel 7: Røning av orena proteiner Följande förfarande utfördes så att den orena lösningen av cellväggprotein i en koncentration av 1 till 2 mg/ml skulle re- nas så att den endast kom att innehålla de effektiva komponen- terna. 2 till 2,5 l oren cellväggproteinlösning utsattes först för en membranfiltrering med en cut-off vid en molekylvikt av 100.000 i ett Pellicon Cassette System för avlägsnande av pro- teinmolekyler med en molekylvikt över 100.000. Enligt detta förfarande återvanns proteiner med en molekylvikt under 100.000 som filtrat och pro-teiner med en molekylvikt större än 100.000 cirkulerades kontinuerligt för att separeras från små molekyler med en molekylvikt under 100.000.
Detta medförde att proteinlösningen koncentrerades med 10 till 20 % av den ursprungliga volymen och successivt tvättades med 20 till 25 1 (tio gånger den ursprungliga volymen protein- lösning) steriliserad fosfatbuffertlösning (Na2HPO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2P04 0,2 g, NaCl 8,766 g, per liter) för att återvinna 90 % eller mer proteiner med en molekylvikt under 100.000. Pro- teiner med en molekylvikt under 100.000 separerade då filtratet påfördes ett membranfilter med en cut-off vid en molekylvikt av »10.000 i samma system för att avlägsna proteiner med en molekyl- vikt mindre än 10.000 och andra föroreningar och samtidigt kon- centrera proteiner med en molekylvikt av 10.000 till 100.000 till en koncentration av 1 mg/ml.
Slutligen ultracentrifugerades supernatanten för att av- lägsna lipopolysackarid (LPS) och cellväggrelaterade fragment, som eventuellt finns närvarande i supernatanten som erhållits ovan i spårmängder. Ultracentrifugering utföres vid 180.000 x g till 200.000 x g i 3 timmar vid 4°C. Efter avlägsnande av pre- cipitaten steriliserades den erhållna supernatanten genom fil- trering genom ett filter 0,2 pm varvid erhålles 250 till 260 mg proteinkomposition för användning i vacciner för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektion. 507 'H4 29 Exempel 8: Rening av cellväggproteiner från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar med olika immunotyper Ãterstående sex typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar enligt föreliggande uppfinning, nämligen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 och CFCPA 70018 behandlades enligt samma metod som den för inkubering och rening av mikroorganismer för framställning av vaccin komposi- tion för CFCPA 30720 Pseudomonas aeruginosa stam som beskrivits i Exempel 5, Exempel 6 och Exempel 7. De så erhållna slutliga Pseudomonas aeruginosa vaccinkompositionerna uppvisade samma bandmönster som CFCPA 30720 vaccinkompositionen i 10 till 15% koncentrationsgradient SDS-PAGE. Som resultat av jämförelse med standardmolekylviktsmarkör kunde vidare fastställas att samtliga proteiner som fanns i vaccinkompositionerna har en molekylvikt varierande från 10.000 till 100.000 (Figur 1).
Exempel 9: kors-skyddskapacitetstest med kombinerade antigener De cellväggproteiner som härrör från varje försvagad Pseudo- monas aeruginosa stam efter separerings- och reningssteg enligt de metoder som beskrives i exemplen 7 och 8 administrerades intraperitonealt i en mängd av 0,2 mg/kg till 6 veckor gamla ICR hanmöss med en vikt av 23 till 25 g för att immunisera djuret.
Varje grupp bestod av 10 till 15 försöksdjur. En vecka från immuniseringen togs blodprov från 2 till 3 möss per grupp för ELISA (enzymbunden immunosorbentanalys). De återstående ICR- mössen injicerades med vildtyp Pseudomonas aeruginosa stam mot- svarande respektive immunotyp i en mängd av 10 till 50 gånger det ursprungliga LDSO-värdet för varje mikroorganismstam som angivits i tabell 2 i exempel 2. Skyddseffekten mot varje Pseu- domonas aeruginosa stam undersöktes kontinuerligt i en vecka.
Som ett resultat därav uppvisade samtliga försöksgrupper en skyddseffekt mot motsvarande Pseudomonas aeruginosa stammar och ELISA för samtliga uppsamlade blodprover uppvisade också goda positiva värden, vilket innebär en förbättring av de immunolo- giska svaren.
Enligt föreliggande uppfinning för framställning av vacci- ner som kan uppvisa samma skyddseffekt mot infektioner orsakade 507 114 30 av varje typ av Pseudomonas aeruginosa stam behandlades fyra ty- per av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar (3 typer av Pseudomonas aeruginosa stammar som oftast detekteras i infektio- ner i människokroppen och en typ av Pseudomonas aeruginosa stam som är svår att övervinna om den etablerats, nämligen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 Och CFCPA 60534) för erhållande av cellväggproteiner som kombinerades i ett förhållande av ekvi- valenta mängder och därefter undersöktes med avseende på kors- skyddsförmåga mot varje immunotyp av Pseudomonas aeruginosa stammar.
Cellväggproteiner separerade från de fyra typerna av de försvagade Pseudomonas aeruginosa stammarna, som angivits ovan, slogs samman i ett förhållande av ekvivalenta mängder (1:1:1:1) baserat på vikten. De sammanslagna cellväggproteinerna admini- strerades intraperitonealt till ICR-hanmöss för att immunisera testdjuren. Kontrollgruppen erhöll 0,3 ml fosfatbuffertlösning (Na2HPO4 1,15 g, KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, NaCl 8,766 g, per liter). Efter en vecka från immuniseringen erhöll var och en av de testgrupper som immuniserats med Pseudomonas aeruginosa vaccin och kontrollgruppen som immuniserats med fosfatbuffert- lösning intraperitonealt Pseudomonas aeruginosa i 5 olika kon- centrationer spädda i en serie av 10 gånger från 1 x 108 celler till 1 x 104 celler; och efter en vecka räknades antalet över- levande försöksdjur för beräkning av effektivitetsindex (EI).
Resultaten därav anges i tabell 7 nedan, vari effektivitetsindex definieras som ett värde av LD50 i försöksgruppen delat med LDSO i kontrollgruppen. Som framgår av tabell 7 har ett vaccin som består av cellväggproteiner erhållna från 4 typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar, nämligen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 och CFCPA 60534, ett EI-värde av 3,0 till 18 eller mer mot varje immunotyp av Pseudomonas aeruginosa stammar.
När man därför beaktar att vacciner med ett EI-värde av minst 2 anses ha god immunologisk effekt framgår det att vaccinet enligt föreliggande uppfinning visar en god skyddande effekt mot in- fektioner orsakade av varje typ av de 7 slagen av Pseudomonas aeruginosa stammar. 507 114 31 Tabell 7 Kors-skyddskapacitetatest för Pseudomonas aeruginosa vaccin framställt under använd- ning av fyra (4) olika arter av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar mot varje typ av mikroorganism Testad stam Immunotyp Serotyp EI-värde Moderstam till CFCPA 10142 1 06 9,5 Moderstam till CFCPA 20215 2 011 13 || Moderstam till CFCPA 30720 3 02 >l8 Moderstam till CFCPA 40057 4 01 3 Moderstam till CFCPA 50243 5 010 4,5 Moderstam till CFCPA 60534 6 07 8,4 Moderstam till CFCPA 70018 7 05 7 Enligt förfarandet som angivits ovan, förutom att den fram- ställda blandningen av cellväggproteiner härrörde från 3 typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stamar CFCPA 10142, CFCPA 30720 och CFCPA 20215 (grupp I), och att blandningen av cell- väggproteiner som framställts av alla 7 typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar (grupp II), vari samtliga cell- väggproteiner finns närvarande i ett förhållande av ekvivalent mängd, användes i stället för blandningen av 4 typer av pro- teiner, undersöktes kors-skyddskapaciteten hos dessa 2 typer av vacciner mot infektion av varje Pseudomonas aeruginosa. Resul- taten därav beskrives i tabell 8. 507 114 32 Tabell 8 Kors-skyddskapaoitet för vacciner eoa härrör från 3 typer (grupp I) eller 7 typer (grupp II) av försvagade Pseudomonas aeruginoea stammar mot varje typ av mikro- organism EI-värde ( ) Testad stam LDSO i kontrollgruppen Grupp I Grupp II Moderstam till H CFCPA 10142 14,3 9,2 Moderstam till CFCPA 20215 12,0 10,7 Moderstam till Ä l CFCPA 30720 >18,0 15,0 ' Moderstam till M CFCPA 40057 2,5 8,3 Moderstam till CFCPA 50243 4,0 10,6 Moderstam till CFCPA 60534 3,7 9,7 “ Moderstam till CFCPA 70018 2,8 12,9 Som framgår av ovanstående försöksresultat uppvisar detta vaccin, eftersom de blandade proteinkomponenterna i vaccinet enligt föreliggande uppfinning är sammansatt av cellväggpro- teiner som framställts av minst 3 olika typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar som uppvisar olika immunotyp i förhållande till varandra, utmärkt skyddseffekt mot varje im- munotyp av Pseudomonas aeruginosa jämfört med endast en typ av vanligt antigen. Dvs, även om effektivitetsindex för vaccinet enligt föreliggande uppfinning varierar med typen och antalet 507 114 33 utvalda mikroorganismer från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar, blandningsförhållandet mellan därav härledda cellvägg- proteiner, immunologiskt schema och metod etc, kan det bekräftas att vaccinet enligt föreliggande uppfinning är effektivt mot samtliga Pseudomonas aeruginosa stammar som för närvarande före- kommer på sjukhus och i patienter.
Exempel 10: Toxikologiskt test för cellväggproteiner För framställning av ett komponentvaccin för profylax mot infektion orsakad av Pseudomonas aeruginosa bör tillförsäkras att cellväggproteinerna som skall användas i sig som komponent- vaccin är säkra, liksom mikroorganismstammarna i sig såsom be- skrivits i exempel 2. I detta exempel renades cellväggprotei- nerna partiellt och undersöktes därefter med avseende på säker- heten i ett försöksdjur, nämligen mus. Speciellt inkuberades var och en av de försvagade mikroorganismerna med tryptisk sojabu- ljong som odlingsmedium i en fermentor på 5 ml och behandlades därefter enligt de förfaranden som beskrivits i exemplen 5, 6 och 7. Supernatanterna av cellväggproteinerna som extraherats från försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar slogs samman, centrifugerades ånyo vid 10.000 g vid 4°C i 30 minuter för att avlägsna fina partiklar som eventuellt kan finnas närvarande i lösningen. De erhållna cellväggproteinerna filtrerades genom ett Amicon membranfilter och gav en blandning av cellväggproteiner med en molekylvikt varierande från 10.000 till 100.000, som kon- centrerades till en proteinkoncentration av 1 mg/ml och därefter steriliserades med en 0,2 pm filter för framställning av en proteinkälla för toxikologisk undersökning.
I det toxikologiska testet var de använda försöksdjuren ICR- hanmöss med en vikt från 20 till 22 g. Till denna testgrupp in- jicerades proteinkällan intravenöst i en mängd av 20 mg/kg och 100 mg/kg. Kontrollgruppen erhöll fysiologisk salin i en mängd av 25 ml/kg. Som framgår av tabell 9 och bifogade figur 2 upp- visade testgruppen en ringa inhibering av viktökningen den första dagen efter administration men på och efter den andra dagen efter administrationen uppvisades en normal tillväxt och inga speciella symtom. Vidare kunde på och efter den sjunde dagen ingen specifik ändring eller symtom i något organ på- 507 114 34 träffas.
Tabell 9 Akut toxikologiskt test av callväggproteinkälla av försvagade Pseudomonaa aeruginosa stammar Grupp Dos Testade Överlevnad/test Anmärkning individer individer Testgrupp A 20 20 20/20 Ingen ändring mg/kg av kroppsvikten Teetgrupp B 100 15 15/15 Ändring av mg/kg kroppsvikten enbart den första dagen Kontroll- Fysio- 15 15/15 Ingen ändring grupp logisk av kroppavikten ealin E Exempel 11: Bestämning av antigenicitet av cellväggproteiner Cellväggproteiner som erhållits genom partiell rening av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar på samma sätt som i exempel 10 användes som antigen och injicerades intravenöst i ICR-möss i en mängd av 0,1 mg/kg eller 0,2 mg/kg för att immu- nisera försöksdjuren. En vecka från immuniseringen togs en viss mängd blod från varje mus i gruppen av möss, serum separerades från det uppsamlade blodet och bildandet av antikropp bestämdes enligt ELISA-metoden [J. Clin. Microbiol. 15, 1054-1058, 1982].
Först sattes 100 ul antigen som framställts enligt exempel 10 som ställts på en koncentration av 0,1 mg/ml i en belägg- ningsbuffert (0,05 M karbonatbuffertlösning bestående av NaHCO3 2,85 g, Na2CO3 1,70 g, H20 1, pH 9,6) till varje brunn i en 96- brunnars mikroplatta och reagerades sedan antingen vid rumstem- peratur i 2 timmar eller vid 4°C i 12 till 14 timmar så att pro- teinet häftade vid plattan.
Efter avlägsnande av vattenlösningen sattes 200 ul 1% bovint serumalbumin (BSA) till varje brunn i plattan och det hela reagerades vid rumstemperatur i en timme för att blockera den återstående delen i brunnarna som ej är bunden till protein. 567 114 35 Vid detta test användes serum från icke-immuniserad mus som antikropp för kontrollgruppen. När reaktionen avslutats tvätta- des plattan ånyo 5 till 6 gånger med en fosfatbuffertlösning (pH 7,0-7,2) och 100 ul av en andra antikropp, nämligen kanin-anti mus Ig-peroxidas konjugat, sattes till varje brunn och fick rea- gera vid normal temperatur i en timme.
Därefter tvättades plattan kraftfullt 7 gånger eller mer med samma fosfatbuffert-tvättlösning (pH 7,0-7,2). Som substrat tillsattes 50 ul orto-fenylendiamin-dihydroklorid, ställd på en koncentration av 0,3 till 0,4 mg/ml i citrat-fosfatbuffertlös- ning (0,1 M citrat-fosfatbuffert, pH 5,0) till varje brunn i plattan och fick reagera i 20 minuter i frånvaro av ljus. Där- efter tillsattes 50 ul 1N-svavelsyra för att stanna reaktionen i varje brunn. Därefter mättes för varje reaktionslösning absor- bansen vid 490 nm med hjälp av en spektrofotometer.
Tabell 10 Bildande av antikropp mot cellväggproteiner från varje nikroorganism (490 nm) _* __ Antikropps- epädning 1/5 1/25 1/125 1/625 1/3125 1/15625 Antigen- halt (mg/kg) Kontrollgrupp 0,16 0,15 0,29 0,47 0,41 0,43 Test- 0,1 0,29 0,25 0,32 0,52 1,1 1,2 ru g PP 0,2 0,76 0,67 0,50 0,49 1,3 1,4 ä Som framgår av tabell 10 medför administration av 0,1 eller 0,2 mg/kg antigen till testgruppen en immunitet som är 2 till 5 gånger högre än densamma i kontrollgruppen.
Exempel 12: Framställning av immunoglobulin för Pseudomonas aeruginosa Den från exempel 7 erhållna proteinlösningen administrerades till kaniner för att ge motsvarande immunoglobulin. Även om det cellväggprotein som erhållits av den försvagade Pseudomonas aeruginosa stammen CFCPA 30720 användes som typiskt exempel kan 5G7114 36 samma metod tillämpas på andra försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar. 0,5 till 1 ml (som innehåller 100 till 200 pg cellvägg- protein) av den cellväggproteinlösning som erhållits från stam CFCPA 30720 i exempel 7 användes för att ympa albinokaniner 3 gånger med intervall på 7 dagar. Därefter togs blodprov med regelbundna intervall från varje kanin och serumet separerades. 100 ml av det separerade kaninserumet blandades med 300 ml de- stillerat vatten och blandningen sattes till 500 g (våtvikt) DEAE-cellulosa vid 4°C. Den erhållna blandningen skakades nog- grant i en timme vid 4°C, fick stå och sedan separeras super- natanten och avlägsnades. Den kvarvarande återstoden tvättades 3 gånger med vardera 200 ml av 0,01 M fosfatbuffertlösning (Na2HP04 1,15 g, KH2PO4 0,2 g, KCl 0,2 g, NaCl 8,766 g per liter, pH 8,0) för erhållande av 600 mg immunoglobulin IgG med en renhet av 96% eller mer.
Exempel 13: Terepeutisk effekt ev immunoglobulin på Pseudomonas aeruginosa infektion För immunoglobuliner mot Pseudomonas aeruginosa stammar som erhållits i exempel 12 ovan undersöktes deras terapeutiska ef- fekt på Pseudomonas aeruginosa infektion på följande sätt. I det följande användes 10 möss i varje grupp. 1,0-3,0 x 105 celler av var och en av de patogena Pseudo- monas aeruginosa stammarna med Fisher immunotyp 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7 injicerades intraperitonealt i varje mus för att fram- kalla Pseudomonas aeruginosa infektion. Inom 2 till 6 timmar efter injektionen injicerades det renade immunoglobulinet för varje stam intravenöst i varje mus i en mängd av 0,1 till 2 mg per mus för undersökning av den terapeutiska effekten därav.
I kontrollgruppen injicerades 0,5 ml fysiologisk salin för injektion intravenöst i stället för immunoglobulin. I detta test var de använda immunoglobulinerna CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 och CFCPA 60534 eller en blandning av dessa 4 typer av immunoglobuliner i ett förhållande av ekvivalenta mängder.
Som resultat uppvisade kontrollgruppen som endast erhöll fysiologisk salin en dödlighetsgrad av 50% eller mer inom 48 timmar och 100% efter 72 timmar. Testgruppen däremot som erhöll 5Ü7 'H4 37 motsvarande immunoglobulin uppvisade en överlevnadsgrad av 80% eller mer efter 72 timmar. Man kunde följaktligen visa att im- munoglobulinet är effektivt för behandling av infektion orsakad av patogen Pseudomonas aeruginosa stam med motsvarande Fisher immunotyp. Inget enstaka immunoglobulin hade emellertid någon större effekt på en infektion orsakad av patogena Pseudomonas aeruginosa stammar med Fisher immunotyperna 4 och 5. Å andra sidan uppvisade den musgrupp som erhållit kombina- tionen av 4 typer av immunoglobuliner i ett förhållande av 1:1:1:1 med avseende på vikten en överlägsen terapeutisk effekt också på Fisher 4 och 5 typer av Pseudomonas aeruginosa stammar _ pga deras korsreaktivitet. Följaktligen kan den kombinerade immunoglobulinkompositionen enligt föreliggande uppfinning användas som ett terapeutiskt medel som är effektivt mot in- fektion orsakad av Pseudomonas aeruginosa stammar av samtliga Fisher immunotyper. Resultaten av dessa försök sammanfattas i tabellerna 11 och 12.
Tabell 11 Immunologisk skyddseffekt genom användning av immunoglobuliner separat eller i en kombination därav H Stammar använda för fram- Fisher Immunologiskt ställning av immunoglobulin immunotyp skyddsområde CPCPA 20215 stam enbart 2 Fisher typ 3, 7 CPCPA 60534 stam enbart 5 Fisher typ 3, 7 CPCPA 10142 stam enbart 1 Fisher typ 2, 1 CPCPA 30720 stam enbart 3 Fisher typ 6 CFCPA 20215 - CFCPA 60534 blandade 2, 6, 1, 3 Fisher typ CFCPA 10142 stammar 3, 7, 2, 1, 6, CFCPA 30720 4 och 5 507 114 38 Tabell 12 y ömsesidigt förhållande mellan imnunologiskt skydd av immunoglobulin mot Pseudomonas aeruginosa stammar CFCPA 20215 stam- Immunologiskt skydd inducerat immuno- mot Fisher typ 3 globulin och Fisher typ 7 CFCPA 60534 stam- inducerat immuno- globulin Immunologiskt skydd CFCPA 10142 stam- mot Fisher typ 2 inducerat immuno- och Fisher typ 1 globulin CFCPA 30720 stam- .Immunologiskt skydd inducerat immuno- mot Fisher typ 6 globulin Kombination av ovan- Immunologiskt skydd mot stående 4 typer av samtliga Fisher typ immunoglobuliner 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7 Exempel 14: terapeutisk effekt av de kombinerade immunoglobulinerna på Pseudomonas aeruginosa infektion 4 typer av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar selek- terade i exempel 13, nämligen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 och CFCPA 60534 inkuberades och extraherades enligt sama förfaranden som i exemplen 5, 6 och 7 för framställning av en kombinerad komposition av cellväggproteiner som därefter ympades 3 gånger med intervall på en vecka i en mängd av 1,5 till 2 mg i en get på samma sätt som i exempel 13 för framställning av kom- binerade Pseudomonas aeruginosa immunoglobuliner i stor mängd som renades enligt den kända metoden [se Practical Immunology, 507 114 39 3:e uppl., (1989), sid 292-2941.
För att bestämma den immunologiska skyddseffekten och tera- peutiska effekten av det renade och kombinerade immunoglobulin som erhållits ovan på patogent Pseudomonas aeruginosa av olika Fisher immunotyper ympades patogena Pseudomonas aeruginosa stam- mar av varje immunotyp i en musgrupp (sex grupper: 20 möss per grupp) vartill den kombinerade immunoglobulinkompositionen tidi- gare injicerats tre gånger, och en annan musgrupp (sex grupper: 10 möss per grupp som ej erhöll immunoglobulinkomposition) i en mängd av 1,0 till 3,0 x 105 celler per mus för att iakttaga den immunologiska skyddseffekten av det kombinerade immunoglobuli- net. I en annan musgrupp (sex grupper: 10 möss per grupp) ympa- des vidare först patogen Pseudomonas aeruginosa stam och efter 2 till 6 timmar injicerades den kombinerade immunoglobulinkomposi- tionen som erhållits ovan intravenöst i en mängd av 0,1 till 5 mg per mus med en vikt av ca 20 till 25 g för iakttagande av den terapeutiska effekten av immunoglobinkompositionen enligt före- liggande uppfinning.
Som resultat därav kunde visas att den kombinerade immuno- globulinkompositionen enligt föreliggande uppfinning uppvisar en immunologiskt skyddseffekt av 80% eller mer, och en terapeutisk effekt av 75% eller mer (bestämd som överlevnadsgraden (%) efter 7 dagar) under det att samtliga kontrollgrupper dött inom 3 da- gar.
Man kan följaktligen fastslå att den kombinerade immunoglobu- linkompositionen enligt föreliggande uppfinning kan användas som ett användbart läkemedel som uppvisar utmärkt terapeutisk effekt och en immunologisk skyddseffekt.
Exempel 15: Formulering av immunoglobuliner Kombinationen av cellväggproteiner som erhölls genom inkube- ring och extraktion av 4 typer av försvagade Pseudomonas aerugi- nosa stammar som selekterats i exempel 13, nämligen CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 20720 och CFCPA 60534 på samma sätt som i exemplen 5, 6 och 7, administrerades till en hanget på samma sätt som i exempel 14 för erhållande av ett kombinerat Pseudo- monas aeruginosa immunoglobulin som separerades och renades och därefter formulerades med hjälp av olika farmaceutiskt godtag- 507 114 40 bara bärare så att 1 till 100 mg antikropp immunoglobulin kan administreras per kg kroppsvikt. Det formulerade immunoglobuli- net administrerades till möss infekterade med Pseudomonas aeru- ginosa för att bestämma effekten av immunoglobulinet beroende på de typer av bärare som immunoglobulinet använt. Som resultat härav uppvisar i fallet med en flytande formulering immunoglobu- linpreparatet med fysiologisk salin för injektion eller fosfat- buffertlösning som bärare hög effektivitet och i fallet med lyo- filiserad beredning ger användning av mannitol, sackaros eller laktos som bärare immunoglobulinpreparatet en hög effekt. Å andra sidan sänker i en lyofiliserad formulering användning av humant albumin tillsammans med Pseudomonas aeruginosa immunoglo- bulin enligt föreliggande uppfinning effekten av immunoglobulin och i fallet med en flytande formulering ger användning av aluminiumhydroxid som en farmaceutisk bärare låg effekt. Test- resultaten sammanfattas i tabell 13. 507114 41 Tabell 13 Effekt av Pseudomonas aeruginosa immunoglobulin beroende på farmaoeutisk bärare Formuleringstyp Beståndsdelar Effekt Renad kombinerad immunoglobulin- ++++ komposition + mannitol (5-20%) Renad kombinerad immunoglobulin- +++ komposition + laktos (5-20%) Renad kombinerad immunoglobulin- +++ Lyofiliserad komposition + sackaros (5-20%) formulering Renad kombinerad immunoglobulin- ++ komposition + humant albumin (1-5%) Renad kombinerad immunoglobulin- ++++ komposition + fysiologisk salin Flytande formulering Renad kombinerad immunoglobulin- ++++ komposition + destillerat vatten för injektion Renad kombinerad imunoglobulin- ++++ komposition + fosfatbuffert- lösning Renad kombinerad immunoglobulin- ++ komposition + aluminiumhydroxid +_lösningsmedel Exempel 16: Effektivitet av formulerad immunoglobulinkomposition Immunoglobulin som formulerats med en fosfatbuffertlösning, som identifierats ge hög effektivitet enligt testresultatet i exempel 15, undersöktes för bestämning av effektiviteten som ett profylaktiskt och terapeutiskt medel för en sekundär kutan infektion vid rivsår, brännsâr, trauma och liknande. En mus erhöll ett brännsår enligt brännsårstestförfarandet [se J.
Infect. Dis. 131, 688-691, 1975]. Det flytande preparatet som innehöll 0,5 till 1 mg kombinerat Pseudomonas aeruginosa im- munoglobulin per 1 ml fosfatbuffertlösning formulerades till en spray, som därefter anbringades på den brännskadade delen av musen i försöksgruppen för att bestämma effekten därav jämfört med densamma i kontrollgruppen som ej behandlats med immunoglo- bulinspray. Som resultat av detta försök visar musgruppen som behandlats med immunoglobulin-fosfatbuffertlösningspray en anmärkningsvärt högre överlevnadsgrad än den icke behandlade 507 114 42 gruppen. Man kan följaktligen visa att Pseudomonas aeruginosa immunoglobulinhaltigt preparat enligt föreliggande uppfinning uppvisar en överlägsen skyddseffekt och en överlägsen terapeu- tisk effekt på Pseudomonas aeruginosa infektion. Resultaten av detta försök beskrives i följande tabell 14.
Tabell 14.
Resultat av brännakadatost ä r-í Behandling Antal Pseudomonas Överlevnadsgrad möss aeruginosa Ympníng 24h 48h 72h 96h eller mer Brännskada Lokal (behandlad 20 ympning 20/20 19/20 16/20 16/20 med immuno- globulin) Brännakada Lokal (inte 20 ympning 18/20 4/20 0/20 - behandlad med immuno- globulin) Kontroll- Ingen 10 ympning 10/10 10/10 10/10 10/10 E Såsom beskrivits ovan är varje försvagad Pseudomonas aerugi- nosastam enligt föreliggande uppfinning betydligt säkrare i för- hållande till vildarten eller den patogena arten. Eftersom vi- dare cellväggproteinerna därav uppvisar en utmärkt säkerhet och kors-skyddsegenskaper samt även en överlägsen neutraliserande antikroppsbildande kapacitet kan dessutom cellväggproteinerna användas inte bara som vaccin för profylax mot Pseudomonas aeruginosa infektion utan även som antikroppsinducerande medel i försöksdjur för framkallande av immunoglobulin som kan användas som ett terapeutiskt medel för Pseudomonas aeruginosa infektion.
Man kan följaktligen se att de försvagade Pseudomonas aerugi- nosa stammarna enligt föreliggande uppfinning är mycket använd- bara mikroorganismer för framställning av ett profylaktiskt 5Û7 114 43* vaccin och ett terapeutiskt medel för Pseudomonas aeruginosa infektion.
Claims (20)
1. En försvagad Pseudomonas aeruginosa stam vald ur den grupp som består av CFCPA 10142 (KCCM 10029), CFCPA 20215 (KCCM 10030), CFCPA 30720 (KCCM 10031), CFCPA 40057 (KCCM 10032), CFCPA 50243 (KCCM 10033), CFCPA 60534 (KCCM 10034), CFCPA 70018 (KCCM 10035), varvid varje stam utgör en av sju olika Fisher- Devlin immunotyper av försvagade Pseudomonas aeruginosa.
2. Användning av minst en Pseudomonas aeruginosa stam enligt krav 1 för framställning av ett vaccin för immunisering mot Pseudomonas aeruginosa infektion.
3. Ett polyvalent vaccin för induktion av ett immunsvar mot infektioner av Pseudomonas aeruginosa omfattande en blandning av cellväggproteiner härledda från minst en av sju olika Fisher- Devlin immunotyper av försvagade stammar av Pseudomonas aeruginosa valda ur den grupp som omfattar CFCPA 10142 (KCCM 10029), CFCPA 20215 (KCCM 10030), CFCPA 30720 (KCCM 10031), CFCPA 40057 (KCCM l0032),CFCPA 50243 (KCCM 10033), CFCPA 60534 (KCCM 10034) och CFCPA 70018 (KCCM 10035); vilka proteiner har en molekylvikt av 10.000 till 100.000 och ej innehåller cytoplasmaproteiner inklusive proteas, elastas, exotoxin A eller DNA och väsentligen ingen lipopolysackarid.
4. Vaccin enligt krav 3, vari proteinerna vart och ett härrör från stammarna CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 och CFCPA 60534, i ett blandningsförhållande mellan cellväggproteinerna av 1:1:l:1, 1:1:1,5:0,5 eller 0,5:1,5:l,5:0,5 med avseende på proteinkoncentration.
5. Ett förfarande för framställning av ett vaccin som ett profylaktiskt medel mot Pseudomonas aeruginosa infektion, omfat- tande stegen: (a) försvagning av utvalda stammar av Pseudomonas aeruginosa genom passage flera gånger genom en lämplig värd varvid inga mutagena substanser användes; (b) framställning av rena, isolerade celler av försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar; (c) behandling av mikroorganismcellerna med ett organiskt 45 507 114 lösningsmedel för inaktivering av cellerna och avlägsnande av lipidkomponenter; (d) extrahering av de så behandlade mikrooganismcellerna så att ett extrakt erhålles; (e) fraktionering och rening av det erhållna extraktet genom ultrafiltrering och/eller ultracentrifugering för selektion av en specifik fraktion av proteiner; (f) återvinning av den utvalda fraktionen av proteiner; och (g) framställning av ett vaccin under användning av den utvalda fraktionen av proteiner, varvid förbättringen omfattar att steg (d) utföres under tillräckligt milda betingelser för att mikroorganismens cellvägg ej skall förstöras, varigenom erhålles ett extrakt som ej innehåller några cytoplasmaprotei- ner, och att i steg (e) den specifika proteinfraktionen har en molekylvikt av 10.000 till 100.000 och väsentligen ej innehåller någon lipopolysackarid.
6. Förfarande enligt krav 5, varvid steg (d) utföres genom införing av de i steg (c) behandlade mikroorganismcellerna i en buffertlösning, varefter den erhållna blandningen får stå under försiktig omröring.
7. Förfarande enligt krav 6, varvid omröringen utföres vid 4°C med en blandare eller homogenisator som drives vid 100 till 2000 varv/min.
8. Förfarande enligt krav 6, varvid buffertlösningen väljes ur den grupp som består av en fosfatbuffertlösning och en tris- buffertlösning.
9. Förfarande enligt krav 6, varvid extraktet under eller efter steg (d) inspekteras för bestämning av huruvida mikroorga- nismcellerna har förstörts genom fastställande av förekomsten av laktosdehydrogenas eller hexokinas som ett cytoplasmiskt markör- enzym.
10. Förfarande enligt krav 5, varvid de stammar som användes i steg (b) väljes ur den grupp som består av Pseudomonas aerugi- nosa CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 och CFCPA 70018. 507 114
11. Förfarande enligt krav 5, varvid det organiska lösnings- medel som användes i steg (c) väljes ur den grupp som består av aceton, kloroform, etanol och butanol.
12. Förfarande enligt krav 5, varvid framställningen av rena isolerade celler av Pseudomonas aeruginosa stammar omfattar odling av stammarna i ett inkubationsmedium som innehåller glukos 30 g/l pepton 15 g/l Mgso., 0,5 g/l caco, 5 g/l KHZPO., 1 g/l FeS04 5 mg/l CuSO4 5 mg/l ZnSO4 5 mg/l.
13. Ett terapeutiskt medel för behandling av Pseudomonas aeruginosa infektion hos en patient som har infektionen, vilket medel omfattar minst ett immunoglobulin specifikt mot minst en Pseudomonas aeruginosa stam enligt krav 1, varvid detta immunoglobulin induceras genom injektion av vaccin enligt något av kraven 3-4 i en lämplig värd i en mängd som är tillräcklig för att inducera ett immunsvar i denna värd för att initiera produktion av detta immunoglobulin för att åtminstone minska de ogynnsamma effekterna av en sjukdom som orsakas av Pseudomonas aeruginosa.
14. Terapeutiskt medel enligt krav 13, som innehåller ett immunoglobulin mot var och en av de typer av Pseudomonas aerugi- nosa stammar som motsvarar Fisher immunotyp 1-7.
15. Terapeutiskt medel enligt krav 13, som innehåller immuno- globuliner mot vilka fyra typer som helst av de Pseudomonas aeruginosa stammar som motsvarar Fisher immunotyp 1-7.
16. Terapeutiskt medel enligt krav 13, som innehåller immu- noglobuliner mot vilka tre typer som helst av de Pseudomonas aeruginosa stammar som motsvarar Fisher immunotyp 1-7. 47 so? 11.4
17. Terapeutiskt medel enligt krav 13, som finns närvarande i lyofiliserad form.
18. Terapeutiskt medel enligt krav 13 som vidare omfattar en lämplig farmaceutiskt godtagbar bärare vald ur den grupp som består av mannitol, laktos, sackaros och humant albumin.
19. Terapeutiskt medel enligt krav 13, som finns närvarande i flytande form och som vidare omfattar lämpliga farmaceutiskt godtagbara bärare.
20. Terapeutiskt medel enligt krav 13, som framställts i farmaceutisk dosform som injektionspreparat, tablett, kapsel, ögondroppar, spray eller salva.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019930010281A KR970001710B1 (ko) | 1993-06-07 | 1993-06-07 | 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 |
| KR1019930010273A KR960014620B1 (ko) | 1993-06-07 | 1993-06-07 | 신규한 약독화 녹농균 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 |
| PCT/KR1994/000062 WO1994028928A1 (en) | 1993-06-07 | 1994-06-02 | Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9500418D0 SE9500418D0 (sv) | 1995-02-06 |
| SE9500418L SE9500418L (sv) | 1995-04-07 |
| SE507114C2 true SE507114C2 (sv) | 1998-03-30 |
Family
ID=26629705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9500418A SE507114C2 (sv) | 1993-06-07 | 1995-02-06 | Nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0702564B1 (sv) |
| JP (1) | JP2911603B2 (sv) |
| CN (1) | CN1112356A (sv) |
| AT (1) | AT408445B (sv) |
| AU (1) | AU676575B2 (sv) |
| CA (1) | CA2141871C (sv) |
| CH (1) | CH687233A5 (sv) |
| DE (3) | DE4493997C2 (sv) |
| ES (1) | ES2074968B1 (sv) |
| GB (1) | GB2285925B (sv) |
| NL (1) | NL194910C (sv) |
| NO (1) | NO317148B1 (sv) |
| RU (1) | RU2155226C2 (sv) |
| SE (1) | SE507114C2 (sv) |
| TW (1) | TW403655B (sv) |
| WO (1) | WO1994028928A1 (sv) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1086588C (zh) * | 1995-12-07 | 2002-06-26 | 余国华 | 假单胞菌活性蛋白及其生产方法 |
| CN1328371C (zh) * | 2005-09-01 | 2007-07-25 | 北京未名凯拓农业生物技术有限公司 | 一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用 |
| CN102534029A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 上海中优医药高科技有限公司 | MRSA中QacB基因的检测引物及其检测方法 |
| CN102534027A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 上海中优医药高科技有限公司 | MDRPA中QacEΔ1基因的检测引物及其检测方法 |
| IT201600091033A1 (it) * | 2016-09-08 | 2018-03-08 | Bioimmunizer Sagl | Ceppi di batteri probiotici appartenenti al genere Bifidobacterium e loro estratti di cellule probiotiche (ECP) aventi proprietà immunostimolanti. |
| CN109401992B (zh) * | 2017-08-18 | 2021-07-23 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌及其应用 |
| CN110724647B (zh) * | 2018-07-17 | 2022-11-04 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一株所产内毒素蛋白对7种血清型菌株具有免疫保护作用的铜绿假单胞菌及其应用 |
| US20220378902A1 (en) * | 2019-08-22 | 2022-12-01 | Sichuan University | Bacterial membrane vesicles, and separation and preparation system and method therefor |
| CN114763544A (zh) * | 2021-01-15 | 2022-07-19 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种铜绿假单胞菌高产蛋白菌株的生物诱变方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3987164A (en) * | 1970-10-20 | 1976-10-19 | Yuzuru Homma | Method for prevention of pseudomonas aeruginosa infections |
| US3928565A (en) * | 1971-10-19 | 1975-12-23 | Yuzuru Homma | Pharmaceutical preparation of pseudomonas aeruginosa bacterial component possessing anti-tumor and anti-infection properties |
| JPS5612435B1 (sv) * | 1971-03-29 | 1981-03-20 | ||
| DE3829616C2 (de) * | 1988-09-01 | 1996-08-29 | Behringwerke Ag | Lipoprotein I (OMPI) von Pseudomonas aeruginosa |
-
1994
- 1994-06-02 DE DE4493997A patent/DE4493997C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 AU AU68571/94A patent/AU676575B2/en not_active Ceased
- 1994-06-02 CA CA002141871A patent/CA2141871C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 CN CN94190491A patent/CN1112356A/zh active Pending
- 1994-06-02 EP EP94917176A patent/EP0702564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-02 CH CH00454/95A patent/CH687233A5/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 AT AT0900694A patent/AT408445B/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 ES ES09550003A patent/ES2074968B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 JP JP7501593A patent/JP2911603B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 RU RU95113158/13A patent/RU2155226C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 NL NL9420005A patent/NL194910C/nl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-02 GB GB9502373A patent/GB2285925B/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 WO PCT/KR1994/000062 patent/WO1994028928A1/en active IP Right Grant
- 1994-06-02 DE DE4447677A patent/DE4447677C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-02 DE DE4493997T patent/DE4493997T1/de active Pending
- 1994-06-04 TW TW083105105A patent/TW403655B/zh not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-02-06 NO NO19950421A patent/NO317148B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-02-06 SE SE9500418A patent/SE507114C2/sv not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9502373D0 (en) | 1995-03-29 |
| NL194910B (nl) | 2003-03-03 |
| WO1994028928A1 (en) | 1994-12-22 |
| JP2911603B2 (ja) | 1999-06-23 |
| GB2285925A (en) | 1995-08-02 |
| DE4447677C2 (de) | 1998-07-23 |
| ES2074968B1 (es) | 1996-05-01 |
| AT408445B (de) | 2001-11-26 |
| NO950421D0 (no) | 1995-02-06 |
| CH687233A5 (de) | 1996-10-31 |
| CN1112356A (zh) | 1995-11-22 |
| SE9500418D0 (sv) | 1995-02-06 |
| NO950421L (no) | 1995-04-07 |
| NL9420005A (nl) | 1995-06-01 |
| ATA900694A (de) | 2001-04-15 |
| EP0702564B1 (en) | 2000-03-01 |
| CA2141871A1 (en) | 1994-12-22 |
| NL194910C (nl) | 2003-07-04 |
| TW403655B (en) | 2000-09-01 |
| JPH09501826A (ja) | 1997-02-25 |
| DE4493997C2 (de) | 1997-07-17 |
| AU676575B2 (en) | 1997-03-13 |
| GB2285925B (en) | 1997-04-09 |
| NO317148B1 (no) | 2004-08-30 |
| EP0702564A1 (en) | 1996-03-27 |
| AU6857194A (en) | 1995-01-03 |
| DE4493997T1 (de) | 1995-10-05 |
| RU2155226C2 (ru) | 2000-08-27 |
| CA2141871C (en) | 1999-05-11 |
| SE9500418L (sv) | 1995-04-07 |
| ES2074968A1 (es) | 1995-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stoenner et al. | Antigenic variation of Borrelia hermsii. | |
| EP0648127B1 (en) | Type i surface antigens associated with staphylococcus epidermidis | |
| Lancefield et al. | The properties of T antigens extracted from group A hemolytic streptococci | |
| Hatheway et al. | Atypical toxin variant of Clostridium botulinum type B associated with infant botulism | |
| US6391315B1 (en) | Vaccine for inhibiting and preventing induced staphylococcus infection, isolated antigens used therein, and isolated antibodies induced thereby | |
| SE507114C2 (sv) | Nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar | |
| US5215914A (en) | Adherent and invasive mycoplasma | |
| CN1134112A (zh) | 衣原体感染的疫苗及治疗方法 | |
| US5861163A (en) | Process for preparing a vaccine against pseudomonas aeruginosa using attenuated strains | |
| EP0761819A1 (en) | Exopolysaccharides of burkholderia pseudomallei and burkholderia mallei | |
| KR970001704B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 20215를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001703B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 10142를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR960014620B1 (ko) | 신규한 약독화 녹농균 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| Iwanaga et al. | Pili of Vibrio cholerae widely distributed in serogroup O1 strains | |
| KR970001707B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 50243을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001709B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 70018을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| OKADA et al. | Monoclonal antibodies against the haemolysin of Vibrio vulnificus | |
| KR970001705B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 30720을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001706B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 40057을 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001708B1 (ko) | 약독화 녹농균주 cfcpa 60534를 이용한 녹농균 감염 예방 백신 | |
| KR970001710B1 (ko) | 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 | |
| KR100421453B1 (ko) | 그람음성균에 의해 유발되는 질환의 예방 백신 및 그의제조방법 | |
| Peterson et al. | Pathogenesis of Salmonellosis: Salmonella Exotoxins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |