KR970001710B1 - 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 - Google Patents

녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR970001710B1
KR970001710B1 KR1019930010281A KR930010281A KR970001710B1 KR 970001710 B1 KR970001710 B1 KR 970001710B1 KR 1019930010281 A KR1019930010281 A KR 1019930010281A KR 930010281 A KR930010281 A KR 930010281A KR 970001710 B1 KR970001710 B1 KR 970001710B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pseudomonas aeruginosa
cfcpa
kccm
cell wall
agent
Prior art date
Application number
KR1019930010281A
Other languages
English (en)
Other versions
KR950000164A (ko
Inventor
김현수
박완제
문우상
유왕돈
노갑수
이남중
김영지
조양제
Original Assignee
제일제당 주식회사
이종기
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1019930010281A priority Critical patent/KR970001710B1/ko
Application filed by 제일제당 주식회사, 이종기 filed Critical 제일제당 주식회사
Priority to CH00454/95A priority patent/CH687233A5/de
Priority to NL9420005A priority patent/NL194910C/nl
Priority to DE4493997T priority patent/DE4493997T1/de
Priority to CA002141871A priority patent/CA2141871C/en
Priority to EP94917176A priority patent/EP0702564B1/en
Priority to DE4447677A priority patent/DE4447677C2/de
Priority to JP7501593A priority patent/JP2911603B2/ja
Priority to GB9502373A priority patent/GB2285925B/en
Priority to AT0900694A priority patent/AT408445B/de
Priority to AU68571/94A priority patent/AU676575B2/en
Priority to RU95113158/13A priority patent/RU2155226C2/ru
Priority to ES09550003A priority patent/ES2074968B1/es
Priority to CN94190491A priority patent/CN1112356A/zh
Priority to DE4493997A priority patent/DE4493997C2/de
Priority to PCT/KR1994/000062 priority patent/WO1994028928A1/en
Priority to TW083105105A priority patent/TW403655B/zh
Publication of KR950000164A publication Critical patent/KR950000164A/ko
Priority to SE9500418A priority patent/SE507114C2/sv
Priority to NO19950421A priority patent/NO317148B1/no
Priority to US08/773,330 priority patent/US5861163A/en
Publication of KR970001710B1 publication Critical patent/KR970001710B1/ko
Application granted granted Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조 방법
본 발명은 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 신규한 약독화 녹농균주( Pseudomonas aeruginosa)로부터 순수하게 분리된 세포벽 단백질에 의해 유도된 면역글로부린을 함유하는 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 길이가 1.5 내지 3.0㎛이고, 폭이 0.5㎛ 정도인 간균으로서 1개의 편모를 갖고 있고 운동성이 있는 통성 호기성의 그람 음성균이며 토양, 물, 하수 및 사람의 장관에 널리 분포되어 있다[Mol. Microbiol. 4, 1069-1075, 1990]. 이러한 녹농균은 패혈증, 전신감염, 만성기도감염증, 췌낭포성 섬유증 등의 난치성 감염을 일으키는 병원성 균이다. 특히 녹농균에 의해 야기되는 패혈증은 수술, 열상 및 외상 등에 의해 저항력이 저하된 환자의 혈액중에 미생물 그 자체가 침입하거나 그의 독성 구성성분이 분비됨으로써 유발되는 질병으로 고열, 혈압저하 등의 쇼크를 일으켜 결국 사망에 까지 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 더구나 최근에는 녹농균이 요도감염증에서도 검출되어 더욱 주목을 받게 되었다. 따라서, 녹농균에 의해 야기되는 패혈증, 요도감염증 등의 난치성 화농성 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 약제의 개발이 절실이 요구되어 왔다. 그러나, 녹농균은 일부의 항생제를 제외한 상용 항생물질에 대해 내성을 갖고 있을 뿐만 아니라 현재까지도 좋은 효과를 갖는 치료제가 개발되어 있지 않은 상태이므로 녹농균 감염으로 인한 치사율이 갈수록 높아지고 있다.
녹농균은 여러 가지 방법으로 분류되고 있는데, 녹농균의 일반화된 대표적인 분류방법으로는 피셔 면역형태(Fisher Immunotype)에 따라 7가지로 분류하는 방법, 테라다(Terada)에 의해 제안된 o-항원 그룹 분류방법, 또는 IATS(International Antigenic Typing Scheme) 분류방법 등이 있다. 분류형태별로 볼 때 녹농균 감염증 환자로부터 가장 빈번하게 검출되는 녹농균주는 피셔 면역형/o-혈청으로서 5/2a, 2c, 3,7/3a 3c, 1/4a, 4b, 6/5a, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /11 및 3,7/3d, 3e 형이며, 특히 피셔 면역형으로서 3, 7, 2 및 1형(o-혈청형으로 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a 및 4b에 상응함)이 주종을 이루고 있다.
현재까지 개발되어 실용화된 녹농균 감염증에 대한 치료법으로 녹농균에 대한 항독소를 만들어 녹농균에 의해 분비되는 독소를 중화시키는 방법이다. 그러나 항독소는 가격이 고가이기 때문에 일반 환자에게 범용적으로 사용할 수는 없다는 단점이 있을 뿐 아니라, 가장 커다란 결점은 항독소의 투여에 의한 녹농균 감염증의 완치율이 비교적 낮으며, 이에 비해 부작용은 크다는 점이다.
또 다른 녹농균 감염증에 대한 공지의 치료방법으로 광범위 항생물질이나 녹농균에 대해 선택성이 높은 화학요법제 등을 선택하여 치료하는 방법이 있으나, 녹농균의 약제내성이 일반적으로 매우 높고 형(type)이 다양하여 치료가 불가능한 녹농균에 의한 희생자가 많았다. 또한, 치료성 면역글로부린을 이용하는 방법이 개발되어 있으나, 이 면역글로부린은 특정의 미생물들에 대한 폴리클로날 항체를 제조하는 방법에 의해 제조된 것이기 때문에 수많은 녹농균에 대해 공통적으로 작용할 수 없어 모든 녹농균 감염증을 치료할 수 없거나 유효성이 낮아 극히 제한된 범위의 녹농균 감염증에만 사용되어 왔다.
또 다른 방법으로는 세포 융합 기술을 이용하여 녹농균에 대한 마우스 모노클로날 항체[J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985] 또는 인간 모노클로날 항체[FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990]를 생산하고, 각 항체중에서 녹농균을 가장 잘 중화시킬 수 있는 항체생산 세포주를 선별하여 이것을 생산 균주로 이용한 대량 생산을 통해 저가의 치료제를 개발하려 하는 시도가 있다. 그러나 이 방법 역시 한 종류의 모노클로날 항체에 의해서만은 현재까지 혈청학적, 면역학적으로 알려진 수십여종의 녹농균에 의한 감염증을 모두 치료할 수는 없기 때문에 감염된 환자 모두를 효과적으로 치료할 수 없다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 서로간의 교차반응성(cross-reactivity)을 조사하여 몇가지의 항체를 동시에 투여하는 방법과 녹농균 감염 환자의 혈액을 채취하여 녹농균의 혈청학적 또는 면역학적 형태를 규명하여 여기에 맞는 모노클로날 항체를 투여하는 방법이 제시되기도 하였으나. 이것 역시 시간이 많이 소요되기 때문에 시간을 다투는 환자의 치료법으로는 부적절하다.
이에 본 발명자들은 다양한 형태의 녹농균에 의한 감염증에 대하여 높은 유효성을 나타낼 수 있는 치료제를 개발하고자 광범하고 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 특정하게 약독화시킨 녹농균주들로부터 얻은 세포벽 단백질을 항체유도인자로 하여 동물체내에서 녹농균 감염증에 대한 면역글로부린을 생성시키면, 이러한 면역글로부린이 다양한 녹농균 감염 뿐 아니라 중증의 감염증에 대하여도 우수한 치료효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다, 특히 본 발명은 약독화시킨 안전한 녹농균주로부터 세포벽 단백질을 순수하게 분리 정제하여 이것을 항체 유도물질로서 실험동물에게 주입하여 유도생성되는 면역글로부린을 함유하는 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다.
본 발명에서 항체 유도물질인 세포벽 단백질의 공급원으로 사용되는 약독화 녹농균주는 신규한 균주로써 본 출원과 동일자로 출원되는 본 출원인의 다른 특허출원의 대상이다. 이 약독화 녹농균주는 녹농균에 감염된 환자로부터 녹농균주를 분리하여, 이들 분리된 미생물들을 피셔 면역형태에 따라 7종으로 분류한 후, 이 중 대표적인 미생물들을 면역형태별로 1주씩 선택하여 이들을 각각 실험동물에 반복적으로 주입해서 순화시켜 각 균주에 대해 가장 약독화된 균주를 선별하여 얻어지는 안전한 약독화 균주이다. 이렇게 하여 수득되는 안전한 약독화 녹농균주는 CFCPA 10142(피셔 1형), CFCPA 20215(피셔 2형), CFCPA 30720(피셔 3형), CFCPA 40057(피셔 4형), CFCPA 50243(피셔 5형), CFCPA 60534(피셔 6)형 및 CFCPA 70018(피셔 7형)의 7종이며, 이들 균주는 1993년 5월 12일자로 국제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에 기탁되어 CFCPA 10142는 KCCM 10029, CFCPA 20215는 KCCM 10030, CFCPA 30720으 KCCM 10031, CFCPA 40057은 KCCM 10032, CFCPA 50243은 KCCM 10033, CFCPA 60534는 KCCM 10034, 또한 CFCPA 70018은 KCCM 10035의 기탁번호를 부여 받았다.
이러한 약독화 녹농균주를 최적 생장조건을 유지한 발효조에서 배양하여 다량의 균체를 수득하고, 수득한 균체를 각각 유기용매 처리 및 추출, 한외 여과에 의한 분자량 크기에 따른 분리, 초원심분리 등의 일련의 과정에 따라 처리함으로써 세포벽 단백질을 수득한다.
이 과정에서 약독화 녹농균주의 배양을 위한 배지로는 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)를 사용하거나, 특히는 녹농균주의 배양에 적합하도록 구성된 특수 배지를 사용한다. 이 특수배지는 글루코즈(30ｇ/l), 펩톤(15ｇ/l), MgSO4(0.5g/l), CaCO3(5g/l), KH2PO4(1g/l), FeSO4(5mg/l), CuSO4(5mg/l) 및 ZnSO4(5mg/l)로 구성된다. 이 특수배지는 녹농균주의 배양에 적합하도록 본 발명자들에 의해 특별히 고안된 것으로 신규한 것이다. 이들 농녹균주를 특수배지에서 배양하면 트립틱 소이 브로스 배지에서 배양하였을 때에 비해 건조 균체의 중량을 기준하여 적어도 30% 이상 높은 건조균체를 수득할 수 있으므로 특수배지를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
이러한 균체 배양단계에서 최적 배양 조건은 온도 37℃, 통기량 1vvm (volume / volume·minute), 접종량은 배양배지액의 5v/v%로 하는 것이며, 초기 2시간은 교반속도를 100ppm으로 하고, 그후에는 600rpm으로 하여 10 내지 20시간, 바람직하게는 12내지 16시간 동안 배양한다.
배양이 완료되면, 제2단계로 배양액으로 부터 침전된 세포를 원심분리 등의 방법에 의해 분리한다. 분리한 세포를 제3단계에서는 유기용매로 처리하여 미생물을 불활성화시키는 동시에 세포벽 지질 성분을 제거한다. 이때 유기용매로 바람직하게는 아세톤, 클로로포름, 에탄올, 부탄올 등이 사용되며, 가장 바람직하게는 아세톤이 사용된다.
계속해서, 제4단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 하면서 5 내지 6회 반복해서 세포벽 단백질을 추출한다. 이를 위해서는 미생물 세포를 인산염 완충액, 트리스염 완충액 등의 용매, 바람직하게는 인산염 완충액중에서 정치시키거나 믹서(mixer) 또는 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 추출한다. 추출과정은 4℃에서 100내지 2000rpm으로 교반하여 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 제4단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 주의하여야 하며, 이는 목적하는 세포벽 단백질에 세포질내의 유독성 단백질 및 핵산이 혼입되는 것을 방지하기 위해서이다. 따라서, 추출과정중에 세포질내 표지효소인 락테이트 데하이드로게나제 또는 헥소키나제를 측정함으로써 세포의 파쇄여부를 계속 확인하는 것이 필요하다.
이렇게 하여 상등액으로부터 수득되는 약독화 녹농균주의 세포벽 단백질은 1차 및 2차 한외여과하여 분자량이 10,000내지 100,000범위의 단백질만이 수득되도록 분획화시킨다. 이때 세포벽 단백질의 분자량 범위가 10,000내지 100,000이 되도록 하는 것은 매우 중요한데, 이는 분자량이 10,000 미만이면 실험동물을 사용한 실험에 의해 밝혀진 것으로 목적하는 항체유도 물질로서의 효과가 없고,분자량이 100,000 보다 큰 범위에서는 고분자량의 리포폴리사카라이드(LPS)의 존재로 인해 독성이 야기될 수 있기 때문이다.
분리된 분자량 범위 10,000 내지 100,000의 세포벽 단백질 분획은 다시 초원심분리(ultracentrifuge)하여 잔존할 수 있는 미량의 리포폴리사카이드를 제거함으로써 순수한 세포벽 단백질을 수득한다.
이렇게 순수하게 분리된 약독화 녹농균의 세포벽 단백질을 항원으로 하며 양, 토끼 등의 실험동물에게 접종하여 항체, 형성을 유도한 후, 실험동물로 부터 채혈하여 혈청을 분리한다. 분리된 혈청을 공지의 방법으로 처리하여 목적하는 면역글로부린을 정제된 형태로 수득한다. 이때, 혈청으로 부터 면역글로부린을 정제하여 분리하는 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 수행하며[참조 : Practical Immunology, 3rd Ed., pp 292-294], 예를들면 분리된 혈청을 증류수와 혼합하여 DEAE-셀룰로즈에 가하여 흡착시킨 후, 상등액을 버리고 면역글로부린이 흡착된 DEAE-셀룰로즈를 인산염 완충액으로 수회 반복 세척하여 정제된 면역글로부린을 수득할 수 있다.
이렇게 하여 각각의 약독화 녹농균으로부터 얻은 세포벽 단백질을 일정비율로 혼합하여 실험동물을 면역시켜 수득한 면역글로부린을 녹농균 감염증에 대한 치료제로 사용한다. 7종의 약독화 녹농균주의 세포벽 단백질 각각을 일정비율로, 일반적으로는 거의 동량의 배율로 배합시켜 실험동물을 면역시켜 얻어진 면역글로부린을 사용할 수도 있지만, 서로의 교차 반응성을 고려하여 볼 때 바람직하게는, 약독화 녹농균주 CFCPA 10142 CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534의 4종의 균주로부터 얻은 세포벽 단백질을 1:1:1:1의 비로 배합하고 면역시켜 얻어진 면역글로부린을 사용함으로서도 피셔 1,2,3,4,5,6 및 7형 모두의 녹농균에 의한 감염증에 대해 우수한 치료효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따르는 녹농균에 대한 면역글로부린은 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 예를들면 안정화제, 보존제, 등장화제 등을 추가로 함유하는 동결건조제제 또는 액체형태의 약제학적 조성물, 바람직하게는 주사제 형태로 제형화시킬 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 예를들면, 동결건조제제의 경우 만니톨, 락토즈, 사카로즈, 인체 알부민 등이며, 액체제제의 경우에는 생리식염수, 주사용 증류수, 인산염 완충액, 수산화알루미늄 등이다.
투여용량은 녹농균에 감염된 환자의 연령, 체중, 성별,건강상태 및 녹농균 감염증의 중증도 및 또한 배합된 면역글로부린의 종류에 따라 광범하게 변화하지만, 일반적으로 성인 체중 kg당 1일 0.1mg 내지 1000mg, 바람직하게는 1mg 내지 100mg을 정맥내 투여한다.
본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
녹농균 감염 환자로부터 녹농균의 분리 및 동정
녹농균 감염증 환자들로부터 채혈된 서로 상이한 260종의 혈액을 각각 약 1내지 5ml씩 무균적으로 분양 받아 실온에서 1시간 정도 방치한 후, 4℃의 냉장고에서 밤새 보관한 다음 4℃에서 1500g으로 10분간 원심분리하여 고형물을 제거하고 상등액으로 혈청을 수득하였다. 미리 준비된 1.0내지 1.5% 아가(agaar)를 첨가한 트립틱 소이 브로스 배양평판에 상기에서 얻어진 혈청을 인산염 완충용액(당 Na2HPO41.15g, KCl 0.2g, KH2PO40.2g, NaCl 8.766g)으로 1:10의 비로 희석하여 각각을 도말한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건의 배양기에서 12시간 이상 배양하였다. 이렇게 하여 수득된 배양물을 새로운 배양 평판에 옮겨서 공지의 미생물 순수분리방법[참조 : Biology of Microorganisms]을 사용하여 미생물을 순수한 형태로 분리하였다.
실시예 2
분리된 각 녹농균으로부터 약독화된 미생물의 선별
녹농균을 백신 제조에 사용될 수 있는 안전한 미생물로 약독화 시키기 위해서 실시예 1에서 분리된 다른 면역형태를 가진 균주중의 대표적인 미생물을 각각 1주씩 선택하여, 이 미생물을 가지고 반복적인 순화를 통해서 약독화시켰다. 이때 대조군으로 사용되는 독성 녹농균은 GN 11189(일본의 Episome Institute로 부터 구입)를 선택하였으며, GN11189은 2.0×106세포를 체중 20 내지 35g의 수컷 ICR 생쥐에 정맥(또는 복강)을 통해서 주입하게 되면 3일 이내에 100%의 치사율을 나타낸다.
상기에서 선택된 면역형태가 다른 각 1주씩의 녹농균을 각각 트립틱 소이 브로스 내에서 실시예 1에서와 동일한 조건하에 액체 배양한 후, 4℃에서 6000g으로 10분간 원심분리한다. 수득된 세포 침전물을 생리식염수 10ml에 현탁시켜 상기와 동일한 조건으로 재원심 분리한 후, 신선한 생리식염수로 ml당 5×105, 5×106, 5×107및 5×108세포가 되도록 적절히 희석하여 각각의 세포들을 한 그룹당 10마리씩의 생쥐에게 정맥(또는 복강을 통해) 투여하였다. 이때 대조군에게는 GN 11189균주 2.0×106세포만을 투여하였으며, 3일 이내 모두 100% 치사율을 보이는 시점에서 가장 높은 균체 농도에서 생존한 ICR 생쥐로부터 녹농균을 다시 무균적으로 분리하였다. 분리한 녹농균을 다시 트립틱 소이 아가 평판배지에 도말하여 상기에 언급한 미생물 순수 분리 방법을 사용하여 각각의 미생물을 순수하게 분리하였다.
상기와 같이 생쥐를 통해 1차로 약독화시킨 미생물을 재차 상기와 동일한 방법으로 3 내지 7회 반복 투여하여 목적하는 LD50이 최소 2.0×107세포 이상이 될 때까지 선택된 7균주 모두를 반복해서 처리하였다. 각각의 안전하게 약독화된 최종 미생물의 LD50으로 표시한 안전성 측정치는 표 1에서 나태었다.
실시예 3
약독화된 녹농균주의 확인
121℃에서 15분간 고압증기 멸균시킨 액체 영양배지(pH 7.2 내지 7.4)에 멸균된 10%(w/v) 세트리미드(Cetrimide)를 최종 농도가 0.3%(v/v)가 되도록 가하였다. 이렇게 하여 수득한 배지를 10ml씩 무균적으로 분취하여 시험관에 넣고, 여기에 상기 실시예 2로부터 순수하게 분리시킨 약독화 녹농균주들은 각각 1적씩 접종하고 30 내지 37℃에서 12 내지 16시간 동안 종배양하였다. 증식이 일어난 것으로 확인된 시험관에서 배양액 0.5ml씩을 취하여 녹농균 분리용 배지인 세트리미드 한천 배지에 도말하여 평판배양한 다음, 색소형성 등에 의해 녹농균으로 일차 확인된 집락을 플루오레신(fluorescin) 검출용 녹농균 한천 배지(Pseudononas agar medium) 및 파이오시아닌(pyocyanin) 검출용 녹농균 한천배지에 차례로 옮겨 배양한 다음, 형태학적 시험, 영양자화성 및 옥시다제(oxidase) 반응시험을 행하여 녹농균을 다시 확인 동정하였다.
이때, 선별된 녹농균의 형태는 녹농균 항원 킷트(Pseudomonas aeruginosa antigen kit : Difco사 제품)를 사용하여 IATS 분류법에 따라 o-혈청형을 판별한 후 피셔 면역혈청 형태에 따라 분류하였다. 시험결과는 다음표 2에 기재된 바와 같다.
실시예 4
약독화 녹농균의 배양
(1) 실시예 2에 따라 수득된 녹농균의 균체를 다량으로 수득하기 위해 5L 배양기를 사용하였다. 5L 배양기에, 증류수 1당 트립틱 소이 브로스 30g을 용해시켜 수득한 배지용액 2.5를 pH 7.2로 조정하여 멸균시킨 후에 도입시켰다. 배양온도는 37℃, 통기량은 1vvm, 접종량은 배양용액에 대해 실시예 2에서 수득한 약독화 녹농균 균체 5(v/v)%의 조건을 사용하였으며 초기 2시간 동안은 교반 속도를 100rpm으로 유지하고, 그 이후에는 600rpm으로 고정시킨 후 12 내지 16시간 동안 배양하였다. 녹농균의 종류에 따라서 수득된 균체의 양은 다소 다르나, 평균적으로 배양액당 대략 8g(건조 중량)의 균체를 얻었다.
(2) 배지로 글루코즈(30g/), 펩톤(15g/), MgSO4(0.5g/), CaCO3(5g/), KH2PO4(1g/), FeSO4(5mg/), CuSO4(5mg/) 및 ZnSO4(5mg/)로 구성된 녹농균 배양용 특수배지를 사용하는 것을 제외하고는 상기(1)에서와 동일한 배양조건으로 약독화 녹농균 7종 각각을 배양하였다. 이 특수배지를 사용함으로써 각 균주당 건조중량 약 10.4 내지 10.5g의 균체를 수득하였다. 따라서 트립틱 소이 브로스를 사용한 경우에 비해 최소 30% 이상 높은 건조 중량의 균체를 수득할 수 있었다.
실시예 5
약독화 녹농균으로 부터 세포벽 단밸질의 부분 정제
녹농균에 대한 백신을 제조하기 위해 7종의 약독화 녹농균으로부터 세포벽 단백질을 부분 정제하였다. 이하에서는 대표적인 예로 타입 3의 균주 CFCPA 30720을 사용하였으며, 다른 약독화 녹농균주에 대해서도 하기에 언급한 정제방법과 동일한 방법을 사용하여 정제하였다.
5L 발효조에 2.5L의 상기 실시예 4(2)에서 사용된 특수배지를 가한 후, 상기에서 언급한 것과 동일한 배양조건을 유지하면서 12 내지 16시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 2.5L의 배양액을 4℃에서 6000g으로 20분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전된 세포를 4℃의 인산염 완충액(당 Na2HPO41.15g, KCl 0.2g, KH2PO40.2g, NaCl 8.766g, pH 7.2)에 현탁시키고 다시 원심분리한 후, 동일한 인산염 완충액으로 세포를 세척하였다. 수득된 세포 100g에 3용적의 아세톤을 가하여 4℃에서 12시간 이상 동안 방치하였다. 침전된 세포로부터 아세톤을 제거한 후, 2용적의 신선한 아세톤을 다시 가하여 5 내지 10분 동안 교반하고 4℃에서 8000g으로 20분간 원심분리 시켰다. 상층의 아세톤을 제거하고 잔류물에 동일 용적의 아세톤을 가하여 상기와 동일한 방법으로 교반한 다음 원심분리하고 상등액을 제거하여 침전된 세포를 실온상태로 평판상에서 건조시켜 아세톤을 제거하였다. 건조시킨 미생물을 10(w/v)% 최종농도가 되도록 250ml의 상기와 동일한 인산염 완충액을 가하여 현탁시켰다. 4℃로 유지된 상태에서 균질화기를 사용하여 10분 동안 500 내지 1500rpm의 속도로 세포벽 단백질을 추출하였다. 수득된 현탁액을 8000 내지 10000g으로 30분간 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, 침전세포에 다시 동일 용적의 인산염 완충액을 가하여 현탁시킨 후, 상기의 추출방법과 동일한 조건으로 2차 추출하여 다시 상등액을 얻었다.
상기에서 사용한 추출방법과 동일한 조건을 사용하여 세포가 파쇄되지 않는 상태로 유지해 주면서 5 내지 6회 반복 추출하였다. 이때 세포의 파쇄 여부는 세포질내 표지물질인 특정 단백질, 즉 락테이트 데하이드로게나제 또는 헥소키나제를 측정함으로써 확인하였다. 세포질내 단백질인 락테이트 데하이드로게나제 및 헥소키나제가 혼입되지 않은 상태로 세포벽 단백질이 추출되어 있는 것으로 확인된 각각의 추출된 상등액을 모아 교반한 다음, 최종적으로 4℃에서 10,000g으로 30분간 재원심분리하여 등명한 상등액을 수득하였다. 이렇게 하여 수득된 2내지 2.5L의 조 세포벽 단백질 수용액을 페리콘 카세트 시스템(Pellicon Cassette System)에서 분자량 100,000-절단 막 여과기(Cut-off membrane filter)를 사용하여 먼저 분자량 100,000이상의 단백질 분자를 제거한다. 이렇게 하면 분자량이 100,000 이하인 단백질은 여과액(filtrate)으로 빠져나가게 되며 분자량이 100,000보다 큰 단백질은 계속 순환되면서 분자량이 100,000보다 작은 분자들을 분리 시키게 된다.
최초 용적의 10 내지 20%로 농축된 단백질 수용액을 최초 용적의 10배인 20 내지 25L의 멸균된 인산염 완충액(당 Na2HPO4 1.15g, KCl 0.2g, KH2PO40.2g, NaCl 8.766g)으로 계속 세척해줌으로써 분자량 100,000 이하인 단백질을 90% 이상 회수할 수 있었다. 여과액으로 분리된 분자량 100,000 이하의 단백질을 동일 시스템에서 분자량 10,000-절단 막 여과기를 사용하여 분자량이 10,000 미만인 단백질 및 기타 성분을 제거하는 동시에 분자량 10,000 내지 100,000 사이 단백질을 1mg/ml의 농도가 될 때까지 농축시켰다.
최종적으로, 상기에서 수득한 상등액에 미량으로 존재하는 리포폴리사카라이드(LPS)나 세포벽 관련 단편들을 제거하기 위해 상등액을 초원심분리시켰다. 초원심분리는 4℃로 유지된 상태에서 180,000g 내지 200,000g으로 3시간 동안 수행하여 침전물을 제거한 후, 수득한 상등액을 0.2㎛ 필터를 사용하여 제균함으로써 최종적으로 순수한 세포벽 단백질 250 내지 260mg을 수득하였다.
실시예 6
녹농균에 대한 면역글로부린의 생성
실시예 5에서 수득한 단백질 용액을 토끼에게 투여하여 상응하는 면역글로부린을 생성시킨다. 이하에서는 대표적인 예로 약독화 녹농균주인 CFCPA 30720으로부터 수득한 세포벽 단백질을 사용하였으며, 다른 약독화 녹농균주에 대해서도 하기에 언급한 방법과 동일한 방법을 적용시킬 수 있다.
실시예 5에서 CFCPA 30720 균주로부터 수득한 세포벽 단백질 용액 0.5내지 1ml(세포벽 단백질 100 내지 200㎍을 함유)를 알비노 토끼에게 7일 간격으로 3회 접종하였다. 그후 토끼의 혈액을 일정한 간격으로 채혈하여 혈청을 분리시켰다. 분리된 토끼 혈청 100ml를 증류수 300ml와 혼합하여 4℃의 DEAE 셀룰로즈 500g(습윤중량)에 가하였다. 이 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 충분히 진탕한 후, 정치시켜 분리되는 상등액을 제거하고 잔류물을 0.01M 인산염 완충액(구성:당 Na2HPO41.15g, KH2PO40.2g, KCl 0.2g, NaCl 8.766g, pH 8.0) 200ml씩으로 3회 세척하여 순도 96% 이상의 면역글로부린 IgG 600mg을 수득하였다.
실시예7
면역글로부린의 녹농균 감염증에 대한 치료효과
실시예 6에서 수득한 각 균주에 대한 면역글로부린의 녹농균 감염증에 대한 치료효과를 다음과 같은 방법에 의해 확인하였다. 이하에서는 각 군당 10마리씩의 생쥐를 사용하였다.
생쥐에게 피셔 면역형 1,2,3,4,5,6,7 각각의 병원성 녹농균 균주를 각각 1.0내지 3.0×106세포씩 복강내 주사하여 녹농균 감염증을 야기시키고, 2 내지 6시간 후에 정제된 각 균주에 대한 면역글로부린을 생쥐당 0.1 내지 2mg의 양으로 정맥주사하여 치료효과를 시험하였다. 대조군에는 면역글로부린 대신에 주사용 생리식염수 0.5ml를 정맥주사하였다. 이 시험에서 사용된 면역글로부린은 각각 CFCPA 10142 균주에 대한 면역글로부린, CFCPA 20215 균주에 대한 면역글로부린, CFCPA 30720 균주에 대한 면역글로부린, CFCPA 60534 균주에 대한 면역글로부린 및 이들 4종의 면역글로부린의 혼합물이었다.
그 결과, 주사용 생리식염수만을 투여한 대조군에서는 48시간 이내에 50% 이상, 72시간에 100%의 치사율로 나타낸 반면에 각각의 해당 면역글로부린을 투여한 군에서는 72시간 후에도 80% 이상의 생존율을 나타내었다. 따라서, 면역글로부린이 해당 피셔 면역형의 병원성 녹농균주에 의한 감염증의 치료에 유효한 것으로 입증된다.
그러나, 개개의 면역글로부린은 피셔 4형 및 5형의 병원성 녹농균주에 의한 감염증에 대하여는 치료효과가 비교적 낮았다. 반면에 각 4종의 면역글로부린을 1:1:1:1로 배합하여 투여한 생쥐군에서는 피셔 4형과 5형에 대해서도 교차반응성을 나타내어 우수한 치료효과를 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따르는 배합된 면역글로부린 조성물은 전체 피셔 면역형의 녹농균주에 의한 감염증에 대해 효과적인 치료제로 사용할 수 있다. 이 결과는 표 3 및 표 4에 요약하여 나타내었다.
실시예 8
혼합된 면역글로부린의 녹농균 감염증 치료효과
상기 실시예 7에서 선택된 4종의 약독화 녹농균주 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534를 실시예 4 및 5에서와 동일한 방법으로 배양 및 추출하여 수득한 세포벽 단백질의 배합조성물을 포유동물인 염소에게 실시예 7에서와 같은 방법으로 1.5 내지 2mg의 양으로 1주일 간격을 두고 3회 접종하여 대량의 복합 녹농균 면역글로부린을 수득하고, 공지의 방법[참조 : Practical Immunolgy, 3rd Ed., (1989), pp 292-294]에 따라 정제하였다.
이렇게 정제하여 수득한 복합면역글로부린이 피셔 면역 형태에 따른 각종의 병원성 녹농균에 대한 면역방어 효과와 치료효과가 있는지를 검증하기 위하여 미리 복합 면역글로부린 조성물을 3회 주사한 생쥐그룹(6그룹 : 그룹당 20마리)과 면역글로부린 조성물을 주사하지 않은 생쥐 그룹(6그룹 : 그룹당 10마리)에 각 면역형의 병원성 녹농균을 생쥐당 1.0 내지 3.0×106세포의 양으로 접종하여 복합 면역글로부린의 면역방어 효과를 관찰하였다. 또한, 별도의 생쥐그룹(6그룹 : 그룹당 10마리)에 먼저 병원성 녹농균을 접종하고, 2 내지 6시간 경과후에 상기에서 수득된 복합 면역글로부린 조성물을 체중 20 내지 25g 정도의 생쥐당 0.1 내지 5mg의 양으로 정맥주사하여 본 발명에 따르는 면역글로부린 조성물의 치료효과를 관찰하였다.
그 결과, 본 발명에 따르는 복합 면역글로부린 조성물은 80% 이상의 면역방어 효과 및 75% 이상의 치료효과(7일 후의 생존율%로 측정)를 나타내는 반면에 대조군에서는 3일 이내에 모두 사망하였다.
따라서, 본 발명의 복합 면역글로부린 조성물은 우수한 치료효과와 면역방어 효과 모두를 나타내는 우수한 약제로 사용될 수 있음이 입증된다.
실시예 9
면역글로부린의 제제화
상기 실시예 7에서 선택된 4종의 약독화 녹농균주 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CDCPA 30720 및 CFCPA 60534를 실시예 4 및 5에서와 동일한 방법으로 배양 및 추출하여 수득한 세포벽 단백질의 배합 조성물을 실시예 8에서와 같은 방법으로 수컷 염소에게 투여하여 분리, 정제한 복합 녹농균 면역글로부린을 체중 kg당 항체 면역글로부린 1 내지 100mg이 투여될 수 있도록 다양한 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제제화하였다. 제제화되 면역글로부린을 녹농균 감염증이 유발되 생쥐에게 투여하여 담체의 종류에 따른 면역글로부린의 유효성 차이를 관찰하여 보았다. 그 결과, 액체제제의 경우에는 담체로 주사용 생리식염수 또는 인산염 완충액을 사용한 면역글로부린 제제가 유효성이 높았으며, 동결 건조제제인 경우에는 만니톨, 사카로즈 또는 락토즈를 담체로 사용한 경우가 높은 유효성을 나타내었다. 반면에 동결 건조제제의 경우에 인체알부민을 본 발명에 따른 녹농균 면역글로부린과 병용한 경우에는 오히려 유효성이 낮아졌으며, 액체제제의 경우에는 수산화알루미늄을 약제학적 담체로 사용한 경우에 효과가 낮아졌다. 시험결과는 다음 표 5에 요약하여 기재하였다.
실시예 10
제제화된 면역글로부린 조성물의 유효성
실시예 9의 시험결과에 따라 유효성이 높은 것으로 관찰된 인산염 완충액 제제를 사용하여 제제화된 면역글로부린의 열상, 화상, 외상 등에서의 2차 피부감염에 대한 예방 및 치료제로서의 유효성을 확인하였다. 공지의 화상 시험방법[참조 : J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975]으로 생쥐에게서 화상을 유도한 후, 인산염 완충액 ml당 복합 녹농균 면역글로부린 0.5 내지 1mg을 함유항는 액체제제를 분무제로 제형화하여 시험군 생쥐의 화상 부위에 분무처리하여 그 효과를 면역글로부린을 분무하지 않은 비처리군에서의 상태와 비교하여 판정하였다. 그 결과, 면역글로부린-인산염 완충액 분무제로 분무처리한 생쥐 그룹에서는 비처리군에 비해 월등히 우수한 생존율을 나타내었으며, 따라서 본 발명에 따른 녹농균 면역글로부린-함유제제가 녹농균 감염증에 대해 우수한 예방 및 치료효과를 나타냄을 알 수 있다. 이 시험의 결과는 다음 표 6에 나타내었다.

Claims (10)

  1. 안전한 약독화 녹농균주로부터 분리, 정제된 세포벽 단백질에 의해 유도된 녹농균에 대한 면역글로부린을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 녹농균 감염증 치료제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 약독화 녹농균주가 녹농균의 피셔 면역형 1,2,3,4,5,6 및 7에 상응하는 균주임을 특징으로 하는 녹농균 감염증 치료제.
  3. 제2항에 있어서, 약독화 녹농균주가 CFCPA 10142(KCCM 10029), CFCPA 20215(KCCM 10030), CFCPA 30720(KCCM 10031), CFCPA 40057(KCCM 10032), CFCPA 50243(KCCM 10033), CFCPA 60534(KCCM 10034) 및 CFCPA 70018(KCCM 10035)중에서 선택됨을 특징으로 하는 녹농균 감염증 치료제.
  4. 제3항에 있어서, 약독화 녹농균주가 CFCPA 10142(KCCM 10029), CFCPA 20215(KCCM 10030), CFCPA 30720(KCCM 10031) 및 CFCPA 60534(KCCM 10034)임을 특징으로 하는 녹농균 감염증 치료제.
  5. 제1항에 있어서, 약제학적으로 혀용되는 담체와 함께 동결건조제제의 형태로 제형화된 녹농균 감염증 치료제.
  6. 제5항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 만니톨, 락토즈, 사카로즈 또는 인체 알부민임을 특징으로 하는 녹농균 감염증 치료제.
  7. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 액체제제로 제형화된 녹농균 감염증 치료제.
  8. 제7항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 생리식염수, 주사용 증류수, 인산염 완충액 또는 수산화 알루미늄임을 특징으로 하는 녹농균 감염증 치료제.
  9. 제1항에 있어서, 주사제, 정제, 캅셀제, 점안제, 분무제 또는 연고제의 형태로 제형화된 녹농균 감염증 치료제.
  10. a)피셔 면역형태에 따라 순수하게 분리하여 반복적으로 순화시킴으로써 약독화시켜 수득한 약독화 녹농균주를 배양하여 수득한 균체를 유기용매로 처리하여 미생물을 불활성화시키는 동시에 세포벽의 지질성분을 제거하고, b) 수득한 균체로부터 세포벽 단백질을 추출분리한 후. c) 수득된 세포벽 단백질을 한외여과하여 분자량이 10,000 내지 100,000범위인 단백질 성분만을 분리하고, d) 이 단백질 성분을 초원심분리시켜 세포벽 단백질만을 순수하게 분리시킨 다음, e) 분리된 세포벽 단백질을 동물에게 접종하고, f) 접종된 동물로부터 혈액을 채취하고, g) 채혈된 혈액으로부터 면역글로부린을 분리시켜 정제함을 특징으로 하여, 제1항 내지 9항중의 어느 하나에 따른 녹농균 감염증 치료제를 제조하는 방법.
KR1019930010281A 1993-06-07 1993-06-07 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법 KR970001710B1 (ko)

Priority Applications (20)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019930010281A KR970001710B1 (ko) 1993-06-07 1993-06-07 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법
ES09550003A ES2074968B1 (es) 1993-06-07 1994-06-02 Nuevas cepas de pseudomonas aeruginosa atenuadas.
NL9420005A NL194910C (nl) 1993-06-07 1994-06-02 Verzwakte stam van Pseudomonas aeruginosa, alsmede een vaccin en een geneesmiddel tegen Pseudomonas aeruginosa-infecties, en een werkwijze ter bereiding van het vaccin.
CA002141871A CA2141871C (en) 1993-06-07 1994-06-02 Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
EP94917176A EP0702564B1 (en) 1993-06-07 1994-06-02 Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
DE4447677A DE4447677C2 (de) 1993-06-07 1994-06-02 Verfahren zur Herstellung eines Impfserums zur Immunisierung gegen Pseudomonas Aeruginosa-Infektionen
JP7501593A JP2911603B2 (ja) 1993-06-07 1994-06-02 新規な弱毒化シュードモナス・エルギノーザ株
GB9502373A GB2285925B (en) 1993-06-07 1994-06-02 Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
CN94190491A CN1112356A (zh) 1993-06-07 1994-06-02 新型的减毒铜绿假单胞菌菌株
AU68571/94A AU676575B2 (en) 1993-06-07 1994-06-02 Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
CH00454/95A CH687233A5 (de) 1993-06-07 1994-06-02 Neue abgeschwaechte Pseudomonas aeruginosa Staemme.
DE4493997T DE4493997T1 (de) 1993-06-07 1994-06-02 Neue abgeschwächte Pseudomonas-Aeruginosa-Stämme
AT0900694A AT408445B (de) 1993-06-07 1994-06-02 Neue attenuierte pseudomonas aeruginosa-stämme
DE4493997A DE4493997C2 (de) 1993-06-07 1994-06-02 Neue abgeschwächte Pseudomonas-Aeruginosa-Stämme
PCT/KR1994/000062 WO1994028928A1 (en) 1993-06-07 1994-06-02 Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
RU95113158/13A RU2155226C2 (ru) 1993-06-07 1994-06-02 Новый ослабленный штамм pseudomonas aeruginosa
TW083105105A TW403655B (en) 1993-06-07 1994-06-04 Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
SE9500418A SE507114C2 (sv) 1993-06-07 1995-02-06 Nya försvagade Pseudomonas aeruginosa stammar
NO19950421A NO317148B1 (no) 1993-06-07 1995-02-06 Nye svekkede Pseudomonas aeruginosastammer, vaksiner, fremgangsmate for fremstilling derav og terapeutisk middel
US08/773,330 US5861163A (en) 1993-06-07 1996-12-24 Process for preparing a vaccine against pseudomonas aeruginosa using attenuated strains

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019930010281A KR970001710B1 (ko) 1993-06-07 1993-06-07 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR950000164A KR950000164A (ko) 1995-01-03
KR970001710B1 true KR970001710B1 (ko) 1997-02-14

Family

ID=19356971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019930010281A KR970001710B1 (ko) 1993-06-07 1993-06-07 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR970001710B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017150849A1 (ko) * 2016-03-03 2017-09-08 아이진 주식회사 생산성 및 안전성이 향상된 약독화 녹농균 및 이를 포함하는 백신 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017150849A1 (ko) * 2016-03-03 2017-09-08 아이진 주식회사 생산성 및 안전성이 향상된 약독화 녹농균 및 이를 포함하는 백신 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR950000164A (ko) 1995-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bodey et al. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa
Liu et al. The roles of various fractions of Pseudomonas aeruginosa in its pathogenesis
Patrick et al. Haemophilus influenzae lipopolysaccharide disrupts confluent monolayers of bovine brain endothelial cells via a serum-dependent cytotoxic pathway
JPH04501107A (ja) 在郷軍人病ワクチン及びその製造方法
US20110243991A1 (en) Process for production of vaccines
US6391315B1 (en) Vaccine for inhibiting and preventing induced staphylococcus infection, isolated antigens used therein, and isolated antibodies induced thereby
KR100221452B1 (ko) 장감염에 대한 백신조성물의 제조방법
AU676575B2 (en) Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
Perlzweig et al. STUDIES ON PNEUMOCOCCUS IMMUNITY: III. THE NATURE OF PNEUMOCOCCUS ANTIGEN.
KR970001710B1 (ko) 녹농균 감염증 치료제 및 그의 제조방법
JPH10298105A (ja) 腸管出血性大腸菌による感染症の予防剤および治療剤
RU2311197C1 (ru) Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий
US5861163A (en) Process for preparing a vaccine against pseudomonas aeruginosa using attenuated strains
KR970001707B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 50243을 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR970001704B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 20215를 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR970001709B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 70018을 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR970001706B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 40057을 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR970001703B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 10142를 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR100250714B1 (ko) 녹농균 감염증 치료제
KR970001708B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 60534를 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR960014620B1 (ko) 신규한 약독화 녹농균 및 그를 이용한 녹농균 감염 예방 백신
KR970001705B1 (ko) 약독화 녹농균주 cfcpa 30720을 이용한 녹농균 감염 예방 백신
Pearson et al. Effects of antithymocyte sera and antimacrophage sera on cell-mediated immune reactions in Listeria-infected mice
Malina et al. Informative value of a mouse model of Klebsiella pneumoniae infection used as a host-resistance assay
EP0890648B1 (en) Non-toxic lipopolysaccharide and its preparation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20080626

Year of fee payment: 12

LAPS Lapse due to unpaid annual fee