KR100221452B1 - 장감염에 대한 백신조성물의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람의 장독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장감염에 대한 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 각각 특정 타입의 콜로니형성 인자 항원을 발현시키는 능력을 가진 서로 다른 공지의 균주로 부터 선택되는 대장균 균주는 액체 배지 중에서 증식된다. 최종적으로 상기 특정 타입의 콜로니형성 인자 항원의 항원 특성 및 혈구 응집 특성을 보유하는 포르말린처리된 대장균 균주는 의약적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제와 혼합된다. 또한 본 발명은 사람의 장소독성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장감염을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 비활성된 대장균 균주를 함유하는 백신 조성물을 상기 감염에 대해 예방하고자 하는 사람에게 투여한다.

Description

[발명의 명칭]
장감염에 대한 백신조성물의 제조방법
본 발명은 사람의 장독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장감염에 대한 백신접종에 사용되는 포르말린으로 처리된 콜로니형성-인자-항원(CFA)-발현성 대장균의 제조방법에 관한 것이다.
특히 본 발명은 사람의 장독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장 감염에 대한 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
장독소성 대장균(이하 "ETEC"로 표기함)에 의해 유발되는 설사는 특히 개발도상국 및 이러한 나라를 여행하는 사람에게 있어서 중요한 건강 문제이다. 개발도상국에 있어서 급성 설사의 원인을 병원 및 진료소를 기초로 조사해본 결과 10-50%가 ETEC에 의한 것으로 확인되었는데 평균적으로 20%가 5세 이하의 어린이였고 5세 이상의 그룹에서 약간 더 높은 비율을 보였다. 이와 마찬가지로 선진국가로부터 개발도상국을 여행하는 사람들 중 급성 설사에 걸린 경우의 1/3이상 내지 1/2은 ETEC가 원인이 된 것이 확인되었다.
ETEC에 의해 유발되는 질병은 탈수현상을 동반하지 않은 가벼운 설사에서부터 콜레라와 같은 류의 질병에 이르기까지 다양하다. 개발도상국의 많은 어린이는 생후 처음 5년 동안에 매년 ETEC에 의해 유발되는 설사의 증상을 1-2회 경험한다. ETEC 감염의 대부분은 그 증상이 비교적 경미하나, ETEC는 개발도상국가의 어린이 가운데 매년 10억 이상이 설사증상을 나타내며 백만 정도가 사망에 이르게 되는 원인이 된다. 따라서 ECTC에 의한 사망률 및 발병률을 감소시킬 수 있는 그 어떠한 수단도 공증 보건 면에서 큰 의미를 가진다.
여태까지는 ETEC 설사에 대하여 사람에게 사용할 수 있는 백신이 전혀 개발되지 않았다. 그러나 새로 개발된 경구용 콜레라 백신을 광범위하게 실시한 결과, ETEC의 열에 불안정한 엔테로톡신(이하 "LT"로 표기함)과 면역학적으로 교차 결합하는 이러한 백신의 B 서브유니트 성분이 콜레라뿐만 아니라 LT를 생성하는 ETEC에 의해 유발되는 설사에 대해서도 보호해 준다는 것을 알게 되었다. 이러한 ETEC 감염에 대한 보호는 특히 생명을 위협하는 심각한 탈수현상을 동반하는 질병에 대해 이루어지는데, 이는 면역시킨 후 처음 3개월 동안에 백신에 의해 86%까지 감소될 수 있다.
[질병의 메카니즘 및 면역]
질병을 유발시키기 위해서 ETEC는 소장에 콜로니형성화 되어 LT 또는 열에 안정한 엔테로톡신(이하 "ST" 또는 "STa"로 표기함)을 합성하여야 한다. 대장균 LT는 구조 및 기능 면에서 콜레라 톡신과 비슷하여 톡신-활성 A 유니트에 세포막수용체에 결합되는 것을 조정하는 5개의 B 서브유니트가 부착되어 있다. ST 분자는 불과 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 작은 폴리펩티드로서 장세포내에서 구아닐레이트시클라제 활성을 자극시킨다. 강한 면역원인 LT와는 달라서 ST는 보다 큰 캐리어 단백질과 실험적으로 결합되지 않는 한 비면역원이다. ST만을 생성하는 균주 및 LT 또는 ST를 생성하는 균주는 풍토병으로서의 설사의 중요한 원인이 되는 반면, LT만을 생성하는 균주는 개발도상국을 여행하는 사람에게 질병을 유발시킨다. 여러 가지 엔테로톡신 특성을 가지는 ETEC 균주의 비율은 각 나라마다 다르다.
많은 ETEC 균주의 경우 장 점막에의 유착은 항원적으로 별개의 선모(fimbria)에 의해 조정된다. 사람에 있어서 병원이 되는 균주의 경우 3개의 주요 어드헤신(adbesin)이 확인되었다. 이를 콜로니형성-인자-항원 CFA/I, CFA/II 및 CFA/IV(이전에는 PCF8775 라고 불리워짐)라고 칭하기로 한다. CFA/I 는 하나의 동종의 선모 항원이고 CFA/II는 대장균표면(CS)항원 CS1, CS2 및 CS3으로 구성되며 CFA/IV는 CS4, CS5 및 CS6 항원으로 구성된다. 이러한 서로 다른 콜로니 형성 인자는 지리적으로 다양하게 퍼져 있으나, 보통 임상적으로 설사를 겪는 사람으로 분리된 대장균의 1/2 내지 3/4의 경우 CFA/I, CFA/II 또는 CFA/I가 발견된다.
그러나 추가적인 어드헤신도 또한 확인된다.
풍토병 지역에 있어서 어린아이들에게 가장 높은 ETEC 감염율이 나타난다. 나이가 높아질수록 감염율이 감소되고 어린이보다 어른의 경우 무증후성의 비율이 높다는 것은 자연적으로 보호성 면역이 생긴다는 것을 시사하는 것이다. 마찬가지로 감염 위험이 높은 나라에서 오랜시간동안 체류하는 동안 여행자들은 ETEC 설사에 대해 저항력이 생긴다. 또한 동물과 사람에 대한 실험적 조사는 ETEC 감염은 동족의 세균에 의한 재공격에 대해 면역성을 생기게 할 수 있다는 것을 보여준다.
항균성 면역 및 항독성 면역이 ETEC 설사에 대한 보호에 기여한다는 증거가 있다. ETEC에 대한 항균성 면역은 O-항원에 대한 항체가 동족의 O-그룹의 ETEC에 대한 보호를 잘 할 수 있다 할지라도 대부분은 여러 콜로니 형성인자-항원(CFA)에 대한 면역으로 여겨진다. 동물의 경우 항 CFA 항체는 동족의 CFA를 발현하는 ETEC의 공격에 대해 보호된다. 마찬가지로 동물 및 사람 둘다의 경우 CFA/I, CFA/II 또는 CFA/IV를 발현시키는 ETEC 균주를 사용한 경구 또는 장내 면역화는 동족의 CFA 또는 CS- 인자를 가지는 대장균에 의한 차후의 공격에 대한 보호성 면역을 유도한다.
자연적으로 유도되는 항독성 ETEC 면역은 본래의 ST가 비면역원이기 때문에 LT에 대해서만 이루어진다. 항-LT 면역 반응은 주로 콜레라 톡신의 B 서브 유니트와 면역학적으로 교차 결합하는 분자의 B 서브유니트 부분에 대해서 이루어진다. 이는 기술한 바와 같이 콜레라 B 서브유니트를 사용한 경우 면역화가 ETEC 설사에 대한 보호를 유도할 수 있는지[1], 보호는 LT-만에 대해서 뿐만 아니라 LT 또는 ST ETEC 균주에 대해서도 유도될 수 있는지[1], 또한 조사결과가 콜레라 또는 LT B 서브유니트를 사용한 면역화후의 동물에서의 조사결과(발표되지 않은 데이터)에 의해 입증되는지를 설명해준다.
또한 사람의 경우 임상적인 ETEC 질병은 장에서 항균성뿐만 아니라 항독성 면역 반응을 일으키며, 그 결과 LT 및 동족의 CFA 및 O 항원에 대해 특이적인 IgA 항체 역가가 세장액 내에서 증가한다는 것이 알려져 있다[2]. 항엔테로톡신 및 항콜로니형성 인자 항체는 둘다 실험적인 ETEC 감염에 대해 서로 독립적으로 보호할 수 있으며, 장내에 함께 존재하는 경우 이 항체 특이성은 ETEC 질병에 대한 보호면에서 공동 상승적으로 협력한다고 알려져 있다[3].
ETEC 질병에 대한 항 LT 면역의 보호기능은 잘 알려져 있는데 반하여 항 ST 면역의 보호에 대해서는 불확실하다. 자연적인 상태의 ST는 면역원이 아니지만 캐리어 단백질과 결합되어 사용되는 경우 ST 중화성 항체를 생기게 한다. 이는 또한 백신에 의해 유도되는 항 ST 면역이 획득 가능한 목적일 수 있다는 것을 제시하는 것이다. 그러나 화학적 커플링 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유도되는 지금까지 테스트 된 다른 ST 캐리어 콘주케이트도 모두 때로는 독성 활성을 감소시키나 유효하다. 따라서 비독성 ST 관련 에피토프를 확인하기 위한 시도에서 최근에 몇몇 합성 수정된 ST 펩티드가 제조되었다. 또한 같은 펩티드에 대한 코드하는 합성 올리고뉴클레오티드도 제조되었으며, 이것이 콜레라 B 서브유니트에 관한 유전자에 융합되어 콜레라균에 삽입되는 경우 이 복합성 유전자는 고농도의 완전 비독성 ST-B-서브유니트 콘쥬케이트로 실험동물을 면역화시킴으로써 항 ST 항체 반응을 일으킨다. 그러나 이제까지는 단지 약한 중화활성을 가질 뿐이다.
[칸디데이트 백신]
ETEC 감염에 대해 작동하는 주요 면역 메카니즘 및 ETEC 박테리아의 주요 보호성 항원에 관한 이러한 지식을 기초로 하여 효과적인 ETEC 백신은 경구로 제공되어야 하며 이상적으로는 장에서 항-콜로니형성 및 항독성 면역반응 두가지를 일으킬 수 있어야 한다는 결론지을 수 있다. 따라서 백신은 박테리아 세포와 톡신-유도 항원의 조합물을 함유하여야 한다. 이러한 전체를 기초로 하여 최근에는 여러 생존 또는 비활성 ETEC 백신 칸디데이트가 고려되고 있다.
[생존백신]
주요 CFA를 발현시키고 B 서브유니트 또는 관련 엔테로톡소이드를 생성하는 생존박테리아를 백신으로서 고려할 수 있다. 이러한 백신은 장내 증식을 통해 국소적 장내 면역계통의 자극을 일련의 항원에게 줄 수 있기 때문에다. 그러나 일반적으로 서로 다른 콜로니형성 인자는 같은 균주에 관해 발현되지 못하며 서로 다른 CFAs에 대한 유전자가 같은 숙주균으로 콜론화 되지 못하기 때문에 이러한 백신은 적어도 현재까지는 몇몇 서로 다른 균주의 혼합체를 기본으로 한다. 그러나 이러한 종류의 백신에는 몇 가지 문제점이 존재한다. 이러한 문제점중의 하나는 함유된 백신 균주 등의 한 균주가 다른 균주를 억누르고 이상 증식할 위험이 있다는 점이다. 또다른 문제점은 톡신을 코드하는 프라스미드의 흡수에 의해 독성이 복귀될 위험성이 있으며, 생체내에서 증식하는 동안 엔테로톡소이드의 생성이 낮고, 또한 저장기간동안 백신균주의 생존가능성이 낮게 된다는 점이다. 그러므로, 생존하는 경구용 ETEC 백신은 아직 현실성이 없다.
[비생존 백신]
백신중에 함유하는 가장 중요한 체세포 항원은 지리적으로 서로 다른 지역에 있어서 ETEC 균주에 대한 보급율이 높은 CFA 항원이다. 이러한 항원에는 CFA/I, CFA/II 및 CFA/IV가 있으며, 몇가지 추가적인 CFA도 포함될 수 있다. 그러나 정제된 CFA 항원은 제조비용이 비교적 많이 들며, 더군다나 분리된 CFA는 경구 투여한 후 사람의 위장관내에서 분화되기 쉽다[4,5]는 것이 입증되었다.
백신을 구성하는데 있어서 보다 현실적인 방법은 그 표면에서 가장 중요한 CFA를 발현시키고 이 세균을 적절한 톡소이드 성분과 조합시킨 죽은 ETEC 박테리아를 제조하는 것이다. 해당 백신 제조에 있어서 해소해야 할 문제점은 첫째, 다른 CFA의 항원특성 및 유착(혈구응집)특성을 보존시키면서 백신균주를 안전하게 죽이는 방법(이상적으로 이러한 방법은 또한 사람의 장 환경에서의 분해로부터 CFA를 안정화시킬 수 있어야 한다)을 찾아내는 것과 둘째, 백신의 대량제조를 촉진시키기 위해 퍼멘터(fermentor)내에서 액체 배지 중에 증식시키는 동안 박테리아에 대한 CFA의 발현이 높은 수준으로 이루어질 수 있도록 하는 조건을 찾아내는 것이다.
전체 세포 백신으로서 사용되는 박테리아를 비활성화시키기 위한 방법으로서 잘 알려진 유리한 방법은 포르말린 처리를 이용하는 것이다. 이러한 목적을 위해서는 보통 1M 농도의 포르말린을 사용한다. 본 발명자는 통상적으로 사용되는 백신 제조방법으로 CFA 발현 ETEC를 처리하는 경우 ETEC 세균을 안전하게 죽일 수는 있으나 이와 동시에 대부분의 또는 모든 CFA 항원이 파괴되기 때문에 이러한 방법은 CFA 면역성원을 보유하는 비활성 ETEC 균주의 제조에는 적당치 않다는 것을 알게 되었다. 이 방법에 따르면 레비(Levine)[6]은 탁게트(tacket)외 수명의 제한된 성공이 IgA 항체의 생성과 대상자의 보호를 자극하기 위한 한 균주의 포르말린 처리 ETEC 세균을 사용함으로써 이루어진다고 기술하고 있다. 백신은 대장균 균주 E1392-75-2A 로서 CS1 및 CS3 선모를 발현시키지만, LT 또는 ST를 합성하지 않는 O6 : H16 바이오타입 A 균주로부터 제조된다. 이미 경구용 생존 백신으로서 사용된 경우 단일 분량의 E1392-75-2A는 CS1 및 CS3을 발현시키는 세로타입(serotype) O139 : H28 의 LT+/ST+ETEC 균주에 의한 실험적 공격으로부터 대상자를 보호하였다(E 1392-75-2A 박테리아는 메릴랜드, 포릭스트 그렌 소재의 월터 리드 아미 인스티튜트 오브리서치의 U.S. 아미백신 프로덕션파실리티의 연구자에 의해 포르말린-비활성화 되었다). NaHCO를 함유하는 3회 분량의 백신(1회 분량의 백신은 5×1010의 비활성 박테리아를 함유함)을 탁게트의 수명의 방법에 의해 2주 간격으로 9명의 대상자에게 주사하였다. 9명의 백신접종자 중 2명의 혈청 내에서 CFA 항체의 증가가 검출되었고 9명중 4명의 경우 장내에서 SIgA 항-선모 항체의 증가가 검출되었다. 4명의 백신접종자와 10명의 대조용 그룹에 병원성 ETEC 균주 E24377A(O139 : H28, CS1, CS3, LT+/ST+)를 주사하여 공격에 대한 연구를 수행하였다. 보호가 이루어졌다는 증거는 전혀 관찰되지 않았다. 즉 4명의 백신 접종자 중 2명 및 10명의 대조용 그룹 중 6명에게서 설사가 일어났다.
액체배지내에서의 CFAs의 발현에 있어서 이러한 현상은 보고되지 않았다. 사실상 액체 배지는 CFAs의 발현을 억제하고 대신 만노즈-민감성 타입 1필리의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있으므로 [7]아직까지는 이러한 발현은 가능한 것으로 생각되지 않는다.
다른 CFAs 및 CS 단백질을 발현하는 ETEC를 기본으로 하는 프로토타입 백신을 개발하기 위한 초기의 노력 [8]은 백신의 다량 제조의 가능성을 심각하게 방해하는 고체 한천판 상에서 세균을 증식시키는 것에 의존해야 했다. 이제 본 발명자는 최적의 CFA-촉진 한천판 증식 조건하에서와 같이 진탕 배양의 액체 배지내에서 증식시키는 동안 ETEC에 대한 CFAs의 발현을 똑같이 우수하게 달성할 수 있는 방법을 개발하였으며, 또한 본 발명자는 퍼멘터 배양조건하에서 대장균상에의 CFAs의 발현을 높은 수준으로 이룰 수 있다는 것을 보여준다. 또한 본 발명자는 이러한 퍼멘터내에서 액체배지중에 증식된 대장균을 테스트된 ETEC 백신 균주를 안전하게 죽이는 것을 보장하며 이와 동시에 양을 한정하여 박테리아 표면상에 CFA를 보존하면서 안정화시키는 방식으로 포르말린으로 비활성화시키는 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 스웨덴의 성인을 0일, 14일 및 28일에 프로토타입 ETEC 백신으로 3회 면역시키고(↓), 면역화 이전에 즉시, 그리고 2차 면역화 및 3차 면역화후 9일 후에 세장액표본을 모았다. 정제된 CFA/I, CFA/II (CSI＋CS3) 및 CTB(GMI-ELISA IgA 역가를 측정한 다음 각 표본의 총 IgA 농도로 나누었다.
[발명에 대한 설명]
발명의 한 특징은 사람의 장독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장감염에 대한 백신 조성물을 제조하는 방법에 있다. 본 방법에 의하여 각각 특정타입의 콜로니 형성인자 항원을 발현시킬 수 있는 능력을 가진 서로 다른 공지의 균질로부터 선택되는 1종 이상의 대장균 균주를 예정된 밀도로 대장균 박테리아의 표면상에서 상기 특정형태의 콜로니 형성인자 항원의 발현을 달성시킬 수 있는 액체배지내에서 적절한 조건하에 증식시킨 다음 수확하고 염수중에 박테리아 배양액을 재현탁시킨 후에 약하게 교반시키면서 이 현탁액에 포르말린을 가함으로써 최종농도를 0.2M 포름알데히드로 한 다음 계속 교반시키면서 37℃에서 약 2시간 동안 배양시킨 후 다시 4℃에서 24-48시간 동안 배양시킴으로써 상기 특정 타입의 콜로니 형성인자 항원의 항원특성 및 혈구응집 특성을 보유하는 포르말린으로 처리된 대장균 균주를 형성시킨 다음 즉시 이 포르말린으로 처리된 대장균 박테리아를 의약적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제와 적절한 농도로 혼합한다.
본 발명의 이러한 특징에 관한 실시예에 따르면 상기 액체 배지는 1%(w/v) 카사미노산, 0.15%(w/v)효모추출액, 0.4mM MgSO4, 0.4mM MnCl2및 탈이온수(pH 7.4)를 함유하며, 배양은 약 37℃에서 4-6시간 동안 철저한 교반하에 또는 광범위하게 통기시킬 수 있는 기타 다른 수단하에 수행되고 그 후 박테리아의 수확은 원심분리나 여과 또는 기타 다른 수단에 의해 이루어진다.
본 발명의 이러한 특징에 관한 또다른 실시예에 따르면, 상기 특정타입의 콜로니 형성 인자 항원을 발현시키는 균주는 사람의 장의 콜로니 형성 인자 항원 CFA/I, CFA/II(CS1,CS2,CS3) 및 CFA/IV(CS4,CS5,CS6)으로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 특징에 관한 실시태양에 따르면, 산-중화성 완충액 및 엔도톡신에 대한 면역을 유도하는 추가적인 항원성 성분이 추가적으로 가해진다.
본 발명의 또 다른 특징은 사람의 장 독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장 감염을 예방하는 방법에 있다. 본 방법에 의하면 각각 특정 타입의 콜로니 형성 인자 항원을 발현시킬 수 있는 능력을 가지며 각각 이 특정 타입의 콜로니 형성인자 항원의 항원특성 및 혈구 응집특성을 보유하는 서로 다른 공지의 균주로부터 선택되는 1종 이상의 대장균 균주를 면역성분으로서 함유하는 백신조성물을 적당량으로 상기 감염을 예방하고자 하는 사람에게 투여한다.
본 발명의 이러한 특징에 관한 바람직한 실시예에 따르면 투여경로는 경구투여이다.
본 발명의 방법에 의하면 퍼멘터의 도움하에 선별된 대장균 박테리아 균주는 CFA/I, CFA/II 및 CFA/IV를 포함하는 서로 다른 CFA를 발현시키는 능력을 상실하지 않고 액체 배지 내에서 고밀도로 증식된 후에 CFA를 파괴하지 않고 세균을 안전하게 죽이는 수단에 의해 처리될 수 있다. 본 방법에 의하면 이러한 대장균이 사람의 장독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장감염 또는 설사에 대해 안정한 비생존 경구용 백신으로서 사용될 수 있다. 이러한 박테리아 백신 성분을 제조하는 방법 및 상기 성분의 장 점막 면역원으로서의 유용성을 입증하기 위해 사용되는 방법에는 다음과 같은 방법이 있다.
1. 앞서 기술한 바와 같은 한천판 또는 기타 고체 배지보다는 액체 배지내에서 증식시키는 동안 대장균 상에서의 원하는 서로 다른 타입의 CFAs(CFA/I,CFA/II 및 CFA/IV)의 발현을 높은 수준으로 달성하기 위한 방법.
2. 퍼멘터내에서 액체 배중에 증식된 대장균상에서의 이러한 CFAs의 발현을 높은 수준으로 달성하기 위해 상기 방법을 성공적으로 적용하는 방법.
3. 포르말린의 도움하에 특이적 항체와의 면역학적 반응성 및 서로 다른 CFAs의 혈구응집활성을 거의 완전하게 보유하는 선별된 대장균을 비활성화 시키는 방법.
4. 액체 배지중에 증식된 포르말린으로 처리된 대장균으로 토끼를 면역시킨 결과 한천상에서 증식된 해당 생존 박테리아로 면역화시켰을 때와 똑같이 서로 다른 CFAs에 대해 특이적인 항체의 역가가 높게 나타나는 것을 보여주는 테스트.
5. 산 완충액이나 사람의 위장액내에서 박테리아를 배양했을 때 포르말린으로 처리된 백신 박테리아 상의 CFAs가 포르말린 비처리된 생존 박테리아 상의 CFAs보다 높은 안정성을 가지는 것을 입증하는 테스트.
6. 액체 배지 중에서 포르말린으로 비활성화된 CFAs-대장균 박테리아는 경구용 백신과 같이 사람에게 심각한 부작용을 주지 않고 투여될 수 있으며 이러한 백신을 2회 또는 3회 투여함으로써 백신의 CFAs에 대해 순환에 있어서 특이적인 항체-분비 세포의 생성뿐만 아니라 세장액 내에서의 IgA 항체 형성을 자극시킨다는 것을 입증하는 조사.
[실시예]
CFA/I, CFA/II(CS1,CS2,CS3,CS1＋CS3 또는 CS2＋CS3을 발현시키는 균주 포함) 또는 CFA/IV(CS4＋CS6 또는 CS5＋CS6)를 발현시키는 다수의 ETEC 균주를 테스트하였다. 이 균주는 실험실에서 얻어진 균주뿐만 아니라 세계의 여러 지역으로부터 얻어진 임상 분리물로 구성되었으며 서로 다른 패턴의 엔토로톡신 생성(LT＋ST,LT 또는 ST 및 톡신-음성 유도체)을 유도하는 균주를 포함하였다. 후술하는 실시예 1-5에 기술된 방법은 다른 CFA 타입 또는 서브타입 및 엔테로톡신 특성의 다른 균주에도 유효한 것으로 밝혀졌으므로 본 실시예에 기술된 실험 및 결과는 몇몇 선별된 균주에서 얻어지는 전형적인 결과에 한정될 것이다.
[실시예 1]
[진탕배양 또는 퍼멘터내에서 액체 배지중에서 증식시킨 후의 대장균 상에서의 CFAs의 발현]
액체 배지에서의 증식은 통상적으로 CFAs의 발현을 억제시키는 반면 대장균 박테리아 상에서의 타입1(보통) 필리의 발현을 촉진시킨다고 알려져 있기 때문에 대장균 상에서 CFAs를 발현시키기 위해서 이전에 사용되었던 방법은 항상 세균을 고체표면, 일반적으로 이른바 CFA 한천 판 상에서 증식시키는 것[7]을 기본으로 하고 있다. 본 발명자는 ETEC 백신의 다량 제조를 촉진시키기 위해서 액체 배지 중의(퍼멘터 내에서 또는 플라스크 속의 진탕 배양물 내에서)증식조건하에 대장균의 표면상에서의 서로 다른 CFA의 발현을 높은 수준으로 달성시킬 수 있는 방법을 개발하였다.
통상적으로 사용되어온 몇 가지 다른 세균학적 액체배지에 대해 성공적으로 테스트하지 못한 후에 본 발명자는 액체 배지 내에서 증식시킨후 각각의 모델 균주 SBL101(CFA/I), SBL102 및 SBL103(둘 다 CFA/I) 상에서의 CFAs의 발현을 원하는 수준으로 달성시키고 이를 입증할 수 있는 방법에 도달하였다. 그후 본 발명자는 또한 CS5의 발현을 위한 배지의 조성에 약간의 수정을 가함으로써 다른 균주 상에서의 CFA/IV의 발현을 우수한 수준으로 달성시켰다. 서로 다른 균주의 냉동시드로트(10t)(-70℃에서 글리세롤 중에 유지됨)로부터 37℃에서 밤새 주입시켜 CFA 한천판상에 백금륜 스크래핑을 주입하였다. CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 및 CS6에 대해 특이적인 모노클론 항체로 응집반응 테스트를 함으로써 적절한 CFA를 발현시키기 위해 판상의 콜로니를 조절하였다. 이러한 모노클론 항체는 본 출원인의 실험실 내에서 제조된다. 그 다음 CFA 한천 판상의 박테리아를 인산염 완충액(PBS)을 사용하여 수확한 후에 이 현탁액으로부터 생성된 5-10×109개의 접종물로서 400ml의 액체 배지 중에 가하였다. 상기 CFA 배지의 조성은 카사미노산 1%(w/v), 효모추출물 0.15(w/v), MgSO4, -.4mM, MnCl2, 0.04Mm, 탈수이온(pH7.4)으로 이루어져 있다. 이 플라스크를 37℃에서 20시간동안 150rev/min으로 흔들어 주면서 배양시켰다. 이때 현탁액을 1 : 10으로 희석시킨 현탁액의 광학 밀도는 Ca 0.25-0.5이었다. 박테리아를 4℃에서 원심분리에 의해 수확한 다음 박테리아 펠리트를 PBS로 한번 세척하고 다시 원심분리에 의해 박테리아를 침강시킨 후 PBS중에 재현탁시킴으로써 1 : 10으로 희석시킨 현탁액의 광학 밀도가 0.285가 되게 하였다. 이 현탁액 및(비교용) 같은 광학 밀도로 조절된 CFA 한천판상의 균주의 대응 배양물로부터 수확된 박테리아의 현탁액을 적절한 CFA의 발현에 대해 일련의 희석액을 사용하여 테스트하였다. 이러한 분석을 위해서 모노클론 항-CFA 항체 및 정량의 CFA 억제 ELISA(본 출원인의 실험실에서 생성됨)과의 직접 응집반응을 이용하였다.
결과는 표 2에 요약되어 있다. 이 결과는 액체배지내에서 플라스크 속의 세균을 증식한 후에 얻어진 현탁액은 CFA 한천판상에 증식된 박테리아와 같은 수준의 CFAs의 발현을 나타내었다(박테리아 농도를 같도록 조절한 경우)는 것을 보여준다.
다른 CFA/II CS 단백질을 코드화 하는 균주 CBL102 및 SBL103의 플라스미드는 또한 암피실린 및 카나마이신에 대한 박테리아 저항성을 코드화 하였다. 그러므로 이러한 균주를 액체 배지 및 상기 항생물질을 보충시킨 한천 내에서 대응 배양시켰다. 표 2의 값은 항생물질을 함유시키지 않고 얻은 값이나, 항생물질의 존재 하에 얻은 값이 이와 실질적으로 동일하였다(기록하지 않음). 또한 표 2에 기재된 실험에 사용된 액체 배지내의 증식조건은 테스트된 몇몇 다른 균주로부터 CFA/I, CFA/II 및 CFA/IV(각각의 서브프로테인 CS4,CS5 및 CS6의 발현을 위해 CFA 한천판에서 증식시켰을 때와 같이 만족할만한 수준이라는 것이 입증되었으며, 이때 CS5의 적절한 발현을 위해 예비배양에 사용된 CFA 한천 및 액체 CFA 배지에 0.15% 박토바일(Bacto Bile)염 1.5g/l[디프코(Difco)사 제품]을 보충시켰다.
후속 실험에서는 액체 배지 내에서 ETEC 상에의 CFAs의 발현을 높은 수준으로 달성시키기 위한 이러한 방법을 퍼멘터내에서의 액체 배지중의 중식에 이용하였다. 다음의 방법은 CFA/I 균주에 대해 기술된 것이나 CFA/II 또는 CFA/IV를 생성하는 기타 다른 균주에도 똑같이 유용한 방법으로서, 결과적으로 CFA 한천 또는 진탕 배양에서의 증식의 경우와 같은 수준으로 박테리아 수당 CFA의 발현을 나타내었음이 밝혀졌다.
CFA 한천판을 균주 SBL101(CFA/I)로 접종시키고 37℃에서 밤새 증식시켰다. 이때 냉동 시드 로트 박테리아를 접종물로서 사용하였다. 생리적 식염수를 함유한 CFA 한천판으로부터 박테리아를 수확한 다음 5×1010개의 박테리아를 4리터의 CFA 배지에 접종물로서 가하였다. 이때 CFA 배지내의 박테리아의 로그상 진탕 배양물을 접종물로서 사용할 수도 있다. 그 다음 이 박테리아비-플로(Bio-flo)III 퍼멘터(New Brunswick Scientific Co. Edison, N. J. USA]내에서 pH의 조절 없이 철저한 교반(800rev/min)하에 37℃에서 증식시켰다. 퍼멘터 배양을 시작한지 4-5시간 경과 후에 이 배양물의 광학 밀도는 4-5였다. 즉 1 : 10으로 희석시킨 현탁액의 광학밀도는 0.4-0.5였다. 20시간동안 퍼멘터내에서 계속 배양시킨 후에 광학밀도의 증가는 관찰되지 않았다. 배양을 시작한 후 시간간격을 두고 퍼멘터로부터 수확한 표본 및(비교용)같은 박테리아 접종물의 진탕 배양(플라스크속)으로부터 제조된 박테리아의 현탁액을 같은 박테리아 농도(즉 1010박테리아/ml)로 조정한 후에 CFA/I의 발현에 대해 테스트하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이 CFA/I(박테리아 수)의 발현은 퍼멘터내에서의 배양 4-5시간 후에 이미 최적 수준이 되었으며 이는 20시간동안 플라스크 속에서 진탕 배양으로 증식된 박테리아에서 관찰되는 CFA/I 발현과 같은 수준이었다.
[실시예 2]
[혈구응집 활성뿐만 아니라 CFAs 면역반응성을 보유하는 대장균 박테리아를 포르말린으로 비활성화시키기 위한 방법]
본 실시예에 기술된 적합한 방법을 개발하기 전까지 조건을 변화시키면서 포르말린으로 처리하는 것을 포함한 여러 가지 물리적 및 화학적 비활성화 방법은 성공적으로 테스트되지 못했다. 수일동안 온도를 변화시키면서 약한 포르말린으로 처리하는 것을 포함하는 본 방법은 CFA 항원 함량 또는 특성을 상실시키지 않으면서 추정상의 대장균 백신 박테리아를 완전하게 죽일 수 있어야 한다는 조건을 충족시킨다. 이는 실시예 1에 기재된 바와 같이 여러 CFAs/CS 성분에 대한 모노클론 항체를 기본으로 하는 정량의 CFA 억제 ELISA를 사용하여 포르말린으로 처리하기 전과 후에 박테리아상의 여러 CFAs의 양을 측정함으로써 테스트되었다. 본 방법은 박테리아 표면상의 CFAs의 정확한 측정을 가능하게 한다. 설정된 전제조건에는 박테리아 제제는 비활성화된 후에 살아있는 출발 박테리아에 비교하여 적어도 1/3이상의 CFA 항원 함량을 보유하여야 하며 또는 CFA 항원성과 함께 검출 가능한 수준의 혈구응집 활성을 가져야 한다는 것이 포함된다.
다음의 실시예는 본 방법 및 그 유용성을 보다 자세히 기술할 것이다. CFA/I 또는 CFA/II/CS 항원을 발현시키는 박테리아를 실시예 1에서 기술한 바와 같은 방법을 사용하여 액체 배지 내에서 증식시킨 다음 PBS 중에 현탁시켰다. 그 다음 이 현탁액에 약하게 교반시키면서 포르말린(HCHO)을 가함으로써 최종농도가 0.2M 포름알데히드로 되게 하였다. 그 다음 이 현탁액을 계속 교반시키면서 37℃에서 약 2시간동안 배양한 후에 서늘한 방으로 옮겨서 다시 24-48시간 동안 4℃에서 유지시켰다. 포르말린으로 완전히 배양시킨 후 서브샘플을 꺼내어 육즙 내에서 또한 한천판상에서 배양시킴으로써 생존 가능한 세균이 없는지를 테스트하였다. 이때 한천 판 및 육즙 플라스크는 14일간 매일 점검되었다. 본 방법을 실시한 결과 언제나 테스트된 모든 대장균 박테리아는 완전히 죽었다.
저온에서 포르말린처리가 완료된 후에 각 표본의 혈구응집 활성을 조사함으로써 박테리아 현탁액을 CFA 함량에 대해 [7] 또는 [9]에 기술된 바와 같은 CFA ELISA의 해당 모노클론 항체가 결합되는 것을 저지할 수 있는 능력에 대해 분석하였다. 비교목적을 위해 각 실험에 있어서 포르말린으로 처리된 세균과 같은 박테리아 농도로 조정된 각각의 균주의 바로 제조된 비처리 배양물을 함유시켰다. 표 4에서 보여주는 바와 같이 포르말린 처리된 제제는 혈구응집 능력을 보유하였으며 각각의 CFA ELISA 저지 테스트에서 평가했을 때 적어도 50%의 CFA 항원성을 유지하였다. 포르말린 처리된 박테리아는 비처리된 박테리아의 50-100%에 해당하는 농도에서 50%까지 정제된 CFA가 결합된 고체상에 해당 모노클론 항체가 결합되는 것을 저지하였다는 본 결과는 다수의 연속적인 실험에서 입증되었다.
[실시예 3]
[포르말린으로 처리된 ETEC와 비처리된(생존하는)ETEC 상에서의 CFAs의 보존 및 배양안정성 비교]
또 다른 실험으로부터 조사한 결과 분리된 비처리 CFA 선모는 위산에 매우 민감하다는 것을 알게 되었다. 위산을 중성으로 중화시키기 전에는 pH가 선모 단백질의 CFA 항원성에 대한 역효과를 억제하지 못한다[4]. 이러한 배경에 대해서 본 발명자는 각각 산 위장액과 공장액 중에서 배양한 후 포르말린으로 처리된 대장균 및 비처리된 해당 대장균 박테리아 상에서 발현된 CFAs의 항원성을 비교하였다. 또한 표본을 여러 pH로 조절된 PBS중에 배양하였다.
처음 실험에서 여러 가지 포르말린으로 처리된 박테리아 현탁액과 비처리된 박테리아 현탁액을 여러 pH에서(pH3 내지 pH11) 30분간 37℃에서 배양한 후 중성 pH로 재조정하였다. 상기 pH에서의 배양이 포르말린 처리된 죽은 박테리아 제제 또는 비처리된 박테리아제제의 CFA 항원성에 영향을 주지 않았다. 그 다음 실험에서는 산 위장액과 공장액 중에서 pH2의 완충액중의 생존박테리아 및 포르말린으로 활성화 된 박테리아의 배양을 비교하였다. 위장액과 공장액은 괴테보르크 소재의 사알그렌스케 호스피탈의 스웨덴 성인으로부터 수거하였다. 표 5에서 보여주는 바와 같이 포르말린 처리된 박테리아는 pH2의 완충액이나 산 위장액중에서의 배양에 의해 전혀 영향을 받지 않거나 단지 약간 영향을 받았으며, 공장액중에서 배양한 후에 CFA 항원성의 감소가 전혀 관찰되지 않았다. 한편 비처리된 생존 박테리아의 CFA 항원성은 대부분의 경우 pH2의 완충제액 및 산 위장액중에서 배양한 후에 현저하게 감소되었다. 이러한 분석결과는 포르말린으로 처리함으로써 위액중의 분해로부터 CFA 선모를 보호할 수 있다는 것을 시사해준다.
[실시예 4]
[포르말린으로 처리된 ETEC와 비처리된(생존하는) ETEC 상의 CFAs의 면역원 특성의 비교]
포르말린으로 처리된 대장균과 비처리된(생존하는) CFA 양성 대장균의 항-CFA 항체반응을 유도할 수있는 능력을 비교하였다. 면역화의 개시에 있어서 2-3kg 무게의 성숙한 뉴질랜드 백색 토기에 해당량(5×108- 2×109박테리아)의 포르말린 처리된 박테리아 또는 비처리된 생존 박테리아를 3-5회 피하 주사하였다. 이때 1차 주사는 프로인트 완전보조액으로 제공되었으며, 2차 주사는 불완전 보조액으로 그 다음 주사는 보조액 없이 제공되었다. 포르말린으로 처리된 박테리아 면역화의 개시시에 제조한 다음 사용시까지 4℃에서 저장하였다. 생존 박테리아는 각각의 면역화 실시일에 바로 제조하였다. 포르말린 처리된 박테리아는 CFA 배지내에서 배양하였으며 비처리된 생존 박테리아는 CFA 한천에서 배양하였다. 그 다음 면역화 이전에 포르말린으로 처리된 박테리아 및 비처리된 박테리아를 PBS 2회 세척하였다.
면역화 개시이전에 즉시 그리고 마지막 주사한 후 7-10일에 동물에게서 혈액을 채취하였다. 혈청을 마련하여 분석시까지 -30℃에서 분할하여 냉동시켰다. 면역시키는 균주의 CFA에 대해 특이적인 항체반응을 여러 ELICA 방법을 사용하여 측정하였다. ELISA 미세적정판을 PBS 중에 용해된 정제 CFAs, CFA/I, CFA/II(CS1＋CS3), CS2, CS4 또는 CS5로 코팅함으로써 즉 상기 판을 CFA 용액으로 37℃에서 밤새 배양시킴으로써 최종 농도를 1-5㎍/㎖가 되도록 하였다. 그 다음 앞서 기술한 바와 같이 [2,3]혈청을 5배 희석시킨 일련의 희석액을 판 중에서 적정하였다. 역가는 효소가 기질과 20분간 반응했을 때 배경보다 0.3이 큰 흡광도를 가지는 희석도의 역수로서 측정되었다.
면역화 이전에 채취된 혈액중 그 어느 것도 유효한 수준의 CFA 항체를 가지지 않았다. 즉 CFA 역가가 50을 초과하였다. 한편 완전히 면역시킨 후 모든 혈청은 25,000 내지 300,000 사이의 동종의 CFA에 대한 항체역가를 가졌다(표 6). 포르말린으로 처리된 박테리아로 면역시킨 후의 동종의 CFA에 대한 역가는 비처리된 해당 박테리아의 경우와 거의 동일하게 나타났다.(표 6).
[실시예 5]
[사람의 장내에서의 특이적인 IgA 항체의 생성을 자극시키는 능력 및 안정성에 대한 포르말린으로 처리된 ETEC의 테스트]
CFA/I, CS1, CS2 및 CS3(즉, 표 1에 제시된 균주 SBL101, SBL102 및 SBL103)을 발현시키는 포르말린으로 처리된 박테리아로 구성된 ETEC 백신제제를 소규모의 임상실험을 위해 스웨덴의 내셔날 박테리올로지컬레보레이토리에 의해 제조하였다. 이 백신 성분은 콜레라 B 서브유니트(CTB[1])와 함께 제공되었다. 이 조합된 CFA-ETEC-CTB 백신의 장내에서의 국소적 면역성 및 안전성을 테스트하기 위해 스웨덴의 성인을 대상으로 조사하였다. 또한 말초 혈액 임파구에 의한 특이적인 항체의 생성 뿐만 아니라 혈청 내에서의 항체 반응에 대해서도 평가하였다.
대상자 각각에 대해 2주 간격으로1회당 1011개의 비생존 대장균 및 1mg의 CTB로 3회 경구 면역시켰다. 이 백신은 방글라데시에서 실지시험중에 있는 경구용 콜레라 백신[1]과 같은 구연산염-중탄산염 정제(스웨덴의 스톡홀름, ACO)를 사용하여 150ml의 완충중탄산염 용액으로서 제공된다. 면역화시키기 바로 전에 그리고 2차 면역화 및 3차 면역화 후 9일에 장 표본 및 혈청을 수거하였다. 말초 혈액임파구는 1차 면역화 실시일에 그리고 1차 면역화, 2차 면역화 및 3차 면역화 후 7일에 얻었다.
가장 중요한 보호성 항원에 대한 장내 IgA 항체 반응을 앞서 기재한 바와 같이[2] 세장액 중에서 조사하였다. 장세척은 대상자로 하여금 물설사가 계속 될때까지 동장 염용액(일반적으로 3-5리터)을 마시게 함으로써 이루어졌다. 모아진 액체성 변을 거즈를 통해 거른 다음 여러 가지 효소 불활성화제로 처리하고 원심 분리한 후에 동결건조에 의해 농축시켰다. 이전의 조사에서 본 발명자는 세장액이 장내에서 공급되는 항원에 대한 국소적으로 생성되는 분비성 IgA 항체의 풍부한 공급원이며, 장내에서 국소적으로 합성되는 분비성 IgA 항체는 ETEC 설사에 대한 보호성 면역에 가장 중요하다는 것을 알게 되었다. 예를 들면 경구용 백신에 의해 장내에서 국소적으로 자극받은 면역세포는 일반적으로 림프를 통해 혈액으로 이동하며 그 다음이 면역세포가 주로 IgA-분비성 플라즈마 세포로 성숙되는 장소인 장내로 되돌아온다. 경구 면역화 후 정해진 빠른 시간에 -적절하게는 7일에[10]-말초 혈액 임파구를 수거함으로써 이러한 장내 항체 분비 세포(ASSs)를 얻을 수 있으며 자극을 위해 사용되는 항원에 대해 특이적인 항체의 생성여부를 분석할 수 있다. 마지막으로 특히 IgA 부류의 혈청 항체 또는 이러한 장내 면역반응에 낮은 정도로 영향을 미칠 수 있다.
26명의 대상자에게 3회에 걸쳐 백신을 주사하였다. 면역화에 수반될 수 있는 어떠한 국지적 또는 전신적인 역반응의 예도 관찰되지 않았다. 11명의 백신주사를 맞은 사람으로부터 수거한 세장액을 CTB/LT, CFA/I, CFA/II 및 면역화시키기는 균주[2]의 하나인 0-항원에 대한 항체에 대해 조사하였다. 각 표본에 대해 특이적 ELISA IgA 역가를 총 IgA 함량으로 나눈 값을 결정하였다. 표 7에서 보여준 바와 같이 대부분의 백신주사를 맞은 사람의 경우 CTB 및 CFA/I 및 CFA/II에 대해서 유요한 IgA 항체 반응이 관찰되었다. 장내에서의 반응의 횟수는 CFA-양성 대장균으로 인한 감염으로부터 회복한 방글라데시인에게서 이미 관찰된 것과 같은 수준이다. CFA/I 및 CFA/II에 대한 항체 반응의 정도는 ETEC 질병으로부터 회복된 방글라데시인에게서 이미 관찰된 것과 같은 수준이다(제1도). 대상자는 또한 백신의 CTB 성분에 대해 현저한 장내 IgA 항체 반응으로 반응하였으며 이러한 반응은 임상적인 ETEC 질병 후에 관찰되는 항 LT 반응보다 높았다.
이러한 결과는 ETEC 백신이 장내에서 국소적으로 CFA 항체반응을 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 반응은 이전에는 분리된 선모를 사용하여 경구 면역화 시킴으로써 사람에게서 유도하기가 곤란하였다[4, 5].
또한 면역화는 대부분의 백신주사를 맞은 사람에 있어서 CFA/I, CFA/II 및 LT/CTB 에 대해 CLISP에 분석[10]으로 측정했을 때와 같은 수준의 혈액 내에서의 특이적인 ASCs의 생성을 유도하였다(표 7). 백신을 1차 주사한 후에 이미 많은 수의 항-CFA ASCs가 관찰되었다. CFA 항체를 생성하는 세포의 반응은 1차 면역화 후 보다는 2차 및 3차 면역화 후에 약간 더 높았으며, 반면 항 LT를 생성하는 세포의 최적수는 2차 면역화 후에 관찰되었다. 생성된 항 CFA 항체는 대부분 IgA 부류이지만 몇몇ASGs를 생성하는 IgM로 또한 관찰되었다. 즉 항 CTB ASCs는 대부분 IgA 동 기준이지만 몇몇 IgG를 생성하는 세포도 또한 확인되었다. 또한 본 백신은 대부분의 대상자에게 있어서 CTB/LT 뿐만 아니라 CFA에 대해 현저한 혈청 항체 반응을 유발시킨다.
[인용 문헌]

Claims (4)

  1. 사람의 장독소성 대장균 박테리아에 의해 유발되는 장감염에 대한 백신조성물을 제조하는 방법으로서, 각각 특정 타입의 콜로니형성 인자 항원을 발현시킬 수 있는 능력을 가진 서로 다른 공지의 균주로부터 선택되는 1종 이상의 대장균 균주를 예정된 밀도로 대장균 박테리아의 표면상에서 상기 특정 형태의 콜로니형성 인자 항원의 발현을 높은 수준으로 달성시킬 수 있는 액체 배지 내에서 적절한 조건 하에 증시시킨 다음 수확하고, 염수중에 박테리아 배양액을 재현탁시킨 후에 약하게 교반시키면서 이 현탁액에 포르말린을 가함으로써 최종농도를 0.2M 포름알데히드로 되게 한 다음 계속 교반시키면서 37℃에서 약 2시간 동안 배양시킨 후 다시 4℃에서 24-48시간 동안 배양시킴으로써 상기 특정 타입의 콜로니형성 인자 항원의 항원특성 및 혈구응집 특성을 보유하는 포르말린으로 처리된 대장균 균주를 형성시킨 다음 즉시 이 포르말린으로 처리된 대장균 박테리아를 의약적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제와 적절한 농도로 혼합하는 것을 특징으로 하는 장감염에 대한 백신조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체 배지는 1%(w/v)카사노미산, 0.15%(w/v) 효모추출액, 0.4mM, MgSO4, 0.04mM MnCl2및 탈이온수(pH 7.4)를 함유하며, 배양은 37℃에서 4-6시간동안 철저한 교반하에 또는 광범위하게 통기시킬 수 있는 기타 다른 수단하에 수행되고, 그후 박테리아의 수확은 원심분리나 여과 또는 기타 다른 수단에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 장감염에 대한 백신조성물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 특정타입의 클로니형성 인자 항원을 발현시키는 균주는 사람의 장의 콜로니형성 인자 항원 CFA/I, CFA/II (CS1,CS2,CS3) 및 CFA/IV (CS4,CS5,CS6)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장감염에 대한 백신조성물.
  4. 제1항에 있어서, 산-중화성 완충액 및 엔도톡신에 대한 면역을 유도하는 추가적인 항원성 성분을 추가적으로 가하는 것을 특징으로 장감염에 대한 백신조성물의 제조방법.
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SE (1) SE9100556D0 (ko)
SK (1) SK280919B6 (ko)
WO (1) WO1992014487A1 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7118758B1 (en) * 1997-01-24 2006-10-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Transformed bacteria producing CS6 antigens as vaccines
SE9401921D0 (sv) * 1994-06-03 1994-06-03 Sbl Vaccin Ab A method of cultivating bacteria
US7404961B2 (en) 1996-08-02 2008-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Peptides responsive to antibodies against consensus peptide of the CS4-CFA/I family proteins
US7094883B1 (en) 1996-08-02 2006-08-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Monoclonal antibody which agglutinates E. coli having the CS4-CFA/I family protein
US5994078A (en) * 1997-07-31 1999-11-30 Maine Medical Center Stable encapsulated reference nucleic acid and method of making
SE515285C2 (sv) * 1998-12-18 2001-07-09 Sbl Vaccin Ab Oralt vaccin mot diarré
GB0121998D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Acambis Res Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
NZ547156A (en) * 2003-10-31 2009-08-28 Univ British Columbia Attenuation of A/E pathogen virulence by modulating expression of NleA
CN101378780A (zh) * 2006-02-01 2009-03-04 Sbl疫苗公司 重组细菌中的肠产毒性大肠杆菌定居因子(cf)抗原
EP2711013A4 (en) * 2011-05-18 2015-03-04 Ajinomoto Kk IMMUNSTIMULANDS FOR ANIMALS, FEED THEREFOR AND MANUFACTURING PROCESS THEREFOR
WO2013009843A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Camas Incorporated Compositions against bacterial toxins
CN103917244B (zh) 2011-09-12 2016-07-06 斯堪的纳维亚生物制药控股公司 用于提高细胞表面的etec cs6抗原呈递的方法及可由其获得的产物
WO2013037397A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Scandinavian Biopharma Holding Ab Vaccine for protection against etec induced diarrhea comprising dmlt.
RO132299A3 (ro) 2017-06-06 2018-12-28 Fântână Raul Sorin Compoziţie şi metodă de preparare şi evaluare a unui imunogen complex numit i-spga, destinat producerii de proteine imunologic active ()

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD62894A (ko) *
DE1208038B (de) * 1963-08-01 1965-12-30 Wellcome Found Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen Coli-Infektionen
GB1472624A (en) * 1974-09-02 1977-05-04 Canadian Patents Dev Enteric disease vaccine
US4338298A (en) * 1980-04-04 1982-07-06 Endowment And Research Foundation At Montana State University Vaccine for passive immunization against enteric colibacillosis and method of use
DK41885A (da) * 1985-01-31 1986-11-13 Slagteriernes Forskningsinst 987p-fimbrie-producerende mikroorganisme, vaccine til immunisering af grise samt fremgangsmaade til fremstilling af vaccinen
IL79432A (en) * 1985-07-31 1992-05-25 Univ Leland Stanford Junior Unicellular microorganisms having invasive capability due to exogenous inv gene and vaccines comprising such microorganisms
FI76484C (fi) 1986-02-03 1988-11-10 Osmo Norvasto Kundstol.
JPS6399020A (ja) * 1986-06-05 1988-04-30 ベイラ−　カレツジ　オブ　メデイシン ワクチンとその製法
SU1723116A1 (ru) * 1988-04-15 1992-03-30 Оренбургский Государственный Медицинский Институт Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS, используемый дл получени препарата дл профилактики и лечени воспалительных процессов и аллергических заболеваний
EP0433372B1 (en) * 1988-09-06 2002-06-12 Washington University Oral immunization by transgenic plants
SE9401921D0 (sv) * 1994-06-03 1994-06-03 Sbl Vaccin Ab A method of cultivating bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
HU9302410D0 (en) 1993-11-29
EP0573527A1 (en) 1993-12-15
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HUT67198A (en) 1995-02-28
DE69226944T2 (de) 1999-02-11
US6558678B1 (en) 2003-05-06
CZ281556B6 (cs) 1996-11-13
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NO933037D0 (no) 1993-08-25
SK280919B6 (sk) 2000-09-12
AU663864B2 (en) 1995-10-26
DE69226944D1 (de) 1998-10-15
HU213924B (en) 1997-11-28
BG98070A (bg) 1994-06-30
BG61683B1 (bg) 1998-03-31
AU1330892A (en) 1992-09-15

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