JPH04501107A - 在郷軍人病ワクチン及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 在郷軍人広２り±２及び土塁製造方法 銘府＠委託 本発明は、米国保健・福祉省より与えられた認可番号Ａｌ−２２４２１の下、政 府支援により実施されたものである。本発明の正当な権利は政府が所有ｌＮ−７ ，。

発明Ω分野 本発明は、広範囲にわたる細胞内寄生虫に対するワクチンに関する。さらに言え ば、本発明は、レジュネラ・二二−モフィラ菌（Ｌｅｇｊｏｎｅｉｌａ　ｐｎｅ ＋ｍｐｈｉｌａ）などの細胞肉寄ノを虫に感染し、た哺乳類の宿主に効果的な免 疫范・答をさせるワクチンとその製造方法に関するが、そのような病原体の細胞 外生成物は、隔離された細菌性病原体の表面成分を利用するのではなく、ワクチ ンとして使用される。

見切Ω背景 多くの細菌は無害である。事実、人間や他の哺乳類にどって有益な細菌は数多く ある。

し、かじ、ある細菌は人間や他の哺乳類の組織に入って成長・伝播する。その中 で特に問題となっている有毒な微生物として細胞内微生物がある。この範鴫に入 る有毒病原体は、細胞の外ではなく、感染宿主の細胞内において繁殖する。

細胞内病原体を広く分類すると、世界で罹病と死亡の主要原因となっている微生 物が含まれる。例えば、細胞内病原体により、世界でおよそ１　、０００万人も か毎年結核にかかり、（米国では年間約２５．０００人）、その内結核で死亡す る数は年間約３００万人にも達し、ロンセン病はおよそ１，２００万人も罹病す る。さらに、アメリカ・トリパノゾーマ病（シャガス病）ではおよそ１，０００ 万人に達する。その他にも、この細胞内病原体は、在郷軍人病を始め、皮膚・内 臓す・−シュマニア症、リスプリア病、トキソプラズマ症、ヒストプラズマ症、 トリコーマ、オウム病、Ｑ熱、レジオネラ症などの重要な疾病の原因となってい る。しか１７、このような細胞内病原体による疾病に有効なワクチンは数少ない 。唯−広く使用されているのか結核に対するＢＣＧワクチンである。ＢＣＧワク チンはヨーロッパで初めは使用されたが、その効力については疑わしい生菌ワク チンである。

在郷軍人病の原因病原体であるレジュネラ・ニューモフィラ菌は、まさにそれを 防御するために設計されている免疫系の細胞である単核白血球やマクロファージ の細胞内で繁殖するため、とりわけ厄介な細胞内病原体である。レジュネラ・ニ ューモフィラ菌は、細菌を殺すために設計されている免疫系の細胞に侵襲し、そ れを宿主細胞とすることにより、正常な免疫防御機能から実際に免れいている細 胞内病原体の１つである。従って、本発明の原理を実証するのに、このレジュネ ラ・二二−モフィラ菌はとりわけ適している。

本発明は、専業者であれば、以下レジュネラ・二二−モフィラ菌について説明す る実施例が在郷軍人病の治療だけに限られるものでは決しでないこと、また、他 の細胞内病原体による疾病の治療についても本発明が適用されることがわかるで あろう。

在郷軍人病の臨床検査は、１９７６年６月、２２１人の軍人（多くが米国在郷軍 人）がフィラデルフィアで罹病上たときから始まる。このとき、結局３４人の軍 人が命を落とした。その後新たにわかンたこととして、在郷軍人病は新しい病気 ′Ｃはなく、流行病や風土病の形で世界的に見られるということである。米国で は肺炎の主要な原因菌としで、また致命的な院内肺炎においては高い確率でこれ が原因していると考えられ−こいる。全年齢層にわたり感染するが、とりわけ３ ０歳以上か感染し、多くの場合女性よりも男性を標的と１７でいる。

また、この疾病は、喫煙者、飲酒家、旅行愛好者、建築作業員１免疫機能障岩者 、威器移植者などに偏って感染する。

レジュネラ・ニコーモフィラ菌は培養条件の難し、い好気性グラム陰性菌である 。この微生物は汚染源から空気感染により人間および哺乳類の宿主に寄生すると 考えられている。

環境に偏在する（二のり、・ジュネラ・ニューモフィラ菌は、水、土、泥、空調 システムの冷却塔から分離されている。また、細菌を運ぶエアゾルを作る渦流や シャワーの先端などにも関連する。

この任意細胞侶細菌性病原体に感染１７た患者は、体液性免疫反応と細胞性免疫 反応の両刀を引き起こす。体液性免疫反応は、抗体が補体によって細菌性病原体 を殺そうとしないたｔルジュネラ・ニューモフィラ菌に対して宿主防御の二次的 役割に過ぎないように思われる。さらに、体液性免疫反応は食細胞によって穏や かな殺傷効果しか示ざず、単核白血球におけるり、−ジュネラ・ニューモフィラ 菌の細胞内増殖を抑制しない。それとは逆に細胞性免疫反応は、活性化した単核 白血球と肺胞の一７クロフアージが細胞内増殖を抑制するため、レジュネラ・ニ ューモフィラ菌に対して宿主防御の一次的役割を果たすように思われる。

在郷軍人病研究の好適な哺乳類モデルとしては、し・ジュネラ・ニューモフィラ 菌の肺感染に対し、て人間と同じ感受性をもつモルモットである。レジュネラ・ 二二−モフィラ菌を含んだエアゾルに曝したモルモットは、数日の潜伏期間後に 、発熱、体重減少、呼吸困難などを特徴とし、ときには死に至らしめる肺疾患を 発現する。この感染症候群は、人間の在郷軍人箔の症候群に臨床上および病理学 上極めて類似している。人間と同様、致死量に近いレジュネラ・ニューモフィラ 菌に曝されると、モルモットも体液性免疫反応と細胞性免疫反応を示す。このモ ルモットは、次に致死的なレジュネラ・ニューモフイラ菌の抗原投与に対しても 防御免疫を呈する。レジュネラ・二ニー・モフィラ菌はモルモットにとって極め て毒性が高く、腹膜内とエアゾルの両接種ルートによってこの動物にとっては致 死的である。

従って、本発明では、発明を限定するためではなく、単に説明する目的のために 、哺乳類の宿主としてモルモットを実施例に使用して説明する。専業者であれば 、人間を含むその他の哺乳類の宿主にも本発明が適用されることがわかるであろ う。

ここで、レジュネラ・ニューモフィラ菌を始めとするレジュネラ眉は、「在郷軍 人病」としてまとめて言及されるさまざまな症候群に対する原因菌と捉えるべき である。在郷軍人病には、他にボンティアツク熱、心内膜炎、神経性症も含まれ る。現在のところ、レジュネラ層に対するワクチンは存在しない。さらに、上述 １−だように、一般に細胞内病原体が原因の疾病に対するワクチンはほとんど存 在しない。

レジュネラ・ニューモフィラ菌などの細胞内病原体に対する効果的なワクチンの 研究が行き詰まるのは、これらの有毒病原体が通常宿主の細胞内に入って隔離さ れており、七のため宿主の免疫系がそれを容易に検出できないという事実がある からである。さらに、レジュネラ・ニューモフィラ菌などの細胞内病原体の一部 には、細菌性表面成分に対し７て生成される抗体が、実際はそれらの病原体が増 殖に必要な細胞内環境へ病原体を誘導して取り込んでしまう。従って、このよう な細菌の細胞の表面抗原に対して伝統的に当てらねている従来のワクチンは、感 染を抑えるのではなく、実際はこれらの感染性微生物の増殖を刺激してしまうこ とがある。このように、細菌の表面成分に対（、で当てられる従来のワクチンは 、細胞内病原体の場合には禁忌であると言える。このような従来のワクチンは、 細胞内病ｗ体の感染に対して一次的な防御の役割を果たす免疫形態の細胞性免疫 が衰退している患者にとっては特に大きな問題となる。それはそうした患者は急 激に増殖する感染性に対して戦う力を消失しているからである。これらの患者に は、臓器移植患者やＨＩＶ感染者などの免疫機能陣再患者または免疫抑制患者が 含まれる。これらの患者はすべて細胞内病原体の感染に特に高い感受性を有して いる。

そこで、本発明の第一の目的は、レジュネラ・ニューモフィラ菌などの細胞内病 原体に対して効果的な免疫応答を引き起こすワクチンとその製造方法を提供する ことである。

本発明の第二の目的は、従来の全細菌性ワクチンに関する毒性をなくしたワクチ ンを提供することである。

本発明の第三の目的は、細胞内病原体の食作用すなわち細胞への取り込みを誘導 （７ないワクチンとその製造方法を提供することである。

本発明の第四の目的は、ワクチン接種した哺乳類の宿主が宿主の細胞内に隔離さ れた病原体を検出できるようになり、それによって宿主の免疫系が感染病原体を 殺傷、またはその増殖を阻止することができるようなワクチンとその製造方法を 提供することである。

光切９棗上衿 これらの目的およびその他の目的は、レジュネラ・ニューモフィラ菌の様々な種 やセログループの細胞内病原体による二次感染に対して効果的な免疫応答が哺乳 類の宿主内で形成される本発明によるワクチンおよび製造方法により達成される 。

つまり、本発明の免疫処置は、病原体自体の成分ではなく、免疫因子のような細 胞内病原体から作る細胞外生成物を利用する。このような細胞外細菌性生成物は 、一旦免疫化されると宿主の免疫系に認識されて、病原体の二次感染に対し効果 的な免疫反応を引き起こすことができる。

本発明によれば、特定の細胞内病原体に対する哺乳類のための効果的なワクチン は、まず初めに標的とする細胞内病原体を選択し、その標的の病原体に免疫をも つ哺乳類の宿主においてリンパ細胞の強力な増殖反応を刺激する病原体の１つま たは複数の細胞外生成物を同定し、次に、その細胞外生成物を使って宿主に免疫 をもたせることによって製造される。

本発明の１つの実施例においては、レジュネラ・ニューモフィラ菌の主要分泌タ ンパク質（ＭＳＰ）を利用している。ＭＳＰはレジュネラ・ニューモフィラ菌の 成長過程において培養上澄み液に遊離される主要タンパク質であり、免疫獲得哺 乳類において強力な細胞性免疫反応を引き起こす。ＭＳＰは実験ブイヨン内でレ ジュネラ・ニューモフィラ菌を培養すれば簡単に得ることができる。

さらに詳しく言えば、】つの実施例では、フィラデルフィア１型菌株のレジュネ ラ・ニューモフィラ菌を酵母抽出ブイヨン（ＭＳＰの分離を容易にするためにア ルブミンは除去）内で培養し、そのブイヨンを遠心分離して細菌をベレットにす る。上澄み液を保持して濾過すると、ＭＳＰが硫酸アンモニウム沈澱物を通って 上澄み液から沈澱し、さらに透析する。沈澱したＭＳＰを分子ふるいクロマトグ ラフィ、続いてイオン交換クロマトグラフィにかけると精製されてほぼ１００パ ーセント純度のＭＳＰが出来上がる。

精製後、ＭＳＰを単独にまたはフロインドアジュバントないしフロイント不完全 アジュバントと共にできれば注射して哺乳類の宿主動物に投与する。例えば、フ ロイント完全アジュバントに精製ＭＳＰを入れて皮下注射にて免疫処置した後、 約３週間後にフロイント不完全アジュバントにて２回目の免疫処置をすることも できる。しかし、単回投与で標的の病原体に効果的な免疫反応を引き起こすこと のできる成分の細胞外生成物を単回投与して免疫処置することも、本発明の範囲 内にあると考えられる。

ある実施試験では、５匹のモルモットを上述のように免疫処置し、対照の５匹の モルモットにはＭＳＰを含まないフロイント完全アジュバントと不完全アジュバ ントにて偽の免疫処置を行った。３週間後、処理モルモットと対照モルモットの 両方に致死量のレジュネラ・ニューモフィラ菌を抗原投与した。−回目の試験で はＭＳＰ免疫処置群の８０パーセントが生存したが、対照群の生存はゼロであっ た。続いて行ったフォローアツプ試験では、ＭＳＰ免疫処置群の８３パーセント が生存したが、対照群の生存はゼロであった。

初めの試験では、１回目の投与で１０マイクログラムのＭＳＰを、２回目の投与 で４０マイクログラムのＭＳＰを動物に投与した。フォローアツプ試験では、１ 回目、２回目とも４０マイクログラムのＭＳＰを動物に投与した。

本発明の適用範囲の広さに立証されるように、その後行った試験では、フィラデ ルフィラ１型菌株のレジュネラ・ニューモフィラ菌から抽出したＭＳＰはレジュ ネラ層の他のセログループおよび種との間に交差反応をもつことがわかった。さ らに、ＭＳＰを臭化シアンで開裂しても、ＭＳＰのサブユニットは防御免疫を引 き続き誘導する。同様に、熱を加えて変性しても防御免疫を引き続き誘導する。

細胞内病原体のＭＳＰおよびその他の分泌生成物は、感染宿主の細胞によって細 胞外に放出されると考えられるために、本発明はワクチン接種された宿主の免疫 系が宿主の細胞内に隔離された病原体を検出できるようにさせるものである。こ のように、ワクチン接種された宿主の免疫系は効果的な免疫応答を活性化させ、 細胞内の病原体を殺傷またはその増殖を阻止することできる。同様に重要なこと として、細胞外分泌生成物に対して当てられる抗体は細胞内病原体の取り込みを 引き起こさず、従って、感染を容易にしない。このことは特に免疫機能障害者や 臓器移植患者にとっては重要なことである。

本発明の他の目的、特徴、利点は、以下の好適実施例の詳細な説明を考察すれば 、専業者にとってみれば自明のことであろう。

図９間単望説盟 第１図は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって同定されるように、ＭＳＰの３段階の精製 方法を示す。

第２図は、レジュネラ・ニューモフィラ菌のさまざまなセログループに共通する ＭＳＰ様分子を示す。

詳椴に説労 本発明は、細胞内病原体に対する効果的な免疫反応を起こすワクチンとその製造 方法を提供する。好適実施例として、レジュネラ・二二−モフィラ菌を標的病原 体として使用した。本発明の教えによれば、免疫処置（致死量に近い感染を受け た）モルモットにおいてリンパ細胞の強力な増殖反応および皮膚の遅延型過敏症 を刺激するＭＳＰ分子を同定し、その後、その分子でモルモットを免疫処置する と、特異的な細胞性（および体液慣免疫反応および防御免疫を引き起こすことが 認められた。専業者であれば、上述の方法をどの細胞内病原体についても利用し て、本発明の方法を実施できることがわかるであろう。従って、本発明は、レジ ュネラ・二二−モフィラ菌だけに対するワクチンおよび免疫処置方法ということ に特に限るものではない。

例えば、この方法に従って、レジュネラ・ニューモフィラ菌の主要分泌タンパク 質であるＭＳＰは分子であると同定されたが、これに対して免疫獲得モルモット は非常に強い細胞性免疫反応を示した。３段階の精製手順を１回行うだけで、多 くのＭＳＰを得ることができる。免疫獲得動物から得たリンパ細胞は、はんの少 ないＭＳＰ量でも強く増殖することがわかった。同様に、免疫獲得動物は、ＭＳ Ｐに対し強い皮膚遅延型過敏症を引き起こした。免疫反応を調べるために、モル モットにＭＳＰを皮下免疫処置したところ、ＭＳＰで免疫処置されたモルモット は、ＭＳＰに対して強い特異的細胞性免疫反応（リンパ細胞の増殖と皮膚遅延型 過敏症りを呈し、特に重要なこととしては、レジュネラ・ニューモフィラ菌の致 死的なエアゾル抗原投与に対しても効果的な免疫反応を呈した。

個々に独立した試験において、ＭＳＰを皮下注射したモルモットは、致死的なエ アゾル抗原投与に対しても８０パーセントから１００パーセントが生存した。全 体では、１６匹のＭＳＰ免疫処置モルモットの内８８パーセントがそのような抗 原投与に対し生存したものの、１５匹の対照動物の生存はゼロであった。レジュ ネラ・二二−モフィラ菌の細胞外膜の２つの主要成分であるリポ多糖類（透析し た）と主要外膜タンパク質は、ＭＳＰとは違って免疫処置されたモルモットにお いてリンパ細胞の増殖を刺激しなかった。

以下の無限に拡げることができる実施例から、専業者は本発明をさらに理解でき るものと思われる。

大施透よ レジュネラ・ニューモフ　ラ　か゛のＭＳＰの３′まず、レジュネラ・ニューモ フィラ菌を木炭酵母抽出寒天培地に接種する。その後、コロニーをその寒天培地 から１０ｍ１の酵母抽出ブイヨン（アルブミン当量−アルブミン不在酵母抽出ブ イヨン）に懸濁する。２リツトルの滅菌したネジキャップ付きフラスコを２個用 意し、それぞれに５００　ｍｌの酵母抽出ブイヨンを入れる。各フラスコを予め 暖めておき、それにレジュネラ・二二−モフィラ菌懸濁液５ｍｌを接種する。− 晩３７℃にて１２Ｏｒｐｍの速度でインキュベートする（約２０時間）。培地の 純度を光顕微鏡を使って、少なくとも１０箇所を４００倍で走査し、また、羊血 液寒天培地と木炭酵母抽出寒天培地を接種して調べる。

〔両寒天上で多くの汚染源は急速に（１日で）成長する。レジュネラ・ニューモ フイラ菌は木炭酵母抽出寒天培地だけではゆっくりと（数日かけて）成長する。

〕　ブイヨンのアリコートをプラスチックの遠心分離缶に入れ、細胞を４℃で遠 心分離してペレットとする。

［ＧＡＳ　ｏ−テークと２５０　ｍ１缶のある５ｏｒｖａ１１遠心分離器の場合 、１０分間、１２，０００　ｒｐｍで遠心分離〕　上澄み液（ＭＳＰ含有）を静 かに傾けて、始め０．４５　ミクロンのフィルタで濾過し、次に０．２ミクロン のフィルタを使って残留する細菌粒子を除去する。

硫酸アンモニウムを４５パーセント飽和するまで濾過した上澄み液に加え、４℃ で１時間ゆっくり撹拌してＭＳＰ以外の成分を沈澱させる。溶液をプラスチック 容器に静かに注ぎ、沈澱物は４℃で遠心分離にかけてプレットとする。（ＧＡＳ 口−テークと６個の２５０　ｍ１缶のある５ｏｒｖａ１１遠心分離器の場合、３ ５分間、１２．０００　ｒｐｍで遠心分離〕　上澄み液を静かに注ぎ、４５％硫 酸アンモニウム沈澱物は破棄する。硫酸アンモニウムを９５パーセント飽和する まで上澄み液に加え、その液を４℃にてインキュベートし、−晩ゆっくり撹拌す る。インキュベーション後、溶液をプラスチック容器にゆっくり注ぎ、沈澱物を 上述のようにして遠心分離にかけてベレットとする。上澄み液を捨て、ＭＳＰ高 含有の沈澱物を集めて、少量のＢＥＮ　（０，０２５Ｍ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ、　 ０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ　、および０．１５　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ５，９）で２ 度洗浄して、１リツトルＢＥＮに対して５，０００〜６，０００　ｍｗの５ｐｅ ｃｔａｐｏｒ透析膜で透析する。

透析したＭＳＰ高含有液を５０　ｃｍＸ２．５　ｃｍカラムの５ｅｐｈａｃｒｙ ｌ　５−２００に移す。〔装置：ＬＫＢ　Ｍｕｌｔｉｒａｃフラクションコレク タ、Ｂｅｃｋｍａｎモデル１５３分析用ＵＶディテクタ、Ｒａｂｂｉｔ嬬動ポン プ（Ｒａｉｎｉｎ）　、Ｂｅｃｋｍａｎ分析用光学装置、リニアチャーＦ・レコ ーダ〕　カラムを一晩８　ｍｌ／ｈｒで回し、２ｍｌの分画を集め、次の段階が 終るまで４℃にて保管する。各分画の２５μｍサンプルを硫酸ドデシルナトリウ ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により検査する。〔 ２５μｍサンプルを２５μｍサンプル緩衝液と混合し、１２．５％５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲルに移す。分子量標準品がが同時に動く。）　ＭＳＰを多く含み、非ＭＳ Ｐタンパク質をほとんど含まない分画を同定してプールする。プールした分画を 、容量が２〜４ｍｌになるまで、３０　、０００分子量を排除するフィルタが付 いたＡｍ１ｃｏｎフイルタ装置で濃縮濾過する。

濃縮上た分画をＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６８カラム（２，５ｃｍ Ｘ１３　ｃｍ）に移す。各チャンバーに２．５ベツド容量をもつ勾配メーカーを 使って、０．０２５　Ｍ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ、　０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　 ｐＨ５，９に０．１５　Ｍ　ＮａＣ１−０，６５Ｍ　ＮａＣ１を勾配させる。カ ラムを約８　ｍｌ／ｈｒ回し、２ｍｌの分画を集め、次の段階が終了するまで４ ℃にて保管する。各分画の２５μ】サンプルを上述したように５ＤＳ−ＰＡＧＥ にて検査する。ＭＳＰだけを含有する分画を同定しプールする。プールした分画 を、容量が約１ｍ１Ｃｒｃのリットル容量に対して）になるまで、３０，０００ 分子量を排除するフィルタが付いたＡｍ１ｃｏｎフイルタ装置を使って氷上で濃 縮濾過する。その後、１リツトルＢＥＮの３種に対し５，０００〜６，０００　 ｗの５ｐｅｃｔａｐｏｒ透析膜で濃縮物を透析する。

図１に示したように、レジュネラ・二二−モフィラ菌はブイヨン培地で成長し、 遠心分離することによって分離することができる。上澄みのタンパク質は硫酸ア ンモニウムで沈澱し、上述したように５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられる。レーンＢ は、この調製（手段１）によるタンパク質のプロフィールを示す。硫酸アンモニ ウム沈澱後に得たタンパク質は分子ふるいカラムにかけられ、ＭＳＰを含有する 分画が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより同定された。これらの分画に含まれるタンパク質 はエタノールで沈澱させ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。レーンＣは、この調 製（手段２）によるタンパク質のプロフィールを示す。分子ふるいクロマトグラ フィ後に得たタンパク質はイオン交換カラムにかけ、溶出し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ にかけた。レーンＤは、この調製（手段３）によるタンパク質のプロフィールを 示す。レーンＡは、分子量標準品（牛アルブミン６６．０００　、オボアルブミ ン４５，０００　、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ３６，０ ００　、炭酸脱水素酵素２９，０００、トロプシノーゲン２４，０００、トリプ シンインヒビター２０，１００）を含む。

大施何２ ４つの独立した試験において、モルモットにＭＳＰを４０μｇ３週間にわたり２ 回皮下投与して免疫処置した。１回目の投与はフロイント完全アジュバント内に 入れて、２回目の投与、はフロインド不完全アジュバント内に入れて行った。対 照のモルモットにはフロイン）・完全または不完全アジュバントに緩衝液を加え て偽の免疫処置を行った。３週間後、、すべての動物に致死量のレジュネラ・ニ ューモフィラ菌をエアゾル抗原投与（７、生存個体を調べた。

表Ａに示したように、免疫処置されたモルモットは致死のエアゾル抗原投与に対 ｊ、強い防御を示した。

表−八 試験番号　供試モルモット　抗原投与数に対する生存モルモット数　μおよび生 存率％ 八　対　照　０１５　（０％） 免疫処置　４１５　（８０％）００５ Ｂ　対　照　０１５　（０％） 免疫処置　５／６　（８３％）　０．０２Ｃ対　照　０／４　（０％） 免疫処置　４／４　（１００％）００３Ｄ　対　照　０／６　（０％） 免疫処置　４／６　（６７％）００３ 合計　対　照　０／２０　（０％） 免疫処置　１７／２１　（８１％＞　ｏ、ｏｏｏｏｏｏｏｓ＊フィッシャー抽出 試験、２テ一ル 人見例１ ２つの独立した試験において、モルモットにＭＳＰを皮下投与して免疫処ｆｆｌ 、（始めフロイント完全アジュバント内に入れて、３週間後にフロインド不完全 アジュバント内に入れて４０μｇ投与）、またはモルモッ１へに偽の免疫処置（ 始めフロイント完全アジュバントだけ、３週間後はフロインド不完全アジュバン トだけを投与）をした。すべての動物に総容１１００１ｄのＭＳＰ指示ａ縮物を 皮肉注射して皮膚試験を行い、２４時間後に紅斑および硬化の範囲を測定しこ。

表Ｂに示したように、ＭＳＰ免疫処置されたモルモットは、最小限の反応し、が 示さなかった対照動物と比べ、ＭＳＰの皮肉投与の反応に対し７て明確な紅斑お よび硬化を示；７た。

表一旦 試験番号　供試モルモット　モルモット数　皮膚反応　ＭＳＰ指示濃縮物（μｇ Ａｎｌ）１．００μｍに対する紅斑および硬化の範囲（＋＋＋＋ｎ）Ａ　□置　 ６　紅斑　２４　１４　９　０硬化　１３７４０ 対　照　３　紅　斑　８　４　０　０ 硬化　０　０　００ Ｓ、１．　（紅斑跡３　３．５　、、ｏ　−Ｓ、Ｉ、（硬化跡　ψ　（ｙ）　■ 　−１！２ Ｂ　勉（資）置　３　紅斑　】７０ 硬化　６０ 対　照　３　紅　斑　３０ 硬化　１０ Ｓ、１．　（紅斑）＊５．７　− Ｓ、１．　（硬化）ｔ６．０　− ＊ＳＩ−変異免疫処置を受けたモルモットの平均皮膚反応（ｍｍ）　／対照モル モットの平均皮膚反応（薗） 実施何重 ４つの独立した試験において、前の表と同様に、モルモットをＭＳＰで免疫処置 、または偽免疫処置（対照）した。牌臓リンパ細胞を取り出し、マイクロカス１ −ウェル内で３７℃にて２日間、抗原がない状態、または指示濃度のＭＳＰ、ホ ルマリンで殺したレジュネラ・ニスーモフィラ菌（ＦＫＬＰ）　（１０〜句）、 あるいは１ノジユネラ・ニューモフィラ菌膜組織（１０”／ｍｌ）が存在する状 態でインキュベートシた。リンパ細胞を、”　Ｈ−チミジンとの結合能について 調べ、刺激係数を計算した。

表Ｃに示されているように、ＭＳＰ免疫処置の動物から採取したリンパ細胞は、 λ・］照置物のリンパ細胞に比べ、ＭＳＰに対し明確な反応を示した。ＭＳＰ免 疫処置動物のリンパ細胞および対照動物のリンパ細胞とも、ホルマリンで殺した レジュネラ・ニューモフイラ菌（ＦＫＬＰ）およびｌノジュネラ・ニューモフイ ラ菌膜組織に対しては反応か弱かった。

表一旦 試験番号　抗原　刺激係数（Ｓ、Ｌ、）＊免疫処置モルモット　対照モルモット 　Ｓ、１．免疫処【Ｓ、１．対照 Ａ　ＭＳＰ　（ｂｚｇ／ｍｌ）　１７．２　１，０　１７．２Ｍ５Ｐ　（０，１ Ｈｇ／ｍｌ）　１５．８　１，０　１５．８ＦＫＬＰ　４４．９　２９．０　１ ．５膜組織　２１．４　９．０　２．４ Ｍ５Ｐ　（ｌμｇ／ｍｌ）　１３．８　１，２　１１．５Ｍ５Ｐ　（０，１Ｈｇ ／ｍｌ）　１１．１　１．１．　１０．１ＦＫＬＰ　２１．６　１０．７　２． ０膜、！！　１１．０　６．４　１．７ Ｍ５Ｐ　（１０μｇ／ｍｌ）　１５．２　７．７　２．０Ｍ５Ｐ　（１Ｈｇ／ｍ ｌ）　４．２　５．５　０．８ＦＫＬＰ　２８．５　２８．３　１．０膜組、＠ 　３４．４　２６．３　１．３Ｍ５Ｐ　（１０μｇ／ｍｌ）　２２．１　１，５ 　１４．７Ｍ５Ｐ　（１Ｈｇ／ｍｌ）　１８．０　３．０　６．０ＦＫＬＰ　４ ３．１　２１．２　２．０膜組織　３３，９　２７．０　１．３ 大施例旦 ２つの独立した試験において、モルモットをＭＳＰ（フロイント完全アジュバン ト内４０μｇ）を皮下投与により免疫処置、またはフロイント完全アジュバント だけを皮下投与した（対照）。３週間後、婢臓リンパ細胞を取り出し、マイクロ テストつＪル内で３７℃にて２日間、抗原がない状態、または指示濃度のＭＳＰ 、指示濃度の加熱ＭＳＰ（６０℃、１時間）が存在する状態でインキュベートし た。リンパ細胞を　ａＨ−チミジンとの結合能について調べ、刺激係数を計算し た。

表りに示されているよう１こ、ＭＳＰ免疫処置のモルモットは、対照モルモット と比べ、ＭＳＰおよび加熱（タンパク質分解が生じ不活（ロ）ＭＳＰの両方に対 し明確なリンパ細胞増殖反応を示した。

表一旦 試験番号　抗　原　刺激係数（Ｓ、Ｌ、）木（μｇ／ｍｌ）　免疫処置モルモッ ト　対照モルモット　Ｓ、Ｉ免疫処ｔ／Ｓ、１．対照 Ａ　ＭＳＰ（１）　１７．４　１．９　９．２Ｍ５Ｐ　（０，１）　１７．５　 ３．９　４．５加ＭＭＳＰ　（１）　Ｈ，２２，０５，６加顯ＳＰ　（０，１） 　８．８　３．６　２．４Ｂ　ＭＳＰ（１）　２４．７　１，９　１３．０Ｍ５ Ｐ　（０，１）　２０．６　１．８　１１．４加熱耶Ｐ　（１）　１９．４　１ ，６　１２．１加熱耶Ｐ　（０，１）　１５．６　２．０　７．８＊　Ｓ、１． （刺激係数）＝抗原とインキュベートしたリンパ細胞の８Ｈ−チミジン平均結合 （ｃｐｍ）／抗原を伴わずにインキュベートシたリンパ細胞の３Ｈ−チミジン平 均結合（ｃｐｍ） 寒施例旦 １つの試験において、モルモットに加熱ＭＳＰ（６０℃、１時間）を皮下投与し て免疫処置しく始めフロイント完全アジュバント内に加熱ＭＳＰを４０μｇ１続 いて３週間後にフロインド不完全アジュバント内に加熱ＭＳＰを４０μｇ投与） 、別のモルモットには皮下投与にて偽の免疫処置（対照）をした（始めフロイン ト完全アジュバントだけを、続いて３週間後にフロインド不完全アジュバントだ けを投与）。３週間後、膵臓リンパ細胞を取り出し、マイクロテストウェル内で ３７℃にて２日間、抗原がない状態、または指示濃度のＭＳＰ１指示濃度の加熱 ＭＳＰが存在する状態でインキュベートした。リンパ細胞を、ＩＨ−チミジンと の結合能について調べ、刺激係数を計算した。

表Ｅに示されているように、加熱によりタンパク質分解が起こり不活性となった ＭＳＰで免疫処置したモルモットから採取したリンパ細胞は、対照のモルモット から採取したリンパ細胞と比べ、すべての濃度のＭＳＰに対して、また１０μｇ ／＋ｎｌ〜１μｇ／ｍｌの加熱ＭＳＰに対して明確な増殖反応を示した。

表一旦 試験番号　抗　原　刺激係数（Ｓ、Ｌ、）＊（μｇ／ｍｌ）　免疫処置モルモッ ト　対照モルモット　Ｓｌ、免疫処置ＶＳ、１．対照 Ａ　ＭＳＰ（１０）　１９．８　５．１　３．９Ｍ５Ｐ　（１）　１９．４　６ ．３　３．１Ｍ５Ｐ　（０，１）　１０．４　０，９　１１．６Ｍ５Ｐ　（０， ０１）　２．８　１．９　１．５加熱ＭＳＰ　（１０）　２２．９　５．３　４ ．３加熱ＭＳＰ　（１）　９．８　３．４　２．４加熱ＭＳＰ　（０，１）　２ ．８　２．８　１．０加熱ＭＳＰ　（０，０１）　１．４　１．２　１．２＊　 Ｓ、Ｔ、（刺激係数）＝抗原とインキュベートしたリンパ細胞の８Ｈ−チミジン 平均結合（ｃｐｍ）／抗原を伴わずにインキュベートしたリンパ細胞の３Ｈ−チ ミジン平均結合（ｃｐｍ） 実施例ユ ２つの独立した試験において、モルモットにＭＳＰを皮下投与して免疫処置しく 始めフロイント完全アジュバント内に４０μｇ、続いて３週間後にフロインド不 完全アジュバント内に４０μｇを投与）、または、皮下投与にて偽の免疫処置（ 対照）をした（始めフロイント完全アジュバントだけを、続いて３週間後にフロ インド不完全アジュバントだけを投与）。

膵臓リンパ細胞を取り出し、マイクロテストウェル内で３７℃にて２日間、抗原 がない状態、または、指示濃度のＭＳＰあるいは指示濃度のＭＳＰの臭化シアン 消化物（ＣＮＢｒ　ＭＳＰ）が存在する状態でインキュベートした。リンパ細胞 を　ｓＨ−チミジンとの結合能について調べ刺激係数を計算した。

表Ｆに示されているように、ＭＳＰで免疫処置した動物から採取したリンパ細胞 は、対照動物に比べＭＳＰに対して、また高濃度のＣＮＢｒに対して有意に明確 な反応を示した。

表一旦 試験番号　抗　原　刺激係数（Ｓ、Ｌ、）＊（μｇ／ｍｌ）　免疫処置モルモッ ト　対照モルモット　Ｓ、１．免疫処ＶＡ　ＣＮＢｒ　ＭＳＰ　２０＃　１５． ９　４．１　３．９ＣＮＢｒ　ＭＳＰ　２＃　１．４　１．７　０．８Ｍ５Ｐ　 Ｏ，１９，５６，８１，４ Ｂ　ＣＮＢｒ　ＭＳＰ　２０＃　１２．７　３．０　４．２ＣＮＢｒ　ＭＳＰ　 ２＊＊　１．７　１．５　１．１Ｍ５Ｐ　Ｏ，１１２，９３，６３，６ ＊　Ｓ、１．（刺激係数）＝抗原とインキュベートしたリンパ細胞のＩＩＨ−チ ミジン平均結合（ｃｐｍ）／抗原を伴わずにインキュベートしたリンパ細胞の８ Ｈ−チミジン平均結合（ｃｐｍ） 林最初の量。試験での実際量は取扱い時に損失するため低くなり易い。

実施伝旦 ２つの独立した試験において、モルモットに、始めフロイント完全アジュバント 内に４０μｇのＭＳＰ、続いて３週間後にフロインド不完全アジュバント内に４ ０μｇのＭＳＰを皮下投与して免疫処置し、または、皮下投与にて偽の免疫処置 （対照）をした（始めフロイント完全アジュバントだけを、続いて３週間後にフ ロインド不完全アジュバントだけを投与）。牌臓リンパ細胞を取り出し、抗原が ない状態、または、指示濃度の変異レジュネラ・二二−モフィラ菌フィラデルフ ィア１型菌株、レジュネラ・ニューモフイラ菌トガス１型菌株、またはレジュネ ラ・ニューモフィラ菌シカゴ２型菌株の細胞外タンパク質が存在する状態でイン キュベートした。

表Ｇに示されているように、ＭＳＰセログループ１の免疫処置したモルモットか ら採取したリンパ細胞は、対照のモルモットに比べ、レジュネラ・ニューモフイ ラ菌セログループ１．２、および６の細胞外タンパク質に対して、明確な増殖を 示した。

表一旦 試験　菌株　七ログ　細胞外　刺激係数（Ｓ、Ｌ、）＊番号　ループ　タンパク 質　免疫処置　対照モル　ｓ、ｒ、免疫処置ノの濃度　モルモット　モット　ｓ 、ｒ、対照Ａ　Ｐｈ１ｌｌ　１　２０　１２．８　４．０　３．２（変異）　２ 　１９．２　６．２　３．１Ｔｏｇｕｓｌ　２　２０　１９．３　７．０　２． ８２　１５．８　６．８　２．３ Ｃｈｉｃａｇｏ２　６　２０　２０．２　７．６　２．７２　１１．７　６．４ 　１．８ Ｂ　Ｐｈ１ｌｌ　１　２０　１９．０　５．１　３．７（変異）　２　１７．０ 　６．９　２．５Ｔｏｇｕｓｌ　２　２０　２１．４　７．０　３．１２　１４ ．０　６．９　２．５ Ｃｈｉｃａｇｏ２　６　２０　１２．８　８．２　１．６２　１４．３　６．１ 　２．３ ＊Ｓ、１．＝変異免疫処置を受けたモルモットの平均皮膚反応（■）／対照モル モットの平均皮膚反応（ｍｍ） レジュネラ・ニューモフィラ菌フィラデルフイラ１型菌株から作ったＭＳＰは、 レジュネラ・ニューモフィラ菌トガス１型（セログループ２）、レジュネラ・ニ ューモフイラ菌シカゴ２型（セログループ６）、およびレジュネラ・ニューモフ イラ菌フィラデルフィア１型の変異の見掛は分子量が同一のＭＳＰ様分子と同じ 抗原を共有することは注意すべきである。野生型レジュネラ・ニューモフイラ菌 フィラデルフィア１型（レーンＡ）の総膜組織、変異レジュネラ・ニューモフィ ラ菌フィラデルフィア１型（レーンＢ）、レジュネラ・二二−モフィラ菌トガス １型（セログループ２）（レーンＣ）、レジュネラ・ニューモフィラ菌シカゴ２ 型（セログループ６）（レーンＤ）の硫酸アンモニウム沈澱細胞外タンパク質、 および野生型レジュネラ・ニューモフィラ菌フィラデルフィア１型（セログルー プ１）（レーンＥ）から精製したＭＳＰは、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニ トロセルロース紙上に移した。野生型レジュネラ・ニューモフィラ菌フィラデル フィア１型から精製したＭＳＰで免疫処置したモルモットから得た抗血清の１： ５００希釈液でプロットをインキュベートした。アルカリ性ホスファターゼであ る共役ヤキ抗モルモット免疫グロブリンを使って組織化学的に抗原抗体複合体を 明らかにした。

レジュネラ・ニューモフィラ菌フィラデルフィア１型ＭＳＰ（セログループ１） に対する抗体は、野生型（レーンＥ）および変異体（レーンＢ）のレジュネラ・ ニューモフイラ菌フィラデルフィア１型のＭＳＰを認識しただけでなく、レジュ ネラ・ニューモフイラ菌トガス１型（セログループ２）（レーンＣ）およびレジ ュネラ・ニューモフイラ菌シカゴ２型（セログループ６）（レーンＤ）のＭＳＰ 様分子も認識した。しかし、その抗体は、野生型レジュネラ・ニューモフィラ菌 フィラデルフィア１型（レーンＡ）の膜組織のＭＳＰをいずれも検出しなかった 。

ＭＳＰは、レジュネラ・ニューモフィラ菌のその他のセログループおよび種の攻 撃に対し交差防御免疫を提供することができるため、専業者であれば、レジュネ ラ・二二−モフィラ菌に対して示されたワクチンに関して、レジュネラ層の他の 種およびセロタイプの微生物を使って本発明を実施することができるであろうこ とは自明のことであろう。従って、上述の実施例は説明の目的のために提供して いるものであって、本発明の範囲および内容を限定するものではなく、また本発 明をレジュネラ・ニューモフィラ菌単体に対するＭＳＰ１ワクチン、またはレジ ュネラ・ニューモフィラ菌の特定の種またはセログループに限定するものではな い。

専業者は本発明の利点をさらに評価するであろう。すなわち、例えばＭＳＰや他 の分泌性生成物あるいは細胞外生成物は、細菌全体ではなく、単−型の分子であ って、従って、細胞内生物に対する既知のワクチンとは違って、本発明のワクチ ンは毒性がないものと思われる。さらに、このような細胞外生成物は簡単に取り 出し、精製することができ、組換えＤＮＡ技術および専業者に知られているタン パク質分子のその他の製造方法により合成して製造することができる。

モルモットを使った試験では、ＭＳＰは１０μｇという低免疫処置量で効果的な 免疫反応を引き出すことがわかった。キログラム単位ベースに換算して、ＭＳＰ をレジュネラ・ニューモフィラ菌に対するワクチンとして代表的な人間に投与す るとした場合、７０キログラム体重の患者ではおよそ３ミリグラムであろう。

専業者は、本発明の精神または本質的な特性から外れることなく、他の特殊な形 態で本発明を実施することができることがわかるであろう。上述した本発明の説 明は、本発明の好適実施例だけを開示したいるという点においては、それは、他 のバリエーションも本発明の範囲に入るものとして理解されなければならない。

このように、限定するものではなく、例証として、他の細胞内寄生虫の細Ｍ生成 物を使って本発明を実施することができる。従って、本発明はここで詳細に説明 した特定の実施例に限るものではない。本発明の範囲と内容を記した添付の請求 範囲を参照すべきである。

手続補正書防式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０３４８６ 平成１年特許願第５０９５４６号 ２、発明の名称 在郷軍人病ワクチン及びその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ザ　リージェンッ　オブ　ザ　ユニバーシティオブ　カリフォルニア ４、代理人 ５、補正命令の日付　平成３年１０月２１日（発送日　平成３年１１月５日） （２）委任状及びその訳文 （３）明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （１）（２）別紙のとおり （３）明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告　 。ＲＲεこ丁ｅｓ　Ｉ：ＳＡ／１１５１ｍ−′＠″昇＾−馴−ｐｃ〒／ＵＳ８９ １０３４８６“□′″　−’　Ｍ”／ＩＴ！ｌ；ＦＩＱ／ｌ’ｌ１４Ａｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的とする細胞内病原体を選択する段階と、少なくとも１種の免疫獲得哺乳 類宿主において、強力なリンパ細胞増殖反応を刺激する前記病原体の少なくとも １つの細胞外生成物を同定する段階と、前記細胞外生成物の有効量で二次哺乳類 宿主に免疫を与える段階とを有することを特徴とする、特異な細胞内病原体に対 する哺乳類ワクチンの製造方法。 ２．標的とする細胞内病原体が、レジュネラ・ニューモフィラ菌である請求項１ 記載の製造方法。 ３．前記細胞外生成物が、レジュネラ・ニューモフィラ菌主要分泌性タンパク質 である請求項２記載の製造方法。 ４．請求項１に記載の方法により製造されるワクチン。 ５．標的病原体がレジュネラ・ニューモフィラ菌である請求項１に記載の方法に より製造されるワクチン。 ６．レジュネラ・ニューモフィラ菌主要分泌性タンパク質からなるワクチン薬で あって、哺乳類においてレジュネラ・ニューモフィラ菌に対し効果的な免疫反応 の促進に使用されるワクチン薬。 ７．前記主要分泌性タンパク質が、変性されている請求項６記載のワクチン薬。 ８．前記主要分泌性タンハク質が、小さなサブユニットに開裂される請求項６記 載のワクチン薬。 ９．前記主要分泌性タンパク質が、レジュネラ・ニューモフィラ菌の培養上澄み 液から得られる請求項６記載のワクチン薬。 １０．前記主要分泌性タンパク質が、合成して製造される請求項６記載のワクチ ン薬。 １１．アジュバント化合物からなる請求項６記載のワクチン薬１２．レジュネラ ・ニューモフィラ菌主要分泌性タンパク質で哺乳類宿主を免疫処置する段階を有 することを特徴とする、レジュネラ・ニューモフィラ菌の二次感染に対する哺乳 類宿主の免疫処置方法。 １３．主要分泌性タンパク質が、変性されている請求項１２記載の免疫処置方法 。 １４．主要分泌性タンパク質が、小さなサブユニットに開裂される請求項１２記 載の免疫処置方法。 １５．主要分泌性タンパク質が、レジュネラ・ニューモフィラ菌の培養上澄み液 から得られる請求項１２記載の免疫処置方法。 １６．主要分泌性タンパク質が、合成して製造される請求項１２記載の免疫処置 方法。