DE68928432T2

DE68928432T2 - Legionellosis-impfstoffe und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE68928432T2
Application number: DE68928432T
Authority: DE
Inventors: Marcus Horwitz
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1989-08-15
Publication date: 1998-03-05
Anticipated expiration: 2009-08-16
Also published as: EP0432203A4; DE68929318T2; US5108745B1; DE68928432D1; EP0753310B1; EP0432203B1; ATE159857T1; ATE203677T1; CA1337333C; JP2841094B2; EP0753310A1; JPH04501107A; US5108745A; DE68929318D1; WO1990001944A1; EP0432203A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem breiten Aspekt Impfstoffe gegen intrazelluläre Parasiten. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoffe und Verfahren zu ihrer Verwendung bei der Erzeugung einer effektiven Immunreaktion in Säugerwirtstieren, die anschließend einer Infektion durch intrazelluläre Parasiten ausgesetzt werden, wie etwa Legionella pneumophila, wobei die extrazellulären Produkte solcher Pathogene als Impfstoffe verwendet werden, statt der Verwendung der Oberflächenkomponenten solcher maskierten bakteriellen Pathogene.

Hintergrund der Erfindung

Die meisten Bakterien sind harmlos. Tatsächlich sind viele für Menschen und andere Säugetiere nützlich. Bestimmte Bakterien sind jedoch in der Lage, in menschlichen und Säugergeweben zu wachsen und sich zu verbreiten. Eine Klasse solcher virulenten Organismen, die von besonderem Interesse ist, ist die der intrazellulären Pathogene. Diese Kategorie von virulenten Pathogenen vervielfältigt sich innerhalb der Zellen des infizierten Wirtsorganismus statt extrazellulär
Die breite Klassifikation von intrazellulären Pathogenen schließt Organismen ein, die die Hauptursachen von Erkrankungshäufigkeit und Sterblichkeit weltweit sind. Zum Beispiel sind intrazelluläre Pathogene verantwortlich für die geschätzten 10.000.000 neuen Fälle von Tuberkulose pro Jahr in der Welt (ungefähr 25.000 pro Jahr in den Vereinigten Staaten), die ungefähr 3.000.000 Tuberkulose-Toten pro Jahr und die geschätzten 12.000.000 Fälle von Lepra. Sie sind auch verantwortlich für die geschätzten 10.000.000 Fälle von Südamerikanischer Trypanosomiase (Chagas-Krankheit). Zusätzlich bewirken intrazelluläre Pathogene auch andere wichtige Erkrankungen, einschließlich Haut- und Viszeralleishmaniase, Listeriose, Toxoplasmose, Histoplasmose, Trachom, Psittacose, Q-Fieber und Legionellose, einschließlich Legionärskrankheit. Wenige Impfstoffe sind gegen solche durch intrazelluläre Pathogene hervorgerufenen Erkrankungen verfügbar. Der einzige in breitem Umfang verwendete Impfstoff ist BCG-Impfstoff gegen Tuberkulose. BCG-Impfstoff ist ein Lebend-Bakterien-Impfstoff mit fraglicher Wirksamkeit, der primär in Europa verwendet wird.
Legionella pneumophila, der Krankheitserreger der Legionärskrankheit, ist ein besonders unangenehmes intrazelluläres Pathogen, weil es sich intrazellulär in Monozyten und Makrophagen vervielfältigt, gerade in den Zellen des Immunsystems, die dazu gedacht sind, dagegen zu verteidigen. L. oneumophila ist somit in einer Klasse von intrazellulären Pathogenen, die tatsächlich die normalen Immunabwehrmechanismen umgangen haben, indem sie die Zellen des Immunsystems nehmen, die dazu gedacht sind, Bakterien abzutöten, um sie als Wirtszellen zu verwenden. Demgemäß ist L. pneumophila besonders gut geeignet, um die Prinzipien der vorliegenden Erfindung zu zeigen.
Die Fachleute werden anerkennen, daß die folgende beispielhafte Diskussion von L. pneumophila in keiner Weise dazu gedacht ist, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auf die Behandlung von Legionellose oder Legionärskrankheit allein zu beschränken, und daß die Behandlung anderer intrazellulärer Pathogene innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung liegt.
Die klinische Erforschung der Legionärskrankheit begann im Juli 1976, als 221 Leute, hauptsächlich amerikanische Legionäre, in Philadelphia von dieser Krankheit befallen wurden. Letztendlich verloren 34 Menschen ihr Leben. Neu erkannt wurde anschließend festgestellt, daß die Legionärskrankheit nicht neu war und daß sie weltweit im epidemischen und endemischen Formen auftritt. Man glaubt, daß sie eine Hauptursache der Pneumonie in den Vereinigten Staaten und verantwortlich für einen beträchtlichen Anteil der Nosocomialpneumonie ist. Obgleich sie alle Altersgruppen befällt, befällt sie insbesondere diejenigen, die über 30 Jahre alt sind, und befällt Männer häufiger als Frauen. Die Krankheit zeigt auch eine Predilektion für Individuen, die rauchen oder übermäßig Alkohol konsumieren, Reisende, Bauarbeiter, Individuen mit beeinträchtigtem Immunsystem und Transplantationspatienten. Die Krankheitsfall-Sterblichkeitsrate liegt im Bereich zwischen ungefähr 15 % - 20 %
L. pneumophila ist ein aerobes gram-negatives Bakterium mit anspruchsvollen Wachstumsanforderungen. Man glaubt, daß der Organismus auf Menschen und andere Säugerwirte von kontaminierten Quellen über den Luftweg übertragen wird. Überall in der Umwelt vorhanden, ist L. pneumophila aus Wasser, Boden, Schlamm und den Kühltürmen von Klimaanlagen isoliert worden. Es ist auch in Zusammenhang gebracht worden mit Whirlpools und Duschköpfen, die Aerosole erzeugen können, die diese Bakterien tragen.
Menschliche Patienten, die sich mit diesem fakultativen intrazellulären bakteriellen Pathogen infiziert haben, entwickeln sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunreaktionen. Humorale Immunreaktionen scheinen in der Wirtabwehr gegen L. pneumophila nur eine sekundäre Rolle zu spielen, weil der Antikörper das Abtöten des bakteriellen Pathogens durch Komplement nicht fördert. Überdies fördert er nur mäßiges Abtöten durch Phagozyten und hemmt die intrazelluläre Vervielfältigung von L.pneumophila bei Monozyten nicht. Im Gegensatz dazu scheinen zellvermittelte Immunreaktionen eine primäre Rolle in Wirtabwehrmechanismen gegen L. pneumophila zu spielen, weil aktivierte Monozyten und alveolare Makrophagen eine intrazelluläre Vervielfältigung hemmen.
Ein hervorragendes Säugermodell für das Studium der Legionärskrankheit ist das Meerschweinchen, das mit Menschen eine Anfälligkeit gegen Lungeninfektionen mit L. pneumophila teilt. Nach einem Inkubationszeitraum von mehreren Tagen entwickeln Meerschweinchen, die Aerosolen ausgesetzt worden sind, die L. pneumophila enthalten, eine Lungenkrankheit, die gekennzeichnet ist durch Fieber, Gewichtsverlust und erschwerte Atmung, die manchmal zum Tode führt. Dieses Infektionssyndrom zeigt enge Parallelen mit dem klinischen und pathologischen Syndrom der Legionärskrankheit beim Menschen. Wie bei menschlichen Patienten entwickeln Meerschweinchen, wenn sie einer subletalen Dosis von L. pneumophila ausgesetzt werden, auch humorale und zellvermittelte Immunreaktionen. Solche Meerschweinchen entwickeln auch Schutzimmunität gegen anschließende Immuntests mit letalen Dosen von L. pneumophila. L. pneumophila ist hochvirulent für Meerschweinchen und ist für dieses Tier über sowohl den intraperitonealen als auch den Aerosol-Weg der Inokulation letal.
Demgemäß wird die vorliegende Erfindung, nur zu Zwecken der Erläuterung und nicht zu Zwecken der Beschränkung, im beispielhaften Kontext von Meerschweinchen als dem Säugerwirt diskutiert werden. Die Fachleute werden anerkennen, daß die vorliegende Erfindung mit anderen Säugerwirten praktiziert werden kann, einschließlich Menschen.
Es sollte angemerkt werden, daß L. pneumophila und andere Legionella-Organismen die Krankheitserreger für eine Vielzahl von Syndromen sind, die zusammenfassend als vilegionellosen bezeichnet werden. Zusätzlich zur Legionärskrankheit schließt Legionellose Pontiac-Fieber, Endocarditis und neurologische Symptome ein. Gegenwärtig existiert kein Impfstoff gegen die durch Legionella hervorgerufenen Erkrankungen. Überdies existieren, wie oben angemerkt, im allgemeinen nur wenige Impfstoffe gegen Erkrankungen, die durch intrazelluläre Pathogene hervorgerufen werden.
Was die Suche nach effektiven Impfstoffen gegen intrazelluläre Pathogene, einschließlich L. pneumophila, erschwert, ist die Tatsache, daß die virulenten Pathogene normalerweise in Zellen des Wirtsorganismus maskiert und somit vom Immunsystem des Wirts nicht ohne weiteres erkennbar sind. Uberdies induzieren, bei einigen intrazellulären Pathogenen, einschließlich L. pneumophila, Antikörper, die gegen bakterielle Oberflächenkomponenten erzeugt werden, tatsächlich die Aufnahme der Pathogene in das intrazelluläre Milieu, das sie zur Vervielfältigung benotigen. Demgemäß können herkömmliche Impfstoffe, die traditionellerweise gegen solche bakteriellen Zelloberflächenantigene gerichtet sind, tatsächlich die Proliferation dieser infektiösen Organismen stimulieren, statt die Infektion aufzulösen. Somit können herkömmliche Impfstoffe, die gegen bakterielle Oberflächenkomponenten gerichtet sind, im Falle intrazellulärer Pathogene kontraindiziert sein. Solche herkömmlichen Impfstoffe könnten ein besonderes Problem darstellen für Personen mit unterdrückter zellvermittelter Immunität, derjenigen Form von Immunität, die primär die Verteidigung gegen die Infektion mit intrazellulären Pathogenen übernimmt, weil solche Patienten eine verminderte Fähigkeit hätten, die schneller proliferierende Infektion zu bekämpfen. Solche Personen schließen Patienten mit beeinträchtigtem oder unterdrücktem Immunsystem ein, wie etwa Organtransplantatempfänger oder mit HIV infizierte Individuen, die alle besonders anfällig für Infektionen mit intrazellulären Pathogenen sind.
Olinical Research, Volume 35, Number 3, 1987, Seite 469(a), offenbart, daß Lymphozyten aus infizierten Meerschweinchen proliferieren, wenn sie vom MSP von Legionella pneumophila stimuliert werden.
Demgemäß ist es eine hauptsächliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe und Verfahren für ihre Verwendung beim Bewirken einer effektiven Immunreaktion gegen intrazelluläre Pathogene wie etwa L. pneumophila zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe zur Verfügung zu stellen, die verringerte Toxizität relativ zu traditionellen Vollbakterien-Impfstoffen zeigen.
Es ist eine weitere zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe und Verfahren für ihre Herstellung zur Verfügung zu stellen, die nicht Phagozytose oder Zellaufnahme von intrazellulären Pathogenen induzieren.
Es ist noch eine weitere zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe und Verfahren für ihre Verwendung zur Verfügung zu stellen, die einen geimpften Säugerwirt in die Lage versetzen werden, Pathogene zu erkennen, die in Wirtszellen maskiert sind, wodurch ermöglicht wird, daß das Immunsystem des Wirts das infizierende Pathogen abtötet oder seine Vervielfältigung hemmt.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese und andere Aufgaben werden erreicht durch die Impfstoffe und das Verfahren der vorliegenden Erfindung, die eine wirksame Immunreaktion in Säugerwirten gegen anschließende Infektion durch intrazelluläre Pathogene erzeugen, einschließlich verschiedener Spezies und Serogruppen von L. pneumophila.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Säuger-Impfstoffes gegen spezifische intrazelluläre Pathogene zur Verfügung gestellt, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt:

Selektionieren eines intrazellulären Ziel-Pathogens;

Identifizieren wenigstens eines extrazellulären Produktes besagten Ziel-Pathogens, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes Ziel-Pathogen immun ist; und Immunisieren eines späteren Wirtes mit einer wirksamen Menge besagten wenigstens einen extrazellulären Produktes.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff zur Verwendung bei der Förderung einer wirksamen Immunreaktion in Säugern auf ein intrazelluläres Pathogen zur Verfügung gestellt, wobei der Impfstoff wenigstens ein extrazelluläres Produkt besagten Ziel-Pathogens umfaßt, das stark zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes intrazelluläres Pathogen immun ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem noch ein Impfstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung einer wirksamen Immunreaktion in Säugern auf ein intrazelluläres Pathogen zur Verfügung gestellt, wobei der Impfstoff wenigstens ein extrazelluläres Produkt besagten Ziel-Pathogens umfaßt, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes extrazelluläres Pathogen immun ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem noch ein Säuger-Impfstoff gegen ein intrazelluläres Pathogen zur Verfügung gestellt, wobei der Impfstoff wenigstens ein extrazelluläres Produkt besagten Ziel-Pathogens, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes intrazelluläres Pathogen immun ist, und ein Adjuvans umfaßt.
Kurz gesagt nutzt das Immunisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung extrazelluläre Produkte von solchen intrazellulären Pathogenen als Immunisierungsstoffe statt Komponenten der Pathogene selbst. Nach erfolgter Immunisierung werden diese extrazellulären bakteriellen Produkte durch das Immunsystem des Wirtes erkannt, der eine wirksame Immunreaktion gegen spätere Infektion durch solche Pathogene aufbauen kann.
Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung werden wirksame Säuger-Impfstoffe gegen spezifische intrazelluläre Pathogene dadurch hergestellt, daß zunächst ein intrazelluläres Ziel- Pathogen selektioniert wird, ein oder mehrere extrazelluläre Produkte des Pathogens, die starke Lymphozyten-proliferative Reaktionen in Säugerwirten, die gegen das Ziel-Pathogen immun sind, stimulieren, identifiziert und anschließend Wirte mit dem extrazellulären Produkt immunisiert werden.
Eine beispielhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt das Hauptsekretionsprotein (MSP) von L. pneumophila. MSP ist das Hauptprotein, das in Kulturüberstände während des Wachstums von L. pneumophila abgegeben wird, und induziert eine starke zellvermittelte Immunreaktion in immunisierten Säugern. MSP wird leicht erhalten im Anschluß an das Wachstum von Legionella pneumophila in einer Laborbrühe.
Genauer gesagt, wird, in einer beispielhaften Ausführungsform, Legionella pneumophila, Philadelphia-1-Stamm, in Hefeextraktbrühe gezogen (mit entferntem Albumin, um die MSP-Isolierung zu erleichtern), und die Brühe wird zentrifugiert, um die Bakterien herauszupelletieren. Die Überstandslösung wird zurückbehalten und filtriert und das MSP wird aus dem Überstand durch Ammoniumsulfat-Fällung ausgefällt und anschließend dialysiert. Weitere Reinigung des ausgefällten MSPs wird erreicht durch Molekularsiebchromatographie und anschließende lonaus -tauschchromatographie, die praktisch 100 % reines MSP erzeugen.
Im Anschluß an die Reinigung wird das MSP entweder allein oder mit einem Adjuvans, wie etwa Freundschem Adjuvans oder unvollständigem Freundschen Adjuvans, Säuger-Wirtstieren, vorzugsweise durch Injektion, verabreicht. Zum Beispiel kann Immunisierung mit gereinigtem MSP in vollständigem Freundschen Adjuvans durch subkutane Injektion, gefolgt von einer zweiten Injektion in unvollständigem Freundschen Adjuvans ungefähr drei Wochen später, eingesetzt werden. Es sei jedoch daran gedacht, daß es innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt, eine einzige Verabreichung des extrazellulären Produktes einzusetzen, wenn solche Verbindungen eine wirksame Immunreaktion gegen ein Ziel-Pathogen mit einer einzigen Dosis induzieren werden.
In einem beispielhaften Experiment wurden 5 Meerschweinchen immunisiert, wie oben diskutiert, und 5 Kontroll-Meerschweinchen wurden mit vollständigem und unvollständigem Freundschen Adjuvans, dem MSP fehlte, scheinimmunisiert. Drei Wochen später wurden sowohl die Test- als auch die Kontrollmeerschweinchen einer letalen Dosis von Legionella pneumophila ausgesetzt. Im ersten Experiment überlebten 80 % der mit MSP immunisierten Tiere, wohingegen 0 % der Kontrolltiere überlebten. In einem anschließenden Folgeexperiment überlebten 83 % der mit MSP immunisierten Tiere, während 0 % der Kontrolltiere überlebten.
Im ersten Experiment erhielten die Tiere 10 Mikrogramm MSP in der ersten Injektion und 40 Mikrogramm MSP in der zweiten Injektion. Im Folgeexperiment erhielten die Tiere 40 Mikrogramm MSP in sowohl der ersten als auch der zweiten Injektion.
Zur Bestätigung der Breite der vorliegenden Erfindung haben anschließende Studien bewiesen, daß MSP, das aus dem Philadelphia-1-Stamm von Legionella pneumophila extrahiert worden ist, Kreuzreaktivität zwischen anderen Serogruppen und Spezies von Legionella besitzt. Zusätzlich, wenn fragmentiert durch Cyanbromid-Spaltung, setzten MSP-Untereinheiten die Induktion der Schutzimmunität fort. In ähnlicher Weise setzt auch MSP, das durch Hitze denaturiert ist, die Induktion der Schutzimmunität fort.
Weil man glaubt, daß MSP und andere sekretorische Produkte intrazellulärer Pathogene von den infizierten Wirtszellen extrazellulär freigesetzt werden, ermöglicht die vorliegende Erfindung, daß das Immunsystem eines geimpften Wirtes Pathogene erkennt, die in den Wirtszellen maskiert sind. Auf diese Weise ist das Immunsystem des geimpften Wirtes in der Lage, eine wirksame Immunreaktion zu aktivieren, um das Pathogen in ihm abzutöten oder seine Vervielfältigung zu hemmen. Ebenso wichtig ist es, daß Antikörper, die gegen die extrazellulären sekretorischen Produkte gerichtet sind, nicht die Aufnahme des intrazellulären Pathogens induzieren und daher nicht die Infektion erleichtern. Dies ist besonders wichtig für Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem und Organtransplantatpatienten.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten aus der Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung von bevorzugten beispielhaften Ausführungsformen derselben deutlich werden.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung stellt Impfstoffe und Verfahren zu ihrer Verwendung bei der Entwicklung wirksamer Immunreaktionen gegen intrazelluläre Pathogene zur Verfügung. Als eine bevorzugte beispielhafte Ausführungsform wurde Legionella pneumo- Dhila als das Ziel-Pathogen verwendet. Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung wurden MSP-Moleküle, die starke Lymphozyten-proliferative Reaktionen und verzögerte Hauthypersensitivität bei immunen (subletal infizierten) Meerschweinchen stimulierten, identifiziert, und anschließend wurde festgestellt, daß die Immunisierung von Meerschweinchen mit solchen Molekülen spezifische zellvermittelte (und humorale) Immunreaktionen und Schutzimmunität induzierte Die Fachleute werden anerkennen, daß die vorstehende Strategie bei jedem intrazellulären Pathogen eingesetzt werden kann, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu praktizieren, und demgemäß ist die vorliegende Erfindung nicht spezifisch begrenzt auf Impfstoffe und Immunisierungsverfahren, die gegen L. pneumophila allein gerichtet sind.
Zum Beispiel wurde, unter Befolgung dieser Strategie, MSP, das Hauptsekretionsprotein von L. pneumophila, als ein Molekül identifiziert, gegen das immune Meerschweinchen eine sehr starke zellvermittelte Immunreaktion entwickelten. Ein dreistufiges Verfahren zur Reinigung großer Mengen von MSP wurde entwickelt. Es wurde festgestellt, daß Lymphozyten von immunen Tieren in Reaktion auf geringe Konzentrationen MSP stark proliferierten. In ähnlicher Weise entwickelten immune Tiere auch eine starke verzögerte Hautsensivität gegen MSP. Meerschweinchen, die subkutan mit MSP immunisiert worden waren, wurden auf Immunreaktionen untersucht, und es wurde festgestellt, daß die mit MSP immunisierten Meerschweinchen starke spezifische zellvermittelte Immunreaktionen (Lymphozytenproliferation und verzögerte Hautsensivität) gegen das MSP entwickelten und, am wichtigsten, wirksame Immunität gegen letale Aerosol-Exposition mit L. pneumophila entwickelten.
In unabhängigen Experimenten lieferte die subkutane Injektion bei Meerschweinchen mit MSP 80 % - 100 % Schutz gegen letale Aerosol-Exposition. Insgesamt überlebten 88 % von 16 mit MSP immunisierten Meerschweinchen eine solche Exposition, verglichen mit 0 % von 15 Kontrolltieren. Im Gegensatz zu MSP stimulierten die zwei Hauptkomponenten der Außenzellmembran von Legionella pneumophila, das Lipopolysaccharide (dialysiert) und das Hauptaußenmembranprotein, keine Lymphozytenproliferation in immunisierten Meerschweinchen.
Ein weiteres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird den Fachleuten durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele geliefert werden.

Beispiel 1

3-Stufen-Reinigung von MSP aus L. pneumophila

L. pneumophila wird zunächst auf Charcoal Yeast Extract Agar übertragen. Anschließend werden die Kolonien aus dem Agar in 10 ml Yeast Extract Broth (Äquivalent zu Albumin Yeast Extract Broth ohne Albumin) suspendiert. Zwei sterile 2-Liter-Kolben mit Schraubkappe werden vorbereitet, jeder mit 500 ml Yeast Extract Broth. Jeder Kolben wird vorgewärmt und mit 5 ml der L. pneumophila-Suspension inokuliert und bei 370 bei 120 UPM über Nacht (ungefähr 20 Stunden) inkubiert. Die Reinheit der Kultur wird durch Lichtmikroskopie, bei einem Scanning von wenigstens 10 Feldern bei 400x, und durch Inokulation von Sheep Blood Agar und Charcoal Yeast Extract Agar überprüft. (Die meisten Kontaminanten werden auf beiden Agars schnell wachsen (1 Tag); L. pneumophila wird nur auf Charcoal Yeast Extract Agar langsam wachsen (mehrere Tage)). Aliquote Teile der Brühe werden in Kunststoff-Zentrifugen-Flaschen überführt und die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 4ºC pelletiert. (In einer Sorvall-Zentrifuge mit GAS-Rotor und 250-ml- Flaschen, Zentrifugation bei 12.000 UPM für 10 Minuten). Die überstehende Flüssigkeit (die MSP enthält) wird dekantiert und durch einen 0,45 Mikron-Filter futriert, gefolgt von einem 0,2 Mikron-Filter, um jegliche restliche bakterielle Teilchen zu entfernen.
Ammoniumsulfat wird zur filtierten überstehenden Flüssigkeit bis 45 % Sättigung bei 400 unter vorsichtigem Rühren für 1 Stunde zugegeben, um Nicht-MSP-Verbindungen auszufällen. Die Lösung wird in Kunststoff-Flaschen hinein dekantiert und der Niederschlag wird durch Zentrifugation bei 400 pelletiert. (In einer RC5C-Sorvall-Zentrifuge mit GAS-Rotor und sechs 250-ml- Flaschen, zentrifugation bei 12.000 UPM für 35 Minuten.) Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und die 45 % Ammoniumsulfat-Niederschlag werden verworfen. Ammoniumsulfat wird zur überstehenden Flüssigkeit bis 95 % Sättigung zugegeben und die Flüssigkeit wird bei 4ºC unter vorsichtigem Rühren über Nacht inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wird die Lösung in Kunststoff-Flaschen hinein dekantiert und der Niederschlag wird durch Zentrifugation wie oben pelletiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und MSP-reicher Niederschlag gesammelt und zweimal mit kleinen Volumina BEN (0,025 M Bis Tris, 0,01 M EDTA und 0,15 M NaCl, pH 5,9) gewaschen und mit einer Spectapor-Dialysemembran 5.000 - 6.000 MG gegen 1 Liter BEN bei 4ºC über Nacht dialysiert.
Die dialysierte MSP-reiche Flüssigkeit wird auf eine Säule aus Sephacryl s-200 mit den Abmessungen 50 cm x 2,5 cm geladen. (Ausrüstung: LKB Multirac Fraction Oollector, Beckman Model 153, Analytical UV Detector, Rabbit Peristaltic Pump (Ramm), Beckman Analytical Optical Unit, Linear Chart Recorder). Die Säule wird bei 8 ml/Stunde über Nacht betrieben und 2-ml-Fraktionen werden gesammelt und bei 4º bis zum Abschluß des nächsten Schrittes aufbewahrt. 25-µl-Proben jeder (oder jeder zweiten) Fraktion werden mit Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht. (25 µl Probe, vermischt mit 25 µl Probenpuffer und geladen auf 12,5 % SDS- PAGE-Gel. Molekulargewichtsstandards laufen gleichzeitig mit). Fraktionen, die die meisten Mengen an MSP und die wenigste Menge an Nicht-MSP-Protein enthalten, werden identifiziert und gepoolt. Gepoolte Fraktionen werden mit einer Amicon Filter Unit mit einem 30.000-Molekulargewicht-Ausschlußfilter konzentriert, bis das Volumen 2 - 4 ml beträgt.
Die konzentrierten Fraktionen werden auf eine Säule aus DEAE Sepharose CL-6B (2,5 cm x 13 cm) geladen. Ein Gradient von 0,15 M NaCl bis 0,65 M NaC1 in 0,025 M Bis Tris, 0,01 M EDTA, pH 5,9, wird unter Verwendung eines Gradientenmachers mit 2,5 Bettvolumenteilen in jeder Kammer angewendet. Die Säule wird mit ungefähr 8 ml/Stunde betrieben und 2-ml-Fraktionen werden gesammelt und bis zum Abschluß des nächsten Schrittes bei 400 aufbewahrt. 25 µl jeder (oder jeder zweiten) Fraktion werden durch SDS-PAGE wie oben untersucht. Fraktionen, die MSP enthalten, werden identifiziert und gepoolt. Das gepoolte Volumen wird auf Eis mit einer Amicon Filter Unit mit einem 30.000-Molekulargewicht-Ausschlußfilter filterkonzentriert, bis das Volumen ungefähr 1 ml beträgt (pro ursprünglichem Liter Volumen). Das Konzentrat wird anschließend in einer Spectapor-Dialysemembran mit 5.000 - 6.000 MG gegen 3 Wechsel von 1 Liter BEN dialysiert.
L. pneumophila wurde in Brühenkultur gezüchtet und die Bakterien von der Brühe durch Zentrifugation abgetrennt. Die Proteine im Überstand wurden mit Ammoniumsulfat ausgefällt und SDS- PAGE unterzogen, wie oben diskutiert. Spur B zeigt das Proteinprofil dieser Zubereitung (Schritt 1). Die Proteine, die nach Ammoniumsulfat-Ausfällung erhalten werden, wurden auf einer Molekularsiebsäule aufgebracht, Fraktionen, die MSP enthielten, wurden durch SDS-PAGE identifiziert und die Proteine in diesen Fraktionen wurden mit Ethanol ausgefällt und SDS- PAGE unterzogen. Spur 0 zeigt das Proteinprofil dieser Zubereitung (Schritt 2). Die Proteine, die nach Molekularsiebchromatographie erhalten wurden, wurden auf eine lonenaustauschsäule aufgebracht, eluiert und mit SDS-PAGE untersucht. Spur D zeigt das Proteinprofil dieser Zubereitung (Schritt 3). Spur A enthält Molekulargewichtsstandards (Rinderalbumin, 66.000; Ovalbumin, 45.000; Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasen 36.000; Kohlensäureanhydrase, 29.000; Trypsinogen, 24.000; Trypsininhibitor 20.100).

Beispiel 2

In vier unabhängigen Experimenten wurden Meerschweinchen subkutan zweimal mit 40 µg MSP im Abstand von 3 Wochen immunisiert. Die erste Dosis wurde in vollständigem Freundschen Adjuvans verabreicht und die zweite Dosis in unvollständigem Freundschen Adjuvans. Kontrollmeerschweinchen wurden scheinimmunisiert mit Puffer in vollständigem oder unvollständigem Freundschen Adjuvans. Drei Wochen später wurden alle Tiere einer letalen Aerosoldosis von L. pneumophila ausgesetzt und die Überlebensrate wurde quantifiziert.
Wie dargestellt in Tabelle A wurden immunisierte Meerschweinchen gegen letale Aerosol-Exposition stark geschützt. TABELLE A
*Fisher's Extract Test, zweischweifig

Beispiel 3

In zwei unabhängigen Experimenten wurden Meerschweinchen subkutan mit MSP (40 µg in vollständigem Freundschen Adjuvans, drei Wochen später gefolgt von unvollständigem Freundschen Adjuvans) immunisiert oder scheinimmunisiert (ausschließlich vollständiges Freundsches Adjuvans, drei Wochen später gefolgt von ausschließlich unvollständigem Freundschen Adjuvans). Alle Tiere wurden auf der Haut getestet mit einer intradermalen Injektion der angegebenen Konzentration von MSP in einem Gesamtvolumen von 100 µl und das Ausmaß von Hautröte und Induration 24 h später gemessen.
Wie dargestellt in Tabelle B, zeigten mit MSP immunisierte Tiere ausgeprägte Hautröte und Induration als Reaktion auf intradermales MSP im Vergleich zu Kontrolltieren, die minimale Reaktionen hatten. TABELLE B *S.I. = Mittlere Hautreaktivität (mm) mutanter immunisierter Meerschweinchen/ mittlere Hautreaktivität (mm) von Kontrollmeerschweinchen

Beispiel 4

In vier unabhängigen Experimenten wurden Meerschweinchen mit MSP immunisiert oder scheinimmunisiert (Kontrollen) wie in der vorstehenden Tabelle. Milzlymphozyten wurden gewonnen und (10&sup7;/ml) in Mikrotest-Näpfen bei 37ºC für 2 Tage ohne Antigen, mit MSP in der angegebenen Konzentration, mit mit Formalin abgetöteten L. pneumophila (FKLP) (10&sup8;/ml) oder mit L. pneumo phila-Membranen (10&sup8;/ml) inkubiert. Die Lymphozyten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht, ³H-Thymidin einzubauen, und Stimulationsindizes berechnet.
Wie dargestellt in Tabelle C, zeigen Lymphozyten von mit MSP immunisierten Tieren ausgeprägte Reaktionen auf MSP im Vergleich zu Lymphozyten von Kontrolltieren. Lymphozyten von sowohl mit MSP immunisierten Tieren als auch Kontrolltieren reagierten schwach auf mit Formalin abgetötete L. pneumophila (FKLP) und L. pneumophila-Membranen. TABELLE C Stimulationsindizes (S.I.)*

Beispiel 5

In zwei unabhängigen Experimenten wurden Meerschweinchen subkutan mit MSP (40 µg in vollständigem Freundschen Adjuvans) immunisiert oder subkutan mit ausschließlich Freundschem Adjuvans scheinimmunisiert (Kontrollen). Drei Wochen später wurden Milzlymphozyten gewonnen und (10&sup7;/ml) in Mikrotest-Näpfen bei 37ºC für zwei Tage ohne Antigen, mit MSP in der angegebenen Konzentration oder mit erhitztem MSP (60ºC x 1 Std.) bei der angegebenen Konzentration inkubiert. Die Lymphozyten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht, ³H-Thymidin einzubauen, und Stimulationsindizes wurden berechnet.
Wie dargestellt in Tabelle D, zeigten mit MSP immunisierte Meerschweinchen ausgeprägte Lymphozytenproliferationsreaktionen auf sowohl MSP als auch erhitztes (proteolytisch inaktives) MSP im Vergleich zu Kontrollmeerschweinchen. TABELLE D Stimulationsindizes (S.I.)*
*Stimulationsindex = (mittlerer ³H-Thymidin-Einbau (cpm) von Lymphozyten, die mit Antigen inkubiert sind)/(mittlerer ³H-Thymidin-Einbau (CPM) von Lymphozyten, die ohne Antigen inkubiert sind).

Beispiel 6

In einem Experiment wurde ein Meerschweinchen mit erhitztem MSP (60ºC für 1 Stunde) subkutan immunisiert (40 ijg erhitztes MSP in vollständigem Freundschen Adjuvans, 3 Wochen später gefolgt von 40 µg erhitztem MSP in unvollständigem Freundschen Adjuvans) und ein weiteres Meerschweinchen wurde subkutan scheinimmunisiert (ausschließlich Freundsches Adjuvans, 3 Wochen später gefolgt von ausschließlich unvollständigem Freundschen Adjuvans) (Kontrolle). Drei Wochen später wurden Milzlymphozyten gewonnen und (10&sup7;/ml) in Mikrotest-Näpfen bei 37ºC für zwei Tage ohne Antigen, mit Antigen bei der angegebenen Konzentration oder mit erhitztem MSP in der angegebenen Konzentration inkubiert. Die Lymphozyten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht, ³H-Thymidin einzubauen, und Stimulationsindizes wurden berechnet.
Wie dargestellt in Tabelle E, zeigten Lymphozyten von den Meerschweinchen, die mit erhitztem, proteolytisch inaktivem MSP immunisiert worden waren, eine ausgeprägte Prohferationsreaktion auf MSP in allen Konzentrationen und auf 10 und 1 µg/ml erhitztes MSP im Vergleich mit Lymphozyten vom Kontrollmeerschweinchen. TABELLE E Stimulationsindizes (S.I.)*
Stimulationsindex = (mittlerer ³H-Thymidin-Einbau (cpm) von Lymphozyten, die mit Antigen inkubiert sind)/(mittlerer ³H-Thymidin-Einbau (cpm) von Lymphozyten, die ohne Antigen inkubiert sind).

Beispiel 7

In zwei unabhängigen Experimenten wurden Meerschweinchen subkutan mit MSP immunisiert (40 µg in vollständigem Freundschen Adjuvans, drei Wochen später gefolgt von 40 µg in unvollständigem Freundschen Adjuvans) oder subkutan scheinimmunisiert (ausschließlich vollständiges Freundsches Adjuvans, drei Wochen später gefolgt von ausschließlich unvollständigem Freundschen Adjuvans) (Kontrolle) - Milzlymphozyten wurden gewonnen und inkubiert (10&sup7;/ml) in Mikrotest-Näpfen bei 37ºC für zwei Tage ohne Antigen, mit MSP in der angegebenen Konzentration oder mit einem Cyanbromid-Verdauungsprodukt von MSP (CNBR MSP) in der angegebenen Konzentration. Die Lymphozyten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht, ³H-Thymidin einzubauen, und Stimulationsindizes wurden berechnet.
Wie dargestellt in Tabelle F, zeigten Lymphozyten von mit MSP immunisierten Tieren signifikant stärkere Reaktionen auf MSP und die höhere Konzentration von CNBr als Kontrolltiere. TABELLE F Stimulationsindizes (S.I.)*
*Stimulationsindex = (mittlerer ³H-Thymidin-einbau (cpm) von Lymphozyten, die mit Antigen inkubiert sind)/(mittlerer ³H-Thymidin-Einbau (cpm) von Lymphozyten, die ohne Antigen inkubiert sind).
**Ursprüngliche Mengen. Tatsächliche Mengen im Experiment wegen Verlust bei der Handhabung wahrscheinlich geringer.

Beispiel 8

In zwei unabhängigen Experimenten wurden Meerschweinchen subkutan mit MSP immunisiert (40 µg in vollständigem Freundschen Adjuvans, drei Wochen später gefolgt von 40 µg in unvollständigem Freundschen Adjuvans) oder subkutan scheinimmunisiert (ausschließlich vollständiges Freundsches Adjuvans, drei Wochen später gefolgt von ausschließlich unvollständigem Freundschen Adjuvans) (Kontrolle) - Milzlymphozyten wurden gewonnen und inkubiert ohne Antigen oder mit den extrazellulären Proteinen von mutanten L. pneumophila Philadelphia 1, L. pneumophila Togus 1 oder L. pneumophila Chicago 2 in den angegebenen Konzentrationen. Stimulationsindizes wurden berechnet.
Wie dargestellt in Tabelle G, zeigten Lymphozyten aus mit MSP Serogruppe 1 immunisierten Schweinen eine ausgeprägte Proliferationsreaktion auf extrazelluläre Proteine von L. pneumophila Serogruppen 1, 2 und 6 im Vergleich zu Kontrollmeerschweinchen. TABELLE G Stimulationsindizes (S.I.)*
*S.I. = Mittlere hautreaktivität (mm) mutanter immunisierter Meerschweinchen/mittlere Hautreaktivität (mm) von Kontrollmeerschweinchen.
Es sollte angemerkt werden, daß MSP aus L. pneumophila Philadelphia 1 (Serogruppe 1) gemeinsame Antigene mit MSP-ähnlichen Molekülen desselben scheinbaren Molekulargewichts von L. pneumophila Togus 1 (Serogruppe 2) und L. pneumophila Chicago 2 (Serogruppe 6) und einer aus L. pneumophila Philadelphia 1 gewonnen Mutante teilt. Gesamtmembranen von Wildtyp-L. pneumophila Philadelphia 1 (Spur A), mit Ammoniumsulfat ausgefällte extrazelluläre Proteine von mutanten L. pneumophila Philadelphia 1 (Spur B), L. pneumophila Togus 1 in Serogruppe 2 (Spur C), L. pneumophila Chicago 2 in Serogruppe 6 (Spur D) und gereinigtes MSP aus Wildtyp-L. pneumophila Philadelphia 1 in Serogruppe 1 (Spur E) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrozellulosepapier überführt. Die Blots wurden anschließend mit 1:500 Antiserum von einem Meerschweinchen inkubiert, das mit gereinigtem MSP aus Wildtyp-L. pneumophila Philadelphia 1 immunisiert worden war. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden histochemisch nachgewiesen, unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-anti-Meerschweinchen-IgG.
Der Antikörper gegen L. pneumophila Philadelphia 1-MSP (Serogruppe 1) erkannte nicht nur MSP des Wildtyps (Spur E) und der Mutanten (Spur B) von L. pneumophila Philadelphia 1, sondern auch ein MSP-ähnliches Molekül von L. pneumophila Togus 1 in Serogruppe 2 (Spur 0) und L. pneumophila Chicago 2 in Serogruppe 6 (Spur D). Der Antikörper wies kein MSP in den Membranen von Wildtyp-L. pneumophila Philadelphia 1 (Spur A) nach.
Weil MSP Kreuz-Schutzimmunität gegen Exposition mit anderen Serogruppen und Spezies von L. pneumophila bereitstellen kann, werden die Fachleute anerkennen, daß andere Spezies und Serotypen von Legionella-Organismen verwendet werden können, um die vorliegende Erfindung in bezug auf gegen L. pneumophila gerichtete Impfstoffe in die Praxis umzusetzen. Demgemäß sind die vorstehenden Beispiele zu Zwecken der Veranschaulichung bereitgestellt und nicht dazu gedacht, den Schutzumfang und den Inhalt der vorliegenden Erfindung zu beschränken oder diese Erfindung auf MSP oder Impfstoffe gegen Legionella pneumophila allein oder auf bestimmte Spezies oder Serogruppen davon zu beschränken.
Die Fachleute werden weitere Nutzen der vorliegenden Erfindung anerkennen. Zum Beispiel sind MSP und andere sekretorische oder extrazelluläre Produkte einzelne Typen von Molekülen statt vollständige Bakterien, daher ist es wahrscheinlich, daß von den Impfstoffen der vorliegenden Erfindung weniger Toxizität ausgeht, im Gegensatz zu bekannten Impfstoffen gegen intrazelluläre Organismen. Zusätzlich werden extrazelluläre Produkte leicht gewonnen und gereinigt und können synthetisch durch rekombinante DNA-Technologie und andere Techniken für die Produktion von Proteinmolekülen, die den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden.
Weitere Experimente mit Meerschweinchen haben gezeigt, daß eine so niedrige Immunisierungsdosis wie 10 Mikrogramm MSP eine effektive Immunreaktion erzeugen wird. Bei Extrapolieren auf einer Basis pro Kilogramm läge eine beispielhafte menschliche Dosis von MSP als einem Impfstoff gegen L. pneumophila in der Größenordnung von 3 Milligramm für ein 70 Kilogramm schweres Individuum.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Säuger-Impfstoffes gegen spezifische intrazelluläre Pathogene, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt:

Selektionieren eines intrazellulären Ziel-Pathogens;

Identifizieren wenigstens eines extrazellulären Produktes besagten Ziel-Pathogens, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes Ziel-Pathogen immun ist; und Erzeugen einer wirksamen Menge besagten wenigstens eines extrazellulären Produktes zur Verwendung bei der Immunisierung eines späteren Säugerwirtes.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das verantwortlich ist für Tuberkulose, Südamerikanische Trypanosomiase, Hautleishmaniase, Viszeralleishmaniase, Listeriose, Toxoplasmose, Histoplasmose, Trachom, Psittacose, Q- Fieber und Legionellose.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das für Tuberkulose verantwortlich ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei besagtes intrazelluläre Ziel-Pathogen Legionella pneumophila ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei besagtes extrazelluläre Produkt Legionella pneumophila-Hauptsekretionsprotein ist.

6. Ein Impfstoff zur Verwendung bei der Förderung einer wirksamen Immunreaktion in Säugern auf ein intrazelluläres Pathogen, wobei der Impfstoff wenigstens ein extrazelluläres Produkt besagten Ziel-Pathogens umfaßt, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes intrazelluläres Pathogen immun ist.

7. Ein Impfstoff nach Anspruch 6, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das verantwortlich ist für Tuberkulose, Südamerikanische Trypanosomiase, Hautleishmaniase, Viszeralleishmaniase, Listeriose, Toxoplasmose, Histoplasmose, Trachom, Psittacose, Q- Fieber und Legionellose.

8. Ein Impfstoff nach Anspruch 7, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das für Tuberkulose verantwortlich ist.

9. Ein Impfstoff nach Anspruch 7, wobei besagtes intrazelluläre Ziel-Pathogen Legionella pneumophila ist.

10. Ein Impfstoff nach Anspruch 7, wobei besagtes extrazelluläre Produkt Legionella pneumophila-Hauptsekretionsprotein ist.

11. Der Impfstoff nach Anspruch 10, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein denaturiert ist.

12. Der Impfstoff nach Anspruch 10 oder 11, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein in kleinere Untereinheiten gespalten ist.

13. Der Impfstoff nach Anspruch 10, 11 oder 12, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein aus Legionella pneumophila- Kulturüberstand gewonnen ist.

14. Der Impfstoff nach Anspruch 10, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein synthetisch hergestellt ist.

15. Der Impfstoff nach einem der Ansprüche 6 bis 14, der außerdem eine Adjuvans-Verbindung umfaßt.

16. Ein Impfstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung einer wirksamen Immunreaktion in Säugern auf ein intrazelluläres Pathogen, wobei der Impfstoff wenigstens ein extrazelluläres Produkt besagten Ziel-Pathogens umfaßt, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Säugerwirt stimuliert, der gegen besagtes intrazelluläres Pathogen immun ist.

17. Ein Impfstoff nach Anspruch 16, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das verantwortlich ist für Tuberkulose, Südamerikanische Trypanosomiase, Hautleishmaniase, Viszeralleishmaniase, Listeriose, Toxoplasmose, Histoplasmose, Trachom, Psittacose, Q- Fieber und Legionellose.

18. Ein Impfstoff nach Anspruch 17, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das für Tuberkulose verantwortlich ist.

19. Ein Impfstoff nach Anspruch 17, wobei besagtes intrazelluläre Ziel-Pathogen Legionella pneumophila ist.

20. Ein Impfstoff nach Anspruch 19, wobei besagtes extrazelluläre Produkt Legionella pneumophila-Hauptsekretionsprotein ist.

21. Ein Impfstoff nach Anspruch 20, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein denaturiert ist.

22. Ein Impfstoff nach Anspruch 20 oder 21, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein in kleinere Untereinheiten gespalten ist.

23. Ein Impfstoff nach Anspruch 20, 21 oder 22, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein aus Legionella pneumophila- Kulturüberstand gewonnen ist.

24. Ein Impfstoff nach Anspruch 20, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein synthetisch hergestellt ist.

25. Ein Impfstoff nach einem der Ansprüche 16 bis 24, der außerdem eine Adjuvans-Verbindung umfaßt.

26. Ein Säuger-Impfstoff gegen ein intrazelluläres Pathogen, wobei der Impfstoff wenigstens ein extrazelluläres Produkt besagten Ziel-Pathogens, das starke zellvermittelte Immunreaktionen in wenigstens einem Saugerwirt stimuliert, der gegen besagtes intrazelluläres Pathogen immun ist, und ein Adjuvans umfaßt.

27. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 26, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das verantwortlich ist für Tuberkulose, Südamerikanische Trypanosomiase, Hautleishmaniase, Viszeralleishmaniase, Listeriose, Toxoplasmose, Histoplasmose, Trachom, Psittacose, Q-Fieber und Legionellose.

28. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 27, wobei das intrazelluläre Pathogen ein intrazelluläres Pathogen ist, das für Tuberkulose verantwortlich ist.

29. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 27, wobei besagtes intrazelluläre Ziel-Pathogen Lecrionella pneumophila ist.

30. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 29, wobei besagtes extrazelluläre Produkt Legionella pneumophila-Hauptsekretionsprotein ist.

31. Ein säuger-Impfstoff nach Anspruch 30, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein denaturiert ist.

32. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 30 oder 31, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein in kleinere Untereinheiten gespalten ist.

33. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 30, 31 oder 32, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein aus Legionella pneumophila-Kulturüberstand gewonnen ist.

34. Ein Säuger-Impfstoff nach Anspruch 30, wobei besagtes Hauptsekretionsprotein synthetisch hergestellt ist.

35. Ein Säuger-Impfstoff nach einem der Ansprüche 26 bis 34, der außerdem eine Adjuvans-Verbindung umfaßt.