DE69635783T2

DE69635783T2 - Antigen omp26 aus haemophilus influenzae

Info

Publication number: DE69635783T2
Application number: DE69635783T
Authority: DE
Inventors: Jennelle McKeller KYD; Allan Curtin CRIPPS; John Christopher SMITH
Original assignee: CORTECS INTERNAT Ltd; CORTECS INTERNATIONAL Ltd
Current assignee: CORTECS INTERNAT Ltd; CORTECS INTERNATIONAL Ltd
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-27
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2016-06-28
Also published as: NZ311120A; NO976119D0; WO1997001638A1; JPH11510373A; CA2225405A1; ES2259443T3; US6313281B1; CN1144875C; JP2009034107A; TW457247B; ZA965482B; US6254875B1; US6284477B1; MX9710412A; AU6236396A; ATE317013T1; KR19990028423A; EP0835313A1; EP0835313B1; NO976119L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antigen von Haemophilus influenzae, dieses aufweisende Impfstoffe und ihre Verwendung bei der Therapie und Diagnose.
H. influenzae ist ein Gram-negatives aerobes heterotrophes Bakterium in der Form von Stäbchen (Krieg und Holt (Editoren), Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, S. 563 (1984)). Es ist ein Krankheitserreger bei akuten Atemwegsinfektionen und es wird ferner bei Patienten mit chronischer Bronchitis und Mittelohrentzündung gefunden.
Wir haben nun ein einzigartiges Außenmembranprotein (OMP 26 genannt) mit 26 kDa aus NTHI identifiziert und isoliert, und haben überraschenderweise gefunden, daß dieses Protein, wenn es als Antigen verwendet wird, eine schützende Immunreaktion gegen eine Infektion mit homologen und heterologen Stämmen von NTHi induziert. Dieses Protein weist bei SDS-PAGE ein Molekulargewicht auf, welches P5 ähnlich ist, aber es wurde gefunden, daß es von diesem Protein deutlich abweicht.
Das Außenmembranprotein P5 ist eines von zwei niederen Molekularmassenbanden auf SDS-PAGE-Gelen, welche zum Ermitteln von Subtypen von H. influenzae-Stämmen verwendet werden, und weist eine scheinbare Molekülmasse von 25-27 kDa auf. Das P5-Protein ist hitzemodifizierbar und weist nach einer Erhitzung auf 100°C für 30 Minuten in der Gegenwart von β-Mercaptoethanol eine scheinbare Molekülmasse von 35 kDa auf. Jüngst wurde ein weiteres, von NTHi exprimiertes Protein, Fimbrin-Protein genannt, charakterisiert, und es wurde gezeigt, daß es ähnliche Molekülmasseneigenschaften, Hitzemodifizierbarkeit und eine 92 % Sequenz-Homologie zu dem zuvor beschriebenen P5 aufweist. Das Protein OMP26 zeigt weder eine Sequenz-Homologie noch Hitzemodifizierbarkeits-Charakteristika wie sie sowohl für P5 als auch das Fimbrin-Protein bestimmt sind.
Daher stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein isoliertes oder rekombiniertes Protein mit einem mittels SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht von 26 kDa bereit, wobei das Protein ein Außenmembranprotein von H. influenzae ist und die folgende N-terminale Sequenz aufweist: NH₂EEKIAFINAGYIFQHHPDR-AV--K
Dieses Protein wird als OMP26 bezeichnet.
Bei einem ersten Ausführungsbeispiel weist das Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung die in 1 dargestellte, mit Aminosäure Nr. 24 als die N-terminale Aminosäure beginnende Aminosäuresequenz oder eine zu dieser zu zumindest 70 % oder zu zumindest 90 % homologe Sequenz auf. Die ersten 23 Aminosäuren stellen eine "Signal"-Sequenz dar und es wird angenommen, daß ein Protein ohne diese Sequenz gleichwertig anwendbar ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes oder rekombiniertes Außenmembranprotein von H. influenzae bereit, das die in 1 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine zu dieser zu mindestens 99 % homologe Sequenz aufweist.
Das erfindungsgemäße Protein ist ein Antigen und somit in der Lage, eine Immunreaktion zu induzieren, welche gegen eine Infektion mit H. influenzae schützt.
Proteine, welche "im wesentlichen homolog" zu OMP26 sind, können zu 40 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder sogar 99 % homolog sein.
Darüber hinaus ist es im Stand der Technik bekannt, daß "konservative" oder "semi-konservative" Änderungen an der Aminosäuresequenz eines Proteins durchgeführt werden können, die dessen grundlegende Aktivität nicht ändern. Beispielsweise können Aminosäuren wie Glycin, Valin, Leucin und Isoleucin, welche alle aliphatische Seitenketten aufweisen, oftmals gegeneinander ausgetauscht werden, ohne die biologische Aktivität des Proteins wesentlich zu verändern. Entsprechend können Aminosäuren wie beispielsweise Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, welche alle aromatische Seitenketten aufweisen, gegeneinander ausgetauscht werden. Derartige Proteine, welche die hierin beschrie bene antigene Wirkung behalten, liegen in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Es ist ferner möglich, daß antigene Teile oder antigene Regionen eines erfindungsgemäßen Proteins zum Induzieren der Schutzwirkung gegen H. influenzae verwendet werden. Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Fusionsprotein bereit, welches einen antigenen Teil oder eine antigene Region des erfindungsgemäßen Proteins aufweist, wobei der antigene Teil oder die antigene Region eine Schutzwirkung gegen H. influenzae induzieren kann.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die aus einer Sequenz, vorzugsweise DNA, besteht, welche ein erfindungsgemäßes Protein, Varianten davon wie oberhalb beschrieben, antigene Teile oder antigene Regionen davon oder ein Protein, welches einen antigenen Teil oder eine antigene Region eines erfindungsgemäßen Proteins aufweist, codiert. Insbesondere stellt die Erfindung eine in 1 gezeigte DNA-Sequenz bereit, welche OMP26 codiert. In einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung eine in 1 gezeigte DNA-Sequenz bereit, welche bei Nukleinsäure Nr. 69 beginnt. Der Fachmann erkennt, daß es aufgrund der Degeneration des genetischen Codes möglich ist, konservative Änderungen an der DNA-Sequenz vorzunehmen, welche nicht zu Änderungen an der Aminosäuresequenz des Proteins führen. Somit liegen derartige DNA-Sequenzen ebenfalls in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Geeigneterweise kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Teil eines Vektors wie beispielsweise eines Plasmids bilden.
Wie hierin beschrieben, stimulieren die erfindungsgemäßen Proteine eine Immunreaktion gegen H. influenzae und somit stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem vierten Aspekt eine Impfstoffformulierung bereit, die ein wie hierin beschriebenes erfindungsgemäßes Protein ggf. zusammen mit einem oder mehreren Trägerstoffen und/oder Hilfsstoffen aufweist.
Gemäß einem fünften Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins, wie es hierin beschrieben ist, bei der Zubereitung eines Impfstoffes gegen H. influenzae bereit.
Die erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung kann zum Immunisieren eines Subjekts gegen eine H. influenzae-Infektion verwendet werden, und zum Herstellen sowohl einer systemischen Immunität als auch/oder einer mukosalen Immunität.
Gemäß einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Impfstoffformulierung bei der Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe oder die Behandlung von Atemwegserkrankungen oder einer Mittelohrentzündung bereit.
Gemäß anderen Aspekten stellt die Erfindung bereit:

(a) Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins, wie es hierin beschrieben ist, bei der Herstellung einer Diagnostik für eine H. influenzae-Infektion; und
(b) einen Ausrüstungssatz zur Verwendung bei der Diagnose einer H. influenzae-Infektion mit einem erfindungsgemäßen Protein, wie es hierin beschrieben ist.

Bevorzugte Merkmale jedes Aspektes der Erfindung sind mutatis mutandis bei jedem anderen Aspekt bevorzugt.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht als die Erfindung irgendwie begrenzend ausgelegt werden sollen.
Die Beispiele beziehen sich auf die Figuren, in welchen:
1 die DNA-Sequenz, die OMP26 codiert und die Aminosäuresequenz, die von dieser DNA-Sequenz abgeleitet ist, zeigt;
2 die SDS-PAGE-Analyse von OMP26 und zwei weiteren Proteinen mit höherer Molekularmasse zeigt;
3 die N-terminale Sequenz der ersten 25 Aminosäurereste von OMP26 (a) und ferner einen Vergleich von dieser mit Proteinen von P. multocida und Y. pseudotuberculoses zeigt;
4 das NTHI-I-Bakterium zeigt, welches 4 Stunden nach einer Reizung (challenge) mit lebenden Bakterien aus Bronchialspülungen wieder gewonnen wurde;
5 OMP26-spezifische Level von IgG-Subklassen im Serum von mit OMP26 immunisierten Ratten zeigt;
6 ein Immunoblot für die Erkennung von OMP26-spezifischem Antikörper in Serum zeigt; und
7 eine Antigen-spezifische Proliferation von Lymphozyten zeigt, die aus dem MLN von OMP26-immunisierten und nichtimmunisierten Ratten isoliert wurden.
Bei dem folgenden Beispiel wurden die Daten als die mittleren +/– Standardfehler des Mittels gezeigt. Die pulmonalen Clearance-Daten, die Gesamtzahlen von Phagozytzellen und Differenzialzellbilddaten wurden mit Ein-Weg-Varianzanalysen, gefolgt von Tuckey's Test für Multi-Vergleichsanalysen (Macintosh Systat) auf eine statistische Signifikanz zwischen Gruppen verglichen. Antikörper-Daten wurden mit einem unpaarigen T-Test auf eine Extrem-Gruppen-Signifikanz hin ausgewertet, und Lymphozyt-Proliferations-Daten wurden mit einer Voll-Fakturiell-Varianzanalyse ausgewertet (Macintosh Systat). Eine Linearkorrellation zwischen zwei Variablen wurde unter Verwendung des Korrellationskoeffizenten von Pearson ermittelt (Macintosh Systat).
Beispiel 1
(i) Proteinreinigung
Ein Protein (OMP26) mit 26 kDa wurde durch präparative Elektrophorese aus einem NTHI-I-Stamm isoliert. Bakterien von Übernachtkulturen von 100 Agarplatten wurden durch Abschaben der Platten geerntet und zweifach durch Zentrifugieren bei 10.000 g für 10 Minuten bei 4°C gewaschen. Durch Extraktion des Außenmembran-Bestandteils mit gepuffertem Zwittergent 3-14 Detergent und Ethanol-Fällung wurde ein unbehandeltes Außenmembranpräparat erhalten. Das Außenmembranextrakt wurde lyophilisiert, in einer minimalen Menge destillierten Wassers erneut suspendiert und in der vierfachen Menge Natriumdodecylsulfat (SDS) Reducing Buffer weiter gelöst (62,5 mM Tris, [pH 6,8], 10 % [Vol/Vol] Glycerol, 2 % [Gew./vol] SDS, 5 % [vol/Vol] β-Mercaptolethanol, 1,2 × 10^–3% [Gew./Vol] Bromphenolblau). Das SDS-Präparat wurde bei 37°C für zumindest 30 Minuten inkubiert, bevor es auf dem Stacking-Gel der Elektrophoresesäule angeordnet wurde. OMP26 wurde unter Verwendung der präparativen Polyacrylamid-Elektrophorese (PAGE) gereinigt. Die präparative SDS-PAGE zum Reinigen von OMP26 wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Modells 491 Prep Cell unter Verwendung von 60 ml 14 T-1,42 % C Acrylamid/BIS (N,N'-Methylenbisacrylamid)-Trenngel mit 10 ml 4 % T-0,36 % C Acrylamid/BIS-Stacking-Gel, welches in einer 37 mm (Innendurchmesser [i.d.]) Säule polymerisiert wurde, durchgeführt. Die von der Säule eluierten Fraktionen wurden durch Lyophilisation aufkonzentriert und mit einer analytischen SDS-PAGE auf den Proteingehalt untersucht. Das gemäß diesen Bedingungen isolierte OMP26 enthielt SDS, welches anschließend mit Kaliumphosphat und Ausfällung entfernt wurde. Die OMP26 enthaltenden Fraktionen wurden vor der Bestimmung der Proteinkonzentration vereinigt und dialysiert.
Eine analytische Identifikation des Proteins wurde mit einer analytischen SDS-PAGE unter Verwendung eines Acrylamid-Gels mit einem Gradienten von 10-15 % oder eines homogenen Acrylamid-Gels mit 12,5 % und Silberanfärbungen durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Pierce Mirco BCA-Assays bestimmt. Die Gegenwart von LOS wurde sowohl durch Silberanfärbung von SDS-PAGE-Mini-Gelen und Ermittlung mit dem E-TOXATE-Limulus-Lysat-Test ausgewertet.
Ergebnisse
OMP26 wurde erfolgreich von einer Gruppe von drei Proteinen mit molekularen Gewichten zwischen 26-30 kDa getrennt. 2 zeigt die Position des Proteins in Bezug auf die zwei anderen, und das mit Silber angefärbte Gel zeigt den hohen Reinheitsgrad des resultierenden Präparats. Eine Auswertung der Wärme-Modifizierbarkeits-Charakteristik diese Proteins wurde durch Erwärmen der Proteinprobe auf 1000 für 30 Minuten in der Gegenwart von β-Mercaptoethanol durchgeführt. Es wurde gefunden, daß nach 30 Minuten die gekochte Proteinprobe nach wie vor mit dem gleichen Molekulargewicht wandert (2). Um zu bestimmen, ob eine der anderen benachbarten Proteinbanden das wärmemodifizierbare P5 gewesen war, wurden sämtliche drei Proteine innerhalb dieses Massenbereichs für 30 Minuten in der Gegenwart von β-Mercaptoehtanol gekocht, wobei keine der Proteine eine wärmemodifizierbare Charakteristik zeigte (2). Eine Auswertung des Proteins auf das Vorhandenseins einer LOS-Kontamination wurde unter Verwendung des E-TOXATE-Analysekits durchgefunden und als geringer als 0,6 μg Endotoxin pro mg Protein ermittelt.
(ii) Herstellung von OMP26 für N-terminale Aminosäuresequenzierung.
OMP26 wurde für eine N-terminale Aminosäuresequenz-Analyse durch Übertragen der Proteinbande von einem SDS-PAGE-Gel auf eine PVDF-Membran hergestellt. Diese Proteinprobe wurde für eine Sequenzanalyse an Cortecs Diagnostic, Techbase 1, Newtech Square, Deeside, Clwyd, Großbritannien gesendet.
Amiaosäuresequenz-Ideatifikation
Eine N-termine Aminosäuresequenz wurde von der auf PVDF übertragene Proteinbande erhalten. Die Aminosäuresequenz-Analyse der ersten 25 Peptide ist in 3 gezeigt. Die Sequenzanalyse zeigt weder eine Sequenzhomologie mit der N-terminalen Sequenz von Hib P5 noch mit der des Fimbrinproteins. Die N-terminale Aminosäuresequenz zeigt eine 56 % Homologie mit einem 21,4 kDa Protein von Pasteurella multocida und eine 44 % Sequenz homologie mit einem 19 kDa Außenmembranprotein von Yersinia pseudotuberculosis.
(iii) Immuaisation und bakterielle Reizung bzw. Belastung (bacterial challenge)
Spezielle nicht mit Krankheitskeimen belastete männliche Ratten erhielten an Tag 1 eine Intra-Peyersche-Drüsen-(IPP)-Immunisierung, an Tag 14 einen Intra-Tracheal(IT)-Boost und an Tag 21 die abschließende Reizung mit lebenden Bakterien. Die Tiere wurden mit Halothan sediert, um eine intravenöse Betäubung mit Chloralhydrat über die Schwanzvene zu vereinfachen. Der Dünndarm wurde über einen Unterbauchmittelschnitt freigelegt und das Antigen wurde unter Verwendung einer 27-Gauge-Nadel subserosal in jede Peyersche Drüse injiziert. Das Immunisierungsprotein (OMP26) wurde durch Emulgierung von 200 oder 800 μg Protein pro ml in einem 1:1 Verhältnis von Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) und Phosphat gepufferter Saline (PBS) hergestellt, und ein Gesamtimpfgut von 10 bzw. 40. μg Protein wurde jedem Tier verabreicht. Zwei Kontrollgruppen von Ratten bestehend aus (i) einer Mischung aus unbehandelten und scheinimmunisierten Gruppen (immunisiert mit IFA und PBS) und (ii) einer positiven, mit abgetöteten Bakterien des homologen NTHI-Stammes immunisierten Gruppe. Die Ratten erhielten nach IPP-Immunisierung an Tag 14 einen IT-Boost. Die mit OMP26 immunisierten Ratten erhielten einen IT-Boost von 10 μg OMP26. Die nicht immunisierte Gruppe erhielt 50 μl PBS, während die mit abgetöteten Bakterien immunisierte Gruppe 50 μl abgetötete Bakterien (Bakterienzahl von 10¹⁰ pro ml) erhielt. 21 Tage nach der ersten Immunisierung wurden die Tiere für 4 Stunden lebenden Bakterien (Bakterienzahl 5 × 10⁸) ausgesetzt. Ein heterologer Stamm, NTHI-II, wurde ebenfalls für die bakterielle Reizung verwendet. Die Bakterien wurden über Nacht bei 37°C in 5 % CO₂ auf Brain-Heart-Infusions-Agarplatten gezüchtet, welche mit 50 ml defibriniertem Pferdeblut pro Liter Agar ergänzt wurden, sodann zurückgewonnen, gewaschen und in PBS wieder auf die erforderliche Konzentration suspendiert. Die Bakterien wurden über eine intra-tracheale Kanüle in die Lungen eingebracht und 4 Stunden später wurden die Ratten eingeschläfert. Das Blut wurde gesammelt und Serum-Aliquote wurden bei –20°C für eine Antikörper-Analyse gelagert. Die Lungen wurden durch Spülen mit 5 × 2 ml PBS gespült und die vereinigte Spülungslösung (BAL) auf die Anzahl der Bakterien hin untersucht. Nach der Lungenspülung wurden die Lungen entfernt, homogenisiert und auf die Anzahl von Bakterien hin untersucht. Cytopsin-Objektträger wurden zur Bestimmung von Differentialzellzahlen in der Lungenspülung hergestellt. Die gesamte in der Lungenspülung enthaltene Anzahl wurde durch Anfärben mit Methylenblau und Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers berechnet.
Ergebnisse
Mit OMP26 immunisierte und am Tag 21 mit lebenden Bakterien des homologen NTHI-I Stammes gereizte Ratten zeigten eine signifikante bakterielle Clearance (P < 0,005). Immunisierte und mit 10 μg OMP26 "gestärkte" (boosted) Ratten hatten nach 4 Stunden 92 % weniger Bakterien in der Lunge als die nicht immunisierte Gruppe, wohingegen Ratten, welche 40 µg OMP26 bei der IPP-Immunisierung erhalten hatten und mit 10 µg OMP26 gestärkt wurden, 96 % weniger Bakterien aufwiesen und der bei mit abge töteten Bakterien immunisierten Ratten beobachteten Clearance von 95 % entsprachen (4).
Mit OMP26 immunisierte Ratten wurden ebenfalls mit lebenden Bakterien eines heterologen Stammes (non-typeable), NTHI-II, gereizt. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß die Immunisierung mit OMP26 ebenfalls Bakterien bei einer Lungenreizung mit einem anderen Stamm signifikant (P < 0,005) beseitigen bzw. vermindern (cleared). Die immunisierte Gruppe wies nach 4 Stunden in der BAL 93 % weniger Bakterien auf als die nicht immunisierte Gruppe, was eine Geschwindigkeit der bakteriellen Clearance zeigt, die vergleichbar mit der einer homologen Reizung ist. Eine Immunisierung mit OMP26 vermindert ferner, verglichen mit den nicht immunisierten Gruppen, die Anzahl der Bakterien, die in dem Lungen-Homogenat der immunisierten Gruppe vorhanden ist. Die Lungen-Homogenate von den mit NTHI-II gereizten Ratten (heterologer Stamm) weisen signifikant weniger Bakterien auf als die nicht immunisierten Lungen. Jedoch betrug das Ausmaß der Änderung 80 % in den Lungen bei 93 % Clearance in der BAL verglichen mit 89 % Clearance in den Lungen und 87 % Clearance in der BAL bei mit NTHI-I (dem homologen Stamm) gereizten Gruppen. Der Prozentsatz der Clearance für NTHI-I in diesem Experiment unterscheidet sich aufgrund des lebendigen bakteriellen Impfstoffes, welcher erheblich mehr Bakterien enthält als üblich, von vorherigen Experimenten (ein üblicher Impfstoff bewegt sich zwischen 0,6 und 1,4 × 10¹⁰ CFU pro ml).
In der BAL von mit OMP26 immunisierten Tieren war eine größere Anzahl von Phagozytzellen vorhanden, was mit der erhöhten bakteriellen Clearance bei diesen Tieren korreliert (Tabelle 2). Die Zunahme der Zell-Rekrutrierung bei immunisierten Gruppen war sowohl bei der homologen als auch der nicht homologen bakteriellen Reizung gleich. Jedoch waren 4 Stunden nach Reizung die Differentialzellzahlen zwischen immunisierten und nicht immunisierten Gruppen nicht signifikant unterschiedlich (Tabelle 2), wobei beide Gruppen ähnliche Verhältnisse von PMNs zu Macrophagen zeigen:
(iv) OMP26-spezifische ELISA
Polysorb-Microtiter-Löcher (wells) wurden mit gereinigtem OMP26 mit einer Konzentration von 1 µg pro ml für einen Nachweis von IgG, IgG_2a, IgA und IgM und mit 10 µg für einen Nachweis von IgG₁, IgG_2b, OgG_2C und IgE beschichtet. Die Platten wurden fünfmal in PBS mit 0,05 % Tween 20 zwischen Inkubationsschritten gewaschen. Die Löcher wurden mit einer 5 % Magermilch in PBS-0,05 % Tween 20 für 60 Minuten blockiert. Die Löcher wurden für 90 Minuten mit Serum (1/25 bis 1/3200) oder BAL (1/2 bis 1/16) inkubiert, und Proben wurden in einem Blockingpuffer für Analysen seriell verdünnt. Das verwendete konjugierte Immunoglobolin war Anti-Ratten-IgG (1/2000), IgA (1/1000) und IgM (1/4000) vom Schaf (Fc-spezifisch), Anti-Ratten-IgG₁ (1/500), IgG_2a (1/1000), IgG_2b (1/500) und IgG_2c (1/500) von einer Maus, und die Löcher wurden mit konjugiertem Immunoglobolin für 90 Minuten inkubiert. Die Platten wurden anschließend entwickelt.
Ergebnisse
Auf OMP26 spezifische Antikörper wurden in dem Serum und den BAL-Proben sowohl von mit OMP26 immunisierten Ratten als auch in von Ratten, die mit abgetöteten Bakterien von vier verschiedenen Stämmen von H. influenzae immunisiert worden sind, gemessen. Hohe OMP26-spezifische Antikörper-Titer für IgG, IgA und IgM wurden in dem Serum, und für IgG und IgA in der BAL von mit OMP26 immunisierten Ratten gefunden, wobei die höchsten Level bei der Gruppe beobachtet wurden, welche die höhere Immunisierungsdosierung von 40 µg erhalten hat (Tabelle 3). Nachweisbare Level von OMP26-spezifischem IgG, IgA und IgM in dem Serum, und IgG und IgA in der BAL wurden ferner bei Ratten gefunden, die mit unterschiedlichen Stämmen von H. influenzae immunisiert wurden (Tabelle 3), obwohl die für diese Gruppen beobachteten Level signifikant geringer waren als jene bei den OMP26-immunisierten Gruppen. Es wurden ebenfalls IgG-ELISAs an dem Serum von OMP26-Rattengruppen durchgeführt, jedoch konnten keine OMP26-spezifischen Level von IgE gemessen werden (Daten nicht gezeigt).
Eine Messung von OMP26-spezifischen Unterklassen zeigte, daß OMP26 spezifisches IgG₁ nur nach einer Immunisierung mit 40 µg nachweisbar war, wohingegen signifikante Level von IgG_2a- und IgG_2b-Unterklassen sowohl bei 10 µg als auch bei 40 µg OMP26-Immunisierungsgruppen gefunden wurden (5). Die Level von sowohl IgG_2a als auch IgG_2b nahmen mit der Zunahme der Konzentration von OMP26 in dem IPP-Impfstoff von 10 µg auf 40 µg signifikant (P < 0,05) zu. IgG_2c wurde ebenfalls gemessen, jedoch konnten keine signifikanten Level vom OMP26-spezifischen Antikörper von dieser Subklasse ermittelt werden (Daten nicht gezeigt).
(v) Immuaoblot
Mit SDS-PAGE separierte Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulose transferriert (0,2 µm Porengröße). Rattenserum von sowohl OMP26, NTHI-I, NTHI-II als auch den Stämmen von HI-CD und Hib-II-immunisierten Gruppen wurden 10fach in TTBS-5% (w/v) Magermilchpulver verdünnt und als der primäre Antikörper verwendet. Eine 500fache Verdünnung von mit Horseradish Peroxidase konjugiertem Anti-Ratten-IgG von Schafen (Fc-spezifisch) in TTBS-5% Magermilch wurde als der zweite Antikörper verwendet.
Ergebnisse
Immunoblot-Analysen einer Antigenerkennung von OMP26 durch in dem Serum von nicht immunisierten, OMP26-immunisierten und H. influenzae-(vier Stämme) immunisierten Ratten zeigten eine Antigenerkennung dieses Proteins durch in dem Serum von jeder der immunisierten Gruppen vorhandenen Antikörpern, nicht aber in der nicht-immunisierten Gruppe (6). Dies zeigt die Kreuz-Reaktivität von Antikörperreaktionen, die durch Immunisierung mit den H. influenzae-Stämmen erzeugt wurden, welche in dieser Studie mit dem aus dem NTHI-I-Stamm isolierten OMP26 verwendet wurden.
(vi) Aatigea-spezifische Lymphozyt-Auswertuag
Aus den Mesenteriallymphknoten (MLH) erhaltende Lymphozyten wurden auf eine Konzentration von 10⁶ Zellen pro ml kultiviert. Das Antigen (OMP26) wurde in dem Kultur-Medium in einer 10fachen Verdünnungsserie suspendiert und steril filtriert. Die Zellensuspension und das Antigen wurden dreifach auf Platten mit flachem Boden und mehreren Löchern gegeben, so daß ein endgültiges Volumen von 0,2 ml pro Loch resultiert. Die Lymphozyt-Proliferation wurde durch Einbringung von [³H]-Thymidin für die letzten 8 Stunden einer 4-Tage-Kultur abgeschätzt. Ergebnisse wurden durch Subtraktion des Hintergrunds von dem geometrischen Mittel von dreifachen Löchern und anschließend dem geometrischen Mittel ± Standartfehler der gesamten Behandlungsgruppe erhalten.
Ergebnisse
Lymphozyten von den MLN von OMP26-immunisierten und nicht immunisierten Ratten wurden auf antigen-spezifische proliferative Reaktionen hin untersucht. Zellen von der OMP26-immunisierten Gruppe reagierten signifikant auf OMP26 in Kultur in vitro, wohingegen Zellen von den nicht-immunisierten Ratten keine signifikante Poliferation zeigten (7A). Die Lymphozyten von mit OMP26 immunisierten Ratten wurden ebenfalls mit OMP-Extrakten von vier H. influenzae Stämmen kultiviert, um kreuz-reaktive Reaktionen auszuwerten. Signifikante proliferative Reaktionen wurden bei den Lymphozyten der OMP26-immunisierten Gruppe für die OMP-Extrakte der Stämme NTHI-I, NTHI-II und HI-CD gefunden, aber keine signifikante Proliferation wurde bei dem Extrakt von dem Hib-II-Stamm beobachtet (7B bis 7E).
Beispiel 2: Clonen und Sequenzieren von OMP26
DNA wurde aus NTHi extrahiert. Der OMP26 codierende DNA-Bereich wurde identifiziert und mit Standard-PCR-Verfahren unter Verwendung von Primern, die zum Erkennen des Gens entwikkelt wurden (synthetisiert im Biomolecular Resource Facsility, John Curtin School of Medical Research, Canberra, ACT, Australia), verstärkt. Nach der Analyse zum Bestimmen einer erfolgreichen Erkennung des korrekten Produkts wurde das PCT-DNA-Produkt extrahiert.
Zwei Plasmide wurde hergestellt. Ein DNA-Produkt enthielt den Bereich, der sowohl das Signal-Peptid als auch das reife (mature) OMP26-Produkt codiert, und das zweite codiert das endgültige reife OMP26 (ohne das führende Signal-Peptid). Die PCR-DNA-Produkte wurden mit den Endonucleasen HindIII für OMP26 + Signal-Peptid und NspBII und HindIII für das reife OMP26 verdaut (digested). Die verdaute DNA wurde aufgearbeitet und bei dem SmaI- und HindIII-Stellen in die Plasmide pQE30 oder pQE33 (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) für OMP26 + Signal-Peptid bzw. reifes OMP26-Protein ligiert. Die Plasmide wurden dann gereinigt und ausgefällt. Eine Sequenzierung wurde mit dem Dye Deoxy-Terminator-Verfahren an der biomolekularen Forschungsein richtung, John Curtin School of Medical Research, Canberra, Austalien durchgeführt.
Ergebnisse
Die in 1 gezeigte Sequenz stellt sowohl das reife OMP26 als auch das Signal-Peptid dar. Die Signal-Peptid-Sequenz umfaßt die ersten 23 Aminosäuren. Das endgültige von NTHi bei der Außenmembran exprimierte Produkte beginnt bei Aminosäure 24.

Claims

Isoliertes oder rekombinantes Protein mit einem mittels SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht von 26kDa, wobei das Protein ein Außenmembranprotein des H. Influenzae ist und die folgende N-terminale Sequenz aufweist: NH₂EEKIAFINAGYIFQHHPDR-AV-K
Protein nach Anspruch 1, das die in 1 dargestellte, mit Aminosäure 24 als N-terminale Aminosäure beginnende Aminosäuresequenz oder eine zu dieser zu mindestens 70 % homologe Sequenz aufweist.
Protein nach Anspruch 2, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 90 % homolog zu der in 1 dargestellten, mit Aminosäure 24 als N-terminale Aminosäure beginnenden Aminosäuresequenz ist.
Isoliertes oder rekombinantes Außenmembranprotein des H. Influenzae, das die in 1 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine zu dieser zu mindestens 99 % homologe Sequenz aufweist.
Antigener Teil oder antigene Region eines Proteins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der antigene Teil bzw. die antigene Region eine Schutzwirkung gegen H. Influenzae induzieren kann.
Fusionsprotein, das einen antigenen Teil oder eine antigene Region eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist, dessen antigener Teil bzw. dessen antigene Region eine Schutzwirkung gegen H. Influenzae induzieren kann.
Isolierte Nukleinsäure, die aus einer Sequenz ersteht, die ein Protein entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 7, die eine DNA-Sequenz ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 8, die, wie in 1 dargestellt, bei Nukleinsäure Nummer 69 beginnt.
Nukleinsäure nach Ansprüch 8, wie in 1 dargestellt.
Eine Impfstoffformulierung, das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Trägerstoffe und/oder Hilfsstoffe aufweist.
Verwendung eines Proteins wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert bei der Zubereitung eines Impfstoffs gegen H. Influenzae.
Verwendung eines Impfstoffpräparats nach Anspruch 11 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von Atemwegserkrankungen oder Otitis media.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Entwicklung einer Diagnostik für H. Influenzae-Infektion.
Ausrüstungssatz zur Verwendung bei der Diagnose von H. Influenzae-Infektion, das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist.