DE69110082T2

DE69110082T2 - Untereinheit-Impfstoff gegen Actinobacillus Pleuropneumoniae.

Info

Publication number: DE69110082T2
Application number: DE69110082T
Authority: DE
Inventors: Den Bosch Johannes Francis Van
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2011-04-12
Also published as: CA2040544C; CN1056428A; HUT61489A; ZA912796B; DK0453024T3; HU911303D0; EP0453024A1; AU7519291A; DE69110082D1; US5648081A; JPH04225924A; HU211031B; GR3017160T3; CN1055024C; JP3240063B2; ES2075325T3; NZ237867A; EP0453024B1; AU634879B2; KR910018033A

Description

Die Erfindung betrifft eine Impfstoffzusammensetzung zum Schutz von Schweinen gegen Actinobacillus pleuropneumoniae (App)- Infektionen und auch ein Verfahren zum Schutz von Schweinen durch Verabreichung eines solchen Impfstoffs.
Porcine Pleuropneumonie, eine bedeutende Erkrankung der Atemwege bei Schweinen, tritt weltweit auf und verursacht grosse wirtschaftliche Verluste in der Schweineindustrie, die auf perakuten Tod, Behandlung von akut erkrankten Schweinen und Verzögerungen beim Verkauf von chronisch infizierten Tieren zurückzuführen sind. Als etiologisches Agens dieser Krankheit wurde Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) identifiziert. Es wird primär durch direkten Kontakt zwischen Tieren übertragen und die daraus resultierende Infektion verursacht einen klinischen Verlauf, der von perakut bis chronisch variiert. Die Krankheit ist primär eine Infektion des respiratorischen Trakts, die als klinischen Zeichen hohes Fieber, ernste Atembeschwerden, Husten und Anorexie aufweist. Das Einsetzen der Krankheit ist schnell, Morbidität und Mortalität sind hoch. Von pathologischem Interesse sind die Entwicklung und die Verteilung pneumonischer Läsionen in den Lungen.
Selbstverständlich wurde versucht solche A. pleuropneumoniae- Infektionen unter Schweinen durch Impfprogramme zu kontrollieren.
Bis heute wurden Schweine mit Bakterien, inaktivierten A. pleuropneumoniae-Bakterien, geimpft. Nielsen, R; Nord. Vet. Med. 36: 221-234 (1984), Inzana et al.; Inf. Imm. 56: 1880-1889 (1988), Higgins, R.; Can. Vet. Journ. 26: 86-89 (1985).
Ein Nachteil eines solchen Impfstoffs sind die damit einhergehenden ernsten Nebenreaktionen. Darüber hinaus resultieren Bacterinimpfungen primär in Antikörpern, die gegen (Lipo)- Polysaccharide gerichtet sind, die nur für einen bestimmten A. pleuropneumoniae-Serotyp spezifisch sind und daher nicht gegen andere A. pleuropneumoniae-Serotypen schützen. Ausserdem lösen Bacterine von A. pleuropneumoniae nur einen geringen Schutz gegen Feldinfektionen aus.
Die Verwendung von kapsulären Extrakten zum Schutz von Schweinen gegen A. pleuropneumoniae wurde ebenfalls beschrieben [Fenwick et al.; Inf. Imm. 53: 298-304 (1986), Fenwick et al; Am. J. Vet. Res. 47: 1888-1891 (1986)]. Jedoch ergab eine Immunisierung von Schweinen und Mäusen mit solchen Extrakten nur eine teilweise Immunität. Ausserdem induzieren auf Kapseln basierende Impfstoffe nur einen homologen Schutz, d.h. Schweine, die mit einem Kapselimpfstoff geimpft wurden, der von einem spezifischen A. pleuropneumoniae-Serotyp stammt, sind nicht gegen einen Challenge mit einem A. pleuropneumoniae eines unterschiedlichen Serotyps geschützt.
Lebende, abgeschwächte A. pleuropneumoniae-Impfstoffe können auch eine Anzahl von Nachteilen bergen, einschliesslich dem Risiko der Impfung von Tieren mit ungenügend abgeschwächten Krankheitserregern und der Möglichkeit, dass die abgschwächten Bakterien wieder in ein pathogenes Stadium übergehen können, in der Erkrankung der geimpften Tiere und der möglichen Verbreitung der Krankheitserreger auf andere Tiere resultierend.
Es besteht daher seit langem ein Bedürfnis für einen A. pleuropneumoniae-Impfstoff, der sicher und Serotyp-unabhängig ist und der eine starke schützende Immunantwort in Schweinen hervorruft.
Es ist daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung einen Untereinheitsimpfstoff gegen porcine Pleuropneumonie zur Verfügung zu stellen, der im wesentlichen frei von A. pleuropneumoniae- Zellen ist, der im wesentlichen eine Kombination von mindestens zwei verschiedenen Untereinheitskomponenten, die von A. pleuropneumoniae stammen, umfasst, genannter Impfstoff
- ruft einen guten Schutz gegen A. pleuropneumoniae- Infektionen in Schweinen hervor,
- ist ausserdem Serotyp-unabhängig.
Die vorliegende Erfindung stellt einen A. pleuropneumoniae- Impfstoff zur Verfügung, der im wesentlichen frei von A. pleuropneumoniae-Zellen ist, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Impfstoff von einem Proteinpräparat der äusseren Membran von A. pleuropneumoniae mit mindestens einer bedeutenden antigenen Proteinkomponente von ungefähr 42 KD, die in SDS-PAGE gemessen wurden, stammt und mindestens einem Toxin, dass aus der Gruppe bestehend aus
1. einem Hämolysin (Hly) von A. pleuropneumoniae von ungefähr 105 KD in der SDS-PAGE und
2. einem Macrophagentoxin (Mat) von A. pleuropneumoniae von ungefähr 120 KD in der SDS-PAGE ausgewählt wird.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass das Hämolysin und/oder Macrophagentoxin von A. pleuropneumoniae zusammen mit dem Proteinpräparat der äusseren Membran von A. pleuropneumoniae mit einer dominanten antigenen Proteinkomponente von ungefähr 42 KD, das in der SDS-PAGE gemessen wurde (im folgenden als das 42 KD OMP-Präparat bezeichnet), als ein Impfstoff gegen A. pleuropneumonia-Infektionen von Schweinen angewendet werden kann, der aussergewöhnlich schützende Eigenschaften bietet, die von keinem der dem Stand der Technik bekannten Impfstoffe gezeigt wird.
Es ist bekannt, dass Hämolysin einen gewissen Schutz in Schweinen hervorruft. Jedoch Impfstoffe, die sowohl Hämolysin und/oder Macrophagentoxin als auch ein 42 KD OMP-Präparat umfassen, induzieren einen vollständigen und heterologen Schutz gegen einen Challenge mit virulenten A. pleuropneumoniae- Bakterien (Beispiel 3 und 5). Die Kombination der Hly- und Mat- Komponenten mit dem 42 KD OMP resultiert in einem Anstieg der schützenden Eigenschaften des Impfstoffs, mit dem nicht gerechnet wurde.
Hämolysin ist dadurch gekennzeichnet, dass
- es ein Calcium-induzierbares Protein ist, isolierbar aus einem Zellkulturüberstand von A. pleuropneumoniae
- es ein Molekulargewicht von 105 ± 5 KD, in der SDS-PAGE gemessen, besitzt (wie hier dargestellt)
- es abhängig von dem Serotyp ist, von dem Hämolysin isoliert wurde, es besitzt eine hämolytische Aktivität gegenüber Erythrocyten, die
- hitzeempfindlich ist
- und empfindlich gegenüber Proteinase K-Behandlung ist.
Die hämolytische Aktivität des Hämolysins kann gemäss dem in Beispiel 2.1 beschriebenen Test dargestellt werden.
Die hämolytische Aktivität des Hämolysin ist instabil und baut sich während der Lagerung zusätzlich zur Abnahme des Molekulargewichts des 105 KD-Proteins ab, was nicht in der Inaktivierung der immunisierenden Eigenschaften resultiert.
Daher können die genannten Hämolysine, die keine hämolytische Aktivität mehr besitzen oder antigene Fragmente des Hämolysin, die noch immunisierende Eigenschaften besitzen, ebenfalls in einem Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Von den Serotypen 1-12 produzieren nur die Typen 1, 5a, 5b, 9, 10 und 11 ein Hämolysin mit hämolytischer Aktivität (Beispiel 2.1), die anderen Serotypen produzieren äquivalente nichthämolytische Proteine von 105 KD, die serologisch mit dem 105 KD grossen Hämolysin mit hämolytischen Eigenschaften verwandt sind (Beispiel 2.3). Besagte immunologische Äquivalente oder Fragmente davon werden hierin als Hämolysine bezeichnet.
Darüber hinaus wird gezeigt, dass gegen Hämolysin gerichtetes Antiserum, das von einem hämolytischen Serotyp von A. pleuropneumoniae stammt, die hämolytische Aktivität des Hämolysins, das von den anderen hämolytischen A. pleuropneumoniae-Serotypen stammt, kreuzneutralisiert wird (Beispiel 2.3).
In Anbetracht der obengenannten nahen immunologischen Verwandtschaft zwischen Hämolysinen, die von verschiedenen Serotypen stammen, wird angenommen, dass ein Impfstoff gegen A. pleuropneumoniae-Infektion hergestellt werden kann, der neben dem 42 KD grossen OMP-Präparat ein Hämolysin enthält, das von jedem der zur Verfügung stehenden hämolytischen A. pleuropneumoniae- Serotypen oder -Stämmen stammen kann.
Ein in einen Impfstoff gemäss der Erfindung einzubauendes Hämolysin kann leicht durch Züchten von A. pleuropneumoniae-Zellen unter Bedingungen erhalten werden, die die Expression des Hämolysins und das Trennen des überstands von den Zellen fördern. Das Hämolysin kann weiterhin durch Ultrafiltration und Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Molekularsiebchromatographie gereinigt werden.
Während des Reinigungsverfahrens kann die, mit dem von hämolytischen Stämmen stammendem Hämolysin angereicherte Fraktion aufgrund ihrer hämolytischen Aktivität gegenüber Erythrocyten gemäss dem in Beispiel 2.1 dargestellten Verfahren beobachtet werden.
Ein Mitglied der Klasse der Hämolysine, das in einen Impfstoff gemäss der Erfindung eingebaut werden soll, kann von A. pleuropneumoniae-Zellen des Serotyps 1 gemäss dem unten aufgeführten Verfahren isoliert werden:
a. Züchten von genannten Bakterien während 6 Stunden in Columbia-Bouillon, die mit 0,01% NAD, 1% IsoVitalex und 25 mM CaCl&sub2; supplementiert wird;
b. Konzentrieren des zellfreien Überstands der so erhaltenen Kultur in einem Filter mit eine Durchlassgrösse für ein Molekulargewicht von 300.000 D;
c. Fällung des konzentrierten Überstands durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 55% und anschliesende 10-minütige Zentrifugation der Fällung bei 16.000 x g;
d. Trennen der wieder gelösten Fällung in 10 mM Tris-HCl- Puffer auf einer Sephacryl 5-200-Säule;
e. Sammeln des ersten eluierten Peaks.
Dieses Isolierungsverfahren kann auch angewendet werden, um Hämolysine zu erhalten, die von anderen von A. pleuropneumoniae- Serotypen stammen (Die Reinigung und teilweise Charakterisierung eines Serotyp 1-Hämolysins wurde auch von Frey J. und Nicolet, J., FEMS Microbiol. Letters (1988), 55, 41-46 berichtet).
Macrophagentoxin (Mat) ist dadurch gekennzeichnet, dass
- es ein Protein ist, das aus dem Zellkulturüberstand von A. pleuropneumoniae erhältlich ist,
- es ein Molekulargewicht von 120 ± 10 KD besitzt, in der SDS-PAGE gemessen (wie hier dargestellt),
- es eine N-terminale Aminosäurensequenz besitzt: Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met,
- es cytotoxisch für alveolare Macrophagen von Schweinen ist, und hitzeempfindlich ist und
- es anfällig gegenüber Proteinase K-Behandlung ist.
Die cytotoxische Aktivität von Mat kann gemäss dem in Beispiel 4.1 dargestellten Test nachgewiesen werden.
Die cytotoxische Aktivität von Mat ist instabil und nimmt während der Lagerung zusätzlich zu einer Abnahme des Molekulargewichts des 120 KD-Proteins ab, was jedoch für die immunisierenden Eigenschaften des Mat nicht wesentlich ist.
Daher können auch die genannten Proteine, deren cytotoxische Macrophagenaktivität verloren gegangen ist, welche immer noch immunisierende Eigenschaften besitzen, in einen Impfstoff gemäss der Erfindung eingebaut werden.
Von den Serotypen 1-12 produzieren die A. pleuropneumoniae- Referenzstämme der Serotypen 2, 3, 4, 6 und 8 Mat. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Antikörper, die gegen Mat gebildet wurden, welches von Zellen eines spezifischen Serotyps stammen, die cytotoxische Macrophagenaktivität des Mat- Präparats neutralisieren (Beispiel 4).
In Anbetracht der nahen immunologischen Verwandtschaft zwischen Mat, die von verschiedenen Serotypen stammen, wird angenommen, dass ein Impfstoff gemäss der Erfindung gegen A. Pleuropneumonia-Infektion hergestellt werden kann, das von jedem der zur Verfügung stehenden A. pleuropneumoniae-Serotypen oder Stämmen stammen kann, die Mat bilden.
Ein in einen Impfstoff gemäss der Erfindung einzubauendes Mat kann leicht durch Züchten von A. pleuropneumoniae-Zellen unter Bedingungen erhalten werden, die die Expression des Mat und das Trennen des überstands von den Zellen fördern. Das Mat kann weiterhin durch die Schritte Ultrafiltration, Chromatographie und Konzentration durch Ultrafiltration gereinigt werden.
Während des Reinigungsverfahrens kann die mit Mat angereicherte Fraktion aufgrund ihrer cytotoxischen Macrophagenaktivität gemäss dem in Beispiel 4.1 dargestellten Verfahren beobachtet werden.
Ein Mitglied der Macrophagencytotoxine, das in einen Impfstoff gemäss der Erfindung eingebaut werden soll, wird durch das folgende Verfahren charakterisiert und erhalten:
a. Züchten von Bakterien des A.pleuropneumoniae-Serotyps 2 während ungefähr 6 Stunden bei 37ºC in Columbia-Bouillon, die mit 0,01% NAD supplementiert wird;
b. Konzentrieren des Kulturüberstands durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters mit einer Durchlassgrösse für ein Molekulargewicht von 300.000 D;
c. Eluieren des Konzentrats aus einer Cl4B-Säule;
d. Sammeln des ersten eluierten Peaks;
e. Filtrieren des Toxins durch einen 0,45 pm grossen Celluloseacetatfilter.
Dieses Isolierungsverfahren kann auch angewendet werden, um Mat zu erhalten, die von den gleichen oder verschiedenen A. pleuropneumoniae-Serotypen stammen.
Die nicht-toxische Komponente eines Impfstoffs gemäss der Erfindung ist ein Proteinpräparat der äusseren Membran von A. pleuropneumoniae-Zellen, das ein 42 ± 5 KD grosses Protein, in der SDS-PAGE (wie hier ausgeführt) gemessen, oder ein antigenes Fragment davon als bedeutendes dominantes antigenes Protein (42 KD OMP-Präparat) umfasst, wobei das 42 KD OMP
- hitzeveränderlich
- empfindlich gegenüber Proteinase K-Behandlung ist.
Von Serotyp 1-Zellen stammendes Antiserum, dass gegen ein 42 KD OMP-Präparat ausgelöst wird, zeigt starke Kreuzreaktion mit Zellysaten, die von den Serotypen 1-12 von A. pleuropneumoniae stammen. Da das genannte Antiserum hauptsächlich Antikörper umfasst, die das 42 KD grosse OMP im Western Blot erkennen, kann geschlossen werden, dass das 42 KD OMP das wichtigste dominante antigene Protein in dem gereinigten OMP-Präparat ist (Beispiel 1.2). Aus dem oben beschriebenen wird erwartet, dass ein Impfstoff gegen A. pleuropneumoniae hergestellt werden kann, der neben einem Hämolysin und/oder Mat, ein 42 KD CMP-Präparat enthält, das von jedem zur Verfügung stehenden A. pleuropneumoniae-Serotyp stammen kann.
Genanntes 42 KD OMP-Präparat kann durch Züchten von A. pleuropneumoniae-Zellen unter Bedingungen erhalten werden, die die Expression des 42 KD OMP fördern, die Sedimentation der Zellmembranfraktion, gefolgt von dem Aufbrechen der A. pleuropneumoniae-Zellen, z.B. durch Ultraschallbehandlung, durch Mahlen oder durch eine Presse, weiteres Reinigen besagter Membran in innere und äussere Membranen, z.B. durch Dichtegradientensedimentation oder durch differenzierte Auflösung der inneren Membran mit Detergentien wie Triton X-100 oder Sarkosyl gefolgt von einer Zentrifugation und falls erwünscht Herstellung eines OMP-Präparats, das weiter mit dem 42 KD grossen OMP angereichert ist.
Ein Mitglied der Klasse der Proteinpräparate der Aussenmembran, die mit dem 42 KD Protein angereichert sind, um in einen Impfstoff gemäss der Erfindung eingebaut zu werden, können aus A. pleuropneumoniae-Zellen des Serotyp 1 gemäss dem unten dargestellten Verfahren isoliert werden:
a. Züchten besagter Bakterien über Nacht in einem Gehirn-Herz- Infusionsbouillon, das mit 0,01% NAD supplementiert wird;
b. Ernten der bakteriellen Zellen durch Zentrifugation und Resuspendieren in 10 mM HEPES-Puffer;
c. Aufbrechen der Zellen durch Ultraschallbehandlung;
d. Entfernen der grossen Zellbruchstücke durch Zentrifugation und Ernten der gesamten Membranfragmente aus dem Überstand durch 1-stündige Zentrifugation bei 100.000 x g und Resuspendieren in 10 mM HEPES-Puffer;
e. Zugabe von Natrium-N-Laurylsarcosinat (Sarkosyl) bis zu einer Endkonzentration von 1% (G/V) und 1-stündigem Rühren;
f. Ernten der Aussenmembranproteine durch 1-stündige Zentrifugation bei 100.000 x g und Resuspendieren in H&sub2;O.
Dieses Isolierungsverfahren kann angewendet werden, um 42 KD OMP-Präparate zu erhalten, die von allen zur Verfügung stehenden A. pleuropneumoniae-Serotypen stammen.
Falls erwünscht, kann das 42 KD OMP durch im Stand der Technik bekannte Verfahren bis zur Homogenität gereinigt werden, z.B. durch Lösen des 42 KD OMP von besagtem 42 KD-Präparat durch Extraktion mit einem oder mehreren Detergentien gefolgt von weiterer Reinigung einschliesslich Ionenaustausch- oder Molekularsiebchromatographie unter Bedingungen, die die schützenden Eigenschaften des 42 KD grossen oMP nicht beeinträchtigen.
Ein Hämolysin, Mat und ein 42 kD grosses OMP, die in einen Impfstoff gemäss der Erfindung eingebaut werden sollen, können durch chemische Synthese, Reinigung von A. pleuropneumoniae- Zellkulturen oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden.
Im letzteren Fall können Nukleinsäuresequenzen, die für die obengenannten Proteine oder Fragmente davon codieren, z.B. durch Screening einer genomischen DNA-Bibliothek von A. pleuropneumoniae nach individuellen Klonen, die die genannten Sequenzen umfassen, identifiziert werden, z.B. durch Anwendung einer spezifischen Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die gegen Hämolysin, Mat oder das 42 KD grosse OMP gerichtet sind. Die Nukleinsäuresequenzen können mit verschiedenen, die Expression beeinflussenden DNA-Sequenzen ligiert sein, in einem sogenannten rekombinanten Nukleinsäuremolekül resultierend, das für die Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet werden kann. Solche hybriden DNA-Moleküle können zum Beispiel von Plasmiden oder von Nukleinsäuemolekülen stammen, die in den Viren vorhanden sind. Die Wirtszelle kann prokaryotischen Ursprungs sein, z.B. von Bakterien oder eukaryotischen Ursprungs, wie eine Säugetierzelle. Die transformierten Wirtszellen können verwendet werden, um das Hämolysin oder 42 KD grosse OMP herzustellen, wonach die genannten Proteine isoliert und nachfolgend in einen Impfstoff gemäss der Erfindung eingebaut werden können.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Lebendvektorimpfstoff hergestellt werden, der nicht-pathogene Mikroorganismen, z.B. Viren oder Bakterien umfasst, die die Gene, welche für das Hämolysin und/oder Mat und das 42 KD grosse OMP codieren, in den gleichen oder verschiedenen Mikroorganismus kloniert besitzt.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung stammt von einer Hämolysinund/oder Mat-Komponente und einer 42 KD OMP-Präparatkomponente, die beide von A. pleuropneumoniae abstammen. Der Impfstoff kann die jeweiligen Komponenten oder antigenen Fragmente der genannten Komponenten, die noch immunisierende Eigenschaften besitzen, umfassen, oder können in der Form eines rekombinanten DNA- Impfstoffs sein, wie oben dargestellt.
Geeignete immunochemisch aktive Polypeptidfragmente von Proteinkomponenten des vorliegenden Impfstoffs, die ein oder mehrere Epitope enthalten, können mit Hilfe des in der Patentanmeldung WO 86/06487, Geysen, M.M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002, 1984), Geysen, H.M. et al. (J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987) beschriebenen Verfahrens nachgewiesen werden, das auf der sogenannten Pepscan-Methode basiert, worin eine Serie von teilweise überlappenden, mit Teilsequenzen des vollständigen Polypeptids korrespondierenden Sequenzen des in Frage kommenden vollständigen Polypeptids synthetisiert wird und ihre Reaktionsfähigkeit mit Antikörpern untersucht wird.
Ausserdem kann eine Anzahl von Regionen des Polypeptids mit der dargelegten Aminosäuresequenz festgelegte Epitope auf der Basis theoretischer Betrachtungen und struktureller Übereinstimmungen mit bereits bekannten Epitopen sein. Die Bestimmung dieser Regionen basiert auf einer Kombination der Hydrophilitätskriterien gemäss Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828, 1981) und den Sekundärstrukturaspekten gemäss Chou und Fasman (Advances in Enzymolgy 47, 45-148. 1987).
T-Zellepitope, die notwendig sein können, können aus entsprechenden theoretischen Gründen mit Hilfe des Berzofsky'schen Amphiphilitätskriteriums (Science 235, 1059-62, 1987) erhalten werden. Kleine Fragmente werden vorzugsweise an Trägermoleküle gebunden, um ihre Immunogenität zu erhöhen. Für diesen Zweck geeignete Träger sind Macromoleküle, wie natürliche Polymere (Proteine wie das Hämocyan der Napfschnecke, Albumin, Toxine), synthetische Polymere, wie Polyaminosäuren (Polylysin, Polyalanin) oder Micellen amphiphiler Verbindungen wie Seifen. Alternativ können diese Fragmente als Polymere davon, vorzugsweise als lineare Polymere zur Verfügung gestellt werden.
Genauer gesagt, stammt die Hämolysinkomponente von A. pleuropneumoniae-Stämmem des Serotyps 1, 5a, 5b, 9, 10 oder 11.
Die Mat-Komponente in einem Impfstoff gemäss der Erfindung stammt vorzugsweise von A. pleuropneumoniae-Zellen des Serotyps 2, 3, 4, 6 oder 8.
Der am meisten bevorzugte Impfstoff gemäss der Erfindung ist ein trivalenter Impfstoff, der aus dem 42 KD OMP-Präparat, dem Hämolysin und dem Mat von A. pleuropneumoniae besteht.
Ausgesprochen gute Ergebnisse können mit dem trivalenten Impfstoff erhalten werden, wenn das 42 KD OMP von Serotyp 1-Zellen stammt, das Hämolysin von Serotyp 5b-Zellen stammt und das Mat von Serotyp 2-Zellen stammt.
Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann einem herkömmlichen aktiven Immunisierungsschema entsprechend verabreicht werden: einzelne oder wiederholte Verabreichungen auf eine Weise, die mit der Dosierungsrezeptur verträglich ist und in solch einer Menge, die therapeutisch wirksam und imunogen ist. Die Verabreichung des Impfstoffs kann z.B. intradermal, subcutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal erfolgen.
Auf einer per Dosis-Basis kann die Konzentration der obengenannten Komponenten von ungefähr 1 ug bis 1 mg pro Schwein rangieren. Ein bevorzugter Bereich ist von 25 ug bis 200 ug pro Schwein.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann durch Mischen der Hämolysin- und/oder Mat-Komponente und der 42 KD OMP-Präparat- Komponente zu einer Zusammensetzung mit immunisierender Aktivität hergestellt werden.
Zur parenteralen Verabreichung, wie eine intramuskuläre Injektion, können die genannten Komponenten mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verbunden sein, zum Beispiel einem wässrigen Medium oder einer Wasser enthaltenden Suspension, oft mit anderen Bestandteilen gemischt, um z.B. die immunisierende Aktivität oder die Lagerungsdauer zu erhöhen. Diese Bestandteile können Salze, ph-Puffer, Stabilsatoren, Emulgatoren, Adjuvatien sein, um die Immunantwort zu verbessern (Öl-in-Wasser Emulsionen, z.B. Beispiel von Vitamin E, Wasser-in-Öl Emulsionen, Aluminiumverbindungen, Muramyldipeptide, Seifen, Polyanionen, amphipatische Verbindungen oder Block-(Co)polymere und Konservierungsmittel.
Der Impfstoff kann auch mit anderen immunisierenden Komponenten für andere Krankheiten verbunden werden, um multivalente Impfstoffe herzustellen oder mit anderen Medikamenten, zum Beispiel Antibiotika. Zum Beispiel können multivalente Impfstoffe hergestellt werden, die zusätzliches antigenes Material von einem oder mehreren Schweinekrankheitserreger, z.B. dem Pseudorabiesvirus, dem übertragbaren Gastroenteritisvirus, porcinen Parvovirus, dem Schweineinfluenzavirus, Mycoplasma hyopneumoniae, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusipathiae, Bordetella bronchiseptica und Pasteurella multocida umfassen.

Beispiel 1

1. Reinigung und Charakterisierung eines 42 KD angereicherten Proteinpräarats der äusseren Membran (OMP)

Verfahren

Die Reinigung der OMP wurde im wesentlichen wie von Barenkamp et al. (J. Infect. Dis. 143, 668-676; 1981) beschrieben, durchgeführt.
Der Referenzstamm vom App-Serotyp 1 wurde über Nacht in Gehirn/Herz-Infusionsbouillon gezüchtet, das mit 0,01% NAD supplementiert wurde, die Bakterien wurden durch Zentrifugieren geerntet und in 10 mM Hepes-Puffer (pH 7,4) resuspendiert. Bakterielle Zellen wurden mit einem Branson-Ultraschallgerät (Typ B- 12) Ultraschall behandelt, während sie auf Eis gekühlt wurden, bis die meisten Bakterien zerstört waren und die OD&sub6;&sub6;&sub0; um mindestens 90% abgenommen hatte. Grosse Zelltrümmer wurden durch eine 20-minütige Zentrifugation mit 5.000 x g entfernt, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation mit 10.000 x g. Die Membranen wurden aus dem Überstand durch einstündige Ultrazentrifugation mit 100.000 x g entfernt und in HEPES-Puffer resuspendiert. Grosses unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren (11.000 x g, 2 Minuten) und 5 um-Filtration entfernt. Natrium- N-Laurylsarcosinat (Sarkosyl) wurde dem Filtrat bis zu einer Endkonzentration von 1% (G/V) zugegeben. Nach 1-stündigem Schütteln wurden die in Sarkosyl unlöslichen OMP 1 Stunde bei 100.000 x g pelletiert, in H&sub2;O resupendiert und 0,45 um filtriert.
Gereinigte OMP-Präparate wurden in SDS-PAGE gemäss dem Verfahren von Laemmli (Nature 227, 680-684; 1970) aufgetrennt.
Der Proteingehalt wurde durch ein modifiziertes Folin- Ciocalteu-Assay (J. Biol. Chem. 73, 627; 1927) unter Verwendung von BSA als Standard gemessen, die Kohlenhydratkomponente wurde durch einen Phenol-Schwefelsäure-Assay gemäss Dubois et al. (Anal. Chem. 28, 350-356, 1956) unter Verwendung von Glukose als Standard durchgeführt.
Die Hitzemodifizierbarkeit der OMP wurde in SDS-PAGE durch Vorbehandlung der Proben in Probenpuffer bei verschiedenen Temperaturen (30ºC-100ºC) während 10 Minuten vor dem Auftragen auf das Gel getestet.
Empfindlichkeit der OMP bezüglich Proteinase-K-Behandlung wurde wie folgt getestet. Die Proben wurden auf ungefähr 0,05 mg/ml Protein in 10 mM Tris-HCL-Puffer gebracht, der mit 5 mM EDTA und 0,5% SDS supplementiert war und 100 ug/ml Proteinase K (Boehringer) enthielt. Nach der 3-stündigen Inkubation bei 37ºC unter schwachem Schütteln und Aufbewahrung über Nacht bei 4ºC, wurden Proteinase K- und leer behandelte Proben in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden mit CBB oder mit Silber (Wray et al., Anal. Biochem. 118, 197-203; 1981) gefärbt oder für Western Blots mit Serum von rekonvaleszenten Schweinen (Anal. Biochem. 120, 46-51; 1982) verwendet. Die verwendeten Schweineseren waren alles Seren von rekonvaleszenten Schweinen, die eine Feldinfektion mit dem f-Serotyp 2 oder 9 überlebt hatten oder von Schweinen die einen experimentellen Challenge mit den App-Serotypen 1, 2, 5a oder 9 überlebt hatten.

Ergebnisse

Das Protein-Kohlenhydrat-Verhältnis des gereinigten OMP- Präparats betrug 1:0,8. SDS-PAGE mit CBB-Färbung des gereinigten OMP-Präparats zeigte eine 42 KD grosse Doppelbande als das Hautprotein, deutlich angereichert im Vergleich mit dem gesamten bakteriellen Lysat und den rohen gesamten Membranpräparaten. Figur 1 zeigt ein Beispiel eines Gelscans des gereinigten OMP-Präparats, der mit einem Shimadzu Dual-Wavelength TLC Scanner (CS-930) durchgeführt wurde, welcher mit einem Shimadzu Datenrekorder (DR-2) verbunden war. Die Reinheit des 42 KD grossen Proteins schien ungefähr 60% auf Proteinbasis zu betragen.
Vorbehandlung der gereinigten OMP bei verschiedenen Temperaturen vor dem SDS-PAGE zeigte, dass nach einer Vorbehandlung bei 70ºC oder höher das 42 KD Protein die hauptsächliche Bande war. Nach der Vorbehandlung unter 60ºC war die Bande bei 42 KD vollständig abwesend, wohingegen eine andere Hauptbande bei ungefähr 200 KD auftrat. Diese 200 KD grosse Bande war nach einer Vorbehandlung bei 70ºC oder höher nicht vorhanden. Es wurde geschlossen, dass das 42 KD grosse OMP eine hitzemodifizierbares Protein ist.
Vorbehandlung der gereinigten OMP mit Proteinase K vor der SDS- PAGE und anschliessendes Färben der Gele mit CBB zeigte, dass keine einzige Bande nach der Proteinase K-Behandlung übrigblieb, wohingegen eine Leerbehandlung keine Wirkung auf das Proteinmuster in den Gelen hatte. Silberfärbung der Gele zeigte, dass nur wenige niedrige Molekulargewichtsbanden (12-20 KD) nach der Proteinase K-Behandlung übrigblieben, wohingegen eine Leerbehandlung der Proben ein normales Bandenmuster, einschliesslich der Hauptbande von 42 KD, aufwiesen. Western Blotting der Gele mit dem Serum rekonvaleszenter Schweine zeigte, dass nicht jede Bande nach der Proteinase K-Behandlung entwikkelt war, wohingegen sich das normale Muster nach der Leerbehandlung ausbildete (Figur 2). Offensichtlich enthielt das Serum der rekonvaleszenten Schweine keine gegen die Proteinase K- resistenten niederen Proteinbanden, die in den mit Silber gefärbten Gelen gesehen wurden. Es wurde geschlossen, dass das 42 KD grosse OMP-Protein gegenüber proteolytischer Aktion durch Proteinase K empfindlich ist.

2. Testen der Antiaenität von gereinigtem OMP

Verfahren

Meerschweinchen wurden subcutan mit 20 ug einer Wasser-in-Öl Emulsion aus, wie zuvor beschrieben, gereinigtem OMP geimpft. Vier Wochen nach der Impfung wurden die Seren gesammelt und in einem Western Blot auf bakteriellen Lysaten getestet.
(Bakterielle Lysate wurden von den APP-Referenzstämmen der Serotypen 1-10 wie folgt hergestellt. Die Bakterien wurden pro Stamm von 3 grossen, 15 cm-Schokoladenagarplatten geerntet, in ungefähr 10 ml PBS (0,04 M, pH 7,2) mit 0,3% Formalin gelöst. Die Bakterien wurden durch Ultraschallbehandlung mit einem Branson-Ultraschallgerät B-12 so lange wie notwendig lysiert, um eine Reduktion der OD&sub6;&sub6;&sub0; von ungefähr 90% zu erzielen. Bakterien-und grosse Zelltrümmer wurden herunterzentrifugiert und das Lysat durch einen 0,45 um-Filter filtriert. Die Lysate wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt.

Ergebnisse

Wie in Figur 3 gezeigt, richtete sich die Antwort auf die Impfung hauptsächlich gegen die 42 KD (Doppel)Bande. Obwohl der Impfstoff von einem 42 KD-OMP, der von dem App-Referenzstamm des Serotyps 1 gereinigt wurde, hergestellt wurde, erkannten die Antikörper eine gleiche 42 KD (Doppel)bande in Lysaten der App-Referenzstämme der Serotypen 1 bis 10. Es wurde geschlossen, dass das 42 KD OMP ein gemeinsames kreuzreaktives Antigen ist, das in allen getesteten App-Serotypen vorhanden ist.

Beispiel 2

1. Hämolytische Aktivität der App-Stämme

Verfahren

Die hämolytische Aktivität der Stämme wurde in wesentlichen wie von Frey und Nicolet (Infec. Immun. 56, 2570-2575; 1988) beschrieben, durchgeführt. Die Bakterein wurden in Columbia- Bouillon (Difco), das mit 1% IsoVitaleX (BBL), 0,01% β-NAD (Sigma) und 25 mM CaCl&sub2; (Merck) supplementiert war, 4-6 Stunden bei 37ºC bis zur Mitt-End-log-Pase gezüchet. Die Bakterienzellen wurden 10 Minuten bei 12.000 x g herunterzentrifugiert und Serienverdünnungen des Überstands wurden in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS; 10 mM Tris-HCl in 0,85% NaCl, pH 7,5) hergestellt. Gleiche Volumen einer 2%-igen Pferdeerythrocytesuspension in TBS wurde zu den Verdünnugen des Überstands gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei 37ºC unter Schütteln inkubiert, gefolgt von einer statischen Inkubation über Nacht zur Sedimentation der Erythrocyten. Die optische Dichte der resultierenden Überstände wurde bei 540 nm (A&sub5;&sub4;&sub0;) gemessen. In jedem Assay waren mindestens vier 100%-Kontrollen, die aus 1 Teil destilliertem Wasser und einem Teil 2%-igen Pferdeerythrocyten bestanden, enthalten.
Negativkontrollen bestanden aus einem Teil TBS und einem Teil 2%-ige Erythrocyten. Hämolytische Aktivität war vorhanden, wenn die Verdünnung des Kulturüberstands 25% Hämolyse relativ zu der mittleren 100%-igen Kontrolle ergab. Proben wurden als positiv angesehen, wenn unverdünnte Proben mindestens 25% Hämolyse relativ zu der mittleren 100%-igen Kontrolle zeigten. Negativkontrollen wurden als Qualitätskontrolle für die Erythrocytensuspension verwendet, eine A&sub5;&sub4;&sub0; von 0,100 nicht überschreitend.

Ergebnisse

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der App-Referenzstämme dargestellt. Den im Verfahrensabschnitt beschriebenen Assay verwendend, schienen die Serotypen 1, 5a, 5b, 9, 10 und 11 hämolytisch zu sein, wohingegen die anderen Serotypen negativ waren. Beim Testen von Feldisolaten, waren im allgemeinen die gleichen Serotypen hämolytisch. Tabelle 1: Hämolytische Aktivität der Referenzstämme von A. pleuropneumoniae (in Flüssigkultur) Serotyp Referenzstam Nr. hämolytisch

2. Reinigung und Charakterisierung des Hämolysins

Verfahren

Zur Reinigung des App-Hämolysins wurden die Referenzstämme vom Serotyp 1 oder Serotyp 5b in mit 1% IsoVitalex , 0,01% NAD und 25 mM CaCl&sub2; supplementierter Columbia-Bouillon bei 37ºC ungefähr 6 Stunden gezüchtet. Alle anschliessenden Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Bakterien wurden durch Zentrifugieren (30 Minuten mit 16,000 x g) und 0,45 um-Filtration unter Verwendung von Celluloseacetatmembranfiltern (Sartorius) entfernt. Der zellfreie Überstand wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung des Minitan -Systems (Millipore) mit einem PTMK-Filter (MG-Durchlassgrösse 300,000; Polysulfon) konzentriert. Hämolysin wurde über Nacht in 55%-igen gesattigtem Ammoniumsulfat gefällt, 10 Minuten mit 16,000 x g zentrifugiert und in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 gelöst. Schliesslich wurde das Hämolysin von einer Sephacryl S-200-Säule oder einer CL4B-Säule (Pharmacia) unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) als Elutionspuffer eluiert. Der erste eluierte Peak enthielt das Hämolysin.
Gereinigte Hämolysin-Präparate wurden auf SDS-PAGE gemäss dem Verfahren von Laemmli (Nature 227, 680-684; 1970) aufgetrennt.
Rohe Hämolysinpräparate wurden von allen Serotypen mittels Ammoniumsulfatfällung der Kulturüberstände hergestellt. Alle Präparate wurden, wenn nicht anders beschrieben, bei -70ºC aufbewahrt.
Hitzeempfindlichkeit wurde durch 10-minütiges Erhitzen der Kulturüberstände auf 60ºC und anschliessendes Testen der hämolytischen Aktivität (siehe vorher) nachgewiesen. Empfindlichkeit gegenüber Proteinase-K-Behandlung wurde durch 10-minütige Inkubation der Kulturüberstände mit 0,02 mg/ml Proteinase K (Boehringer; von T. album) bei 37ºC und anschliessendes Prüfen der hämolytischen Aktivität getestet.
Empfindlichkeit gegenüber Trypsin wurde durch 10-minütige Inkubation der Kulturüberstände in Anwesenheit von 0,02 mg/ml Trypsin (Sigma) bei 37ºC getestet, gefolgt von der Zugabe von 0,03 mg/ml Trypsin-Inhibitor (Sigma) und einer weiteren 10-minütigen Inkubation bei 37ºC. Das gereinigte Hämolysin, das 0,6 mg/ml enthielt, wurde mit 0,1 mg/ml Proteinase K 3 Stunden bei 37ºC inkubiert und anschliessend einer SDS-PAGE unterzogen. Die Stabilität des gereinigten Hämolysins wurde durch Lagerung der Präparate bei verschiedenen Temperaturen für unterschiedliche Zeitspannen und anschliessender Analyse in der SDS-PAGE getestet.

Ergebnisse

Hämolysine, die von den Referenzstämmen der Serotypen 1 und 58 gereinigt wurden, der im Verfahrensteil beschriebenen Methode folgend, zeigten nach der CBB-Färbung eine Bande in der SDS- PAGE bei 105 KD. Ein Gel-Scan des gereinigten Hämolysins von Serotyp 5b ist in Figur 4 dargestellt. Obwohl das offensichtliche MG in der SDS-PAGE ungefähr 105 KD zu betragen scheint, blieb das native Hämolysin bei der Filtration unter Verwendung eines Filters mit einer MG-Durchlassgrösse von 300 KD zurück. Darüber hinaus wurde von dem durch die Gelfiltration erhaltenen Profil geschlossen, dass das native Hämolysin oder Aggregate davon ein MG von mindestens 10x10&sup6; D haben (Figur 5). Unter Verwendung einer Sephacryl S-1000-Säule (Pharmacia) mit bovinem Thyroglobulin (ungefähres MG 669 KD; Sigma) als Markerprotein, wurde Hämolysin direkt nach dem Leervolumen eluiert, wohingegen Thyroglobulin zurückblieb.
Das Protein-Kohlenhydratverhältnis der gereinigten Hämolysinpräparate betrug ungefähr 10:1.
Rohe Hämolysinpräparate von Kulturüberständen der Referenzstämme, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, zeigen alle eine gleiche Bande bei 105 KD in der SDS-PAGE. Auch die Referenzstämme ohne hämolytische Aktivität, wie im beschriebenen Assay getestet, zeigten alle eine 105 KD grosse Proteinbande, gleich derjenigen, der hämolytischen Stämme.
Gereinigtes Hämolysin hatte noch hämolytische Aktivität, vorausgesetzt, dass die Reinigung innerhalb von zwei oder drei Tagen nach der Züchtung der Bakterien durchgefüht wurden. Die hämolytische Aktivität blieb stabil, wenn das Hämolysin bei -70ºC aufbewahrt wurde, ging aber innerhalb von wenigen Tagen nach der Lagerung bei 4ºC oder höheren Temperaturen verloren.
Auch in der SDS-PAGE war das 105 KD grosse Protein nicht stabil, wenn das gereinigte Hämolysin bei 4ºC oder höheren Temperaturen aufbewahrt wurde. Eine 7-tägige Lagerung des Hämolysins bei 4ºC, Raumtemperatur oder 37ºC verursachte einen schrittweisen Abbau des Molekulargewichts der Proteinbande bis ungefähr 65 KD nach Lagerung bei 37ºC. Als ein Beispiel zeigt Figur 6 Gel-Scans von gereinigtem Hämolysin, das bei -20ºC und bei 37ºC aufbewahrt wurde.
Hämolytische Aktivität in Kulturüberständen von Stämmen, die zu den hämolytischen Serotypen gehören (siehe Tabelle 1), wurde vollständig durch 10-minütiges Erhitzen bei 60ºC zerstört. Hämolytische Aktivität der Kulturüberstände war ebenfalls empfindlich gegenüber Proteinase K- oder Trypsin-Behandlung. Zugabe von 0,5% Formalin zu den Kulturen und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur oder bei 37ºC zerstörte ebenfalls die hämolytische Aktivität.

3. Testen der Antigenität des gereinigten Hämolysin und Kreuzreaktion der Antiseren

Verfahren

Seren von rekonvaleszenten Schweinen wurden von Schweinen gewonnen, die eine experimentelle Infektion mit den App-Serotypen 1, 2, 5a oder 9 überlebt hatten, aber signifikante, für App typische Lungenläsionen entwickelt hatten.
Hyperimmunseren wurden in Hasen durch zwei intramuskuläre Injektionen in einem Intervall von 6 Wochen mit gereinigtem Hämolysin hergestellt, das von Referenzstämmen des Serotyps 1 oder des Serotyps 5b, wie zuvor beschrieben, gereinigt wurde. Die Hasen wurden mit zwei Dosen von 100 ug gereinigtem Hämolysin vom Serotyp 1 in Freund'schem vollständigen, beziehungsweise unvollständigem Adjuvans immunisiert. Die Hasen wurden mit zwei Dosen von 25 ug gereinigtem Hämolysin vom Serotyp 5b in einer Tocolderivatemulsion immunisiert.
Hyperimmunseren wurden ebenfalls gegen Hämolysin, das vom App- Serotyp 5b gereinigt wurde, in Hasen hergestellt, das Hämolysin wurde für einen längeren Zeitraum bei verschiedenen Temperaturen gelagert: -70ºC, 4ºC und Raumtemperatur. Die Hasen erhielten zwei intramuskuläre Dosen von 25 ug Hämolysin in einer Wasser-in-Öl-Emulsion in einem Intervall von 6 Wochen. Das Alter der Präparate, die bei verschiedenen Temperaturen aufbewahrt wurden, betrug 75 Tage beim Priming und 118 Tage bei der Booster-Injektion. Alle Tiere hatten SPF-Qualität oder waren zumindest App-frei, wie serologisch mit den Präimmunseren getestet wurde (ELISA, Western Blot). Antiseren wurden zwei Wochen nach der Booster-Injektion gewonnen.
Monoklonale Antikörper (MAb) produzierende Hybridomazellinien wurden gemäss Standardverfahren hergestellt. Balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem Hämolysin vom App-Serotyp 1 immunisiert, Milzzellen wurden mit Ag8-Myelomazellem fusioniert und positive Hybridomazellen wurden mittels limitierender Verdünnung kloniert. MAb wurden von dem Hybridomakulturüberstand oder von der Mausascitesflüssigkeit geerntet.
ELISA (enzymgebundener immunadsorbierender Assay) wurde gemäss Standardverfahren, unter Verwendung von gereinigtem Hämolysin des Serotyps 1 und des Serotyps 5b als überziehende Agentien durchgeführt. Antiseren wurden 1:100 vorverdünnt, bevor die Serienverdünnungen hergestellt wurden. Hintergrungadsorptionswerte wurden von dem 1:100-verdünnten Präimmunserum ausgehend berechnet.
Western Blots mit rohen Hämolysinpräparaten und gereinigtem Hämolysin wurden, wie zuvor beschrieben, durchgeführt.
Neutralisation der hämolytischen Aktivität durch Antiseren wurde wie folgt getestet: Kulturüberstände wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Antiseren wurden 1:25 vorverdünnt und Serienverdünnungen in TBS hergestellt. Gleiche Volumen an unverdünntem Kulturüberstand wurden zu den Antiserumverdünnungen zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC. Diese Mischung wurde, wie zuvor beschrieben, auf hämolytische Aktivität getestet. Die Neutralisationstiter wurden als diejenige Serumverdünnung definiert, die 50% Hämolyse relativ zu dem zweifach verdünnten Kulturüberstand ergaben. Präimmunseren dienten als Negativkontrolle in jeden Assay.

Ergebnisse

Wie in Tabelle 2 gezeigt, enthielten Seren von rekonvaleszenten Schweinen, die eine Infektion mit dem Serotyp 1, 5a oder 9 überlebten, hohe Antikörpertiter im ELISA gegen Hämolysin, das von den Serotypen 1 und 5b gereinigt wurde und neutralisierten die hämolytische Aktivität der Kulturüberstände der App- Serotypen 1, 5b und 9. Serotyp 2-Serum von rekonvaleszenten Schweinen enthielt nur niedrige Antikörpertiter im ELISA gegen das Hämolysin der Serotypen 1 und 5b, wohingegen eine Neutralisation der hämolytischen Aktivität nicht nachgewiesen werden konnte.
Hyperimmunes Hasenantiserum, das gegen gereinigtes Hämolysin der App-Serotypen 1 und 5b gezüchtet wurde, zeigten hohe Antikörpertiter im ELISA, sowohl gegen das Hämolysin vom Serotyp 1 als auch gegen 5b und beide Antiseren zeigten Neutralisation des Hämolysins vom Serotyp 1, 5b und 9.
Vier verschiedene, gegen das App-Hämolysin vom Serotyp 1 gerichtete MAb, besassen hohe Titer im ELISA gegen Hämolysin vom Serotyp 1 und vom Serotyp 5b, zeigten jedoch keine Neutralisation der hämolytischen Aktivität. Alle vom App-Serotyp 1 getesteten Antiseren (Serum von rekonvaleszenten Schweinen, hyperimmunes Hasenserum und MAb) reagierten im Western Blot mit der 105 KD grossen Bande des gereinigten Hämolysin vom Serotyp 1 und 5b als auch mit der 105 KD grossen Bande in rohen Hämolysinpräparaten aller App-Serotypen (1-12). Als ein Beispiel zeigt Figur 7 den Western Blot roher Hämolysinpräparate und gereinigtem Hämolysin vom App-Serotyp 5b mit einem der MAb.
Es wurde 1) geschlossen, dass das 105 KD grosse, labile Hämolysin sowohl bei einer akuten Infektion antigen wirkt, als auch nach der Immunisierung mit gereinigtem Hämolysin; 2) dass die anti-Hämolysin-Antikörper Kreuzreaktion mit einem gleichen 105 KD grossen Antigen zeigen, das von allen App-Serotypen (1-12) hergestellt wird, einschliesslich den Stämmen ohne hämolytische Aktivität, die wie in dem beschriebenen Assay getestet wurden; 3) dass die hervorgerufenen Antikörper Kreuzneutralisation der hämolytischen Aktivität verschiedener Serotypen zeigen, vorausgesetzt, dass die Antikörper von einem 105 KD grossen Antigen von einem hämolytischen Serotyp induziert wurden. Offensichtlich erkennen die MAb Epitope, die nicht an der hämolytisch Aktivität beteiligt sind.
Wie zuvor gezeigt, resultiert die Lagerung von gereinigtem Hämolysin bei einer Temperatur von 4ºC oder höher in einer schrittweisen Abnahme des offensichtlichen MG in der SDS-PAGE, von 105 KD bis 65 KD. Antiseren, wie in Tabelle 2 aufgeführt, die gegen das 105 KD grosse Hämolysin gerichtet sind, reagierten im Western Blot noch mit gealterten Hämolysinpräparaten mit verringertem MG (Daten nicht gezeigt). Die antigenen Eigenschaften der gealterten Präparate nach der Immunisierung von Hasen sind in Tabelle 3 dargestellt. Es wurde geschlossen, dass das gealterte Hämolysin mit einem verringerten offensichtlichen MG in der SDS-PAGE immer noch Antikörper hervorruft, die mit dem ursprünglichen 105 KD grossen Hämolysin der Serotypen 1 und 5b reaktionsfähig sind. Eine geringe Abnahme der Antikörpertiter konnte beobachtet werden, aber auch die Immunisierung mit dem 65 KD grossen gealterten Hämolysinpräparat lieferte Antiseren mit sehr hohen Antikörpertitern. Diese Antikörper zeigten auch Neutralisation der hämolytischen Aktivität. Tabelle 2. Kreuzreaktionen der Antiseren mit Hämolysinpräparaten. Antiseruma) (Serotyp) ELISAb) Blotc) Neutralisationd)
a) CPS = Seren von rekonvaleszenten Schweinen, die mit dem angezeigten App-Serotyp infiziert wurden.
HRS = hyperimmune Hasenseren gegen gereinigtes Hämolysin des aufgeführten Serotyps.
Mab = 4 verschiedene monoklonale Antikörper, die gegen das Hämolysin vom App-Serotyp 1 hergestellt wurden.
PPS und PRS: Präimmune Schweine- beziehungsweise Kaninchenseren.
b) Antikörpernachweis im ELISA gegen gereinigtes Hämolysin der App-Serotypen 1 und 5b;
- = Titer < 100, + = 100< Titer< 1000; ++ = Titer > 1000
c) Reaktion mit der 105 KD grossen Bande in rohen Hämolysinpräparaten aller App-Serotypen (1-12) und in gereinigtem Hämolysin der App-Serotypen 1 und 5b; nt = nicht getestet.
d) Neutralisation der hämolytischern Aktivität im Kulturüberstand der App-Serotypen 1, 5b und 9. Tabelle 3. Antigene Eigenschaften der gealterten gereinigten Hämolysine des App-Serotyps 5b (mittleren Werte von 3 Hasenseren pro Präparat). Antigen gelagert bei prominente Bande(n) in der SDS-PAGE bei ELISAa) Raumtemperatur
a) ¹&sup0;log-Titer im ELISA gegen gereinigtes 105 KD grosses Hämolysin der App-Serotypen 1 und Sb.

Beispiel 3

Schutz von Schweinen gegen App-Challenge durch Impfung

Verfahren

Challenge von Schweinen mit App wurde durch Aerosolaussetzung unter Verwendung eines DeVilbiss 65 Ultraschallsprühers (DeVilbiss Co., Pennsylvania, USA) durchgeführt. Die Verwendung dieses Sprühers wurde von Sebunya et al. (Can. J. Comp. Med. 47, 48-53, 1983) zur Untersuchung der App-Pathogenese und genauer, zur Beurteilung von Impfstoffen empfohlen.
Die Challenges wurden mit den App-Referenzstämmen der Serotypen 1 und 5a (Tabelle 1) durchgeführt. Bakterien wurden jeweils ungefähr 6 Stunden entweder in Gehirn-Herz-Infusions-Bouillon, die mit 0,01% NAD supplementiert war, oder in mit 1% IsoVitaleX und 0,01% NAD supplementierter Columbia-Bouillon gezüchtet, durch Zentrifugation geerntet und in Salzlösung bis zur gewünschten Konzentration resuspendiert. Zählungen der lebensfähigen Bakterien wurden auf Schokoladenagarplatten durchgeführt.
Die Tiere wurden nach dem Challenge unter negativem Druck unter SPF-Bedingungen in kontrollierten Schutzräumen untergebracht.
Für den Challenge wurden ungefähr 50 ml einer bakteriellen Suspension während 15 Minuten versprüht. Der Spüher wurde ausserhalb des Challengeraums plaziert und sein Aerosolraum wurde durch die Wand mit einer perforierten Leitung, die ungefähr 1,50 m über dem Boden angebracht war, verbunden. Alle geimpften und Kontrolltiere in einem Experiment wurden zusammen in demselben Challengeraum behandelt. Die Tiere wurden während zwei Wochen nach dem Challenge beobachtet. Todesfälle, als auch die nach zwei Wochen überlebenden Schweine wurden postmortem auf pathologische Läsionen hin untersucht. Typische, durch App verusachte Lungenläsionen, hämorrhagische, nekrotisierende, fibrinöse Pleuropneumonie wurden auf einer Skala von 0-4 auf der Basis des Prozentanteils der befallenen Lunge bewertet: 0 = keine Läsionen, 1 = < 25% befallen; 2 = > 25%, jedoch < 50% befallen; 3 = > 50%, jedoch < 75% befallen; 4 = 75% befallen.
Die Versuche wurden mit Schweinen unterschiedlichen Ursprungs durchgeführt, die in verschiedenen Altersstufen mit unterschiedlichen Impfstoffen und antigenen Dosen geimpft wurden und bei denen der Challenge mit Bakterien der App-Serotypen 1 und 5a durchgeführt wurde. Alle Impfstoffe wurden intramuskulär in den Hals, jeweils in 2 ml-Dosen verabreicht. Der Zeitraum zwischen der ersten und der zweiten Impfung betrug 6 Wochen, wobei der Challenge der Schweine 2 Wochen nach der zweiten Impfung durchgeführt wurde. Antigendosen, die in den Impfstoffen enthalten waren, wurden auf der Basis der Gesamtproteininhalte der gereinigten Präparate berechnet.
Als Antigen wurde ein Präparat des 42 KD grosse Aussenmembranproteins (OMP) verwendet, das wie in Beispiel 1.1 beschrieben gereinigt wurde, sowie das wie in Beispiel 2.2 beschrieben gereinigte Hämolysin (Hly) oder 2 käuflich erhältliche Impfstoffe, die inaktivierte App-Bakterien von verschiedenen Serotypen enthielten. Diese Bakterine wurden gemäss der Anleitung des Herstellers verabreicht. Weitere Einzelheiten von jedem Versuch sind in dem Ergebnisteil dargelegt.

Ergebnisse

Von Versuch 1 (Tabelle 4) wurde geschlossen, dass beide käuflich erhältlichen Bacterine keinen Schutz gegen einen Challenge induzierten, obwohl in beiden Bacterinen inaktivierte Bakterien des gleichen Serotyps wie der des Challenge-Stamms (App 1) vorhanden waren.
In Versuch 2 (Tabelle 5) wurde festgestellt, dass nach der Impfung von Schweinen mit der Kombination von Hämolysin und dem 42 KD OMP-Präparat, beide aus App 1 gereinigt, ein beinahe vollständiger Schutz gegen einen Challenge mit App 5a bezüglich Mortalität und Lungenläsionen beobachtet wurde. Die mittlere Lungenläsionsrate von 0,3 bedeutet in diesem Fall, dass nur ein Schwein ein kleines App-Lungenknötchen bei der Sektion aufwies.
In Versuch 3 (Tabelle 6) wurden sehr junge Schweine mit verschiedenen Dosen der Kombination aus Hämolysin, das von dem App-Serotyp 5b gereinigt wurde und dem 42 KD OMP-Präparat, das von dem Serotyp 1 gereinigt wurde, geimpft und der Challenge wurde im Anschluss mit App vom Serotyp 1 durchgeführt. Im Vergleich mit den Kontrolltieren waren alle Schweine, die mit den verschiedenen antigenen Dosen geimpft wurden, vollständig geschützt, sowohl hinsichtlich der Mortalität durch die App- Infektion, als auch der App-Lungenläsionen. Versuch 4 (Tabelle 7) ist dem Versuch 3 sehr ähnlich, mit dem einzigen Unterschied des Ursprungs und Status der Schweine. Wurden in Versuch 3 SPF- Schweine ohne mütterliche Antikörper gegen die Antigene des Impfstoffs verwendet, wurden in Versuch 4 Schweine verwendet, die von Muttertieren mit hohen Antikörpertitern gegen die Impfstoffkomponenten geboren wurden. Zum Zeitpunkt der Impfung im Alter von 5 Wochen hatten die Schweine Antikörpertiter zwischen 1:100 und 1:1000 gegen die beiden Impfstoffkomponenten Hämolysin und 42 KD OMP. Ebenfalls in diesem Versuch, unter Verwendung von Schweinen mit mütterlichen Antikörpern, schützte die Impfung mit der Kombination aus Hämolysin und dem 42 KD OMP gegen einen Challenge mit dem App-Serotypen 1.
Von diesen Impfversuchen wurde geschlossen, dass die Impfung von Schweinen mit Hämolysin und dem 42 KD OMP-Präparat zusammen einen vollständigen Schutz gegen einen App-Challenge induzierte. Der Schutz war nicht nur gegen den homologen App-Serotyp (Antigene, die vom gleichen Serotyp, wie der App-Serotyp gereinigt wurden) gerichtet, sondern auch gegen heterologe App- Serotypen (Antigene, die von App-Serotypen gereinigt wurden, die verschieden von den App-Challenge-Serotypen waren). Tabelle 4. Impfversuch Nr 1a) Impfstoffb) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Delsuvac HP Pleurovac Kontrolle (Bacterin)
a) SPF-Schweine; erste Impfung im Alter von 12 Wochen; 3 oder 4 Schweine pro Gruppe.
b) Delsuvac HP von Mycofarm, Niederlande, Bakterien der App- Serotypen 1, 2, 3, 6, 8 und 9 enthaltend. Pleurovac von Bloxham Veterinary Products Ltd., Irland, Bakterien der App-Serotypen 1, 2, 3, 4, 6 und 8 enthaltend.
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 1x10&sup9;/ml
d) App-Lungenläsionsrate auf einer Skala von 0-4, basierend auf dem Prozentsatz der angegriffenen Lunge: 0 = keine Läsionen, 1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = > 75%. Tabelle 5. Impfversuch Nr. 2a) Impfstoffb) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis (ug) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Kontrolle
a) Käuflich erhältliche App-freie Schweine; erste Impfung im Alter von 8 Wochen, 3 Schweine pro Gruppe.
b) Impfstofformulierung: Wasser-in-Öl-Emulsion
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 6x10&sup6;/ml
d) siehe Legende Tabelle 4 Tabelle 6. Impfversuch Nr. 3a) Impfstoffb) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis (ug) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Kontrolle
a) SPF-Schweine; erste Impfung im Alter von 4 Wochen; 3 Schweine pro Gruppe
b) Impfstofformulierung: Tocolderivatemulsion
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 7,4x10&sup8;/ml
d) siehe Legende Tabelle 4
e) in den gekennzeichneten Gruppen starb ein Tier aus unbekannter Ursache, ohne typische App-Zeichen oder Pathologie. Tabelle 7. Impfversuch Nr. 4a) Impfstoffb) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis (ug) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Kontrolle
a) Käuflich erhältliche Schweine mit mütterlichen Antikörpern; erste Impfung im Alter von 5 Wochen; 3 Schweine pro Gruppe
b) Impfstofformulierung: Tocolderivatemulsion
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 7,4x10&sup8;/ml
d) siehe Tabelle Legende 4

Beispiel 4

1. Cytotoxische Aktivität der App-Stämme

Verfahren

Zum Testen der Cytotoxizität wurden Überstände der App-Kulturen mit Macrophagen aus Alveolaren von Schweinen inkubiert. Alveolare Macrophagen wurden durch Spülen der Schweinelungen mit Hank's Balanced Salt Solution (Flow), die mit 0,01 M EDTA und 20 mM HEPES, pH 7,4 supplementiert war, gespült. Die Zellen wurden 3 mal in der gleichen Lösung ohne EDTA gewaschen und nach der letzten Zentrifugation wurden die Zellen in mit 10% foetalem Kälberserum (Gibco) supplementiertem RPMI 1640-Medium (Flow) gelöst und abschliessend auf eine Konzentration von 2x10&sup6;/ml eingestellt.
Gewebekulturplatten (24 Vertiefungen, Costar) mit runden Glasabdeckplättchen (∅12 mm; Tamson) wurden verwendet und in jede Vertiefung wurden 0,5 ml der endgültigen Zellsuspension ausgesät und die Macrophagen konnten sich 2 Stunden bei 37ºC in einer 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre anheften. Anschliesend wurden die Platten 3 mal mit RPMI ohne Serum gewaschen.
Bakterien wurden in Columbia-Bouillon (Difco), die mit 0,01% β- NAD (Sigma) supplementiert war, bei 37ºC 3 bis 6 Stunden bis zur Mitte-Ende-log-Phase inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation entfernt und 0,5 ml des Überstands wurden pro Vertiefung zu den Gewebekulturplatten mit den Macrophagen gegeben. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Abdeckplättchen mit den Macrophagen 3 mal mit RPMI 1640 gewaschen und umgekehrt auf ein Glasplättchen auf einen Tropfen von 20 ul einer 0,05%-igen Trypanblaulösung (Merck) in PBS plaziert. Die Prozentzahl der toten Zellen, die sich blau durch die Aufnahme von Trypanblau färbten, wurde durch Phasenkontrastmikroskopie bestimmt. Negative Kontrollen bestanden aus Macrophagen, die mit Columbia-Bouillon inkubiert wurden.

Ergebnisse

Wie in Tabelle 8 gezeigt, waren alle App-Referenzstämme für alveolare Macrophagen cytotoxisch, eine Aktivität, die von den Bakterien ausgeschieden wurde. Negative Kontrollen zeigten 10% oder weniger Toxizität für Macrophagen.
Während die Cytotoxizität der hämolytischen Stämme dem in Beispiel 2 beschriebenen Hämolysin zugeschrieben werden kann, sollten die nichthämolytischen Stämme andere toxische Moleküle herstellen. Im Gegensatz zu der hämolytischen Aktivität, wurde die Macrophagentoxizität auch exprimiert, wenn die Bakterien in Abwesenheit von supplementiertem CaCl&sub2; gezüchtet wurden. Tabelle 8 Toxizität für alveolare Schweinemakrophagen, hämolytische Aktivität und SDS-PAGE der Überstände der App-Referenzstämme Serotyp (Ref.-Stamm) Toxizität für Macrophagena) hämolytischb) Anwesenheit in der SDS-PAGE
a) Prozentsatz der toten Macrophagen, bestimmt wie in dem Verfahrensteil dieses Beispiels beschrieben.
b) Hämolytisch, wie in dem in Beispiel 2.1 beschriebenen Assay bestimmt.
c) Eine sichtbare Bande, die etwas höher als die 120 KD- Position liegt und die nicht mit dem monoklonalen Antikörper Int 33-8 reagiert (siehe Beispiel 4.3).

2. Reinigung und Charakterisierung des App-Makrophagentoxins Mat

Verfahren

Zur Reinigung der toxischen Aktivität der Macrophagen vom App- Serotyp 2, wurde ein nichthämolytischer Stamm gemäss Beispiel 2 in Columbia-Bouillon, die mit 0,01% NAD supplementiert war, bei 37ºC ungefähr 6 Stunden gezüchtet. Die weitere Reinigung wurde im wesentlichen wie in Beispiel 2.2 für die Hämolysin-Reinigung beschrieben durchgeführt, einschliesslich dem Entfernen der Bakterien durch Zentrifugation, Konzentrierung des Kulturüberstands durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters mit einer MG-Durchlassgrösse von 300.000 und Eluieren des Konzentrats aus einer Sepharose CL4B-Säule. Der erste eluierte Peak enthielt die toxische Aktivität. Das Toxin konnte durch einen 0,45 um Celluloseacetatfilter (Sartorius) ohne Verlust der Aktivität oder des Antigens filtriert werden.
Rohe Mat-Präparate wurden von allen Serotypen durch Ammoniumsulphatfällung der Kulturüberstände hergestellt. Alle Präparate wurden, wenn nicht anders angegeben, bei -70ºC oder -20ºC aufbewahrt.
Hitzeempfindlichkeit, Proteinase K-Empfindlichkeit und Stabilität des Mat wurden wie in Beispiel 2.2 für Hämolysin beschrieben, getestet. SDS-PAGE wurde gemäss dem Verfahren von Laemmli durchgeführt.
Analyse der N-terminalen Aminosäuren wurde mit einer Probe durchgeführt, die erhalten wurde, nachdem das Mat-Präparat wie oben beschrieben einer Elektrophorese und Elektroblotting unterzogen wurde.
In Kürze, PAGE-Gele wurden mit einem Laufpuffer hergestellt, der in dem Laemmli-System verwendet wird (Nature 227, supra). Nach der Elektrophorese werden die Proteine auf PVDF (Immobilon-P , Water/Millipore) geblottet, unter Verwendung von 10 mM CAPS, pH 9-11, 10% Methanol als Transferpuffer. Die Proteine des Blots wurden für die Sequenzanalyse durch Edman- Abbau mit einem automatischen Sequenziergerät (pulse-liquid, Model 477A, Applied Biosystems) verwendet, das direkt mit einer HPLC (Model 120A, Applied Biosystems) zur Identifizierung der schrittweisen Freisetzung der PTH-Aminosäuren, verbunden war.

Ergebnisse

Macrophagentoxin (Mat), das von dem Referenzstamm vom Serotyp 2 durch das oben beschriebene Verfahren gereinigt wurde, zeigte noch toxische Aktivität, vorausgesetzt, dass die Reinigung innerhalb von 2 bis 3 Tagen bei 4ºC durchgeführt wurde. Da der Referenzstamm vom Serotyp 2 ein inaktives Hämolysin, wie in Beispiel 2 beschrieben produziert, wird die 120 KD grosse Bande dahingehend gedeutet, dass sie das Mat darstellt.
Auswertung der rohen Mat-Präparate zeigte dieselbe 120 KD grosse Bande in der SDS-PAGE in den Überständen der Serotypen 2, 3, 4, 6 und 8. Der Überstand der Serotyp 10-Kultur zeigte eine Bande bei einer Position, die etwas höher als die 120 KD-Bande lag (Tabelle 8). Eine ähnliche 120 KD grosse Bande wurde ebenfalls in einer Anzahl von Feldisolaten der Serotypen 2 und 5 beobachtet.
Die Macrophagentoxizität wurde nach 15-minütiger Behandlung der MAT-Präparate bei Temperaturen von mindestens 60ºC oder nach Proteinase K-Behandlung völlig zerstört. Das 120 KD-Protein der SDS-PAGE war bei einer Lagerung bei -20ºC stabil, 3 Monate Lagerung bei +4ºC resultierten jedoch in einer Zersetzung der 120 KD-Bande in der SDS-PAGE.
Die Analyse der N-terminalen Aminosäurensequenz des Mat zeigte die folgende Aminosäurensequenz:
Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met;
(?) bedeutet eine unverbindliche Zuordnung der Aminosäure.

3. Anticenität des Macrophacentoxins (Mat) und Kreuzreaktivität der Antiseren

Verfahren

Seren von rekonvaleszenten Schweinen, wie in Beispiel 2.3 beschrieben, wurden verwendet. Monoklonale Antikörper (MAb) produzierende Hybridomazellinien wurden gemäss Standardverfahren hergestellt; durch Screening wurden Hybridomas selektioniert, die MAb produzierten, welche mit gereinigtem Mat des Serotyps 2, jedoch nicht mit gereinigtem Hämolysin der App-Serotypen 1 oder 5b im ELISA reagierten.
Western Blotting wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Neutralisation der Mat-Aktivität wurde mittels Zugabe gleicher Volumen des App-Kulturüberstands zu Antiserumverdünnungen getestet, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC, vor dem wie in Beispiel 4.1 beschriebenen Toxizitätstest.

Ergebnisse

Seren von rekonvaleszenten Schweinen, die eine Infektion mit dem App-Serotyp 2 überlebten, jedoch nicht die Seren von Schweinen, die mit den App-Serotypen 1, 5a und 9 infiziert wurden, erkannten die 120 KD Bande der Mat-Präparate im Western Blot. Rekonvaleszente Seren vom Serotyp 2 neutralisierten ebenfalls Mat-Aktivität.
MAb-Int 33-8 neutralisierten Mat-Aktivität und kreuzreagierten im Western Blot mit einer 120 KD grossen Bande in rohen Mat- Präparaten der Serotypen 2, 3, 4, 6 und 8, jedoch nicht mit anderen (Referenz-)Serotypen (Figur 8).
Eine Reaktion mit einer 120 KD-Bande wurde ebenfalls in rohen Mat-Präparaten von Feldisolaten vom Serotyp 2 und in einigen Serotyp 5-Feldisolaten beobachtet.
MAb Int 33-4 reagierte im Western Blot nur mit der 120 KD-Bande von Serotyp 2-Präparaten und nicht mit Präparaten von anderen Serotypen.
Wie zuvor beschrieben, resultierte die 3-monatige Lagerung des gereinigten Mat bei 4ºC in einer Zersetzung der 120 KD grossen Bande, wie in der mit CBB gefärbten SDS-PAGE zu sehen ist. Western Blotting solcher alten Präparate zeigten jedoch Banden bei ungefähr 70-80 KD, die mit Mab Int 33-8 reagierten.

Beispiel 5

Schutz von Schweinen gegen App-Challenge durch Impfung mit einem trivalenten Impfstoff

Verfahren

Challenge wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. In einem Versuch (Nr. 8) wurde der Challenge der Schweine intranasal mit 1 ml einer 6 Stunden-Kultur durchgeführt, die 106 lebende Bakterien enthielt. Die für den Challenge verwendeten Stämme waren der App-Referenzstamm vom Serotyp 1 oder App- Feldisolate der Serotypen 2 oder 9.
Die Impfung wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Antigendosen, die in den Impfungen enthalten waren, wurden auf der Basis der Gesamtproteininhalte der gereinigten Präparate berechnet. Als Antigene wurden das 42 KD grosse Aussenmembranprotein (OMP) verwendet, das wie in Beispiel 1.1 beschrieben gereinigt wurde, das 105 KD grosse Hämolysin (Hly), das wie in Beispiel 2.2 beschrieben gereinigt wurde und das 120 KD grosse Macrophagentoxin (Mat), welches wie in Beispiel 4.2. beschrieben, gereinigt wurde.
Weitere Einzelheiten eines jeden Vesuchs sind in den Ergebnissen dargestellt.

Eraebnisse

In Versuch 5 (Tabelle 9) wurde der bivalente Impfstoff aus dem 105 KD grossen Hämolysin und dem 42 KD grossen OMP, der ebenfals in Beispiel 3 verwendet wurde, auf seinen Schutz gegen einen Challenge mit dem App-Serotyp 2 getestet. Wie dargestellt, induzierte der Impfstoff einen gewissen Schutz gegen Läsionen, schützte jedoch nicht vollständig gegen einen Challenge mit dem App-Serotypen 2.
Im Versuch 6 (Tabelle 10) wurden Schweine entweder mit einem Impfstoff geimpft, der das 120 KD grosse, vom Serotyp 2 gereinigte Macrophagentoxin (Mat) und das 42 KD grosse, vom Serotyp 1 gereinigte OMP enthielt, oder mit einem Impfstoff, der das 120 KD grosse, vom Serotyp 2 gereinigte Mat, das 42 KD grosse vom Serotyp 1 gereinigte OMP und das 105 KD grosse, vom Serotyp 5b gereinigte Hämolysin (Hly) enthielt. Es wurde festgestellt, dass der bivalente, das 120 KD grosse Mat und das 42 KD grosse OMP enthaltende Impfstoff nicht gegen Läsionen nach einem Challenge mit dem App-Serotyp 1 schützte. Dieser Mangel an Schutz wurde erwartet, da der Impfstoff gemäss Beispiel 3 das 105 KD grosse Hämolysin enthalten muss, um gegen den App-Serotyp 1 zu schützen, und der für den Challenge verwendete App-Stamm vom Serotyp 1 exprimierte nicht das 120 KD grosse Mat.
Überraschenderweise induzierte die Zugabe des 105 KD grossen Hly zu dem bivalenten Impfstoff, welche von Zellen des Serotyps 5b gereinigt wurde, vollen Schutz gegen ein Challenge mit dem App-Serotypen 1.
Im Versuch 7 (Tabelle 11) wurden die gleichen bivalenten und trivalenten Impfstoffe wie in Versuch 6 auf ihren Schutz gegen einen Challenge mit dem App-Serotyp 2 getestet. Wie dargestellt schützen beide Impfstoffe sehr gut gegen einen Challenge mit dem App-Serotypen 2, beide hinsichtlich Mortalität und Lungenläsionen. Zugabe des 120 KD grossen Mat zu dem bivalenten 105 KD Hly/42 KD grossen OMP-Impfstoff macht den Impfstoff auch gegen den App-Serotyp 2 schützend.
Im Versuch 8 (Tabelle 12) wurde festgestellt, dass der gleiche, wie in Versuch 7 verwendete trivalente Impfstoff, der das 120 KD grosse Mat, das 42 KD grosse OMP und das 105 KD grosse HLY enthielt, Schweine auch gegen einen vollständig heterologen Challenge mit einem App-Serotyp 9-Stamm schützte. Tabelle 9 Impfversuch Nr. 5a) Impfstoffb) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis Kontrolle
a) SPF-Schweine, erste Impfung im Alter von 12 Wochen; 3 Schweine pro Gruppe
b) Impfstofformulierung: Tocolderivatemulsion
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 1,9x10&sup8;/ml
d) siehe Legende Tabelle 4 Tabelle 10 Impfversuch Nr. 6a) Impfstoffb) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis Kontrolle
a) SPF-Schweine, erste Impfung im Alter von 7 Wochen; 3 Schweine pro Gruppe
b) Impfstofformulierung: Tocolderivatemulsion
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 2,1x10&sup9;/ml
d) siehe Legende Tabelle 4 Tabelle 11 Impfversuch Nr. 7a) Impfstoffb) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis Kontrolle
a) SPF-Schweine, erste Impfung im Alter von 12 Wochen; 3 Schweine pro Gruppe
ausser*, wo ein Schwein vor dem Challenge starb
b) Impfstofformulierung: Tocolderivatemulsion
c) Lebensfähige Anzahl der Challenge-Suspension: 5x10&sup8;/ml
d) siehe Legende Tabelle 4 Tabelle 10 Impfversuch Nr. 8a) Impfstoffb) Challenge Stammc) (Serotyp) Mortalität (Todesfälle/gesamt) Mittlere Lungenläsionend) Antigen (von Serotyp) Antigen Dosis Kontrolle
a) SPF-Schweine, erste Impfung im Alter von 8 Wochen; 8 Schweine pro Gruppe
b) Impfstofformulierung: Tocolderivatemulsion
c) Intranasaler Challenge mit 10&sup6; lebenden Bakterien
d) siehe Legende Tabelle 4

Legenden zu den Figuren

Figur 1 Scan der SDS-PAGE, der mit dem angereicherten 42 KD- OMP-Präparat durchgeführt wurde.
Figur 2 Western Blot der Proteinase K-OMP-Präparate mit Serum von rekonvaleszenten Schweinen. Spalten 1 und 4: rohes OMP; Spalten 2, 3, 5 und 6: gereinigtes OMP; Spalten 1-3: leerbehandelt; Spalten 4-6: Proteinase K- behandelt.
Figur 3 Western Blotting von bakteriellen Lysaten mit post- Vakzinationsserum.
Figur 4 Scan der SDS-PAGE, die mit gereinigtem Hämolysin (B) und Markerproteinen (A) durchgeführt wurde.
Figur 5 Elutionsprofil des Hämolysins unter Verwendung einer Sephacryl S-1000-Säule.
Figur 6 Gel-Scans von Markerproteinen (A) und gereinigtem Hämolysin, das bei -20ºC oder 37ºC (B) aufbewahrt wurde.
Figur 7 Western Blotting von rohen Hämolysinpräparaten und gereinigtem Hämolysin (*) vom App-Serotyp 5b mit monoklonalen Antikörpern, die gegen Hämolysin vom App-Serotyp 1 hergestellt wurden.
Figur 8 Western Blotting von rohen Mat-Präparaten mit monoklonalen Antikörpern, die gegen das Mat des App-Serotyps 2 hergestellt wurden.

Claims

1. Impfstoffzusammensetzung zum Schutz von Schweinen gegen Actinobacillus pleuropneumonia-Infektion, welche im wesentlichen frei von vollständigen A. pleuropneumoniae- Zellen ist, dadurch gekennzeichnet, dass genannter Impfstoff von einem Proteinpräparat der äusseren Membran von A. pleuropneumoniae mit einer bedeutenden, dominanten, antigenen Proteinkomponente von ungefähr 42 KD, die in einer SDS- PAGE gemessen wurden, stammt und mindestens einem Toxin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

1. einem Hämolysin von A. pleuropneumoniae von ungefähr 105 KD in SDS-PAGE, und

2. einem Makrophagentoxin von A. pleuropneumoniae von ungefähr 120 KD in SDS-PAGE.

2. Impfstoff gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff aus dem Proteinpräpaparat der äusseren Membran, dem Hämolysin und dem Makrophagentoxin, besteht.

3. Impfstoff gemäss Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff von dem Hämolysin der Zellen vom Serotyp 1, 5a, 5b, 9, 10 oder 11 stammt.

4. Impfstoff gemäss Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff von dem Makrophagentoxin der Zellen vom Serotyp 2, 3, 4, 6 oder 8 stammt.

5. Impfstoff gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff von dem Proteinpräparat der äusseren Membran von Zellen des Serotyps 1 stammt, das Hämolysin von Serotyp 5b-Zellen und das Makrophagentoxin von Serotyp 2- Zellen stammt.

6. Impfstoff gemäss Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass genannter Impfstoff weiterhin antigenes Material anderer porciner Krankheitserreger umfasst.

7. Impfstoff gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der porcine Krankheitserreger Pseudorabiesvirus oder Schweineinfluenzavirus ist.

8. Impfstoff gemäss Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff ein Adjuvans umfasst.

9. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz von Schweinen gegen Actinobacillus pleuropneumoniae- Infektion, der im wesentlichen frei von vollständigen A. pleuropneumonia-Zellen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das von einem Proteinpräparat der äusseren Membran von A. pleuropneumoniae stammende antigene Material, das eine bedeutende, dominante, antigene Proteinkomponente von ungefähr 42 KD, die in einer SDS-PAGE gemessen wurde, besitzt und mindestens ein Toxin, das aus der Gruppe bestehend aus

2. ein Makrophagentoxin von A. pleuropneumoniae von ungefähr 120 KD in SDS-PAGE ausgewählt wird, gereinigt werden, gefolgt von Zumischen immunologisch wirksamer Mengen von:

dem antigenen A. pleuopneumonia-Material, das von genannter Proteinpräparation der äusseren Membran stammt und mindestens einem Toxin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

1. dem Hämolysin von A. pleuropneumoniae von ungefähr 105 KD in SDS-PAGE und

2. dem Makrophagentoxin von A. pleuropneumoniae von ungefähr 120 KD in SDS-PAGE.