TWI461529B - 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ之方法 - Google Patents

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Description

產製RTX毒素ApxI之方法
本發明關於經由將胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )培養在支持該細菌生長之培養基質中以產製RTX毒素ApxI的方法，該基質中加入鈣鹽以在基質中形成鈣離子。
豬胸膜肺炎(一種豬之重要呼吸疾病)遍佈全球並使豬工業因急病豬隻之急性死亡、治療及經慢性感染之動物延遲銷售而產生嚴重之經濟損失。該致病媒介為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )。其主要係藉由動物間之直接接觸傳染，所造成之感染產生的臨床病程變化可從特急性至慢性。此疾病主要為呼吸道感染，其臨床徵候為高燒、嚴重呼吸窘迫、咳嗽及厭食症。疾病開始得非常快且發病率及致死率高。控制胸膜肺炎放線桿菌(以下亦稱為“APP”)感染的方法之一係藉由疫苗接種方案進行。細菌素過去曾用於此類方案中，但已知其具有嚴重之副作用。現今則普遍使用以APP之毒素為底的次單位疫苗。
APP產生稱為RTX之毒素(RTX代表重複子毒素(repeat-in-toxin))。這些RTX-毒素之存在高度促成此細菌之致病性。RTX-毒素在過去已被廣泛檢閱並描述於文獻中。如眾所周知，並非所有之APP血清型均製造所有RTX-毒素。例如：血清型1、5、9及11產製ApxI及ApxII。血清型2、3、4、6及8產製ApxII及ApxIII。血清型10僅產製ApxI，且血清型7及12僅產製ApxII。目前市售之抗APP的疫苗係以毒素ApxI、ApxII及ApxIII為底。最近已發現所有APP血清型均產製第四種RTX毒素，現在稱為ApxIV(見EP 0 875 574)。
如何藉由在培養基質(其中加入鈣鹽，即，一種以酸為基礎之化學化合物，其係經由以一或多個鈣離子取代該酸之全部或部分氫離子來形成)中培養胸膜肺炎放線桿菌來產製RTX毒素ApxI乃眾所周知。特定言之，EP 0 453 024中已描述這類方法(見“實例2”，第2段“Purification and characterisation of hemolysin”，“方法”小段)。注意：ApxI過去係稱為“HLY”(見Frey et al. in“J Gen Microbiol. 1993 Aug;139(8): 1723-8”)。由此EP專利得知在基質中加入鈣化合物(CaCl2 )。確實，在Microbiol Pathogenesis 37(2004)29-33中陳述ApxI操縱子之轉錄活性可經由在生長基質中加入鈣來增加。以此方法可提供高濃度之ApxI。該基質必須支持APP細菌之生長。如何建構支持細菌生長之基質已普遍為眾人所知。傳統之培養基質係在1950及1960年代由伊果(Eagle)、漢姆(Ham)及其他人最先研發。他們發現滿足生長之基本需求的基質應包含無機鹽、氮來源(例如：為含氮化合物之形式，諸如肽類或蛋白質類)、碳來源及維生素。該基質係經適當緩衝以防止其變成太酸或太鹼。在此基礎配方內可取得許多不同之組成。例如，個人可選擇自動物衍生之組成分以提供胺基酸，但個人亦可選擇經化學定義之胺基酸。在其他化合物方面亦可有多種變化。確實，構成可支持細菌生長之基質很簡單。然而，將生長及/或代謝物之產製最優化可能需要一些研發時間，尤其是當基質宜不含血清及其他自動物衍生之組成分時。然而，改良發酵基質效能的策略為本技藝所周知且詳盡描述於文獻中(見，例如：在Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology(1999)23,456-475中Kennedy及Krouse所寫之評論文章)。這類最優化形成發酵實驗室中例行實驗之一部分。在培養APP之情況中，由於APP為NAD(菸醯胺腺嘌呤二核苷酸)倚賴性，NAD本質上形成基質之一部分。缺少NAD時，基質將無法支持胸膜肺炎放線桿菌生長，因此，在本申請案及附屬之申請專利範圍的觀念中不能被視為用於支持APP細菌生長之液態基質。用於支持細菌生長之基質或構成這類基質之組成分可從多家公司購得，諸如Sigma Aldrich、Quest International、Oxoid、Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc.、Mediatech、Invitrogen、Marcor、Irvin Scientific etc。
雖然先前技術方法足夠取得經濟相關產量之ApxI毒素，本申請者認定仍有改進之可能性。在發酵期間，該基質變成不透明。本申請者之功勞係了解這是由於一種(或更多)鈣鹽沈澱。即，APP產生二氧化碳，而二氧化碳在基質中造成碳酸鹽離子。碳酸鈣為溶解度特別低之鹽。因此，可能出現數種問題。首先，咸信，沈澱使鈣離子包含在其中而不會接觸APP菌。接著，沈澱之鈣鹽造成下游處理的問題。尤其是，濾器傾向變成淤塞。因此，本申請者在基質中加入不同之複合劑以研究其是否可防止鹽沈澱。確實，例如：藉由加入EDTA，該基質可多多少少保持透明。然而，使用這類複合劑將負面影響ApxI之產量。因此，該假說可能為錯誤或不完全。對改良ApxI產量之需求仍存在。
令人驚訝地，現已發現：與不使用(添加)複合劑或倚賴其他複合劑之先前技術方法相比較，當使用硼葡萄糖酸鹽(即，為2,3-二羥基-3-[2-羥基-5-(羥甲基)-1,3,2-二氧雜硼戊環-4-基]丙酸鹽；亦見，於1937年11月16日收到之Herbert Taylor MacPherson and James Stewart of the Moredun Institute in the Biochemical Journal;“Investigations on the nature of calcium borogluconate”)與鈣離子複合時，個人可製造高濃度之ApxI。顯然地，藉由使用此特殊複合劑而使該基質含有複合物硼葡萄糖酸鈣(如：可以帶有硼酸、鈣鹽2：1之D-葡萄糖醛酸、環形4,5-酯的形式取得)時可防止鈣離子與其他負離子之大量沈澱，但同時鈣離子仍可增加胸膜肺炎放線桿菌之ApxI操縱子的轉錄活性。顯然地，鈣離子被捕捉在鹽複合物中，其中該“捕捉”鍵一方面足夠強，可防止鈣離子與，例如：碳酸鹽或其他負離子形成沈澱，但另一方面則不會阻止細菌本身使用鈣離子，彷彿其係在游離溶液中般(即，僅與水分子複合)。顯然地，硼葡萄糖酸鹽確實實現APP產製ApxI時所需要之必要的平衡。
於一較佳體系中，該硼葡萄糖酸鹽之濃度低於60毫莫耳/升。高於此濃度時，ApxI產量顯示出降至低濃度。雖然仍可用，但濃度宜保持低於此量。更佳之濃度為25至45毫莫耳/升，尤其是40毫莫耳/升，其顯示出為數種基質之理想濃度。
雖然對本發明而言並非必要，該基質可不含動物組成分。許多先前技術方法的缺點之一為其倚賴使用含有自動物衍生之組成分(諸如哥倫比亞肉湯(Columbia broth))。其他先前技術中提及之自動物衍生之組成分為，例如：經修正之哥倫比亞肉湯或腦心浸出液肉湯。如眾所周知者，使用動物組成分具有一些嚴重缺點。首先，各批產物間之化學組成可能變化很大。再者，動物來源之補充品可能被感染劑污染。主要擔憂的是存有引起人類及動物之TSE的普里昂蛋白(prion)。個人可單純選擇不含動物組成分之基質(通常稱為“ACF”-基質)。“動物組成分”在此意指任何以此形式存於動物中的組成分(例如：血液或蛋白質)或衍生自這類組成分之成分(諸如衍生自血液之經改質的血清，或衍生自蛋白質之胺基酸)。然而，本申請者發現與含有自動物衍生之組成分的基質相較下，使用這類ACF基質時ApxI之產製效率低得多，即使鈣之濃度足夠高時。不欲受限於學理，使用血清時，鈣鹽沈澱的問題較不嚴重，因為存有可形成鈣離子可溶性複合物的作用劑。在任何情況中，當使用硼葡萄糖酸鹽與鈣離子複合時可使在這些基質中所取得之ApxI產量明顯增加。
於另一較佳體系中，該鈣鹽為硼葡萄糖酸鈣。雖然個人仍然可使用氯化鈣作為碳來源並加入硼葡萄糖酸鹽與鈣離子複合，但將鈣以硼葡萄糖酸鹽之形式加入較佳。此方法不需等待在基質中發生之不同物理反應(沈澱、溶解、複合－變形、複合－形成)間的平衡。此可節省時間，因此在經濟上較有利。
再於另一較佳體系中，空氣係於培養期間通過液態基質，其中該空氣之二氧化碳含量高於正常大氣含量。令人驚訝地，已知二氧化碳甚至可進一步改良ApxI之產製速度。注意，一般所知者為在培養盤上培養細菌株落期間係使用增加之二氧化碳濃度(見，如US 6019984：EXAMPLES“Bacterial Strains and Growth Conditions”)。然而，此係關係到細菌菌株之培養，該細菌再被用於接種發酵器。在此階段，RTX毒素之產量並無相關。更進一步，一般了解(見，如：Microbial Pathogenesis 37(2004)29-33)發酵器中Apx之最大產量係在高細胞密度下發生，因此，係在指數生長期結束時。據了解，二氧化碳在此階段之意義不再是作為刺激因子。因此，過去未曾嘗試使用增加之二氧化碳濃度來增加Apx之產製。特定言之，本申請者辨識到當空氣中含有5%(體積/體積)二氧化碳(純二氧化碳/完全空氣，體積/體積)時，ApxI之產量非常高。注意：許多用於將空氣通過基質之技術均可用於此較佳體系中，但通常係經由一種令空氣泡自基質某處(即，在基質表面下)逸出的裝置。本發明中，“空氣”意指包含一或多種正常存於大氣中之氣態組成分(諸如氧、氮氣、二氧化碳、氦、氖、氬、氙、氡，等)的氣態基質。
本發明將利用下列非限制性實例進一步解釋。
 材料及方法 細菌菌株及基質
使用產製ApxI之胸膜肺炎放線桿菌株，血清型10(以下稱為APP 10)進行本研究。在所有情況中，使用哥倫比亞血液瓊脂培養基(BAB)培養盤(可自美國Becton Dickinson取得)重構成此菌株之操作籽。使用之液態基質為哥倫比亞肉湯(可自美國Becton Dickinson取得)(其係利用NaOH及醋酸將pH值保持在7.3)或不含動物組成分之基質(稱為“ACF”基質)。後種基質含有MgSO4 (0.75克/升)、半胱胺酸。HCl(0.1克/升)、FeCl3 (0.1克/升)、NaNO3 (0.1克/升)、KCl(0.1克/升)、微量元素(如：2.5毫升之如Handbook of Microbiological Media,3rd edition,Ronald Atlas,CRC Press,2004中所提及之SL-10溶液)、50%葡萄糖溶液(10毫升)和10mM胺基酸溶液(含全部20種胺基酸，除了色胺酸外)、HEPES緩衝液(6克/升；如：可自Sigma Aldrich 取得)及酵母萃取物(10克/升；如：可自Becton Dickinson取得)。
在預培養(precultures)及發酵器中使用這些基質。在預培養及發酵器中使用菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(0.01%)及鈣(不同濃度)。藉0.22微米過濾器將所有基質滅菌。在發酵器中使用前先將基質在85℃加熱1分鐘。
培養
將APP 10菌株之工作籽(working seed)平皿接種在哥倫比亞(Columnbia)BAB培養盤上並在約24小時之期間內在37℃下培育。挑出數個株落以接種在含有75毫升哥倫比亞肉湯之500毫升瓶中。將瓶子在37℃下培育約6小時，並一邊攪動以形成預培養。以此預培養進行數次發酵。這些發酵中有些係在500毫升之瓶中進行。在該情況中，以1毫升之預培養接種在75毫升之基質中。將瓶子在37℃下一邊攪動一邊培育。或者，培養可在含約400毫升培養基質之SIXFORS發酵器(瑞士，Infors AG)中進行，其中加入20毫升預培養作為接種體。培養溫度亦為37℃。
分析
經由測量660nm處之光學密度(OD)來測定細胞生長。藉由例行之ELISA測定法來測量ApxI抗原濃度。
結果
進行第一個實驗以測定鈣(不論是否與硼葡萄糖酸鹽複合)是否仍可為APP菌所用。此實驗依上文之描述在瓶中進行結果記述於下列表1中。
表1中之數據指出：當鈣離子與硼葡萄糖酸鹽複合時可提供良好之ApxI產量。此複合作用之重要優點為鈣鹽沈澱不再明顯影響下游處理。
進行第二個實驗以檢查硼葡萄糖酸鹽在不含動物組成分之基質中的效果。為了達到此目的，吾人比較加入20mM CaCl2 與加入20mM硼葡萄糖酸鈣。結果記述於表2中。
取得二個結果。首先，很清楚地，當使用氯化鈣時，在ACF基質中很難取得足量之ApxI，即使是產生正常之鈣濃度時。當將鈣與硼葡萄糖酸鹽複合時可取得高ApxI產量。在其他基質中可取得相當之結果。吾人在不含氯化鐵亦不含硫酸鎂但其他部分與上述之ACF基質相同的基質(“ACF-alt”)中進行這類實驗。同樣地，當將鈣與硼葡萄糖酸鹽複合時可取得顯著增加之產量。
進行第三個實驗以研究硼葡萄糖酸鹽濃度之影響。吾人使用3種不同濃度，即：20、40和60mM之硼葡萄糖酸鹽。結果描述於表3中。
從表3中清楚得知，約40mM之濃度顯示出合乎理想。
在第四個實驗中，吾人研究增加二氧化碳濃度對ApxI產量之效果。為此，吾人使用如上文描述之ACF-alt基質並將硝酸鈉之濃度增加為0.5克/升。硼葡萄糖酸鹽濃度在40、50及70mM間變化。經由在發酵器中維持1vvm(=體積氣體/體積基質/分鐘)之空氣/CO2 95/5體積/體積混合物的固定氣流來取得較高之二氧化碳濃度。依上述在SIXFORS發酵器中進行實驗此。結果記述於表4中。
從結果可歸結出二氧化碳對ApxI產量具正面影響：即使在70mM硼葡萄糖酸鈣之濃度下仍可產生可接受之ApxI量。同樣地，40mM顯示出為理想之濃度。
結論
本申請者發現：在支持APP細菌生長之液態培養基質中，硼葡萄糖酸鹽可在一方面防止鈣離子與負電離子形成沈澱，一方面維持鈣離子可刺激胸膜肺炎放線桿菌產製ApxI間取得關鍵平衡。此可有利地用於任何含有與鈣離子形成沈澱之負離子的胸膜肺炎放線桿菌培養基質中。確實，根據所選擇之基質並將其組成分最優化，APP細菌本身將產製較高或較低濃度之ApxI。但由於硼葡萄糖酸鹽之遮蔽作用將與細菌本身之確實產製速度無關，此溶液可成功用於所有基質，尤其是由於所有基質本質上含有碳酸鹽離子，而這些離子為可與鈣離子形成沈澱之離子。

Claims (5)

  1. 一種經由將胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )培養在支持該細菌生長之培養基質中以產製RTX(重複子毒素(repeat-in-toxin))毒素ApxI之方法，該基質係經加入鈣鹽以在該基質中形成鈣離子，該方法之特徵在於該培養基質含有濃度低於60毫莫耳/升之硼葡萄糖酸鹽以在該基質中形成硼葡萄糖酸鈣複合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該濃度為25至45毫莫耳/升。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該濃度為40毫莫耳/升。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該鈣鹽為硼葡萄糖酸鈣。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中在培養期間令空氣通過該基質，該空氣含有5%體積/體積之二氧化碳。
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