TWI392737B - 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘIII 之方法 - Google Patents

產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘIII 之方法 Download PDF

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Description

產製RTX毒素ApxI或ApxIII之方法
本發明關於經由將胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)培養在液態培養基質中以產製RTX毒素ApxⅠ或ApxⅢ的方法。
豬胸膜肺炎(一種豬之重要呼吸疾病)遍佈全球並使豬工業因急病豬隻之急性死亡、治療及經慢性感染之動物延遲銷售而發生嚴重之經濟損失。該致病媒介為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。其主要係藉由動物間之直接接觸傳染，所造成之感染產生的臨床病程變化可從特急性至慢性。此疾病主要為呼吸道感染，其臨床徵候為高燒、嚴重呼吸窘迫、咳嗽及厭食症。疾病開始得非常快且發病率及致死率高。控制胸膜肺炎放線桿菌(以下亦稱為“APP”)感染的方法之一係藉由疫苗接種方案進行。細菌素過去曾用於此類方案中，但已知其具有嚴重之副作用。現今則普遍使用以APP之毒素為底的次單位疫苗。
APP產生稱為RTX之毒素(RTX代表重複子毒素(repeat in toxin))。這些RTX-毒素之存在高度促成此細菌之致病性。RTX-毒素過去已被廣泛檢閱並描述於文獻中。如眾所周知，並非所有APP血清型均製造所有RTX-毒素。例如：血清型1、5、9及11產製ApxⅠ及ApxⅡ。血清型2、3、4、6及8產製ApxⅡ及ApxⅢ。血清型10僅產製ApxⅠ，且血清型7及12僅產製ApxⅡ。目前市售之抗APP的疫苗係以毒素ApxⅠ、ApxⅡ及ApxⅢ為底。最近已發現所有APP血清型均產製第四種RTX毒素，現在稱為ApxⅣ(見EP 0 875 574)。
如何藉由在液態培養基質中培養胸膜肺炎放線桿菌來產製RTX毒素ApxⅠ或ApxⅢ已普遍為人所知。特定言之，EP 0 453 024中已描述產製ApxⅠ(見“實例2”，第2段“Purification and characterisation of hemolysin”，“方法”小段)及ApxⅢ(見“實例4”，第2段“Purification and characterisation of App macrophage toxin(Mat)”，“方法”小段)之方法。注意：ApxⅠ過去係稱為“HLY”，而ApxⅢ通常稱為“Mat”(見Frey et al.in"J Gen Microbiol.1993 Aug;139(8)：1723-8")。該基質必須支持APP細菌之生長。如何建構支持細菌生長之基質已普遍為人所知。傳統之培養基質係在1950及1960年代由伊果(Eagle)、漢姆(Ham)及其他人最先研發。他們發現滿足生長之基本需求的基質應包含無機鹽、氮來源(例如：為含氮化合物之形式，諸如肽類或蛋白質類)、碳來源及維生素。該基質係經適當緩衝以防止其變成太酸或太鹼。在此基礎配方內可取得許多不同之組成。例如，個人可選擇自動物衍生之組成分以提供胺基酸，但個人亦可選擇經化學定義之胺基酸。在其他化合物方面亦可有多種變化。確實，構成可支持細菌生長之基質很簡單。然而，將生長及/或代謝物之產製最優化可能需要一些研發時間，尤其是當基質宜不含血清及其他自動物衍生之成分時。然而，改良發酵基質效能的策略為本技藝所周知且詳盡描述於文獻中(見，例如：在Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology(1999)23,456-475)中Kennedy及Krouse所寫之評論文章)。這類最優化形成發酵實驗室中例行實驗之一部分。在培養APP之情況中，由於APP為NAD(菸醯胺腺嘌呤二核苷酸)倚賴性，NAD本質上形成基質之一部分。缺少NAD時，基質將無法支持胸膜肺炎放線桿菌生長，因此，在本申請案及附屬之申請專利範圍的觀念中不能被視為用於支持APP細菌生長之液態基質。用於支持細菌生長之液態基質或構成這類基質之組成分可從多家公司購得，諸如Sigma Aldrich、Quest International、Oxoid、Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc.、Mediatech、Invitrogen、Marcor、Irvin Scientific Inc.。
雖然先前技術提供藉由培養APP產製RTX毒素ApxⅠ及ApxⅢ的方法，但仍需要改良產量。至今，改良產量之努力主要係瞄準APP培養之穩定期中產製毒素之速度，因為已知RTX毒素之最大產量係在高細胞密度時出現，因此，係在指數生長期結束時發生(見，如：Microbial Pathogenesis 37(2004)29-33)。這些企圖並未明顯改良總體產量。然而，令人驚訝地，本申請者發現當空氣係在該胸膜肺炎放線桿菌之RTX毒素的產製期(因此，係在APP菌之生長及/或穩定期)間通過基質時，RTX毒素之產量明顯增加，其中該空氣之二氧化碳含量高於正常大氣含量。確實，一般所知者為在培養盤上培養細菌株落期間係使用增加之二氧化碳含量(見，如：US 6,019,984：實例"Bacterial Strains and Growth Conditions")。然而，此係關係到細菌菌株之培養，該細菌再被用於接種發酵器。在此階段，僅細菌本身生長，並未產製RTX毒素(至少不明顯)。一旦將APP菌置於液態基質中以使其生長成適合產製RTX毒素之高細胞密度時，先前技術中教示可免除增加二氧化碳濃度。此點當然與上述提及之發酵器中之最大Apx產量僅在高細胞密度下發生的先前技術的教示一致，因此，係在指數生長期。在此階段，細胞生長已停止且不再扮演任何角色，因此，二氧化碳過去被認為不重要。再者，APP細菌本身在形成RTX毒素時會製造二氧化碳。因此，咸信，故意在基質中加入二氧化碳甚至會遏制毒素之產製。這些事實解釋為什麼二氧化碳從未被視為RTX毒素產量的刺激因子。然而，為什麼二氧化碳會刺激ApxⅠ及ApxⅢ產製之原因仍不清楚，尤其是因為二氧化碳似乎對RTX毒素ApxⅡ之產量並無正面作用。
令人注意的是現有許多可使空氣通過基質的技術。常用之概念係將空氣經由可令空氣以氣泡形式自基質某處(即，在基質表面下方)逸出之裝置通過。這類裝置根據，如：個人是否想在基質中建立(接近)平衡狀態，且，若是，此平衡應在多快之時間內安定而可具有一個噴嘴或數個裝置。在任何情況中，將空氣通過基質係與使用空氣上方空間及單純主要倚賴擴散相反。這類技術已被發現將提供不正確之結果。本發明中，“空氣”一詞意指包含一或多種正常存於大氣中的氮態組成分(諸如氧、氮氣、二氧化碳、氦、氖、氬、氡，等)的氣態基質。“大氣之正常二氧化碳的含量為空氣之總體積的0.04%體積”。
於一較佳體系中，空氣係在胸膜肺炎放線桿菌之指數生長期間通過。相對於先前技術中之描述，指數生長期顯示出為RTX毒素之全部產製期的一部分(接續在穩定期之後)。令人驚訝地，本申請者發現令二氧化碳在指數生長期間通過可明顯刺激RTX毒素產製，結果，即使在此時期結束時發酵器中仍存在為經濟上關係重大量的毒素。因此，本較佳體系提供在指數生長期結束時或穩定期早期時結束發酵的選擇。一種重大優點為其可節省大量產製時間，且，最終產物中之脂多糖的量可能減少。
於另一較佳體系中，其中該基質係經過緩衝(即，加入一種物質，當溶液中加入酸或鹼時其可使溶液之酸性變化減至最小)，其係藉由使用碳酸氫鹽(如：含HCO3 - 離子之鹽)來緩衝。藉由使用碳酸氫鹽緩衝液顯示出可非常有效地抗衡該過量二氧化碳所固有之pH降低效果。顯然地，使用這類緩衝液(例如：碳酸氫鈉或另一種鹼金屬碳酸氫鹽緩衝液)可使基質中幾乎立刻達到(接近)平衡狀態。
再於一較佳體系中，空氣係經由恆流通過基質。確實，將空氣通過基質的方法可設計成許多不同的方式。其中一種為具有極高二氧化碳含量(最高至，例如：90%)之空氣的脈動流。然而，吾人發現使用恆流可取得非常好之結果。使用此類恆流，空氣中可使用中度含量之二氧化碳。此具有該緩衝劑更能在任何時間將pH保持在平衡值附近的優點。注意：恆流不一定指從頭到尾，在某些時點下二氧化碳之加入並未中斷。例如：於培養期間短暫中斷空氣流並不排除在中斷前及中斷後，該空氣流為恆流。於一較佳體系中，胸膜肺炎放線桿菌之指數生長期間空氣係持續通過，即，在指數生長期間該空氣流並不會被中斷。
於一較佳體系中，該二氧化碳含量至多為10%(體積/體積)。於此較佳體系中，空氣中之二氧化碳的最大體積含量為10%。高於此含量時緩衝劑似乎無法隨時快速提供平衡。此可能負面影響RTX毒素之產量。於一較佳體系中，該二氧化碳含量為5%(體積/體積)。以此二氧化碳含量已取得良好結果，且，從經濟觀點來看，此為較佳之二氧化碳量，因為這類混合物可以非常低之價格購得。
於其中該RTX毒素為ApxⅠ之較佳體系中，該培養基質含有硼葡萄糖酸鈣。確實，普遍所知，ApxⅠ操縱子之轉錄活性可經由在生長基質中加入鈣來增加(見：Microbiol Pathogenesis 37(2004)29-33)。已發現使用硼葡萄糖酸鹽(2,3-二羥基-3-[2-羥基-5-(羥甲基)-1,3,2-二氧雜硼戊環-4-基]丙酸鹽)來與鈣離子複合時有數種好處。首先，其顯示出可防止或至少明顯減少在下游處理中常遇到之沈澱的鈣鹽的問題(尤其是濾器傾向淤塞)。接著，其顯示出與使用其他複合劑(諸如EDTA)之先前技術的方法相較下，個人可製造出明顯增加之ApxⅠ濃度。顯然地，經由使用此特殊複合劑，諸如含有複合三硼葡萄糖酸鈣(即，2,3-二羥基-3-[2-羥基-5-(羥甲基)-1,3,2-二氧雜硼戊環-4-基]丙酸鈣]，亦稱為具有硼酸，鈣鹽2：1之D-葡萄糖酸，環形4,5-酯)之基質可防止鈣離子與其他負離子之大量沈澱，但同時鈣離子仍可增加胸膜肺炎放線桿菌之ApxⅠ操縱子的轉錄活性。
雖然對本發明而言並非必要，該基質可不含自動物衍生之組成分。許多先前技術方法的缺點之一為其倚賴使用含有自動物衍生之組成分(諸如哥倫比亞肉湯(Columbia broth))。其他先前技術中提及之自動物衍生之組成分為，例如：經修正之哥倫比亞肉湯或腦心浸出液肉湯。如眾所周知者，使用動物組成分具有一些嚴重缺點。首先，各批產物間之化學組成可能變化很大。再者，動物來源之補充品可能被感染劑污染。主要擔憂的是存有引起人類及動物之TSE的普里昂蛋白(prion)。個人可單純選擇不含動物組成分之基質(通常稱為“ACF”-基質)。“動物組成分”在此意指任何以此形式存於動物中的組成分(例如：血液或蛋白質)或衍生自這類組成分之成分(諸如衍生自血液之經改質的血清，或衍生自蛋白質之胺基酸)。然而，本申請者發現與含有自動物衍生之組成分的基質相較下，使用這類ACF基質時ApxⅠ之產製效率低得多，即使鈣之濃度足夠高時。不欲受限於學理，使用血清時，鈣鹽沈澱的問題較不嚴重，因為存有可形成鈣離子可溶性複合物的作用劑。在任何情況中，當使用硼葡萄糖酸鹽與鈣離子複合時可使ApxⅠ產量明顯增加，令人驚訝地，所產生之產量甚至較以含有血清之傳統基質所取得之產量為高。
材料及方法
細菌菌株及基質
使用產製ApxⅠ之胸膜肺炎放線桿菌株，血清型10(以下稱為APP10)及產製ApxⅡ和ApxⅢ之菌株(viz.，一種血清型2之菌株，以下稱為APP 2)進行研究。在所有情況中，使用哥倫比亞血液瓊脂培養基(BAB)培養盤(可自美國Becton Dickinson取得)重構成這些菌株之操作籽。使用之液態基質為哥倫比亞肉湯(可自美國Becton Dickinson取得)或不含動物組成分之基質(稱為“ACF”)。後種基質含有作為緩衝劑之K2 HPO4 (14.6克/升)與NaH2 PO4 (3.6克/升)的混合物，以及NaNO3 (0.2克/升)、50%葡萄糖溶液(10毫升)、酵母萃取物15克/升(可自Becton Dickinson取得)、微量元素(如：2.5毫升之如Handbook of Microbiological Media,3rd edition,Ronald Atlas,CRC Press,2004中所提及之SL-10溶液)和10mM胺基酸溶液(含全部20種胺基酸，除了色胺酸外)。一種經測試之替代性不含動物組成分的基質(稱為“ACF-alt”)含有半胱胺酸.HCl(0.1克/升)、NaNO3 (0.5克/升)、KCl(0.1克/升)、微量元素(同上)、50%葡萄糖溶液(10毫升)和10mM胺基酸溶液(同上)、HEPES緩衝液(6克/升；如：可自Sigma Aldrich取得)及酵母萃取物(10克/升)。
在預培養(precultures)及發酵器中使用這些基質。在預培養及發酵器中使用菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(0.01%)。藉0.22微米過濾器將所有基質滅菌。在發酵器中使用前，將基質在85℃加熱1分鐘。
培養
預培養
將APP菌株之工作籽(Working Seed)平皿接種在哥倫比亞(Columbia)BAB培養盤上並在在37℃下培育約24小時。挑出數個株落以接種在含有75毫升哥倫比亞肉湯之500毫升瓶中。將瓶子在37℃下培育約6小時，一邊攪動以形成預培養。以這些預培養進行數次發酵。
在SIXFORS發酵器中培養
在含約400毫升培養基質之SIXFORS發酵器(瑞士，Infors AG)中加入約20毫升之預培養作為接種體。培養溫度為37℃，pH=7.2±0.1(透過加入4N氫氧化鈉或4N醋酸)並在50%pO2 下通氣。約24小時後終止發酵器培養。
在Biostat發酵器中培養
在含約10升基質之Biostat C發酵器(德國，B. Braun Biotech)中加入500毫升之APP預培養作為接種體。應用與SIXFORS發酵器中者相同之設定。然而，經由維持1vvm(=體積氣體/體積基質/分鐘)之空氣/CO2 95/5(體積/體積)之氣體混合物的固定氣流以增加二氧化碳之濃度。此可產生具有約5%之pCO2 的通氣設置。約8.5小時後，在指數期結束時終止發酵器培養。
在試驗廠規模( pilot plant scale)下進行培養
在整批100升之可滅菌的發酵器中進行試驗廠實驗。在攪拌器軸上配備3個6片型Rushton渦輪葉輪。在發酵器中填入75升基質並接種3升之預培養。將溫度保持在37℃，藉由自動pH控制器，使用20%(重量/體積)NaOH及8N醋酸將pH值保持在7.3。在二氧化碳頂空超壓(500毫巴)下進行標準培養，且葉輪係以250rpm之固定速度旋轉。未控制氧氣壓力。在注入二氧化碳之培養實驗中，在基質中補充NaHCO3 ，使其最終濃度為10mM，並通入0.25vvm之空氣固定氣流(其富含0.014vvm CO2 )。如此可使pCO2 為約5%。在APP 10菌株之情況中，該基質中係補充25mM CaCl2 ，並在50% pCO2 下通氣。
分析
在每次實驗結束時，以無菌方式將細菌細胞培養之樣本自發酵器中取出並在648nm處測定光學密度、ApxⅠ、ApxⅡ及/或ApxⅢ之量(ELISA；單位/毫升)以及可選擇地，測定LPS之濃度(LAL分析；單位* 105 /毫升)。
結果
以APP 2菌株，在試驗廠規模下進行第一個實驗以研究二氧化碳通過基質之效果(“注入”二氧化碳之實驗)。所使用之基質為哥倫比亞肉湯。結果記述於表1中。記錄二次實驗之結果(實驗1及實驗2)。
從這些結果可清楚得知：經由將二氧化碳以高於正常大氣壓之含量通過基質可使ApxⅢ產量幾乎變成二倍。ApxⅡ之量並未觀察到絕對增加。指數生長長結束時(其為表1中每一次實驗之終端)LPS之濃度並無極大不同。但由於ApxⅢ之量為二倍高，最終產物中之每一ApxⅢ劑量的LPS量最多將約為以標準設定取得之產品的一半。
第二個實驗亦是在試驗廠規模下進行，但使用APP 10菌株，以研究二氧化碳通過基質(“注入”二氧化碳之實驗)對ApxⅠ產製之效果。所使用之基質為哥倫比亞肉湯。結果記述於表2中。同樣地，記錄二次實驗之結果(實驗1及實驗2)。
從表2清楚得知可取得與ApxⅠ相當之結果。
第三個實驗係依上文之描述，使用ACF基質研究二氧化碳通過基質的效果。第一個培養係在SIXFORS發酵器中進行，但無多餘之二氧化碳通過基質。第二個培養係在Biostat C發酵器中進行，依上述般有多餘之二氧化碳通過基質。由於在Biostat發酵器中之條件的控制稍佳，預期在所有條件皆相等的情況下，Apx毒素之產量將較SIXFORS發酵器中者高約二倍(最多3倍)。結果描述於表3中。
由於Biostat發酵器中之ApxⅢ的量約為倍高，因此可能歸結出當令二氧化碳通過基質時，其對Apx之產量具正面效果，而使用ACF基質時亦是。
於使用APP 10菌株在SIXFORS發酵器中進行之第四個實驗中，吾人研究是否可將鈣以硼葡萄糖酸鹽複合物(取代未複合之鈣)之形式加入。硼葡萄糖酸鹽之濃度在40、50及70mM間變化。在指數生長期結束時終止培養。結果記述於表4中。
從結果可歸結鈣可以硼葡萄糖酸鈣複合物之形式存在以取得足量之ApxⅠ。其優點為鈣沈澱物不再負面影響基質之下游處理(尤其是過濾作用)。較高濃度之硼葡萄糖酸鹽顯示出會負面影響產量。

Claims (8)

  1. 一種經由將胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)培養在支持該細菌生長之液態培養基質中以產製RTX毒素ApxI或ApxⅢ之方法，其特徵在於在該等RTX毒素產製期間令空氣通過該基質，其中該空氣之二氧化碳含量介於0.04%達至10%體積/體積。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該空氣係在胸膜肺炎放線桿菌之指數生長期間通過。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該基質係經緩衝，其中該基質係經使用碳酸氫鹽緩衝。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該空氣係經由恆流通過該基質。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該空氣係在胸膜肺炎放線桿菌之指數生長期間持續通過。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該二氧化碳之含量達至10%體積/體積。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該二氧化碳之含量為5%體積/體積。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該RTX毒素為ApxI，其中該培養基質含有硼葡萄糖酸鈣。
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