JP4964385B2 - 細菌毒素の生成のための方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／１９４，４７８号（２０００年４月４日出願）および同第６０／１９４，４８２号（２００年４月４日出願）に対する優先権を主張し、これらの出願は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（配列表、表またはコンピュータープログラムリストに対する参照）
コンピューター読み取り可能な形式における配列表が、本明細書とともに含まれる。
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、細胞内および細胞外毒素の発現インヒビターの蓄積を減少または排除する方法および組成物を用いて、細菌毒素の生成を増大することに関する。具体的には、本発明は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種の毒素発現インヒビターの蓄積を減少または排除するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、百日咳毒素、パータクチン、アデニレートシクラーゼ毒素である溶血素、繊維性血球凝集素および他の毒素の高収率生成に関する。
【０００４】
百日咳毒素（ＰＴ）は、毒性Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳を引き起こす微生物）により生成される種々の成分のうちの１つである。百日咳は、呼吸器系の重篤な感染であり、かつては、米国で毎年５，０００〜１０，０００名もの人々が死亡する原因であった。百日咳ワクチンの出現以来、百日咳に関連した死亡者数は一年に２０名未満に減少した。現在では、全ての百日咳感染のうち約５０％が１歳未満の子供で生じ、そして１５歳を超える子供では、わずか１５％に生じるにすぎない。Ｋｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ．ｏｒｇ（２０００年３月２３日閲覧）〈ｈｔｔｐ：／／ｋｉｄｓｈｅａｌｔｈ．ｏｒｇ／ｐａｒｅｎｔ／ｃｏｍｍｏｎ／ｗｈｏｏｐｉｎｇ＿ｃｏｕｇｈ．ｈｔｍｌ〉。
【０００５】
ＰＴは、百日咳に対するワクチンにおいて主要な防御抗原である。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにより生成される目的の他の成分は、繊維性血球凝集素、熱不安定性毒素、アデニレートシクラーゼなどであり、これらはまた、防御抗原として重要な役割を果たし得る。診断試薬または化学的試薬として、およびワクチンの調製において有用なこれらの成分の大規模生成は、微生物の大規模培養を要する。しかし、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、大規模醗酵槽で増殖させることが困難であることが証明されている培養しにくい微生物である。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養のための古来からの方法は、静置培養における培養または醗酵槽における培養を用いる。静置培養における増殖は、労働集約的である一方、醗酵規模での培養は、ボルテックスによる攪拌および表面通気を要する。結果として、醗酵槽の有効容積は、減少され、そしてＢ．ｐｅｒｔｕｓｉｓの増殖のための醗酵槽の改変がしばしば必要である。さらに、これらの条件下での醗酵の間に生成されるＰＴの量は、変動性であり、しばしば低い。
【０００６】
米国特許第５，３３８，６７０号は、鉄イオン（すなわち、硫酸鉄）の存在下でＢ．ｐｅｒｔｕｓｉｓを生成するための方法を開示する。高い鉄含有量により、より高い細菌増殖が支持される一方で、ＰＴの生成は抑制される。改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地の鉄含有量を推奨される濃度の１０％に調節することにより、ＰＴの生成は最適化された。
【０００７】
本発明は、以下によりＢ．ｐｅｒｔｕｓｉｓから得られるＰＴの収率を改善することを試みる：（１）硫酸（ＳＯ_４ ^２−）を排除する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）増殖培地に可溶性塩を導入すること、および／または（２）Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を用いること。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、培養培地中に細菌毒素発現インヒビターが蓄積し、そのために有意に毒素生成を減少させるという発見に基づく。さらに、本発明は、毒素発現インヒビターの抑制または排除が、毒素発現を有意に上方調節し得るという知見に基づく。本発明の非限定的例は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．、具体的には、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓおよび／またはＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（これらは、それぞれ百日咳毒素（ＰＴ）およびパータクチンを生成する）を用いることを開示する。しかし、より高い細菌毒素レベルが、本発明の教示（アデニレートシクラーゼ毒素である溶血素、および繊維性血球凝集素を含むが、これらに限定されない）を利用して、他の細菌培養系において達成され得ることが理解される。
【０００９】
一般に、本発明は、細胞内および細胞外ＰＴインヒビター蓄積を排除または減少する（これにより、有意なＰＴ生成の増加を生じる）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓを培養するために用いられる方法および組成物を開示することにより、例示される。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓ増殖を支持し、硫酸アニオンによりＰＴ発現阻害を防止または減少する新規な培養培地を調製するための方法および組成物が開示される。これらの培地組成物および関連する方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地と、硫酸アニオンと実質的に不溶性の錯体を形成する、有効量の１以上の可溶性金属塩とを混合する工程。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖を支持する培養培地が提供され、この培地は、ＰＴインヒビターと実質的に不溶性の錯体を形成するある量の１以上の可溶性塩を含み、ここで、この量は、ＰＴ発現の阻害を防止または減少する。具体的には、硫酸アニオンと実質的に不溶性の錯体を形成する可溶性塩が開示される。
【００１２】
本発明の他の実施形態としては、ＰＴインヒビターの蓄積に寄与する培地構成成分を制限または排除することによりＰＴインヒビターを減少する、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地、およびこの培地を作製し、用いるための方法が挙げられる。具体的には、本発明の１つの実施形態において、システイン濃度が低減される。
【００１３】
本発明はまた、有意なＰＴ生成の増加を生じる培養培地中でＰＴインヒビターの蓄積を排除または減少させる条件下でＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養する工程、およびこの培養培地からＰＴを単離する工程を包含する、ＰＴを生成するための方法および組成物に関する。
【００１４】
本発明のなお別の実施形態において、ＰＴ生成は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を用いて増強される。本発明の１つの実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地中でＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を増殖する工程、およびこの培養培地からＰＴを単離する工程を包含する、ＰＴを生成する方法が提供される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
細菌感染の最も重篤な結果は、しばしば、宿主中の毒素発現から生じる。非限定的な例として、破傷風毒素を産生するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生される神経毒、偽膜性腸炎を引き起こす毒素を産生するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、胃腸炎および腸チフスを引き起こす腸毒素を産生するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、敗血症性ショックを引き起こす毒素を発現し得るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、および百日咳の要因となる毒素を産生するＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓが挙げられる。他の毒素産生性の細菌属としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）が挙げられるが、これらに限定されない。幸運にも、細菌毒素の最も重篤な効果を予防および／または軽減するワクチンが利用可能である。これらのワクチンは、主に、改変された細菌毒素、致死用量未満の精製毒素および／または全細胞ホモジネートから構成される。
【００１６】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）ワクチンは、ワクチンレシピエントにおける百日咳の予防に特に効果的であることがわかっている。百日咳毒素（ＰＴ）を単独またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの他の抗原と組み合わせて含む、非細胞百日咳（ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（ＡＰ）ワクチンは、百日咳感染の予防に非常に効果的であることが見出されている。しかし、ＰＴおよび他の百日咳抗原の多くは微量で発現されるので、収率を最大にするために培養条件を最適化することが重要である。標準的なＳｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培地を使用して、バッチ醗酵途中での百日咳毒素／光学濃度（ＰＴ／ＯＤ_６５０）の比の減少が観察された。この現象が基質利用能または負のフィードバック阻害の欠如に起因するか否かを決定するために、研究を行って、使用済み培地がＰＴ発現についての阻害性因子を含むか否かを決定し、そしてこれらの因子を同定した。培養上清サンプルを、醗酵の種々の段階から採取し、そして基本塩を欠くＳＳ培地成分を再供給した。これらのサンプルを使用して第２の培養を開始し、そしてＰＴ／ＯＤ_６５０比を、新鮮なＳＳ培地と比較して測定した。未処理の使用済み培地および３，０００ｋＤａより小さい分子を含有するこの培地の画分の両方が、ＰＴの産生を阻害した。Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ寒天（ＢＧＡ）上での交差画線実験は、新鮮に画線した細菌における溶血活性のインヒビターの産生を確認した。クーマシー染色したゲルは、全細胞タンパク質プロフィールが、新鮮な培地と比較して、その画分培地において有意に異なることを示し、これは、阻害性因子が２成分の調節系に影響を及ぼしていることを示唆する。これらの阻害性化合物をさらに同定するために、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの中間代謝物の完全なフラックス分析（使用済み培地のＨＰＬＣおよびこれらの経路中の重要な酵素によるアミノ酸および有機酸分析を含む）を行った。硫黄含有アミノ酸（メチオニン）およびピルビン酸が、増殖の後期対数期中に蓄積する（２００ｍｇ／Ｌまで）ことが見出された。ＬＣ−ＭＳによる全ての上清画分の試験は、システイン消費のための経路がスルフェートの形成を導くことを示唆する。次いで、これは、ＰＴ発現の負のフィードバックインヒビターとして作用した。
【００１７】
スルフェートは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにおけるＰＴ発現のインヒビターとして作用するので、醗酵が進行するにつれて細胞内および細胞外のスルフェート蓄積を減少または排除するための方法を開発した。本発明の１つの実施形態において、これらの方法は、スルフェートと実質的に不溶性の錯体を形成する有効量の可溶性塩の添加を包含する。このような可溶性塩としては、アルカリ土類金属または他の塩（ＰｂおよびＡｇ）が挙げられる。本発明の好ましい塩は、アルカリ土類金属塩である、より好ましい塩は、ハロゲン化Ｂａ（ＩＩ）塩である。最も好ましいハロゲン化Ｂａ（ＩＩ）塩は、ＢａＣ１_２またはＢａＢｒ_２である。
【００１８】
塩化バリウムは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによって産生されたＰＴの量の増加の促進において効果的であることが示されている。ＡＴＣＣ９７９７またはＣＳ８７ Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株をＢａＣｌ_２の存在下で培養した場合に、ＰＴ収率における１ＯＤ単位あたりの１０倍の増加が観察された。このケースにおいて、ＢａＣｌ_２の非存在下でのＰＴの量は、２０ｍＭ ＢａＣｌ_２を用いた場合に０．５２５μｇ／ｍＬ／ＯＤ_６５０であるのに対して、０．０５μｇ／ｍＬ／ＯＤ_６５０であった。「有効量」の塩は、醗酵を塩の非存在下で行った場合と比較して、醗酵中のスルフェートによるＰＴ発現の阻害を防止または減少する量を意味する。
【００１９】
スルフェート錯体の可溶性は、溶解度積（Ｋ_ｓｐ）によって規定される。スルフェート錯体は、Ｋ_ｓｐが２５℃で１×１０^−５以下である場合に、「実質的に不溶性」であると規定される。好ましくは、Ｋ_ｓｐは、２５℃で１×１０^−７〜１×１０^−１０である。最も好ましくは、Ｋ_ｓｐは、２５℃で１×１０^−８〜１×１０^−１０である。選択されたスルフェート錯体についての上述の範囲内ある溶解度積を、表１に示す。
【００２０】
表１：選択されたスルフェート錯体についてのＫ_ｓｐ値
【００２１】
【表１】

^ａＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ−第６５版、Ｗｅａｓｔ（編）、Ｂ−２２０頁（１９８４）。
【００２２】
表１に示されるスルフェート錯体は例であることが意味され、それ自体が、本発明の範囲を制限することを意味しない。さらに、スルフェート錯体が、必ずしも増殖培地中に完全に不溶性ではないことに留意すべきである。スルフェート錯体は、単に、スルフェートによるＰＴ発現の阻害を防止または減少するのに十分に不溶性でなければならない。
【００２３】
本発明の塩は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養が開始される前または後で培地に添加され得る。あるいは、塩は、培地の調製に使用する水の添加の前または後であるが、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の導入の前に、培地の他の成分と共に混合され得る。
【００２４】
醗酵中に産生されるＰＴの量の増加を促進するために本発明において使用され得る塩の量は、約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、もっともの好ましくは、約２０ｍＭであり得る。通常には、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの塩が、スルフェートによるＰＴ発現の阻害を防止または減少するために効果的である。当業者は、単なる慣用的な実験によって、任意の特定のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株におけるＰＴ発現の阻害を効果的に防止または減少する最適な量の塩を決定し得る。
【００２５】
別の実施形態において、本発明者らは、毒素インヒビター前駆体の培地濃度を調節することが、細胞内および細胞外の両方の毒素インヒビターの濃度を減少し得ることを決定した。例えば、限定することを意図しないが、本発明者らは、ＰＴインヒビター（スルファイトおよびスルフェートを含むが、これらに限定されない）が、システイン代謝の最終生成物として産生されることを決定した。要するに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａは、酵素システインデスルフィナーゼを含む経路を介して、硫黄含有アミノ酸であるシステインを代謝する。システイン代謝の間に、スルフヒラル（ｓｕｌｆｈｙｒａｌ）基が、システイン分子から酵素的に切断される。このスルフヒラル基は、スルファイトおよびスルフェートにさらに代謝され、これらが、細菌細胞内および細胞外環境内に蓄積する。結果として、システインの存在下でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａを長く増殖させるほど、細胞内および細胞外スルフェート濃度は高くなり、そしてＰＴ産生は減少する。
【００２６】
開始培養培地システイン濃度と最終スルフェート濃度との間の関係に基づいて、本発明者らは、開始システイン濃度を減少することが、細胞内および細胞外のスルフェート蓄積の減少を生じ、結果としてＰＴ阻害の減少を生じるという、非限定的な理論を展開した。スルフェート濃度に対するシステイン濃度の変化の効果を評価するために、本発明者らは、３つの異なる培養系を開発し、これらは、以下の略語を用いて識別される：ＬＣＭＳＳＢ、ＬＣＭＳＳＦＢ、ＬＣＭＳＳＢａ。ＬＣＭＳＳＢ（制限システイン改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅバッチ）培養系は、以下の表２に示される培地を使用してバッチ様式で増殖されるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからなった。手短に言うと、「バッチ様式」は、微生物が、有意な量の使用済み（すなわち、使用した）培養培地の補充または交換を伴わずに、単一の培養培地（通常、液体または半液体）中で培養されるプロセスである。本発明において、バッチ様式培養物（ＬＣＭＳＳＢ）を、当業者に公知の手順を使用して６００ｎｍで分光光度的に測定した場合に、細菌の光学濃度が１．０より高い吸光度に到達するまで、約３５℃〜３７℃で好気的にインキュベートした。第２の培養系ＬＣＭＳＳＦＢ（制限システイン改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ供給バッチ）は、表３に開示される培養培地を使用して維持した。システインは、この基底培地には添加されなかったことに留意する。代わりに、Ｌ−システインを、インキュベーション期間全体にわたって２０ｍｇ／時間の速度で添加した。最後の培養系は、ＬＣＭＳＳＢａ（制限システイン改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅバッチ＋ＢａＣｌ_２）と称され、これは、表２に示される基礎培地を使用した。
【００２７】
３つ全ての培養系を播種し、そして以下のように維持した：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ培養物を、ＡＦＳ Ｂｉｏｃｏｍｍａｎｄ ｖ２．０（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）に連結した２０リットルバイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ ＩＶ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ））中、約３５℃〜３７℃でインキュベートした。このＡＦＳ Ｂｉｏｃｏｍｍａｎｄ ｖ２．０は、ｐＨ、攪拌、溶存酸素、温度、およびエアーフロー速度についてのデータを収集した。消泡剤およびｐＨ制御剤のためのさらなるポンプを、必要な場合に追加し、これは、当業者に公知である。エアーフローを４．０リットル／分に調整し、溶存酸素を４０％に維持し、そしてｐＨを約７．２に維持した。
【００２８】
各２０リットルバイオリアクターは、１１リットルの試験培地を含み、そして１リットルの活発に増殖している細菌開始培養物を播種した。この活発に増殖している開始培養物は、１リットルのＳｔａｉｎｅｒ Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培地（この処方は、表５および６に示される）を含む振盪フラスコに凍結シードを播種して調製し、そして１．０ より高いＯＤ_６００の光学濃度に到達するまで（約２０〜２４時間）インキュベートした。
【００２９】
播種した醗酵槽を、３〜６時間間隔でサンプリングし、そして遠心分離を使用して培養上清と細胞ペレットに分けた。培養上清を、ＰＴ、スルフェート、有機酸、アミノ酸および細菌密度についてアッセイした。細菌細胞ペレットを、内部のスルフェートおよびＰＴ濃度について分析した。各培養系は、培養物の細菌集団の密度が、約１．０を超える吸光度単位に到達したときに（播種後約１２時間）、特定の補充を受けた。ＬＣＭＳＳＢおよびＬＣＭＳＳＢａの両方は、１０．０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏおよび５．０ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウム（ＦｅＳＯ_４／グルタミン酸補充）に加えて、以下の表４に記載の２００ｍＬのアミノ酸補充を受けた。ＬＣＭＳＳＢａ培養物はまた、２０ｎＭのＢａＣｌ_２の最終培養培地濃度を得るのに十分な１ｍＭのＢａＣｌ_２を受け；ＬＣＭＳＳＦＢ培養物は、システインを除くさらなるアミノ酸と共にＦｅＳＯ_４／グルタミン酸補充を受け、ＢａＣｌ_２は受けなかった。補充後、醗酵槽を、実験を終了する直前まで培養した。
【００３０】
【表２】

【００３１】
【表３】

【００３２】
【表４】

３つ全ての還元システイン培養系（ＬＣＭＳＳＢ、ＬＣＭＳＳＦＢ、およびＬＣＭＳＳＢａ）を、当該分野で公知のシステイン濃度を有する従来のＳＳ培地と並行して試験した。Ｂｏｒｔｄｅｔｅｌｌａ細菌およびＰＴ濃度を、図８Ａおよび８Ｂにグラフ表示する。最大のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ細胞濃度は約３２時間で到達することが、図８Ａから理解され得る。最大の増殖は、通常のＰＴ産生培地をバッチ様式での改変ＳＳと比較した場合に、ほぼ同じであった。図８Ｂは、培養培地の最大のＰＴ産生（ｍｇ／ｍｌ）を示す。全体的なＰＴ産生における有意な改善が、従来の培養系と比較した場合、本発明のシステイン制限培養系のいずれかを使用して現実化されることが容易に明らかである。さらに、図９は、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞における内部および外部のスルフェート濃度を示す。ＬＣＭＳＳＢａ培養系は、全体的なＰＴ産生における最良の改善を示した。従って、本発明者らによって理論付けられたように、ＰＴ産生は、培養培地中のインヒビター前駆体の量を制限することによって有意に改善され得る。さらに、よりさらなる改変が、本発明の前駆体制限培養系を本発明の毒素発現インヒビター除去系と組み合わせた場合に現実化され得る。
【００３３】
本発明者らは、以下を実証した：１）毒素産生細菌の培地中に蓄積する特定の毒素発現インヒビターが、全体的な毒素産生を有意に減少し得る；および２）培養培地からの毒素発現インヒビターの除去、または培養培地中のインヒビター前駆体を減少することによる毒素インヒビター形成の減少が、全体的な毒素産生を有意に増加し得る。従って、本発明者らは、毒素発現インヒビターを産生する毒素産生生物の能力を遺伝的に不能化することが、全体的な毒素産生における同様の増加を生じ得ると理論付けた。結果として、本発明のなお別の実施形態において、培養中にスルフェートを産生せず、従って、ＰＴ発現の阻害を示さない、システインデスルフィナーゼ活性を欠失する組換えＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（「ノックアウト変異体」）を提供する。このようなノックアウト変異体は、多くの異なる方法のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第５，５５７，０３２号および同第５，６１４，３９６号を参照のこと。このような方法は、一般に、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体ＤＮＡとのＤＮＡ構築物の相同組換えを含む。相同組換えは、十分に研究されており、これは、各々の最初に存在する分子の一方の領域が他方の分子の領域に連結されるような、同じかまたは実質的に類似（すなわち、相同な）の配列を有する２つの核酸分子の切断およびその２つの分子の連結を生じる、天然の細胞プロセスである（Ｓｅｄｉｖｙ，Ｊ．Ｍ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１１９２−１１９６（１９８８）を参照のこと）。従って、相同組換えは、細胞が、ＤＮＡの「領域」をあるＤＮＡ分子から別のＤＮＡ分子に移入し得る、配列特異的プロセスである。相同組換えが２つのＤＮＡ分子間で生じるために、これらの分子は、互いに「相同な領域」を保持しなければならない。このような相同な領域は、少なくとも２塩基対長でなければならない。２つのＤＮＡ分子は、一方が、相同組換えを生じ得るように第２の分子中の領域に類似する配列の領域を含む場合に、相同な領域を保持する。特定の領域に２つの相同な領域が隣接する場合、ついで、２つの組換え事象が生じ得、これが、その２つの組換え分子間での領域の交換を生じる。相同組換えは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ中に天然に存在する酵素によって触媒される。
【００３４】
１つのこのような方法において、例えば、プラスミドに含まれるシステインデスルフィナーゼをコードする遺伝子（図７）を、その遺伝子内を切断するように選択された制限酵素で切断し、その結果、マーカー遺伝子をコードする新しいＤＮＡ配列が、システインデスルフィナーゼ遺伝子配列内に挿入され得る。このマーカー遺伝子は、システインデスルフィナーゼ遺伝子の発現を妨げるように作用する。マーカー遺伝子は、検出可能および／またはアッセイ可能である任意の核酸配列であり得るが、好ましい実施形態において、これは、抗生物質耐性遺伝子である。マーカー遺伝子は、それ自身のプロモーター、またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにおいて活性であるかまたは容易に活性化され得る、任意の供給源由来の別の強力なプロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態において、マーカー遺伝子は、システインデスルフィナーゼ遺伝子のプロモーターを使用して転写され得る。このマーカー遺伝子は、転写を終結するために、その遺伝子の３’末端にポリＡ配列が結合され得る。好ましいマーカー遺伝子としては、任意の抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｅｒｍＣ’（エリスロマイシン耐性遺伝子）、ｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）、ａｍｐ（アンピシリン耐性遺伝子）、ｋａｎ（カナマイシン耐性遺伝子）、およびｇｅｎｔ（ゲンタマイシン耐性遺伝子））が挙げられる。
【００３５】
ＤＮＡ配列を適切な制限酵素（例えば、ＳｐｌＩおよびＳｐｈＩまたはＰｓｔＩおよびＰｖｏＩ）で消化した後、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に開示される方法を使用して、マーカー遺伝子配列を、システインデスルフィナーゼＤＮＡ配列に連結する。連結されるＤＮＡフラグメントの末端は適合性でなければならず；これは、全てのフラグメントを適合性の末端を生じる酵素で切断するか、または連結前に末端を平滑化するかのいずれかによって達成される。平滑化は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、クレノウフラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩ）または付着末端を充填するための他のＤＮＡポリメラーゼの使用によって行われる。この構築物は、システインデスルフィナーゼ遺伝子の規定の領域に対応する（例えば、システインデスルフィナーゼ遺伝子の３’末端および５’末端に対応する）ＤＮＡ配列を含み、これが、相同組換えによる構築物の組み込みを可能にする。このＤＮＡ構築物は、第２の抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドに連結され得る。
【００３６】
次いで、構築物を、周知の方法を使用して（例えば、エレクトロポレーションまたはトランスフェクトしたＥ．ｃｏｌｉ細胞との接合によって）Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓへトランスフェクトされ得る。細胞のスクリーニングは、存在する抗生物質耐性遺伝子に対応する１以上の抗生物質の致死濃度の存在下で細胞を培養することによって達成される。生存する細胞は、その中にノックアウト構築物が組み込まれている。選択された細胞がその中にプラスミド構築物を有さないように、非複製プラスミドを使用し得る。ノックアウト構築物の組み込みを確かめるために、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ＤＮＡのサザンブロットに、マーカー配列にのみおよび／または除去されたシステインデスルフィナーゼの部分にのみハイブリダイズするように設計された配列をプローブし得る。あるいは、またはさらに、ＤＮＡは、システインデスルフィナーゼ遺伝子の３’末端および５’末端に対応するプローブを用いるＰＣＲによって増幅され得る。最後に、システインデスルフィナーゼ活性をアッセイし得る。
【００３７】
別の実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、システインデスルフィナーゼ遺伝子のコード配列に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列の存在下で培養され得る。この実施形態において、ヌクレオチド配列は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによって取り込まれ、システインデスルフィナーゼコード遺伝子にハイブリダイズし、そしてこの遺伝子の翻訳を阻害する。遺伝子の塩基と相互作用して、共有結合を形成しそれによって翻訳を阻害する、改変されたヌクレオチド配列もまた使用され得る。米国特許第６，０１５，６７６号を参照のこと。
【００３８】
システインデスルフィナーゼ遺伝子に対してアンチセンスであるヌクレオチドの例としては、少なくとも８塩基、好ましくは、１０〜１５塩基の任意のヌクレオチドが挙げられ、これらは、図７のコード領域に相補的である。例としては、以下が挙げられる：
ＧＡＴＴＧＣＴＧＡＴ（配列番号１）
ＴＡＧＡＴＧＧＧＧＣ（配列番号２）
本発明において、種々の培地が、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養するために使用され得る。非限定的で例示的な培地としては、Ｓｔａｉｎｅｒ ＳｃｈｏｌｔｅおよびＧＭＡＲ改変培地が挙げられる。Ｓｔａｉｎｅｒ ＳｃｈｏｌｔｅおよびＧＭＡＲ改変培地の成分を、それぞれ、表２および３に示す。
【００３９】
【表５】

【００４０】
【表６】

本発明の方法によって産生されたＰＴ毒素は、Ｓｅｋｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１４６４７−１４６５１（１９８３）によって記載の方法に従って精製され得る。手短に言うと、Ｓｅｋｕｒａの方法は、２つの連続的なクロマトグラフィー工程を使用してＰＴを精製する。第１の工程は、Ａｆｆｉ−ゲルブルーカラムでのクロマトグラフィーを含む。第２の工程は、フェツイン−アガロースカラムでのクロマトグラフィーを含む。ＳｅｋｕｒａらのＰＴ精製方法は、比較的大量（１０ｍｇを超える）のＰＴの慣用的かつ迅速な精製を可能にする。あるいは、ＰＴは、ペプチドアフィニティーカラムを使用して精製され得る。このようなカラムを、以下の実施例１において記載する。この実施形態において、ＰＴを、カラムに吸着させ、緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ＝６．２）で洗浄し、次いで、ＰＴを、４ＭのＭｇＣｌ_２で溶出する。このＭｇＣｌ_２は、透析によって除去され、実質的に純粋なＰＴを得る。
【００４１】
ここでは、本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによって理解される。これらの実施例は、例示目的でのみ本明細書中に提供され、他に特定化されない限り限定することが意図されない。
【００４２】
（実施例１）
（材料および方法）
生物：野生型Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＣＳ８７を、これらの研究のほとんどで用いた。この株は中国を起源とし、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）の国立小児保健発育研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ＮＩＣＨＤ）に渡された。さらに、ＢＰのいくつかの株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られ、これらには、ＡＴＣＣＣ番号１０３８０が挙げられるが、これに限定されない。これらの両方は、本明細書中に開示されたシステインデスルフィナーゼノックアウトを調製するために適切である。生物は、−７０℃で保存するか、または３７℃での維持される加湿インキュベーター中のＢＧＡ（ＢＢＬ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で維持する。
【００４３】
細胞を培養するために用いた培地は、ＳｔａｉｎｅｒおよびＳｃｈｏｌｔｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：２１１−２２０（１９７０）に記載される規定培地に類似した。この１リットルの培地は、以下を含んだ：１０．７ｇ グルタミン酸ナトリウム、０．２４ｇ プロリン、２．５ｇ ＮａＣｌ、０．５ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２ｇ ＫＣｌ、０．１ｇ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、２０ｍｇ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１．５２ｇ Ｔｒｉｓ、２０ｍｇ アスコルビン酸、１００ｍｇ グルタチオン、４０ｍｇ システイン、および４ｍｇ ナイアシン。これらの塩、グルタミン酸およびプロリンを、基底処方物として調製し、そして滅菌のためにオートクレーブした。培地の残りの物（補充物）は、濃縮形態（１００倍）で調製し、そしてフィルター滅菌した。培地の最終ｐＨは、７．２〜７．５であった。いくつかの実験において、１０ｍｇ／ｍＬのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを添加した。生物を、３７℃に維持したＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａ Ｍｏｄｅｌ ４３００振盪インキュベーター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）中の３連のバッフルしたＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ、または１２Ｌの作動容量を有するバッチ様式で作動するＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ２０Ｌ ＢｉｏＦｌｏ ＩＶ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかにおいて増殖させた。リアクタを、ＡＦＳ Ｂｉｏ Ｃｏｍｍａｎｄ ｖ２．０（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（これは、ｐＨ、攪拌、溶存酸素、温度、およびエアーフロー速度についてのデータを収集した）および消泡剤およびｐＨ制御剤のためのさらなるポンプに連結した。全ての実験において、醗酵槽のエアーフロー速度を０．１２５ｖｖｍに設定し、温度を３６．５℃で制御した。溶存酸素（ＤＯ）を、１５０〜１０００ＲＰＭの振盪カスケードを使用することによって４０％で維持した。ｐＨを、５０％ Ｈ_３ＰＯ_４の添加によって７．２に制御した。
【００４４】
リアクタに、約１１Ｌの規定培地を量り分け、そして活発に増殖しているシード（１Ｌ）を播種して、１２Ｌの総作動容量にした。サンプルを、３〜６時間毎に再滅菌サンプルポートから採取した。細胞外代謝物の分析のために、上清を、０．２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に通して濾過し、そして−２０℃で保存した。
【００４５】
培養物の増殖を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ Ｓｐｅｃ １２０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用して６５０ｎｍの光学濃度（ＯＤ_６５０）によって測定した。培養物の純度を、グラム染色ならびにＢＧＡ（ＢＢＬ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびトリプシカーゼ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズ寒天（ＴＳＡ；ＢＢＬ，Ｉｎｃ．）上でのプレーティングによって確かめた。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの純粋培養物は、全ての生物が、グラム陰性染色し、ＢＧＡ寒天で増殖し、そしてＴＳＡ寒天で増殖しないことを示す。
【００４６】
アミノ酸分析：アミノ酸の分析および定量を、ＡｍｉｎｏＱｕａｎｔカラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｒｃｋａｒｄ Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）について提供されるように、オンラインプレカラム誘導体化を使用して、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって行った。一次アミノ酸を、ＯＰＡ試薬（０．４Ｍホウ酸緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌ ｏ−フタルアルデヒド、１０ｍｇ／ｍｌ ３−メルカプトプロピオン酸）によって誘導体化し、一方、二次アミノ酸を、ＦＭＯＣ試薬（アセトニトリル中の２．５ｍｇ／ｍｌ ９−フルオレニルメチルクロロホルメート）によって誘導体化した。一次アミノ酸について、移動相は、酢酸ナトリウム／エタノールアミン／テトラヒドロフラン（ｐＨ ７．２±０．０５）からなり、３３８ｎｍで検出した。二次アミノ酸は、酢酸ナトリウム／エタノール／アセトニトリル移動相（ｐＨ ７．２±０．０５）を使用して溶出し、２６２ｎｍで検出した。各アミノ酸の同定を、異なる濃度（１００、２５０および１０００ｐｍｏｌ／μｌ）のアミノ酸標準（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）のセットを用いて行った。ＨＰＬＣ Ｍｏｄｅｌ ＨＰ−１０５０（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃａｒｄ，ｖ２．０）と連結して、これらの分析に使用した。
【００４７】
有機酸の検出および定量：有機酸を、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ｖ２．０ソフトウェアを連動し、４ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４の移動気相を有するＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を備えた、Ｍｏｄｅｌ ＨＰ−１０５０（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して検出した。カラムを３５℃で平衡化し、そして平衡（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）流速は６ｍｌ／分であった。検出を、２１５ｎｍで行った。各有機酸の同定を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（これは、シュウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ギ酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムの混合物からなる）を注入することによって達成した。ピルビン酸を、この有機酸標準に２．５ｇ／ｍｌのピルビン酸を添加することによって評価した。
【００４８】
各有機酸を、以下の酵素キットを使用して、そして以下の製造業者推奨のプロトコルに従って定量した：クエン酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット１３９−０７６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；コハク酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット１７６−２８１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；ギ酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット９７９−７３２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；酢酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット１４８−２６１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；シュウ酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット７５５−６９９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；およびピルビン酸、Ｓｉｇｍａキット７２６−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００４９】
定量的ＰＴ ＥＬＩＳＡアッセイ：マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ ＩＩＦ，Ｖａｎｇａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＮＪ）を、１ウェルあたり０．１ｍｌのフェチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（０．１Ｍ炭酸ナトリウム中０．２μｇ／ｍｌ（ｐＨ９．６））を添加することにより感作し、そして室温で一晩インキュベートした。このプレートを、０．９％ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｂｒｉｊ ３５、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および０．０２％アジドを含む溶液を用いて５回洗浄した。ＰＴを含むサンプルを、０．５％ Ｂｒｉｊ３５を含むＰＢＳ中で希釈し、そしてプレートに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。このプレートを、再度、上記のように洗浄し、そしてＰＴ（２０．６）に対するモノクローナル抗体をＰＢＳを用いて希釈した。Ｉｂｓｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２４０８−２４１８（１９９３）。このプレートを再度洗浄し、そして二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ（Ｔａｇｏ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、ＰＢＳ−Ｂｒｉｊ中に希釈した）を、このプレートに添加し、次いで、室温で２時間インキュベートした。このプレートを、上記のように洗浄し、そしてｐ−ニトロフェノールホスフェート（Ｓｉｇｍａホスファターゼ基質１０４）（１ｍｇ／ｍｌ（０．１Ｍ ジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ_２、および０．０２％アジド（ｐＨ９．８）の溶液中））を添加した。このプレートを３７℃にて１時間インキュベートし、そして４０５ｎｍでの吸収をＤｙｎｅｘ Ｍｏｄｅｌ ＭＲＸマイクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用いて決定した。各プレートについて、検量線を、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡおよび０．１％グリセロール中に希釈した、精製したＰＴ（Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃ．）を用いて作成した。培養サンプルからのＰＴの濃度を、検量線から計算した。
【００５０】
スルフェート定量：培地内のスルフェート濃度を、Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆらの方法を用いて定量した。このアッセイをマイクロプレートアッセイに適用した。Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４：３７７−３８６（１９７６）。
【００５１】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｎｉｆＳ様遺伝子のクローニング：ｎｉｆＳ様遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０により増幅した。反応混合物（５０μｌ）は、以下を含んだ：２０ｎｇの精製Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体ＤＮＡ、０．２μＭの各プライマー（正方向プライマー：５’ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＡＣ３’（配列番号３）；逆方向プライマー：５’ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＧＴ ＣＧＧ３’（配列番号４））、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、４００μＭの各ｄＮＴＰ、および２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）。条件は以下である：第１のサイクル、９４℃で２分；次いで、９４℃（２分）、４２℃（１分）、および７２℃（２分）で３５サイクル；そして最後に８分間の７２℃のインキュベーション。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中でゲル精製し、そしてｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にｐＢＰｆｉｌＳを製造する製造業者により勧められる条件を用いて連結した。プラスミドｐＢＰｆｉｌＳを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ形質転換し、そして形質転換体を、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地において選択した。配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ Ｍｏｄｅｌ ３１０自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示書および配列決定キットを用いて行った。
【００５２】
ＢＰｆｉｌＳ様遺伝子中にヌル変異を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株の構築：本発明の教示に従って作製したｐＢＰｆｉｌＳプラスミドを、ＳｐｌＩおよびＳｐｈＩを用いて切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のクレノウフラグメントを用いて末端を平滑末端化した。切断プラスミドを、ゲル精製し、そして平滑末端化エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＣ’）またはルシフェラーゼを、プラスミド構築物中へ連結した。Ｋｌｕｇｍａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２０６６−２０７１（１９８９）。ＤＨ５の形質転換体は、１ｍｌあたり１００μｇのエリスロマイシンに対する耐性を有することを確認した。構築したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて再単離し、そして変異した挿入物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いてプラスミドを切断することにより単離した。この挿入物をゲル精製し、そしてプラスミドｐＳＳ１１２９のＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位へと連結してｐＢＲΔｆｉｌＳを作製した。Ｓｔｉｂｉｔｚ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：２４８４−２４９２（１９９８）。これをＥ．ｃｏｌｉ株ＳＭ１０中へ形質転換し、そしてこの形質転換体を用いてＳｔｉｂｉｔｚにより記載されるようにＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６と結合した。「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｅｘｃｈａｎｇｅ」，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＣｌａｒｋおよびＢａｖｏｉｌ（編）３０１−３０８頁（１９９７）。染色体内にヌルＢｐｆｉｌＳ遺伝子を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ単離物を、ＢＧＡ寒天上で、ゲンタマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性、および／またはエリスロマイシン耐性、あるいはルシフェラーゼ活性について選択した。
【００５３】
その他：すべての物質を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入し、そして／またはこれらは、入手可能な最高グレードであった。総タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により定量した。ヒトＩｇＧをスタンダードとして使用した。形質転換実験に用いられるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＢＰ５３６株（ＢＰ３３８株の自発的ストレプトマイシン耐性変異体）（Ｓｔｉｂｉｔｚ，ＳおよびＭ−Ｓ．Ｙａｎｇ．１９９１．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：４２８８−４２９６）を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのＳｃｏｔｔ Ｓｔｉｂｉｔｚ博士から得た。これらに由来する形質転換されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓノックアウト変異体を、ＢＰ５３６ｐＷＹ株と命名し、そしてブタペスト条約に基づいて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６ｐＷＹに、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３２５４を割り当てた。用いられる全ての方法は、当業者に全て周知である。例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＸＸ巻、Ｂ．Ｄ．ＳｈｅｐａｒｄおよびＭ．Ｓ．Ｇｉｌｍｏｒｅ（編）（１９９５）；ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｌ．Ａｌｐｈｅｙ．Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９７）；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｔ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．Ｃ．ＴｅｎｏｖｅｒおよびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ（編）（１９９３）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ（編）（１９８７）ＪｏｎｅｓおよびＢａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｊ．Ｗ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ａ．ＳｔｅｉｚおよびＡ．Ｍ．Ｗｅｉｎｅｒ（編）（１９８７）Ｔｈｅ Ｂｅｎｇｅｒｍａｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
【００５４】
（結果）
ＢＰのブロス培養におけるＰＴ産生のインヒビターの検出：サンプルをＢＰ培養の増殖期の間の様々な時間で得た。このサンプルを、ＯＤ_６５０を測定することによりＢＰ増殖についておよびＥＬＩＳＡによりＰＴの産生についてモニターした。結果を１ｍｌ／ＯＤ_６５０あたりのＰＴのμｇとして計算して、１細胞あたり産生されたＰＴの量を概算した。図１に示されるように、１細胞あたり産生されたＰＴの量は、増殖サイクルを通じて中間で大幅に減少した。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、対数増殖を続けたが、ＰＴの産生は、殆どＰＴ産生の全面的な排除まで減少するようであった。このことは、ＰＴ産生のインヒビターは、培養の初期の間に生成され、そして阻害濃度に達した後、ＰＴ産生を終えることを示唆した。この仮説を試験するために、静止期まで増殖したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物由来の培養上清を凍結乾燥し、そして塩基性塩を欠く増殖培地を用いて再構築した。次いで、この混合物を用いて、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの２代目の培養物を増殖し、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに用いられる本来の培地と比較した。サンプルを得て、そして上記のようにアッセイした。２つの培地の各々におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖は類似し、ほぼ同じレベルに達するＯＤ_６５０を有する。しかし、再構築した混合物において産生したＰＴの総量は、本来の培地の量と比較して大幅に減少した。このような阻害、およびこのインヒビターはアデニル化シクラーゼの産生（血液寒天プレートに対する溶血の原因）もまた生じることのより視覚的実証を、図２に示す。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの初期画線を、ＢＧＡプレート上に作製し、そして４８時間増殖させた。次いで、第２の交叉画線を作製し、そして寒天プレートを、さらに４８時間インキュベートした。非溶血の帯域は、初期増殖画線から放射状に延びることが考えられ得る。インヒビターの特徴付けは、使用済みの培養培地を３，０００ＭＷＣＯフィルターを通じて濾過し、浸透液および濾液の両方を保持することにより始めた。この両方を、上記のように、凍結乾燥および再構築した。図３は、ＧＭＡＲ培地と比較した場合のこれらの混合物におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖の結果を示す。ＰＴの産生は、浸透混合物により阻害された。このことは、このインヒビターが３，０００より小さい分子量を有したことを示唆する。
【００５５】
アミノ酸分析および有機酸分析：アミノ酸分析および有機酸分析の両方を代表的なＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養の過程の間の様々な時間で得たサンプルに対して行い、これらの化合物の増加および／または増加のタイミングが、ＰＴの産生阻害のタイミングと相関するか否かを決定した。これらのデータを、図４ａおよび４ｂに示す。ＰＴ産生の低下は、増殖期（代表的には２０時間）のほぼ半分を過ぎて生じることに注目すべきである。３つの化合物（メチオニン、システイン、およびピルビン酸）が、出現し、そしてこの時間の周囲で濃度の上昇を続ける。メチオニンの増加が初めに生じ、次いでシステインおよびピルビン酸が出現するようである。多くの経路が、メチオニンからシステインへの代謝に関連する。しかし、わずかな経路が、システインからピルビン酸に生じる。３つのこのような経路は、Ｌｅｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４４１頁（１９７０）に示される。これらの３つの経路の各々において、システインのイオウ基が除去され、そしてピルビン酸が生成され、それによりこれらの化合物の各々の増加がお互いに、および培地内のイオウの増加と関連付けられる。
【００５６】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培地中のイオウ産生：イオウの濃度を、培養サンプルのおのおのに対して決定し、そしてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖（ＯＤ_６５０）と時間とを比較した。図５は、図４のデータを作成するために用いたのと同じサンプルに対するこれらの実証の結果を示す。このデータは、似通った時間でメチオニン、システイン、そして最後にピルビン酸の濃度が増加する場合、イオウの産生の大きな増加が存在することを実証する。
【００５７】
ＢａＣｌ_２の存在下でのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖およびＰＴの産生：イオウイオンは、ビルレント期から静止期までのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのモジュレーターである。この調節は、タンパク質ＢｖｇＳおよびＢｖｇＡにより調節される。ＢｖｇＳおよびＢｖｇＡは、二成分調節分子（ｔｗｏ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の大きなファミリーのメンバーである。これは、外来のイオウの添加が、ＰＴを含むいくつかのビルレンス因子の産生をダウンレギュレートすることが長い間知られていた（ＷｅｉｓｓおよびＨｅｗｌｅｔｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：６６１−６８６（１９８６））が、この系と相互作用する化合物の同定は、未知のままであった。システイン異化またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖の過程の間の別の供給源由来のイオウの可能性のある生成が、ＰＴ産生に影響し得るか否かを決定するために、ある方法は、培養物からのイオウの影響を不活化するかまたは取り除くかのいずれかをしようとする。ＢａＣｌ_２の形態のバリウムは、水の中で非常に可溶性（１．８Ｍ（２５℃）および２．８Ｍ（１００℃））であるが、ＢａＳＯ_４は、非常に不溶性（１０．７μＭ（２５℃）および１７．７μＭ（１００℃））である。溶解度の差異を、しばしば用いて、さらなる測定のために溶液からイオウを沈殿させる。ＢａＣｌ_２の様々な濃度を、増殖培地に添加し、そして培地におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖とＰＴの産生を比較した。これらのデータを図５に示す。両方の濃度でのＢａＣｌ_２の添加は、正常な培地と比較した場合に、９７９７株においてより増加するにもかかわらず、両方のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株において１細胞あたりのＰＴの産生を増加した。可視的な沈殿（おそらくＢａＳＯ_４）が、培養の時間に渡り蓄積が見られることに注目すべきである。これらのデータは、培養物内のＰＴの負のフィードバックインヒビターが、イオウであることを示唆する。
【００５８】
ＢＰからのシステインスルフィネートデスルフィナーゼ遺伝子のクローニング：システインからのイオウの除去を引き起こす、可能な酵素の１つである、ｎｉｆＳ様遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉからクローニングおよび特徴付けされた。Ｍｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２４１７−２２４２４（１９９７）。この配列を使用して、相同性を、部分的Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓゲノムデータベース中で探した。ｎｉｆＳ遺伝子に対して高い相同性を示すオープンリーディングフレームを見出し、そして適切なＰＣＲプライマーを合成した。適切なサイズのＰＣＲ産物を、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体ＤＮＡを用いて産生し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯへとクローニングし、そして当業者に公知の方法を用いて配列決定した（図７）。
【００５９】
ペプチド合成および精製：配列ＧＧＧＤＧＳＦＳＧＦＧＤＧＳＦＳＧＦＧ−ＯＨ（配列番号５）を含むペプチドをＡＢＩ４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてＮＭＰ−ｔ−ブトキシカルボニル化学を用いてＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成した。このペプチドを脱保護し、そしてアニソールの存在下でのＨＦを用いる処理（０℃／１時間）により樹脂から取り出した。このペプチドの予備精製を、Ｃ−１８カラム（２．１４ＩＤ×３０ｃｍ）（Ｄｙｎａｍａｘ−Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて行った。このペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｉｃｏｔａｇシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるＰＴＣアミノ酸分析により定量した。合成したペプチドを、総溶出プロフィールの９５％を構成する主要ピークとしてＣ−１８カラムから溶出する。精製ペプチドのアミノ酸組成は、ペプチドを合成するために用いられた配列と良好な一致を示した。
【００６０】
ペプチドアフィニティーカラムの構築：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを、Ｂｒａｎｄｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３８６：１９６−２０２（１９７５）により記載される方法を用いて活性化した。簡単には、０．１Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ８．０）中の５０％ゲルスラリーのプレウォッシュＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを、エタノール中の２５０ｍＭ ｐ−ベンゾキノンの溶液を用いて処理して、２０％エタノールおよび５０ｍＭ ｐ−ベンゾキノンの最終濃度を得た。懸濁液を、室温で１時間穏やかに攪拌した。次いで、活性化Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを、目の粗い焼結ガラス漏斗において、２０％エタノール、脱イオン化Ｈ_２Ｏ、１Ｍ ＮａＣｌの各々を２容量用いて、広範に洗浄し、そして、もう一度、脱イオン化Ｈ_２Ｏを用いて洗浄した。活性化Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを吸引して、コンパクトな固まりにし、そして０．１Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ８．０）中の２ｍｇ／ｍｌのペプチドを含む溶液の１容量を添加し、そしてこの混合物を４℃で２４時間連続して回転させた。次いで、１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．０）を添加し、そして回転を、室温で１時間続けた。次いで、このゲル混合物を、０．１Ｍ ＮａＨＰＯ_４（ｐＨ７．０）中の脱イオン化Ｈ_２Ｏ、１Ｍ ＮａＣｌを用いて広範に洗浄した。最初のペプチド溶液およびカップリング工程の直後の上清のアリコートを保持し、そしてＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ Ｓｐｅｃ １２０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を用いてＡ_２８０を測定して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂへのペプチドの取り込みを決定した。
【００６１】
上記の記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し得、そして本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変化および改変を過度の実験なしに種々の用途および条件に適用させ得る。全ての特許、特許出願、および本明細書中で引用する刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、醗酵時間の関数として生成したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖（ＯＤ ６５０）およびＰＴの量における変化（［Ｐｔｘ］／ＯＤ）を示すグラフ。
【図２】 図２は、血液寒天プレートの写真。
【図３】 図３は、コントロール培養物上清（Ｃｔｒ．）、使用済み培養培地由来の３，０００ＫＤａより小さい（３Ｋより小さい）分子を含む培養培地、および使用済み培養培地由来の３，０００ＫＤａより大きい（３Ｋより大きい）分子を含む培養培地中のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖（ＯＤ ６５０）およびＰＴの量（Ｐｔｘ濃度）における変化を示す棒グラフ。
【図４Ａ】 図４Ａは、醗酵中のアミノ酸プロフィールを示す、醗酵時間 対 アスパラギン酸、トレオニン、システインおよびリジン濃度（ｍｇ／Ｌ）ならびにアルギニン、メチオニンおよびプロリン濃度（ｍｇ／Ｌ）のグラフ。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、醗酵時間の関数として有機酸濃度の変化を示す、時間（時間） 対 面積（ｍＡＵ 秒）のグラフ。
【図５】 図５は、種々の培養時間でのスルフェート濃度（μｇ／ｍＬ）を示す棒グラフ。
【図６】 図６は、２つのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株（株１＝ＣＳ−８７、株２＝ＡＴＣＣ９７９７）についての産生されたＰＴの量（μｇ／ｍｌ／ＯＤ_６５０）に対するＢａＣｌ_２の濃度（ｍＭ）の増加の効果を示すグラフ。
【図７】 図７は、Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ ＤＮＡデータベースに見出されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ配列（コンティグ３１４）との、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６から単離されたシステインデスルフィナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す。
【図８Ａ】 図８Ａは、６００ｎｍの吸光度での、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中の総Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素産生測定をグラフ表示する。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、毒素／光学濃度単位（ｍｇ／ｍＬ）で測定した、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中の総Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素産生をグラフ表示する。
【図９】 図９は、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中の総Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにおける内部および外部スルフェート濃度をグラフ表示する。

Claims (27)

1. 細菌毒素の増強された生成のための方法であって、該方法は、毒素生成細菌を培養する工程を包含し、該毒素生成細菌により形成される硫酸イオンが排除または減少される、方法であって、ここで、
   該毒素生成細菌が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓであり、そして、該毒素が、百日咳毒素（ＰＴ）である、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   ここで、前記硫酸イオンが、以下：
   ａ）細菌培養培地に、該硫酸イオンと実質的に不溶性の錯体を形成する組成物を添加すること；
   ｂ）硫酸イオン代謝前駆体を欠く細菌培養培地または該硫酸イオン代謝前駆体の濃度が減少した細菌培養培地を提供すること；および
   ｃ）システインデスルフィナーゼノックアウト変異細菌を提供すること、
   からなる群より選択される方法を用いて、細菌培養培地から排除または減少される、
   方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、前記組成物が可溶性金属塩である、方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩がＢａＣｌ_２またはＢａＢｒ_２である、方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
6. 請求項２に記載の方法であって、前記硫酸イオン代謝前駆体が、システインである、方法。
7. 請求項２に記載の方法であって、前記硫酸イオン代謝前駆体を欠く細菌培養培地または前記硫酸イオン代謝前駆体の濃度が減少した細菌培養培地が、前記硫酸イオンと実質的に不溶性の錯体を形成する可溶性金属塩をさらに含む、方法。
8. 請求項２に記載の方法であって、前記システインデスルフィナーゼノックアウト変異細菌が、組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓである、方法。
9. Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養する方法であって、硫酸と実質的に不溶性の錯体を形成する、有効量の１つ以上の可溶性金属塩の存在下で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養する工程を包含する、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、方法。
11. 請求項９に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、ＢａＣｌ_２またはＢａＢｒ_２である、方法。
12. 請求項９に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
13. Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖を支持し、そして硫酸によりＰＴ発現の阻害を防止または減少させる培養培地を作製する方法であって、該方法は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地と、硫酸と実質的に不溶性の錯体を形成する、有効量の１つ以上の可溶性金属塩とを混合する工程を包含する、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、方法。
15. 請求項１３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、ＢａＣｌ_２またはＢａＢｒ_２である、方法。
16. 請求項１３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
17. Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖を支持する培養培地であって、該培地は、硫酸と実質的に不溶性の錯体を形成するある量の１つ以上の可溶性金属塩を含み、該量は、硫酸によるＰＴ発現の阻害を防止または減少させる、培養培地。
18. 請求項１７に記載の培養培地であって、前記可溶性金属塩が、Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、培養培地。
19. 請求項１７に記載の培養培地であって、前記可溶性金属塩が、ＢａＣｌ_２またはＢａＢｒ_２である、培養培地。
20. 請求項１７に記載の培養培地であって、前記可溶性金属塩が、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、培養培地。
21. ＰＴを生成する方法であって、該方法は、硫酸と実質的に不溶性の錯体を形成する有効量の可溶性金属塩を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地においてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを増殖する工程、および該ＰＴを該培養培地から単離する工程を包含する、方法。
22. 請求項２１に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、方法。
23. 請求項２１に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、ＢａＣｌ_２またはＢａＢｒ_２である、方法。
24. 請求項２１に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
25. Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体。
26. ＰＴを生成する方法であって、該方法は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地においてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を増殖する工程、および該ＰＴを該培養培地から単離する工程を包含する、方法。
27. ＰＴの増強された生成のための方法であって、該方法は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を培養する工程を包含し、それにより、非システインデスルフィナーゼノックアウト変異体を用いた場合と比較して、生成したＰＴの増強した量が生成される、方法。

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