JP2889923B2 - 百日咳トキソイドワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は百日咳を予防するワクチンとして適当な抗原
の開発に関する。

（従来技術） 百日咳は細菌ホルデテラ・ペルツッシス（Bordetella
pertussis）に感染した結果起こる症状の重い、伝染性
の強い呼吸器の病気である。現在のところ十分に効果的
な治療法はなく、この病気は相当の患者数および死亡率
と関連しており世界中に広がっている。百日咳は幼児に
とっては特に過酷である。

サト（Sato）ら、インフェクション・アンド・イミュ
ニティー（Infect.＆ Immunity），46,422（1984）は、
百日咳を抑制する全細胞ワクチンの使用とその全細胞ワ
クチンが最近限定ワクチンに取って代わって来ているこ
とについて記述している。

死菌細胞からなる百日咳ワクチンは40年以上の間世界
中で百日咳を減少させる役割を果たして来ている。だ
が、同時にそのワクチンはワクチンの副作用のために最
も受入れられなかったワクチンの一つである。現在で
は、全細胞ワクチンはより限定されたワクチンに取って
代わって来ており、この限定ワクチンは特異的成分から
なり、さらに精製した関連防御抗原または抗体によって
評価される防御力を持つことが可能である。日本で1981
年から使用されている百日咳ワクチンはボルデテラ ペ
ルツッシスのフェースＩの細胞の培養上澄液の画分から
エンドトキシンを除去することおよびホルマリンである
程度毒素性を不活性化することによって幾分か副作用を
減少させてある。ワクチンの主成分は百日咳毒素（PT）
および線状血球凝集（FHA）をホルマリン処理したもの
である。現在のところ我々は、PTが最も有力な抗原であ
りFHAは補助的な防御抗原であること、ならびにそれら
に対する抗体が伝染病および病原体を原因とする病気か
らマウスを防御するのに重要な役割を果たしていると推
測している。

そのような限定ワクチンを調製するために、PTおよび
FHAを連続カラムクロマトグラフィー法によって精製
す。（サトら、同上）。次いでPTおよびFHAを0.2％ホル
マリンで39℃で処理しさらに0.1％ホルマリンでさらに
１日おきに２回以上処理して、その後透析する（同上、
415頁）。

代替法は、FHAを含まないPTを調製し、次いでPTを0.0
5％グルタルアルデヒドで処理して解毒さたPTを得るこ
とからなり、それは伝染病からマウスを防御するのに効
果がある。〔ムノズ（Munoz）ら、インフェクション・
アンド・イミュニティー、32、243（1981）〕。

百日咳毒素を定義するために用いられている用語は文
献中でも混乱している。PTは「リンパ球増加症−ヒスタ
ミン感作因子、島（islet）活性化蛋白質および百日咳
前駆体（pertussigen）」としても知られている。ロッ
ト（Locht）ら、サイエンス（Sicience），232,1258（1
986）。最近、アームストロング（Armstrong）ら、イン
フェクション アンド イミュニティー、55,1294（198
7）、はPTについて次のように記載している。

PTはS₁〜S₅と呼ばれる５つのサブユニットからなるヘ
テロヘキサマー蛋白質である。それらの遺伝子配列よ
り、サブユニットの分子量はS₁が26,024、S₂が21,925、
S₃が21,873、S₄が12,058,およびS₅が11,013である。最
大のサブユニットS₁は真核生物細胞に存在する相同のグ
アニンヌクレオチド依存性調整複合体（ＣまたはＮと呼
ばれている）の一族であるαサブユニットをADP−リボ
シル化する原因となる。他の４つのサブユニットはS₅を
介して互いに結合する２つのダイマー〔S₂S₄（ダイマー
１）およびS₃S₄（ダイマー２）〕からなるペンタマーの
基本単位（base unit）を形成すると考えられている。
基本構造の機能は宿主細胞レセプターへの結合、および
S₁サブユニットが細胞膜を通過する手段の提供にある。

セリン、スレオニン、およびチロシン残基は、PTでは
大腸菌（E.coli）蛋白質の平均よりもより頻繁に現われ
る〔ロット（Locht）ら、サイエンス（Science），232,
1258（1986）〕。これらの残基の水酸基は、水素結合に
よってPTの四次構造内に巻き込まれているであろうと考
えられる（ロットら、同上）。リジン残基はPT遺伝子の
S₁サブユニットにはなく、このことは「リジンを特異的
に化学修飾してもS₁のヒドロキシル活性および酵素活性
に影響を及ぼさないという理由の説明となるであろ
う。」（ロットら、同上） ニコシア（Nicosia）ら、プロシーディング・オブ・
アカデミック・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・
ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Acad.Sci.U.S.A），8
3,4613（1986）は、サブユニットS1内にはリジン残基が
欠如している故に、PTを不活性化するためには厳しい条
件が必要であると記述している。

S1サブユニットはリジン残基を含まない数少ない蛋白
質の１つである。この認識は百日咳の新規ワクチンを開
発する上で重要なかかわり合いをもつ、というのは、標
準的なワクチン調製では細菌毒素を主にリジン残基と反
応する化学薬品で解毒するからである。従って、PTを解
毒するためには他の細菌毒素に使用される条件よりもよ
り厳しい条件が必要であり、さらにそれに次いでグルタ
ルアルデヒド処理を行なうとS1は本来の大きさのまゝ残
るがS2,S3,S4およびS5は架橋されて高分子量の凝集体を
形成することを発見した。

PTはヨウ素化に対して感受性であると記載されている
がそのような感受性はフェチュイン−アガロースへの吸
着によって減少させることができる〔アームストロング
（Armstrong）ら、上記〕。この感受性について考えら
れる理由の１つは、PTの中に存在する多数のチロシン残
基であり、それらのうちのあるものは毒素としてのPTの
機能上重要であろう。慣用的なヨウ素化研究において、
そのような重要なチロシンの修飾は失活理由の説明の１
つであり得た（アームストロングら、同上） 最近、PTサブユニットをコードするDNAのクローニン
グについて記載されている（ロットら、上記；ニコシア
ら、上記）。ロットらは、ワクチンの開発にそのような
遺伝子を利用することについて記載している。

百日咳毒素の遺伝子をクローン化し配列決定すること
は百日咳に対して有効な毒素緩和ワクチンの開発を容易
にするであろう。類似した生化学的機能を持つ他毒素の
遺伝子と比較することによって、さらにS1サブユニット
のADP−リボシル化活性部位またはS2・S4サブユニット
の標的細胞結合活性部位のどちらかを物理的に同定する
ことによって、現在ではホルデテラ ペルツッシス（B.
pertussis）ゲノムの部位特異的変異誘発によるそのよ
うな部位の修飾が可能である。このような修飾は毒素の
免疫原性および防御性を抑制することなく百日咳毒素の
病理生物活性を完全に破壊する。一方、DNA配列を知る
ことによって、防御抗原決定基の位置を決めることが可
能になるであろう。そのような抗原決定基を含むオリゴ
ヌクレオチドを合成することも、また、新世代のワクチ
ン開発に有益であろう。

（課題を解決するための手段） 第一観点において、本発明はヒトの百日咳を予防する
ワクチンとして適当なトキソイドを特徴とし、このトキ
ソイドはポリペプチドからなり、このポリペプチドは濃
度５μg/mlで標準競合ELISAアッセイ試験を行なった場
合にポリクローナル抗毒素抗体の結合活性の80％以上と
競合する能力を持つような十分な抗原性を保持し、かつ
このトキソイドは37℃に８週間放置してもCHO細胞アッ
セイで評価されるような毒性復帰傾向を示さない。

好適な実施態様において、37.5μｇのポリペプチドを
500gのモルモットに注射すると、CHO細胞中和アッセイ
で測定した場合の少なくとも1/200の力価に相当する中
和抗体が生産され、かつトキソイドはその生物活性をア
ッセイした場合にCHO−細胞アッセイで定量した百日咳
毒素の毒素活性の0.0005％未満である；トキソイドは一
匹のマウス当り少なくとも30μｇの服用量を静脈注射
（IV）して試験した場合にHSF試験での死亡原因とはな
らない；トキソイドはガチョウのRBC_sで定量される本来
の血球凝集活性の１％以上を保持しない；トキソイドは
本来のADP−リボシラーゼ活性の５％未満を保持する；
トキソイドは37℃で８週間放置してもHSFまたはHAアッ
セイで評価されるような復帰傾向を示さない；トキソイ
ドは百日咳毒素をニトロ化試薬、最も好適にはテトラニ
トロメタン（TNM）と反応させることによって調製され
る。

他の関連態様において、本発明はヒトの百日咳を予防
するワクチンとして適当なトキソイドを特徴とし、この
トキソイドは本質的にはチロシン残基のみを修飾した百
日咳毒素からなる。尚、本明細書において、アミノ酸残
基の修飾とは、アミノ酸残基を除去すること（欠落させ
ること）も包含する。好適には、百日咳毒素はトリニト
ロメタン処理によって修飾する。また、本発明は精製し
た百日咳毒素をTNMと反応させることによって調製した
トキソイドを特徴とする。

他の関連態様において、本発明は精製百日咳毒素をニ
トロ化試薬、例えばTNMと反応させることを含む百日咳
キトソイドの調製法を特徴とする。

さらに他の態様において、本発明は免疫化量のトキソ
イドをヒトに投与することを含むヒトの百日咳予防法を
特徴とする。

本発明の他の態様および長所は次に記載する好適な実
施態様および特許請求の範囲から明らかになるであろ
う。

百日咳毒素（PT） PTは、例えばアームストロング（1987）およびサトら
（1984）の上記引用文献に記載されているような任意の
標準的な方法によって調製することができる。PT製造の
好適な方法を以下に詳細に述べる。

どのようなボルデテラ・ペルツッシス（B.Pertussi
s）でもトキソイド調製のための百日咳毒素源として利
用しうる。例えば、PTはボルデテラ・ペルツッシス株:C
SK2,18323CIまたは18334KI:から調製される。CSK2株
は、ロン・セクラ博士（Dr.Ron Sekura）より頂いた、
トランスポゾン変異誘発によって生じたCS株のカナマイ
シン耐性誘導株である。18334KI株は、初めザ・ミシガ
ン・デパートメント・オブ・パブリック・ヘルス（the
Michigan Department of Public Health）で単離された
18334株のカナマイシン耐性誘導株である。百日咳毒素
を0.5〜1.0mg/生成する既知の任意株が適当である。
そのような株はATCC（例えば18323株）またはO₀BRR（例
えばトハマ（Tohama）Ｉあるいは165株）より容易に入
手できる。

凍結保存用種培養（seed culture）は100mlのシクロ
デキストリン−富化C.L.培地（第１表に示す）にいろい
ろなB.G.平板地に増殖した菌株を接種して調製する。

この培養液は１の培地を含むスピナ−フラスコへの
接種用に使われる。24時間後、無菌グリセロールが20％
になるように加え、懸濁液を40mlずつに分割し、その後
−70℃で凍結した。

発酵槽培養用に種培養を開始するために、２本の凍結
培養液を急速解凍して６のスピナ−フラスコ内の１
の培地に接種するために用いた。この培養液からの増殖
物は９のC.L.培地を含む14のニュー・ブランズウィ
ック・ミクロファーム（New Brunswick Microferm）に
接種するために使用した。シクロデキストリンは毒素の
収率を上げる。

上記成分を溶解し、5N−HClでpHを7.6に調製し、最終
容量に希釈し、さらにオートクレーブで殺菌した。

上記の熱不安定成分を溶解し、最終容量に調整して10
0倍濃縮物とし、使い捨ての0.2ミクロンナルゲン（Nalg
ene）フィルターユニットを通して濾過殺菌する。発酵
槽培地用には硫酸第一鉄の濃度を1/10にする。

接種後、培地を36〜37℃に保ち、400〜600rpmの羽根
回転速度で激しく撹拌した。通気は環状散気管を通して
0.2〜2.0／分の速度で空気を流入させて行なった。溶
存酸素は40％飽和以上に維持するのが望ましい。（非常
に大量に増殖した場合、そのような酸素濃度に必らずし
も維持できるとは限らない。）培養液をおよそ24〜36時
間増殖させ、その後試料をグラム染色用に、およびCFU
（colonyforming units）を定量するためのBG平板培地
での平板培養用に採取する。またBG平板培地上に形成さ
れたコロニーは溶血素生産でスクリーニングして発酵培
養中を通して毒性期（virulence phase）が維持されて
いることを確認する。

発酵培養液を一枚のH5 P01−43フィルターカートリッ
ジ（カット−オフ分子量10⁶）を装備したアミコン（Ami
con）DL−10L中空系限外濾過に移し、細胞を取去して濾
過液を残した。

PTの生成はセクラ（Sekura）ら、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem），23,14
647（1983）に記載された方法を修正して行なう。簡単
に言えば、アミコン濾過液中に存在する百日咳毒素をア
フィーゲル・ブルー（Affi−Gel Blue）に吸着させて溶
出する。アフィ−ゲル・ブルーを最初に使用する前、さ
らに各精製運転毎アフィ−ゲルブルー樹脂は、５倍ベッ
ト容量の発熱物質を含まない水（PFW）,PFW,0.5Mの炭酸
ナトリウム、PFW,および2M塩素ナトリウムで順次洗浄す
る。使用しない時、樹脂は最終の2M塩化ナトリウム洗浄
液に防腐剤として0.01％チメロソールを加えて４℃で保
持する。使用する前に、樹脂をPFWで洗浄してチメロソ
ールおよび塩化ナトリウムを除去する。

アフィ−ゲル・ブルーカラムからの毒素を含有する溶
出液をPFWで２倍に希釈し、スピナ−フラスコ内で緩や
かに撹拌しながらバッチ法でフェチュイン−セファロー
スに吸着させる。およそ0.5mlの充填ゲルを溶出液中の
推定毒素量1mg当りに対して使用する。使用前に、樹脂
は0.1M−NaHCO₃,0.5M−NaCl pH8.3および0.1M−NaOAc,
0.5M−NaCl pH4.0で交互に繰り返すことによって十分に
洗浄しさらにPFWで洗浄してNaClを除去する。毒素を結
合させた後、樹脂をカラムに注ぎ入れ、10倍ヘッド容量
の0.1M−NaOAc、0.5M−NaCl pH7.0で洗浄する。毒素は4
M−MgCl₂を含む同一緩衝液で溶出させる。

フェチュイン溶出液は大量の0.025M−NaPO₄、0.5M−N
aCl、４％グリセロールで透析して、MgCl₂を除去する。
透析緩衝液のpHは8.7〜8,9に調整する。このpHで数カ月
間毒素を保存しても生物活性の失活は認められなかっ
た。

調製したPTの純度および毒性は以下の方法で試験す
る： a.百日咳毒素のガチョウ赤血球（RBC）凝集能は毒素を
食塩を含むリン酸緩衝液で一連の希釈を行い、次いでそ
れぞれの希釈物を同容量の0.5％ガチョウ赤血球とイン
キュベーションすることによって定量する。終点は完全
に凝集する最低の毒素濃度と定義する。典型的には終点
は100〜200mg/mlであると認められた。

b.精製百日咳毒素は、SDS存在下ラエムリ（Laemmli）緩
衝液システムを用いた電気泳動によってその純度を分析
する。調製物がS1〜S5に相当するサブユニットからな
り、かつ外来蛋白質の混入を示す蛋白質のバンド染色が
認められない場合にこの調製物は均質であると考えられ
る。

c.混入したエンドトキシンのレベルはLALアッセイ（以
下に示す）によって定量する。トキソイド調製用に使用
される調製物は50EU/mg以下の毒素を含む。

百日咳トキソイド 本発明の百日咳トキソイドは百日咳毒素とかなり類似
しているために哺乳類では免疫原性応答を引き起こす
が、百日咳毒素とはかなり異なるためにPTの毒性効果を
示さない。一般的に、酵素機能および結合機能の両方が
分子にその生物活性を付与しているために、毒性を減少
させるための修飾は毒素のS₁サブユニットおよびそのＢ
オリゴマーに起こらなければならない。

本発明のトキソイドは、化学修飾してPTを安定な免疫
原性トキソイドに不可逆的に転化することによって、PT
より調製される。最も好適には、この修飾はPTをTNMの
ようなニトロ化試薬で処理することによって行なわれ
る。この方法はその収率を最大にするために洗浄剤存在
下で行なうのが最も適している。ワクチン調製用に選択
した洗浄剤は、pH7.0以上、好適には約pH8.5の緩衝液中
の１％濃度のコール酸（天然の血清成分）である。ま
た、これ以外の非細胞障害性洗浄剤も適している。どの
ような特別な理論とも結びつかないが、出願人らは、こ
れらの洗浄剤がPTに作用してTNMのようなニトロ化試薬
と反応するためにチロシン残基を露出させると考えてい
る。

変法として、修飾PTは本来のPTをコードする核酸の修
飾を含む遺伝的手段によっても製造される。核酸、特に
S₁をコードするDNA内の１個以上のチロシンコドンを他
のコドンに転化すること、またはこれらの残基を完全に
欠落させることによる核酸の修飾は安定で無毒性の百日
咳トキソイドを生産することができる。

実施例1.PTのTNMでの化学修飾 サブロットのPTを解凍して凝集PTを0.2μＭゲルマン
・アクロディスク（Gelman acrodisc）で濾過除去し
た。蛋白質濃度を透析用緩衝液で220〜240μg/mlに調整
した。一旦蛋白質濃度を調整した後、1/10容量の10％コ
ール酸をトキシンアリコート（Aliquot）に加え、その
結果アリコートのコール酸塩濃度は１％になった。連続
的に撹拌しながら、６％TNM/エタノールをTNMの最終濃
度が0.12％になるまで反応物に滴下した。次いで、この
混合物を２時間室温（20〜22℃）に放置した。反応物に
1/100容量の1M−DDTを加えて急冷（クエンチ）した。次
いで反応混合物は100倍容量の透析用緩衝液（0.5M−NaC
l、４％グリセロール、0.025M−NaPO₄、pH8.5）を３回
交換することによって透析した：緩衝液の交換は少なく
とも24時間４℃に放置した後行なった。十分なトキソイ
ド回収率を確保するために透析はpH7.0以上、好適にはp
H8.5以上で行なうのが望ましい。

トキソイド溶液を0.2ミクロンのゲルマン・ポリスル
ホン・アコディスクで濾過した。次いで４℃に保存し
て、以下に記載する方法でその無菌性、残存活性、蛋白
質含有量、および復帰変異について試験した。

ワクチン接種用トキソイドを調製するために、トキソ
イドをリン酸アルミニウム上に吸着させた。最終生成物
として製剤した場合、調整物は0.90±0.05mg/mlのAlを
含む。

簡単に言えば、吸着は次のように行われた：無菌スピ
ナ−フラスコに最終成分を次の順序： １）0.02％メルチオレートを含む２×AlPO₄ゲル、２）
液体百日咳トキソイド、および３）適切容量の25mM−Na
H₂PO₄、pH5〜6.0:で加え、50μg/mlトキソイドおよび0.
01％メチオレートを含有する１×AlPO₄調製物を得た。
調製物は室温で１時間、さらに４℃で一晩撹拌した。試
料を以下に記載するような標準法によって、その無菌
性、復帰変異分析、力価およびチメロサール定量を行な
うために採取した。

実施例2:トキソイドをコードするPT遺伝子の変異 図に示すように、S₁は（上にS1と書かれた）ATGコド
ンで始まり、塩基番号1313のTAGコドンまでにわたるDNA
にコードされている。チロシンコドンにはＹの符号がつ
けられている。チロシン残基がS₁の毒性と掛かり合うこ
とは、毒性の除去、即ち毒性のトキソイドへの転化にお
けるTNMの上述の効果によって証明される。同じ結果が
１個以上のチロシンコドンを欠落させることによって、
または１個以上のチロシンコドンを非芳香族アミノ酸コ
ドンで置き替えることによって得られる。

次にS₁領域を修飾してトキソイドを製造するのに適し
たオリゴヌクレオチドの例を２つ示す。当業者は、S₁の
修飾がこれらのオリゴヌクレオチド、またはその他のオ
リゴヌクレオチドを使用して、さらにガイド（Gait）、
「オリゴヌクレオチドの合成（Oligonucleotide Synthe
sis）、ア プラクティカル アプローチ（A Practical
Approach）」、ガイド編、IRLプレス株式会社、オック
スフォード、英国（1984）、６〜７頁およびその中に列
挙されている参考文献に記載されているような、インビ
トロ（in vitro）での標準的な変異誘発法を使用して簡
単に行なわれることを認めるであろう。

塩基位置796−799（図面）のチロシン残基を置換する
のに適当なオリゴヌクレオチドは である。オリゴヌクレオチドの下の文字はアミノ酸（標
準−文字記号）を表わす。このオリゴヌクレオチドで
は、796−799の位置のチロシンがアスパラギン（Ｎ）で
置換されている。下線を符した塩基とこのオリゴヌクレ
オチドに導入された１−塩基対突然変異を示す。

塩基位置999−1001（図面）のチロシン残基を欠落さ
せるのに適当なオリゴヌクレオチドは である。このオリゴヌクレオチドの中央の線は999〜100
1の３塩基の欠落領域を表わしており、オリゴヌクレオ
チドそれ自体には依存しない。

簡単に言えば、これらのオリゴヌクレオチドを使用し
てS₁遺伝子を突然変異させるためには、オリゴヌクレオ
チドを本来の百日咳毒素のS₁ユニットをコードする環状
M13−本鎖DNAの鋳型にアニールし、クレノー（Klenow）
DNAポリメラーゼを用いて延長し、次いでT₄−リガーゼ
を用いて結合する。次いで、そのようにして形成された
二本鎖分子を大腸菌（E.Coli）細胞に形質転換するため
に用い、その結果得られたプラークを単離した。これら
のプラクーから得られたDNAは所望の突然変異体毒素を
コードしている。

その他のＳ−サブユニットの類似の修飾もまた有用な
トキソイドを供給することができる。

修飾した要素遺伝子を適切な細胞に形質転換し、トキ
ソイドをこれらの細胞で発現させ、その後標準法で単離
する。このトキソイドはTNM−処理トキソイドのために
上述した方法に従って、ワクチンに調製する。

TNMトキソイドの毒性および免疫原性 毒素の不活性化を評価するために、我々は本発明のト
キソイドの残存赤血球凝集活性、リポシラーゼ活性、CH
O−細胞クラスター形成活性およびHSF活性についてアッ
セイを行なった。

a.残存赤血球凝集（HA）活性 毒素がガチョウの赤血球を血球凝集させる能力は蛋白
質の細胞結合／付着活性を表わすと考えられている。最
近、この結合作用はヒトＴ−リンパ腫培養細胞にマイト
ジェン応答を誘導する能力があることが示された。従っ
て、これから開発しようとするトキソイドは残存HA活性
が全くないことが望ましい。故に、吸着させる前にすべ
ての百日咳トキソイドは、その毒性が十分に除去されて
いることを確認するために、HA試験を行って活性が検出
できないことを証明するべきである。

b.残存ヒスタミン感作因子（HSF）活性 百日咳毒素がマウスのヒスタミンの亜致死服用量を感
作する能力は非常に感度の高いバイオアッセイである。
１〜2ng/マウスの感度で、HSFアッセイは微小量の残存
毒素活性を検出する能力を持つインビボ（invivo）シス
テムを提供する。ヒトに使用する場合の安全性を考慮し
て、吸着させる前にすべての百日咳トキソイドワクチン
は試験用マウスに少なくとも30μg/マウスの投与量を静
脈注射（IV）してもHSF活性を示してはならない。この
アッセイの標準的方法は当業者には明らかであろう。

c.残存するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の
クラスター形成活性 CHO細胞をpg/ml濃度の百日咳毒素にさらすと、再現性
がありかつ定量可能な形態変化を引き起こす。この変化
は、細胞がその典型的な繊維芽細胞の形態を失い、集ま
り、さらに凝塊を形成するクラスター形成効果として説
明されている。アッセイの感度が高いため、我々はこの
クラスター形成活性を利用してトキソイド調製物をスク
リーニングすることにした。HAおよびHSF試験の場合と
同様、トキソイドとして容認され得るためには調製物は
少なくとも10μg/mlの濃度で試験を行なった場合にCHO
細胞クラスター形成活性を示さないことが望ましい。こ
のアッセイの標準的方法は当業者には明らかであろう。

本発明（TNM−処理）の百日咳トキソイドの医療用製
品に対するこれらの分析結果を第２表に示す。赤血球凝
集によって評価されるような結合活性は存在しないこと
がはっきりと示された。Ａ−プロトマー機能（例えばリ
ボシラーゼ活性）のアッセイではわずかな（3.4％）残
存活性が示された。この活性だけではCHO細胞およびHSF
の結果によって示されるようにホロトキシン毒素活性を
調製物に対して少しも与えるものではないと考えられ
る。

百日咳トキソイドの安定性を確認するために、我々は
液体トキソイドおよびリン酸アンモニウムアジュバンド
に吸着させた後の両方の調製物に対して広範囲にわたる
復帰分析を行なった。２種類の調製物、流体および吸
着、を25℃および37℃にインキュベーションしてストレ
ス試験を行なった。４週間および８週間後、それぞれの
調製物のHSF活性を試験した。液体トキソイドの場合、
ヒトの１回の投与量のほゞ２倍相当量（38μｇ）を20匹
のマウスのそれぞれに静脈注射（IV）した。吸着トキソ
イドについてはヒトの１回の投与量の１倍相当量（25μ
ｇ）をマウスに腹腔内注射（IP）した。それぞれの試験
の結果を第３表に示す。復帰徴候はどちらの調製物にも
認められなかった。

また、液体トキソイド試料に対してCHO細胞クラスタ
ー形成アッセイを用いた復帰試験を行なった。これらの
結果を第４表に示す。HSF復帰アッセイの結果と同様
に、百日咳毒素調製物において不安定性は検出できない
ことが認められた。

免疫応答を引き起こす吸着百日咳トキソイドの能力を
定量するために、ヒトの１回の毒素投与量の1.5倍（37.
5μｇ）を８匹の500gモルモットに注射した。免疫処置
後４週間および６週間で動物から採血し、それらの抗百
日咳毒素の力価をIgG−特異的ELISAおよびCHO細胞中和
アッセイによって定量した。結果、それらのうちのいく
つかを第５表に示す、はMAPT−１調製物に免疫原性が潜
在していることを明確に証明しており、その調製物は６
週間後のCHO細胞中和アッセイにおいて1/400以上の力価
を示す。第５表には比較のために、バイオロジックス・
ラボラトリー（Biologics Laboratory）製造の認可済DT
Pワクチン（製品260）、および国立衛生研究所（the Ja
panese National Institute of Health）製造の実験段
階のワクチン（JNIH6）から得られた結果もまた含まれ
ている。JNIH6は現在スウェーデンで臨床研究中であ
り、効果があると考えられている。以上のように、血清
応答結果より、本発明の吸着百日咳トキソイドワクチン
は現在の全細胞ワクチンの代わりとして有望であると考
えられる。

また、TNM−トキソイドの抗原性をウサギのポリクロ
ーナル抗毒素血清を用いた競合ELISAによっても定量し
た。このアッセイの標準的操作法は当業者には明らかで
あろう。（フェチュインと残存毒素分子との結合を利用
した、別の適切な方法も当業者には明らかであろう。）
このアッセイはELISA板上に塗布した毒素と結合した抗
体と競合するトキソイドの能力を比較している。TNM調
製トキソイドは、ウサギの抗血清によって認識される抗
原決定基のすべてではないにしろ、そのほとんどを保持
している。５μg/ml濃度で、トキソイドは抗体結合能力
の80％以上の競合する能力がある。

トキソイド調製物の有用性を定量するために適切なそ
の他の試験として発熱原性、残存TNM、チメロサール、
残存リポ多糖（LPS）、コール酸および無菌についての
試験がある。これらの試験は以下の手順で行なった。

a.発熱原性試験：望ましくは、５μg/kgの投与量を用い
て、すべての液トキソイド製品は標準的なウサギの発熱
試験に合格しなければならない。この投与量は２カ月の
乳児（5kg）およびトキソイド調合量25μg/SHDより予測
されるトキソイド／乳児体重の比率に近い。この試験の
標準操作法は当業者には明らかであろう。

b.残存テトラニトロメタン： 試験を行なう前に、トキソイド化物質はアミコン・ミ
ニコンセントレーター（Amicon miniconcentrator）を
通過させ、TNMアッセイはこの濾過液を用いて行なう。
テトラニトロメタンおよびその副産物は比色アッセイを
用いて検出する。簡単に言えば、10％ヨウ化カリウム溶
液をトキソイド濾過液のアリコートと反応させる。ニト
ロ基が存在するとヨウ化物はヨウ素を形成して黄色に発
色し、これは410nmでモニターできる。このアッセイの
感度は0.0006％である。許可されるためには、すべての
トキソイドが検出可能なTNMを含まないことが望まし
い。

c.チメロサールの定量： バルクトキソイドのチメロサールの標準的アッセイ法
は当業者には明らかであろう。

d.LALアッセイで定量した残存リポ多糖（LPS）： 標準LALアッセイで試験した場合、濃度50μg/mlの液
体トキソイドは約２大腸菌（E.coli）エンドトキシン単
位/ml以上を含んではならない。このことは上限でおよ
そ0.01ng/mlのボルデテラペルツッシス（Bordetella pe
rtussis）のLPSの混入を許している。LPS重量／蛋白質
に換算すると、この値は最大約２×10^-5％の混入と等価
であろう（LALアッセイにおいて、1ngボルデテラ ペル
ツッシスLPS＝160大腸菌エンドトキシン単位）。LALア
ッセイ法は当業者には明らかであろう。

e.残存コール酸 標準アッセイ法は当業者には明らかであろう。

f.バルクの吸着百日咳トキソイドに対する無菌性試験
〔ステリテスト（steritest）〕用標準処方は膜濾過液
の作用による方法である。

使 用 ひとたび構築されれば、本発明のトキソイドは標準的
手順でワクチンに加工され、さらに宿主に免疫応答を誘
発するために十分な投与量を経口または非経口で投与す
る。例えば10〜50μｇのトキソイドを腹腔内（IP）注射
で３〜24カ月の幼児に３回投与し、３年以後に二次免疫
注射を行なう。

他の実施態様は特許請求の範囲に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は百日咳毒素をコードする遺伝子のDNA配列、お
よびそれに対応するアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｉｎｆｅｃｔ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔ ｙ，Ｖｏｌ．55，ｐ．1294（1987) Ｉｎｆｅｃｔ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔ ｙ，Ｖｏｌ．46，ｐ．422（1984) ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．66 （２），ｐ．261−263（1976) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/235,1/113,1/107 A61K 39/10,38/00 C12N 1/21 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ひとつまたは複数のチロシン残基において
   のみ修飾された百日咳毒素からなる、トキソイド。
2. 【請求項２】百日咳毒素をTNMと反応させることにより
   百日咳毒素のひとつまたは複数のチロシン残基がニトロ
   化された、請求項１記載のトキソイド。
3. 【請求項３】百日咳毒素をTNMと反応させて百日咳毒素
   のひとつまたは複数のチロシン残基をニトロ化すること
   により調製された、トキソイド。
4. 【請求項４】百日咳毒素をTNMと反応させることにより
   百日咳毒素のひとつまたは複数のチロシン残基をニトロ
   化する、百日咳トキソイドの調製法。
5. 【請求項５】請求項１記載のトキソイドを含む、ヒトの
   百日咳を予防するためのワクチン。
6. 【請求項６】百日咳毒素がTNM処理により修飾されて百
   日咳毒素のひとつまたは複数のチロシン残基がニトロ化
   された、請求項５記載のワクチン。