JPH0272200A - 百日咳トキソイドワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は百日咳を予防するワクチンとして適当な抗原の
開発に関する。

（従来技術） 百日咳は細菌工水ｋｊＬデｊ−・ペル″　シスＢａｒ牡
虹虹旦」肛旦５ｓｉｓ）に感染した結果起こる症状の重
い、伝染性の強い呼吸器の病気である。現在のところ十
分に効果的な治療法はなく、この病気は相当の患者数お
よび死亡率と関連しており世界中に広がっている。百日
咳は幼児にとっては特に過酷である。

サト（Ｓａｔｏ）ら、インフェクション・アンド・イミ
ｓニー　　−Ｉｎｆｅｃｔ、　＆　Ｉｍｍｕｎｉｔ　　
１４６＋　４２２（１９８４）は、百日咳を抑制する全
細胞ワクチンの使用とその全細胞ワクチンが最近限定ワ
クチンに取って代わって来ていることについて記述して
いる。

死菌細胞からなる百日咳ワクチンは４０年以上の間世界
中で百日咳を減少させる役割を果たして来ている。だが
、同時にそのワクチンはワクチンの副作用のために最も
受入れられなかったワクチンの一つである。現在では、
全細胞ワクチンはより限定されたワクチンに取って代わ
って来ており、この限定ワクチンは特異的成分からなり
、さらに精製した関連防御抗原または抗体によって評価
される防御力を持つことが可能である。日本で１９Ｂ１
年から使用されている百日咳ワクチンはボルデテラ　ベ
ルツソシスのフェース１の細胞の培養上澄液の画分から
エンドトキシンを除去することおよびホルマリンである
程度毒素性を不活性化することによって幾分か副作用を
減少させである。ワクチンの主成分は百日咳毒素（ＰＴ
）および線状血球凝集（ＦＨＡ）をホルマリン処理した
ものである。現在のところ我々は、ＰＴが最も有力な抗
原でありＦＩＩＡは補助的な防御抗原であること、なら
びにそれらに対する抗体が伝染病および病原体を原因と
する病気からマウスを防御するのに重要な役割を果たし
ていると推測している。

そのような限定ワクチンを調製するために、ＰＴおよび
ＦＨＡを連続カラムクロマトグラフィー法によって精製
す。（サトら、同上）。次いでＰＴおよびＦｌｌＡを０
．２χホルマリンで３９℃で処理しさらに０．１％ホル
マリンでさらに１日おきに２回以上処理して、その後透
析する（同上、４１５頁）。

代替法は、ＦＨＡを含まないＰＴを調製し、次いでＰＴ
を０．０５％グルタルアルデヒドで処理して解毒さたＰ
Ｔを得ることからなり、それは伝染病からマウスを防御
するのに効果がある。（ムノズ（Ｍｕｎｏｚ）ら、イン
フエクション・アンド・イミユニティ−３２，２４３（
１９８１）　）。

百日咳毒素を定義するために用いられている用語は文献
中でも混乱している。ＰＴは［リンパ球増加症−ヒスタ
ミン惑作囚子、島（ｉｓｌｅｔ）活性化蛋白質および百
日咳前駆体（ρｅｒｔｕｓｓｉｇｅｎ）　Ｊとしても知
られている。ロット（Ｌｏｃｈｔ）　　ら、サイエンス
旦虹組組し」双、　１２５８（１９８６）。最近、アー
ムストロン’；’　（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）　ら、イン
フエクション　アンートーイヨＬＬ玉ｊジ仁二、刹、　
１２９４（１９８７）、はＰＴについて次のように記載
している。

ＰＴはＳｔ〜ＳＳと呼ばれる５つのサブユニットからな
るヘテロヘキサマー蛋白質である。それらの遺伝子配列
より、サブユニットの分子量はＳ、が２６、０２４、Ｓ
２が２１，９２５、Ｓ３が２１，８７３、Ｓ４が１２，
０５８゜およびＳ、が１１．０１３である。最大のサブ
ユニットＳ＋は真核生物細胞に存在する相同のグアニン
ヌクレオチド依存性調整複合体（ＧまたはＮと呼ばれて
いる）の−族であるαサブユニットをＡＤＰ−リボシル
化する原因となる。他の４つのサブユニットはＳ、を介
して互いに結合する２つのダ・イマー（Ｓ、Ｓ。

（ダイマーｌ）および５３Ｓ４　（ダイマー２）〕から
なるペンタマーの空水単位（ｂａｓｅ　ｕｎｉｔ）を形
成すると考えられている。基本構造の機能番よ宿主細胞
レセプターへの結合、およびＳｌサブユニ、トが細胞膜
を通過する手段の提供にある。

セリン、スレオニン、およびチロシン残ｉは、ＰＴでは
大腸菌Ｊ−Ｅ、ご＋１ｊ）−蛋白質の平均よりもより頻
繁に現われる（ロソ）　（Ｌｏｃｈｔ）　ら、土エエ２
入（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２３２．１２５８（１９８６
））　、これらの残基の水酸基は、水素（、！１合によ
ってＰＴの四次構造内に巻き込まれているであろうと考
えられる（ロットら、同上）、リジン残基はＰＴｉＪｔ
伝子のＳ、サブユニットにはなく、このことは「リジン
を特異的に化学修飾してもＳ、のヒドロキシル活性およ
び酵素活性に影゛Ｓを及ぼさないという理由の説明とな
るであろう、」（ロットら、同上） ニコンア（Ｎｉｃｏｓｉａ）　　ら、プロシーディング
・サブ・アカデミンク・サイエンス・オプ・ザ・ユナイ
テソド・ステイク・サブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。

八ｃａｄ、ｓｃｉ、１１．ｓ、Ａ）、８３．４６１３（
１９８６）は、サフ゛ユニットＳｌ内にはりジン残基が
欠如している故に、ＰＴを不活性化するためには厳しい
条件が必要であると記述している。

Ｓｔサブユニットはりジン残基を含まない数少ない蛋白
質の１つである。この認識は百日咳の新規ワクチンを開
発する上で重要なががわり合いをもつ、というのは、標
準的なワクチン調製では細菌毒素を主にリジン残基と反
応する化学薬品で解毒するからである。従って、ＰＴを
解毒するためには他の細菌毒素に使用される条件よりも
より厳しい条件が必要であり、さらにそれに次いでグル
タルアルデヒド処理を行なうとＳｌは本来の大きさのま
Ｘ、残るがＳ２．　Ｓ３．５４およびｓ５は架橋されて
高分子量の凝集体を形成することを発見した。

ＰＴはヨウ素化に対して感受性であると記載されている
がそのような感受性はフェチュイン−アガロースへの吸
着によって減少させることができる〔アームストロング
（Ａｒｍｓ　ｔｒｏｎｇ）　　ら、上記〕。この感受性
について考えられる理由の１つは、ＰＴの中に存在する
多故のチロシン残基であり、それらのうちのあるものは
毒素としてのＰＴの機能上重要であろう。情用的なヨウ
素化研究において、そのような重要なチロシンの修飾は
失活理由の説明の１つであり得た（アームストロングら
、同上）最近、ＰＴサフ゛ユニントをコードするＤＮＡ
のクロニングについて記載されている（ロットら、上記
；ニコシアら、上記）。ロットらは、ワクチンの開発に
そのような遺伝子を利用することについて記載している
。

百日咳毒素の遺伝子をクローン化し配列決定することは
百日咳に対して有効な毒素緩和ワクチンの開発を容易に
するであろう。類似した生化学的機能を持つ他毒素の遺
伝子と比較することによって、さらにＳ１サブユニツト
のＡＤＰ−リボシル化活性部位またはＳ２・Ｓ４サブユ
ニツトの標的細胞結合活性部位のどちらかを物理的に同
定することによって、現在では本土ヱ±立　ユ火又工之
ム（Ｌ組Ｌｔｕｓｓｉｓ）ゲノムの部位特異的変異誘発
によるそのような部位の修飾が可能である。このような
修飾は毒素の免疫原性および防御性を抑制することなく
百日咳毒素の病理生物活性を完全に破壊する。

一方、ＤＮＡ配列を知ることによって、防御抗原決定基
の位置を決めることが可能になるであろう。

そのような抗原決定基を含むオリゴヌクレオチドを合成
することも、また、新世代のワクチン開発に有益であろ
う。

（課題を解決するための手段） 第一観点において、本発明はヒトの百日咳を予防するワ
クチンとして適当なトキソイドを特徴とし、このトキソ
イドはポリペプチドがらなり、このポリペプチドは濃度
５　、／ｄで標準競合ＥＬＩＳＡアッセイ試験を行なっ
た場合にポリクローナル抗毒素抗体の結合活性の８０％
以上と競合する能力を持つような十分な抗原性を保持し
、かっこのトキソイドは３７℃に８週間放置してもＣＨ
Ｏ細胞アンセイで評価されるような毒性復帰傾向を示さ
ない。

好適な実施態様において、３７．ｓｇのポリペプチドを
５００ｇのモルモットに注射すると、ＣＨＯ細胞中和ア
ンセイで測定した場合の少なくとも１／２００の力価に
相当する中和抗体が生産され、かつトキソイドはその生
物活性をアンセイした場合にＣ）１〇−細胞ア、２セイ
で定量した百日咳毒素の毒素活性の０．０００５％未満
である；トキソイドは一匹のマウス当り少なくとも３０
Ｉ！ｇの服用量を静脈注射（ＩＶ）して試験した場合に
ＨＳＦ　ｇ７験での死亡原因とはならない；トキソイド
はガチョウのＲＢＣ，で定量される本来の血球凝集活性
の１％以上を保持しない；トキソイドは本来のＡ叶−リ
ボッラーゼ活性の５％未満を保持する；トキソイドは３
７℃で８週間放置してもＨ３ＰまたはＨＡアッセイで評
価されるような復帰傾向を示さない；トキソイドは百日
咳毒素をニトロ化試薬、最も好適にはテトラニトロメタ
ン（ＴＮＭ）と反応させることによって調製される。

他の関連態様において、本発明はヒトの百日咳を予防す
るワクチンとして適当なトキソイドを特徴とし、このト
キソイドは本質的にはチロシン残基のみを飾修した百日
咳毒素からなる。好適には、百日咳毒素はトリニトロメ
タン処理によって飾修する。また、本発明は精製した百
日咳毒素をＴＮＭと反応させることによって調製したト
キソイドを特徴とする。

他の関連態様において、本発明は精製百日咳毒素をニト
ロ化試薬、例えばＴＮＭと反応させることを含む百日咳
トキソイドの調製法を特徴とする。

さらに他の態様において、本発明は免疫化量のトキソイ
ドをヒトに投与することを含むヒトの百日咳予防法を特
徴とする。

本発明の他の態様および長所は次に記載する好適な実施
態様および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

］毒−ヒ ＰＴは、例えばアームストロング（１９８７）およびサ
トら＜１９８４）の上記引用文献に記載されているよう
な仔章の標準的な方法によって調製することができる。

ＰＴ裂造の好適な方法を以下に詳細に述べる。

どのような土上ア土旦・ベルブ　シス（Ｂ、Ｐｅｒｔ競
旦旦でもトキソイド調製のための百日咳毒素源として利
用しうる０例えば、ＰＴはボルデテラ・ベルランシス株
：　Ｃ３Ｋ２．１８３２３ＣＩまたは１８３３４に＋　
　：から調製される。　Ｃ３ＫＺ株は、ロン　セクラ博
士（Ｏｒ。

１１ｏｎ　５ｅｋｕｒａ）より頂いた、トランスポゾン
変異誘発によりて生じたＣ３株のカナマイシン耐性誘導
株である。１８３３４ＫＩ株は、初めザ・ミノガン・デ
パートメント・オプ・パブリック・ヘルス（ｔｈｅ　Ｍ
ｉｃｈｉｇａｎ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｕｂ
ｌｉｃ　１ｌｅａｌｔｈ）で単離された１８３３４株の
カナマイシン耐性ＳＡ　＞１株である。

百日咳毒素を０．５〜１．０■／２生産する既知の任意
株が適当である。そのような株はＡＴＣＣ（例えば１８
３２３株）またはＯ，ＢＲＲ（例えばトハマ（Ｔｏｈａ
ｍａ）　１あるいは１６５株）より容易に人手できる。

凍結保存用種培養（ｓｅｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ）は１０
０ｍｆｆ１のンクロデキストリンー富化Ｃ几、培地（第
１表に示す）にいろいろなり、Ｇ、平板地に増殖した菌
株を接種してｊＪｉＩ製する。

この培養液は１ｅの培地を含むスピナーフラスコへの接
種用に使われる。、２４時間後、無菌グリセロールが２
０％になるように加え、！、　９Ｑ液を４０ｄずつに分
割し、その後−７０℃で凍結した。

発酵槽培養用に種培養を開始するために、２本の凍結培
養液を急速解凍して６Ｐのスピナーフラスコ内の１ｐ、
の培地に接種するために用いた。この培養液からの増殖
物は９Ｐのｃ、し、＋Ｂ地を含む１４ｉのニュー・プラ
ンズウィノク・ミクロファーム（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗ
ｉｃｋ　Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）に接種するために使用し
た。シクロデキストリンは毒素の収率を上げる。

トリス（Ｔｒｉｓ） ６．０ グルタミン酸ナトリウム 塩化ナトリウム リン酸カリウムーー塩Ｗ 塩化カリウム 塩化マグヱシウムー六永和吻 塩化カルシウムー二永和吻 プロリン ヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル） ＩＯ９７ ２，５ ０，５ ０，２ ０，１ ０，０２ ０，２４ １，０ Ｂ−ンクロデキストリン アンチフオーム（＾ｎｔｉｆｏａｍ）　Ｃ０，４５ｄ／
　ｆｆ 上記成分を溶解し、５Ｎ−１１ｃＺでｐｌ＋を７．６に
調製し、最終容量に希釈し、さらにオートクレーブで殺
菌し／こ。

成分（熱不安定） ナイアシン 硫酸第一鉄−七水和物 ノスティン グルタチオン アスコルビン酸塩 カナマイノン ｇ／ｅ Ｏ，００４ ０，０１ ０，０４ ０，１５ ０，４ ０、Ｏ６ 上記の熱不安定成分を溶解し、最終容量に調整して１０
０倍濃縮物とし、使い１ｅての０．２ミクロンナルゲン
（Ｎａｌｇｅｎｅ）　フィルターユニットを通して′Ｊ
ｙ過殺菌する０発酵槽培地用には硫酸第一鉄の４度を１
／１０にする。

接種後、培地を３６〜３７℃に保ち、４００〜６００ｒ
ｐＩＩＩの羽根回転速度で激しく攪（↑した。通気は環
状散気管を通して０．２〜２．０１７分の速度で空気を
流入させて行なった。、溶存酸素は４０％飽和以上に維
持するのが雫ましい。（非常に大量に増殖した場合、そ
のような酸素濃度に必らずしも維持できるとは限らない
。）培ａ液をおよそ２４〜３６時間増殖させ、その後試
料をダラム染色用に、およびＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙｆｏ
ｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）を定量するためのＢＧ平板培
地での・平板培ｌ用に採取する。またＢＧ平板培地上に
形成されたコロニーは溶血素生産でスクリーニングして
発酵培養中を通して毒性期（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｐｈ
ａｓｅ）が維持されていることを確認する。

発酵培養液を一枚の１＋５　Ｐｏｔ−４３フイルターカ
ートリンジ（カット−オフ分子量＋０６）を装備したア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＤＬ−１ＯＬ中空系限外濾過に
移し、細胞を取去して濾過液を残した。

ＰＴの精製はセクラ（Ｓｅｋｕｒａ）ら、之土二土土・
走ブＩバイオロジカル駕り辷んＩＬ二（Ｊ、　Ｒｉｏｔ
。

Ｃｈｅｅｔ５に２３．１４６４７（１９８３）に記載さ
れた方法を修正して行なう。簡単に言えば、アミコンｉ
ｔｔ過液中に存在する百日咳毒素をアフィーゲル・ブル
ー（ＡｆｆｉＧｅｌ　Ｂｌｕｅ）に吸着させて溶出する
。アフィーゲル・ブルーを最初に使用する前、さらに各
精製運転毎アフィーケルプルー樹脂は、５倍へント容量
の発熱物質を含まない水（ＰＦＷ）、　ＰＦＷ、　０．
５？Ｉの炭酸ナトリウム、ＰＦＷ、および２Ｍ塩化ナト
リウムで順次洗浄する。使用しない時、樹脂は最終の２
Ｍ塩化ナトリウム洗浄液に防腐剤として０．０１％チメ
ロソールを加えて４℃で保持する。使用する前に、樹脂
をＰＦ−で洗浄してチメロソールおよび塩化ナトリウム
を除去する。

アフィーゲル・ブルーカラムからの毒素を含をする溶出
液をＰＦ−で２倍に希釈し、スピナーフラスコ内で緩や
かに撹拌しなからバッチ法でフェチュイン−セファロー
スに吸着させる。およそ０．５ｄの充填ゲルを溶出液中
の推定毒素量１■当りに対して使用する。使用前に、樹
脂はＯ，１Ｍ−ＮａＨＣＯｚ＋０．５Ｍ−Ｎａ（Ｊ　ｐ
Ｈ８，３およびＯ，ＩＭ−ＮａＯＡｃ、　０．５Ｍ−Ｎ
ａＣＺｐＨ４，ｏで交互に繰り返すことによって十分に
洗浄しさらにＰＰ−で洗浄してＮａＣ１を除去する。毒
素を結合させた後、樹脂をカラムに注ぎ入れ、１０倍ヘ
ンド容量のＯ，ＬＭ−ＮａＯＡｃ、０．５Ｍ−ＮａＣＺ
　ｐＨ７，０で洗浄する。毒素は４Ｍ−ＭｇＣ７ｇを含
む同−緩行を夜で？容量させる。

フェチュイン溶出液は大量の０．０２５１１−ＮａＰＯ
イ、０．５Ｍ−ＮａＣＺ、４％グリセロールで透析して
、ＭｇＣ／。

を除去する。透析緩衝液のｐｉは８．７〜８．９に調整
する。このｐｌ＋で数カ月間毒素を保存しても生物活性
の失活は認められなかった。

調製したＰＴの純度および毒性は以下の方法で試験する
： ａ、百日咳毒素のガチョウ赤血球（ＩＩＢＣ）凝集能は
毒素を食塩を含むリン酸緩衝液で一連の希釈を行い、次
いでそれぞれの希釈物を同容量の０．５％ガチョウ赤血
球とインキュベーションすることによって定量する。終
点は完全に凝集する最低の毒素濃度と定義する。典型的
には終点は１００〜２００ｍｇ／　ｍｌであると認めら
れた。

ｂ、ｔｓ製百日咳毒素はＳＤＳ存在下ラエうリ（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ）ＩＩ衝液液システム用いた電気泳動によって
その純度を分析する。調製物が５１〜Ｓ５に相当するサ
ブユニットからなり、かつ外来蛋白質の混入を示す蛋白
質のバンド染色がＬ２められない場合にこの調製物は均
質であると考えられる。

Ｃ８混入したエンドトキシンのレベルはＬＡＬアッセイ
（以下に示す）によって定量する。トキソイド調製用に
使用される！Ｉｌ製物は５０Ｅｔｌ／ＩＩＩｇ以下の毒
素を含む。

百」−吸１東Ｌエヱ 本発明の百日咳トキソイドは百日咳毒素とかなり類憤し
ているために咄乳煩では免疫啄性応答を引き起こすが、
百日咳毒素とはかなり異なるためにＰＴの毒性効果を示
さない。−船釣に、酵素機能および結合機能の両方が分
子にその生物活性を付与しているために、毒性を減少さ
せるだめの修飾は毒素の３１サブユニントおよびそのＢ
オリゴマーに起こらなければならない。

本発明のトキソイドは、化学修飾してＰＴを安定な免疫
原性トキソイＶに不可逆的に転化することによって、Ｐ
Ｔより調製される。最も好適には、この修飾はＰＴをＴ
ＮＭのようなニトロ化試薬で処理することによって行な
われる。この方法はその収率を最大にするために洗浄剤
存在下で行なうのが最も適している。ワクチン調製用に
選択した洗浄剤は、ｐ１１７．０以上、好適には約ｐｌ
＋８．５の緩衝液中の１％濃度のコール酸（天然の血７
ｎ成分）である。

また、これ以外の非細胞障害性洗浄剤も通している。ど
のような特別な理論とも結びつかないが、出願人らは、
これらの洗浄剤がｌ’Ｔに作用してＴＮＭのようなニト
ロ化試薬と反応するためにチロシン残基を露出させると
考えている。

変法として、修飾ＰＴは本来のＰＴをコードする核酸の
修飾を含む遺伝的手段によっても製造される。

核酸、特にＳ、をコードするＩ）ＮＡ内の１個以上のチ
ロシンコドンを他のコドンに転化すること、またはこれ
らの残基を完全に欠落させることによる核酸の修飾は安
定で無毒性の百日咳トキソイドを生産することができる
。

実」１州１．ＰＴのＴＮ？ｌ゛の　“　　−サブロフト
のＰＴを解凍して凝集ＰＴを０．２μＨゲルマン・アク
ロディスク（Ｇｅｌｍａｎ　ａｃｒｏｄｉｓｃ）で濾過
除去した。蛋白質濃度を透析用緩衝液で２２０〜２４０
　ｇｇ　／　ａｎに調整した。−旦蛋白質濃度を調整し
た後、１ノ１０容１０１０％コール酸をトキシンアリコ
ート（Ａｌｉｑｕｏｔ）に加え、その結果アリコートの
コール酸塩濃度は１％になった。連続的に攪拌しながら
、６％ＴＮＭ／エタノールをＴＮＭの最終濃度が０．１
２％になるまで反応物に滴下した。次いで、この混合物
を２時間室温（２０〜２２’Ｃ）に放置した。

反応物に１ノ１００容量のＩＤＤＴを加えて急冷（クエ
ンチ）した。次いで反応混合物は１００倍容量の透析用
復液’１１１　（０，５？１−Ｎａ（Ｊ、４％グリセロ
ール、０．０２５Ｍ−ＮａＰＯ，、ｐｌ＋８．５）を３
回交換することによって透析した二緩衝液の交換は少な
くとも２４時間４℃に放置した後行なった。十分なトキ
ソイド回収率を確保するために透析はｐＨ７，０以上、
好適にはｐｌ＋８．５以上で行なうのが望ましい。

トキソイド溶液を０．２　ミクロンのゲルマン・ポリス
ルホン・アコディスクで濾過した０次いで４℃に保存し
て、以下に記載する方法でその無菌性、残存活性、蛋白
質含有量、および復帰変異について試罵禽した。

ワクチン接種用トキソイドを調製するために、トキソイ
ドをリン酸アルミニウム上に吸着させた。

最終生成物として製剤した場合、調製物は０．９０±０
．０５＋ｎｇ／ｉｎのＡｔを含む。

節単に言えば、吸着は次のように行われた：無菌スピナ
ーフラスコに最終成分を次の順序：１）０．０２％メル
チオレートを含む・２×八ＩＰＯ，ゲル、２）液体百日
咳トキソイド、および３）適切容置の２５ｍＭ−ＮａＨ
２ＰＯ，、ｐｌ＋５〜６．０：で加え、５０趨／ｍトキ
ソイドおよび０．０１％メチオレートを含有する１×Ａ
ＺＰＯ４調製物を得た。、調製物は室温で１時間、さら
に４℃で一晩攪拌した。試料を以下に記載するような標
準法によって、その無菌性、復帰変異分析、力価および
チメロサール定量を行なうために採取した。

２：　キソイ　　コー゛　るＰＴ　　　　の図に示すよ
うに、Ｓ、は（上に３１と書かれた）ＡＴＧコドンで始
まり、塩基番号１３１３のＴＡＧコドンまでにわたるＤ
ＮＡにコードされている。チロシンコドンにはＹの符号
がつけられている。チロシン残基がＳｌの毒性と掛かり
合うことは、毒性の除去、即ち毒性のトキソイドへの転
化におけるＴＮＨの上述の効果によって証明される。同
じ結果が１個以上のチロシンコドンを欠落させることに
よって、または１個以上のチロシンコドンを非芳香族ア
ミノ酸コドンで置き替えることによって得られる。

次にｓ、ｆＩＩ域を修飾してトキソイドを製造するのに
適したオリゴヌクレオチドの例を２つ示す。当業者は、
Ｓ、の修飾がこれらのオリゴヌクレオチド、またはその
他のオリゴヌクレオチドを使用して、さらにガイド（Ｇ
ａｉｔ）、「オリゴヌクレオチドの合成（Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏＬｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ア　プラ
クティカル　アプローチ（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ）Ｊ。

ガイド編、ＩＲＬプレス株式会社、オノクスフオード、
英国（１９８４）、６〜７頁およびその中に列挙されて
いる参考文献に記載されているような、インビトロ（ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ）での標準的な変異誘発法を使用して簡
単に行なわれることを認めるであろう。

塩基位置７９６−７９９　（図面）のチロシン残基を置
１０するのに適当なオリゴヌクレオチドはである。オリ
ゴヌクレオチドの下の文字はアミノ酸（標準−文字記号
）を表わす。このオリゴヌクレオチドでは、７９６−７
９９の位置のチロシンがアスパラギン（Ｎ）で置換され
ている。下線を符した塩基とこのオリゴヌクレオチドに
導入された１−塩基対突然変異を示す。

塩基位置９９９−１００１　（図面）のチロシン残基を
欠落させるのに適当なオリゴヌクレオチドはである。こ
のオリゴヌクレオチドの中央の線は９９９〜１００１の
３塩基の欠落領域を表わしており、オリゴヌクレオチド
それ自体には依存しない。

簡単に言えば、これらのオリゴヌクレオチドを使用して
Ｓ１遺伝子を突然変異させるためには、オリゴヌクレオ
チドを本来の百日咳毒素のＳ、ユニットをコードする環
状Ｍ１３−本鎖［１ＮＡの鋳型にアニールし、クレノー
（Ｘｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて延長し、
次いでＴ４−リガーゼを用いて結合する。

次いで、そのようにして形成された二本鎖分子を大腸菌
■」虹旦　細胞に形質転換するために用い、その結果得
られたプラークを単離した。これらのプラク−から得ら
れたＤＮＡは所望の突然変異体毒素をコードしている。

その他のＳ−サブユニットの類似の修飾もまた有用なト
キソイドを供給することができる。

修飾した要素遺伝子を適切な細胞に形質転換し、トキソ
イドをこれらの細胞で発現させ、その後標準法で単離す
る。このトキソイドはＴＮＭ−処理トキソイドのために
上述した方法に従って、ワクチンに調製する。

ＴＮＭ　　キソイドの　　および 毒素の不活性化を評価するために、我々は本発明のトキ
ソイドの残存赤血球凝集活性、リポシラーゼ活性、ＣＨ
Ｏ−細胞クラスター形成活性およびＨ３Ｆ活性について
アッセイを行なった。

且−１赤訓」ト片洟」壌し１咀 毒素がガチョウの赤血球を血球凝集させる能力は蛋白質
の細胞結合／付着活性を表わすと考えられている。最近
、この結合作用はヒトＴ−リンパ腫培養細胞にマイトジ
ェン応答を誘導する能力があることが示された。従って
、これから開発しようとするトキソイドは残存１１Ａ活
性が全くないことが望ましい。故に、吸着させる前にす
べての百日咳トキソイドは、その毒性が十分に除去され
ていることを確認するために、ＩＩＡ試験を行って活性
が検出できないことを証明するべきである。

ｂ　　　ヒス　ミン　　　　　Ｈ５Ｆ 百日咳毒素がマウスのヒスタミンの亜致死服用量を感作
する能力は非常に感度の高いバイオアンセイである。１
〜２ｎｇ／マウスの感度で、ＨＳＦアッセイは微小量の
残存毒素活性を検出する能力を持つインビボ（ｉｎｖｉ
ｖｏ）システムを提供する。ヒトに使用する場合の安全
性を考慮して、吸着させる前にすべての百日咳トキソイ
ドワクチンは試験用マウスに少なくとも３０ｔｔｇ／マ
ウスの投与量を静脈注射（ＩＶ）してもＨ５Ｆ活性を示
してはならない、このアッセイの標準的方法は当業者に
は明らかであろう。

Ｃ０残存するチャイニーズハムスター卵ｍ　（ＣＩＩＯ
）のクース Ｃ１（０細胞をｐｇ／ｍ１ｉ４度の百日咳毒素にさらす
と、再現性がありかつ定量可能な形態変化を引き起こす
。この変化は、細胞がその典型的な繊維芽細胞の形態を
失い、集まり、さらに凝塊を形成するクラスター形成効
果として説明されている。アッセイの感度が高いため、
我々はこのクラスター形成活性を利用してトキソイド調
製物をスクリーニングすることにした。１（八およびＨ
ＳＦ試験の場合と同様、トキソイドとして容認され得る
ためには調製物は少なくとも１０ｇｇ／ｍの濃度で試験
を行なった場合にＣ１１０細胞クラスター形成活性を示
さないことが望ましい。このアッセイの標準的方法は当
業者には明らかであろう。

本発明（ＴＮＭ−処理）の百日咳トキソイドの医療用製
品に対するこれらの分析結果を第２表に示す。

赤血球凝集によって評価されるような結合活性は存在し
ないことがはっきりと示された。Ａ−プロトマー機能（
例えばりポジラーゼ活性）のアッセイではわずかな（３
，４χ）残存活性が示された。この活性だけではＣＩＯ
細胞およびｌｌ５Ｉ’の結果によって示されるようにホ
ロトキシン毒素活性を調製物に対して少しも与えるもの
ではないと考えられる。

リボシラーゼ （ｕｇ／ｍｇ蛋白質） １０００　　　　３４．０　　　　　　３．４ＨＡ　活
性　　　　　　　　　　１００　　　　　＞４．７　Ｘ
　１０’　　　　＜０．５（ｎｇ／戚） Ｈ５Ｆ活性　　　　　２．２　　＞３．７６Ｘ１０’　
　＜５．３Ｘ１０−５回日咳トキソイドの安定性を確認
するために、我々は液体トキソイドおよびリン酸アンモ
ニウムアジュバントに吸着させた後の両方の調製物に対
して広範囲にわたる復帰分析を行なった。２種類の調製
物、流体および吸着、を２５℃および３７℃にインキュ
ベーションしてストレス試験を行なった。

４ａ問および８週間後、それぞれの調製物のＨ５Ｆ活性
を試験した。液体トキソイドの場合、ヒトの１回の投与
量のは＼２倍相当量（３８１！ｇ）を２０匹のマウスの
それぞれに静脈注射（ｍ　Ｌ、た。吸着トキソイドにつ
いてはヒトの１回の投与量の１倍相当！　（２５ｇ）を
マウスに腹膜内注射（ＩＰ）した、それぞれの試験の結
果を第３表に示す。復帰徴候はどちらの調製物にも認め
られなかった。

また、液体トキソイド試料に対してＣＨＯ細胞クラスタ
ー形成アッセイを用いた復帰試験を行なった。

これらの結果を第４表に示す。ＨＳＦ復帰アッセイの結
果と同様に、百日咳毒素調製物において不安定性は検出
できないことが認められた。

第−」−−ｋ ａ、毒性は、毒性が認められる最少蛋白質濃度を示す。

ＮＤ−最大濃度で試験しても検出されない。

免疫応答を引き起こす吸着百日咳トキソイドの能力を定
量するために、ヒトの１回の毒素投与量の１．５倍（３
７，５μｇ）を８匹の５００ｇモルモントセントした。

免疫処置後４週問および６週間で動物から採血し、それ
らの抗百日咳毒素の力価をＩｇＧ−特異的ＥＬＩＳＡお
よびＣ）１０細胞中和アッセイによって定量した。結果
、それらのうちのいくつかを第５表に示す、はＭＡＰＴ
−１調製物に免疫原性が潜在していることを明確に証明
しており、その調製物は６週間後のＣＨＯ細胞中和アン
セイにおいて１／４００以上の力価を示す。第５表には
比較のために、バイオロジックス・ラボラトリ−（Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）製造の認可済
ＤＴＰワクチン（製品２６０）、および国立衛生研究所
（ｔｈｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ｌ１ｅａｌｔｈ）製造の実験段階
のワクチン（ＪＮＩＩ＋６）から得られた結果もまた含
まれている。

ＪＮＩＩ＋６は現在スウェーデンで臨床研究中であり、
効果があると考えられている。以上のように、血清応答
結果より、本発明の吸着百日咳トキソイドワクチンは現
在の全細胞ワクチンの代わりとして有望であると考えら
れる。

門ΔＰＴ−１１２，９３２，０１２６４０３１１ＴＰ−
２６０１，４４，８４１１ （１，５３１１０） ３７．５　μｇＦＨＡ） 相乗平均抗体濃度 また、ＴＮ？Ｉ−トキソイドの抗原性をウサギのポリク
ローナル抗毒素血゛清を用いた競合ＥＬＩＳＡによって
も定量した。このアッセイの標準的操作法は当業者には
明らかであろう。（フェチュインと残存毒素分子との結
合を利用した、別の適切な方法も当業者には明らかであ
ろう。）このアッセイはＥＬＩＳＡ板上に塗布した毒素
と結合した抗体と競合するトキソイドの能力を比較して
いる。ＴＮＭ　調製トキソイドは、ウサギの抗血清によ
って認識される抗原決定基のすべてではないにしろ、そ
のほとんどを保持している。５ｔｒｇ／ｍ（１ｍ度で、
トキソイドは抗体結合能力の８０％以上と競合する能力
かある。

トキソイド化物質仔馬性を定量するために適切なその他
の試験として発熱原性、残存ＴＮＭ　、チメロサール、
残存リポ多糖（ＬＰＳ）　、コール酸および無菌につい
ての試験がある。これらの試験は以下の手順で行なった
。

主−光撚亙立試筋；望ましくは、５μｇ　／　ｋｇの投
与量を用いて、すべての液体トキソイド製品は標準的な
ウサギの発熱試験に合格しなければならない。この投与
量は２力月の乳児（５ｋｇ）およびトキソイド調合ｆｆ
１２５尾／ＳＨＤより予測されるトキソイド／乳児体重
の比率に近い。この試験の標準的操作法は当業者には明
らかであろう。

ｂ　　　−トーニ　ロメ　ン： 試験を行なう前に、トキソイド化物質はアミコン・ミニ
コンセントレーク−（Ａｍｉｃｏｎ　ｍ１ｎｉｃｏｎｃ
ｅｎ　Ｌｒａ　ｔｏｒ）を通過させ、ＴＮＭアッセイは
この濾過液を用いて行なう。テトラニトロメタンおよび
その副産物は比色アッセイを用いて検出する。簡単に言
えば、１０％ヨウ化カリウム溶液をトキソイド濾過液の
アリコートと反応させる。ニトロ基が存在するとヨウ化
物はヨウ素を形成して黄色に発色し、これは４１０ｎｍ
でモニターできる。このアッセイの感度は０．０００６
％である。許可されるためには、すべてのトキソイドが
検出可能なＴＮＭを含まないことが望ましい。

Ｃチメロサールの・１土 バルクトキソイドのチメロサールの標準的アンセイ法は
当業者には明らかであろう。

ｄ　　ＬＡＬア　セイで　　し　　　Ｉボ　　　ＬＰＳ
　：標準ＬＡＬアッセイで試験した場合、濃度５０趨／
ｄの液体トキソイドは約２大腸菌■、ｃｏｌ旦エンドト
キシン単位／　ｍ１以上を含んではならない。このこと
は上限でおよそ０．０１ｎｇ／ｍのボルデテラベルラン
シス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　ｅｒｔｕｓｓｉｓ）の
ＬＰＳの混入を許している。ＬＰＳ重量／蛋白質に換算
すると、この値は最大約２Ｘ１０−’％の混入と等価で
あろう（ＬＡＬアッセイにおいて、ｌｎｇ本土ヱ之立　
ユルヱエ’ｉ７　ＬＰＳ−１６０大腸菌工ンドトキシン
単位）。

ＬＡＬアンセイ法は当業者には明らかであろう。

−虹一公着じヒー火醒 標準アッセイ法は当業者には明らかであろう。

ｆ　バルクの粍ｌ咀 バルクの吸着百日咳トキソイドに対する無菌性試験〔ス
テリテスト（ｓｔｅｒｉｔｅｓｔ）　）用標準処方は膜
濾過液の使用による方法である。

使−朋 ひとたび構築されれば、本発明のトキソイドは標準的手
順でワクチンに加工され、さらに宿主に免疫応答を誘発
するために十分な投与量を経口または非経口で投与する
。例えば１０〜５０μｇのトキソイドを腹腔内（ＩＰ）
注射で３〜２４力月の幼児に３回投与し、３年以後に二
次免疫注射を行なう。

他の実施態様は特許請求の範囲に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は百日咳毒素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、
およびそれに対応するアミノ酸配列を示す。 （外４名） 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、ｌ−１ ＦＩＧ、　Ｉ−２ ＹＳＮＡＩＩＹＶＳＱＱＴＩＩＡＮＦＮＰ口Ｇ、Ｉ−３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポリペプチドからなるヒトの百日咳を予防するため
   のワクチンとして適当なトキソイドであって、該ポリペ
   プチドは５μｇ／ｍｌの濃度で標準競合ＥＬＩＳＡアッ
   セイ試験を行なった場合に抗毒素抗体の結合活性の８０
   ％以上と競合する能力を持つような十分な抗原性を保持
   し、かつ該ポリペプチドは３７℃に８週間放置してもＣ
   ＨＯ−細胞アッセイで評価されるような毒性復帰傾向を
   示さない、前記のトキソイド。 ２、３７．５μｇの前記ポリペプチドを５００ｇモルモ
   ットに注射した場合にＣＨＯ細胞中和アッセイで測定し
   た場合の少なくとも１／２００の力価に相当する中和抗
   体の生産が引き起こされ、かつ該ポリペプチドが示す毒
   素活性はＣＨＯ細胞アッセイで定量した場合に百日咳毒
   素の毒素活性の０．０００５％以下である、請求項１記
   載のトキソイド。 ３、前記トキソイドが１０頭のマウスに対して一頭当り
   ３０μｇの投与量を静脈注射（ＩＶ）して試験した場合
   に、ＨＳＦアッセイにおいて死亡を引き起こさない、請
   求項１または２記載のトキソイド。 ４、前記トキソイドがガチョウのＲＢＣで定量される百
   日咳毒素の血球凝集活性の１％以上を保持しない、請求
   項１または２記載のトキソイド。 ５、該トキソイドが百日咳毒素のＡＤＰ−リボシラーゼ
   活性の５％未満を保持する、請求項１または２記載のト
   キソイド。 ６、前記トキソイドが３７℃で最低限６週間放置した場
   合にＨＳＦまたはＨＡアッセイで評価されるような復帰
   傾向を示さない、請求項１または２記載のトキソイド。 ７、精製した百日咳毒素をニトロ化試薬と反応させるこ
   とによって調製したトキソイド。８、前記ニトロ化試薬
   がテトラニトロメタン（ＴＮＭ）である、請求項７記載
   のトキソイド。 ９、精製した百日咳毒素をニトロ化試薬と反応させるこ
   とからなる、百日咳トキソイドの製造方法。 １０、前記ニトロ化試薬がＴＮＭである、請求項９記載
   の方法。 １１、ヒトに対して免疫量の請求項１または２記載のト
   キソイドを投与することからなる、該ヒト百日咳の予防
   法。 １２、ヒトの百日咳を予防するワクチンとして適当なト
   キソイドであって、該トキソイドが本質的にはチロシン
   残基のみを修飾した百日咳毒素からなる、前記トキソイ
   ド。 １３、百日咳毒素がテトラニトロメタン処理によって修
   飾されている、請求項１２記載のトキソイド。