KR20110100189A - 백신 생산 방법 - Google Patents
백신 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20110100189A KR20110100189A KR1020117008708A KR20117008708A KR20110100189A KR 20110100189 A KR20110100189 A KR 20110100189A KR 1020117008708 A KR1020117008708 A KR 1020117008708A KR 20117008708 A KR20117008708 A KR 20117008708A KR 20110100189 A KR20110100189 A KR 20110100189A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- toxin
- vaccine
- toxins
- cleavage
- difficile
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 92
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 91
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 29
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims abstract description 9
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims abstract description 9
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 41
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 22
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 claims description 18
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 claims description 16
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 claims description 16
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 claims description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 claims description 7
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 claims description 6
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 5
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 5
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 claims description 5
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 claims description 5
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 claims description 4
- 241000607735 Xenorhabdus nematophila Species 0.000 claims description 4
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims description 3
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 claims description 3
- 241000193465 Paeniclostridium sordellii Species 0.000 claims description 3
- 241001148079 Vibrio splendidus Species 0.000 claims description 3
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 claims description 3
- 241000123579 Xenorhabdus bovienii Species 0.000 claims description 3
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 claims description 3
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 claims description 3
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 claims description 2
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims description 2
- 241000606731 Actinobacillus suis Species 0.000 claims description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 claims description 2
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 claims description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims description 2
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 2
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 claims description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 claims description 2
- 241000607757 Xenorhabdus Species 0.000 claims description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000037384 Clostridium Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 3
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 3
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 3
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 2
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 2
- 206010054236 Clostridium difficile infection Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Inositol phosphates Chemical class 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- INAPMGSXUVUWAF-XCMZKKERSA-N 1D-myo-inositol 6-phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-XCMZKKERSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- 241000252084 Anguilla Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700022831 Clostridium difficile toxB Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIFOTGBMWFMXRC-UHFFFAOYSA-N Holotoxin A Natural products OC1C(OC)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(OCC(C2O)OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)OC2C(C3C(C=4C(C5(CC(=O)C6C5(C(OC6(CCCC(C)(C)O)C)=O)CC=4)C)CC3)(C)CC2)(C)C)OC(CO)C1O QIFOTGBMWFMXRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002997 Lavandula Nutrition 0.000 description 1
- 241001529749 Lavandula Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 208000025087 Yersinia pseudotuberculosis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940103272 aluminum potassium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011553 hamster model Methods 0.000 description 1
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 1
- BIHNZKYXOTXXSP-GCBHNEMQSA-N holotoxin a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](C)O3)O)[C@H](OC3C(C4[C@](C=5C([C@@]6(CC(=O)[C@H]7C6(C(O[C@]7(CCCC(C)=C)C)=O)CC=5)C)CC4)(C)CC3)(C)C)OC2)O)O[C@H](CO)[C@H]1O BIHNZKYXOTXXSP-GCBHNEMQSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009543 pathological alteration Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000002640 perineum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 102000007268 rho GTP-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010033674 rho GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000005563 spheronization Methods 0.000 description 1
- 230000008925 spontaneous activity Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 201000002516 toxic megacolon Diseases 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 AB 독소를 생산하는 세균성 병원균, 예컨대 클로스트리디움에 대한 백신을 생산하는 방법으로서, (a) 상기 AB 독소가 생산되는 조건 하에 상기 병원균을 배양하고, 배양물을 수거하는 단계; (b) 상기 AB 독소를 시험관내에서, 바람직하게는 보조인자로서 이노시톨 헥사포스페이트를 이용하여, 효소 절단하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 백신 생산 방법, 및 이에 따라 생산된 백신에 관한 것이다.
포자 형성성 그람음성균인 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)은 항생제 관련 설사 증례의 60%, 그리고 위막성 결장염을 앓는 환자의 거의 100%의 원인이다. 질환 발생의 원인인 기전은 아직 충분히 해명되지 않았다. 숙주와 균주의 인자들 모두에 관련이 있을 수 있는데, 그 이유는 씨. 디피실에 감염된 모든 환자에서 질환이 발생하는 것은 아니기 때문이다. 감염된 환자의 임상 증상은 무증상부터 생명을 위협하는 독성 거대결장까지일 수 있다.
사람을 포함하는 동물에서 질환을 유발하는 많은 다른 병원균과 같이 씨. 디피실은 독소를 생산한다. 독소는 매우 낮은 농도에서 활성인, 생세포 또는 유기체에 의해 생산되는 유독 물질이다. 독소는 작은 분자, 펩타이드 또는 단백질일 수 있고 효소 또는 세포 수용체와 같은 생물학적 거대분자와 상호작용하여 체조직과 접촉 또는 흡수 시에 질환을 유발할 수 있다. 씨. 디피실은 항생제-관련 설사 또는 위막성 결장염의 원인인 2가지 독소, 즉 독소 A(TcdA) 및 독소 B(TcdB)를 생산한다. 이들은 매우 큰(308kDa 및 269kDa) 세균 단백질로, 씨. 소델리(C. sordellii)의 TcsH 및 TcsL 및 씨. 노비이(C. novyi)의 Tcnα와 함께 소위 큰 클로스트리디아 세포독소(LCT) 계열의 일부이다. 이 독소들은 모두 고도의 서열 상동성, 유사한 도메인 구조를 보이고 글리코실트랜스퍼라제 부분을 보유한다. TcdA 및 TcdB는 3부로 이루어진 기능성 조직을 특징으로 하는 단일 쇄 단백질이다. 이들의 C-말단 도메인은 표적 세포의 원형질막에 결합하는데 필요하고, 소수성 중간 부분은 추정상의 전위 도메인이며, 단백질의 N-말단 촉매성 도메인은 글리코실트랜스퍼라제 부위를 운반한다. 표적 세포의 세포질로의 흡수 과정은 아직 완전히 특성 규명되지 않았다. 하지만, 일반적으로 상기 독소들은 세포 표면 수용체에 결합한 후 세포내이입되는 것으로 인식되고 있다. 엔도솜의 산성화 후, 독소의 N-말단 도메인만이 세포질 내로 전위한다. 이러한 전위 과정은 공극 형성에 의해 매개되는 것으로 추측되며, 이는 TcdA가 낮은 pH에서 인공 막에 공극을 형성하기 때문이다. 독소의 활성화는 세포질에 N-말단 촉매성 도메인을 보유하는 63 kDa의 작은 단편을 해리시키는, 아미노산 Leu543과 Gly544 사이의 단백분해성 절단을 필요로 한다. TcdB의 더 큰 207kDa C-말단 부분은 막 분획에 남는다. N-말단 63kDa 단편은 완전한 세포독성 활성을 나타낸다. 일단 해리되면, N-말단 글리코실트랜스퍼라제 도메인은 세포질 내에서 자유롭게 이동할 수 있어, 표적 단백질인 Rho/Rac 계열의 GTPase를 불활성화시킨다. 이 단백질은 많은 세포 기능, 예컨대 액틴 세포골격의 조직, 전사 조절, 세포 극성 및 증식에 연관되어 있다. Rho GTPase는 면역계의 많은 기능들, 예컨대 병원균 방어 반응, 사이토킨 발현 및 면역 세포의 시그널링에 중요한 역할을 하기 때문에, 이들은 세균 독소에 가장 적당한 표적이다.
최근, 씨.디피실 독소의 활성화가 자가촉매절단에 의해 일어나는 것으로 밝혀졌다(Reineke et al., Nature 2007, 446: 415-419). 또한, 독소 B의 상기 자가촉매 절단의 잠재적 활성인자 및 보조인자로서 이노시톨 헥사포스페이트(Ins6P, IP6, CAS 번호 [83-86-3])의 역할도 밝혀졌다(Reineke et al., 상기 문헌 참조). 이처럼 고도로 하전된 분자는 여러 기능을 수행하는 것으로 보이고 독소의 입체형태의 안정화에 연관될 수도 있다. 현재 자가촉매 절단을 통한 독소 활성화는 다른 유기체의 유사 독소, 예컨대 클로스트리디움 디피실의 LCT 독소 A(TcdA) 및 B(TcdB), 클로스트리디움 소델리의 치사 독소(TcsL) 및 출혈성 독소(TcsH) 및 클로스트리디움 노비이의 α-독소(Tcnα), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)의 RTX 독소(VcRTX), 브이. 불니피커스(V. vulnificus)(VvRtx), 브이. 스플렌디더스(V. splendidus)(VsRtx), 제노라브더스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila)(XnRtx), 엑스. 보비에니(X. bovienii)(XbRtx), 예르시니아 슈도튜베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis)(YpRtx), 와이. 몰라레티(Y. mollaretti)(YmMfp2) 및 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)(FhaL1-4)(Sheahan KL et al. EMBO J 2007, 27(10): 2552-2561), 리스토넬라 안길라럼(Listonella anguillarum), 포토하브더스 루미네슨스(Photorhabdus luminescens), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)(Lupardus PJ et al. SCIENCE 2008, 322(5899): 265-268)의 유사 독소와 함께 일어나는 것으로 알려져 있다. 이 독소들은 모두 아래에 개략된 바와 같이 "AB 독소"로 분류될 수 있다.
국제특허출원 WO2008014733은 자가촉매 활성의 억제인자 또는 활성인자(IP6)를 환자에게 투여하는, 클로스트리디움 감염의 치료 방법을 개시한다.
여러 공보에 씨. 디피실 백신이 공개되어 있다. TcdA 및 TcdB가 화학약품인 포르말린에 의해 불활성화되는 백신은 문헌[Sougioultzis S.L. et al., Gastroenterology(2005), 128: 764-770; Kotloff, Infect.Immun. 2001; WO 9920304 및 Ghose et al., Infect. Immun. (2007), 75(6), 2826-2832]에 개시되어 있다. TcdA 또는 TcdB의 C-말단 리간드 도메인을 나타내는 재조합 발현된 폴리펩타이드를 함유하는 백신은 문헌[WO 9859053, WO 0061761, WO 0061762, WO 9702836, Pavliakova et al., Infect Immun(2000), 68(4), 2161-2166; Ward et al., Infect Immun(1999), 67(10), 5124-5132; 및 Lyerly et al., Current Micorbiol 21: 29-32]에 개시되어 있다. WO 2007146139는 TcdA 및 TcdB의 수용체 결합 도메인을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA-분자를 개시하고 DNA 백신으로 사용한다. WO 2004041857은 TcdB의 비독성 돌연변이체 및 이의 백신으로서의 용도를 개시한다. 문헌[Genth, H. et al., Infect. Immun.(2000), 68: 1094-1101]은 면역화 항원으로서 효소적 결손성 클로스트리디움 디피실 독소 B를 생산하는 방법을 개시한다.
백신은 일반적으로 상기 병원균의 항원성 성분을 포함하는 제조물을 제조하고, 이를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 제조한다. 효과적인 면역 반응의 달성 및 경제적 이유로 인해, 단지 몇몇 프로세싱 단계 또는 분별화 단계만으로 세균 배양물로부터 수득된 제조물을 사용하는 것이 바람직하다. 독소 생산 유기체의 경우, 문제는 그러한 제조물에 포함된 독소가 불활성화되지 않는 한 투여를 방해할 것이라는 점이다. 따라서, 종래 기술은 독소의 화학적 불활성화, 독소의 비독성 도메인(C-말단 수용체 결합 또는 "B" 도메인)의 재조합 발현 또는 독소의 비독성 돌연변이체의 생산에 의해 씨. 디피실과 같은 AB 독소를 생산하는 세균성 병원균에 대한 백신을 제조하는 시도를 제안했다. 하지만, 이 시도들은 모두 백신의 유효성에 영향을 미칠 수 있는 병원성 유기체의 항원성 에피토프의 상실을 초래하고/하거나 비용이 많이 든다.
본 발명은 AB 독소를 생산하는 세균성 병원균에 대한 백신을 생산하는 방법으로서,
(a) 상기 AB 독소가 생산되는 조건 하에 상기 병원균을 배양하고, 배양물을 수거하는 단계;
(b) 상기 AB 독소를 시험관내에서 효소 절단하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 관점에서, 효소 절단은 자가촉매성이다. 바람직한 관점에서, 이노시톨 포스페이트, 바람직하게는 이노시톨 헥사포스페이트가 효소 절단의 보조인자로서 사용된다.
더욱 바람직한 관점에서, 본 발명은 수거 후에 배양 배지로부터 세포를 분리하고, 상기 배양 배지 중의 상기 AB 독소를 절단하는, 전술한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 클로스트리디움(Clostridium)속, 바람직하게는 씨. 디피실(C. difficile), 씨. 소델리(C. sordellii), 씨. 보툴리눔(C. botulinum), 씨. 퍼프린젠스(C. perfringens), 씨. 테타니(C. tetani) 또는 씨. 노비이(C. novyi), 또는 비브리오(Vibrio)속, 바람직하게는 브이. 콜레라(V. cholerae), 브이. 파라헤몰리티커스(V. parahaemolyticus), 브이. 벌니피커스(V. vulnificus), 브이. 스플렌디더스(V. splendidus) 또는 브이. 안길라럼(V. anguillarum), 또는 제노라브더스(Xenorhabdus)속, 바람직하게는 엑스. 네마토필라(X. nematophila), 엑스. 보비에니(X. bovienii), 또는 예르시니아(Yersinia)속, 바람직하게는 와이. 슈도튜베르큘로시스(Y. pseudotuberculosis), 와이. 페스티스(Y. pestis), 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) 또는 와이. 몰라레티(Y. mollaretti), 또는 보르데텔라(Bordetella)속, 바람직하게는 비. 퍼투시스(B. pertussis), 비. 파라퍼투시스(B. parapertussis) 또는 비. 브론키셉티카(B. bronchiseptica), 또는 악티노바실러스(Actinobacillus)속, 바람직하게는 에이. 플루로뉴모니에(A. pleuropneumoniae) 또는 에이. 수이스(A. suis) 및 이. 콜라이(E. coli) 병원균에 대한 백신 생산에 사용될 수 있다.
백신 조성물에는 보강제를 첨가할 수 있다.
추가 관점에서, 본 발명은 전술한 방법에 의해 생산된 백신에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 AB 독소를 생산하는 세균성 병원균의 감염에 대한, 사람을 포함하는 동물의 백신접종을 위한, 개시된 방법에 따라 생산된 백신의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 방법에 따라 생산된 백신의 유효량을 사람을 포함하는 동물에게 투여함을 포함하는, AB 독소를 생산하는 세균성 병원균의 감염에 대한, 사람을 포함하는 동물의 백신접종 방법에 관한 것이다.
본 발명은 AB 타입의 독소(AB 독소)를 생산하는 세균성 병원균에 대한 백신을 생산하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 그러한 독소의 고유 단백분해 활성을 이용하여 시험관내에서 자가촉매 효소 과정에 의해 AB 독소를 불활성화시키는 명쾌한 방법을 제공한다. 이 목적을 위해, 독소를 함유하는 조성물은 그러한 효소 절단이 일어날 수 있는 조건으로 조정된다. 구체적으로, 이노시톨 포스페이트와 같은 필수 보조인자의 첨가가 AB 독소의 단백분해적 불활성화를 유도할 수 있다. 이 단백분해적 절단에 의해 독소 A 도메인은 트랜스포터 도메인 B로부터 분리되고 독성 효과를 발휘하는데 필요한 세포의 세포질로 유입되는 능력을 상실한다. 사실상, 생성되는 조성물은 생체에 적용되었을 때 더 이상 독성이 아니거나, 또는 단일 쇄 AB 독소보다 독성이 훨씬 적다. 한편, 이러한 종류의 불활성화는 백신의 유효성에 중요한 단백질의 항원성 에피토프 및 자연 입체형태를 보존한다.
본 발명의 문맥에서, "AB 독소"란 용어는 LCT와 같이 촉매성 도메인(A 도메인)과 수용체 결합/전위 도메인(B 도메인 또는 트랜스포터 도메인)을 포함하고 생체내 촉매성 도메인의 활성화가 세포질 내로 촉매성 도메인을 방출시키는 자가촉매 절단에 의해 일어나는 단일 쇄 세균 독소에 사용된다. AB 독소는 예컨대 LCT의 독소, 예를 들어 클로스트리디움 디피실의 독소 A(TcdA) 및 B(TcdB), 클로스트리디움 소델리의 치사 독소(TcsL) 및 출혈성 독소(TcsH), 및 클로스트리디움 노비이의 α-독소(Tcnα)이다. 더욱이, AB 독소는 비브리오 콜레라의 RTX 독소(VcRTX), 브이. 불니피커스(VvRtx), 브이. 스플렌디더스(VsRtx), 제노라브더스 네마토필라(XnRtx), 엑스. 보비에니(XbRtx), 예르시니아 슈도튜베르큘로시스(YpRtx), 와이. 몰라레티(YmMfp2), 와이. 엔테로콜리티카(YST), 리스토넬라 안길라럼(VaRtx) 및 보르데텔라 퍼투시스(FhaL1-4)를 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법은 전술한 세균과 같이 AB 독소를 생산하는 세균성 병원균에 의한 감염에 대한 백신을 제조하는데 적용될 수 있다. 백신은 사람을 포함하는 동물의 특정 질환에 대한 면역성을 향상시키는데 사용되는 약제이다. 백신은 예방적(예컨대, 임의의 자연 또는 "야생" 병원균에 의한 향후 감염 효과를 방지하거나 경감시키는)이거나 또는 치료적, 즉 숙주가 이미 병원균에 감염된 상황에서, 질환의 임상 증상의 유무에 관계없이 적용될 수 있다. 백신은 사멸된 미생물, 변성 생(약독화된) 미생물, 미생물의 항원성 서브유닛 제조물(예컨대, 분획 또는 재조합 발현된 폴리펩타이드), 또는 본 발명의 상황에서 바람직한 것으로, 톡소이드, 즉 병을 주로 유발하는 경우에 불활성화된 독성 화합물을 함유할 수 있다. 백신은 면역계를 자극하여 백신에 대한 반응을 증가시킬 수 있고 스스로는 어떠한 특이적 항원성 효과도 나타내지 않는 제제인 보강제를 함유할 수 있다. 보통 사용되는 보강제의 예로는 명반(수화된 알루미늄 칼륨 설페이트), 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 스쿠알렌, 또는 오일계 보강제이다. 바람직한 보강제는 약 2ml/l의 양으로 존재할 수 있는 시판 Carbopol® 934P(Carbomer 934P; Noveon, Inc., Pedricktown, NJ, USA)이다. Carbopol은 폴리알릴수크로즈와 가교결합된 아크릴산 중합체이다.
이 방법의 제1 단계는 AB 독소가 생산되는 조건 하에 병원균을 배양하는 것이다. 세균 세포 배양은 당업계에 잘 확립되어 있다. 다른 종에 대한 표준 방법도 알려져 있고, 미생물의 적당한 샘플은 공공 수집소로부터 입수할 수 있다. 열거한 미생물은 각각 특별한 조건에 따라 배양한다. 클로스트리디아는 혐기성 대기 하에 배양하지만, 예르시니아, 제노라브더스, 보르데텔라 및 비브리오는 호기적으로 배양할 수 있다. 예르시니아는 내냉성이어서 보통 28℃에서 배양한다. 각 유기체는 당업계에 이미 알려진 성장에 특별한 배지 조성을 필요로 한다.
AB 독소는 보통 배양물의 증식정지기 후반에 배양 배지로 방출된다. 수거 후, 세포는 배양 배지로부터 분리하는 것이 종종 유리한데, 그 이유는 AB 독소가 배지에 충분한 농도로 존재하기 때문이다. 이는 원심분리로 수행할 수 있다. 원심분리로 세포를 분리한 후, 세포는 버리고 상청액은 추가 처리한다. 배지 중의 독소는 그 다음 자가촉매 성질을 이용하여 효소 절단에 의해 활성화시킨다. 절단을 달성하기 위해 효소 활성을 허용하는 조건이 적당하게 조정되어야 한다. 가장 중요한 것은, 효소 활성을 촉진하는 보조인자가 첨가되어야 한다는 점이다. 이노시톨 포스페이트, 특히 이노시톨 헥사포스페이트는 보조인자로서 1 μmol/l 내지 10 mmol/l 농도 범위, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 μmol/l 범위로 사용될 수 있고, 다른 유사체 또는 유도체, 예컨대 1,3,4- 또는 3,4,6-트리포스페이트, 1,2,3,4-, 1,3,4,5-, 3,4,5,6- 또는 1,4,5,6-테트라포스페이트, 또는 1,2,3,4,5-, 1,2,3,5,6-, 1,3,4,5,6-, 2,3,4,5,6-펜타포스페이트도 잘 작용하지만, 더 높은 농도를 필요로 할 수 있다. pH는 6.5 내지 8.5 범위이어야 하고, 배양 배지의 pH는 보통 이미 그 범위 내이다. 그렇지 않으면, 완충액을 투석 또는 한외여과에 의해 첨가하거나 교환할 수 있고, 예컨대 pH 8.5의 Tris HCl이 있다. 적당한 온도 범위는 20 내지 40℃이다. 절단은 보통 1 내지 24시간 내에 종결되어야 하고, 잔류 독성을 피하기 위해 실시예에 개시된 방법과 같은 분석법으로 검사되어야 한다.
독소 종은 불활성화 전에 수거물 및/또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 병원균이 하나보다 많은 독소 종을 생산하는 경우, 이 독소 종은 불활성화 전에 서로 분리할 수 있다. 예를 들어, 씨. 디피실은 전술한 바와 같이 2가지 독소, 독소 A(TcdA) 및 독소 B(TcdB)를 생산한다. 이 두 단백질은 불활성화 전에 이하 실시예 4에 예시된 바와 같이 분리할 수 있고, 그 다음 개별적으로 또는 병용해서 백신 제조물에 사용될 수 있다. 씨. 디피실의 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B, 즉 본 발명에 따라 불활성화된 독소 A 및/또는 독소 B는 백신접종에 바람직한 항원이다. 톡소이드는 자가촉매 절단 후 추가 정제하여, 더 큰 C-말단 절단 단편(예컨대, 홀로톡신 A의 아미노산 543-2710, 또는 홀로톡신 B의 아미노산 544-2666 또는 545-2666으로 이루어진)을 농축시킬 수 있다. 본 발명의 정제된 톡소이드는 또한 백신 제조물에서 다른 병원균의 불활성화된 AB 독소와 병용될 수 있다.
생성되는 제조물은 그 다음 적당할 것으로 추정되는 백신으로 사용하기 위한 최종 제형으로 만든다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체인 수성 환경이 그대로 사용될 수 있다. 이 환경은 또한 예컨대 희석, 투석, 한외여과 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 추가 정제 단계에 의해 변경될 수도 있다. 항원 제조물은 보관하고 사용전에 물로 복원시키기 위해 동결건조될 수 있다. 적당하다면, 보강제가 첨가될 수 있다. 고려될 수 있는 보강제는 예컨대 유중수, 수중유, 다상 또는 비-광유 에멀젼, 알루미늄계 보강제, 중합체성 보강제, 예컨대 Carbopol®, 스쿠알렌, 리포좀, 마이크로입자, 면역자극성 복합체 및 Toll-유사 수용체 캐스캐이드 활성화 보강제이다. 백신은 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사로 투여할 수 있다. 주사 횟수 및 투약량은 표적 종에 따라 달라진다. 민감성 종은 사람, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 양, 어류, 설치류 및 말이다. 백신접종은 예방적 치료이며, 모체의 백신접종에 의해 후손이 예방될 수 있다. 백신접종 시기는 모계 항체가 사라진 후 시작하고 4주 후 및 그 이후 시점에 추가 백신접종을 필요로 할 수 있다.
따라서, 추가 관점으로, 본 발명은 자가촉매 절단에 의해 독소 A 및/또는 독소 B로부터 생산된, 클로스트리디움 디피실의 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B를, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 클로스트리디움-유도 설사에 대한 백신에 관한 것이다. 일부 양태에서, 톡소이드 A는 공개 데이터베이스(EMBL, NCBI)에 등록번호 YP_001087137, ZP_05349827 또는 YP_003213641로 기탁된 서열들의 아미노산 543-2710으로 이루어진다. 추가 양태에서, 톡소이드 B는 공개 데이터베이스(EMBL, NCBI)에 등록번호 YP_001087135, ZP_05349824, ZP_05328744, YP_003217086 또는 YP_003213639로 기탁된 서열들의 아미노산 544-2666 또는 545-2666으로 이루어진다. 백신은 추가로 보강제를 포함할 수 있다.
실시예
실시예
1:
클로스트리디움
디피실
백신의 제조
클로스트리디움 디피실 샘플은 공공 수집소로부터, 예컨대 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassa, VA, USA)에 기탁된 수탁번호 ATCC 9689, ATCC 43255를 입수할 수 있다. 이것은 37℃, 혐기성 조건 하에 3 내지 4일 동안 BHI 배지(뇌-심장 침출배지, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany; American Pharmaceutical Association, 1950. The national formulary, 9th ed., APA, Washington, D.C.)에서 발효조에서 증식시킨다. 2가지 큰 세포독소 TcdA 및 TcdB는 증식정지기 후반에 방출된다. 이 시점에, 배양물을 수거하고, 세균을 8000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 침전시킨다. 상청액을 그대로 사용하거나, 겔 투과 크로마토그래피(예, S300 Sephacryl), 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 한외여과로 독소를 농축시킬 수 있다. 그 다음, 상청액 또는 독소-농축 제조물에 환원제인 디티오트레이톨을 1 내지 50 mmol/l의 최종 농도로 첨가하고, 그 후 킬레이트 형성제인 에틸렌 디아민 테트라아세테이트를 10 내지 100 mmol/l의 최종 농도로 첨가한다. 이노시톨 헥사포스페이트(IP6)를 1 μmol/l 내지 10mmol/l의 최종 농도, 예컨대 10 μmol/l 또는 100 μmol/l로 첨가하고, 이 조성물을 pH 6.5 내지 8.5의 Tris-HCl과 같은 적당한 완충액에서 2 내지 24시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 절단의 완료는 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 단백질 염색에 의해 검사할 수 있다.
생성되는 제조물은 그 다음 적당한 것으로 추정되는 백신으로 사용하기 위한 최종 제형으로 만든다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체인 수성 환경이 그대로 사용될 수 있다. 이 환경은 또한 예컨대 희석, 투석, 한외여과 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 추가 정제 단계에 의해 변경될 수도 있다. 적당하다면, 보강제가 첨가될 수 있다. 고려될 수 있는 보강제는 예컨대 유중수, 수중유, 다상 또는 비-광유 에멀젼, 알루미늄계 보강제, 중합체성 보강제, 예컨대 Carbopol, 스쿠알렌, 리포좀, 마이크로입자, 면역자극성 복합체 및 Toll-유사 수용체 캐스캐이드 활성화 보강제이다. 백신은 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사로 투여할 수 있다. 주사 횟수 및 투약량은 표적 종에 따라 달라진다. 민감성 종은 사람, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 양 및 말이다. 백신접종은 예방적 치료이며, 모체의 백신접종에 의해 후손이 예방될 수 있다. 백신접종 시기는 모계 항체가 사라진 후 시작하고 4주 후 및 그 이후 시점에 추가 백신접종을 필요로 할 수 있다.
실시예
2: 활성 분석
CHO 세포(중국 햄스터 난소, 예컨대 DSM ACC110, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)는 예컨대 5% FCS(소 태아 혈청)가 보충된 Ham's F10 배지 등이 담긴 96웰 또는 24웰 미세역가 플레이트(100 ㎕/웰)에 접종하고 융합성에 도달할 때까지 가습 조건 하에 37℃에서 밤새 항온배양했다. 이를 마그네슘 또는 칼슘과 같은 2가 이온이 제거된 링거액으로 세척하고, 그 다음 웰에 Mg 및 Ca이 제거된 링거액 100 ㎕(96웰 플레이트) 또는 400 ㎕(24웰 플레이트)를 주입했다. 그 다음, 실시예 1의 백신 제조물과 각각의 연속 희석물(10-1 내지 10-8)을 각각 100㎕ 또는 400㎕씩 각 샘플당 2반복으로 웰에 피펫주입했다. 백신 제조물과 같은 방식으로 처리한 BHI 배지는 음성 대조군으로 사용했다. 양성 대조군으로는, 미처리된 씨. 디피실 상청액을 사용했다. 플레이트는 가습 대기 하에 37℃에서 3 내지 24시간 동안 항온배양한 뒤, 세포를 현미경으로 조사했다.
백신 제조물로 처리된 세포는 음성 대조군과 같이 형태적 변화를 보이지 않아야 한다. 미처리 배양 상청액으로 처리된 세포는 주로 구형화되고 "성상세포-유사" 형태로 발달하는 것을 특징으로 하는 세포변성 효과를 나타낼 것이다. 백신-처리된 세포가 양성 대조군과 유사한 세포변성 효과를 나타내면, 효소 절단은 완전하지 않은 것으로 재반복되어야 한다.
실시예
3: 동물의 백신접종
씨. 디피실 감염의 표준 동물 모델로 시리안 골드 햄스터를 사용할 수 있다. 체중이 60 내지 100g인 동물을 실험에 사용했다. 이 동물에게 여러 농도(1-100 ㎍)의 백신 제조물을 복강내 또는 피하 주사로 투여한다. 백신은 보강제를 함유하지 않거나, 또는 보강제로서 완전 프로인트 보강제(백신 제조물과 1:1), 또는 Ribi(모노포스포릴 지질 A 및 트레할로스 디코리노마이콜레이트 에멀젼)를 함유한다. 백신과 동일한 방식으로 처리된 BHI 배지는 음성 대조군으로 사용한다. 최종 백신접종 후 2주 후, 동물에게 10 내지 100 mg/kg 클린다마이신을 복강내 또는 경구위로 투여한다. 24시간 후, 위영양관 또는 공 말단 캐뉼라를 통해 적어도 104 생육성 씨.디피실 균/동물 또는 100 c.f.u(콜로니 형성 단위)를 각각 접종했다. 백신의 방어 효능은 설사의 임상 모니터링 또는 사망률을 통해 측정한다.
실시예
4: 동물의
클로스트리디움
디피실
백신접종
본 연구에서는 클로스트리디움 디피실의 AB-독소를 고유 자가촉매 절단 기능을 이용해 불활성화시켜 동물에서 백신으로 사용했다.
독소 생산을 위해, 씨. 디피실(참고 균주 VPI10463, ATCC 43255) 작업 배양물 1ml를 0.9% NaCl 200ml를 함유하는 전처리 및 멸균된 투석 주머니에 주입했다. 투석 주머니는 1.3 L BHI 배지에 넣고, 혐기성 챔버에서 37℃ 하에 5일 동안 항온배양했다. 5일 후, 투석 주머니의 내용물을 원심분리하고(5000 rpm, 4℃, 15분), 상청액의 과황산암모늄 분별 침전을 수행했다. 1차 침전 단계(독소 A)는 45% (NH)4SO4를 첨가하고 4℃에서 3시간 동안 교반하여 수행했다. 이 시기 후, 용액을 원심분리하고(5000 rpm, 4℃ 및 30분), 2차 침전 단계(독소 B)는 (NH)4SO4를 70%의 최종 함량까지 첨가하여 수행했다. 2차 분획은 4℃에서 3시간 동안 교반하고, 그 후 다시 원심분리했다(5000 rpm, 4℃ 및 30분). 침전 단계의 최종 펠릿은 5ml의 50mM Tris/HCl pH 7.5에 재현탁시켰다. (NH)4SO4 침전으로부터 수거한 2가지 분획(독소 A 및 B)은 다시 수크로오스 밀도 구배 원심분리로 정제했다. 따라서, 수크로오스 밀도 구배는 초원심분리관에 다음과 같은 증가 순서의 수크로오스 용액 4.5ml를 적재하여 제조했다: 50mM Tris/HCl pH 7.5 중의 10%, 18.75%, 27.50%, 36.25% 및 45% 수크로오스. 독소 분획은 상단에 첨가하고, 이 관을 4℃, 100,000 g에서 3.5시간 동안 원심분리했다. 최종 구배는 2ml 분취량으로 수집했다. 샘플의 독소 함량은 CHO-K1 세포를 이용한 세포독성 분석으로 측정했다. 따라서, CHO-K1 세포(ATCC CCL-61)는 10% FCS, 0.5% L-글루타민 및 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F10-배지에서 증식시킨다. 96웰 미세역가 플레이트에 세포의 단층(약 4000/웰)을 제조하고 37℃, 5% CO2 하에 24시간 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 독소 함유 샘플의 10배 희석물을 제조했다. 세포로부터 배지를 제거한 후, 독소 희석물을 첨가했다. 세포독성 효과는 24시간 후 도립 현미경으로 조사했다.
다음 체계를 세포독성을 평가하는데 사용했다:
양성(+): >90% 구형 세포
음성(-): <90% 구형 세포
수크로오스 밀도 구배 원심분리의 독소 함유 분획을 모아서(각각 독소 A 및 독소 B), 50mM Tris/HCl pH 7.5로 1:2로 희석했다. 샘플(독소 A 또는 독소 B)을 이온교환컬럼 위에 적재하고 NaCl 구배를 50mM Tris/HCl pH 7.5 중의 50mM NaCl부터 50mM Tris/HCl pH 7.5 중의 700 mM NaCl로 하여(△NaCl 5mM/ml) 독소를 용출시켰다. 2ml 분획을 수집했다. 샘플의 독소 함량은 CHO-K1 세포를 이용한 세포독성 분석으로 측정했다. 독소 함유 분획을 수집하고 초원심분리 단계로 4℃, 5000 rpm 하에 15분 동안 농축시켰다. 수득한 독소 용액에 20% 글리세린을 첨가하고, 샘플을 -20℃에서 보관했다.
정제 단계도 역시 SDS-PAGE로 모니터했다. 단백질은 쿠마시 염색으로 가시화했다. 최종 독소 샘플의 농도는 BSA 기준물질과 SDS 겔 중의 독소 양을 비교하여 측정했다. 비교는 광학 조정과 컴퓨터 분석에 의해 수행했다.
백신 제조물은 DTT 및 IP6을 첨가하여 독소의 자가촉매 절단을 유도하여 제조했다. 독소 A 절단은 3mM IP6 및 50mM DTT를 첨가하여 최종 용적 50㎕인 H2O에서 수행했다. 독소 B 절단은 1mM IP6 및 150mM DTT를 첨가하여 최종 용적 100㎕인 H2O에서 수행했다. 자가절단은 회전기에서 37℃ 하에 밤새 수행했다.
생성되는 절단 산물은 세포독성 분석 및 SDS PAGE 분석으로 분석했다. 세포독성 분석은 CHO-K1 세포와 Caco 세포를 이용하여 수행했는데, Caco 세포는 독소 A에 대해 더 높은 민감성을 보였기 때문이다. Caco 세포는 37℃, 5% CO2 하에 48시간 동안 항온배양된 96웰 미세역가 플레이트에서 10% FCS 및 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 MEM 배지에서 증식시켰다. 세포독성 분석은 24시간 후 독소 A는 적어도 103배, 독소 B는 104배의 세포독성 감소를 나타냈다. 절단 효율은 쿠마시 염색된 SDS PAGE 분석으로 가시화했다.
각각 불활성화된 독소(톡소이드)를 보유한 백신 용량은 시그마 보강제 시스템(모노포스포릴 지질 A 및 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트를 보유한 수중유 에멀젼)으로 제조했다. 톡소이드 농도는 BSA 기준물질과 SDS 겔에서의 독소 양을 비교하여 측정했다. 비교는 광학 조정과 컴퓨터 분석으로 수행했다. 보강제는 제조업자가 설명한 바와 같이 PBS로 복원시키고 각 톡소이드 샘플과 1:1로 혼합했다.
클로스트리디움 디피실 감염의 고전적 모델 유기체는 시리아 햄스터이다. 시리아 햄스터는 감염에 매우 민감하게 반응하고 임상 징후 및 병리학적 변경이 사람과 유사하게 발생한다. 따라서, 햄스터 감염 모델은 감염 동물의 100% 사망률을 초래하는 매우 엄중한 모델이다.
이 시험에서, 도입 시 체중이 60 내지 80g인 시리아 햄스터를 찰스 리버(Charles River, D-97633, Sulzfeld, Germany)에서 구입했다. 동물은 검사실에 도착 시 각 그룹으로 무작위로 나누고 적어도 5일 동안 적당한 순응기를 주었다. 동물에게 2주 간격으로 3회 백신접종했다. 최종 면역화 후 14일 후에 클로스트리디움 디피실 감염을 수행했다. 클로스트리디움 디피실을 경구 항원공격하기 24시간 전에 2mg의 클린다마이신을 각 동물에게 경구 투여했다. 항생제 클린다마이신의 투여는 장의 정상 세균총을 파괴하여 동물이 씨.디피실 감염에 걸리기 쉽게 한다.
항원공격 후 7일 동안 조심스럽게 매일 임상 조사를 수행했고, 임상 소견을 기록했다. 연구 동안 여러 시점에서 혈액 샘플을 채혈하고 배양된 세포에서 독소 A 및 독소 B의 세포독성을 저해하는 항체에 대해 혈청을 분석했다. 따라서, CHO-K1 세포는 10% FCS, 0.5% L-글루타민 및 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F10-배지에서 96웰 플레이트의 웰당 5000 세포씩 접종하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온배양했다. 햄스터 혈청 희석물은 배지로 제조하고 독소 A 및 B 희석물과 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 독소는 3시간 및 24시간 후 세포의 구형화를 90% 넘게 유발하는 농도로 희석했다. 세포 구형화는 전술한 바와 같이 3시간 및 24시간 후 현미경으로 측정했다. 중화 역가는 24시간 후 세포의 구형화를 완전하게 억제하는 최대 혈청 희석물의 역수로 정의했다.
본 연구의 목적은 불활성화된 독소 A 및 B 병용물의 여러 용량을 이용한 반복 피하 면역화가 생체적합성인지, 그리고 씨. 디피실 감염에 대한 방어가 유도될 수 있는지를 측정하는 것이었다. 따라서, 검사실에 도착 후 각각 4 그룹으로 무작위 선발한 12마리의 수컷 시리아 햄스터를 사용했다. 각 그룹당 3마리로 구성되었다. 그룹을 백신접종 후 잠재적 독성 효과에 대해 반응할 수 있도록 증가 용량으로 다른 연구일에 백신접종했다.
연구 개요:
모든 동물은 피하 백신접종 후 임상 징후가 없었고, 이에 따라 독소 용량은 톡소이드 A 및 B 각각 4 ㎍까지 증가시킬 수 있었다. 또한, 대조군의 동물은 피하 백신접종에 대해 반응을 전혀 보이지 않았고, 이는 시그마 보강제 시스템이 피하 적용 시 충분히 견딜 수 있는 것임을 보여준다. 또한, 연구 동안 여러 일의 체중 측정도 백신접종의 양호한 허용성을 보여주었다. 모든 동물은 항원공격 시까지 체중이 증가했다. 독소 백신접종된 동물의 체중 증가는 대조군과 비슷했다. 또한, 독소 백신접종된 동물의 항원공격 전 마지막에 측정한 체중(평균: 그룹 1: 140.3g; 그룹 2: 136.3g; 그룹 3: 144g)은 대조군 동물의 체중 범위(평균 그룹 4: 141g)내에 있었다.
항원공격 후, 연구 44일째, 대조군 동물은 2 내지 3일 내에 죽었다. 이에 비해 절단된 독소를 백신접종 받은 동물은 모두 더 오래 생존했고, 심지어 동물 2마리는 연구 마지막까지 임상 징후를 거의 나타내지 않았다(그룹 1 동물 1번; 그룹 3 동물 1번).
그룹 1의 동물 1번만 연구 47일째 묽은 변이 발생했지만, 절식 후 회복되었고 다음 연구일에 그리고 연구 마지막까지 임상 소견이 없었다. 연구 마지막까지 생존한 다른 동물(그룹 3의 1번)은 연구 47일부터 연구 50일까지 묽은 변과 약간 습하고 더러워진 회음 및 약간 감소된 자발적 활동을 나타냈다. 연구 51일째에는 임상 징후가 없었다.
이 결과를 바탕으로, 톡소이드 A/B를 이용한 면역화는 면역원성 및 부분 방어를 유도했다: 모든 백신접종 동물이 대조군 동물보다 오래 생존했다. 항원공격이 모든 대조군 동물에게 치명적이었지만, 백신접종 동물의 2/9는 시험 종료까지 생존했다. 더욱이, 세포독성 중화 분석에서 햄스터 혈청 분석은 면역학적 반응의 발생을 확인시켜주었다.
백신접종 전 혈청에서는 독소 A 또는 B에 대한 세포독성 중화 항체를 전혀 검출할 수 없었고, 대조군 동물은 연구 38일째 최종 혈액 채혈시까지 중화 항체 없이 유지되었다. 모든 백신접종 동물은 3회 백신접종 후(연구 38일) 두 독소에 대해 중화 항체를 발생시켰고, 이는 불활성화된 독소 제조물의 면역원성을 분명하게 보여준다. 또한, 항원공격 역가는 상기 민감성 햄스터 모델에서 너무 높아서 추가 순응을 필요로 할 수 있다. 여러 백신 그룹의 생존율을 보면, 용량-관련 효과가 없는 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 적용된 톡소이드 농도의 작은 차이와 상관이 있을 수 있고, 따라서 모든 백신접종 동물은 오히려 하나의 백신 그룹으로 간주될 수 있다.
종합하면, 본 연구 결과는 자가촉매 절단에 의해 불활성화된 독소는 허용성이 양호하고, 감염에 대해 면역학적 반응 및 부분 방어를 유도할 수 있다는 것을 증명해준다.
Claims (12)
- AB 독소를 생산하는 세균성 병원균에 대한 백신을 생산하는 방법으로서,
(a) 상기 AB 독소가 생산되는 조건 하에 상기 병원균을 배양하고, 배양물을 수거하는 단계;
(b) 상기 AB 독소를 시험관내에서 효소 절단하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계
를 포함하는, AB 독소를 생산하는 세균성 병원균에 대한 백신을 생산하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 효소 절단의 보조인자로서 이노시톨 포스페이트, 바람직하게는 이노시톨 헥사포스페이트를 사용하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 수거 후에 배양 배지로부터 세포를 분리하고 상기 배양 배지 중의 상기 AB 독소를 절단하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AB 독소를, 절단 전에 수거물로부터, 바람직하게는 배양 배지로부터 정제하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원균이 클로스트리디움(Clostridium)속, 바람직하게는 씨. 디피실(C. difficile), 씨. 소델리(C. sordellii), 씨. 보툴리눔(C. botulinum), 씨. 퍼프린젠스(C. perfringens), 씨. 테타니(C. tetani) 또는 씨. 노비이(C. novyi), 또는 비브리오(Vibrio)속, 바람직하게는 브이. 콜레라(V. cholerae), 브이. 파라헤몰리티커스(V. parahaemolyticus), 브이. 벌니피커스(V. vulnificus), 브이. 스플렌디더스(V. splendidus) 또는 브이. 안길라럼(V. anguillarum), 또는 제노라브더스(Xenorhabdus)속, 바람직하게는 엑스. 네마토필라(X. nematophila), 엑스. 보비에니(X. bovienii), 또는 예르시니아(Yersinia)속, 바람직하게는 와이. 슈도튜베르큘로시스(Y. pseudotuberculosis), 와이. 페스티스(Y. pestis), 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) 또는 와이. 몰라레티(Y. mollaretti), 또는 보르데텔라(Bordetella)속, 바람직하게는 비. 퍼투시스(B. pertussis), 비. 파라퍼투시스(B. parapertussis) 또는 비. 브론키셉티카(B. bronchiseptica), 또는 악티노바실러스(Actinobacillus)속, 바람직하게는 에이. 플루로뉴모니에(A. pleuropneumoniae) 또는 에이. 수이스(A. suis) 및 이. 콜라이(E. coli)인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 병원균이 클로스트리디움 디피실이고, 독소 A를, 절단 전에 독소 B로부터 정제하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 보강제를 첨가하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 백신.
- 제8항에 있어서, 클로스트리디움 디피실의 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B를 포함하는, 백신.
- 자가촉매 절단에 의해 독소 A 및/또는 독소 B로부터 생성된, 클로스트리디움 디피실의 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B를, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 클로스트리움-유도 설사에 대한 백신.
- AB 독소를 생산하는 병원균의 감염에 대한, 사람을 포함하는 동물의 백신접종을 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 백신의 용도.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 백신의 유효량을 사람을 포함하는 동물에게 투여함을 포함하는, AB 독소를 생산하는 병원균의 감염에 대한, 사람을 포함하는 동물의 백신접종 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08170591.5 | 2008-12-03 | ||
| EP08170591 | 2008-12-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110100189A true KR20110100189A (ko) | 2011-09-09 |
Family
ID=42022135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020117008708A KR20110100189A (ko) | 2008-12-03 | 2009-12-01 | 백신 생산 방법 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110243991A1 (ko) |
| EP (1) | EP2373332A1 (ko) |
| JP (1) | JP2012510497A (ko) |
| KR (1) | KR20110100189A (ko) |
| CN (1) | CN102238960B (ko) |
| AR (1) | AR074455A1 (ko) |
| AU (1) | AU2009324180A1 (ko) |
| BR (1) | BRPI0922219A2 (ko) |
| CA (1) | CA2737403A1 (ko) |
| CL (1) | CL2011001284A1 (ko) |
| CO (1) | CO6390040A2 (ko) |
| MX (1) | MX2011005758A (ko) |
| RU (1) | RU2011126602A (ko) |
| SG (1) | SG171934A1 (ko) |
| TW (1) | TW201026852A (ko) |
| UA (1) | UA105508C2 (ko) |
| WO (1) | WO2010063693A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA201101645B (ko) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2507553T3 (es) * | 2006-08-02 | 2014-10-15 | Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Fármaco contra intoxicaciones por LCT |
| CA2699435A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Pharmaceutical compositions containing clostridium difficile toxoids a and b |
| DK3549949T5 (da) | 2011-04-22 | 2024-09-02 | Wyeth Llc | Sammensætninger vedrørende et mutant Clostridium-difficile-toksin og fremgangsmåder dertil |
| BR122016023101B1 (pt) | 2012-10-21 | 2022-03-22 | Pfizer Inc | Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile |
| US8909605B1 (en) | 2013-02-28 | 2014-12-09 | Emc Corporation | Method and system for accelerating data movement using change information concerning difference between current and previous data movements |
| CN105451762A (zh) * | 2013-04-22 | 2016-03-30 | 俄克拉荷马州大学评议会 | 艰难梭菌疫苗及使用方法 |
| CN109865135A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-06-11 | 宁波大学 | 一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌联合灭活疫苗 |
| KR102376876B1 (ko) * | 2020-04-09 | 2022-03-21 | 대진대학교 산학협력단 | 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편 및 이의 용도 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6967088B1 (en) * | 1995-03-16 | 2005-11-22 | Allergan, Inc. | Soluble recombinant botulinum toxin proteins |
| WO1997002835A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-30 | Oravax, Inc. | Intranasal vaccination against gastrointestinal disease |
| EP2502998A3 (en) * | 1999-04-09 | 2013-02-27 | Intercell USA, Inc. | Recombinant toxin A/ToxinB vaccine against clostridium difficile |
| WO2004041857A2 (en) * | 2002-06-17 | 2004-05-21 | Ballard Jimmy D | Mutant of clostridium difficile toxin b and methods of use |
| CN101500581B (zh) * | 2006-06-08 | 2013-10-30 | 科内尔研究基金会 | 编码艰难梭菌毒素a和毒素b受体结合域的密码子优化dna分子及其使用方法 |
| ES2507553T3 (es) * | 2006-08-02 | 2014-10-15 | Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Fármaco contra intoxicaciones por LCT |
-
2009
- 2009-12-01 WO PCT/EP2009/066109 patent/WO2010063693A1/en active Application Filing
- 2009-12-01 EP EP09775142A patent/EP2373332A1/en not_active Withdrawn
- 2009-12-01 RU RU2011126602/10A patent/RU2011126602A/ru not_active Application Discontinuation
- 2009-12-01 BR BRPI0922219A patent/BRPI0922219A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-12-01 UA UAA201108284A patent/UA105508C2/uk unknown
- 2009-12-01 US US13/126,186 patent/US20110243991A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-01 AU AU2009324180A patent/AU2009324180A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-01 JP JP2011538987A patent/JP2012510497A/ja active Pending
- 2009-12-01 KR KR1020117008708A patent/KR20110100189A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-12-01 MX MX2011005758A patent/MX2011005758A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-12-01 CA CA2737403A patent/CA2737403A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-01 SG SG2011040409A patent/SG171934A1/en unknown
- 2009-12-01 CN CN200980148516.8A patent/CN102238960B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-12-02 TW TW098141177A patent/TW201026852A/zh unknown
- 2009-12-02 AR ARP090104651A patent/AR074455A1/es active Pending
-
2011
- 2011-03-03 ZA ZA2011/01645A patent/ZA201101645B/en unknown
- 2011-05-31 CL CL2011001284A patent/CL2011001284A1/es unknown
- 2011-06-02 CO CO11068894A patent/CO6390040A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201101645B (en) | 2011-11-30 |
| SG171934A1 (en) | 2011-07-28 |
| US20110243991A1 (en) | 2011-10-06 |
| CL2011001284A1 (es) | 2011-09-16 |
| BRPI0922219A2 (pt) | 2018-10-23 |
| RU2011126602A (ru) | 2013-01-10 |
| CN102238960A (zh) | 2011-11-09 |
| AR074455A1 (es) | 2011-01-19 |
| WO2010063693A1 (en) | 2010-06-10 |
| TW201026852A (en) | 2010-07-16 |
| EP2373332A1 (en) | 2011-10-12 |
| CO6390040A2 (es) | 2012-02-29 |
| JP2012510497A (ja) | 2012-05-10 |
| UA105508C2 (uk) | 2014-05-26 |
| MX2011005758A (es) | 2011-06-28 |
| CN102238960B (zh) | 2014-04-23 |
| CA2737403A1 (en) | 2010-06-10 |
| AU2009324180A1 (en) | 2010-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20110100189A (ko) | 백신 생산 방법 | |
| AU2016222520B2 (en) | Attenuated Streptococcus suis vaccines and methods of making and use thereof | |
| TWI624474B (zh) | 類毒素、組合物及相關方法 | |
| AU691797B2 (en) | Immunotherapeutic composition | |
| US9597386B2 (en) | Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof | |
| US6391315B1 (en) | Vaccine for inhibiting and preventing induced staphylococcus infection, isolated antigens used therein, and isolated antibodies induced thereby | |
| WO2020102717A2 (en) | Clostridium difficile multi-component vaccine | |
| JP2911603B2 (ja) | 新規な弱毒化シュードモナス・エルギノーザ株 | |
| US10314902B2 (en) | Outer membrane vesicles and uses thereof | |
| Boroff | Studies of the toxin of Clostridium botulinum. IV. Fluorescence of Clostridium botulinum toxin and its relation to toxicity | |
| US20180110849A1 (en) | Methods for immunizing against clostridium difficile | |
| WO2011005587A1 (en) | Vaccine compositions and methods of use to protect against infectious disease | |
| JP2721218B2 (ja) | ブタ赤痢ワクチン | |
| RU2671473C2 (ru) | Вакцина против кампилобактериоза | |
| Yelyseyeva et al. | Anti-adhesive therapies as a contemporary means to fight infectious diseases and adherence factors of Corynebacteria diphtheriae | |
| WO1992019720A1 (fr) | Souches recombinantes immunogenes de b. anthracis - compositions immunogenes les contenant | |
| Derbise et al. | Contribution of the Type 3 Secretion System to immunogenicity of a live Yersinia pseudotuberculosis plague vaccine | |
| EP0420743A1 (fr) | Vaccin protecteur contre l'hémophilose porcine | |
| Gurjar | Characterization of Clostridium perfringens beta2 toxin | |
| Lowry | Identification of novel gene products associated with virulence of Brucella abortus using gene discovery and targeted approaches |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |