ES2507553T3

ES2507553T3 - Fármaco contra intoxicaciones por LCT

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Publication number: ES2507553T3
Application number: ES07722473.1T
Authority: ES
Inventors: Christoph Von Eichel-Streiber; Jessica Reineke; Stefan Tenzer; Hansjörg Schild; Maja Rupnik
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2007-05-26
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2027-05-26
Also published as: UA96768C2; CA2659684A1; JP5777594B2; US20090311258A1; WO2008014733A9; JP2009545536A; EP2054044B1; EP2054044A1; AU2007280861B2; RU2009107138A; RU2465893C2; AU2007280861A1; US9066961B2; US20130280286A1; WO2008014733A1; JP2013067630A; JP5345532B2; US20150344531A1

Abstract

1,2-epoxi-3-(p-nitrofenoxi)-propano (EPNP) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT (>= citotoxinas clostridiales grandes), concretamente por toxina A de Clostridium difficile (TcdA) y/o toxina B de Clostridium difficile (TcdB) y/o toxina letal de Clostridium sordellii (TcsL) y/o toxina de Clostridium novyi (Tcn).

Description

Fármaco contra intoxicaciones por LCT

La invención se refiere a principios activos para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por citotoxinas clostridiales grandes (LCT), en particular las toxinas A y B de Clostridium difficile (TcdA y TcdB), la toxina letal de Clostridium sordellii (TcsL) y la toxina α de Clostridium novyi (Tcnα).

Clostridium difficile es un germen gram-positivo formador de esporas que crece de forma estrictamente anaerobia, que no se identificó hasta finales de los años 70 como agente etiológico de la diarrea asociada a antibióticos y la colitis pseudomembranosa. Desde los años 90 se considera C. difficile el germen hospitalario más significativo de los países desarrollados. Como consecuencia del empleo de antibióticos de amplio espectro, que continúa extendiéndose constantemente, continúa aumentando constantemente la incidencia de infecciones por C. difficile, sobre todo en pacientes tratados de forma estacionaria.

De las afecciones asociadas a C. difficile son responsables las exotoxinas toxina A (TcdA) y toxina B (TcdB) producidas por C. difficile. Existen distintas cepas con diferente virulencia y producción de toxinas. Aproximadamente un cuarto de todas las cepas no producen ninguna toxina. Las cepas formadoras de toxinas producen casi siempre ambas toxinas. TcdA es una enterotoxina que, debido a lesión citotóxica de los enterocitos, aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal y con ello desencadena una diarrea. TcdB es una citotoxina que altera el transporte electrolítico y es responsable de la pérdida de líquidos y de alteraciones funcionales del intestino. Las toxinas TcdA y TcdB pertenecen al grupo de las denominadas citotoxinas clostridiales grandes (LCT) y están compuestas, respectivamente, de una cadena peptídica con tres dominios funcionales, concretamente el dominio Cterminal, que es responsable de la unión de la toxina a la membrana de la célula hospedadora, el dominio central hidrófobo, que se hace (cor)responsable del proceso de translocación a través de las membranas celulares, y el dominio N-terminal, que presenta una función glucosiltransferasa y que media en la actividad tóxica de la molécula.

Ciertamente, el proceso de absorción de las toxinas al interior de la célula hospedadora todavía no se ha aclarado por completo, sin embargo, se considera un hecho que las toxinas, después de la unión a un receptor de la célula hospedadora, llegan mediante endocitosis al interior de la célula hospedadora y que, para desplegar su toxicidad, se escinde el dominio catalítico N-terminal y se transporta al citosol de la célula hospedadora. Allí, el dominio catalítico glucosila específicamente las GTPasas de las subfamilia Rho (Rho, Rac y Cdc42) que, a su vez, intervienen en gran cantidad de cascadas de transducción de señal y, de este modo, bloquea los procesos correspondientes de transducción de señal, lo que, finalmente, lleva a la disgregación del citoesqueleto y a la muerte celular.

Hasta ahora, en el estado de la técnica se ha partido de que la escisión del dominio N-terminal catalítico de las cadenas peptídicas de toxina de TcdA y TcdB y también otras "toxinas clostridiales grandes" LCT se cataliza por una proteasa celular (Rupnik et al., 2005 y Pfeiffer et al., 2003). Sin embargo, no se ha podido presentar una comprobación correspondiente.

Rupnik et al. 2005 describen experimentos in vitro que muestran que TcdB se escinde en una única etapa proteolítica en dos fragmentos, de los cuales el fragmento N-terminal más pequeño presenta la función citotóxica y la función glucosiltransferasa. Los autores defienden la opinión de que el proceso de escisión es catalizado por una proteasa sensible a pepstatina eucariota de la célula hospedadora, que está localizada en el citoplasma y en la superficie citoplasmática de membranas intracelulares. Se muestra que los fragmentos N-terminales ya escindidos no son recogidos en células eucariotas. En el "ensayo in vitro" descrito para la identificación de sustancias que inhiben o favorecen la reacción de escisión proteolítica, la proteasa en la "fracción citosólica" de la célula hospedadora es la diana para las sustancias de ensayo.

Rode et al. 2003 describen exámenes para la influencia de iones bivalentes directamente sobre la actividad glucosiltransferasa en el dominio tóxico de las LCT con el ejemplo de la interacción de TcdB con calcio. Su sistema de ensayo es una mezcla acelular de LCT, proteínas G pequeñas y UDP-glucosa marcada radiactivamente.

Faruki et al. 1987 describen el efecto del antibiótico LY146032 sobre el crecimiento del Clostridium difficile y la influencia de iones calcio sobre esta actividad antimicrobiana de este antibiótico. El sistema de ensayo son bacterias

C. difficile in vitro sobre placas de Petri. Se muestra que la adición de iones calcio reduce significativamente la eficacia del antibiótico LY146032 como inhibidor del crecimiento de C. difficile.

Supuran et al. 2002 describen en su artículo de revisión la actual situación de los antibióticos contra bacterias, el desarrollo creciente de resistencia bacteriana y las posibilidades de generar nuevas generaciones de antibióticos antibacterianos con mecanismos de acción distintos de los conocidos. Se presenta el estado de la técnica en el diseño de tales inhibidores enzimáticos con potenciales aplicaciones terapéuticas, así como los avances más recientes en el empleo de algunas de estas proteasas en la terapia. No se menciona la aspartato proteasa de LCT.

Martin et al. 1999 describen exámenes con respecto a la proteína bacteriana toxina tetánica (TeNt), que se forma por la bacteria Clostridium tetani, que pertenece a la familia de las endopeptidasas de cinc y que provoca la escisión

de la proteína sinaptobrevina en el aparato de exocitosis de neurotransmisor de células eucariotas. La toxina tetánica no es ninguna toxina de la "familia de toxinas clostridiales grandes (LCT)".

El documento WO 99/24461 describe un compuesto con la fórmula estructural química general (I) y fármacos que contienen el mismo, que se proponen para inhibir la actividad de las toxinas de clostridios toxina tetánica y neurotoxina botulínica (serotipo A a G). (véase descripción, página 1, párrafo 1). La toxina tetánica y la neurotoxina botulínica no son toxinas de la "familia de toxinas clostridiales grandes (LCT)".

Chrzanowska et al. 1995 describen una proteinasa ácida de Penicillium camemberti. Como el sustrato de esta proteasa fúngica se conocen exclusivamente proteínas eucariotas.

En el transcurso de los exámenes en los que se basa la presente invención, no obstante, ahora se ha hallado sorprendentemente que la escisión de TcdA y TcdB es un proceso autocatalítico que es iniciado por inositolfosfato (IP) y que, por consiguiente, las toxinas de Clostridium difficile, además de su función catalítica de la glucosiltransferasa, poseen también la función de una proteasa para la autoescisión o escisión autocatalítica.

Esta función proteasa se identificó como aspartato proteasa. Como centro catalítico de la función proteasa se identificó la región proteica que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición aminoacídica AA 1653 a AA 1678 de la TcdB de acuerdo con la secuencia P18177 (SwissProt/TrEMBL). El motivo DXG característico de aspartato proteasas (Rao et al. 1998) se encuentra en la posición aminoacídica 1665.

Como punto de unión de inositolfosfato se identificó la región proteica que comprende la secuencia de aminoácidos de la posición aminoacídica AA 1517 a AA 2142 de la proteína TcdB de acuerdo con la secuencia Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL). Esta secuencia de aminoácidos representa un motivo inosin-5-monofosfato-deshidrogenasa (IMPDH) que está compuesto de dos zonas, concretamente AA 1517 -AA 1593 y AA 1918 -AA 2142, que están separadas por una sección de proteína de 325 aminoácidos de longitud sin homología de secuencia.

Para el tratamiento de pacientes con infecciones por C. difficile en primer lugar se deja de administrar el antibiótico desencadenante, siempre que esto sea posible. El tratamiento posterior se realiza de forma exclusivamente sintomática. Con una evolución de la enfermedad de mayor duración o grave, así como cuando no es posible dejar de administrar el antibiótico desencadenante por otros motivos, para la terapia se administra metrondiazol o vancomicina.

Las desventajas de la terapia antimicrobiana actual son diversas. En este caso sobre todo es decisivo que una afección que se ha desencadenado como consecuencia del tratamiento de otra situación infecciosa con antibióticos, no se puede curar de forma eficaz con una terapia antimicrobiana. El trasfondo de esto es el hecho de que C. difficile aparece solo de forma relativamente poco frecuente en el intestino de seres humanos sanos y no se puede imponer frente a la flora intestinal normal. Si se destruye la flora intestinal normal mediante terapia con antibióticos, C. difficile se puede imponer y colonizar de forma eficaz el intestino. A su vez, la terapia con antibióticos dirigida contra C. difficile conduce a la destrucción de la flora intestinal y, por tanto, también es la causa de que se impida la generación de una flora intestinal sana. Esto explica también la elevada cantidad de remisiones que se observan después de la finalización de la terapia antimicrobiana. Una desventaja adicional de la terapia actual es la aparición creciente de cepas multirresistentes de C. difficile en tiempos recientes. Con ello existe el riesgo de que también la única terapia hasta ahora para afecciones inducidas por C. difficile se haga inútil y aumente la cantidad de casos mortales como consecuencia de afecciones por C. difficile. A esto se añade que los antibióticos necesarios para el tratamiento de una infección por C. difficile son muy caros y normalmente se emplean solo en casos motivados como antibióticos de reserva.

Por tanto, existe una urgente necesidad de medicamentos que sean adecuados para combatir específicamente (evitar, eliminar, mitigar) infecciones por C. difficile sin que exista el riesgo de desarrollo de resistencias en los clostridios o incluso en otras bacterias y sin dañar la flora bacteriana natural de los pacientes afectados, en particular su flora intestinal.

El objetivo de la presente invención es facilitar un medicamento de este tipo.

Una manera de conseguir el objetivo mencionado consiste en la facilitación de principios activos del tipo que se ha mencionado al principio, que representen inhibidores o activadores de la actividad proteasa autocatalítica de LCT (citotoxinas clostridiales grandes), en particular de la actividad proteasa autocatalítica de toxina A de Clostridium difficile (TcdA) y/o toxina B de Clostridium difficile (TcdB) y/o toxina letal de Clostridium sordellii (TcsL) y/o toxina α de Clostridium novyi (Tcnα) y que están especificados en las reivindicaciones.

En lo sucesivo se denominan efectores de la actividad proteasa autocatalítica de LCT tanto activadores como inhibidores de la actividad proteasa autocatalítica de LCT.

Si el principio activo o efector es un inhibidor, entonces su efecto antitóxico se basa en que inhibe la actividad proteasa de la toxina intacta, en particular de la TcdB o TcdA o TcsL o Tcnα y, por tanto, suprime la escisión del

fragmento de efecto citotóxico con función glucosiltransferasa (en el caso de TcdB y TcdA, esto es el fragmento de 63 kDa).

Son inhibidores adecuados sustancias químicas que inhiben la actividad proteasa de las toxinas.

La expresión "sustancia química" en las anteriores y en las siguientes explicaciones indica compuestos tanto inorgánicos como orgánicos, iones, péptidos o proteínas.

Son inhibidores preferentes aquellas sustancias químicas que inhiben de forma irreversible la actividad proteasa. Un ejemplo de esto es la sustancia EPNP (1,2-epoxi-3-(p-nitrofenoxi)-propano). Las sustancia reacciona de forma irreversible con restos aspartato en el centro catalítico de proteasas y, de este modo, inhibe el efecto proteolítico. Otros inhibidores de proteasa son conocidos por el experto o se pueden identificar fácilmente por el mismo con métodos conocidos (modelado informático, cribado de alto rendimiento). Por ejemplo, para llevar a cabo un "cribado de alto rendimiento" se puede sintetizar un péptido cuya secuencia de aminoácidos se corresponda con la secuencia del punto de escisión de proteasa de las LCT. Mediante acoplamiento de este péptido, por ejemplo, al colorante AMC (7-amino,4-metil-cumarina) con métodos que son conocidos por el experto se puede generar una sonda. Para llevar a cabo el "cribado de alto rendimiento", a continuación, la sonda marcada se agrupa con la toxina y las sustancias candidatas. Si se escinde la sonda, entonces se producen cambios en el espectro de fluorescencia. Estos cambios son fáciles de registrar con los métodos habituales para el experto (detectores de fluorescencia). Entonces, las preparaciones en las que no se puede observar ningún cambio del espectro de fluorescencia contienen potenciales inhibidores de proteasa.

A modo de ejemplo se describe también otro procedimiento para la identificación de sustancias que influyen en la activación de la actividad proteasa autocatalítica de las LCT. Para esto se pueden usar la holotoxina o incluso fragmentos de toxina adecuados que están acoplados, por ejemplo, a un colorante cuya fluorescencia en la toxina o fragmento de toxina no escindido está inactivada. Gracias a la escisión autocatalítica de la toxina o de los fragmentos de toxina se anula el efecto de inactivación. Se pueden registrar fácilmente los cambios en el espectro de fluorescencia, tal como se ha descrito.

Son inhibidores, es decir, efectores con función inhibidora, particularmente adecuados las sustancias químicas, en particular proteínas y, entre estas, sobre todo anticuerpos que inhiben la actividad proteasa autocatalítica de las LCT al interaccionar con el centro activo de la proteasa.

El término "interaccionar" en el presente contexto se refiere a cualquier tipo de interacción entre las LCT y una sustancia química, en particular una proteína, y comprende en particular enlaces covalentes tales como, por ejemplo, enlaces disulfuro y enlaces no covalentes tales como, por ejemplo, fuerzas van-der-Waals, interacciones hidrófobas o electrostáticas, así como enlaces de puentes de hidrógeno.

A este respecto se prefieren proteínas y, entre estas, sobre todo anticuerpos que interaccionan con la región de proteína TcdB de AA 1500 a AA 1800, en particular de AA 1653 a AA 1678 y, sobre todo, con el motivo DXG en la posición 1665 -respectivamente de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL) o las regiones de proteína equivalentes u homólogas con respecto a esto de TcdA o TcsL o Tcnα. En el caso de estas regiones de proteína equivalentes/homólogas se trata, en el caso de TcdA, de la sección de secuencia de aminoácidos de AA 1651 a AA 1675 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdA Nº P16154 (SwissProt/TrEMBL) con el motivo DXG en la posición aminoacídica AA 1662, en el caso de TcsL, de la sección de secuencia de aminoácidos de AA 1654 a AA 1679 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcsL Nº Q46342 (SwissProt/TrEMBL) con el motivo DXG en la posición aminoacídica AA 1666 y en el caso de Tcnα, de la sección de secuencia de aminoácidos de AA 1641 a AA 1665 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de Tcnα Nº Q46149 (SwissProt/TrEMBL).

Otros inhibidores adecuados (efectores con función inhibidora) son sustancias químicas, en particular proteínas y, entre estas, sobre todo anticuerpos que inhiben la actividad proteasa autocatalítica de las LCT al inhibir la interacción del inositolfosfato con la toxina. Al evitarse la unión de IP se suprime la escisión proteolítica de las toxinas.

A este respecto se prefieren proteínas y, entre estas, sobre todo anticuerpos que interaccionan con la región de proteína TcdB de AA 1400 a AA 2300, en particular de AA 1517 a AA 2142 y, sobre todo, de AA 1517 a AA 1593 o AA 1918 a AA 2142 -respectivamente de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL) -o con las regiones de proteína equivalentes u homólogas con respecto a esto de las toxinas TcdA o TcsL o Tcnα.

Igualmente se pueden generar también anticuerpos u otras proteínas que no interaccionan directamente con el punto de unión de inositolfosfato, en particular las regiones de proteína que se han mencionado anteriormente, sino que están dirigidos contra regiones adyacentes y que impiden estéricamente la unión de IP y que evitan, por tanto, la escisión proteolítica de las toxinas. Además se pueden generar anticuerpos u otras proteínas que no interaccionan directamente con el motivo DXG de la función proteasa de las LCT, sino que evitan la escisión proteolítica mediante

unión en secciones de proteína adyacentes.

Son activadores adecuados, es decir, efectores con función activadora, las sustancias químicas que activan la actividad proteasa de las toxinas.

5 El efecto antitóxico de un activador se basa en que inicia la actividad proteasa de la toxina intacta, en particular de la TcdB o TcdA o TcsL o Tcnα, incluso antes de que la toxina se haya unido de tal manera a la célula hospedadora que el fragmento escindido haya podido llegar al interior celular (citosol). Por consiguiente, el activador causa una escisión del fragmento de efecto citotóxico con función glucosiltransferasa (en el caso de TcdB y TcdA es el

10 fragmento de 63 kDa) fuera de la célula hospedadora. Entonces, el fragmento de efecto citotóxico no puede alcanzar ya el interior celular y desplegar allí su efecto citotóxico.

Un activador (efector con función activadora) particularmente adecuado es inositolfosfato (IP) aislado (a diferencia del citosólico), preferentemente inositolhexafosfato (IP6).

15 Un medicamento con este principio activo tiene la ventaja de que la LCT existente en el intestino del paciente, en particular TcdB y/o TcdA y/o TcsL y/o Tcnα, debido al IP suministrado de forma medicamentosa ya en el intestino es inducido a realizar la escisión, es decir, incluso antes de que se pueda unir a células intestinales o a otras células corporales y tener su efecto tóxico.

20 Los centros catalíticos de la función proteasa de las LCT de acuerdo con la invención se pueden usar también como antígenos (sustancias de vacunación) administrados de forma dirigida para la generación de una inmunización frente a las toxinas. Por tanto, también es objetivo de la presente invención el uso de fragmentos proteicos de LCT como principio activo de vacuna durante el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT (= citotóxicas

25 clostridiales grandes), que está caracterizado por que el o los principios activos antigénicos están seleccionados del siguiente grupo de fragmentos proteicos:

-: motivo DXG en posición 1665 de la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL), -las posiciones aminoacídicas AA 1653 a AA 1678 de la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P 18177 30 (SwissProt/TrEMBL), -las posiciones aminoacídicas AA 1500 a AA 1800 de la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P 18177

(SwissProt/TrEMBL), -el motivo DXG en la posición 1662 de la secuencia de aminoácidos de TcdA Nº P16154 (SwissProt/TrEMBL), -las posiciones aminoacídicas AA 1651 a AA 1675 de la secuencia de aminoácidos de TcdA Nº P 16154

35 (SwissProt/TrEMBL) -el motivo DXG en la posición 1666 de la secuencia de aminoácidos de TcsL Nº Q46342 (SwissProt/TrEMBL) -las posiciones aminoacídicas AA 1654 a AA 1679 de la secuencia de aminoácidos de TcsL Nº Q46342

(SwissProt/TrEMBL), -las posiciones aminoacídicas AA 1641 a AA 1665 de la secuencia de aminoácidos de Tcnα Nº Q46149 40 (SwissProt/TrEMBL).

A continuación se explica con mayor detalle la invención mediante ejemplos de realización y figuras. Muestran

La Figura 1: escisión de la holotoxina TcdB10463 (270 kDa) en el domino de translocación/ligando (207 kDa) y el 45 domino catalítico N-terminal (63 kDa) en la SDS-PAGE, llevada a cabo con

a: una mezcla de TcdB10463 marcada con Cy3 y extracto de esplenocitos de cerdo (Ejemplo 1 A);

b: una mezcla de TcdB10463 marcada con Cy3 y extracto de esplenocitos de cerdo sin proteína

(Ejemplo 1 B); 50 c: una mezcla de TedB10463 marcada con Cy3 e inositolfosfato;

d: una mezcla de TedB10463 no marcada e inositolfosfato;

e: una mezcla de TedB10463 no marcada (purificada mediante cromatografía de afinidad) e inositolfosfato; a-e respectivamente después de una incubación a temperatura ambiente durante 1 hora

55 La Figura 2: SDS-PAGE de una mezcla de TcdB10463 y/o IP6, con o sin pretratamiento de la toxina con EPNP;

Carril 1: TcdB10463 después del pretratamiento con EPNP y sin IP6, no comprobable ninguna banda en el intervalo de 63 kDa;

60 Carril 2: TcdB10463 después del pretratamiento con EPNP y después de la incubación con IP6, la banda de 63 kD típica está marcada solo débilmente; Carril 3: TcdB10463 sin pretratamiento con EPNP y después de la incubación con IP6, se puede reconocer una banda marcada claramente en el intervalo de peso molecular de 63 kDa; Carril 4: TcdB10463 sin pretratamiento con EPNP y sin IP6, no comprobable ninguna banda en el

65 intervalo de 63 kDa.

La Figura 3: Análisis de IEN-CLEMEM) después de la digestión con tripsina de la proteína TcdB nativa (a) y

modificada con EPNP (b). Exploraciones de supervivencia de EM (imagen grande) y espectros de

fragmentación (intercalación).

Todos los procedimientos mencionados en los siguientes ejemplos son conocidos por el experto y están descritos, por ejemplo, en Ausubel et al. (2003).

Ejemplo 1: comprobación de la actividad proteasa autocatalítica de TcdB

En primer lugar se marcó mediante fluorescencia con Cy3 la toxina B de Clostridium difficile (270 kDa) de la cepa de referencia VPI10463, llamada en lo sucesivo de forma abreviada TedB10463.

Para esto se marcaron 200-400 µg de TedB10463 (tgcBIOMICS, Mainz, Alemania) con el colorante Cy3 según las indicaciones del fabricante (Amersham Biosciences) al incubarse la toxina junto con colorante disuelto en dimetilformamida durante 1 hora a 4 ºC. A continuación se retiró el colorante no unido mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Size Exclusion Chromatography = SEC), sirviendo como tampón de elución Tris-HCl 10 mM pH 8,5. La proporción molar entre colorante y TcdB10463 marcada con Cy3 era de 0,8 -1,6. Se dividió en alícuotas la TedB10463 marcada y se almacenó a -80 ºC hasta el uso posterior.

(A) Para llevar a cabo el "ensayo de escisión in vitro" conocido en el estado de la técnica (véase, para esto, en particular Rupnik et al. (2005); por la presente se hace referencia expresa al contenido de esa publicación) se incubó una alícuota descongelada a temperatura ambiente de TcdB10463 marcada con Cy3 durante 1 hora a temperatura ambiente con extracto de esplenocitos de cerdo.

Se preparó del siguiente modo este extracto de esplenocitos de cerdo: se recogió bazo de cerdo recién obtenido en tampón fosfato (PBS) y se trituró hasta dar una suspensión de células individuales. Mediante adición de tampón de baja salinidad (Low Salt Buffer), -concretamente NH4Cl 150 mM, KHCO3 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,6 -, se lisaron y, por tanto, retiraron los eritrocitos presentes. A continuación, los esplenocitos se lavaron dos veces con Tris-HCl 10 mM pH 8,5 y se congelaron inmediatamente a -80 ºC. Para el extracto celular deseado en caso necesario se descongeló una alícuota de estos esplenocitos congelados en una alícuota de Tris-HCl 10 mM pH 8,5 y se suspendió y, a continuación, esta suspensión se sometió a un tratamiento por ultrasonidos. El lisado obtenido se centrifugó durante 1 hora a 200 000 x g y 4 ºC y el sobrenadante se usó para los experimentos pendientes.

Al final de la fase de incubación, la mezcla de TcdB10463 marcada con Cy3 y extracto de esplenocitos de cerdo se sometió a una SDS-PAGE para separar y comprobar los fragmentos de TcdB producidos durante la incubación. En la Fig. 1a está representado el resultado de esta SDS-PAGE: de acuerdo con lo esperado se obtuvieron los dos fragmentos conocidos y característicos de 63 kDa y 207 kDa de la toxina B de Clostridium difficile, en este caso de la TcdB10463.

Como controles negativos sirvieron alícuotas de TcdB10463 sin adición por mezcla de extracto de esplenocitos (véase la Fig. 1 "-").

(B) En un ensayo paralelo, el extracto de esplenocitos descrito en (A) antes de la incubación con la TedB10463 marcada con Cy3 se purificó de proteína. Con este fin, una alícuota del extracto de esplenocitos de cerdo preparado de acuerdo con (A) después del tratamiento con ultrasonidos se sometió a seis extracciones con fenol-cloroformo, que se llevaron a cabo del siguiente modo: el extracto de esplenocitos de cerdo se mezcló con fenol-cloroformoalcohol isoamílico (25/24/1) en proporción de volumen 1:1. Esta mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 1.700 x g y 4 ºC. La capa superior acuosa se decantó en un recipiente de centrífuga limpio y la centrifugación y decantación se repitieron de nuevo cinco veces. Para eliminar incluso los últimos restos de fenol, finalmente se llevó a cabo una extracción con cloroformo.

Las alícuotas de la fracción acuosa y sin proteína obtenida de este modo del extracto de esplenocitos se diluyeron en proporción de volumen 1:30 (30), 1:100 (100) o 1:300 (300) con Tris-HCl 10 mM pH 8,5 y, tal como se ha descrito en (A), se mezclaron con alícuotas descongeladas a temperatura ambiente de TcdB10463 marcada con Cy3 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Al final de la fase de incubación, estas mezclas se sometieron a una SDS-PAGE para separar y comprobar los fragmentos de TcdB producidos durante la incubación. El resultado de esta SDS-PAGE fue visible con ayuda del lector de imágenes Gel Doc EQ System (BIO-RAD München, Alemania) y está representado en la Fig. 1b: en todas las preparaciones de ensayo se obtuvieron los dos fragmentos característicos de 63 kDa y 207 kDa de TcdB10463. Esto muestra que la fracción acuosa y sin proteína del extracto de esplenocitos continúa poseyendo o poseía, al igual que antes, la propiedad de escindir la TcdB10463 en sus dos subfragmentos característicos.

En otro ensayo paralelo, el extracto de esplenocitos descrito en (A) se trató con calor (96 ºC, 30 minutos) antes de que, tal como se ha descrito en (A), se incubara con TcdB10463 marcada con Cy3 y se sometiera a la SDS-PAGE. El resultado de esta SDS-PAGE está representado también en la Fig. 1b: de nuevo se obtuvieron los dos fragmentos característicos de 63 kDa y 207 kDa de TcdB10463.

El resultado muestra que el extracto de esplenocitos inducido térmicamente continúa poseyendo la propiedad de escindir la TcdB10463 en sus dos subfragmentos característicos.

(C) En otra serie de ensayos se incubó TcdB10463 marcada con Cy3 y TcdB10463 no marcada en solitario (es decir, sin adición por mezcla de extracto de esplenocitos) con distintos inositolfosfatos durante 1 hora a temperatura ambiente y las respectivas mezclas se sometieron a continuación a una SDS-PAGE. El resultado de estos exámenes está representado en la Tabla 1 y en las Figuras 1c-e. Proporcionó las sorprendentes afirmaciones clave de que la escisión proteolítica de TcdB10463 en solitario se puede iniciar por una sustancia química tal como IP y que, por consiguiente, en el caso de esta escisión proteolítica se trata de un proceso autocatalítico de la proteína de toxina.

En la Tabla 1 se puede ver que una serie de inositolfosfatos pueden iniciar la escisión autocatalítica de TcdB10463. El inositolhexafosfato (IP6) provoca entre los inositolfosfatos ensayados la mayor actividad de escisión y esto quiere decir que IP6 posee la mayor actividad iniciadora (véase también las Fig. 1c-e).

El experto conoce análogos estructurales u otras sustancias relacionadas con los inositolfosfatos que poseen una actividad iniciadora, o se pueden establecer fácilmente con métodos conocidos (por ejemplo, modelado informático). Por ejemplo, también se pueden usar los "ensayos de alto rendimiento" que se han descrito anteriormente.

El ensayo de diferentes concentraciones de IP6 en el ensayo de incubación con TcdB10463 (véase las Fig. 1c y 1d) muestra que para la escisión de toxina B marcada con fluorescencia es suficiente una concentración de IP de 10 µM (Fig. 1c), mientas que para la escisión de toxina B no marcada (y no hecha visible hasta la SDS-PAGE mediante tinción con cinc (Zinc Stain and Destain Kit, Biorad, Hercules, EEUU)) son suficientes concentraciones aún menores de hasta 1 µM(Fig. 1d).

Se llevaron a cabo experimentos análogos también con las LCT TcdA10463, TcsL de C. sordellii y Tcnα. A este respecto se mostró que los inositolfosfatos tienen un efecto activador sobre la escisión autocatalítica de todas las toxinas examinadas de la familia de LCT.

(D) Para excluir que la TcdB10463 empleada en los ensayos, purificada de sobrenadante de cultivo de C. difficile estuviese contaminada con proteasas se llevó a cabo un ensayo de control con TcdB10463 purificada de forma especial. Esta purificación de la TcdB10463 se realizó mediante cromatografía de afinidad con empleo del anticuerpo monoclonal 2CV (DSM ACC 2321) del siguiente modo:

7 mg del anticuerpo monoclonal 2CV específico para TcdB (sobrenadante purificado de proteína G de un cultivo de hibridoma asérico) se acopló a una columna HiTrap NHS Sepharose (disponible en el mercado en GE Healthcare, Freiburg, FRG). El acoplamiento y la elución se llevaron a cabo de acuerdo con las indicaciones del fabricante. La columna terminada se cargó con aproximadamente 4 mg de TcdB10463 y las proteínas no unidas se eliminaron mediante lavado por tres veces con Tris/HCl 50 mM, pH 7,0; NaCl 125 mM. La elución se realizó en una etapa con trietanolamina-HCl 0,1 mM pH 11. La toxina eluyó en tres fracciones de 4 ml con concentraciones entre 450-185 µg/ml. La toxina eluida se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 1 M pH 7,5 en proporción de volumen 1/10, lo que estaba garantizado gracias a que esta solución de neutralización se había dispuesto ya antes del comienzo de la elución en los tubos de recogida para las fracciones. A continuación se comprobó la ausencia de proteínas contaminantes mediante SDS-PAGE y tinción posterior con cinc (véase la Fig. 1e "-").

El ensayo de control consistía en la incubación de TcdB10463 no marcada purificada de este modo con IP6 y posterior SDS-PAGE y comprobación de la toxina o de los fragmentos de toxina mediante tinción con cinc. En la Figura le está representado el resultado de este ensayo y muestra la escisión completa de la holotoxina en los dos fragmentos conocidos de 63 kDa y 207 kDa.

Ejemplo 2: inactivación de TcdB-10463 mediante incubación con un inhibidor de proteasa

Se purificó TcdB10463 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 (D) mediante cromatografía de afinidad con empleo del anticuerpo monoclonal 2CV y a continuación se pretrató (i) con el inhibidor de proteasa EPNP (1,2-epoxi-3-(pnitrofenoxi)-propano 10 mM) o (ii) -como control -con tampón (HEPES 50 mM, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, pH 8,0) durante 60 minutos a temperatura ambiente.

A continuación se llevó a cabo un ensayo de escisión in vitro de forma análoga al Ejemplo 1 (A). Las preparaciones de ensayo comprendían respectivamente un volumen de 10 µl y contenían respectivamente 50-100 ng de TcdB10463 no marcada, IP6 100 µM y Tris-HCl 10 mM pH 8,5. Estas preparaciones de ensayo se sometieron después de la incubación (1 h a temperatura ambiente) a una SDS-PAGE (10 %) y se hicieron visibles las toxinas y los fragmentos de toxina a continuación mediante tinción con cinc.

La Fig. 2 muestra el resultado de este experimento: la incubación de TcdB10463 en solitario con IP6 (carril 3) muestra una banda claramente marcada en el intervalo de peso molecular de 63 kDa. Cuando se pretrata la toxina previamente con EPNP (carril 2), la banda típica de 63 kD está solo débilmente marcada. Este hallazgo muestra que mediante la adición de EPNP, la actividad proteolítica (actividad proteasa) de la TcdB10463 prácticamente está

inhibida por completo.

La toxina pretratada con EPNP además se examinó en el ensayo de CHO según Moos et al. (2000) con respecto a su actividad residual (efecto citotóxico).

El ensayo de CHO se llevó a cabo del siguiente modo: en una placa de microtitulación de 96 pocillos se sembraron células CHO (células de ovario de hámster chino) (5000 células/pocillo) y se incubaron durante 16 horas en condiciones convencionales (5 % de CO2, 37 ºC, DMEM F12 complementado con L-glutamina 2 mM, 5 % de FCS). A continuación, las toxinas después de la dilución gradual en medio de cultivo se añadieron a las células. Se ensayaron niveles de dilución entre 100 y 10-8 . Las células se incubaron durante 3 horas en condiciones convencionales. A continuación se determinó microscópicamente la parte de células redondeadas al fotografiarse varios recortes representativos de los pocillos y al recontarse las células estiradas así como las redondeadas. (véase también Moos et al., Meth Enzymol. 2000, 325: 114-125. Por la presente se hace referencia expresa al contenido de esta publicación).

Los resultados de este ensayo de CHO muestran que la TcdB10463 pretratada con EPNP presenta una actividad citotóxica sustancialmente más débil que la TcdB10463 no tratada (compárese con la Tabla 2). Ya que el efecto inhibidor de EPNP, como es sabido, se basa en que EPNP realiza interacciones covalentes con restos aspartato catalíticos y, por ello, provoca una inactivación irreversible de la proteasa (Salto et al. 1994), los resultados del presente ensayo muestran que la inhibición de la actividad de TcdB10463 se basa en la inhibición de una actividad proteasa de esta molécula de toxina.

El experimento descrito en el presente documento con EPNP demuestra que el efecto tóxico de TcdB-0463 y otras LCT se reduce significativamente mediante pretratamiento de las toxinas con un inhibidor de proteasa adecuado.

EPNP representa una sustancia modelo para un inhibidor covalente de las LCT. El experto conoce otros inhibidores de efecto comparablemente covalente o que inhiben de forma competitiva o se pueden establecer por el mismo con métodos conocidos, por ejemplo, con los "ensayos de alto rendimiento" que ya se han descrito.

Ejemplo 3: inactivación del efecto citotóxico de TcdB10463 mediante activación extracelular de la actividad proteasa con IP6

Se incubó TcdB1063 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 (C) con IP6 100 µM. Después de la incubación se separó el fragmento de la proteína de toxina de 63 kDa de menor tamaño escindido por la actividad proteasa al purificarse la preparación a través de tubos Microcon (Millipore, tamaño de exclusión 100 kD). Este fragmento de 63 kDa de TcdB10463 a continuación se examinó en el ensayo de CHO descrito en el Ejemplo 2 según Moos et al. (2000) con respecto a la redondez de la células. A este respecto se añadió la proteína sin diluir y en niveles de dilución a las células.

En este ensayo se mostró que el fragmento de 63 kDa, que presenta la función glucosiltransferasa de TcdB10463, en las condiciones dadas en solitario no es/era capaz de causar un efecto citotóxico. Ni en el estado diluido ni en el no diluido se pudo observar una redondez de las células (como consecuencia de una glucosilación de GTPasas específicas de la subfamilia Rho, bloqueo resultante a partir de esto de procesos de transducción de señal y disgregación resultante a partir de esto del citoesqueleto). Este hallazgo de que el fragmento de toxina generado mediante autocatálisis extracelularmente es inactivo confirma los resultados de Pfeifer et al. (2003) y Rupnik et al. (2005), que muestran que el dominio catalítico escindido de TedB10463 no se recoge en células eucariotas y, por tanto, es inactivo en el medio celular. (Mientras que sin embargo en esos trabajos se excluye una actividad autocatalítica de las LCT explícitamente [Pfeiffer et al., 2003] o se especula acerca de una proteasa celular para la activación de las LCT [Rupnik et al., 2005], los resultados de ensayo obtenidos en relación con la presente invención muestran por primera vez que el fragmento de toxina N-terminal se escinde autocatalíticamente).

El efecto citotóxico de TcdB10463 y otras LCT, por consiguiente, se puede inhibir al inducirse la escisión proteolítica de las toxinas ya antes de la penetración de las toxinas en las células.

Ejemplo 4: comprobación del centro activo de la proteasa de TcdB

TcdB10463 inactivada con EPNP (compárese con el Ejemplo 2) y no tratada se separaron mediante gel SDS y se representaron con tinción con cinc. A continuación se recortaron las bandas correspondientes a las proteínas y se dividieron en pequeños trozos. Estos se decoloraron y secaron, a continuación se redujeron en DTT 2 mM y se alquilaron con yodoacetamida 20 mM. Después del lavado y nuevo secado de los fragmentos de gel, los mismos se digirieron con tripsina durante una noche a 37 ºC. A continuación, los péptidos resultantes se separaron mediante HPLC (NanoAcquity ultraperformance Liquid Chromatography, Waters, Milford, EEUU). Para esto se aplicaron 2 µl de las muestras sobre una columna de fase inversa (NanoEase BEH C18 (75 µm x 10 cm) de Waters, Milford, EEUU) en 2 % de tampón de fase móvil B (0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo). El tampón de fase móvil A contenía el 0,1 % de ácido fórmico en H2O. A continuación se eluyeron los fragmentos a través de un gradiente del 3-40 % de tampón de fase móvil B (90 min a 300 nl/min) de la columna.

A continuación se examinaron mediante espectrometría de masas los fragmentos eluidos. Para esto se usó un espectrómetro de masas Q-Tof Premium de la empresa Waters. El aparato se calibró con una solución de [Glu-1]péptido de fibrinógeno (500 fmol/µl con 300 nl/min) a través del pulverizador de referencia de la fuente NanoLockSpray (Waters). Para el análisis de los resultados se usó el software MassLnyx4.1 (Waters).

El análisis de los resultados muestra que la TcdB no tratada se diferencia de la toxina tratada con EPNP solo en un fragmento de tripsina (Figura 3). Este fragmento comprende los aminoácidos AA 1653 a 1678 de la proteína de TcdB de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P 18177 (SwissProt/TrEMBL) con el motivo DXG característico de aspartato proteasas en la posición 1665.

Una comparación de la secuencia de aminoácidos AA 1653 a AA 1678 del centro catalítico de TcdB con los correspondientes centros catalíticos y regiones de proteína de las toxinas TcdA, TcsL y Tcnα muestra que la región está altamente conservada (véase la Tabla 3).

Por tanto, el experto con métodos conocidos puede generar anticuerpos u otras proteínas que interaccionan específicamente con el centro activo del domino de proteasa de las toxinas y, por tanto, evitan por ejemplo la escisión autocatalítica de las LCT. Del mismo modo se pueden generar también anticuerpos o proteínas que no bloquean directamente el centro activo, sino que están dirigidos contra regiones adyacentes y, por tanto, impiden estéricamente la escisión autoproteolítica de la toxina.

Ejemplo 5: inhibición del efecto de TcdB por anticuerpos como consecuencia de la inmunización con TcdB inactivada

Para inducir una protección frente a los efectos citotóxicos de la TcdB se prepararon las siguientes preparaciones de TcdB y se emplearon para la inmunización en conejos:

Preparación A: TcdB, inactivada con formalina

Preparación B: TcdB, inactivada con EPNP (compárese con el Ejemplo 2)

Preparación C: fragmento de TcdB AS1601-1716 (motivo DSG)

Preparación D: fragmento de TcdB AS1508-1601 (parte del motivo de unión a inosina)

Preparación E: fragmentos de TcdB AA 1508-2157

(motivo DSG y todo el motivo de unión a inosina)

Los fragmentos de TcdB se expresaron con los métodos conocidos por el experto en el plásmido pET-19 (Novagen) y se purificaron a través del marcador His unido. A continuación se escindió el marcador His mediante digestión con enterocinasa. La pureza de la proteína se comprobó en el gel de SDS (datos no mostrados)

Para la inmunización en primer lugar se inmunizaron de base conejos con el antígeno y a continuación se sometieron a varias inmunizaciones de refuerzo. De la sangre de los conejos se obtuvieron finalmente antisueros policlonales.

Para comprobar el efecto neutralizante de los antisueros policlonales se pretrató en primer lugar TcdB con antisuero policlonal (nivel de dilución 1:100) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación se comprobó el efecto neutralizante de los antisueros, tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, mediante el ensayo de CHO. La medida del efecto neutralizante de los sueros era cuánto tiempo estaban protegidas las células del efecto citotóxico de la TcdB.

Los conejos inmunizados con la preparación A presentaban solo un reducido título de anticuerpos (compárese con la Tabla 4), además el suero de estos conejos no tenía ningún efecto neutralizante. Este hallazgo se corresponde con los resultados conocidos por el experto de ensayos de inmunización con LCT formalizadas.

Los animales que se habían inmunizado con la preparación B ciertamente desarrollaron un título claro (que se puede diluir hasta 1:1500), no obstante, tampoco este antisuero mostró ningún efecto neutralizante en el ensayo de CHO (Tabla 4).

Los conejos que se habían inmunizado con las preparaciones C a E también presentaban un título de anticuerpos y además sus sueros policlonales en el ensayo de CHO mostraban un efecto claramente neutralizante (Tabla 4). A este respecto, el suero policlonal que se había generado mediante inmunización con la preparación E presentaba las mejores propiedades neutralizantes.

Los sueros que se habían preparado mediante inmunización por separado con las preparaciones C y D frente a eso mostraron una menor acción neutralizante.

El éxito de la inmunización con el fragmento D, que comprende una parte de la región de unión a inositol, demuestra que en el caso de esta sección de las LCT se trata de una región importante para la activación de las toxinas. La unión del IP6 en esta sección de toxina conduce a la activación de la actividad proteasa autocatalítica y, por tanto,

también a la activación de las LCT.

El efecto neutralizante de la región alrededor del motivo DSG demuestra que los anticuerpos que están dirigidos contra el centro activo de la proteasa pueden inhibir la actividad proteolítica. Por tanto, con tales anticuerpos se 5 puede conseguir también in vivo una protección frente a los efectos tóxicos de las LCT.

Durante la inmunización con la preparación E se emplearon solo los dos fragmentos de las preparaciones C y D exitosas conjuntamente. El éxito de la inmunización con ambos fragmentos de TcdB se basa en que en los animales se inducen anticuerpos que están dirigidos tanto contra el centro activo de la proteasa como anticuerpos que se

10 unen a la región de unión a inositol-fosfato. Por tanto, el efecto del antisuero se basa en que se han podido inducir por primera vez anticuerpos específicos que evitan de forma precisa la activación de la toxina.

Para la absorción natural de las LCT en sus células diana es importante la escisión autocatalítica de las toxinas, ya que solo así se libera en las células diana el fragmento N-terminal que media en la actividad tóxica en sí. La unión

15 de anticuerpos específicos en el entorno del motivo DSG de la aspartato proteasa y del sitio de unión de inositolfosfato evita la escisión autocatalítica de las toxinas. Por tanto, en los pacientes mediante empleo de fragmentos de toxina que son necesarios para la escisión autocatalítica de las LCT, se puede conseguir una inmunización eficaz frente a las LCT.

20 Bibliografía:

Ausubel, F. M. et al.: "Current Protocols in Molecular Biology" (2003), John Wiley and Sons. Inc.

Rupnik et al. (2005) "Characterization of the cleavage site and function of resulting cleavage fragments after 25 limited proteolysis of Clostridium difficile toxin B(TcdB) by host cells." Mikrobiol 151, 199-208.

Moos et al. (2000) "Purification and evaluation of large clostridial cytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies" Meth Enzymol. 325: 114-125.

30 Pfeifer et al. (2003) "Cellular Uptake of Clostridium difficile toxins B" J. Biol. Chem. 278: 44535-41.

Rao et al. (1998) "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases" Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 597-635.

35 Salto et al. (1994) "In vitro characterization of nonpeptide irreversible inhibitors of HIV proteases", J. Biol. Chem.

269: 10691-8.

Tang (1971) "Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like Epoxides", J. Biol. Chem. 246: 4510-17.

40 Tabla 1: escisión autocatalítica de TcdB10463 con adición de inositolfosfatos definidos

IP: Concentración

1 mM: 100 µM 10 µM

1,5: - - -

1,4: - - -

4,5: - - -

1,4,5: - - -

2,3,5: - - -

1,3,5: - - -

1,3,5,6: - - -

1,2,3,4,6: - - -

1,3,4: + - -

1,3,4,5: + - -

3,4,6: + - -

1,2,3,4: + - -

1,2,3,4,5: + - -

1,2,3,5,6: + + -

1,3,4,5,6: + + -

3,4,5,6: + + -

2,3,4,5,6: + + -

1,4,5,6: + + -

1,2,3,4,5,6: + + +

Tabla 2: redondez celular (en %) de células CHO después de incubación con TedB10463 -con o sin pretratamiento con EPNP

Dilución: Células redondeadas [%] después de 3 h

TcdB-10463: TcdB-10463 + EPNP

10 -3: 100 % 100 %

10 -4: 100 % 100 %

10 -5: 100 % 50 %

10 -6: 100 % 10 %

10 -7: 10 % <5 %

10 -8: <5 % <5 %

Tabla 3: comparación de la secuencia de aminoácidos AA 1653 a AA 1678 del centro catalítico de la función proteasa de TcdB con los correspondientes centros catalíticos y regiones de proteína de las toxinas TcdA, TcsL y Tcnα.

Toxina: Región de secuencia homóloga

TcdB-10463: 1653-QNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQ-1678

TcdA-10463: 1651-RNVVVEPIYNPDTGEDISTSL-DFSY-1675

TcsL: 1654-QNLIVEPSYHLDDSGNISSTVINFSQ-1679

Tcnα: 1641-CNVIVSGSNKLNSEGDLADT-IDVLD-1665

Tabla 4: comienzo del redondeo celular (en h) de células CHO tras incubación con TcdB que se había pretratado con antisuero policlonal.

Preparación: Título de anticuerpos comienzo de redondeo celular después de

A: 1:100 1,5 h

B: 1:1500 3 h

C: 1:750 12-15 h

D: 1:500 9-12 h

E: 1:1000 >24 h

10 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia 15 <120> Fármaco contra intoxicaciones por LCT

<130> PCT/DE2007/000957

<140> EP07722473.1 20 <141>

<150> DE102006036373.6

<151> 25 <150> DE102007004938.4

<151>

<160> 19 30 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 <211>3

<212> PRT 35 <213> Clostridium difficile

<300>

<308> P16154

<309> 40 <313> (1662)..(1664)

>1

<210>2

<211> 25 5 <212> PRT

<213> Clostridium difficile

<300>

<308> P16154 10 <309>

<313> (1651)..(1675)

<400> 2

<210>3

<211> 2710

<212> PRT 20 <213> Clostridium sordellii

<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (1662)..(1664) 25 <223> Motivo DXG

<300>

<308> P16154

<309> 30 <313> (1)..(2710)

<400> 3

<210>4 5 <211>3

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<300> 10 <308> P18177

<309>

<313> (1665)..(1667)

<400> 4 15

<210>5

<211> 26 20 <212> PRT

<213> Clostridium difficile

<300>

<308> P18177 25 <309>

<313> (1653)..(1678)

<400> 5

<210>6

<211> 301 5 <212> PRT

<213> Clostridium difficile

<300>

<308> P18177 10 <309>

<313> (1500)..(1800)

<400>6

<210>7

<211> 901

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 7

<210>8

<211> 626

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 8

<210>9

<211> 77

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 9

<210> 10

<211> 225

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 10

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 11

<210> 12

<211> 94

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 12

<210> 13

<211> 650

<212> PRT

<213> Clostridium difficile

<400> 13

<210> 14

<211> 2366 5 <212> PRT

<213> Clostridium difficile

<220>

<221 > MISC_FEATURE 10 <222> (1665)..(1667)

<223> Motivo DXG

<300>

<308> P18177 15 <309>

<313> (1)..(2366)

<400> 14

<210> 15

<211> 25 5 <212> PRT

<213> Clostridium novyi

<300>

<308> Q46149 10 <309>

<313> (1641)..(1665)

<400> 15

<210> 16

<211> 2178

<212> PRT 20 <213> Clostridium novyi

<300>

<308> Q46149

<309> 25 <313> (1)..(2178)

<400> 16

<210> 17

<211>3 5 <212> PRT

<213> Clostridium sordellii

<300>

<308> Q46342 10 <309>

<313> (1666)..(1668)

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> PRT 20 <213> Clostridium sordellii

<300>

<308> Q46342

<309> 25 <313> (1654)..(1679)

<400> 18

30

<210> 19

<211> 2364

<212> PRT

<213> Clostridium sordellii

35

<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (1666)..(1668)

<223> Motivo DXG

40

<300>

<308> Q46342

<309>

<313> (1)..(2364)

45

<400> 19

Claims

REIVINDICACIONES

1.

1,2-epoxi-3-(p-nitrofenoxi)-propano (EPNP) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT (= citotoxinas clostridiales grandes), concretamente por toxina A de Clostridium difficile (TcdA) y/o toxina B de Clostridium difficile (TcdB) y/o toxina letal de Clostridium sordellii (TcsL) y/o toxina α de Clostridium novyi (Tcnα).
2.

Inositolfosfato para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT (= citotoxinas clostridiales grandes), concretamente por toxina A de Clostridium difficile (TcdA) y/o toxina B de Clostridium difficile (TcdB) y/o toxina letal de Clostridium sordellii (TcsL) y/o toxina α de Clostridium novyi (Tcnα).
3.

Inositolhexafosfato (IP6) para el uso de acuerdo con la reivindicación 2.
4.

Anticuerpo que interacciona con la región de proteína TcdB de AA 1653 a AA 1678 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
5.

Anticuerpo que interacciona con el motivo DXG en la posición aminoacídica AA 1665 de la proteína TcdB de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
6.

Anticuerpo que interacciona con el centro activo de la proteasa en la región de proteína TcdA de AA 1651 a AA 1675 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdA Nº P16154 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación LCT.
7.

Anticuerpo que interacciona con el motivo DXG en la posición aminoacídica AA 1662 de la proteína TcdA de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdA Nº P16154 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
8.

Anticuerpo que interacciona con el centro activo de la proteasa en la región de proteína TcsL de AA 1654 a AA 1679 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcsL Nº Q46342 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
9.

Anticuerpo que interacciona con el motivo DXG en la posición aminoacídica AA 1666 de la proteína TcsL de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcsL Nº Q46342 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
10.

Anticuerpo que interacciona con el centro activo de la proteasa en la región de proteína Tcnα de AA 1641 a AA 1665 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de Tcnα Nº Q46149 (SwissProt/TrEMBL) para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
11.

Anticuerpo que interacciona con la región de proteína TcdB de AA 1517 a AA 2142 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P 18177 (SwissProt/TrEMBL) o con regiones de proteína equivalentes u homólogas con respecto a esto de TcdA o TcsL o Tcnα para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
12.

Anticuerpo que interacciona con la región de proteína TcdB de AA 1517 a AA 1593 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL) o con regiones de proteína equivalentes u homólogas con respecto a esto de TcdA o TcsL o Tcnα para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
13.

Anticuerpo que interacciona con la región de proteína TcdB de AA 1918 a AA 2142 de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P 18177 (SwissProt/TrEMBL) o con regiones de proteína equivalentes u homólogas con respecto a esto de TcdA o TcsL o Tcnα para usar en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT.
14.

Fragmento de proteína de LCT (a) y/o (b) y/o (c) y/o (d) para usar como principio activo de vacuna en el tratamiento para evitar o mitigar una intoxicación por LCT (= citotoxinas clostridiales grandes), concretamente por toxina A de Clostridium difficile (TcdA) y/o toxina B de Clostridium difficile (TcdB) y/o toxina letal de Clostridium sordellii (TcsL) y/o toxina α de Clostridium novyi (Tcnα),

-

en el que

(a)

es aquel fragmento de proteína TcdB de la secuencia de aminoácidos de TcdB Nº P18177 (SwissProt/TrEMBL) que comprende al menos el motivo DXG en posición 1665 o la secuencia de aminoácidos de las posiciones aminoacídicas AA 1653 a AA 1678,

(b)

es aquel fragmento de proteína TcdA de la secuencia de aminoácidos de TcdA Nº P16154 (SwissProt/TrEMBL) que comprende al menos el motivo DXG en posición 1662 o la secuencia de aminoácidos de las posiciones aminoacídicas AA 1651 a AA 1675,

(c)

es aquel fragmento de proteína TcsL de la secuencia de aminoácidos de TcsL Nº Q46342

(SwissProt/TrEMBL) que comprende al menos el motivo DXG en posición 1666 o la secuencia de aminoácidos de las posiciones aminoacídicas AA 1654 a AA 1679 y

(d)

es aquel fragmento de proteína Tcnα de la secuencia de aminoácidos de Tcnα Nº Q46149 (SwissProt/TrEMBL) que comprende al menos la secuencia de aminoácidos de las posiciones aminoacídicas AA 1641 a AA 1665.
15. Autoproteasa de LCT para el uso como diana en un procedimiento de cribado para la identificación de sustancias que activan o inhiben la función proteasa autocatalítica de LCT.