JP2009545536A - Ｌｃｔ中毒に対する医薬品 - Google Patents

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Abstract

大クロストリジウム細胞毒（ＬＣＴｓ）、特にクロストリジウムディフィシレ細胞毒素Ａ及びＢ（ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ）による中毒の回避又は軽減のための医薬品は、作用物質として、ＬＣＴｓ（大クロストリジウム細胞毒）の自触性のプロテアーゼ活性の少なくとも１種のエフェクター、即ち阻害剤又は活性化剤を含有することにより特徴付けられる。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、大クロストリジウム細胞毒（Large Clostridial Cytotoxins、ＬＣＴｓ）、特にクロストリジウムディフィシレ細胞毒素Ａ及びＢ（ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ）、クロストリジウムソルデリィラテレス毒素（ＴｃｓＬ）及びクロストリジウムノヴィα毒素（Ｔｃｎα）による中毒の回避又は軽減のための医薬品に関する。
クロストリジウムディフィシレは、厳密的に嫌気的に成長する、胞子を形成する、グラム陽性の病原菌であり、これは最初に７０年代末に、抗生物質に関連した下痢及び偽膜性の大腸炎の病因論的な剤として同定された。９０年代からは、Ｃ．ディフィシレは、発展国の最も重要な病室病原菌として評価される。絶え間のない更に広がっている、広範囲スペクトル抗生物質の使用の結果として、Ｃ．ディフィシレ感染の発生は、特に入院して治療される患者では更に絶え間なく上昇する。
Ｃ．ディフィシレに関連した疾患のためには、Ｃ．ディフィシレにより産生されたエキソトキシン毒素Ａ（ＴｃｄＡ）及び毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）が関与している。様々なビルレンス及び毒素産生を有する様々な株が存在する。全ての株のおよそ４分の１は、毒素を産生しない。毒素を形成する株は、ほぼ常に両方の毒素を産生する。ＴｃｄＡは、腸細胞の細胞毒性損傷により、腸の粘膜の透過性を高め、これにより下痢を誘発するエンテロトキシンである。ＴｃｄＢは、電解質輸送を妨げ、かつ、腸の液体損失及び機能障害を担う細胞毒素である。細胞毒素ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢは、いわゆる大クロストリジウム細胞毒（ＬＣＴｓ）の群に属し、かつ、それぞれ３つの機能的ドメイン、即ちＣ末端ドメイン（宿主細胞膜への毒素の結合を担う）、疎水性中間ドメイン（細胞膜（ｍｉｔ）によりトランスロケーションプロセスを担わせる）、及び、Ｎ末端ドメイン（グリコシル転移酵素機能を有し、かつ、この分子の毒性活性を媒介する）を有するペプチド鎖からなる。
確かに、宿主細胞中への毒素の吸収プロセスは完全に明確になっていないもの、しかしながら、細胞毒が宿主細胞レセプターへの結合の後にエンドサイトーシスにより宿主細胞中へと達し、かつ、この毒性の発揮のためにはＮ末端の触媒性ドメインが分離され、かつ、宿主細胞のサイトゾル中へと運ばれるとの事実が存在する。ここで、触媒性ドメインはＲｈｏサブファミリー（Ｒｈｏ、Ｒａｃ及びＣｄｃ４２）のＧＴＰアーゼを特異的にグリコシル化し、これはこの側で多量のシグナルトランスダクションカスケードに関与し、かつ、このようにして、問題となるシグナルトランスダクションプロセスを遮断し、これにより細胞骨格の剥離、そして細胞死が最終的に引き起こされる。
技術水準においてこれまでには、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの毒素ペプチド鎖の触媒性Ｎ末端ドメイン及び他の「大クロストリジウム細胞毒」ＬＣＴの分離もが、細胞内プロテアーゼにより触媒作用されると仮定されてきた(Rupnik et al., 2005及びPfeiffer et al., 2003)。相応する示唆はしかしながら提供されることができていない。
本発明の根拠となる検査の経過において、意外にも、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＮの分解が、自己触媒性プロセスであり、これはイノシトールリン酸（ＩＰ）により開始され、かつ、従って、クロストリジウムディフィシレの毒素は、グリコシルトランスフェラーゼの触媒性機能の他に、自己分解又は自己触媒性分解のためのプロテアーゼの機能をも有することが見出された。
このプロテアーゼ機能は、アスパラギン酸−プロテアーゼとして同定された。プロテアーゼ機能の触媒中心として、タンパク質領域が同定され、これは、配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＴｃｄＢのアミノ酸位置ＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８のアミノ酸配列を含有する。アスパラギン酸−プロテアーゼを特徴付ける、モチーフＤＸＧ（Rao et al. 1998）は、アミノ酸位置１６６５にある。
イノシトールリン酸結合部位として、タンパク質領域が同定され、これは、配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＴｃｄＢタンパク質のアミノ酸位置ＡＳ１５１７〜ＡＳ２１４２のアミノ酸配列を含有する。このアミノ酸配列は、イノシン−５−一リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）モチーフを示し、これは２つの領域、即ちＡＳ１５１７〜ＡＳ１５９３及びＡＳ１９１８〜ＡＳ２１４２から構成され、これは３２５アミノ酸長さのタンパク質断片により配列ホモロジー無しに分離されている。
Ｃ．ディフィシレ感染を有する患者の治療のためには、可能である限りは、まず作動性の抗生物質を中止する。この更なる治療は、症候性にのみ行われる。より長期に持続的な又は重症な疾病経過では、並びに、作動性の抗生物質の中止が他の理由から可能でない場合には、治療のためにメトロンジアゾール又はバンコマイシンが投与される。
慣用の抗生物質両方の欠点は多岐にわたる。決定的なのは、この際特に、抗生物質を用いた他の感染状態の治療の結果作動された疾病が、抗生物質療法を用いては効率的に治癒されないことである。このための背景は、Ｃ．ディフィシレが健康なヒトの腸中で比較的稀にのみ存在し、かつ、通常の腸フローラに対して耐えることができないとの事実である。正常の腸フローラが抗生物質療法により破壊される場合には、Ｃ．ディフィシレは耐え、かつ腸に良好に生息することができる。Ｃ．ディフィシルに対して指向した抗生物質療法は、再度、腸フローラの分解を生じ、かつ、これにより、健康な腸フローラの発生をも因果関係上妨げる。これは、抗生物質療法の終了後に観察できる多数の緩解をも説明する。慣用の療法の数々の欠点は、最近の多耐性Ｃ．ディフィシル株の増加する発生である。これにより、Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾病のためのこれまでの単独の療法も役にたたなくなり、かつ、Ｃ．ディフィシル疾病の結果死亡例の数が上昇することに脅かされる。これに加えて、Ｃ．ディフィシル感染の治療のために必要とされる抗生物質が極めて高価であり、かつ、通常は、正当な場合にのみ貯蔵抗生物質（Reserveantibiotika）として使用されることになる。
従って、Ｃ．ディフィシル感染の特異的な克服（回避、除去、軽減）に適している医薬品の至急の要求が存在し、この際、クロストリジウム又は他の細菌での耐性の発達の危険は生じず、かつ、関係する患者の天然の細菌フローラ、特に腸フローラは損なわれない。
本発明の課題は、そのような医薬品の提供である。
前述の課題の解決は、導入部で挙げた種類の医薬品であって、作用物質として、ＬＣＴｓ（大クロストリジウム細胞毒）の自己触媒性のプロテアーゼ活性の、特にクロストリジウムディフィシル毒素Ａ（ＴｃｄＡ）及び／又はクロストリジウムディフィシル毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）及び／又はクロストリジウムソルデリィラテレス毒素（ＴｃｓＬ）及び／又はクロストリジウムノヴィα毒素（Ｔｃｎα）の、少なくとも１種のエフェクター、即ち、阻害剤又は活性化剤を含有することを特徴とする医薬品の提供にある。
ＬＣＴｓの自己触媒性のプロテアーゼ活性のエフェクターとして、以下においてはＬＣＴｓの自己触媒性プロテアーゼ活性の活性化剤もまた同様に阻害剤も指す。
作用物質又はエフェクターが阻害剤である場合には、その抗毒性作用は、この物質が無傷の毒素の、特にＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのプロテアーゼ活性を妨げ、かつ従って、グルコシルトランスフェラーゼ機能を有する細胞毒性的に有効な断片（ＴｃｄＢ及びＴｃｄＡの場合には、これは６３ｋＤａ断片である）の分離を阻止することに基づく。
適した阻害剤は、毒素のプロテアーゼ活性を阻害する化学物質である。
「化学物質」との概念は、前述の及び後述の実施形態において、無機化合物も有機化合物、イオン及びペプチド又はタンパク質をも指す。
有利な阻害剤は、プロテアーゼ活性を不可逆的に阻害する化学物質である。このための一例は、物質ＥＰＮＰ（１，２−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）−プロパン）である。この物質は、プロテアーゼの触媒中心中のアスパラギン酸残基と不可逆的に反応し、かつ、このようにしてこのタンパク質分解性作用を阻害する。更なるプロテアーゼ阻害剤は当業者に公知であるか又は当業者により公知の方法（Computer-Modelling, High-Throughput-Screening）を用いて容易に同定されることができる。例えば、「High-Troughput Screenings」の実施のためには、ＬＣＴｓのプロテアーゼ分解部位の配列のアミノ酸配列に相当するペプチドが合成されることができる。このペプチドの、例えば着色剤ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）とのカップリングにより、当業者に公知の方法を用いてセンサーが産生されることができる。「High-Troughput Screenings」の実施のためには、引き続きラベル化したセンサーに毒素及び候補物質を接触させる。センサーが分解すると、蛍光スペクトルの変更が生じる。この変更は当業者に慣用の方法（蛍光検出器）を用いて容易に認識することができる。蛍光スペクトルの変更が観察できないバッチは、可能性のあるプロテアーゼ阻害剤を含有する。
例示的に、ＬＣＴｓの自己触媒性プロテアーゼ活性の活性化に影響を及ぼす物質の同定のための更なる方法が記載される。このためには、ホロトキシン又は適した毒素断片も使用されることができ、これらは例えば着色剤とカップリングされていて、分解していない毒素又は毒素断片におけるこの蛍光は消滅している。毒素又は毒素断片の自己触媒性分解により、この消滅性の作用は終結される。蛍光スペクトル中の変更は、記載したとおり、容易に把握することができる。
特に適した阻害剤、即ち阻害性の機能を有するエフェクターは、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であり、これは、ＬＣＴｓの自己触媒性のプロテアーゼ活性を、プロテアーゼの活性中心と相互作用することにより、阻害する。
「相互作用する」との概念は、本願の文脈において、ＬＣＴｓと化学物質、特にタンパク質との全ての種類の相互作用を意味し、かつ、特に共有結合、例えばジスルフィド結合及び非共有結合、例えばファンデワワールス力、疎水性の又は静電性の相互作用並びに水素架橋−結合を含む。
有利には、この際、それぞれ、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１５００〜ＡＳ１８００、特にＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８、とりわけ１６６５位のＤＸＧモチーフのＴｃｄＢタンパク質領域又はＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのこれに等価の又はホモログのタンパク質領域と相互作用するタンパク質、特に抗体である。この等価の／ホモログのタンパク質領域とは、ＴｃｄＡの場合には、アミノ酸配列ＡＳ１６６２位にＤＸＧモチーフを有する、ＴｃｄＡアミノ酸配列Ｐ１６１５４（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６５１〜ＡＳ１６７５のアミノ酸配列断片、ＴｃｓＬの場合には、アミノ酸配列ＡＳ１６６６位にＤＸＧモチーフを有する、ＴｃｓＬアミノ酸配列Ｑ４６３４２（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６５４〜ＡＳ１６７９のアミノ酸配列断片、及びＴｃｎαの場合には、Ｔｃｎαアミノ酸配列Ｑ４６１４９（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６４１〜ＡＳ１６６５のアミノ酸配列断片である。
更なる適した阻害剤（阻害剤機能を有するエフェクター）は、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であり、これは、ＬＣＴｓの自己触媒性プロテアーゼ活性を、イノシトールリン酸と毒素との相互作用を阻害することにより妨げる。ＩＰ結合が妨げられることにより、毒素のタンパク質加水分解性分解は行われないままである。
有利には、この際、それぞれ、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１４００〜ＡＳ２３００、特にＡＳ１５１７〜ＡＳ２１４２、とりわけＡＳ１５１７〜ＡＳ１５９３又はＡＳ１９１８〜ＡＳ２１４２のＴｃｄＢタンパク質領域又は毒素ＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのこれに等価の又はホモログのタンパク質領域と相互作用するタンパク質、特に抗体である。
同じくらい良好に抗体又は他のタンパク質が産生されることができ、これは、イノシトールリン酸結合部位、特に前述のタンパク質領域と直接的に相互作用せず、隣接する領域に対して指向されていて、かつ、このＩＰ結合を立体的に障害し、従って毒素のタンパク質加水分解性による分解を抑制する。更に、抗体又は他のタンパク質が産生されることができ、これは、ＬＣＴｓのプロテアーゼ機能のＤＸＧモチーフと直接的に相互作用せず、隣接するタンパク質断片中での結合によりタンパク質加水分解性の分解を妨げる。
適した阻害剤（阻害剤機能を有するエフェクター）は更に、イノシトールリン酸（ＩＰ）、特にイノシトール六リン酸（ＩＰ６）の構造類似体を示し、これはＩＰ、特にＩＰ６の代わりに、ＬＣＴ、特にＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ、及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαの反応結合部位を有することができるが、ＩＰ又はＩＰ６のイニシエーター機能を有しない。これらの構造類似体は、従って、アゴニストＩＰ（特にＩＰ６）に対するアゴニストであり、かつ、ＬＣＴ、特にＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαのプロテアーゼ活性の拮抗的阻害をもたらす。適した構造類似体は、当業者に公知であるか、又は、公知の及び当業者に慣用の試験方法（このための例は、既に前もって記載されている）を用いて容易に同定されることができる。
適した阻害剤は、更に、イノシトールリン酸のための／イノシトールリン酸の抑制物質（同意語、イノシトールリン酸抑制物質又はイノシトールリン酸阻害剤）であり、即ち、イノシトールリン酸、特にイノシトール六リン酸に、ＬＣＴ、特にＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαのプロテアーゼ活性の開始のための能力が阻止されているように結合又は変更する阻害物質である。このような物質のための一例は、二価イオン、例えばＣａ2+であり、これはＩＰ６と不溶性錯体を生じる。類似の物質は、当業者に公知であるか、又は、公知の及び当業者に慣用の試験方法（このための例は、既に前もって記載されている）を用いて容易に同定されることができる。
更なる適した阻害剤（阻害剤機能を有するエフェクター）は、イノシトールリン酸の形成を患者（哺乳類、特にヒト）の腸内腔中で又は患者（哺乳類、特にヒト）の体細胞中で抑制するか、又は、既に存在するイノシトールリン酸を分解し、かつこのようにしてＬＣＴｓのタンパク質加水分解性開裂を細胞質中への侵入の際に妨げる化学物質である。このような物質のための有利な例は、リチウム、ＶＰＡ（バルプロ酸）又はＣＢＺ（カルバマゼピン）である。
適した活性化剤、即ち、活性化剤機能を有するエフェクターは、毒素のプロテアーゼ活性を活性化する化学物質である。活性化剤の抗毒性作用は、これは、この種の毒素が宿主細胞に結合し、この分離された断片が細胞内部（細胞質）中に達成することができる前に完全な毒素、特にＴｃｄＢ又はＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのプロテアーゼ活性を開始させることに基づく。この活性化剤は、従って、グリコシルトランスフェラーゼ機能を有する細胞毒性的に有効な断片の分離（ＴｃｄＢ及びＴｃｄＡの場合には、これは６３ｋＤａの断片である）を宿主細胞の外側で引き起こす。この細胞毒性的に有効な断片は、次いで、もはや細胞内部に達することができず、ここで、その細胞毒性作用を発揮する。
特に適した活性化剤（活性化剤機能を有するエフェクター）は、単離された（細胞質性のものとは異なり）イノシトールリン酸（ＩＰ）、有利にはイノシトール六リン酸（ＩＰ６）である。
この作用物質を有する医薬品は、患者の腸中に存在するＬＣＴ、特にＴｃｄＢ及び／又はＴｃｄＡ及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαが、この医薬的に供給されるＩＰを通じて既に腸中で分離されるという利点を有し、即ち、これが腸細胞又は他の体細胞に結合し、かつ毒的に作用することができる前である。
同様に、活性化剤（活性化剤機能を有するエフェクター）として、ＩＰ６に類似してＬＣＴ、特にＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαの自己触媒性のプロテアーゼ活性を促進する物質が良好に適している。
このような物質は当業者に公知であるか、又は、公知の方法を用いて容易に同定されることができる。このためには、前記で記載された「High-Troughput-Assays」の更に改変された変異体も適する。この際、毒素及び可能性のある活性化剤−物質は一緒に添加され、かつ、時間経過において蛍光スペクトルにおける変更について試験される。短時間に強い変更が生じるバッチは、適した活性化剤（活性化剤作用を有するエフェクター）を含有する。
ＬＣＴｓのプロテアーゼ機能の触媒中心は、本発明により、狙いを定めて投与される抗原（接種物質）として、毒素に対する免疫化を生じるためにも使用されることができる。本発明の主題は従って、ＬＣＴ（＝大クロストリジウム細胞毒）による中毒の回避又は軽減のための医薬品でもあり、これは、ワクチンとしての投与に適し、かつ、ＴｃｄＢ及び／又はＴｃｄＡ及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαの触媒中心のアミノ酸配列全て又はこの断片を抗原性作用物質として有することにより特徴付けられる。この抗原作用物質１種又は数種は、有利には、タンパク質断片の以下の群から選択される：
ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）の１６６５位のＤＸＧモチーフ、
ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）のアミノ酸位置ＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８、
ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）のアミノ酸位置ＡＳ１５００〜ＡＳ１８００、
ＴｃｄＡアミノ酸配列Ｐ１６１５４番（SwissProt/TrEMBL）の１６６２位のＤＸＧモチーフ、
ＴｃｄＡアミノ酸配列Ｐ１６１５４番（SwissProt/TrEMBL）のアミノ酸位置ＡＳ１６５１〜ＡＳ１６７５、
ＴｃｓＬアミノ酸配列Ｑ４６３４２番（SwissProt/TrEMBL）の１６６６位のＤＸＧモチーフ、
ＴｃｓＬアミノ酸配列Ｑ４６３４２番（SwissProt/TrEMBL）のアミノ酸位置ＡＳ１６５４〜ＡＳ１６７９、
Ｔｃｎαアミノ酸配列Ｑ４６１４９番（SwissProt/TrEMBL）のアミノ酸位置ＡＳ１６４１〜ＡＳ１６６５、
本発明は、以下において、実施例及び図に基づきより詳細に説明される。図は、以下のことを示す：
図１：
ａ：Ｃｙ3標識化したＴｃｄＢ10463及びブタ脾臓抽出物からの混合物（実施例１Ａ）、
ｂ：Ｃｙ3標識化したＴｃｄＢ10463及びタンパク質不含のブタ脾臓抽出物からの混合物（実施例１Ｂ）、
ｃ：Ｃｙ3標識化したＴｃｄＢ10463及びイノシトールリン酸からの混合物、
ｄ：標識化していないＴｃｄＢ10463及びイノシトールリン酸からの混合物、
ｅ：標識化していない（親和性クロマトグラフィにより精製した）ＴｃｄＢ10463及びイノシトールリン酸からの混合物；を用いて実施した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＴｃｄＢ10463（２７０ｋＤａ）ホロトキシンの、トランスロケーション／リガンドドメイン（２０７ｋＤａ）及びＮ末端の触媒性ドメイン（６３ｋＤａ）への開裂、
ａ−ｅはそれぞれ、室温で１時間のインキュベーションに関連する。
図２：ＴｃｄＢ10463及び／又はＩＰ６の混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＰＮＰでのこの毒素の前処理有り又は無しで；
レーン１：ＥＰＮＰを用いた前処理後、かつ、ＩＰ６無しのＴｃｄＢ10463、６３ｋＤａの範囲中にバンドを検出できない、
レーン２：ＥＰＮＰを用いた前処理後及びＩＰ６を用いたインキュベーション後の前処理後のＴｃｄＢ10463、この典型的な６３ｋＤａのバンドはわずかにのみ見える：
レーン３：ＥＰＮＰを用いた前処理無しそしてＩＰ６でのインキュベーション後のＴｃｄＢ10463、これは、６３ｋＤａの分子量範囲中で顕著に際だったバンドが認識可能である；
レーン４：ＥＰＮＰを用いた前処理無し、そしてＩＰ無しでのＴｃｄＢ10463、６３ｋＤａ中にバンドは検出可能でない。
図３：天然の（ａ）及びＥＰＮＰ改変した（ｂ）ＴｃｄＢタンパク質の典型的な消化後のＥＳＩ−ＬＣＭＳＭＳ−分析ＭＳ検査スキャン（大きい画像）及び断片化スペクトル（追加挿入部）。
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＴｃｄＢ10463（２７０ｋＤａ）ホロトキシンの、トランスロケーション／リガンドドメイン（２０７ｋＤａ）及びＮ末端の触媒性ドメイン（６３ｋＤａ）への開裂を示す図である。 図２は、ＥＰＮＰでのこの毒素の前処理有り又は無しでのＴｃｄＢ10463及び／又はＩＰ６の混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。 天然の（ａ）及びＥＰＮＰ改変した（ｂ）ＴｃｄＢタンパク質の典型的な消化後のＥＳＩ−ＬＣＭＳＭＳ−分析ＭＳ検査スキャン（大きい画像）及び断片化スペクトル（追加挿入部）。
以下の実施例において挙げられる方法の全ては当業者に公知であり、かつ、例えばAusubel et al. (2003)中に記載されている。
実施例１：ＴｃｄＢの自己触媒性プロテアーゼ活性の検出
参照株ＶＰＩ １０４６３のクロストリジウム細胞毒Ｂ（２７０ｋＤａ）、以下において短縮してＴｃｄＢ10463と呼ぶ、をまずＣｙ３で蛍光標識化した。このためには、２００〜４００μｇのＴｃｄＢ10463（tgcBIOMICS, Mainz, Germany）を着色剤Ｃｙ３で、この毒素をジメチルホルムアミド中に溶解した着色剤と一緒に１時間４℃でインキュベーションすることにより、製造者の指示（Amersham Biosciences）に応じて標識化した。結合していない着色剤を引き続き、サイズ排除クロマトグラフィ（Size Exclusion Chromatographie = SEC）を用いて取り除き、その際１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を展開緩衝液として使用した。着色剤とＣｙ３標識化したＴｃｄＢ10463のモル比は、０．８〜１．６であった。標識化したＴｃｄＢ10463をアリコート採取し、−８０℃で更なる使用まで貯蔵した。
（Ａ）技術水準において公知の「In-vitro-cleavage assay」（このために、特にRupnik et al (2005)を参照のこと、この刊行物の内容は参照により明らかに含まれる）の実施のために、室温で解凍した、Ｃｙ３標識化したＴｃｄＢ10463のアリコートを１時間室温でブタ脾臓細胞抽出物と共にインキュベーションした。
このブタ脾臓細胞抽出物を以下のとおり製造した。新規に獲得したブタ脾臓をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に取り込み、そして、個々の細胞懸濁液へと破砕した。低塩緩衝液（Low Salt Buffer）、即ち−１５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６−の添加により存在する赤血球を溶解し、従って除去した。引き続き、この脾臓細胞を２回１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄し、すぐさま−８０℃で冷凍した。所望される細胞抽出物のために、要求に応じてこの冷凍した脾臓細胞のアリコートをアリコート１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で解凍し、かつ、懸濁し、そしてこの懸濁液を引き続き超音波処理にかけた。この得られる溶解物を１時間２０００００×ｇ及び４℃で遠心分離し、そしてこの上清を定まった実験のために使用した。
このインキュベーション相の終わりに、このインキュベーションの間に生じるＴｃｄＢ断片を分離及び検出するためにＣｙ３標識化したＴｃｄＢ10463及びブタ脾臓細胞抽出物からの混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は図１ａ中に示されている。期待に応じてこの両方の公知の及び特徴的な６３ｋＤａの及び２０７ｋＤａの、クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂの、ここではＴｃｄＢ10463の断片を得た。
ネガティブコントロールとして、ＴｃｄＢ10463のアリコートを脾臓細胞抽出物の混合無しに使用した（参照図１"−"）。
（Ｂ）並行した試験において、（Ａ）中で記載された脾臓細胞抽出物を、Ｃｙ３標識化したＴｃｄＢ10463を用いたインキュベーションの前にタンパク質から精製した。この目的のために、（Ａ）に応じて製造されたブタ脾臓細胞抽出物のアリコートを超音波処理に引き続き、６個のフェノール−クロロホルム抽出にかけ、これは以下のように実施された。ブタ脾臓抽出物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５／２４／１）と容積比１：１で混合した。この混合物を１０分間１７００×ｇ及び４℃で遠心分離した。この水性の最上層を、新規な遠心分離容器中にデカンテーションし、そして遠心分離及びデカンテーションを更に５回繰り返した。
最後の残分からフェノールも取り除くために、引き続きクロロホルム抽出を実施した。このようにして獲得された、水性の及びタンパク質不含の、脾臓細胞抽出物の画分のアリコートを、容積比１：３０（３０）、１：１００（１００）又は１：３００（３００）で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で希釈し、そして（Ａ）で記載したとおり、室温で解凍された、Ｃｙ３標識化されたＴｃｄＢ10463のアリコートと混合し、そして、１時間室温でインキュベーションした。このインキュベーション相の終わりに、このインキュベーションの間に生じるＴｃｄＢ断片を分離し、かつ、検出するために、この混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をGel Doc EQ System Image Readers (BIO-RAD Muenchen, Deutschland)を用いて可視可能にし、かつ、図１ｂ中に示した。全ての試験バッチで、ＴｃｄＢ10463の、この両方の特徴的な６３ｋＤａ及び２０７ｋＤａの断片が得られた。これは、この脾臓細胞抽出物の水性の及びタンパク質不含の画分が、依然として、ＴｃｄＢ10463をこの両方の特徴的な部分断片に分解するための特性を有するか又は有したことを示す。
更なる並行した試験において、（Ａ）中に記載された脾臓細胞抽出物を、（Ａ）に記載されたようにＣｙ３標識化したＴｃｄＢ10463でインキュベーションし、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける前に、熱（９６℃、３０分間）処理した。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は同様に図１ｂ中に示されている。再度、ＴｃｄＢ10463のこの両方の特徴的な６３ｋＤａ及び２０７ｋＤａの断片が得られた。この結果は、熱誘導された脾臓細胞抽出物が更に、ＴｃｄＢ10463をその特徴的な部分断片に分解するための特性を有することを示す。
（Ｃ）更なる一試験系列において、Ｃｙ３標識化したＴｃｄＢ10463及び標識化していないＴｃｄＢ10463を単独で（即ち、脾臓細胞抽出物の混合無しに）様々なイノシトールリン酸で１時間室温でインキュベーションし、かつ、このそれぞれの混合物を引き続きＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。この検査の結果は表１及び図１ｃ−ｅ中に示される。これは、意外な核となる内容を提供し、つまり、ＴｃｄＢ10463単独のタンパク質加水分解性分解が、化学物質、例えばＩＰにより開始可能であり、従って、このタンパク質加水分解性分解が、毒素タンパク質の自己触媒性プロセスであるとの内容である。
表１からは、イノシトールリン酸の系列が、ＴｃｄＢ10463の自己触媒性分解を開始することができることが明らかである。イノシトール六リン酸（ＩＰ6）は、この試験されたイノシトールリン酸のもとでこの増強された分解活性を引き起こし、即ち、ＩＰ6は、最高のイニシエーター活性を有する（参照、図１ｃ−ｅ）。
構造類似体又は他のイノシトールリン酸類似物質は、これはイニシエーター活性を有するが、当業者に公知であるか又は公知の方法（例えばComputer-Modelling）を用いて容易に突き止められることができる。例えば、前述の「High-Troughput-Assays」も使用されることができる。
インキュベーション試験における、ＴｃｄＢ10463を用いたＩＰ6の異なる濃度の試験（参照、図１ｃ及び１ｄ）は、蛍光標識化した毒素Ｂの分解のために１０μＭのＩＰ濃度で十分であり（図１ｃ）、その一方で標識化していない（そして初めてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて亜鉛着色（Zinc Stain 及びDestain Kit, Biorad, Hercules, USA）により可視可能になった）毒素Ｂの分解のためには、更により低い１μＭまでの濃度で十分である（図１ｄ）。
類似の実験を、Ｃ．ソルデリィのＬＣＴｓ ＴｃｄＢ10463、ＴｃｓＬ及びＴｃｎαを用いても実施した。この際、イノシトールリン酸が全ての試験された、ＬＣＴファミリーの毒素の自己触媒性分解に対して活性性に作用することが示された。
（Ｄ）この試験において使用された、Ｃ．ディフィシルの培地上清から精製されたＴｃｄＢ10463がプロテアーゼで汚染されていることを排除するために、特別に精製されたＴｃｄＢ10463を用いた対照試験を実施した。ＴｃｄＢ10463のこの精製を、アフィニティクロマトグラフィを用いて、モノクローナル抗体２ＣＶ（DSM ACC 2321）を使用して以下のように実施した：ＴｃｃＢ特異的なモノクローナル抗体２ＣＶ（血清不含のハイブリドーマ培地のタンパク質Ｇ精製した上清）７ｍｇを、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ セファロースカラム（GE Healthcare, Freiburg, FRGで市販されている）にカップリングした。カップリング及び溶出を製造者指示に従い実施した。この完成したカラムを約４ｍｇのＴｃｄＢ10463で処理し、かつ、結合していないタンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；１２５ｍＭ Ｎａｃｌを用いた３回の洗浄により除去した。この溶出を一工程において、０．１Ｍ トリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ１を用いて実施した。この毒素は３回、４５０〜１８５μｇ／ｍｌの濃度を有する、４ｍｌの画分において溶出した。この溶出した毒素を、すぐさま１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて、１／１０の容積比で中和し、これは、この中和化溶液が、溶出の開始前に既にこの画分のための捕捉管中に装入されていることにより保証された。引き続き、汚染性タンパク質の不在をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続く亜鉛染色により検出した（参照図１ｅ"−"）。
この対照試験は、このようにして精製された標識化されていないＴｃｄＢ10463のＩＰ6でのインキュベーション、及び、引き続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びこの毒素又は毒素断片の亜鉛染色を用いた検出からなった。この試験の結果を図１ｅ中に示し、かつ、これは、この両方の既知の断片６３ｋＤａ及び２０７ｋＤａへのこのホロトキシンの完全な分離を示す。
実施例２：プロテアーゼ阻害剤でのインキュベーションによるＴｃｄＢ10463の不活性化
ＴｃＤＢ10463を実施例１（Ｄ）中に記載したとおりにアフィニティクロマトグラフィを用いて、モノクローナル抗体２ＣＶを使用して精製し、引き続き（ｉ）プロテアーゼ阻害剤ＥＰＮＰ（１０ｍＭ １，２−エポキシ−３−（ニトロフェノキシ）−プロパン）を用いて又は（ｉｉ）対照として緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて、６０分間室温で前処理した。
引き続きin-vitro-Cleavage-Assayを、実施例１（Ａ）と同様に実施した。この試験バッチはそれぞれ１０μｌの容積を含み、かつ、それぞれ５０〜１００ｎｇの標識化されていないＴｃｄＢ10463、１００μＭ ＩＰ６及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を含有した。この試験バッチをインキュベーション（１時間、室温で）に引き続きＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）にかけ、そして、毒素及び毒素断片を引き続き亜鉛染色を用いて可視可能にした。
図２はこの実験の結果を示す。ＩＰ６を用いたＴｃｄＢ10463単独のインキュベーション（レーン３）は、顕著に際だったバンドを分子量範囲６３ｋＤａに示す。この毒素が前もってＥＰＮＰで前処理されている場合には（レーン２）、この典型的な６３ｋＤａのバンドは弱くのみ現れる。この知見は、ＥＰＮＰの添加により、ＴｃｄＢ10463のタンパク質加水分解活性（プロテアーゼ活性）がほとんど完全に抑制されていることを示す。
ＥＰＮＰで前処理した毒素を、更に、Moos et al. (2000) に応じたＣＨＯ試験において、その残留活性（細胞毒性作用）について試験した。
このＣＨＯ試験を以下のように実施した。９６ウェルのマイクロプレート中にＣＨＯ細胞（＝Chinese-Hamster-Ovarialcells）を播種し（５０００細胞／ウェル）、そして１６時間標準的な条件（５％、ＣＯ2、３７℃、ＤＭＥＭ Ｆ１２、２ｍＭのＬ−グルタミンで補給されている、５％ＦＣＳ）下でインキュベーションした。引き続きこの毒素を、成長培地中への段階式の希釈後にこの細胞へと添加した。１０0〜１０-8の希釈段階を試験した。この細胞を３時間標準的な条件下でインキュベーションした。引き続き、この丸くなった細胞の割合を、ウェルの複数の代表的な断片の写真をとり、そして、伸びている並びに丸くなった細胞をカウントすることにより、顕微鏡で測定した（Moos et al., Meth Enzymol. 2000, 325: 114-125も参照のこと、この刊行物の内容についてはここで参照により明示的に組み込まれる）。
このＣＨＯ試験の結果は、ＥＰＮＰを用いて前処理したＴｃｄＢ10463が、未処理のＴｃｄＢ10463に比較して実質的により弱い細胞毒性活性を有することを示す（参照、表２）。ＥＰＮＰのこの阻害性の作用は、既に知られているとおり、触媒性のアスパラギン酸残基がＥＰＮＰと共有的な相互作用を生じ、これにより、プロテアーゼの不可逆的な不活性化が生じることに基づくので(Salto et al. 1994)、本試験の結果は、このＴｃｄＢ10463活性の抑制は、この毒素分子のプロテアーゼ活性の抑制に基づくことを示す。
ＥＰＮＰを用いるここに記載された実験は、ＴｃｄＢ10463及び他のＬＣＴｓの毒性作用が、適したプロテーゼ阻害剤を用いた毒素の前処理により顕著に減少されることを示す。
ＥＰＮＰは、ＬＣＴｓの共有的な阻害剤のためのモデル物質を示す。更なる比較可能な共有的に作用するか又は拮抗的に抑制する阻害剤は、当業者に公知であるか又は公知の方法を用いて、例えば既に記載された「High-Troughput-Assays」を用いて突き止められることができる。
実施例３：ＩＰ６を用いたプロテアーゼ活性の細胞外不活性化によるＴｃｄＢ10463の細胞毒性作用の不活性化
ＴｃｄＢ10463を、実施例１（Ｃ）中に記載されたのと同様に１００μＭのＩＰ６でインキュベーションした。このインキュベーションに引き続き、このプロテアーゼ活性により分解されるより小さいな６３ｋＤａの毒素タンパク質の断片を、このバッチをマイクロコン管（Millipore, 排除サイズ１００ｋＤ）を用いて精製することにより分離した。この６３ｋＤａのＴｃｄＢ10463の断片を、引き続き実施例２中に記載された、Moos et al. (2000)に応じたＣＨＯ試験において細胞の丸み付けについて試験した。この際、このタンパク質を未希釈で、及び、希釈段階において細胞へと添加した。
この試験において、ＴｃｄＢ10463のグルコシルトランスフェラーゼ機能を有する６３ｋＤａの断片は、所定の条件下で単独では細胞毒性作用を引き起こすことができないことが示された。希釈状態、更には未希釈状態において、細胞の丸み付け（Ｒｈｏサブファミリーの特定のＧＴＰアーゼのグルコシル化、ここから生じるシグナルトランスファクションプロセスの遮断及びここから生じる細胞骨格の解離の結果）が観察されることができなかった。自己触媒を用いて産生された毒素断片が細胞外で不活性であるとの結果は、Pfeifer et al. (2003)及びRupnik et al (2005)による結果を確認し、これらは、分離された、ＴｃｄＢ10463の触媒活性ドメインが、真核細胞中では取り込まれず、従って細胞培地中で不活性であることを示す。（しかしながらこの論文においてＬＣＴｓの自己触媒活性は明白に排除される（Pfeiffer et al., 2003）又はＬＣＴｓの活性化のための細胞内プロテアーゼが考慮される（Rupnik et al., 2005）一方で、本発明との関連において得られる比較結果は、最初に、Ｎ末端の毒素断片が自己触媒性に分解されることを示す）。
ＴｃｄＢ10463及び他のＬＣＴｓの細胞毒性作用は、従って、この毒素のタンパク質加水分解性分解が既に、細胞中への毒素の侵入の前に誘導されることにより抑制されることができる。
実施例４：ＴｃｄＢのプロテアーゼの活性中心の検出
ＥＰＮＰ不活性化した（参照、実施例２）及び未処理のＴｃｄＢ10463を、ＳＤＳゲルを用いて分離し、かつ、亜鉛染色を用いて示した。引き続き、このタンパク質に相当するバンドを切断し、小さな破片に分解した。これらから着色剤を取り除き、乾燥させ、引き続き２ｍＭのＤＴＴ中で還元し、２０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。このゲル断片の洗浄及び新規の乾燥後に、この断片を、トリプシンを用いて一晩３７℃で消化させた。この生じるペプチドを引き続きＨＰＬＣ（NanoAcquity Ultraperformance Liquid Chromatography, Waters, Milford, USA）を介して分離した。このために２μｌの試料を２％の移動相Ｂ緩衝液（アセトニトリル中０．１％ギ酸）中の逆相カラム（NanoEase BEH C18（７５μｍ×１０ｃｍ）、Waters, Milford, USA）に設けた。移動相Ａ緩衝液は、Ｈ2Ｏ中に０．１％ギ酸を含有した。引き続きこの断片を３〜４０％の移動相Ｂ緩衝液（３００ｎｌ／分で９０分間）の勾配によりカラムを通じて溶出した。
この溶出した断片を引き続き質量分析により検査した。このために、Waters社のQ-Tof Premier質量分析計を使用した。この装置を［Ｇｌｕ１］−フィブリノゲンペプチド溶液［５００ｆｍｏｌ／μｌ、３００ｎｌ／分で］を用いてNanoLockSpray-供給源（Waters）の対照スプレーヤーを介して校正した。この結果の分析のためにMassLnyx4.1 Software（Waters）を使用した。
この結果の分析は、未処理のＴｃｄＢがＥＰＮＰ処理した毒素とは、典型的な断片においてのみ相違することを示す（図３）。この断片は、アスパラギン酸−プロテアーゼに特徴的なＤＸＧモチーフを１６６５位に有する、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７（SwissProt/TrEMBL）に応じたＴｃｄＢタンパク質のアミノ酸ＡＳ１６５３〜１６７８を含有する。
ＴｃｄＢの触媒中心のアミノ酸配列ＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８と相応する触媒中心及び毒素ＴｃｄＡ、ＴｃｓＬ及びＴｃｎαのタンパク質領域の比較は、この領域が高度に保存されていることを示す（参照、図３）。
従って、当業者は公知の方法を用いて、この毒素のタンパク質ドメインの活性中心と特異的に相互作用し、従って、例えばＬＣＴｓの自己触媒性分解を妨げる抗体又はタンパク質を産生することができる。同様に良好に、直接的にこの活性中心を遮断しないが、隣接した領域に対して指向していて、従って、この毒素の自己タンパク質加水分解性分解を立体的に障害する抗体又はタンパク質も産生されることができる。
実施例５：不活性化したＴｃｄＢを用いた免疫化の結果の、抗体によるＴｃｄＢ作用の阻害
ＴｃｄＢの細胞毒性効果に対する保護を誘導するために、以下のＴｃｄＢ調製物を製造し、かつ、免疫化のためにウサギにおいて使用した。
調製物Ａ：ＴｃｄＢ、ホルマリンで不活性化、
調製物Ｂ：ＴｃｄＢ、ＥＰＮＰで不活性化（参照、実施例２）、
調製物Ｃ：ＴｃｄＢ断片ＡＳ１６０１〜１７１６（ＤＳＧモチーフ）、
調製物Ｄ：ＴｃｄＢ断片ＡＳ１５０８〜１６０１（イノシン結合性モチーフの部分）、
調製物Ｅ：ＴｃｄＢ断片ＡＳ１５０８〜２１５７
（ＤＳＧモチーフ及び全体のイノシン結合性モチーフ）。
ＴｃｄＢ断片を当業者に公知の方法を用いて、プラスミドｐＥＴ１９ （Novagen）中に発現し、付属のＨｉｓタグを介して精製した。引き続きこのＨｉｓタグをエンテロキナーゼ消化を用いて分解した。このタンパク質の純度をＳＤＳ−ゲル中で試験した（データ示さず）。
免疫化のためにウサギを抗原でまず基礎免疫化し、引き続き複数の追加免疫にかけた。このウサギの血液から最終的にポリクローナル抗血清が得られた。
このポリクローナル抗血清の中和性作用を試験するために、まずＴｃｄＢをポリクローナル抗血清で前処理し（希釈男系１：１００）、そして１時間室温でインキュベーションした。引き続きこの抗血清の中和性の作用を実施例２において記載したのと同様にＣＨＯ試験に基づき試験した。この血清の中和性作用の程度は、この細胞がＴｃｄＢの細胞毒性作用からどれだけ長く保護されるかである。
調製物Ａで免疫化したウサギは、少ない抗体価のみを有し（参照、表４）、更にこのウサギの血清は中和性に作用しない。この知見は、ホルマリン処理したＬＣＴｓでの免疫化検査の当業者に公知の結果に相当する。
調製物Ｂで免疫化された動物は、顕著な力価（１：１５００まで希釈可能）を発達したが、但し、この抗血清も、ＣＨＯ試験における中和性作用を有しない（表４）。
調製物Ｃ〜Ｅを用いて免疫化したウサギは、同様に、抗体価を有し、更に、ＣＨＯ試験においてそのポリクローナル血清は、顕著に中和性の作用を示した（表４）。調製物Ｅでの免疫化により産生されたポリクローナル血清はこの際、最良の中和性特性を示した。
調製物Ｃ及びＤを用いた別個の免疫化により製造された血清は、これに対して、より少ない中和性作用を示した。
イノシトール結合性の領域の一部を含有する断片Ｄを用いた免疫化の成功は、ＬＣＴｓのこの断片が、毒性の活性化のために重要な領域であることを確認する。この毒素断片中のＩＰ６の結合は、自己触媒性プロテアーゼ活性の活性化を生じ、従って、ＬＣＴｓの活性化をも生じる。
ＤＳＧモチーフ周辺のこの領域の中和性作用は、このプロテアーゼの活性中心に対して指向されている抗体が、このタンパク質加水分解性活性を阻害することができることを確認する。このような抗体を用いて、従って、ｉｎ ｖｉｖｏでも、ＬＣＴｓの毒性効果からの保護が達成されることができる。
調製物Ｅを用いた免疫化では、この成功した調製物Ｃ及びＤの両方の断片のみが一緒に使用されることができる。この両方のＴｃｄＢ断片を用いた免疫化の成功は、動物において、プロテアーゼの活性中心に対して指向されている抗体も、また同様にイノシトール−リン酸−結合性領域に結合する抗体も誘発することに基づく。この抗血清の作用は、即ち、狙いを定めて毒素の活性化を抑制する特異的な抗体を初めて誘発することができたことに基づく。
目標細胞中のＬＣＴｓの天然の取り込みのためには、毒素の自己触媒性分解が重要であり、というのは、このようにしてのみ、Ｎ末端、本来の毒素の活性を媒介する断片が目標細胞中に放出されるからである。アスパラギン酸−プロテアーゼ及びイノシトール−リン酸結合部位のＤＳＧモチーフの周囲中の特異的抗体の結合は、この毒素の自己触媒性分解を抑制する。患者においては、従って、ＬＣＴｓの自己触媒性の分解のために必要である、毒素−断片の使用により、ＬＣＴｓに対する有効な免疫化が達成されることができる。
文献：
Figure 2009545536
表１：定義されたイノシトールリン酸の添加下でのＴｃｄＢ10463の自己触媒性分解。
Figure 2009545536
表２：ＥＰＮＰ前処理有り又は無しでのＴｃｄＢ10463を用いたインキュベーション後のＣＨＯ細胞の細胞の丸み付け（％で）。
Figure 2009545536
表３：ＴｃｄＢのプロテアーゼ機能の触媒中心のアミノ酸配列ＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８と、毒素ＴｃｄＡ、ＴｃｓＬ及びＴｃｎαの相応する触媒中心及びタンパク質領域との比較。
Figure 2009545536
表４：ポリクローナル抗血清で前処理されているＴｃｄＢを用いたインキュベーション後のＣＨＯ細胞の細胞丸み付け（時間で）の開始。
Figure 2009545536

Claims (20)

  1. 作用物質として、ＬＣＴ（大クロストリジウム細胞毒）のプロテアーゼ活性の、少なくとも１種のエフェクター、即ち阻害剤又は活性化剤を含有することを特徴とする、ＬＣＴ（＝大クロストリジウム細胞毒）による中毒を回避又は軽減するための医薬品。
  2. 作用物質が、クロストリジウムディフィシレ毒素Ａ（ＴｃｄＡ）及び／又はクロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）及び／又はクロストリジウムソルデリィラテレス毒素（ＴｃｓＬ）及び／又はクロストリジウムノヴィα−毒素（Ｔｃｎα）のプロテアーゼ活性のエフェクター、即ち阻害剤又は活性化剤であることを特徴とする、請求項１記載の医薬品。
  3. 阻害剤が、１，２−エポキシ−３−（ｐ−ニトロフェノキシ）−プロパン（ＥＰＮＰ）であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  4. 活性化剤が、イノシトールリン酸、有利にはイノシトール六リン酸（ＩＰ６）であることを特徴とする、請求項３記載の医薬品。
  5. エフェクターが、イノシトールリン酸、有利にはイノシトール六リン酸（ＩＰ６）の、拮抗的に阻害する構造類似体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  6. 活性化剤が、ＩＰ６に類似して、ＬＣＴｓ、特にＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ及び／又はＴｃｓＬ及び／又はＴｃｎαの（自触性の）プロテアーゼ活性を促進する物質であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  7. エフェクターが、哺乳類、特にヒトの腸内腔中のイノシトールリン酸濃度を減少するために適している化学物質であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  8. エフェクターが、哺乳類細胞、特にヒトの細胞中のイノシトールリン酸濃度を減少するために適している化学物質であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  9. 阻害剤が、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１５００〜ＡＳ１８００のＴｃｄＢタンパク質領域中のプロテアーゼ活性中心と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  10. 阻害剤が、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８のＴｃｄＢタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  11. 阻害剤が、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＴｃｄＢタンパク質のＡＳ１６６５のアミノ酸位置にあるＤＸＧモチーフと相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  12. 阻害剤が、ＴｃｄＡアミノ酸配列Ｐ１６１５４番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６５１〜ＡＳ１６７５のＴｃｄＡタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  13. 阻害剤が、ＴｃｄＡアミノ酸配列Ｐ１６１５４番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＴｃｄＡタンパク質のＡＳ１６６２のアミノ酸位置にあるＤＸＧモチーフと相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  14. 阻害剤が、ＴｃｓＬアミノ酸配列Ｑ４６３４２番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６５４〜ＡＳ１６７９のＴｃｓＬタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  15. 阻害剤が、ＴｃｓＬアミノ酸配列Ｑ４６３４２番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＴｃｓＬタンパク質のＡＳ１６６６のアミノ酸位置にあるＤＸＧモチーフと相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  16. 阻害剤が、Ｔｃｎαアミノ酸配列Ｑ４６１４９（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１６４１〜ＡＳ１６６５のＴｃｎαタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  17. 阻害剤が、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１４００〜ＡＳ２３００のＴｃｄＢタンパク質領域と又はＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのこの等価の又はホモログのタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  18. 阻害剤が、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１５１７〜ＡＳ２１４２のＴｃｄＢタンパク質領域と又はＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのこの等価の又はホモログのタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  19. 阻害剤が、ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）に応じたＡＳ１５１７〜１５９３又はＡＳ１９１８〜ＡＳ２１４２のＴｃｄＢタンパク質領域と又はＴｃｄＡ又はＴｃｓＬ又はＴｃｎαのこの等価の又はホモログのタンパク質領域と相互作用する、化学物質、特にタンパク質、とりわけ抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬品。
  20. （１）ワクチンとしての投与のために適している、及び、
    （２）抗原性作用物質として
    （ａ）ＴｃｄＢアミノ酸配列Ｐ１８１７７番（SwissProt/TrEMBL）のＴｃｄＢタンパク質断片を含有し、これが少なくとも位置１６６５のＤＸＧモチーフ、有利にはアミノ酸位置ＡＳ１６５３〜ＡＳ１６７８のアミノ酸配列、特にアミノ酸位置ＡＳ１５００〜ＡＳ１８００のアミノ酸配列を含む、
    及び／又は（ｂ）ＴｃｄＡアミノ酸Ｐ１６１５４番（SwissProt/TrEMBL）のＴｃｄＡタンパク質断片を含有し、これが少なくとも位置１６６２のＤＸＧモチーフ、有利にはアミノ酸位置ＡＳ１６５１〜ＡＳ１６７５のアミノ酸配列を含む、
    及び／又は（ｃ）ＴｃｓＬアミノ酸配列Ｑ４６３４２番（SwissProt/TrEMBL）のＴｃｓＬタンパク質断片を含有し、これが少なくとも位置１６６６のＤＸＧモチーフ、有利にはアミノ酸位置ＡＳ１６５４〜ＡＳ１６７９のアミノ酸配列を含む、
    及び／又は（ｄ）Ｔｃｎαアミノ酸配列Ｑ４６１４９番（SwissProt/TrEMBL）のＴｃｎαタンパク質断片を含有し、これが少なくともアミノ酸位置ＡＳ１６４１〜ＡＳ１６６５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、
    ＬＣＴ（＝大クロストリジウム細胞毒）による中毒の回避又は軽減のための医薬品。
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