KR20100028558A

KR20100028558A - 녹농균 외막 단백질 ｐａ4710

Info

Publication number: KR20100028558A
Application number: KR1020097026143A
Authority: KR
Inventors: 지로 타나카; 히로시 나가소; 마사시 쿠마가이; 케이코 오츠카; 히로토모 아카바네; 타카히사 스즈키
Original assignee: 메이지 세이카 가부시키가이샤
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2010-03-12
Also published as: AU2008272087A1; CA2691626A1; JPWO2009005040A1; CN101878302A; SG182975A1; WO2009005040A1; US20100330100A1; AU2008272087B2; EP2175017A1; EP2175017A4

Abstract

녹농균 감염을 실질적으로 예방 또는 치료하는 능력을 갖고, 녹농균 감염 환자 유래의 치료분리주의 다양성에 대응할 수 있는 백신 조성물로 사용할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원, 또 당해 항원에 대한 항체를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 녹농균 관련 질환의 진단, 예방, 또는 치료에 사용되는 단백질 항원, 펩티드 항원 및 이들에 대한 항체를 제공한다. 본 발명에 의하면, 녹농균과 관련되는 질환의 진단, 예방, 또는 치료에 사용될 수 있다. 녹농균의 외막단백질 PA4710 유래의 단백질 또는 펩티드 및 이들에 대한 항체가 제공된다.

녹농균, PA4710, 다제 내성 녹농균 감염

Description

녹농균 외막 단백질 ＰＡ4710{Pseudomonas Aeruginosa Outer Membrane Protein PA4710}

본 발명은 녹농균 외막 단백질 PA4710 유래의 단백질 항원 또는 펩티드 항원, 및 이 항원에 대한 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 항원을 포함하여 이루어지는 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 항체를 포함하여 이루어지는 의약조성물, 녹농균 감염증 진단제, 녹농균 감염증 치료제, 녹농균의 검출 키트(kit)에 관한 것이다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 토양, 수중 등 자연환경 중에 널리 일반적으로 분포되어 있는 그램 음성 간균이지만, 치료 저항성이 심한 치사성(致死性) 감염증을 일으킨다. 그 주된 표적은, 열상, 장기이식 또는 암환자를 포함한, 일반적으로 감염되기 쉬운 숙주(compromised host)라 불리는 생체 방어기능이 쇠약한 감염성 환자로서, 녹농균은 병원내감염의 주요한 원인균이다. 그리고 본 균에 의한 폐감염증은 낭포성 섬유증 환자에게는 치사성이다. 이들 환자에 대해, 주로 항 녹농균 활성을 가지는 항균제가 투여되지만, 녹농균의 약제 내성에 의해 충분히 치료 효과가 얻어지지 않는 증상례가 많다. 또, 녹농균에 대한 백신이나 항체에 대해서도 오래 전부터 검토되고 있으나, 직접 비활성화한 균을 이용하는 방법에서는, 녹 농균의 혈청형별로 여러 가지 백신이나 항체를 조제해야만 하는 등의 결점이 있었다.

이와 같은 상황에서, 녹농균 사이에서 공통인 아미노산 서열을 가지는 녹농균 유래의 단백질을 이용한 능동면역 또는 수동면역에 의한 녹농균 감염증의 예방 또는 치료가 기대되고 있다. 녹농균 유래의 단백질을 백신에 응용하는 예로는, 외막 단백질 OprF 및 OprI의 일부분을 융합시킨 조환 단백질(일본 특개평 8-245699호 공보: 문헌 1), typeIV pilin 단백질(WO2004/099250호 공보: 문헌 2) 등이 알려져 있다.

또, 녹농균 유래의 단백질을 표적으로 하는 항체 의약에 관해서는 항 typeIV pilin 항체(문헌 2), 항 PA1706(또는 PcrV) 항체(US6309651호 공보: 문헌 3, US6827935호 공보: 문헌 4), 항 PA5158 항체(WO2007/049770호 공보 문헌 5) 등이 보고되어 있다.

그러나, 다양한 혈청형을 나타내는 녹농균의 임상분리주가 공통으로 보유하는 균체 유래의 단백질은, 「녹농균 공통항원」으로서 녹농균 감염증의 예방, 진단 또는 치료에 응용할 수 있기 때문에, 항상 요구되고 있다.

그런데, PA4710(또는 PhuR) 유전자(Genebank accession No.AF055999)에 코드되는 PA4710(별명 PhuR) 단백질은, TonB 의존성 수용체 패밀리에 속하는 헴포획 시스템을 구성하는 외막 헤민 수용체 단백질이다(Microbiology, 2000, 146, 185-198: 문헌 6, Environmental Microbiology, 2003, 5, 1350-1369: 문헌 7). TonB 의존성 수용체는, 22개의 외막 관통 β사슬로 구성되는 외막 β 배럴(barrel)과 프라그· 도메인으로 이루어진다. 프라그·도메인은 페리프라즘 측으로부터 배럴 내로 들어가, 마개를 이루는 형태로 된다. 리간드가 결합하면 TonB 의존성 수용체는 형태(conformation)의 변화를 일으켜, 리간드를 페리프라즘에 포착한다. TonB 의존성 수용체에 의한 리간드의 포착에는 에너지를 요한다. 이 에너지는, 내막에 존재하는 3개의 단백질 TonB-ExbB-ExbD로 이루어진 에너지 변환 복합체로부터, TonB 단백질과 TonB 의존성 수용체의 아미노 말단으로 뻗은 TonB 박스와의 상호작용을 거쳐 공급된다. PA4710 단백질의 부분 서열이 백신의 성분으로서, 또 이로부터 만들어지는 항체 조성물을 감염증 치료약 또는 진단약으로 이용될 수 있는가의 개시는, 유일하게 D-Squared Biotechnologies, Inc.가, 실시예를 수반하지 않고, 폭넓은 균종(菌腫) 간의 철포획계 단백질의 상동성(相同性) 만으로부터 기재되어 있을 뿐이다(WO2002/083843호 공보: 문헌 8, WO2003/006672호 공보: 문헌 9).

본 발명은 녹농균 감염을 실질적으로 예방 또는 치료하는 능력을 갖고, 녹농균 감염환자 유래의 임상분리주의 다양성에 대응할 수 있는 백신 조성물로 사용할 수 있는 단백질 항원, 펩티드 항원, 또는 이 항원에 대한 항체를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 녹농균의 외막 단백질로부터 신규하고 유용한 「녹농균 공통항원」을 탐색할 것을 시도하여, 여러 가지 검토한 결과, 녹농균의 외막에 있는 PA4710(별명 PhuR) 단백질을 코드하는 유전자가, 인간 혈청의 존재 여하에 관계없이, 정상적으로 발현되어 있는 것을 GeneChip 해석으로부터 알아내었다(실시예 1). 또, 67주의 녹농균 임상분리주에 대해 유전자 해석을 실시함으로써, PA4710 단백질에서의 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역을 동정함과 더불어, 이 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역 중에 PA4710 단백질의 11개소에 걸치는 세포 외 영역을 특정하는 것에 성공하였다(실시예 2, 9).

그리고, 본 발명자들은 PA4710 조환 단백질 또는 이 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역 내에 있는 세포 외 영역의 펩티드를 면역해서 얻은 항 혈청 또는 항체가, PA4710 단백질에 결합하고, 녹농균의 균체 표면에도 결합하는 것을 알아내었다(실시예 7, 8). 또, 당해 항체가 녹농균 감염 모델 마우스에서 높은 감염방어효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 10 ~ 12).

즉, 본 발명자들은 PA4710 단백질의 전체 길이 영역에 걸쳐 상세한 해석을 실시함으로써, PA4710 단백질의 면역 우성 영역을 좁히는 것에 성공함과 더불어, 그 영역에 대한 항체가 녹농균 감염 모델 마우스에서 높은 감염방어효과를 나타내는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은, 보다 상세하게는 이하의 발명에 관한 것이다.

< 1 > 이하의 (i), (ii), (iii), 및 (iv)로부터 선택되는 단백질:

(i) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질;

(ii) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질;

(iii) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한(stringent) 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질; 및

(iv) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질.

< 2 > 서열번호:3으로 나타나는 아미노산 서열에서의, 181위에서 198위, 204위에서 257위, 259위에서 311위, 313위에서 319위, 321위에서 436위, 440위에서 491위, 493위에서 600위, 602위에서 764위로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이고, 또한, 녹농균의 표면으로부터 노출되어 있는 펩티드 영역을 코드하는 펩티드.

< 3 > < 2 >에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 4 > 서열번호:5 내지 15 중 어느 것으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 5 > < 4 >에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 6 > < 2 >에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 7 > < 3 >에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 8 > < 4 >에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 9 > < 5 >에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.

< 10 > 녹농균 유래의 PA4710 단백질 또는 그 일부에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 11 > 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 일부가, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 세포 표면 루프 함유 영역인, < 10 >에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 12 > < 1 >에 기재된 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 13 > < 2 >에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 14 > < 3 >에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 15 > < 4 >에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 16 > < 5 >에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 17 > < 6 >에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 18 > 서열번호:5 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하고, 서열번호:5 내지 15의 아미노산 서열에 있어서 그 이외의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 19 > 녹농균 표면에 결합하는 < 10 >에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 20 > 항체가 모노크로널 항체인 < 10 > ~ < 19 >의 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 21 > 녹농균이 감염되어 있는 환자에서 항균 활성을 가지는 < 10 >에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 22 > 환자가 호중구가 감소되어 있는 상태에 있는 환자인, < 21 >에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 23 > 녹농균이, 다제(多劑) 내성 녹농균인, < 21 >에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 24 > 항체가 모노크로널 항체인, < 21 > ~ < 23 >의 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 25 > FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 어느 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 26 > FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 어느 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노크로널 항체의 항원과 동일한 항원과 반응하는 모노크로널 항체 또는 그의 기능적 단편.

< 27 > < 20 >에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.

< 28 > < 24 >에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.

< 29 > FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마.

< 30 > 녹농균 유래의 PA4710 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하여 이루어지는 항원 조성물.

< 31 > < 1 >에 기재된 단백질 또는 < 2 > ~ < 9 >의 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하여 이루어지는 항원 조성물.

< 32 > < 3 0 > 또는 < 31 >에 기재된 항원 조성물과, 경우에 따라서는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 애쥬번트(adjuvant)를 포함하여 이루어지는, 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.

< 33 > 녹농균 관련 질환이, 녹농균 감염에 기인하는 전신감염 질환인, < 32 >에 기재된 백신 조성물.

< 34 > 녹농균 감염이, 다제 내성 녹농균 감염인, < 33 >에 기재된 백신 조성물.

< 35 > < 10 > ~ < 19 >, < 21 > ~ < 23 >, < 25 >, < 26 >의 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편과, 경우에 따라서는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하여 이루어지는, 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

< 36 > 녹농균 관련 질환이, 녹농균 감염에 기인하는 전신감염 질환인, < 35 >에 기재된 의약 조성물.

< 37 > 녹농균 감염이, 다제 내성 녹농균 감염인, < 36 >에 기재된 의약 조성물.

< 38 > < 10 > ~ < 19 >, < 25 >, < 26 >의 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하여 이루어지는, 녹농균 감염증 진단제.

< 39 > < 10 > ~ < 19 >, < 25 >, < 26 >의 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하여 이루어지는, 녹농균의 검출 키트.

발명을 실시하기 위한 최상의 형태

[PA4710 단백질]

PA4710 단백질은 녹농균 유래의 외막 PA4710 단백질이다. 당해 단백질의 아미노산 서열은, 서열번호:3에 기재되고, 당해 단백질을 코드하는 폴리뉴크레오티드의 염기서열은, 서열번호:1에 기재된다.

여기서, 대장균 FhuA 단백질의 구조 해석 정보(Cell, 1998, 95, 771-778, Science, 1998, 282, 2215-2220), 대장균 FepA 단백질의 구조 해석 정보(Nat. Struct. Biol., 1999, 6, 56-63), 대장균 FecA 단백질의 구조 해석 정보(Science, 2002, 295, 1715-1719, J. Mol. Biol., 2003, 332, 353-368), 녹농균 FpvA 단백질의 구조 해석 정보(J. Mol. Biol., 2005, 347, 121-134) 및 PA4710 단백질의 2차 구조 예측 정보로부터 얻어지는 정보에 의해, 서열번호:1로 나타나는 염기 서열 중, 아미노산 코드 영역 2295 염기 중의 541번째부터 2295번째의 염기 서열(서열번호: 2)은, PA4710 단백질의 외막 β 배럴 단백질 부분을 코드한다고 추측되었다. 이 영역은 외막을 관통하는 22개의 역평행(逆平行) β 사슬로 이루어지고, 각 사슬을 잇는 21개의 루프 중, 11개의 루프가 세포 표면에 표출한다고 추측되었다. 이하, 이 영역을 「세포 표면 루프 함유 영역」이라고 칭한다.

PA4710 단백질의 세포 표면 루프 함유 영역은, 이하의 (i), (ii), (iii), 및 (iv)로부터 선택되는 단백질인:

(iii) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질; 및

본 명세서에서, 「아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열」이란, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 주지의 방법으로, 또는 천연으로 생길 수 있는 정도의 복수 개의 아미노산의 치환 등에 의해 개변이 이루어진 것을 의미한다. 아미노산의 개변의 개수는, 바람직하기는 1 ~ 50개, 보다 바람직하기는 1 ~ 30개, 보다 더 바람직하기는 1 ~ 10개, 더욱 더 바람직하기는 1 ~ 5개, 가장 바람직하기는 1 ~ 2개이다.

PA4710 단백질의 개변 아미노산 서열의 예는, 바람직하기는, 그 아미노산이, 1 또는 복수 개(바람직하기는, 1 내지 수 개(바람직하기는 1, 2, 3, 또는 4개)의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열일 수가 있다.

본 명세서에서, 「보존적 치환」이란, 1 또는 복수 개의 아미노산 잔기를, 별개의 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환한 것을 의미한다. 예컨대, 어떤 소수성(疎水性) 잔기를 별개의 소수성 잔기로 치환하는 경우, 어떤 극성 잔기를 같은 전하를 가지는 별개의 극성 잔기로 치환하는 경우 등을 들 수가 있다. 이와 같은 치환을 실행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은, 아미노산마다 당해 기술분야에서 공지이다. 구체적인 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 발린, 이소로이신, 로이신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 가지는(염기성) 아미노산으로는, 아르긴, 히스티신, 리신 등을 들 수 있다. 또, 부전하(負電荷)를 가지는 (산성) 아미노산으로는, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 「엄격한 조건」이란, 혼성화 후 막의 세정 조작을, 고온 하 저염농도 용액 중에서 실행하는 것을 의미하는바, 예컨대, 0.5 × SSC 농도(1 × SSC: 15mM 구연산 3 나트륨, 150mM 염화나트륨), 60℃, 15분간의 세정조건, 바람직하기는 0.5 × SSC 농도, 0.1% SDS 용액 중에서 60℃, 15분간의 세정조건을 의미한다.

혼성화(hybridization)는 공지의 방법에 따라 실행할 수 있다. 또, 시판의 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

본 명세서에서, 염기 서열 또는 아미노산 서열에 대한 「동일성」이라 함은, 비교되는 서열 사이에서, 각각의 서열을 구성하는 염기 또는 아미노산 잔기가 일치하는 정도의 의미로 쓰인다. 본 명세서에 나타낸 「동일성」의 수치는 모두, 당업자에게 공지된 상동성(相同性) 검색 프로그램을 이용해서 산출되는 수치린 것이 바람직한 바, 예컨대 FASTA, BLAST 등에서 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 이용함으로써, 용이하게 산출할 수 있다.

서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열은, 바람직하기는 80% 이상, 보다 바람직하기는 85% 이상, 더 바람직하기는 90% 이상, 한층 더 바람직하기는 95% 이상, 특히 바람직하기는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하기는 99% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에서, 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열이 주어지면, 이를 코드 하는 뉴클레오티드 서열은 용이하게 정해져, 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 코드하는 여러 가지 뉴클레오티드 서열을 선택할 수가 있다. 따라서, 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드라 함은, 서열번호:2로 나타나는 DNA 서열의 일부 또는 전부에 더해, 동일한 아미노산을 코드하는 DNA 서열로서 축중관계(縮重關係)에 있는 코돈을 DNA 서열로 가지는 서열도 의미하는 것으로 한다. 본 발명에서는 또한 이들에 대응하는 RNA 서열도 포함된다.

서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로는, 서열번호:2로 나타나는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

본 명세서에서, 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 갖는지 여부는 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현과 관련한 생체현상 또는 기능을 평가함으로써 결정할 수가 있는바, 예컨대, 그 단백질을 유전자 조환 기술에 의해 발현시켜, PA4710 단백질에 대한 항체를 만들 수 있는지 여부를 평가함으로써 결정할 수 있다.

본 발명의 단백질은 녹농균의 세포 표면에 존재하기 때문에, 당해 단백질은 녹농균에 대한 항체를 만들기 위한 항원(단백질 항원)으로서 사용할 수가 있다.

본 발명자들은 다수의 임상분리주의 분석에 의해, PA4710 단백질(서열번호:3) 중, 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역을 특정하는 데에 성공하였다. 특정한 영역(5 아미노산 이상인 것)은 이하와 같다:

서열번호:3으로 나타나는 아미노산 서열에서의, 181위에서 198위, 204위에서 257위, 259위에서 311위, 313위에서 319위, 321위에서 436위, 440위에서 491위, 493위에서 600위, 602위에서 764위.

본 발명의 펩티드는, 이들 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역에 포함되는 펩티드로서, 또한, 녹농균의 표면으로부터 노출되어 있는 펩티드 영역(이하, 「세포 외 영역」이라 칭함)의 펩티드인 것이, 녹농균 감염에 대한 의약이나 진단약으로 쓰이는 항체를 만들기 위하여 바람직하다. 이와 같은 펩티드는, 공통항원으로 된다. 세포 외 영역은, PA4710 단백질의 구조적 특징의 분석 및 항체의 녹농균 표면에의 결합 실험에 의한 검증 등(실시예 2, 9 참조)에 의해, 특정할 수 있다. 본 발명자들에 의해, 세포 외 영역으로서, 11개소의 펩티드 영역(서열번호:5 내지 15)이 특정되었다. 서열번호:5 내지 15는, 본 발명의 펩티드의 바람직한 태양이다.

본 발명의 서열번호 5 내지 15 펩티드 중, 서열번호: 11, 12, 14로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는, 그들을 표적으로 한 항체에, 녹농균 감염에 대한 항균 활성이 인정되었다(실시예 11, 12). 따라서, 서열번호: 11, 12, 14로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는, 녹농균 감염에 대한 의약으로 쓰이는 항체를 조제하기 위한 항원으로서, 특히 적합한 펩티드이다.

항체를 조제하는 목적에 쓰이는 본 발명의 펩티드는, 상기 세포 외 영역의 펩티드 전체일 필요는 없다. 항체의 조제가 가능한 한, 아미노산의 고리 길이에 제한은 없으나, 바람직하기는, 7 아미노산 이상(예컨대, 8 아미노산 이상, 10 아미노산 이상, 12 아미노산 이상)이다.

한편, 본 발명의 펩티드는, 공통항원으로 이용하는 목적인 경우에는, 상기 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역에 포함되는 펩티드인 것이 바람직하나, 그 이외의 목적인 경우(예컨대, 녹농균의 특정한 주(株)를 표적으로 하는 경우 등)에는, 변이가 포함되어 있는 영역을 표적으로 하는 것도 생각할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩티드에는, 1 또는 수 개의 아미노산에 변이가 존재하는 것도 포함된다. 이 변이는, 보존적 치환일 수가 있다.

본 발명의 펩티드는, 전하에 의한 응집 등을 막기 위해, N 말단이나 C 말단에 블록 기를 부가할 수 있다. N 말단에는, 아세틸화(acetylation), C 말단에는 아미드화(amidation)가 흔히 이용되지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 펩티드는, 시스테인 잔기를 부가해서, 스페이서와의 결합을 강화하는 수식 등을 이용할 수가 있다.

스페이서로는, DMS(Dimethyl Suberimidate), DMA(Dimethyl adipimidate), Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate), Sulfo-MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester) 등을 사용하는 것이 일반적이나, 이에 한정되는 것은 아니고 스페이서로서 기능하는 화합물이면 족하다.

본 발명의 펩티드는, 담체로서, 우혈청 알부민(BSA), 난백 알부민(OVA), 인간혈청 알부민(HSA) 또는 라파스가이 유래의 헤모시아닌(KLH Keyhole limpet hemocyanin) 등의 캐리어-단백질을 이용할 수가 있으나 이들에 한정되지 않는다. 당해 펩티드를 별개의 단백질의 말단 또는 내부에 편입한 융합 단백질을 만들어, 항체를 만들기 위한 항원으로서 사용할 수 있다.

[항원 조성물]

본 발명의 단백질 또는 본 발명의 펩티드는, 단백질 항원 또는 펩티드 항원으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 외막 PA4710 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있는 당해 단백질 항원 또는 당해 펩티드 항원을 포함하여 이루어지는 항원 조성물이 제공된다.

여기서, 단백질 항원 또는 펩티드 항원은, 바람직하기는, 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 펩티드를 당업자에게 주지된 방법에 따라 정제해서 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 「항원 조성물」이란, 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 유일한 구성요소로 하는 조성물이어도 좋고, 또 다른 성분을 포함하여 이루어지는 조성물이어도 좋다.

본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 PA4710 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하여 이루어지는 항원 조성물이 제공된다.

[항체]

본 발명의 항체는, 녹농균의 외막 PA4710 단백질 또는 그 일부를 인식하고, 또한 녹농균에 결합될 수가 있다.

본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 일부가, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 세포 표면 루프 함유 영역인, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편이 제공된다.

여기서, PA4710 단백질의 세포 표면 루프 함유 영역은, 이하의 (i), (ii), (iii), 및 (iv)로부터 선택되는 단백질이다:

본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 일부가, (i) 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역(서열번호:3으로 나타나는 아미노산 서열에서의, 181위에서 198위, 204위에서 257위, 259위에서 311위, 313위에서 319위, 321위에서 436위, 440위에서 491위, 493위에서 600위, 602위에서 764위)이고, 또한, 세포 외 영역에 있는 펩티드, (ii) (i)의 펩티드의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편이 제공된다.

본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 일부가, (i) 서열번호:5 내지 15로 나타나는 세포 외 루프 영역인 펩티드, (ii) (i)의 펩티드의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편이 제공된다.

본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 PA4710 단백질에서의 서열번호:5 내지 15의 아미노산 서열로 나타나는 세포 외 루프 영역 중, 특정한 세포 외 루프 영역에만 결합하고, 그 이외의 세포 외 루프 영역에는 결합하지 않는 항체가 제공된다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 항원 조성물에 응답해서, 동물 자신의 면역계에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 녹농균에 결합될 수 있는 항체가 제공된다.

본 발명의 항체는, 녹농균 감염의 치료나 진단에, 또는 연구용 시약으로서 사용할 수가 있다. 본 발명의 항체를 녹농균 감염에 적용하는 태양에서, 녹농균이 감염되어 있는 환자에 항균 활성을 가지는 항체 또는 그의 기능적 단편이 제공된다. 이 태양에서, 특히 바람직한 항체는 서열번호:11, 12, 14 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 대한 항체이다. PA4710 단백질(서열번호:3) 중, 서열번호:11, 12, 14 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드의 영역에 대해, 항체를 작용시킴으로써, 녹농균에 대한 항균 활성을 발휘할 수 있게 된다. 이와 같은 항균 활성을 나타내는 구체적인 항체로는, 예컨대 FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체가 예시될 수 있다. 일단, 녹농균에 대한 항균 활성을 항체가 발휘하기 위해, 그 항체의 표적으로서 바람직한 펩티드 영역이 특정된 경우, 당업자라면, 그의 펩티드 영역을 표적으로 해서, 마찬가지 활성을 나타내는 여러 가지 항체를 만들어낼 수 있다. 본 발명에는, 본 발명자들이 의해 알아낸, 이들 표적 펩티드 영역에 결합되는 여러 가지 항체가 포함된다.

녹농균이 감염되어 있는 환자는, 예컨대 여러 가지 약제 투여나 방사선 치료 등에 의해, 호중구가 감소되어 있는 상태로 있는 환자일 수 있다. 본 발명의 항체에 의하면, 심한 감염증으로 발전하기 쉬운, 이와 같은 환자에 대해서도 효과를 발휘할 수 있다는 점에서 유리하다. 또, 환자에게 감염되어 있는 녹농균은, 다제 내성 녹농균일 수 있다. 본 발명의 항체는, 통상 쓰이는 항생물질에 의해서는 치료될 수 없는, 다제 내성 녹농균에 감염된 환자에 대해서도, 유효성을 나타낸다는 점에서도 유리하였다.

본 발명에 의하면, FERM BP-10970. FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 어느 한 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 기능적 단편이 제공된다. 그리고 이들 하이브리도마에 의해 생산되는 모노크로널 항체와 같은 항원과 반응하는 모노크로널 항체인 것을 특징으로 하는 항체가 제공된다.

본 발명의 항체는, 바람직하기는 정제된 본 발명의 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하여 이루어지는 항원 조성물을 면역해서 항체가 유발될 수 있는 량으로 실험동물에 투여함으로써 얻어질 수 있다. 심장 또는 동맥에서 채혈하고, 분리해서 얻은 항혈청을 정제한 후, 순수 항체로서 사용할 수가 있다.

본 발명의 항체에는, PA4710 단백질 또는 펩티드를 항원으로 해서, 당해 항원을 마우스 등의 포유동물에 면역시켜 얻어지는 폴리크로널 항체 또는 모노크로널 항체(본 발명의 모노크로널 항체를 생산하는 하이브리도마가 생산하는 모노크로널 항체도 포함된다), 유전자 조환 기술을 이용해서 제조되는 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 인간항체 생산 트란스제닉 동물 등을 이용해서 제조되는 인간항체가 포함된다. 본 발명의 항체를 의약으로서 인간에 투여하는 경우는, 부작용 저감의 관점에서, 인간항체가 바람직하였다.

「인간항체」라 함은, 모든 영역이 인간 유래인 항체이다. 본 발명의 인간항체는, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 만들 수 있다(예컨대, Intern. Rev. Immunol, 1995, 13, 65-93, J. Mol. Biol, 1991, 222, 581-597, 일본 특개평 10-146194호 공보, 일본 특개평 10-155492호 공보, 일본 특허 제2938569호 공보, 일본 특개평 11-206387호 공보, 일본 특표평 8-509612호 공보, 일본 특표평 11-505107호 공보 등을 참조할 수가 있다).

「인간화 항체」는, 마우스항체의 항원결합부위(CDR; 상보성 결정 영역)의 유전자 서열만을 인간항체 유전자에 이식(CDR 그라프팅)한 항체이다. 본 발명의 인간화 항체는, 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수 있다(예컨대, EP239400, WO90/07861호 공보 등을 참조할 수가 있다).

「키메라 항체」는, 어떤 종류의 항체의 가변영역과 그것과는 이종(異種)인 항체의 정상영역을 연결한 항체이다. 구체적으로는, 항원을 마우스에 면역하고, 그 마우스 모노크로널 항체의 유전자로부터 항원과 결합하는 항체 가변부(V 영역)를 잘라내고, 인간 골수 유래의 항체 정상부(C 영역) 유전자와 결합해서 만들 수 있다. 본 발명의 키메라 항체는, 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수 있다(예컨대, 일본 특개평 8-280387호 공보, 미국특허 제4816397호 공보, 미국특허 제4816567호 공보, 미국특허 제5807715호 공보 등을 참조할 수 있다).

본 발명의 모노크로널 항체는, 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수가 있다(예컨대, Antibodies A LABORATORY MANUAL Ed Harlow, David Lane Cold Spring Harbor Laboratory 1988, 단일 클론 항체 실험 메뉴얼(1987) 코우단샤, 토야마사쿠지 등 편찬, 단일 클론 항체 하이브리도마와 ELISA(1987) 코우단샤, 이와사키 타츠오 등 편찬 등을 참조할 수가 있다).

본 발명의 폴리크로널 항체는, 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수 있다.

본 발명의 「기능적 단편」이라 함은, 항체의 일부분(부분 단편)으로서, 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식하는 것을 의미한다. 구체적으로는, Fab, Fab', F(ab')₂, 가변영역 단편(Fv), 다이설파이드 결합 Fv, 1본쇄 항체(scFv), 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다.

또, 본 발명에 의하면, 상기 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마가 제공된다. 본 발명의 하이브리도마의 바람직한 태양에서, 2008년 5월 28 일자로 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터((우) 305-8566 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반찌 1츄오우 다이6)에 기탁된 수탁번호 FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 하이브리도마가 제공된다. 대응하는 원(原) 기탁은 하기와 같다.

2005년 11월 25일자로 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터1((우) 305-8566 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반찌 1츄오우 다이6)에 기탁된 수탁번호 FERM P-20723의 하이브리도마(4710-B-1), FERM P-20724의 하이브리도마(4710-L3A-1), FERM P-20725의 하이브리도마(4710-L7-1), 및 2007년 2월 8일자로 동 센터에 기탁된 수탁번호 FERM P-21205의 하이브리도마(4710-L8B-1) 및 FERM P-21206의 하이브리도마(4710-L10-1).

[백신 조성물]

본 발명의 항원 조성물은, 백신으로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 녹농균 유래의 외막 PA4710 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있는 항원 조성물을 포함하여 이루어지는 백신 조성물이 제공된다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 항원 조성물과, 경우에 따라서는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 애쥬번트를 포함하여 이루어지는 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 쓰이는 담체는, 투여의 양식 및 경로, 및 표준적인 제약 실무를 기초로 해서 선택되고, 캐리어 단백질(예컨대, 우혈청 알부민(BSA), 난백 알부민(OVA), 인간혈청 알부민(HSA), 라파스가이 유래의 헤모시아닌(KLH:Keyhole limpet hemocyanin) 등), 용해제(예컨대, 에탄올, 폴리솔베이트, Cremophor EL(등록상표) 등), 등장화제, 보존제, 항산화제, 부형제(예컨대, 락토스, 스타치, 결정성 셀룰로오스, 만니톨, 말토스, 인산수소칼슘, 경(輕)무수규산, 탄산칼슘 등), 결합제(예컨대, 스타치, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 아라비아 고무 등), 활택제(예컨대, 스테아린산 마그네슘, 탈크, 경화유 등), 안정화제(예컨대, 락토스, 만니톨, 말토스, 폴리솔베이트, 마크로골, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등) 등이 있다. 필요하다면, 글리세린, 디메틸아세트아미드, 70% 유산 나트륨, 계면활성제, 또는 염기성 물질(예컨대, 수산화나트륨, 에틸렌 디아민, 에탄올 아민, 중탄산 나트륨, 알기닌, 메글루민, 트리스아미노메탄 등) 등을 가하여도 좋다.

캐리어 단백질의 구체적인 예로는, 본 발명의 백신 조성물의 항원성을 높이기 위해, 본 발명의 펩티드에 공지의 KLH 용액(Calbiotec사 제, 50% 글리세롤 용액에 1ml 당 125mg을 용해시킨다)을 커플링(coupling)시킬 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 쓰이는 희석제는, 투여의 양식 및 경로, 및 표준적인 제약 실무를 기초로 해서 선택되는바, 예컨대, 물 또는 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수, 중탄산염 용액 등을 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 쓰이는 애쥬번트는, 투여의 양식 및 경로, 및 표준적인 제약 실무를 기초로 해서 선택되고, 예컨대, 콜레라 독소, 대장균의 열불안정장독소(LT), 리포솜, 또는 면역자극성 복합체(ISCOM:immunostimulating complex) 등을 들 수 있다.

투여는, 녹농균에 의한 감염 우려가 있는 투여대상의 연령, 체중, 성별, 일반적 건강상태에 따라 다르지만, 경구투여, 비경구투여(예컨대, 정맥투여, 동맥투여, 국소투여)의 어떤 투여경로로도 투여할 수 있으나, 바람직하기는 비경구투여이다. 경구투여 및 비경구투여를 위한 제형 및 그의 제조방법은 주지된 것으로, 본 발명의 항원 조성물을, 약학적으로 허용되는 상기의 담체 등과 혼합 등을 함으로써, 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 경구투여를 위한 제형은, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 용제, 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등을 들 수 있다. 비경구투여를 위한 제형은, 용제, 현탁제, 연고제, 크림제, 좌제, 안제(眼劑), 점비제, 점이제 등을 들 수 있다. 경구투여의 경우, 향미료 및 착색료를 가할 수도 있다.

본 제제의 서방(徐放)을 희망하는 경우, 생분해성 폴리머(예컨대, 폴리-D, L-락티드코글리코리드, 폴리글리코리드 등)를, 증량 모재(增量母材)로 가해줄 수 있다(예컨대, 미국특허 5,417,986호 공보, 미국특허 4,675,381호 공보, 미국특허 4,450,150호 공보를 참조할 수가 있다)

적당한 의약용 담체 및 희석제 등, 또 이들의 사용을 위해 의약상 필요한 물(物)은, Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다.

본 발명의 백신 조성물의 투여량은, 예컨대, 백신 항원의 종류, 본 항원과 함께 애쥬번트를 투여할 수 있는지 여부, 함께 투여되는 애쥬번트의 종류, 투여의 양식과 빈도, 및 희망하는 효과(예컨대, 예방인지, 그렇지 않으면 치료인지)에 따라, 본 발명자들에 의해 결정되는바, 일반적으로는, 본 발명의 백신 조성물을 1 성인에 1 투여 당 1㎍ ~ 100mg의 량으로 투여한다. 본 백신과 함께 애쥬번트를 투여하는 경우, 일반적으로는, 1 성인 1 투여 당 1ng ~ lmg의 량을 투여한다. 본 발명자들의 결정에 따라, 필요가 있는 경우에는, 투여를 되풀이한다. 예컨대, 초기화를 위한 투여에 이어, 1주간마다 3회의 증강을 위한 투여를 실행할 수 있다. 또는 증강을 위한 주사를, 최초의 면역접종 후 8 ~ 12주째에, 그리고 2 번째의 증강을 16 ~ 20주째에, 동일한 조합제(調合劑)를 이용해서 실행할 수 있다.

[항체의 용도 및 의약 조성물]

녹농균 관련 질환

녹농균은 숙주의 저항력 저하에 따라 치명적인 결과로 되는 일화견(日和見) 감염의 병원균이고, 또 항생물질에 저항성이기 때문에, 원내 감염의 주요한 원인균이기도 하였다. 다음에 설명되는 실시예에 의해 나타내어져 있듯이, 무틴 투여에 의해 마크로파지의 기능을 저하시킨 마우스 녹농균 이감염성 모델에서, 본 발명의 항체가 실제로 감염방어효과를 가지는 것(실시예 10), 또, 사이클로포스파미드 모노하이드레이트(Cyclophosphamide monohydrate) 투여에 의해 호중구를 감소시킨 마우스 녹농균 이감염성 모델에서, 본 발명의 항체가 실제로 감염방어효과를 갖는 것이 확인되었다(실시예 11). 그리고, 마우스 다제 내성 녹농균 이감염성 모델에서, 본 발명의 항체가 실제로 감염 방어효과를 갖는 것이 확인되었다(실시예 12). 따라서, 녹농균의 PA4710 단백질(특히 그 세포 외 영역)에 본 발명의 항체를 작용시킴으로써, 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료가 가능하였다. 본 발명의 항체는, 여러 가지 발현의 녹농균에 대해, 또 여러 가지 증상의 녹농균 감염환자에 대해, 적용할 수가 있다. PA4710 단백질의 세포 외 영역 중, 서열번호:11, 12, 14 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 영역이, 이와 같은 의료목적에 있어, 특히 적합한 항체의 표적 영역이다. 녹농균 감염 환자에게서, 항균 활성을 나타내는 구체적인 항체로는, 예컨대, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체를 들 수 있다. 치료에 어려움을 겪는 다제 내성 녹농균 감염증의 예방 또는 치료에 대해서는, PA4710 단백질의 세포 외 영역 중, 서열번호:14로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 영역에 대한 항체(예컨대, FERM BP-10974의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체)를 적절히 사용할 수가 있다(실시예 12).

녹농균 관련 질환으로는, 다제 내성 녹농균을 포함한 녹농균 감염에 기인하는 전신감염 질환, 예컨대 패혈증, 수막염, 심내막염 등을 들 수 있다. 이비과(耳鼻科) 영역에서는, 중이염, 부비강염, 호흡기과 영역에서는, 폐렴, 만성 기도 감염증, 카테터 감염증, 외과 영역에서는, 술후 복박염, 술후 담관 등의 염술후(炎術後) 감염증, 안과 영역에서는, 안검농양, 누농염, 결막염, 각막 궤양, 각막 농양, 전안구염, 안와(眼窩) 감염, 비뇨기과 영역에서는, 복잡성 요로감염증을 포함한 요로감염증, 카테터 감염증, 항문주변 농양 등을 들 수 있다. 그 외에도, 중증 열상, 기도 열상을 포함한 열상이나 욕창 감염증, 낭포성 섬유증 등을 들 수 있다.

본 발명에 의하면, 예방상 또는 치료상의 유효량의 본 발명의 항체를, 인간을 포함한 포유류에 투여하는 공정을 포함하여 이루어지는, 녹농균 관련 질환의 예방방법 또는 치료방법이 제공된다.

녹농균 감염증 진단제

다음에 설명될 실시예에서 나타나는 것과 같이, 본 발명의 항체는, 녹농균의 세포 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역과 결합하는 것이 확인되었다(실시예 8). 또 본 발명의 항체는, 녹농균의 세포 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역과 결합하는 것이 확인되었다(실시예 9). 이들의 결과로부터, 본 발명의 항체는, 녹농균의 존재를 검출할 수 있음이 시사되었다. 따라서, 본 발명의 항체는, 녹농균 감염증 진단제로서 사용할 수 있다. PA4710 단백질의 세포 외 영역 중, 서열번호:11, 12, 14 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드의 영역에 결합하는 항체가, 이와 같은 진단에서 특히 적합한 항체이다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 항체를 이용하는 녹농균 감염의 진단방법이 제공된다. 본 발명의 진단방법은, 녹농균 감염의 염려가 있는 인간을 포함한 포유동물로부터 객담, 폐 세정액, 농, 눈물, 혈액, 뇨 등의 생체시료를 채취하고, 이어서 채취한 시료와 본 발명의 항체를 접촉시켜, 항원 항체반응이 생기는지 여부를 판단함으로써 실시할 수 있다.

녹농균 감염증 진단 키트

본 발명에 의하면, 녹농균의 존재를 검출하기 위한 키트(kit)으로, 본 발명의 항체를 적어도 포함하여 이루어지는 키트가 제공된다.

본 발명의 항체는, 표지(標識)한 것이어도 좋다. 이 검출용 키트는 항원 항체반응을 검출함으로써 녹농균의 존재를 검출한다.

따라서 본 발명의 검출 키트는, 소망에 따라, 항원 항체 반응을 실시하기 위한 여러 가지 시약, 예컨대 ELISA법 등에 이용하는 2차 항체, 발색시약, 완충액, 설명서 및/또는 기구 등을 더 포함할 수가 있다.

의약 조성물

본 발명의 의약 조성물 또는 용제는, 본 발명의 항체를 유효성분으로 이용하고, 바람직하기는, 정제한 항체 조성물과 임의의 성분, 예컨대 생리식염수, 포도당 수용액 또는 인산염 완충액 등을 함유하는 조성물의 형태로 사용하여도 좋다.

본 발명의 의약 조성물은 필요에 따라 액체 또는 동결건조한 형태로 제형화하여도 좋고, 임의로 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 안정화제, 방부제, 등장화제(isotonic agent) 등을 함유시킬 수도 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는, 동결건조한 제제의 경우, 만니톨, 락토스, 사카로스, 인간알부민 등을 예로 들 수가 있고, 액상 제제의 경우에는, 생리식염수, 주사용수, 인산염 완충액, 수산화 알루미늄 등을 예로 들 수가 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

투여는, 투여대상의 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강상태에 따라 다르지만, 경구투여, 비경구투여(예컨대, 정맥투여, 동맥투여, 국소투여)의 어느 투여경로로도 투여할 수 있으나, 바람직하기는 비경구투여이다.

의약 조성물의 투여량은, 환자의 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강상태, 녹농균 감염증의 정도 및 투여하는 항체 조성물의 성분에 따라 다양하다. 본 발명의 항체 조성물은, 일반적으로 정맥 내 투여의 경우, 성인에는 체중 1kg 당 1일 0.1 내지 1000mg, 바람직하기는 1 내지 l00mg을 투여한다.

본 발명의 의약 조성물은, 녹농균에 의한 감염 우려가 있는 환자에 대해 미리 투여해 놓는 것이 바람직하다.

진단제로 조제하는 데에는, 합목적적인 임의의 수단을 채용해서 임의의 제형으로 이들을 얻을 수가 있다. 예컨대 복수(腹水), 목적 항체를 함유한 배양액, 또는 정제한 항체에 대해 그 항체가를 측정해서, 적당히 PBS(생리 식염을 함유한 인산 완충액) 등으로 희석한 후, 0.1% 나트륨아지드 등을 방부제로서 가한다. 또는 라텍스 등으로 본 발명의 항체를 흡착시킨 것도 항체가를 구해 적당하게 희석하고, 방부제를 첨가해서 이용한다. 상기와 같이 본 발명의 항체를 라텍스 입자에 결합시키는 것은, 진단약으로서 바람직한 제형의 한 가지이다. 이 경우의 라텍스로는 적당한 수지재료 예컨대 폴리스티렌, 플리비닐톨루엔, 폴리부타디엔 등의 라텍스가 적당하였다.

이하, 본 발명의 이해를 깊이 하기 위해 실시예를 따라 설명하는바, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]: GeneChip^R 해석

인간혈청 첨가 배지에서 발현되어 있는 유전자를 탐색하는 수법으로서, GeneChip^R 발현 해석 시스템(Affymetrix 사 제 GeneChip^R P. aeruginosa 게놈 어레이)를 이용하였다. 녹농균 PAO1 균주를 이용해서, 3가지의 배양조건, 즉 0%, 20%, 50% 인간혈청 첨가 Luria-Bertani(LB) 배지(나가라이테스크 사제)(최종의 LB 배지 조성은 균일)에서 37℃에서 595nm의 흡광도(吸光度)가 1.0으로 되기까지 진탕 배양하고, RNeasy Protect Bacteria Mini 키트(QIAGEN GmbH 사제)을 이용하여, 첨부 문서의 방법에 따라, 전 RNA를 추출하고, 2100 바이오 애널라이저(Agilent Technologies 사제)에 의해 정량(定量)을 행하였다. 그 후, GeneChiP^R의 첨부 문서의 방법에 따라서 실험을 행하였다. 유전자 발현 데이터의 해석은 Microarray Suite 5.0(Affymetrix 사제)로 실행하고, 시그널 및 디텍션을 계산하였다. 이때, 전체 프로브 세트의 시그널의 평균치가 1000으로 되도록 보정을 행하였다. 실험은 독립해서 2회 실시하였다.

그 결과, 하우스키핑 단백질인 PA4761 단백질(DnaK 또는 HSP70)은, 어느 배양조건에서도 혈청 첨가의 유무에 불구하고, 전사 산물이 검출된 것을 나타내는 「Present」로 판정되어, 당해 유전자가 발현되어 있는 것이 나타났다. 또, PA5158 단백질(OpmG) 및 PA2019 단백질(MexX)와 회합(會合)해서 약제 배출 펌프를 구성하는 내막 관통 단백질로 테트라사이클린이나 아미노글리코시드계 항생물질 등 리보솜 저해제에 의해 유도되는 PA2018 단백질(MexY)(J. Bacteriology, 2005, 187, 5341-5346)은 그들 약제가 존재하지 않는 이런 조건 하에서는「Absent」로 판정되어, 이들 유전자가 발현되어 있지 않은 것이 나타났다. 한편, PA4710 유전자에 관해서는, 혈청 비첨가 조건에서는 「Absent」로 판정되어, 유전자가 발현되어 있지 않은 것이 나타났지만, 혈청 첨가 조건 하에서는 「Present」로 판정되었다.

이상으로부터, 틀림없이 PA4710 유전자가 발현되고, 그 유전자 산물인 PA4710 단백질이 균체 표면에 정상적으로 존재하고 있을 가능성이 시사되었다. 이로부터, 녹농균의 PA4710 단백질이 백신의 성분으로서 유용하다는 것이 시사되었다.

[실시예 2]: 임상분리주에서의 PA4710 유전자의 해석

사용 균주는, 전국의 임상시설에서 각종 임상재료로부터 분리된 녹농균 67 주(메이지세이카 가부시키가이샤, 요꼬하마 연구소에 보관)를 시험에 제공하였다. 이들 균주는 혈액, 뇨, 객담, 고름, 인두 점액 등에 유래하는 것이고, 혈청형은 녹농균연구회 주최의 형별(型別) 검토위원회의 결정(1975년)에 의한 혈청학적 분류에 기초하여, A군, B군, E군, G군, I군, M군 등이 포함되어 있다.

(1) 게놈 DNA의 제조

임상분리의 녹농균 67주에 대해, 뮤라힌톤 배지(벡톤·디킨슨 사제)에서 37℃에서 하룻밤 배양하고, 저속 원심에 의해 집균(集菌)하였다. 얻어진 균체로부터 DNeasy Tissue 키트(QIAGEN GmbH 사제)을 이용하여, 첨부 문서의 방법에 따라서, 게놈 DNA를 조제하였다.

(2) PCR법에 의한 DNA 단편의 증폭

조제한 게놈 DNA를 주형으로, PA4710 유전자를 포함한 영역을 PCR에 의해 증폭하였다. 구체적으로는, 녹농균 PA01주의 게놈 서열(NCBI의 데이터 베이스에서의 접근 번호:NC_002516)을 기초로 PA4710 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트(서열번호:16, 서열번호:17)를 설계하고, Takara ExTaq(타가라바이오 주식회사제)로 첨부의 설명서에 따라, GeneAmp PCR System 9700(Applied BioSystems 사제)을 이용해서 PCR을 실시하였다. PCR에서 증폭된 DNA 단편은, 아가로오스 겔 전기영동에 의해, 목적하는 사이즈(2635 염기대(鹽基對))임을 확인하였다.

(3) DNA 시퀀서에 의한 폴리뉴클레오티드 서열의 해석

PCR 산물은 MultiScreen PCR 플레이트(Millipore Corporation 사제)에서 정제 후, 시퀀스 반응에 제공하였다. PA01 균주의 게놈 서열(NC_002516)을 기초로, 각 PCR 산물을 시퀀싱할 수 있는 프라이머(서열번호:18 ~ 서열번호:22)를 설계하고, 시퀀스 반응에는 BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequeneing 키트(Applied BioSystems 사제)를 이용하였다. 시퀀스 반응은 첨부의 설명서에 따라, GeneAmp PCR System 9700(Applied BioSystems 사제)으로 실시하였다. 시퀀스 반응 산물은, 미리 물로 팽창시킨 Sephadex G-50 Fine DNA Grade(Amersham Biosciences AB 사제)를 채운 MultiScreen-HV 플레이트(Millipore Corporation 사제)로 정제한 후, Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(Applied BioSystems 사제)를 이용해서 폴리뉴클레오티드 서열의 해석을 실행하였다.

상기 해석에 의해 판명된 임상분리주의 폴리뉴클레오티드 서열을 폴리펩티드 서열로 치환하고, PA01 주의 것과 비교 검토한 결과, PA4710 단백질의 전장서열(全長配列)에서, 17곳에 변이가 인정되었다(표 1).

그리고, 대장균 FhuA 단백질의 구조 해석 정보(Cell, 1998, 95, 771-778, Science, 1998, 282, 2215-2220), 대장균 FepA 단백질의 구조 해석 정보(Nat. Struct. Biol., 1999, 6, 56-63), 대장균 FecA 단백질의 구조 해석 정보(Science, 2002, 295, 1715-1719, J. Mol. Biol., 2003, 332, 353-368), 녹농균 FpvA 단백질의 구조 해석 정보(J. Mol. Biol., 2005, 347, 121-134) 및 PA4710 단백질의 2차 구조 예측정보로부터 얻어지는 정보를 기초로 한 구조 분석으로부터, 이 17곳의 변이를 포함하지 않은 펩티드 영역(아미노산 서열이 보존되어 있는 펩티드 영역)에서, 세포 외 영역(서열번호:5 ~ 서열번호:15)이 발견되었다. 이들, 녹농균의 PA4710 단백질의 세포 외 영역 펩티드는, 「녹농균 공통 항원」으로서 유용하다.

[표 1]: 임상분리주에서의 PA4710 단백질의 변이 패턴

-: PA01주와 같은 아미노산인 것을 나타냄.

[실시예 3]:PA4710 유전자 DNA 단편의 클로닝

녹농균 PA4710 유전자(서열번호:1)의 아미노산 코드 영역 2295 염기 중의 541번째부터 2295번째의 DNA 단편(서열번호:2)을, 이하의 방법으로, 무세포계(無細胞系) 단백질 발현 벡터 pIVEX2.4d(Roche Diagnostics 사) 및 대장균 발현 벡터 pET15b(Novagen 사)에 넣었다.

아미노산 코드 영역의 l번째부터 540번째의 염기 서열은, 시그널 서열 및 PA4710 단백질과 동족인 TonB 의존성 수용체에 속하는 대장균 FhuA 단백질의 구조 해석 정보(Cell, 1998, 95, 771-778, Science, 1998, 282, 2215-2220, 대장균 Fe pA 단백질의 구조 해석 정보(Nat. Struct. Biol., 1999, 6, 56-63), 대장균 FecA 단백질의 구조 해석 정보(Science, 2002, 295, 1715-1719, J. Mol. Biol., 2003, 332, 353-368), 녹농균 FpvA 단백질의 구조 해석 정보(J. Mol. Biol., 2005, 347, 121-134) 및 PA4710 단백질의 2차 구조 예측정보를 기초로, 세포 표면에 표출되지 않은 부분을 코드하는 것으로 추측해서, 클로닝 대상에서 제외하였다.

클로닝하는 DNA 단편을 녹농균 PAOl주의 게놈 DNA로부터 PCR(DNA Thermal cycler 480; Perkin-Elmer 사제)로 증폭하였다. DNA 폴리머라제는 Pyrobest(다까라 주조사제)를 사용하여, 반응액에 디메틸술폭시드를 5% 첨가하고, PCR 프라이머는 제한효소부위 Xhol(CTCGAG) 및 BamHI(GGATCC)를 부가하기 위한 염기를 함유한 프라이머(서열번호:23, 서열번호:24)를 이용하였다.

PCR의 온도조건은, 94℃에서 2분간 가열한 후, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간을 30 사이클로 하였다. PCR 산물을 GenElute PCR DNA Purification Kit(Sigma 사제)를 이용해서 정제하고, XhoI(New England Biolabs 사제) 및 BamHI(도요 방사제)로 절단하였다. pIVEX2.4d를 Xhol 및 BamHI로 절단하고, 이들의 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen 사제)을 이용해서 추출 정제하였다. Xhol-BamHI로 절단한 PCR 산물 및 pIVEX2.4d를 T4 DNA 리가제(Invitrogen 사제)로 연결해서, 대장균 DH5α 균주(Competent High DH5α, 도요 방사제)를 형질전환하였다. PA4710 유전자 단편이 도입된 pIVEX2.4d 플라스미드(pIVEX-PA4710-l)를, QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen 사제)을 이용해서 정제하고, BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 사제)을 이용해서 사이클 시퀀스를 반응을 실행하여, 삽입부분의 염기 서열을 확인하였다(3730 DNA Analyzer, Applied Biosystems/HITACHI 사제).

다음에, pET15b를 Xhol 및 BamHI로 절단하고, pIVEX-PA4710-1의 Xhol-BamHI 삽입 단편과 연결해서 대장균을 형질전환하고, PA4710 유전자 단편이 도입된 pET15b 플라스미드(pET-PA4710-4)를 얻었다.

[실시예 4]:PA4710 조환 단백질의 발현 및 정제

조환 단백질의 발현에는, 무(無)세포 및 대장균의 발현계를 이용하였다.

무세포계는, T7 RNA 폴리머라제와 대장균 라이제이트에 의해 전사와 번역을 실행하는 RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit(Roche Diagnostic 사제)을 사용하였다. 무세포계 단백질 발현 벡터 pIVEX-PA4710-1은, T7 프로모터의 하류에 His-태그(6개의 연속된 히스티딘)가 융합된 PA4710 단백질을 코드하는 플라스미드이다(실시예 3 참조). 취급 설명서에 따라 무세포계 반응액을 조제하고, 10㎍의 pIVEX-PA4710-1을 첨가해서 30℃에서 20시간 반응한 후, 생성한 불용성 단백질을 원심으로 회수하였다.

대장균 발현계는 T7 RNA 폴리머라제 유전자가 도입된 대장균 BL21(DE3) 균주와 T7 프로모터를 가지는 pET 벡터의 발현계(Novagen 사제)를 사용하였다. 대장균 발현 벡터 pET-PA4710-4는, T7 프로모터의 하류에 His-태그가 융합된 PA4710 단백질을 코드하는 플라스미드이다(실시예 3 참조). BL21(DE3) 균주를 염화칼슘으로 처리(Molecular Cloning 제2판, Sambrook 외(1989) 참조)하고, pET-PA4710-4에 의해 형질전환하였다. 형질전환체를 50㎍/ml 암피실린을 포함한 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, 새로운 배지에 200배 희석으로 현탁해서 37℃에서 4시간 배양 후, IPTG를 최종농도 0.5mM로 첨가하고, 다시 3시간 배양하였다. 세포를 원심으로 회수하여, -20℃에서 동결하였다. 세포를 단백질 추출 시약 BugBuster Protein Extraction Reagent(Novagen 사제)로 용해하고, 첨부 설명서에 준해서 봉입체를 회수하였다. 이때, 초음파처리를 가해서, 라이소자임(난백 라이소자임, 생화학공업사제)은 최종 농도 200㎍/ml로 하였다.

단백질의 정제에는, His-태그를 이용한 Ni 킬레이트 크로마토그래피를 이용하였다. 무세포 또는 대장균의 발현계에서 발현한 불용성 단백질을, 용해 버퍼(8M 요소, 5mM 이미다졸, 200mM NaCl 및 0.05% NP-40을 첨가한 둘베코 인산 완충염류 용액(PBS))에서 가용화하였다. 용해된 단백질을 Ni-NTA Agarose(Qiagen 사제)에 결합하고, 40 용량의 용해 버퍼로 세정하였다. 그리고 40 용량의 세정 버퍼(NP-40을 제외한 용해 버퍼)로 세정한 후, 용출 버퍼(8M 요소, 300mM 이미다졸, 200mM NaCl을 첨가한 PBS)에 의해, His-태그 부착 단백질을 용출시켜 회수하였다.

그 결과, 무세포계에서는 1ml의 반응액으로부터 1.7mg의 단백질, 대장균 발현계에서는 100ml의 배양으로부터 7.2mg의 단백질이 최종적으로 얻어졌다.

[실시예 5]: 항원의 면역 및 혈청의 조제

녹농균은 PA 103 균주(ATCC29260)를 뮤라힌톤 한천 배지 상에서 하룻밤 37℃에서 배양하고, 수 개의 콜로니를 LB 배지에 현탁한 후, 하룻밤 37℃에서 진탕 배양하고, PBS로 세정, 재현탁한 후, 1%로 되도록 포르말린을 가하고, 24시간 이상 불활화 처리한 불활화 균을 사용하였다. PA4710 조환 단백질에 의한 면역은 100㎍/ml로 되도록 8M 요소 용액에 용해해서 이용하였다.

PA4710 단백질에서의 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역 중에 발견된 세포 외 영역의 아미노산 서열(서열번호:5 ~ 서열번호:15) 중, 서열번호:6 ~ 서열번호:15를 포함한 펩티드의 합성을, Fmoc을 이용하는 고상합성법(固相合成法)으로 실시하였다. 서열번호:6 ~ 서열번호:15의, 각 아미노산 서열의 아미노 말단에 시스테인 잔기를 부가하고, 카르복실 말단을 아미드화 펩티드(서열번호:25 ~ 서열번호:37)를 합성하였다.

4710 Loop2(서열번호:6)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710 L2(서열번호:25)는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 2446.199(계산치 m/z 2447.451)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 10.265분에 에리어 면적비 88.29%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop3(서열번호:7)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L3A(서열번호:26)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1587.823(계산치 m/z 1588.713)을 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 12.205분에 에리어 면적비 59.02%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop3(서열번호:7)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L3B(서열번호:27)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1461.256(계산치 m/z 1457.65)을 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 15.568분에 에리어 면적비 73.71%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop4(서열번호:8)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L4(서열번호:28)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 2683.446(계산치 m/z 2682.107)을 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 13.117분에 에리어 면적비 73.64%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop5(서열번호:9)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L5(서열번호:29)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 2335.175(계산치 m/z 2335.495)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 12.629분에 에리어 면적비 83.12%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop6(서열번호:10)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L6(서열번호:30)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1681.271(계산치 m/z 1679.824)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 9.656분에 에리어 면적비 73.45%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop7(서열번호:11)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L7(서열번호:31)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1731.422(계산치 m/z 1730.92)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 14.669분에 에리어 면적비 56.67%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop8(서열번호:12)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L8A(서열번호:32)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1337.108(계산치 m/z 1335.501)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 14.011분에 에리어 면적비 81.31%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop8(서열번호:12)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L8B(서열번호:33)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1037.734(계산치 m/z 1037.066)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 10.083분에 에리어 면적비 70.18%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop9(서열번호:13)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L9(서열번호:34)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1316.107(계산치 m/z 1315.426)을 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 11.011분에 에리어 면적비 70.61%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop10(서열번호:14)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L10 (서열번호:35)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1467.748(계산치 m/z 1465.514)을 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 13.276분에 에리어 면적비 65.81%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop11(서열번호:15)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L11A (서열번호:36)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1186.740(계산치 m/z 1184.244)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 12.609분에 에리어 면적비 55.14%의 피크를 부여하였다.

4710 Loop11(서열번호:15)의 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710L11B (서열번호: 37)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1258.403(계산치 m/z 1257.434)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 14.268분에 에리어 면적비 61.47%의 피크를 부여하였다.

세포 내 영역에 있는 아미노산 서열을 포함한 펩티드의 합성은 Fmoc를 이용하는 고상합성법을 이용하였다. 각 펩티드의 아미노산 서열의 아미노 말단에 시스테인 잔기를 부가하고, 카르복실 말단을 아미드화 한 펩티드를 합성하였다.

세포 외 영역 4710 Loop7(서열번호:11)과 4710 Loop8(서열번호:12)의 사이에 존재하는 세포 내 영역에 있는 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710A(서열번호: 38)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1110.919(계산치 m/z 1110.25)를 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 13.687분에 에리어 면적비 71.88%의 피크를 부여하였다.

세포 외 영역 4710 Loop9(서열번호:13)와 4710 Loop10(서열번호:14)의 사이에 존재하는 세포 내 영역에 있는 아미노산 서열을 포함한 합성 펩티드 4710C(서열번호:39)에서는, 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1107.356(계산치 m/z 1105.097)을 관측하고, HPLC 분석에서, 유지시간 10.992 분에 에리어 면적비 58.52%의 피크를 부여하였다.

그리고, 상기의 합성 펩티드에 스페이서를 매개로 Keyhole limpet hemocyanin(KLH)와 커플링시킨 콘쥬게이트 펩티드도 동시에 조제하였다. 스페이서로는 Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate: Pierce 사제)를 이용하였다. 한편, 펩티드 합성 및 그의 KLH 콘쥬게이트 펩티드의 조제는 hermo ELECTRON 사에 위탁하였다.

KLH 콘쥬게이트 펩티드에 의한 면역은, 각 KLH 콘쥬게이트 펩티드의 최종 농도가 83.3㎍/ml로 되도록 8M 요소 용액에 용해해서 이용하였다. 동물에 대한 면역 방법으로는 수컷 BN 랫(일본 챨스리버 사에서 구입) 또는 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼(일본 챨스리버 사에서 구입)의 피하 또는 근육 내에 초회(初回)만 프로인트 완전 애쥬번트와 함께, 2번째 이후는 불완전 애쥬번트와 함께 2주간 간격으로, 합계 6회 투여하였다. 포르말린 불활화 균, PA4710 조환 단백질은 각각 20㎍/animal, 각 KLH 콘쥬게이트 펩티드는 41.7㎍/animal로 면역되었다. 최종면역의 1주일 후, 경동맥 또는 복부대동맥으로부터 전채혈을 행하고, 실온 1시간 방치 후, 원심분리(1500G, 20분간)를 행하고, 상청을 항혈청으로 해서 랫 1마리 당 약 5ml, 토끼 1마리당 약 50ml를 얻었다.

[실시예 6]: 항혈청 및 복수로부터의 IgG 획분의 정제

랫 항혈청 및 복수로부터의 IgG 획분의 정제는 McCauley R&Racker, E; Molecular and Cellular Biochemistry 1, 73-81(1973)들의 유안(硫安) 침전을 이용한 방법(유안침전법)에 따랐다.

유안침전법에서는, 항혈청에 빙냉 포화황산암모늄 용액(pH8)을 43(v/v)%로 되도록 첨가하고, 얻어진 현탁액을 실온에서 15분간 교반하였다. 10,000×g에서 20분간 원심(遠心)함으로써 침전을 회수하고, 10% 글리세롤을 첨가한 10mM 인산칼륨 완충액(pH8)에 용해시킨 후, 빙냉 포화황산암모늄 용액(pH8)을 50(v/v)%로 되도록 첨가하여 재차 침전을 석출시켜줌으로써 2회 세정을 실행하였다. 침전을, 10% 글리세롤을 첨가한 l0mM 인산칼륨 완충액(pH8)에 용해하고, 이어 당해 완충액에 대해 하룻밤 투석(透析)하였다. 원심 후, 음이온 교환 크로마토그래피(DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH사제)에 첨가하여, 280nm의 자외선흡수를 측정함으로써 통과용적을 IgG 획분으로서 회수하였다. 최종 표품(標品)은, Amicon Ultra-15(Millipore)을 이용해서 농축하고, 최종적으로 PBS(-) 용액으로 교환하였다. PA4710 조환 단백질 면역 랫 항혈청 5ml로부터 정제를 실행하여, IgG 획분으로서 54mg의 단백질을 회수하였다. 얻어진 정제 IgG 획분을 항 PA4710 IgG로 명명하였다. 단백 정량은 Lowry법에 기해 DC Protein Assay(Bio-Rad사제), IgG의 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.

또 간이한 별개의 방법으로 Harlow&Lane, 288-318, Chapter 8, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor(1988) 등의 카프릴산을 이용한 방법을 사용하였다. 랫 항혈청 또는 랫-마우스 하이브리도마를 마우스 복강에서 증식시켜, 얻은 복수를 10,000×g에서 20분간 원심하여 불용물을 제거한 상청(上淸)에, 2용량의 60mM 초산나트륨(pH4.0)을 첨가한 후, 1N 염산으로 pH를 4.8로 조제하였다. 복수(腹水) 시료에 대해 0.06 용량의 카프릴산을 실온에서 서서히에 첨가하여 30분간 교반해서 불용물을 생성시켰다. 13.000×g에서 10분간 원심하여 침전을 제거한 후, 0.45㎛의 필터를 통과시켰다. 얻어진 시료는, Amicon Ultra-15(Millipore사제)을 이용해서 농축한 후, 최종적으로 PBS(-) 용액으로 교환하여 최종 표품으로 하였다. 랫 항혈청 10ml 또는 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-10970. FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974인 하이브리도마로부터 생산된 랫 MAb를 포함한 마우스 복수 llmL, 9mL, llmL, 40mL, 36mL로부터 정제를 실행하고, IgG 획분으로서 24mg, 6.5mg, 2.7mg, 4.5mg, 6.8mg, 5.2mg의 단백질을 회수하였다. 단백 정량은 Lowry법에 기해 DC Protein Assay(Bio-Rad사제), IgG의 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.

[실시예 7]: ELISA 시험

PA4710 조환 단백질에 결합하는 항체를 ELISA법으로 검출하기 위해, PA4710 조환 단백질을 8M 요소(尿素)를 첨가한 PBS에 용해하고, 96웰 니켈 플레이트(HIS-Select High Sensitivty(HS) Nickel Coated Plates, Sigma사제)에 웰 당 0.5㎍의 단백질을 넣고, 실온에서 1시간 두어 플레이트에 결합시켰다. 세정 버퍼(0.05% Tween 20, 5mM 이미다졸 및 500mM NaCl을 첨가한 PBS)로 세정하고, 블로킹 버퍼(0.5% 젤라틴을 첨가한 세정 버퍼)에서 블로킹한 후, 실시예 5 또는 6에서 얻어진 항체를 함유한 시료를 웰에 넣고, 30분간 반응 후 세정하고, 2차 항체(퍼옥시다제 표지 염소 항 랫 IgG 항체, 10000배 희석, Sigma사제)를 넣고, 30분간 반응 후에 세정하였다. 발색 기질(TMB Microwell Peroxidase Substrate System, KPL사제)을 첨가해서 반응 후, 1M 인산으로 효소반응을 정지시켜, 450nm의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청(10,000배 희석)의 흡광도는 0.676이었음에 대해, 음성대조(陰性對照)인 면역 전(前) 혈청(10,000배 희석)의 흡광도는 0.058이었다. 이는 PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청 중에, 면역원으로 한 PA4710 조환 단백질에 결합하는 항체가 함유되어 있음을 나타내고 있다.

또 합성 펩티드(서열번호:25 ~ 39)에 결합하는 항체를 ELISA 법으로 검출하기 위해, 합성 펩티드를 탄산 버퍼(0.15% Na₂CO₃, 0.3% NaHCO₃)에 용해하고, 96웰 플레이트(Maxisorp, Nunc사제)에 웰 당 1㎍의 펩티드를 넣고, 4℃에서 하룻밤 두어 플레이트에 흡착시켰다. PBS로 세정하고, 0.5% 우혈청 알부민을 첨가한 PBS로 블로킹한 후, 실시예 5 또는 6에서 얻어진 항체를 함유한 시료를 희석해서 웰에 넣고, 2시간 반응 후, 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 세정하였다. 2차 항체를 웰에 넣고 1시간 반응 후, 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 세정하였다. 상기와 마찬가지로 발색하고, 흡광도를 측정하였다. 결과는 뒤에 설명하는 실시예 9에 나타내어져 있다.

[실시예 8]: 전 세포(Whole cell) ELISA 시험

전 세포 ELISA는, LB 배지에서 배양한 PAl03 균주의 균액(菌液)을 ELISA 플레이트(Maxi Sorp type, Nunc사제)에 분주해서 4℃에서 고상화한 후, 세정 버퍼(0.05% Tween 20 함유 TBS)로 세정하고, 블로킹 버퍼(2% 우혈청 알부민 함유 TBS)에 의한 블로킹 후, 1차 항체 샘플로서, PBS로 희석한 실시예 5에서 얻어진 혈청 또는 정제 IgG 획분을 가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 세정한 후, 2차 항체로서 퍼옥시다제 표지 염소 항 랫 IgG 항체(5000배 희석, Sigma사제)를 이용하여, 발색 기질(TMB Microwell Peroxidase substrate System, KPL사제)을 첨가해서 반응 후, 0.18M 황산으로 효소반응을 정지시키고, 450nm의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청에 대해서는, 음성대조인 면역 전 랫 혈청(100배 희석)의 흡광도가 0.142이었음에 대해, PA4710 조환 단백질을 면역시킨 랫 혈청(100 배 희석)에서는 0.462이었다. 이는 PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청 중에, 균체 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(lgG)가 포함되어 있음을 나타내고 있다.

또, PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청으로부터 얻어진 정제 IgG 획분인 항 PA4710 IgG에 대해서는, 음성대조인 애쥬번트만을 투여해서 얻은 대조 랫 혈청으로부터 정제한 IgG 획분(50㎍/well)의 흡광도가 0.116이었음에 대해, 항 PA4710 IgG(50㎍/well)에서는, 0.377이었다. 이는 당해 IgG 획분 중에, 세포 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(lgG)가 포함되어 있음을 나타내고 있다.

[실시예 9]: 모노크로널 항체(MAb)의 제작

PA4710 조환 단백질 또는 KLH 콘쥬게이티드 펩티드의 실시예 5에서의 최종 면역의 1주일 후, 랫으로부터 마취 하에서 무균적으로 비장(脾臟)을 적출하였다. 얻어진 비장을 RPMI-1640 배지(Gibco사제)로 세정한 후, 슬라이드 글라스에 비장을 사이에 끼우고, 으깨어진 미소편(微小片)으로 시험에 제공될 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장 세포는 RPMI-1640 배지에서 l000rpm, 5분간 원심해서 세정하였다. 한편, 10% FCS(우태아 혈청)를 포함한 RPMI-1640 배지에서 5% CO₂, 상대습도 100%, 37℃에서 미리 배양해서 대수 증식기(對數增殖期)에 있는 미엘로마 세포(P3X63Ag8U1 세포)를 RPMI-1640 배지에서 원심 세정하고, 먼저 설명한 비장 세포와 미엘로마 세포의 비가 4:1이 되도록 혼합하였다. 혼합한 세포를 1000rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 버려 세포를 충분히 풀었다. 이 세포를 포함한 원심관에 폴리에틸렌글리콜(M.W.1000, 和光純藥社 제) 2g, RPMI-1640 배지 2mL 및 DMSO(나카라이테스크사제) 0.2mL로 이루어진 용액 1mL를 조용하게 가하고, 원심관을 천천히 회전시켜 세포를 혼합시켰다. 1분 후, 원심관을 천천히 회전시키면서 RPMI-1640 배지 15mL를 3 분에 걸쳐 가하였다. l000rpm에서 5분간 원심 후, 상청을 버리고 충분히 세포를 푼 후, 비장 세포로서 1.6 × 10⁶/mL로 되도록 HAT 배지(Gibco사제)로 조정하고, 96웰 마이크로 플레이트(스미토모 베이크라이트사제)에 0.2mL씩 분주(分株)하였다. 5% CO₂, 상대습도 100%, 37℃에서 약 1 ~ 2주간 배양 후, 웰 중에 생육하고 있는 하이브리도마가 현미경 하에서 관찰되었다.

(1) 목적 항체의 스크리닝

PA4710 조환 단백질 또는 PA4710 단백질의 추정 세포 외 영역(서열번호:5 ~ 15)에 결합하는 항체를 실시예 7에 기재한 ELISA법으로 검출하였다. 또, 녹농균의 세포 표면에 결합하는 항체를 실시예 8에 기재한 전 세포 ELISA 법으로 검출하였다.

(2) 목적 항체 생산 세포의 클로닝

스크리닝의 결과, 목적 항체를 생산하고 있다고 판정된 하이브리도마를 5개/0.2mL 또는 20개/0.2mL로 되도록 BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement(Roche Diagnostics사제)를 5% 함유한 10% FCS/HT(Gibco사제) 배지에서 조정하고, 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 0.2mL 씩 분주해서 배양하였다. 1 ~ 2주간 후에 클론의 생육이 현미경 하에서 관찰될 수 있었다. 스크리닝의 항에서 설명한 방법으로 분석하여, 목적 항체를 생산하고 있는 클론을 선택하였다. 재차 상기의 방법으로 하이브리도마로서 1개/0.2mL 또는 2개/0.2mL로 되도록 BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement를 5% 함유한 10% FCS/HT(Gibco사제) 배지에서 조 정한 하이브리도마를, 각 웰에 0.2mL씩 분주하였다. 1 ~ 2주간 후에 스크리닝 항에서 설명한 방법으로 분석하여 목적하는 항체를 생산하는 단(單) 클론을 선택하여, 일본 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-10970. FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974인 하이브리도마를 얻었다.

(3) 인 비트로(in vitro)에서의 세포의 배양 및 MAb의 생산

96웰 마이크로 플레이트에서 충분히 증식시킨 목적 클론은 48웰 플레이트, 12웰 플레이트, 50mL, 250mL 플라스크에 서서히 스케일 업 하여 10% FCS-RPMI 배지에서 배양하였다. 이와 같이 해서 얻어진 세포의 배양 상청에 생산되어 있는 MAb를 실시예 7에 기재한 ELISA법으로 검출하였다.

그 결과, 세포 외 영역인 4710 Loop3(서열번호:7)에 함유되는 실시예 5의 합성 펩티드 4710 3A(서열번호:26)를 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도가, 음성대조인 10% FCS-RPMI 배지에서는 0.078이었는데 대해, 일본 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-10971인 하이브리도마의 배양 상청은, 흡광도가 1.382이었다. 세포 외 영역인 4710 Loop7(서열번호:11)에 함유되는 실시예 5의 합성 펩티드 4710 L7(서열번호:31)을 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도가, 11% FCS-RPMI 배지에서는 0.097이었는데 대해, 수탁번호 FERM BP-10972에서는 하이브리도마의 배양 상청은, 흡광도가 0.637이었다. 또, 세포 외 영역인 4710 Loop8(서열번호: 12)에 함유되는 실시예 5의 합성 펩티드 4710 L8A(서열번호:38)를 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도가, 10% FCS-RPMI 배지에서는 0.071이었는데 대해, 수탁번호 FERM BP-10970인 하이브리도마의 배양 상청은, 흡광도가 1.211이었다. 그리고, 수탁번호 FERM P-21205인 하이브리도마의 배양 상청은, 세포 외 영역인 4710 Loop8(서열번호:12)에 함유되는 실시예 5의 합성 펩티드 4710 L8B(서열번호:33)를 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도가 0.497이었는데 대해, 4710 L8B 이외의 펩티드(서열번호:25 ~ 서열번호:32, 서열번호:34 ~ 서열번호:39)를 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도는 0.060 ~ 0.088이었다. 수탁번호 FERM BP-10974인 하이브리도마의 배양 상청은, 세포 외 영역인 4710 Loop10(서열번호:14)에 함유되는 실시예 5의 합성 펩티드 4710 L10(서열번호:35)를 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도가 0.810이었는데 대해, 4710 L10 이외의 펩티드(서열번호:25 ~ 서열번호:34, 서열번호:36 ~ 서열번호:39)를 흡착한 웰로의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도는 0.061 ~ 0.085이었다. 이상의 결과로부터, 각각의 펩티드에 결합되는 MAb가 생산되어 있음이 분명해졌다.

(4) 인 비보(in vivo)에서의 세포의 복수화 및 MAb의 생산

BALB/c-nu/nu 마우스(일본 챨스리버사로부터 구입)에 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10970. FERM BP-10973, FERM BP-10974인 하이브리도마를 1 x 10⁷/mouse로 되도록 복강 내 투여하고, 1 ~ 2주간 후에 복수를 채취하였다. 복수 중에 함유되는 MAb는 실시예 6에 기재한 방법으로 정제하고, 얻어진 정제 IgG 획분을 각각, 항 4710 L3A IgG(MAb), 항 4710 L7 IgG(MAb), 항 4710 L8A IgG(MAb), 항 4710 L8B IgG(MAb), 항 4710 L10 IgG(MAb)로 명명하였다. 이 랫 MAb의 IgG의 서브 클라스는, 모노크로널 항체 아이소타이핑 키트(RMT1, 다이니폰세이야쿠사제)에 의해 중쇄(重鎖) 및 경쇄(輕鎖)를 판정한 결과, 중쇄는 각각 IgG1, IgG2a, IgG1, IgG2b, IgG2b 이고, 경쇄는 모두 κ로 판정되었다.

실시예 6에 기재된 방법으로 마우스 복수로부터 정제한 상기 MAb의 녹농균 표면에의 결합을, 실시예 8에 기재된 전 세포 ELISA에서 확인하였다.

항 4710 L7 IgG(MAb)의 결과: 수탁번호가 FERM BP-10972인 하이브리도마를 투여한 마우스 복수로부터 정제하여 얻은 IgG 획분인 항 4710 L7 IgG(MAb)의 흡광도가 0.601이었는데 대해, 음성대조인 애쥬번트만을 투여해서 얻은 대조 랫 혈청으로부터 정제한 IgG 획분(50㎍/well)의 흡광도는 0.280이었다. 이 결과로부터, 당해 IgG 획분 중에, 세포 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(lgG)가 포함되어 있음이 분명해졌다.

항 4710 L8B IgG(MAb)의 결과: 수탁번호가 FERM BP-10973인 하이브리도마를 투여한 마우스 복수로부터 정제하여 얻은 IgG 획분인 항 4710 L8B IgG(MAb)의 흡광도가, 0.530이었는데 대해, 음성 대조인 애쥬번트만을 투여해서 얻은 대조 랫 혈청으로부터 정제한 IgG 획분(50㎍/well)의 흡광도는 0.244이었다. 이 결과로부터, 당해 IgG 획분 중에, 세포 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(IgG)가 포함되어 있음이 분명해졌다.

항 4710 L10 IgG(MAb)의 결과: 수탁번호가 FERM BP-10974인 하이브리도마를 투여한 마우스 복수로부터 정제하여 얻은 IgG 획분인 항 4710 L10 IgG(MAb)의 흡광도가 0.435이었는데 대해, 음성 대조인 애쥬번트만을 투여하고 얻은 대조 랫 혈청으로부터 정제한 IgG 획분(50㎍/well)의 흡광도는 0.092이었다. 이 결과로부터, 당해 IgG 획분 중에, 세포 표면에 노출되는 PA4710 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(IgG)가 포함되어 있음이 분명해졌다.

[실시예 10] 정상 마우스에서의 PA103 균주 전신감염에 대한 PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청의 감염 방어능

정상 마우스 전신감염 모델에서의 평가는, 4주령의 CD-1 마우스(일본 챨스리버사로부터 구입)에 5% 무틴 함유 생리식염수 500㎕에 현탁한 PAl03 균주의 생균 10 x 10⁵ cfu/마우스(20LD₅₀)을 복강 내에 투여하고, 직후에 생리식염수로 2.5배 희석한 혈청 샘플을 0.1mL/마우스로 꼬리 정맥으로부터 투여해서, 7일 후의 생사로 감염방어활성을 판정하였다.

그 결과, 음성대조의 랫 sham 혈청에서는 7마리 중 5마리의 마우스가 사망하였으나, 포르말린 불활성화 PA103 균주를 면역한 토끼 혈청 투여군에서는 모든 예가 생존하여, 감염방어활성이 인정되었다. 이 조건 하에서, PA4710 조환 단백질 면역 랫 혈청 투여군은 7마리 중 6마리 생존하여, 감염방어활성이 인정되었다.

[실시예 11] 호중구 감소 마우스에서의 PA103 균주 전신감염에 대한 PA4710 모노크로널 항체의 감염 방어능

호중구 감소 마우스 전신감염 모델에서의 평가는, 사이클로포스파미 드(cyclophosphamide: 이하, CY로 한다. Sigma-Aldrich사제)의 12.5mg/mL(생리식염수)를 조제하여, 4주령의 CD-1 수컷 마우스에 125mg/kg의 투여량으로 day-5, -2, 0으로 합계 3회 복강 내 투여해서 말초혈중의 호중구를 감소시켰다. 그 후, 생리식염수 250㎕에 현탁한 PA103 균주의 1.8 x 10⁵ cfu/마우스(133LD₅₀)을 복강 내에 접종하고, 직후에 생리식염수로 희석한 샘플(혈청 및 정제 IgG 획분)을 0.2mL/마우스로 꼬리 정맥으로부터 투여하고, 7일 후의 생사로 감염방어활성을 판정하였다.

그 결과, 정제 혈청 IgG 획분을 샘플로 한 경우(0.5mg/mouse), 음성대조인 랫 sham IgG 투여군은 7마리 중 6마리의 마우스가 사망하고 생존은 1마리만이었지만, 포르말린 불활성화 PA103 균주 면역 혈청으로부터 얻어진 항 PA103 IgG 투여군에서는 7마리 중 5마리가 생존하여, 감염방어활성이 인정되었다. 이 조건 하에서, 실시예 9에서 얻어진 랫 MAb인 항 4710 L7 IgG(MAb) 및 항 4710 L8B IgG(MAb) 투여군은, 7마리중 각각 4 및 5마리 생존하여, 감염방어활성이 인정되었다.

[실시예 12]: 호중구 감소 마우스에서의 다제 내성 녹농균 전신감염에 대한 정제 혈청 IgG 획분 및 모노크로널 항체의 감염 방어능

다제 내성 녹농균 MSC06120 균주에 대한 각종 항균제의 최소발육저지농도는, 이미페넴:32㎍/ml, 아미카신:64㎍/ml, 시프로프록사신:>256㎍/ml이었다. 본 균주를 이용한 호중구 감소 마우스 전신감염 모델에서의 평가는, CY의 12.5mg/mL(생리식염수)를 조제하고, 4주령의 CD-1 수컷 마우스에 125mg/kg의 투여량으로 day-5, -2, 0으로 합계 3회 복강 내 투여해서 말초혈중의 호중구를 감소시키고, 그 후, 생리식 염수 250㎕에 현탁한 MSC06120 균주의 1.73 x 10⁵ cfu/마우스(15.5LD₅₀)를 복강 내에 접종하고, 직후에 생리식염수로 희석한 샘플을 0.2mL/마우스로 꼬리 정맥으로부터 투여하고, 7일 후의 생사로 감염방어활성을 판정하였다.

그 결과, 정제 혈청 IgG 획분 및 모노크로널 항체를 샘플로 한 경우(0.5mg/mouse), 음성대조인 랫 sham IgG 투여군은 7마리 중 4마리의 마우스가 사망하고 생존은 3마리였지만, 포르말린 불활성화 PA103 균주 면역 혈청으로부터 얻어진 항 PA103 IgG 투여군에서는 7마리 중 4마리가 생존하였다. 이 조건 하에서, 실시예 6에서 얻어진 항 4710 IgG 및 실시예 9에서 얻어진 랫 MAb인 항 4710 L10 IgG(MAb) 투여군은, 7마리 중 각각 6 및 5마리 생존하여, 감염방어활성이 인정되었다.

본 발명은, 녹농균 감염증을 실질적으로 예방 또는 치료하는 능력을 갖고, 또는 녹농균 감염증 환자 유래의 임상분리주의 다양성에 대응하는 백신 조성물 및 폴리크로널 항체(이하, PAb라 기재함) 또는 모노크로널 항체(이하, MAb라 기재함)를 제공하는 것으로, 녹농균 감염증의 예방 또는 치료제, 또는 녹농균 감염증 진단약에의 응용을 가능하게 하는 것이다.

그리고 본 발명의 항체는, 녹농균의 외막 내지는 세포 외에 존재하는 PA4710 단백질의 세포 외 영역과 결합하고, 더구나 이들 영역은, 혈청형 등에 의하지 않고 균주 사이에서의 보존성이 극히 높아 다양한 임상분리주와 반응한다고 생각될 수 있는 때문에, 녹농균 감염증에 대해 높은 치료효과가 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> Meiji Seika Kaisha Ltd. <120> Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein PA4710 <130> PM1904 <150> JP 2007-171680 <151> 2007-07-29 <160> 39 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2295 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 atgccgctct ccccgccctt cgccctgcgc ccctgcctgg ccctgctgtt gctcagccct 60 tccctggccc tggcggggaa cgccgtcccg ctgaccccga ccaccatcac cgccacccgt 120 accgagcagg cagtggattc ggtgccaagc accgtcagcg tgcagacccg cgaacaactg 180 gaccggcaga acgtcaacaa catcaaggaa ctggtgcgct acgaaccggg agtctcggtc 240 ggcggcgccg gccagcgtgc cgggatcacc ggctacaaca tccgcggcat cgacgggaac 300 cgcatcctta cgcagatcga cggggtcgaa ctgcccaacg acttcttcag cggcccctac 360 gcgcagaccc accgcaacta cgtcgatccg gacatcgtaa agcgcgtgga gatccttcgc 420 ggcccggcct cggcgctgta cggcagcaac gccatcggcg gcgcggtgag ctacttcacc 480 ctcgacccgt cggacatcat caaggacggc aaggacgtcg gcgcccggct gaaggccggc 540 tacgagtcgg ccagccactc ctggttgacc tcggccaccg tcgccggccg cgccgacgac 600 ttcgacggcc tgctgcatta tggctaccgc cagggccacg agaccgaatc caacggcggc 660 cacggcggca ccgggctctc gcgcagcgaa gccaacccgg aagacgccga cagctacagc 720 ctgctcggca agctgggctg gaactacgcc gagggcagcc gcttcgggct ggtcttcgag 780 aagtacaaga gcgacgtcga taccgaccag aagagcgcct atggcggccc gtacgacaag 840 ggcaagccgg ccatcccgcc gagcatgctg ccgggcggca tgtaccagtg gcgcaagggc 900 aacgacaccc tgactcgcga gcgctacggc ctggagcacc atttcctgct cgacagccag 960 gtcgccgatc gcatccagtg gagcctgaac taccagttgg cgaagaccga ccaggcgacc 1020 cgcgagttct actacccgat cacccgcaag gtcctgcgca cccgcgacac tacctacaag 1080 gaacgcctgt gggtcttcga cagccagttg gacaagagct tcgccatcgg cgagaccgag 1140 cacctgctga gctacgggat caatctcaag caccagaagg tcaccggcat gcgcagcggc 1200 accggcacca acctggacac cggcgcggac agcccgcgcg atgccctgga acgcagcagc 1260 gactttcccg atccgacggt gaagacctac gccctgttcg cccaggacag catcagctgg 1320 aacgactgga ccttcactcc cggcctgcgt tacgactaca cgcgcatgga gccgcacatc 1380 accgacgagt tcctgcgcac catgaagcag agccagaaca ccgcggtcga cgagtcggac 1440 aagaaatggc accgggtttc gcccaagttc ggcgtgacct acgacttcgc ccagcactac 1500 acctggtacg gccaatacgc ccagggcttc cgcacgccca ccgccaaggc gctgtacggt 1560 cgattcgaga acctgcaggc gggctaccac atcgagccta accccaacct caagccggaa 1620 aagagccaga gcttcgagac cgggttgcgc ggcaagttcg acgaaggcag cttcggtgta 1680 gcggtgttct acaacaaata tcgcgacttc atcgacgaag acgccctgaa taccgatagc 1740 accggcggca acggccagac cttccagtcc aacaacatcg agcgggcggt gatcaagggc 1800 gtcgagctca agggccgcct ggagctgggc gccttcggcg cgccgcaggg gctctacacc 1860 cagggcagcg tggcctacgc ctacggtcgc aacaaggaca acggcgagcc gatcaacagc 1920 gtcaacccac tcaccggagt gttcggcctg ggctacgacg aagcagacgg caactacggc 1980 gggctgctca gctggaccct ggtcaaacgc aaggatcgcg tcgacgacag caccttccac 2040 accccggatg gcaccgccag ccagttcaag accccgggct tcggcgtcct cgacctcagc 2100 gcctactaca ggctgagcaa ggacctgacc ctcaacgccg gtctctacaa cctgaccgac 2160 aagaaatact ggctgtggga tgacgtgcgc ggctacgaca gcgtcggcga ggcttcggcg 2220 ctggccccgg ccaacatcga ccgactgtcc cagccaggcc gcaatttcgc ggtcaacctg 2280 gtctgggaca tctga 2295 <210> 2 <211> 1755 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 tacgagtcgg ccagccactc ctggttgacc tcggccaccg tcgccggccg cgccgacgac 60 ttcgacggcc tgctgcatta tggctaccgc cagggccacg agaccgaatc caacggcggc 120 cacggcggca ccgggctctc gcgcagcgaa gccaacccgg aagacgccga cagctacagc 180 ctgctcggca agctgggctg gaactacgcc gagggcagcc gcttcgggct ggtcttcgag 240 aagtacaaga gcgacgtcga taccgaccag aagagcgcct atggcggccc gtacgacaag 300 ggcaagccgg ccatcccgcc gagcatgctg ccgggcggca tgtaccagtg gcgcaagggc 360 aacgacaccc tgactcgcga gcgctacggc ctggagcacc atttcctgct cgacagccag 420 gtcgccgatc gcatccagtg gagcctgaac taccagttgg cgaagaccga ccaggcgacc 480 cgcgagttct actacccgat cacccgcaag gtcctgcgca cccgcgacac tacctacaag 540 gaacgcctgt gggtcttcga cagccagttg gacaagagct tcgccatcgg cgagaccgag 600 cacctgctga gctacgggat caatctcaag caccagaagg tcaccggcat gcgcagcggc 660 accggcacca acctggacac cggcgcggac agcccgcgcg atgccctgga acgcagcagc 720 gactttcccg atccgacggt gaagacctac gccctgttcg cccaggacag catcagctgg 780 aacgactgga ccttcactcc cggcctgcgt tacgactaca cgcgcatgga gccgcacatc 840 accgacgagt tcctgcgcac catgaagcag agccagaaca ccgcggtcga cgagtcggac 900 aagaaatggc accgggtttc gcccaagttc ggcgtgacct acgacttcgc ccagcactac 960 acctggtacg gccaatacgc ccagggcttc cgcacgccca ccgccaaggc gctgtacggt 1020 cgattcgaga acctgcaggc gggctaccac atcgagccta accccaacct caagccggaa 1080 aagagccaga gcttcgagac cgggttgcgc ggcaagttcg acgaaggcag cttcggtgta 1140 gcggtgttct acaacaaata tcgcgacttc atcgacgaag acgccctgaa taccgatagc 1200 accggcggca acggccagac cttccagtcc aacaacatcg agcgggcggt gatcaagggc 1260 gtcgagctca agggccgcct ggagctgggc gccttcggcg cgccgcaggg gctctacacc 1320 cagggcagcg tggcctacgc ctacggtcgc aacaaggaca acggcgagcc gatcaacagc 1380 gtcaacccac tcaccggagt gttcggcctg ggctacgacg aagcagacgg caactacggc 1440 gggctgctca gctggaccct ggtcaaacgc aaggatcgcg tcgacgacag caccttccac 1500 accccggatg gcaccgccag ccagttcaag accccgggct tcggcgtcct cgacctcagc 1560 gcctactaca ggctgagcaa ggacctgacc ctcaacgccg gtctctacaa cctgaccgac 1620 aagaaatact ggctgtggga tgacgtgcgc ggctacgaca gcgtcggcga ggcttcggcg 1680 ctggccccgg ccaacatcga ccgactgtcc cagccaggcc gcaatttcgc ggtcaacctg 1740 gtctgggaca tctga 1755 <210> 3 <211> 764 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 3 Met Pro Leu Ser Pro Pro Phe Ala Leu Arg Pro Cys Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ser Pro Ser Leu Ala Leu Ala Gly Asn Ala Val Pro Leu Thr 20 25 30 Pro Thr Thr Ile Thr Ala Thr Arg Thr Glu Gln Ala Val Asp Ser Val 35 40 45 Pro Ser Thr Val Ser Val Gln Thr Arg Glu Gln Leu Asp Arg Gln Asn 50 55 60 Val Asn Asn Ile Lys Glu Leu Val Arg Tyr Glu Pro Gly Val Ser Val 65 70 75 80 Gly Gly Ala Gly Gln Arg Ala Gly Ile Thr Gly Tyr Asn Ile Arg Gly 85 90 95 Ile Asp Gly Asn Arg Ile Leu Thr Gln Ile Asp Gly Val Glu Leu Pro 100 105 110 Asn Asp Phe Phe Ser Gly Pro Tyr Ala Gln Thr His Arg Asn Tyr Val 115 120 125 Asp Pro Asp Ile Val Lys Arg Val Glu Ile Leu Arg Gly Pro Ala Ser 130 135 140 Ala Leu Tyr Gly Ser Asn Ala Ile Gly Gly Ala Val Ser Tyr Phe Thr 145 150 155 160 Leu Asp Pro Ser Asp Ile Ile Lys Asp Gly Lys Asp Val Gly Ala Arg 165 170 175 Leu Lys Ala Gly Tyr Glu Ser Ala Ser His Ser Trp Leu Thr Ser Ala 180 185 190 Thr Val Ala Gly Arg Ala Asp Asp Phe Asp Gly Leu Leu His Tyr Gly 195 200 205 Tyr Arg Gln Gly His Glu Thr Glu Ser Asn Gly Gly His Gly Gly Thr 210 215 220 Gly Leu Ser Arg Ser Glu Ala Asn Pro Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Ser 225 230 235 240 Leu Leu Gly Lys Leu Gly Trp Asn Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Phe Gly 245 250 255 Leu Val Phe Glu Lys Tyr Lys Ser Asp Val Asp Thr Asp Gln Lys Ser 260 265 270 Ala Tyr Gly Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Lys Pro Ala Ile Pro Pro Ser 275 280 285 Met Leu Pro Gly Gly Met Tyr Gln Trp Arg Lys Gly Asn Asp Thr Leu 290 295 300 Thr Arg Glu Arg Tyr Gly Leu Glu His His Phe Leu Leu Asp Ser Gln 305 310 315 320 Val Ala Asp Arg Ile Gln Trp Ser Leu Asn Tyr Gln Leu Ala Lys Thr 325 330 335 Asp Gln Ala Thr Arg Glu Phe Tyr Tyr Pro Ile Thr Arg Lys Val Leu 340 345 350 Arg Thr Arg Asp Thr Thr Tyr Lys Glu Arg Leu Trp Val Phe Asp Ser 355 360 365 Gln Leu Asp Lys Ser Phe Ala Ile Gly Glu Thr Glu His Leu Leu Ser 370 375 380 Tyr Gly Ile Asn Leu Lys His Gln Lys Val Thr Gly Met Arg Ser Gly 385 390 395 400 Thr Gly Thr Asn Leu Asp Thr Gly Ala Asp Ser Pro Arg Asp Ala Leu 405 410 415 Glu Arg Ser Ser Asp Phe Pro Asp Pro Thr Val Lys Thr Tyr Ala Leu 420 425 430 Phe Ala Gln Asp Ser Ile Ser Trp Asn Asp Trp Thr Phe Thr Pro Gly 435 440 445 Leu Arg Tyr Asp Tyr Thr Arg Met Glu Pro His Ile Thr Asp Glu Phe 450 455 460 Leu Arg Thr Met Lys Gln Ser Gln Asn Thr Ala Val Asp Glu Ser Asp 465 470 475 480 Lys Lys Trp His Arg Val Ser Pro Lys Phe Gly Val Thr Tyr Asp Phe 485 490 495 Ala Gln His Tyr Thr Trp Tyr Gly Gln Tyr Ala Gln Gly Phe Arg Thr 500 505 510 Pro Thr Ala Lys Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Glu Asn Leu Gln Ala Gly 515 520 525 Tyr His Ile Glu Pro Asn Pro Asn Leu Lys Pro Glu Lys Ser Gln Ser 530 535 540 Phe Glu Thr Gly Leu Arg Gly Lys Phe Asp Glu Gly Ser Phe Gly Val 545 550 555 560 Ala Val Phe Tyr Asn Lys Tyr Arg Asp Phe Ile Asp Glu Asp Ala Leu 565 570 575 Asn Thr Asp Ser Thr Gly Gly Asn Gly Gln Thr Phe Gln Ser Asn Asn 580 585 590 Ile Glu Arg Ala Val Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Gly Arg Leu Glu 595 600 605 Leu Gly Ala Phe Gly Ala Pro Gln Gly Leu Tyr Thr Gln Gly Ser Val 610 615 620 Ala Tyr Ala Tyr Gly Arg Asn Lys Asp Asn Gly Glu Pro Ile Asn Ser 625 630 635 640 Val Asn Pro Leu Thr Gly Val Phe Gly Leu Gly Tyr Asp Glu Ala Asp 645 650 655 Gly Asn Tyr Gly Gly Leu Leu Ser Trp Thr Leu Val Lys Arg Lys Asp 660 665 670 Arg Val Asp Asp Ser Thr Phe His Thr Pro Asp Gly Thr Ala Ser Gln 675 680 685 Phe Lys Thr Pro Gly Phe Gly Val Leu Asp Leu Ser Ala Tyr Tyr Arg 690 695 700 Leu Ser Lys Asp Leu Thr Leu Asn Ala Gly Leu Tyr Asn Leu Thr Asp 705 710 715 720 Lys Lys Tyr Trp Leu Trp Asp Asp Val Arg Gly Tyr Asp Ser Val Gly 725 730 735 Glu Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Asn Ile Asp Arg Leu Ser Gln Pro 740 745 750 Gly Arg Asn Phe Ala Val Asn Leu Val Trp Asp Ile 755 760 <210> 4 <211> 584 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 4 Tyr Glu Ser Ala Ser His Ser Trp Leu Thr Ser Ala Thr Val Ala Gly 1 5 10 15 Arg Ala Asp Asp Phe Asp Gly Leu Leu His Tyr Gly Tyr Arg Gln Gly 20 25 30 His Glu Thr Glu Ser Asn Gly Gly His Gly Gly Thr Gly Leu Ser Arg 35 40 45 Ser Glu Ala Asn Pro Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Ser Leu Leu Gly Lys 50 55 60 Leu Gly Trp Asn Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Phe Gly Leu Val Phe Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Ser Asp Val Asp Thr Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Gly Gly 85 90 95 Pro Tyr Asp Lys Gly Lys Pro Ala Ile Pro Pro Ser Met Leu Pro Gly 100 105 110 Gly Met Tyr Gln Trp Arg Lys Gly Asn Asp Thr Leu Thr Arg Glu Arg 115 120 125 Tyr Gly Leu Glu His His Phe Leu Leu Asp Ser Gln Val Ala Asp Arg 130 135 140 Ile Gln Trp Ser Leu Asn Tyr Gln Leu Ala Lys Thr Asp Gln Ala Thr 145 150 155 160 Arg Glu Phe Tyr Tyr Pro Ile Thr Arg Lys Val Leu Arg Thr Arg Asp 165 170 175 Thr Thr Tyr Lys Glu Arg Leu Trp Val Phe Asp Ser Gln Leu Asp Lys 180 185 190 Ser Phe Ala Ile Gly Glu Thr Glu His Leu Leu Ser Tyr Gly Ile Asn 195 200 205 Leu Lys His Gln Lys Val Thr Gly Met Arg Ser Gly Thr Gly Thr Asn 210 215 220 Leu Asp Thr Gly Ala Asp Ser Pro Arg Asp Ala Leu Glu Arg Ser Ser 225 230 235 240 Asp Phe Pro Asp Pro Thr Val Lys Thr Tyr Ala Leu Phe Ala Gln Asp 245 250 255 Ser Ile Ser Trp Asn Asp Trp Thr Phe Thr Pro Gly Leu Arg Tyr Asp 260 265 270 Tyr Thr Arg Met Glu Pro His Ile Thr Asp Glu Phe Leu Arg Thr Met 275 280 285 Lys Gln Ser Gln Asn Thr Ala Val Asp Glu Ser Asp Lys Lys Trp His 290 295 300 Arg Val Ser Pro Lys Phe Gly Val Thr Tyr Asp Phe Ala Gln His Tyr 305 310 315 320 Thr Trp Tyr Gly Gln Tyr Ala Gln Gly Phe Arg Thr Pro Thr Ala Lys 325 330 335 Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Glu Asn Leu Gln Ala Gly Tyr His Ile Glu 340 345 350 Pro Asn Pro Asn Leu Lys Pro Glu Lys Ser Gln Ser Phe Glu Thr Gly 355 360 365 Leu Arg Gly Lys Phe Asp Glu Gly Ser Phe Gly Val Ala Val Phe Tyr 370 375 380 Asn Lys Tyr Arg Asp Phe Ile Asp Glu Asp Ala Leu Asn Thr Asp Ser 385 390 395 400 Thr Gly Gly Asn Gly Gln Thr Phe Gln Ser Asn Asn Ile Glu Arg Ala 405 410 415 Val Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Gly Arg Leu Glu Leu Gly Ala Phe 420 425 430 Gly Ala Pro Gln Gly Leu Tyr Thr Gln Gly Ser Val Ala Tyr Ala Tyr 435 440 445 Gly Arg Asn Lys Asp Asn Gly Glu Pro Ile Asn Ser Val Asn Pro Leu 450 455 460 Thr Gly Val Phe Gly Leu Gly Tyr Asp Glu Ala Asp Gly Asn Tyr Gly 465 470 475 480 Gly Leu Leu Ser Trp Thr Leu Val Lys Arg Lys Asp Arg Val Asp Asp 485 490 495 Ser Thr Phe His Thr Pro Asp Gly Thr Ala Ser Gln Phe Lys Thr Pro 500 505 510 Gly Phe Gly Val Leu Asp Leu Ser Ala Tyr Tyr Arg Leu Ser Lys Asp 515 520 525 Leu Thr Leu Asn Ala Gly Leu Tyr Asn Leu Thr Asp Lys Lys Tyr Trp 530 535 540 Leu Trp Asp Asp Val Arg Gly Tyr Asp Ser Val Gly Glu Ala Ser Ala 545 550 555 560 Leu Ala Pro Ala Asn Ile Asp Arg Leu Ser Gln Pro Gly Arg Asn Phe 565 570 575 Ala Val Asn Leu Val Trp Asp Ile 580 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 5 Glu Ser Ala Ser His Ser 1 5 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 6 Gly His Glu Thr Glu Ser Asn Gly Gly His Gly Gly Thr Gly Leu Ser 1 5 10 15 Arg Ser Glu Ala Asn Pro Glu Asp Ala Asp Ser Tyr 20 25 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 7 Asp Val Asp Thr Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Gly Gly Pro Tyr Asp Lys 1 5 10 15 Gly Lys Pro Ala Ile Pro Pro Ser Met Leu Pro Gly Gly Met Tyr Gln 20 25 30 Trp Arg Lys Gly Asn Asp Thr Leu 35 40 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 8 Thr Asp Gln Ala Thr Arg Glu Phe Tyr Tyr Pro Ile Thr Arg Lys Val 1 5 10 15 Leu Arg Thr Arg Asp Thr Thr Tyr Lys Glu Arg 20 25 <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 9 Gly Met Arg Ser Gly Thr Gly Thr Asn Leu Asp Thr Gly Ala Asp Ser 1 5 10 15 Pro Arg Asp Ala Leu Glu Arg Ser Ser Asp Phe Pro Asp Pro Thr Val 20 25 30 Lys <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 10 Ile Thr Asp Glu Phe Leu Arg Thr Met Lys Gln Ser Gln Asn Thr Ala 1 5 10 15 Val Asp Glu Ser Asp Lys Lys Trp His Arg Val 20 25 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 11 Tyr Gly Arg Phe Glu Asn Leu Gln Ala Gly Tyr His Ile Glu Pro Asn 1 5 10 15 Pro Asn Leu Lys Pro Glu 20 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 12 Tyr Asn Lys Tyr Arg Asp Phe Ile Asp Glu Asp Ala Leu Asn Thr Asp 1 5 10 15 Ser Thr Gly Gly Asn Gly Gln 20 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 13 Gly Arg Asn Lys Asp Asn Gly Glu Pro Ile Asn Ser Val Asn Pro Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 14 Asp Ser Thr Phe His Thr Pro Asp Gly Thr Ala Ser Gln Phe Lys Thr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 15 Asp Asp Val Arg Gly Tyr Asp Ser Val Gly Glu Ala Ser Ala Leu Ala 1 5 10 15 Pro Ala Asn Ile Asp Arg Leu Ser Gln Pro Gly Arg Asn 20 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gggaaaggct gggagtgctg ctcat 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtggatcatg ggcgctccgt ttgcc 25 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atgctgccgg gcggcatgta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 catggagccg cacatcaccg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tacacccagg gcagcgtggc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gacccaccgc aactacgtcg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gccgtccttg atgatgtccg 20 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gactctcgag tacgagtcgg ccagccact 29 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gactggatcc tcagatgtcc cagaccaggt t 31 <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 25 Cys Thr Glu Ser Asn Gly Gly His Gly Gly Thr Gly Leu Ser Arg Ser 1 5 10 15 Glu Ala Asn Pro Glu Asp Ala Asp Ser 20 25 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 26 Cys Thr Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Gly Gly Pro Tyr Asp Lys Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 27 Cys Gly Met Tyr Gln Trp Arg Lys Gly Asn Asp Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 28 Cys Glu Phe Tyr Tyr Pro Ile Thr Arg Lys Val Leu Arg Thr Arg Asp 1 5 10 15 Thr Thr Tyr Lys Glu 20 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 29 Cys Thr Gly Ala Asp Ser Pro Arg Asp Ala Leu Glu Arg Ser Ser Asp 1 5 10 15 Phe Pro Asp Pro Thr Val 20 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 30 Cys Lys Gln Ser Gln Asn Thr Ala Val Asp Glu Ser Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 31 Cys Phe Glu Asn Leu Gln Ala Gly Tyr His Ile Glu Pro Asn Pro 1 5 10 15 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 32 Cys Tyr Asn Lys Tyr Arg Asp Phe Ile Asp 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 33 Cys Leu Asn Thr Asp Ser Thr Gly Gly Asn Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 34 Cys Gly Arg Asn Lys Asp Asn Gly Glu Pro Ile Asn 1 5 10 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 35 Cys Asp Ser Thr Phe His Thr Pro Asp Gly Thr Ala Ser Gln 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 36 Cys Asp Asp Val Arg Gly Tyr Asp Ser Val Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 37 Cys Asn Ile Asp Arg Leu Ser Gln Pro Gly Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 38 Cys Leu Arg Gly Lys Phe Asp Glu Gly Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 39 Cys Tyr Asp Glu Ala Asp Gly Asn Tyr Gly 1 5 10

Claims

이하의 (i), (ii), (iii), 및 (iv)로부터 선택되는 단백질:

(i) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질;

(ii) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질;

(iii) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질; 및

(iv) 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열번호:4로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질.
서열번호:3으로 나타나는 아미노산 서열에서의, 181위에서 198위, 204위에서 257위, 259위에서 311위, 313위에서 319위, 321위에서 436위, 440위에서 491위, 493위에서 600위, 602위에서 764위로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이고, 또한 녹농균의 표면으로부터 노출되어 있는 펩티드 영역을 코드하는 펩티드.
제2항에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
서열번호:5 내지 15 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제4항에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 보존적 치환을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제2항에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제3항에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제4항에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제5항에 기재된 펩티드의 아미노산 서열에서의 연속하는 적어도 7개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
녹농균 유래의 PA4710 단백질 또는 그 일부에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
제10항에 있어서, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 일부가, 녹농균 유래의 PA4710 단백질의 세포 표면 루프 함유 영역인, 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 기재된 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
제2항에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
제3항에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
제4항에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
제5항에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
제6항에 기재된 펩티드에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편.
서열번호:5 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하고, 서열번호:5 내지 15의 아미노산 서열에 있어서 그 이외의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제10항에 있어서, 녹농균 표면에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노크로널 항체인, 항체 또는 그의 기능적 단편.
제10항에 있어서, 녹농균이 감염되어 있는 환자에서 항균 활성을 가지는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제21항에 있어서, 환자가, 호중구가 감소되어 있는 상태에 있는 환자인, 항체 또는 그의 기능적 단편.
제21항에 있어서, 녹농균이 다제 내성 녹농균인, 항체 또는 그의 기능적 단편.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노크로널 항체인, 항체 또는 그의 기능적 단편.
FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974 중 어느 한 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974 중 어느 한 수탁번호로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노크로널 항체의 항원과 동일한 항원과 반응하는 모노크로널 항체 또는 그의 기능적 단편.
제20항에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.
제24항에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.
FERM BP-10970, FERM BP-10971, FERM BP-10972, FERM BP-10973, FERM BP-10974의 수탁번호로 기탁된 하이브리도마.
녹농균 유래의 PA4710 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하여 이루어지는 항원 조성물.
제1항에 기재된 단백질 또는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 펩티 드를 포함하여 이루어지는 항원 조성물.
제30항 또는 제31항에 기재된 항원 조성물과, 경우에 따라서는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 애쥬번트를 포함하여 이루어지는, 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제32항에 있어서, 녹농균 관련 질환이 녹농균 감염에 기인하는 전신감염 질환인, 백신 조성물.
제33항에 있어서, 녹농균 감염이 다제 내성 녹농균 감염인, 백신 조성물.
제10항 내지 제19항, 제21항 내지 제23항, 제25항, 또는 제26항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편과, 경우에 따라서는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하여 이루어지는, 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제35항에 있어서, 녹농균 관련 질환이 녹농균 감염에 기인하는 전신감염 질환인, 의약 조성물.
제36항에 있어서, 녹농균 감염이 다제 내성 녹농균 감염인, 의약 조성물.
제10항 내지 제19항, 제25항, 또는 제26항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하여 이루어진, 녹농균 감염증 진단제.
제10항 내지 제19항, 제25항, 또는 제26항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하여 이루어진, 녹농균 검출 키트.