CN102137870B - 抗PcrV抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对感染症、特别是绿脓杆菌引起的感染症的治疗有效的方法。提供抗PcrV单克隆抗体或其一部分、以及含有它们作为有效成分的药物组合物。具体而言，本发明的单克隆抗体在绿脓杆菌对靶细胞的细胞毒抑制活性方面具有优异的抑制活性。另外，本发明的单克隆抗体与PcrV具有高的亲和性。

Description

抗PcrV抗体
技术领域
本发明涉及识别PcrV的单克隆抗体或其一部分。具体而言，本发明涉及中和活性(以下，也称作细胞毒抑制活性)较以往的抗PcrV抗体高的抗体或其一部分、以及含有该抗体或其一部分的药物组合物。 
背景技术
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是自然界中广泛存在的专性需氧性革兰氏阴性杆菌。其病原性通常低，但却是引起在患有癌症或糖尿病等各种基础疾病的患者、给予具有免疫抑制作用的药物的患者中多发的机会性感染症的病原菌，往往会引起肺炎、尿路感染、败血症等，带来严重后果。绿脓杆菌感染症在临床现场中被认为是目前最难治疗的感染症之一。其原因在于：绿脓杆菌不仅对现有抗生素的感受性本来就低，而且对各种抗生素容易产生耐药性，难以治疗的倾向强。因此，对于绿脓杆菌，在开发新的抗生素的对策方面存在局限，人们迫切希望开发不依赖于抗生素的疗法。 
绿脓杆菌的强细胞毒性是通过经由III型外毒素分泌系统将毒素注入真核细胞内而发挥出来的。PcrV是包含294个残基(NCBI检索号AAC45935、SEQ ID NO：1)的III型外毒素分泌系统的构成蛋白，编码该蛋白的操纵子序列已公开(专利文献1、非专利文献1)。对PcrV的控制可能与绿脓杆菌感染症的治疗方法有关(非专利文献2)，因此有人报道了具有中和活性的抗PcrV多克隆抗体(非专利文献3、4)和单克隆抗体(专利文献2、非专利文献5、6)。但多克隆抗体难以人源化，而且难以改善抗原性，难以用作药物组合物。此外，迄今为止所报道 的单克隆抗体，其中和活性低，还不能满足临床现场的要求。 
专利文献1：美国专利6551795 
专利文献2：日本特表2005-500250 
非专利文献1：Yahr，T.L.等人，J.Bacteriol.1997年，第179卷，7165页 
非专利文献2：T.Sawa等人，Nature Medicine，1999年，第5卷，392页 
非专利文献3：Shime N等人，J.Immunol.2001年，第167卷，5880页 
非专利文献4：Imamura Y等人，Eur.Respir.J.2007年，第29卷，965页 
非专利文献5：Karine Faure等人，J.Immune.Based.Therapies andVaccines，2003年，第1卷 
非专利文献6：Dara W.Frank等人，J.Infect.Disease，2002年，第186卷，64页 
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于：提供对感染症、特别是绿脓杆菌引起的感染症的治疗有效的方法。 
解决课题的方法
本发明人等就抗PcrV单克隆抗体的制作进行了深入研究，结果成功地制作了认为与以往已知的抗PcrV单克隆抗体相比对疾病的疗效更高的新型单克隆抗体，从而完成了本发明。 
即，本发明涉及下述(1)～(10)。 
(1).抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有选自以下(A)～(C)的至少一种性质： 
(A)在体外以1nM～200nM的浓度抑制50％以上的绿脓杆菌对白细胞 的细胞毒性； 
(B)在体外以1nM～50nM的浓度抑制50％以上的绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性；以及 
(C)与PcrV的解离常数(Kd)为2×10-9(M)以下。 
(2).单克隆抗体或其一部分，所述单克隆抗体具有由下述杂交瘤的至少一种产生的单克隆抗体的所有互补性决定区(CDR)的氨基酸序列：以保藏号FERM P-21403保藏的杂交瘤、以保藏号FERM P-21404保藏的杂交瘤、以保藏号FERM P-21405保藏的杂交瘤或以保藏号FERM P-21406保藏的杂交瘤。 
(3).单克隆抗体或其一部分，所述单克隆抗体由下述杂交瘤的至少一种产生：以保藏号FERM P-21403保藏的杂交瘤、以保藏号FERMP-21404保藏的杂交瘤、以保藏号FERM P-21405保藏的杂交瘤或保藏号FERM P-21406保藏的杂交瘤。 
(4).抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的136位～233位具有其表位。 
(5).抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有下述的重链可变区和轻链可变区： 
1)互补性决定区包含下述氨基酸序列的重链可变区：SFTSYWMH(SEQ ID NO：15)、INPSNGRTNYNEKFNT(SEQ ID NO：16)和YGNYVVYYTMDY(SEQ ID NO：17)；以及 
2)互补性决定区包含下述氨基酸序列的轻链可变区：SASTSVSYME(SEQ ID NO：18)、TTSKLAS(SEQ ID NO：19)和HQWRNYPFT(SEQ ID NO：20)。 
(6).抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有下述的重链可变区和轻链可变区： 
1)互补性决定区包含下述氨基酸序列的重链可变区：SITSDYAWN(SEQ ID NO：21)、YITYNGDTSYNPSLKS(SEQ ID NO：22)和SRNYYGAWFAY(SEQ ID NO：23)；以及 
2)互补性决定区包含下述氨基酸序列的轻链可变区：KASQYVGTTVA(SEQ ID NO：24)、RASTRHT(SEQ ID NO：25)和QQYCSSPLT(SEQ ID NO：26)。 
(7).抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有： 
1)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；以及 
2)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。 
(8).抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有： 
1)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；以及 
2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。 
(9).药物组合物，该药物组合物含有上述(1)～(8)中任一项所述的抗体或其一部分作为有效成分。 
(10).杂交瘤，该杂交瘤产生上述(1)～(8)中任一项所述的抗体或其一部分。 
发明效果
本发明的单克隆抗体或其一部分对PcrV的中和活性非常优异，所以作为感染症的治疗药是有效的。 
附图说明
图1显示PcrV抗体(1F3、2A4、6F5、7A7和Mab166)中生物素标记PcrV被未标记PcrV取代的曲线。 
图2显示利用表面等离子共振分析得到的PcrV抗体(1F3、2A4、6F5、7A7和Mab166)的亲和性。 
图3显示PcrV抗体(1F3、2A4、6F5、7A7、Mab166)与Mab166的夹心测定(sandwich assay)的结果。 
图4显示PcrV抗体(1F3、2A4、6F5、7A7和Mab166)抑制绿脓杆菌SR24株对U937细胞的细胞毒活性的效果。 
图5显示PcrV抗体(1F3、2A4、6F5、7A7和Mab166)抑制绿脓杆菌SR24株对骨髓瘤细胞P3U1的细胞毒活性的效果。 
图6显示PcrV抗体(1F3、2A4、9D12、12H9和m166)中生物素标记PcrV被未标记全长PcrV和缺失突变PcrV取代的曲线。 
图7显示在蛋白质印迹法中与PcrV抗体(1F3、2A4、9D12、12H9和m166)中的全长PcrV和缺失突变PcrV的反应性。 
图8是通过抑制细胞毒抑制活性来显示抗体与全长PcrV的关联关系。 
图9是通过抑制细胞毒抑制活性来显示抗体与缺失突变PcrV的关联关系。 
图10显示1F3抗体可变区的氨基酸序列。下划线部分显示CDR区。 
图11显示2A4抗体可变区的氨基酸序列。下划线部分显示CDR区。 
具体实施方式
作为本发明的对象的“单克隆抗体”，是指与上述PcrV特异性结合的单克隆抗体。更具体而言，是指具有选自以下(1)～(3)的至少一种性质的抗PcrV单克隆抗体： 
(1)在体外以1nM～200nM的浓度抑制50％以上的绿脓杆菌对白细胞的细胞毒性； 
(2)在体外以1nM～50nM的浓度抑制50％以上的绿脓杆菌对骨髓瘤细胞的细胞毒性；以及 
(3)与PcrV的解离常数(Kd)为2×10-9(M)以下。 
本发明的单克隆抗体，其特征之一在于：具有强的细胞毒抑制活性。例如，当使用白细胞时，具有以1～200nM、优选2～100nM、进一步优选5～25nM的范围内的浓度抑制50％以上的绿脓杆菌所具有的细胞毒活性的抑制(中和)活性。使用骨髓瘤细胞时，具有以1～50 nM、优选2～30nM、进一步优选4～20nM的范围内的浓度抑制50％以上的绿脓杆菌所具有的细胞毒活性的抑制活性。这些值远远超过Dara W.Frank等人(J.Infect.Disease，2002年，第186卷，64页)报道的Mab166的活性值。 
本发明的单克隆抗体还具有以下特征：在PcrV的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的136位～233位的区域具有其表位。本发明人等发现：识别该区的抗体比识别其他区的抗体具有强的活性(细胞毒抑制活性)。 
单克隆抗体的识别表位的鉴定可如下进行。首先，制作单克隆抗体所识别的分子的各种部分结构。制作部分结构时，有以下方法：利用公知的寡肽合成技术制作其分子的各种部分肽的方法；利用基因重组技术将编码目标部分肽的DNA序列插入适当的表达质粒中，在大肠杆菌等宿主内外生产部分肽的方法等，但为了达到上述目的，通常将上述两种方法组合使用。例如，利用本领域技术人员所周知的基因重组技术，制作从抗原蛋白的C末端或N末端起按适当的长度依次缩短的一系列多肽，之后研究单克隆抗体与这些多肽的反应性，确定大致的识别位点。 
之后，利用本领域技术人员所周知的寡肽合成技术，进一步详细合成各种其对应部分的寡肽或该肽的突变体等，研究本发明的预防或治疗药所含有的作为有效成分的单克隆抗体与这些肽的结合性，或者研究肽对该单克隆抗体与抗原的结合的竞争抑制活性，从而限定表位。作为用于得到多种寡肽的简便方法，还可以使用市售的试剂盒(例如SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies社制)、采用多大头针合成法的一系列多大头针/肽合成试剂盒(Chiron社制)等)。 
细胞毒抑制活性可以按照以下程序来测定。首先，将作为细胞毒抑制活性的测定对象的单克隆抗体按2倍稀释系列进行稀释，调整至适当的浓度。 
接下来，用细胞培养用培养基等稀释受到绿脓杆菌的毒素等影响 的细胞(以下，记作靶细胞)，调整至适当的数目。具体而言，使用骨髓瘤细胞时，优选按照3×106～5×106细胞/ml的范围进行调整；使用白细胞时，优选按照1×106～3×106细胞/ml的范围进行调整。进行同样的操作，用培养用培养基等将绿脓杆菌调整成1×107～1×108cfu/ml。然后，在上述单克隆抗体的存在下，在同一试管或孔(例如微量培养板上的孔等体外条件)中，利用适当的培养条件培养绿脓杆菌和靶细胞。此时的培养条件可以是利于细胞或细菌生长的普通培养条件。另外，根据靶细胞的种类，将培养时间适当改变成最佳条件，例如，使用骨髓瘤细胞时，培养时间优选1～3小时左右；使用白细胞时，培养时间优选1～3小时左右。以未添加抗体的孔作为对照组，算出相对于对照组抑制50％的浓度(有效浓度)。关于判定靶细胞的生死，确立了各种方法，但在添加显色试剂后，测定适当波长(例如400～500nm)处的吸光度等是有效的(参考文献：Nature Medicine，1999年，第5卷，392～395页)。 
本发明的单克隆抗体，其特征之一在于：与PcrV具有高的亲和性。用作表示单克隆抗体与抗原的亲和性的指标的解离常数(Kd)可以通过各种方法来分析。例如，按照使用用各种标记物标记的抗原的Scatchard法、或使用市售的测定试剂盒BiacoreX(Amersham Pharmacia社制)或类似试剂盒按照该试剂盒所附带的操作说明书和实验操作方法，可以容易地进行分析。使用这些方法求得的解离常数(Kd值)以M(摩尔)单位表示。被试验的单克隆抗体，其解离常数越小，表示具有越强的亲和性。本发明的单克隆抗体或其一部分与PcrV的解离常数(Kd)为2×10-9(M)以下，优选1.5×10-9(M)以下，进一步优选为1.2×10-9(M)以下。 
本发明的单克隆抗体中，优选重链和轻链的可变区来源于人，例如可以具有SEQ ID NO：11～14的修饰体(例如包含1个或多个氨基酸的取代、插入、添加或缺失的修饰体，但并不限于此)的序列。恒定区结构域优选包含适当的人恒定区结构域、例如Kabat E.A.等人，USDepartment of Health and Human Services，Public Health Service， National Institute of Health中记载的人恒定区结构域。通过将可变区的氨基酸序列适用于由Kabat等人作成的抗体氨基酸序列的数据库(“Sequence of Proteins of Immunological Interest”US Dept.Health andHuman Services，1983)中来研究同源性，可以发现CDR区。至于CDR区的序列，当在保有本发明所期望的生物学活性(例如，结合活性或中和活性)的范围内时，通过至少1个添加、插入、取代或缺失而得到的修饰体也包含在本发明中。可以列举与各CDR区的同源性为90～100％的序列。优选列举同源性为95～100％的序列。进一步优选列举同源性为98～100％的序列。 
构架区可以和任意种类的构架区有关，但优选为来自人的构架区。可以参照Kabat E.A.等人的文献来选择适当的构架区。优选的重链构架为人重链构架，例如为图10或图11所示的抗PcrV抗体的构架。这可以参照上述文献，由图10或图11所示的序列来确定。按照同样的方法，对于抗PcrV轻链构架，也可以参照上述文献，由图10或图11所示的序列来确定。 
本发明的单克隆抗体，作为其更优选的方式，可以列举以下抗体，该抗体至少包含a)：(i)免疫球蛋白重链可变区(VH)或其片段，其中在序列中包含作为互补性决定区的CDR1、CDR2和CDR3，此时，CDR1具有氨基酸序列SFTSYWMH(SEQ ID NO：15)，CDR2具有氨基酸序列INPSNGRTNYNEKFNT(SEQ ID NO：16)，CDR3具有氨基酸序列YGNYVVYYTMDY(SEQ ID NO：17)；以及(ii)人重链的恒定部分或其片段。 
而且，优选包含b)：(i)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中CDR1具有氨基酸序列SASTSVSYME(SEQ ID NO：18)，CDR2具有氨基酸序列TTSKLAS(SEQ ID NO：19)，CDR3具有氨基酸序列HQWRNYPFT(SEQ ID NO：20)；以及(ii)人轻链的恒定部分或其片段。 
此外，作为本发明更优选的抗PcrV抗体，可以列举以下抗体，该抗体至少包含a)：(i)免疫球蛋白重链可变区(VH)或其片段，其中在 序列中包含作为互补性决定区的CDR1、CDR2和CDR3，此时，CDR1具有氨基酸序列SITSDYAWN(SEQ ID NO：21)，CDR2具有氨基酸序列YITYNGDTSYNPSLKS(SEQ ID NO：22)，CDR3具有氨基酸序列SRNYYGAWFAY(SEQ ID NO：23)；以及(ii)人重链的恒定部分或其片段。 
而且，优选包含b)：(i)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中CDR1具有氨基酸序列KASQYVGTTVA(SEQ ID NO：24)，CDR2具有氨基酸序列RASTRHT(SEQ ID NO：25)，CDR3具有氨基酸序列QQYCSSPLT(SEQ ID NO：26)；以及(ii)人轻链的恒定部分或其片段。 
本发明的单克隆抗体，可以使用PcrV(天然体、重组体、合成物等)作为免疫原，按照现有的普通的制备方法来制备。具体而言，首先，以PcrV作为免疫原，根据需要将其与弗氏佐剂一起对哺乳动物的皮下内、肌肉内、静脉内、爪垫内或腹腔内注射1次～数次，来实施免疫致敏，所述哺乳动物优选小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猪、山羊、绵羊、驴、马或牛(包括产生人抗体的转基因小鼠这样的制作成产生来自其他动物的抗体的转基因动物)，更优选小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或兔。通常，自初次免疫起，每隔约1～21天进行1～4次免疫，最终免疫起约1～10天后，可以由被免疫致敏的哺乳动物体内获得产生抗体的细胞。根据所用免疫原的性质等，可以适当改变实施免疫的次数和时间间隔。 
需要说明的是，作为用作免疫原或半抗原的PcrV，可以例示如下。 
(1)在细胞表面表达PcrV的细胞或按照在细胞表面表达PcrV的方式人工确立的细胞株、或按照在细胞表面表达PcrV的方式利用基因重组技术制成的基因重组细胞； 
(2)按照将PcrV或其一部分作为蛋白来表达的方式，利用基因重组技术制作基因重组细胞，培养所得的基因重组细胞，由此得到的培养上清或从该培养上清中纯化的PcrV或其一部分；或者 
(3)化学合成的PcrV或其一部分。 
分泌单克隆抗体的杂交瘤的制作，可以按照Kohler和Milstein等人的方法(Nature，1975，第256卷，第495～497页)和基于该方法的方法来进行。即，通过使由如上所述进行免疫致敏的哺乳动物得到的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等、优选脾脏中所含的产生抗体的细胞与来自优选小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物、更优选小鼠、大鼠或人的不具有自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合，可以制备杂交瘤。 
作为用于细胞融合的骨髓瘤细胞，通常可以使用：由小鼠得到的株化细胞、例如8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(来自BALB/c)骨髓瘤株P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton，D.E.等人.Current Topics inMicrobiology and Immunology，81，1-7(1978)]、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler，G.等人.European J.Immunology，6，511-519(1976)]、Sp2/O-Ag 14(SP-2)[Shulman，M.等人.Nature，276，269-270(1978)]、P3X63Ag8.653(653)[Kearney，J.F.等人.J.Immunology，123，1548-1550(1979)]、P3X63Ag8(X63)[Horibata，K.和Harris，A.W.Nature，256，495-497(1975)]等。 
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选如下进行：例如在微量滴定板中培养杂交瘤，通过RIA或ELISA等免疫测定法测定见到增殖的孔的培养上清与上述小鼠免疫致敏中使用的免疫原的反应性，选择产生对该免疫原或半抗原显示出特异亲和性的单克隆抗体的克隆。而且，通常采用非竞争ELISA法：将免疫原固相化，使用以酶标记的抗小鼠二次抗体检测与上述固相化的免疫原结合的培养上清中的抗体。 
由杂交瘤制备单克隆抗体可如下进行：在体外培养杂交瘤、或者在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等、优选小鼠或大鼠、更优选小鼠的腹水中等培养杂交瘤，从所得的培养上清或哺乳动物的腹水中分离单克隆抗体。在体外进行培养时，综合所培养的细胞种的特性、试验研究的目的以及培养方法等各种条件，使杂交瘤增殖，并加以维持和保存，可以使用用于在培养上清中产生单克隆抗体的已知营养培养基或 由已知的基本培养基诱导制备的所有营养培养基来实施。 
作为基本培养基，例如有：Ham’F12培养基、MCDB153培养基或低钙MEM培养基等低钙培养基；以及MCDB104培养基、MEM培养基、D-MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基本培养基中，根据目的可以含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。单克隆抗体的分离、纯化可以通过将上述培养上清或腹水供给饱和硫酸铵、离子交换层析(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱等亲和柱层析等来进行。 
作为本发明的单克隆抗体，可以使用下述重组型抗体：由产生抗体的细胞、例如杂交瘤克隆抗体基因，将其插入适当的载体中，再将其导入宿主中，利用基因重组技术产生的重组型抗体(例如Carl等人，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，1990年发行)。 
具体而言，从产生目标抗体的杂交瘤或产生抗体的免疫细胞、例如利用癌基因等使致敏淋巴细胞等无限增殖而得到的细胞中分离编码抗体可变区(V区)的mRNA。mRNA的分离如下进行：利用公知方法、例如胍超速离心法(Chirgwin、J.M.等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。 
使用逆转录酶，由所得的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒等来进行。另外，进行cDNA的合成和扩增时，可以使用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clonetech制)和利用了PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988年，第85卷，8998页等)。从得到的PCR产物中纯化目标DNA片段，将其与载体DNA连接。再由此制作重组载体，将其导入大肠杆菌等中，选择菌落，制备所期望的重组载体。利用公知方法、例如脱氧法确认目标DNA的核苷酸序列。 
得到编码目标抗体V区的DNA时，将其与编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，之后将其插入表达载体中。或者，可以将编码抗体V区的DNA插入包含抗体C区的DNA的表达载体中。制备本发明中使用的抗体时，将抗体基因插入表达载体中，使其在表达控制区、例如增强子/启动子的控制下表达。接下来，利用该表达载体转化宿主细胞，可以使抗体表达。 
为了表达抗体基因，可以将抗体的重链(H链)或轻链(L链)分别插入表达载体中来共转化宿主，或者可以将编码H链和L链的DNA插入单一的表达载体中使宿主转化(参照WO94/11523)。 
本发明的单克隆抗体包括：为了降低对人的异种抗原性等而进行人工修饰的基因重组型单克隆抗体、例如嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体以及人单克隆抗体。 
嵌合单克隆抗体包含来自人以外的哺乳动物抗体的V区和来自人抗体的C区，人源化单克隆抗体包含来自人以外的哺乳动物抗体的CDR和来自人抗体的FR及C区，由于这些单克隆抗体在人体内的抗原性降低，所以作为本发明所使用的抗体是有用的。上述修饰单克隆抗体可以采用已知方法来制备。 
嵌合单克隆抗体可如下获得：将如上操作得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其插入表达载体中，之后导入宿主中，使之产生抗体，从而得到嵌合单克隆抗体(例如WO95/14041)。采用该已知方法，可以得到对本发明有用的嵌合单克隆抗体。 
人源化单克隆抗体是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR；complementarity determiningregion)移植到人抗体的CDR中得到的抗体，其一般的基因重组方法也已知(例如WO95/14041)。 
具体而言，利用PCR法，由多个制作成末端部具有重叠部分的寡核苷酸合成设计成连接小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR； framework region)的DNA序列。将得到的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后插入表达载体中，再将其导入宿主中，使之产生抗体，从而得到人源化单克隆抗体(例如WO95/14041)。 
经由CDR连接的人抗体的FR选择CDR形成良好的抗原结合位点的FR。根据需要，可以取代抗体V区的FR的氨基酸，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合位点(Sato、K.等人，Cancer Res.1993年，第53卷，851页)。嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体中使用人抗体C区。作为优选的人抗体C区，可以使用Cγ、例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。 
人单克隆抗体包含来自人抗体的V区和C区，可以用免疫原对产生人抗体的转基因小鼠(例如WO94/25585号)等产生人抗体的转基因非人哺乳动物进行免疫，按照单克隆抗体的现有的普通制备方法来制备。 
在本发明中，“单克隆抗体的一部分”是指上述本发明的单克隆抗体的一部分，意思是指与该单克隆抗体一样与PcrV具有特异结合性的区(以下，还将其只称作“抗体片段”)。 
具体可以列举：与上述人PcrV具有特异结合性的Fab(抗原结合片段)、F(ab’)2、Fab’、单链抗体(单链Fv；以下记作scFv)、二硫键稳定抗体(二硫键稳定Fv；以下记作dsFv)、二聚体V区片段(以下记作双抗体(Diabody))、包含CDR的肽等(Expert opinion on therapeuticpatents，第6卷，第5号，第441～456页，1996年)。 
Fab是分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段，是用木瓜蛋白酶分解在IgG的铰链区交联2条H链的2个二硫键(S-S键)的上部的肽部分而得到的，其由H链的约一半N末端侧和整条L链构成。本发明中使用的Fab可以用木瓜蛋白酶处理上述本发明的单克隆抗体而得到。或者，将编码上述本发明的单克隆抗体的Fab的DNA插入细胞用表达载体中，再将该载体导入细胞中使之表达，由此也可制备 Fab。 
F(ab’)2是分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段，由2个Fab’区在铰链部分结合而构成，上述Fab’是通过胃蛋白酶分解IgG铰链区的2个S-S键的下部而得到的。本发明中使用的F(ab’)2可以用胃蛋白酶处理上述本发明的单克隆抗体而得到。或者，将编码该单克隆抗体的F(ab’)2的DNA插入细胞用表达载体中，再将该载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达，由此也可制备F(ab’)2。 
Fab’是切断上述F(ab’)2的铰链间的S-S键而得到的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。本发明中使用的Fab’，可以用还原剂二硫苏糖醇处理上述本发明的单克隆抗体的F(ab’)2而得到。或者，将编码该单克隆抗体的Fab’的DNA插入细胞用表达载体中，再将该载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达，由此也可制备Fab’。 
scFv是用适当的肽接头(以下，记作P)连接单条VH和单条VL而得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原活性的抗体片段。本发明所使用的scFv中所含的VH和VL可以是上述本发明的单克隆抗体的VH和VL。本发明中使用的scFv可如下制备：由产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，构建scFv表达载体，再将其导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达，制备scFv。 
dsFv是将多肽经由S-S键结合而得到的，所述多肽中VH和VL中的各1个氨基酸残基被取代成半胱氨酸残基。取代成半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照Reiter等人所示的方法(Protein Engineering，7，697(1994))，根据抗体的立体结构预测来选择。本发明中使用的dsFv中所含的VH或VL可以是本发明的单克隆抗体的VH或VL。本发明中使用的dsFv可如下制备：由产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，将其插入适当的表达载体中，构建dsFv表达载体，再将该表达载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达，由此可以制备dsFv。 
双抗体是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二聚体的抗体片段，是对相同抗原具有二价抗原结合活性、或对不同抗原具有两种特异性抗原结合活性的抗体片段。例如，与本发明的单克隆抗体发生特异性反应的二价双抗体可如下制备：获得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码具有3～10个残基的肽接头的scFv的DNA，将该DNA插入细胞用表达载体中，再将该表达载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使双抗体表达，由此可以制备二价双抗体。 
包含CDR的肽含有VH或VL的CDR的至少1个区以上而构成。多个CDR可以直接或经由适当的肽接头结合。本发明中使用的包含CDR的肽可如下制备：获得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，之后构建编码CDR的DNA，将该DNA插入动物细胞用表达载体中，再将该载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达，由此可以制备肽。此外，包含CDR的肽还可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制备。 
本发明的单克隆抗体或其一部分只要能够适用于本发明即可，可以是其修饰物。作为修饰物，可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。对抗体的修饰可以是通过导入化学键进行的修饰，也可以是对抗体的氨基酸序列进行的修饰。本发明的单克隆抗体或其一部分也包括这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得抗体进行修饰而得到。这些方法在该领域已经确立。 
本发明的单克隆抗体或其一部分作为药物组合物是有效的。因此，含有本发明的单克隆抗体及其一部分的药物组合物可以以口服或胃肠外给药的方式进行全身或局部给药。作为胃肠外给药，例如可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内给药、吸入等，但已知绿脓杆菌通过呼吸道感染特别是对肺上皮细胞和肺泡的巨噬细胞造成损伤(T.Sawa等人，Nature Medicine，1999年，第5卷，392页)，因此优选鼻腔内给药和吸入。 
本发明的药物组合物的给药目的在于：治疗由绿脓杆菌引起的囊 性纤维化或感染症患者。例如，有效给药量在每次每1kg体重0.01mg～100mg的范围内选择。或者，可以选择每名患者1～1000mg、优选5～50mg的给药量。但含有本发明的单克隆抗体或其一部分的药物组合物并不限于上述给药量。另外，可以根据患者的年龄、症状适当选择给药期间。本发明的药物组合物，根据给药途径，可以同时含有药学上可接受的载体或添加剂。 
上述载体和添加剂的例子有：水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、酪蛋白、二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、可允许作为药物添加剂的表面活性剂等。所用添加剂根据剂型从上述物质中适当或组合选择，但并不限于这些。 
参考例 
重组Mab166的制作
为了进行比较实验，制作Mab166(日本特愿2005-500250等)作为重组抗体。 
首先，从产生亚纲为IgG2a的抗体的杂交瘤中提取mRNA，通过RT-PCR法克隆H链和L链的恒定区。通过PCR扩增的各片段被插入pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen社制)的NheI、NotI位点，再插入多克隆位点，使可以插入可变区部分的DNA片段。 
接下来，将Mab166可变区部分的H链和L链的基因序列分别分成4份，之后合成它们的有义DNA和反义DNA，进行退火反应。退火后的片段通过DNA连接酶进行结合，将H链克隆到MfeI和Blp I区、将L链克隆到EcoRV和BsiW I区。 
使用脂质转染胺2000(Invitrogen社制)，将已确认核苷酸序列的H链和L链的载体导入HEK239T细胞中，48小时后回收其细胞上清。使用蛋白G(PIERCE社制)柱从回收的细胞上清中纯化重组Mab166。 
以下，给出实施例，来具体说明本发明，但本发明并不限于下述实施例。需要说明的是，作为抗体制作方法，如果没有特别限定，则是指采用了Immunochemistry in Practice(Blackwell ScientificPubliations)中记载的方法。另外，作为基因操作方法，如果没有特别限定，则是指采用了Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor Laboratory)中记载的方法。 
实施例1 
抗原的制备
提取由东海大学提供的绿脓杆菌株标准株PAO1的染色体DNA，以该DNA为模板，利用PCR法扩增编码PcrV蛋白的基因(SEQ ID NO：2)。在5’侧引物中设有限制酶Sph I识别位点，在3’侧引物中设有限制酶Hind III识别位点(SEQ ID NO：3、4)，再插入表达载体时，设计成在组氨酸tag与起始密码子之间插入有半胱氨酸，以进行生物素标记。已扩增的PCR片段在Sph I和Hind III位点克隆到pQE30载体(GEhealthcare社制)中。确认核苷酸序列后，将该载体导入大肠杆菌JM109中，得到重组大肠杆菌(PcrV-JM109)。将PcrV-JM109在500ml的LB/氨苄青霉素液体培养基中、于37℃下培养，当OD600达到0.5时，加入200μl 0.1M的IPTG，诱导PcrV的表达。再于37℃下培养1.5小时，之后将菌体离心，加入15ml含有0.5％溶菌酶(Sigma社制)的缓冲液A(25mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M NaCl、2mM MgCl2)，在0℃下放置30分钟后，进行超声处理。离心后，得到可溶性组分，通入His-Bind柱(Novagen社制)后，用含有200mM咪唑的缓冲液B(20mM磷酸缓冲液(pH7.4)、500mM NaCl)洗脱。最终的洗脱组分用10mM磷酸缓冲液(pH7.4)进行透析，由此进行缓冲液置换。 
抗原的生物素标记
按照上述方式，使表达、纯化的PcrV蛋白在终浓度为10mM的巯基乙胺溶液中、于37℃下反应150分钟，还原半胱氨酸残基。向被 还原的SH基中添加以摩尔比计为20倍量的PEO-马来酰亚胺活化的生物素(PIERCE社制)，在4℃下反应一夜，之后进行透析以除去过剩的生物素。 
抗原的免疫
将作为抗原的已纯化的20μg PcrV和弗氏完全佐剂同时对7只4周龄Balb/c雌性小鼠进行腹腔内给药，作为初次免疫。之后，于14天后、35天后将20μg PcrV和弗氏不完全佐剂一同给药，作为加强免疫。再于77天后腹腔给予20μg PcrV、尾静脉给予10μg PcrV，由此作为最终免疫。 
杂交瘤的制作
最终免疫的3天后摘出脾脏，回收脾细胞。使用50％的聚乙二醇4000使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(p3×63-Ag8.U1、东京肿瘤研究所)融合，用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培养基进行选择。 
PcrV抗体的选定
细胞融合8天后，进行产生特异抗体的细胞的筛选。筛选中采用的免疫测定如下。在96孔微量滴定板(Nunc社制)的各孔中加入200μl含有2μg 抗小鼠IgG抗体(Shibayagi社制)的Tris缓冲液(50mMTris-HCl、pH7.5)，在4℃下固定16小时。这些孔用300μl清洗液(含有0.1％Tween20的生理盐水)清洗2次后，加入300μl BlockAce(大日本制药社制)，在室温下放置2小时，进行封闭(抗小鼠IgG抗体固相化板)。各孔用300μl清洗液清洗2次后，用150μl缓冲液C(含有0.9％氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.5％牛血清白蛋白、0.01％Tween80、25μM二亚乙基三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸的50mM Tris缓冲液、pH7.6)稀释50μl杂交瘤培养上清，之后添加到各孔中，在4℃下反应一夜。用300μl清洗液清洗3次后，加入200μl含有10ng Eu-标记链霉亲和素(PERKIN ELMER社制)和25ng生物素标记PcrV的缓冲液C，在室温下反应1小时。反应后，用300μl清洗液清洗3次，添加200μl增强试剂(1.39g/l邻苯二甲酸钾、19.3mg/l三正辛基氧化膦、 4.59mg/l 2-萘甲酰三氟丙酮、1.0g/l Triton-X100、6.0g/l乙酸)，测定其时间分辨荧光。 
根据筛选结果，选择20个对重组PcrV显示出强亲和性的杂交瘤克隆，按照实施例4确认对绿脓杆菌产生的细胞毒的抑制活性。其结果，在10个克隆中确认到细胞毒抑制活性，利用有限稀释法对这些克隆进行2次克隆，由此获得了产生识别PcrV的单克隆抗体的杂交瘤的克隆。从获得的10个克隆中选择4个细胞毒抑制活性高的克隆，分别命名为1F3、2A4、6F5、7A7。使用小鼠单克隆抗体同种型ELISA试剂盒(BD Biosciences社制)，确定这些抗体的亚纲，结果1F3的亚纲为IgG2a、2A4的亚纲为IgG2b、6F5的亚纲为IgG2a、7A7的亚纲为IgG2a。 
产生单克隆抗体1F3、2A4、6F5、7A7的杂交瘤，于平成19年10月18日(2007年10月18日)分别以保藏号FERM P-21403、FERMP-21404、FERM P-21405、FERM P-21406保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。 
实施例2 
抗体的结合活性
为了测定抗体(1F3、2A4、6F5、7A7)的结合活性，进行竞争免疫测定。向96孔微量滴定板(Nunc社制)的各孔中加入100μl含有1.5μg抗小鼠Fc抗体(Jackson ImmunoReseach社制)的Tris缓冲液(50mMTris-HCl、pH7.5)，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl清洗液清洗2次，之后加入300μl含10％蔗糖的BlockAce(大日本制药社制)溶液，在室温下放置2小时，进行封闭(抗小鼠IgG抗体固相化板)。各孔用300μl清洗液清洗2次，之后添加2ng/孔的各抗体以及自500ng/孔起以10倍稀释系列稀释5个阶段的未标记的PcrV。之后，添加5ng/孔的生物素化PcrV，反应一夜。用300μl清洗液清洗4次，添加 100/孔的增强溶液(Wallac社制)后搅拌1分钟，之后测定时间分辨荧光。其结果，与Mab166相比，1F3、2A4、6F5、7A7显示出与PcrV的强结合活性(图1)。 
接下来，通过表面等离子共振分析，算出1F3、2A4、6F5、7A7、Mab166与PcrV的亲和性。使用小鼠抗体捕集试剂盒(BIACORE社制)，将抗小鼠抗体固定在CM5传感器芯片上，然后捕集各PcrV抗体。向载有该固相传感器芯片的BICORE T100上加载重组PcrV，求出亲和性。 
其结果，Mab166的亲和性为3.0×10-9，相对于此，1F3的亲和性为3.7×10-10，2A4的亲和性为3.5×10-10，6F5的亲和性为1.1×10-10，7A7的亲和性为1.1×10-9，所有克隆的亲和性均较Mab166高(图2)。 
实施例3 
能否与Mab166进行夹心测定
为了证明1F3、2A4、6F5、7A7与Mab166的表位不同，研究能否进行该抗体与Mab166的夹心测定。 
最初，进行Mab166的生物素标记。将100μg的Mab166和7.853μg的NHS-PEO4生物素(PIERCE社制)在0.1M PBS(pH7.4)中混合，使之在冰中反应2小时。之后，进行凝胶层析(G2000SW柱(TOSHO社制))，以从反应溶液中除去未反应的生物素。 
接下来，进行夹心测定。在96孔微量滴定板(Nunc社制)中加入100μl含有各500μg的PcrV抗体(1F3、2A4、6F5，7A7)的PBS(-)溶液，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl清洗液(含有0.01％Tween20的生理盐水)清洗1次，之后加入300μl BlockAce(大日本制药社制)，在室温下放置2小时，进行封闭。各孔用300μl清洗液清洗2次，之后添加100μl含有50μg PcrV和50ng生物素标记Mab166的测定缓冲液(Wallac社制)，在4℃下反应一夜。用清洗液清洗3次后，添加100μl含有50ng Eu-标记链霉亲和素(Wallac社制)的测定缓 冲液，在室温下反应1小时。用清洗液清洗4次，添加100μl增强溶液，之后经过1分钟的搅拌，测定其时间分辨荧光。 
其结果是1F3、2A4、6F5、7A7可以与Mab166进行夹心测定，表明该抗体组与Mab166的表位不同(图3)。 
实施例4 
细胞毒抑制活性试验
对1F3、2A4、6F5、7A7进行细胞毒抑制活性试验。其方法如下。 
首先，将1F3、2A4、6F5、7A7从32μg/ml起以2倍稀释系列进行稀释，向96孔微量培养板的各孔中分别注入10μl。接下来，使用细胞培养用培养基(含碳酸氢钠、不含L-谷胺酰胺和酚红的RPMI 1640(Sigma社制))，将骨髓瘤细胞P3U1(从ATCC获取)调整至5×106细胞/ml、或者将作为白细胞的一种的U937(从ATCC获取)细胞调整至1×106细胞/ml，在该96孔微量培养板中添加各100μl。再使用细胞培养用培养基将在阳离子调节的Mueller Hinton Broth(Difco)中培养一夜的绿脓杆菌SR24株调整至1×108cfu/ml，将所得菌液按10μl/孔进行添加，于37℃、5％CO2存在下培养3小时。经过3小时后，添加各10μl WST-8(Kishida化学社制)，使用骨髓瘤细胞P3U1时，于37℃、5％CO2存在下培养3小时；使用U937细胞时，培养1小时。培养结束后，测定450nm波长处的吸光度。 
其结果，使用白细胞U937细胞时，其细胞毒抑制活性(IC50)如下：Mab166的IC50为213nM以上，相对于此，1F3的IC50为5.3nM、2A4的IC50为20.7nM、6F5的IC50为12.7nM、7A7的IC50为14.7nM；使用骨髓瘤细胞U3P1时，Mab166的IC50为54nM，相对于此，1F3的IC50为4.0nM、2A4的IC50为16nM、6F5的IC50为7.3nM、7A7的IC50为6.0nM。即，与已知的Mab166(Frank等人、The Journal ofInfectious Diseases，2002年，第186卷，66页)相比，1F3、2A4、6F5、7A7对上述两种细胞均具有强细胞毒抑制活性(图4和图5)。 
实施例5 
缺失突变PcrV的制作
按照以下方法制作缺失突变PcrV(136-233)。 
以PcrV抗原蛋白表达质粒pQE30-PcrV为模板，使用5’侧引物GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC(SEQ ID NO：5)、3’侧引物GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC(SEQ ID NO：6)进行PCR，使用BamHI、HindIII对已扩增的片段进行限制酶处理，之后插入pET32b(Novagen社制)中。确认核苷酸序列后，将该载体导入大肠杆菌BL21-DE3株中，得到重组大肠杆菌(缺失突变PcrV-BL21)。使用2mlLB/氨苄青霉素液体培养基于37℃下预培养该表达株一昼夜。在500ml LB/氨苄青霉素液体培养基中加入2mL预培养液，在37℃下培养，当OD600达到0.5时，将培养液在冰上静置30分钟。加入IPTG使终浓度达到0.75mM，使用震荡培养基在15℃下以160rpm的转速培养一昼夜，诱导PcrV的表达。将培养液于4℃下以5000g的离心力离心30min，形成集菌。除去上清，向菌体中加入10ml含有0.1％溶菌酶(Sigma社制)的缓冲液X(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2mM MgCl2)，进行悬浮，在冰上静置1小时后，边冰冷边进行超声粉碎处理。通过离心得到可能性组分，将其通入充填有Ni-NTA琼脂糖(Quiagen)的柱中，之后用缓冲液Y(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、200mM咪唑)洗脱。最终的洗脱组分用10mM磷酸缓冲液(pH7.4)进行透析，由此进行缓冲液置换。 
表位区的确定
向96孔微量滴定板(Nunc社制)的各孔中加入150μl含有1.5μg抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson ImmunoResearch社制)的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5)，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl清洗液(含0.1％Tween20的生理盐水)清洗2次，之后加入300μl封闭溶液(50mM Tris-HCl pH7.5、2％BlockAce(大日本制药社制)、10％蔗糖)，在室温下放置2小时，将各孔封闭(抗小鼠IgG抗体固相化板)。各孔用300μl清洗液清洗1次，之后向各孔中分别添加50μl用缓冲液C(含0.9％氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.5％牛血清白蛋白、0.01％Tween80、25μM二亚乙基三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸的50mMTris缓冲液、pH7.6)稀释至80ng/ml的PcrV抗体溶液，向各孔中分别加入50μl用缓冲液C稀释至200ng/ml的Eu-标记链霉亲和素(PERKIN ELMER社制)溶液，再向各孔中分别加入100μl用DELFIA测定缓冲液稀释至各浓度的缺失突变PcrV蛋白，在4℃下反应一夜。用300μl清洗液清洗3次，之后添加200μl增强试剂(1.39g/l邻苯二甲酸钾、19.3mg/l三正辛基氧化膦、4.59mg/l 2-萘甲酰三氟丙酮、1.0g/lTriton-X100、6.0g/l乙酸)，测定其时间分辨荧光(图6)。
其结果，PcrV抗体1F3、2A4、9D12、12H9以及用作参考例的KaloBios社的m166对PcrV全长(1-294)显示出反应性。另一方面，虽然1F3、2A4对PcrV(136-233)显示出反应性，但m166和不具有中和活性的9D12、12H9对PcrV(136-233)并没有显示出反应性。 
此外，还利用蛋白质印迹法进行了结合分析。将已纯化的重组PcrV蛋白进行SDS-PAGE后，转印到PVDF薄膜上。转印的薄膜用BlockAce(大日本制药制)溶液在室温下震荡2小时进行封闭。向薄膜上加入稀释至1μg/ml的PcrV抗体溶液，在4℃下反应一夜，之后用清洗液B(10mM磷酸缓冲液(pH7.4)、0.05％Tween20)清洗。向薄膜上加入作为二次抗体的标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare社制)溶液，在室温下反应2小时，之后用清洗液B清洗薄膜，用ECL plus蛋白质印迹法测定系统(GE Healthcare社制)进行显色，用LAS-1000(FUJIFILM)摄影(图7)。PcrV中和抗体1F3、2A4与全长PcrV和缺失突变PcrV双方反应，但m166和中和活性低的9D12、12H9只与全长PcrV反应、而不与缺失突变PcrV反应。 
由此可知：PcrV中和抗体1F3、2A4的表位区是氨基酸残基136-233的区，而m166、9D12、12H9并不是仅以氨基酸残基136-233 作为表位区。 
实施例6 
PcrV蛋白的特定区与细胞毒活性的强度的相关性
使用全长PcrV蛋白(SEQ ID NO：1)和缺失突变PcrV蛋白(具有SEQ ID NO：1中的136位-233位的氨基酸序列)，进行1F3、2A4、m166的细胞毒抑制活性的抑制试验。其方法如下。 
首先，将1F3、2A4、m166分别从200nM、200nM、400nM起以2倍稀释系列进行稀释，向96孔微量培养板中分别注入10μl。该试验中1F3、2A4、m166的试验浓度范围分别为1.56-6.25nM、6.25-25nM、50-200nM。相对于各试验浓度范围，以30、10、3、1、0.3倍摩尔浓度向96孔板中添加10μl全长PcrV蛋白和缺失突变PcrV蛋白，在室温下放置30分钟。接下来，使用细胞培养用培养基(含碳酸氢钠、不含L-谷胺酰胺和酚红的RPMI1640(Sigma社制))，制备骨髓瘤细胞U3P1使达到5×106细胞/ml，向该96孔微量培养板中添加各70μl。再添加10μl用细胞培养用培养基将在Mueller Hinton Broth(Difco)中培养一夜的绿脓杆菌SR24株制备成1×108cfu/ml的菌液，在37℃、5％CO2存在下培养3小时。经过3小时后，添加各10μl的WST-8(Kishida化学社制)，在37℃、5％CO2存在下培养3小时。培养结束后，测定450nm波长处的吸光度。 
其结果，未添加PcrV蛋白时，与m166相比，1F3、2A4显示出强的细胞毒抑制活性。另一方面，添加全长PcrV蛋白时，所有抗体均抑制已添加的全长PcrV蛋白的浓度依赖性细胞毒抑制活性(图8)。相对于此，添加缺失突变PcrV蛋白时，其氨基酸区(136-233)具有表位的1F3、2A4抑制已添加的缺失突变蛋白的浓度依赖性细胞毒抑制活性，但不具有表位的m166在细胞毒抑制活性方面没有观察到变化(图9)。 
根据以上结果认为：氨基酸残基136-233中具有表位的抗体(1F3 和2A4)较该区不具有表位的抗体(m166)具有强的细胞毒抑制活性。即，可以认为细胞毒抑制活性的强度根据PcrV抗体所识别的区而不同，不过具有强细胞毒抑制活性的抗体是只在氨基酸残基136-233区与PcrV蛋白具有反应性的抗体。 
实施例7 
PcrV抗体(1F3和2A4)的氨基酸序列的分析
使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN社制)，从所确立的杂交瘤细胞中提取RNA。使用用于cDNA末端的快速扩增的5’RACE系统2.0版(Invitrogen社制)，由提取的1μg RNA扩增DNA片段。此时，用于cDNA合成的引物如下：当为1F3时，引物使用TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT(SEQ ID NO：7)；当为2A4时，引物使用TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC(SEQ ID NO：8)。此外，在5’RACE法中使用的引物如下：当为1F3时，引物使用AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGC TGT(SEQ ID NO：9)，当为2A4时，引物使用AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGG GGTGT(SEQ ID NO：10)。所扩增的片段用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen社制)进行克隆。再使用Applied Biosystems 3130遗传分析仪(AppliedBiosystems社制)分析核苷酸序列。1F3的分析结果见图10，2A4的分析结果见图11。 
产业实用性 
本发明的单克隆抗体或其一部分不仅与PcrV具有高的亲和性，而且在绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)对真核细胞的细胞毒活性方面也显示出强的抑制活性。因此，含有该单克隆抗体或其一部分的药物组合物作为目前在医疗现场被认为是难以治疗的与绿脓杆菌有关联的感染症的治疗药是有效的。 

Claims (6)

1.抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有下述的重链可变区和轻链可变区：
(1)互补性决定区包含下述氨基酸序列的重链可变区：SFTSYWMH即SEQ ID NO：15、INPSNGRTNYNEKFNT即SEQ ID NO：16和YGNYVVYYTMDY即SEQ ID NO：17；以及
(2)互补性决定区包含下述氨基酸序列的轻链可变区：SASTSVSYME即SEQ ID NO：18、TTSKLAS即SEQ ID NO：19和HQWRNYPFT即SEQ ID NO：20，
其中，所述抗PcrV单克隆抗体的一部分为Fab、F(ab’)2、Fab’、单链抗体、二硫键稳定抗体、二聚体V区片段。
2.权利要求1所述的抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述抗PcrV单克隆抗体具有：
(1)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；以及
(2)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。
3.权利要求1所述的抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述单克隆抗体具有由以保藏号FERM P-21403保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体的所有互补性决定区的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的抗PcrV单克隆抗体或其一部分，所述单克隆抗体由以保藏号FERM P-21403保藏的杂交瘤产生。
5.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1～4中任一项所述的抗PcrV单克隆抗体或其一部分作为有效成分。
6.杂交瘤，该杂交瘤产生权利要求1～4中任一项所述的抗PcrV单克隆抗体或其一部分。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2248826E (pt) 2008-01-10 2013-09-06 Shionogi & Co Anticorpo dirigido contra pcrv
SG174225A1 (en) * 2009-03-11 2011-10-28 Shionogi & Co Humanized pcrv antibody having anti-pseudomonal activity
JP6058645B2 (ja) 2011-06-10 2017-01-11 メディミューン，エルエルシー 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子およびその使用
CA2854817C (en) * 2011-11-07 2022-08-16 Medimmune, Llc Combination therapies using anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules
CN104144945A (zh) * 2012-03-02 2014-11-12 埃博灵克斯股份有限公司 结合铜绿假单胞菌pcrv的单可变结构域抗体
MA56205A (fr) 2019-06-11 2022-04-20 Regeneron Pharma Anticorps anti-pcrv qui se lient à pcrv, compositions comprenant des anticorps anti-pcrv, et leurs méthodes d'utilisation
WO2021244421A1 (en) * 2020-06-01 2021-12-09 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing pseudomonas pcrv and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101002947A (zh) * 2007-01-16 2007-07-25 湖南农业大学 一种用于细菌病治疗的靶向药物及其制备方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
AU7949394A (en) 1993-11-19 1995-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human medulloblastomatous cell
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
ES2255329T3 (es) * 1998-11-25 2006-06-16 Mcw Research Foundation, Inc. Metodo y composiciones para inmunizacion con el antigeno v de pseudomonas aeruginosa.
US20030228324A1 (en) * 1999-05-06 2003-12-11 Malcolm Andrew J. Peptide compositions and methods of producing and using same
ATE347374T1 (de) 2001-01-26 2006-12-15 Mcw Res Found Inc Verfahren und zusammensetzungen für immunisierung mit dem pseudomonas antigen
JP4782700B2 (ja) * 2004-01-20 2011-09-28 カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 最低限必須な結合決定基を用いた抗体特異性の移入
WO2007114340A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-11 Meiji Seika Kaisha, Ltd. 緑膿菌の外膜タンパク質ｐａ０４２７
WO2009005040A1 (ja) * 2007-06-29 2009-01-08 Meiji Seika Kaisha Ltd. 緑膿菌の外膜タンパク質pa4710
EP2220117A2 (en) 2007-11-30 2010-08-25 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to the pcrv antigen of pseudomonas aeruginosa
PT2248826E (pt) 2008-01-10 2013-09-06 Shionogi & Co Anticorpo dirigido contra pcrv
SG174225A1 (en) * 2009-03-11 2011-10-28 Shionogi & Co Humanized pcrv antibody having anti-pseudomonal activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101002947A (zh) * 2007-01-16 2007-07-25 湖南农业大学 一种用于细菌病治疗的靶向药物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dara W.Frank et al..Generation and Characterization of a Protective Monoclonal Antibody to Pseudomonas aeruginosa PcrV.《The Journal of Infectious Diseases》.2002,(第186期),第 64页右栏5-10行，第67页左栏第3段，第71页第1段，第72页左栏39-47行，及表1.
Generation and Characterization of a Protective Monoclonal Antibody to Pseudomonas aeruginosa PcrV;Dara W.Frank et al.;《The Journal of Infectious Diseases》;20020731(第186期);第 64页右栏5-10行，第67页左栏第3段，第71页第1段，第72页左栏39-47行，及表1 *

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