EA020544B1 - АНТИТЕЛА ПРОТИВ PcrV - Google Patents

Abstract

Предложено эффективное средство для лечения инфекции, в частности для лечения инфекции, связанной с Pseudomonas aeruginosa. Предложено моноклональное антитело к PcrV или часть такого антитела и фармацевтическая композиция, содержащая такое моноклональное антитело или его часть в качестве активного компонента. В частности, моноклональное антитело согласно настоящему изобретению демонстрирует высокую активность ингибирования цитотоксичности в отношении целевых клеток Pseudomonas aeruginosa. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению также обладает высокой аффинностью к PcrV.

Description

Настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает РсгУ или часть РегУ. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу, обладающему более высокой нейтрализующей активностью (здесь и далее также называемой активностью по ингибированию цитотоксичности), чем обычные анти-РсгУ антитела, а также к фрагментам таких антител и фармацевтическим композициям, включающим такие антитела.

Уровень техники

Ркеийотопак аегидшока представляет собой облигатно аэробную грамотрицательную бациллу, широко распространенную в природе. Хотя ее патогенность обычно низка, она является патогеном, вызывающим оппортунистическую инфекцию, часто возникающую у пациентов, страдающих различными фоновыми заболеваниями, такими как рак и диабет, а также у пациентов, получающих лекарственные средства, обладающие иммуноподавляющим действием, и часто вызывает пневмонию, инфекции мочевого тракта и т.п., что может приводить к тяжелым последствиям. В клинике инфекция Ркеийотопак аегидшока считается одной из наиболее тяжело поддающихся лечению инфекций, поскольку Ркеийотопак аегидшока не только обладает изначально низкой чувствительностью к существующим антибиотикам, но и легко приобретает устойчивость к различным антибиотикам, что затрудняет лечение инфекции. Таким образом, в случае Ркеийотопак аегидшока путь последовательной разработки новых антибиотиков ограничен, и было бы крайне желательным создание способа терапии, который бы не основывался на применении антибиотиков.

Высокая цитотоксичность Ркеийотопак аегидшока обусловлена введением токсина в эукариотическую клетку, осуществляемым посредством системы секреции экзотоксинов III типа. РсгУ представляет собой белок, состоящий из 294 остатков (номер в ΝΟΒΙ ААС45935, БЕЦ ГО N0: 1) и являющийся частью системы секреции экзотоксинов III типа. Последовательность, кодирующая данный белок, известна (патентный документ 1, непатентный документ 1). Поскольку РсгУ потенциально может обеспечить средство для лечения инфекции, вызванной Ркеийотопак аегидшока (непатентный документ 2), были разработаны поликлональные антитела (непатентные документы 3, 4) и моноклональные антитела (непатентные документы 5, 6) против РсгУ, обладающие нейтрализующей активностью. Однако поликлональные антитела тяжело гуманизировать и использовать в качестве фармацевтических композиций, поскольку их антигенность сложно улучшить. Также, моноклональные антитела, о которых сообщалось ранее, обладают низкой нейтрализующей активностью и не соответствуют требованиям, предъявляемым в клинике.

Патентный документ 1: патент США № 6551795.

Патентный документ 2: Японский перевод публикации РСТ № 2005-500250.

Непатентный документ 1: Уайт, Т.Ь. е! а1., I. Вас!егю1., 1997, уо1. 179, р.7165.

Непатентный документ 2: Т. Бауа е! а1., №!иге Мейюше, 1999, уо1. 5, р.392.

Непатентный документ 3: БЫте Ν. е! а1., I. Iттиηо1. 2001, уо1. 167, р.5880.

Непатентный документ 4: Бпатийа Υ. е! а1., Еиг.Кекрй. I., 2007, уо1. 29, р.965.

Непатентный документ 5: Каппе Раите е! а1., I. Iттипе. Вакей. Тйегар1е8 апй Уассшек, 2003, уо1. 1.

Непатентный документ 6: Оага Ргапк е! а1., I. ОйесГ О18еа8е, 2002, уо1. 186, р.64.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача настоящего изобретения

Задачей настоящего изобретения является обеспечение средства, эффективного в лечении инфекции, в частности инфекции, вызванной Ркеийотопак аегидшока.

Средства решения проблемы

В результате настойчивых усилий, направленных на получение моноклонального антитела против РсгУ, авторы настоящего изобретения получили новое моноклональное антитело, которое, как считают, обладает более выраженным терапевтическим эффектом в отношении заболевания, чем известные моноклональные антитела к РсгУ. Таким образом было сделано настоящее изобретение.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к (1) моноклональному антителу против РсгУ или части такого антитела, причем указанное антитело обладает по меньшей мере одним признаком, выбранным из (A) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Ркеийотопак аегидшока в отношении клеток лейкоцитов при концентрации от 1 до 200 нМ ш уйго;

(B) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Ркеийотопак аегидшока в отношении клеток миеломы в концентрации от 1 до 50 нМ ш уйго; и (C) константой диссоциации (Кй) с РсгУ 2х 10^-9 (М) или меньше;

(2) моноклональному антителу или части такого антитела, которое содержит последовательность аминокислот, включающую гипервариабельный участок (СОК) моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21403, или гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21404, или гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21405, или гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21406;

(3) моноклональному антителу или части такого антитела, продуцируемому гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21403, гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21404, гибри- 1 020544 домой, депонированной под номером РЕКМ Р-21405, гибридомой, депонированной под номером РЕКМ Р-21406;

(4) моноклональному антителу против РсгУ или части такого антитела, эпитоп которого располагается в положениях с 136 по 233 последовательности аминокислот 8ЕО ГО N0: 1;

(5) моноклональному антителу против РсгУ или части такого антитела, содержащему 1) гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: 8ΕΤ8ΥΑΛ1ΙI (8КС) ГО N0: 15), ^δΝΟΚΊΝΥΝΕΚΕΝΤ (81 Г) ГО N0: 16), Υ(..ΥΥ\ΛΎΥΤ\1Ι)Υ (8КС) ГО N0: 17), и 2) гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: 8Α8Τ8ν8ΥΜΕ (8Е0 ΙΌ N0: 18), ТТ8КЬА8 (8Е0 ΙΌ N0: 19), Нр\К1^РРТ (8 КС) ГО N0: 20);

(6) моноклональному антителу против РсгУ или части такого антитела, содержащему 1) гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: 8ΙΤ8Ι)ΥΑ\\Ύ (8КС) ΙΌ N0: 21) ΥΙΤΥ\(..Ι)Τ8Υ\Ρ8ΚΚ8 (8КС) ΙΌ N0: 22), 8ΗΥΥΥ(.,Α\\Ί^;ΑΥ (8КС) ΙΌ N0: 23), и 2) гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: ΚΑ8(9ΥΑΥ.ΤΤνΑ (8КС) ΙΌ N0: 24), ΚΑ8ΤΚΗΤ (8КС) ΙΌ N0: 25), 00ΥΕ88ΕΕΤ (8КС) ΙΌ N0: 26);

(7) моноклональному антителу против РсгУ или части такого антитела, содержащему 1) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 11, и 2) вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 12;

(8) моноклональному антителу против РсгУ или части такого антитела, содержащему 1) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 13, и 2) вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Ε^ГОN0: 14;

(9) фармацевтической композиции, включающей антитело или часть антитела, описанные в любом из пунктов (1)-(8) в качестве активного ингредиента; и (10) гибридоме, продуцирующей антитело или часть антитела, описанные в любом из пунктов (1)(8).

Применение изобретения

Моноклональное антитело или часть антитела согласно настоящему изобретению пригодно в качестве агента для лечения инфекции, поскольку оно обладает прекрасной нейтрализующей активностью в отношении РсгУ.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показаны кривые вытеснения меченого биотином РсгУ немеченым РсгУ в антителах к РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66).

На фиг. 2 представлены значения аффинности антител к РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66), определенные методом поверхностного плазмонного резонанса.

На фиг. 3 показаны результаты сэндвич-анализа между антителами к РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66) и МаЫ66.

На фиг. 4 показано ингибирующее влияние антител к РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66) на цитотоксичность Ркеийотоиак аетидшока (штамм 8К24) в отношении клеток И937.

На фиг. 5 показано ингибирующее влияние антител к РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66) ) на цитотоксичность Ркеийотоиак аетидшока (штамм 8К24) в отношении клеток миеломы Р3И1.

На фиг. 6 показаны кривые вытеснения меченого биотином РсгУ немеченым полноразмерным РсгУ и укороченным РсгУ в антителах к РсгУ (1Р3, 2А4, 9Ό12, 12Н9 и МаЫ66).

На фиг. 7 показана реактивность антител к РсгУ с полноразмерным РсгУ и укороченным РсгУ (1Р3, 2А4, 9Ό12, 12Н9 и МаЫ66) в анализе методом Вестерн-блот.

На фиг. 8 показана корреляция между антителом и полноразмерным РсгУ, определенная по активности ингибирования цитотоксичности.

На фиг. 9 показана корреляция между антителом и полноразмерным РсгУ, определенная по подавлению ингибирования цитотоксичности.

На фиг. 10 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 1Р3. Гипервариабельный участок выделен подчеркиванием.

На фиг. 11 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 2А4. Гипервариабельный участок выделен подчеркиванием.

Лучший вариант осуществления изобретения

Моноклональное антитело, являющееся объектом настоящего изобретения, представляет собой антитело, которое специфично связывает описанный выше РсгУ. Более конкретно, такое антитело представляет собой моноклональное антитело против РсгУ, обладающее по меньшей мере одним признаком, выбранным из (1) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Ркеийотоиак аегищиока в отношении клеток лейкоцитов в концентрации от 1 до 200 нМ ίη уйго; (2) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Ркеийотоиак аетидтока в отношении клеток миеломы в концентрации от 1 до 50 нМ ίη уйго; и (3) константой диссоциации с (Кй) РсгУ 2х10^-9 (М) или менее.

Одним из признаков моноклонального антитело согласно настоящему изобретению является высо- 2 020544 кая активность ингибирования цитотоксичности. Например, в случае использования клеток лейкоцитов моноклональное антитело обладает такой активностью ингибирования (нейтрализации), которая обеспечивает ингибирование 50% или более цитотоксичности Рвеиботопав аегидтова при концентрации в диапазоне от 1 до 200 нМ, предпочтительно от 2 до 100 нМ, более предпочтительно от 5 до 25 нМ. В случае использования клеток миеломы антитело обладает такой активностью ингибирования (нейтрализации), которая обеспечивает ингибирование 50% или более цитотоксичности Рвеиботопав аегидтова, при концентрации в диапазоне от 1 до 50 нМ, предпочтительно от 2 до 30 нМ, более предпочтительно от 4 до 20 нМ. Приведенные значения намного превосходят значения активности МЫбб, о которых сообщалось в (Эага Ргапк е1 а1. (I. ЫесР О|БеаБе, 2002, уо1. 18б, р. б4)).

Другим признаком моноклонального антитела согласно настоящему изобретению является то, что эпитоп этого антитела находится в области в положениях от 13б до 233 в полноразмерной последовательности аминокислот РсгУ (δΕΟ N0: 1). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитело, которое распознает данный участок, обладает более высокой активностью (активностью ингибирования цитотоксичностью), чем антитело, которое распознает другой участок.

Распознавание эпитопа моноклональным антителом может быть определено следующим образом. Во-первых, получают множество фрагментов молекулы, которую должно распознавать моноклональное антитело. Для получения указанных фрагментов используют метод получения пептидных фрагментов молекулы по известной методике синтеза пептидов, способ получения их в хозяине, таком как Е. сой, (или секретирования хозяином) путем встраивания в подходящую плазмиду экспрессии последовательности ДНК, кодирующей целевой пептидный фрагмент, и другие подобные способы. Однако, для решений указанной задачи обычно используют комбинацию таких способов. Например, после получения набора полипептидов, представляющих собой укороченный на подходящую длину с С-конца или Т-конца антигенный белок, путем применения технологии рекомбинантных генов, хорошо известной специалистам, исследуют реактивность моноклонального антитела с этими полипептидами, что позволяет приблизительно определить распознаваемый участок.

Затем, более направленно синтезируют множество олигопептидов соответствующей части, мутантных пептидов или подобных вариантов с использованием методики синтеза олигопептидов, хорошо известной специалистам, и определяют эпитоп путем изучения способности антитела, содержащего профилактический или терапевтический агент, согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента с указанными пептидами или путем исследования активности конкурентного ингибирования этих пептидов в отношении связывания между моноклональным антителом и антигеном. В качестве удобного средства для получения множества олигопептидов можно также использовать коммерчески доступный набор (например, набор δΡ0Τ (который можно приобрести в ОепоБуБ Вю1есйпо1од1еБ, 1пс.), серия наборов для синтеза кт4, реализующий метод параллельного синтеза (можно приобрести в СЫгоп Согрогабоп).

Активность ингибирования цитотоксичности может быть измерена следующим образом. Вначале моноклональное антитело, для которого следует измерить токсичность, разбавляют до подходящих концентраций путем серийных 2-кратных разбавлений.

Затем клетки, обработанные токсином Рвеиботопав аегидтова или чем-то подобным (здесь и далее называемые клетками-мишенями), разбавляют, например, при помощи среды для культуры клеток до получения подходящего количества. В частности, предпочтительно доводить количество клеток до 3х10^б-5х10^б клеток/мл в случае использования клеток миеломы и до 1х10^б-3х10^б клеток/мл в случае использования лейкоцитов. Аналогично, клетки Рвеиботопав также доводят до 1х10⁷-5х10⁸ КОЕ/мл с использованием, например, культуральной среды. Клетки Рвеиботопав аегидтова и клетки-мишени культивируют в присутствии моноклонального антитела в одной пробирке или лунке (например, в условиях ш уйго: например, в лунке микропланшета) в соответствующих условиях. Условия культивирования могут представлять собой условия, обычно используемые для культивирования, которые считаются подходящими для выращивания клеток или бактерий. Что касается времени культивирования, оптимальные значения варьируют в зависимости от типа клеток-мишеней и могут составлять, например, приблизительно от 1 до 3 ч в случае клеток миеломы и приблизительно от 1 до 3 ч в случае, если предпочтительно использовать лейкоциты. Лунку, в которую не добавлено антитело, используют в качестве контроля и рассчитывают концентрацию, при которой наблюдают 50% ингибирование по сравнению с контролем (эффективная концентрация). Что касается определения живых и мёртвых клеток-мишений, то хотя были разработаны различные процедуры, часто применяют измерение поглощения на соответствующей длине волны (например, от 400 до 500 нм) после добавления окрашивающего реагента (см. №Щ.1ге Мебюше 1999, уо1.5, р. 392-395).

Одним из признаков моноклонального антитела согласно настоящему изобретению является высокая аффинность в отношении РсгУ. Константу диссоциации (Кб), которую используют в качестве показателя аффинности антитела или моноклонального антитела, можно исследовать различными путями. Например, можно легко осуществить анализ по методу Скэтчарда с использованием антигена, меченого различными метками, или метода с использованием коммерчески доступного набора для измерения

- 3 020544

Ыасоге X (можно приобрести в ЛтегкЬат РЬагтас1а) или аналогичного набора в соответствии с руководством по применению и протоколам экспериментов, прилагающейся к набору. Константа диссоциации (значение Κά), определенная таким способом, выражается в М (молях). Чем меньше константа диссоциации исследуемого моноклонального антитела, там выше аффинность указанного моноклонального антитела. Что касается антитела согласно настоящему изобретению или части такого антитела, константа диссоциации (Κά) с РсгУ составляет 2х10^-9 (М) или менее, предпочтительно 1,5х10^-9 (М) или менее, более предпочтительно 1,2х10^-9 (М) или менее.

Предпочтительно в моноклональном антителе согласно настоящему изобретению вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи имеют человеческое происхождение, возможно имеют последовательность, производную от БЕф ГО N0: 11-14 (например, включают указанные последовательности, содержащие замену, вставку, делецию или присоединение одной или нескольких аминокислот). Константная область предпочтительно включает соответствующую константную область человека (например, как описано у КаЬа! Е.А. е1 а1., ИБ ОераПтеШ о£ Неа1Ш аи4 Нитап Бегуюек, РиЬБс НеаИЬ Бегуюе, Νηΐίοηηΐ 1п81йи1с о£ НеаНЪ). Проверка гомологии путем поиска последовательности аминокислот в базе данных аминокислотных последовательностей антител, созданных КаЬа1 е1 а1. (Бесщепсе о£ РгоЮнъ о£ 1ттипо1офса1 БИегеЧ ИБ Эер1. НеаИЬ ап4 Нитап Бегуюек, 1983) позволяет найти гипервариабельные участки. Что касается гипервариабельного участка, настоящее изобретение включает модифицированные варианты, содержащие по меньшей мере одно присоединение, вставку, замену или делецию при условии сохранения биологической активности (например, активности связывания или активности нейтрализации), требующейся согласно настоящему изобретению. Включены последовательности, обладающие гомологией с каждым гипервариабельным участком, составляющей от 90 до 100%. Предпочтительно настоящее изобретение относится к последовательностям, имеющим гомологию от 95 до 100%. Более предпочтительно изобретение относится к последовательностям, обладающим гомологией от 98 до 100%.

Каркасный участок может представлять собой каркасный участок любого вида и предпочтительно является каркасным участком человека. Предпочтительные каркасные участки могут быть выбраны на основании информации, приведенной в цитируемом выше документе (КаЬа1 Е.А. е1 а1.). Предпочтительный каркасный участок тяжелой кепи представляет собой каркасный участок тяжелой цепи человека, например, каркасный участок антитела к РсгУ, показанного на фиг. 10 или 11. Указанный участок можно определить по показанной на фиг. 10 или 11 последовательности, как описано в цитируемом документе. Аналогично, каркасную область легкой цепи можно определить по последовательности, показанной на фиг. 10 или 11 согласно цитируемому выше документу.

В более предпочтительном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению может включать антитело, содержащее по меньшей мере а)(1) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (У_Н) или ее фрагмент, последовательность которых содержит гипервариабельные участки СГОРЕ СГОВ2 и СГОК3. причем СГОВ1 имеет последовательность аминокислот БРТБУ^МН (БЕф ГО N0: 15), СГОВ2 имеет последовательность аминокислот INРБNСΚΤNΥNЕΚΡNΤ (БЕф ГО N0: 16) и СГОВ3 имеет последовательность аминокислот ΥΟΝΥννΥΥΤΜΌΥ (БЕф ГО N0: 17), и (ίί) константную область тяжелой цепи человека или ее фрагмент.

Затем, Ь) оно предпочтительно включает (ί) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (Уь), в которой СГОВ1 имеет последовательность аминокислот БАБТБУБУМЕ (БЕф ГО N0: 18), СГОВ2 имеет последовательность аминокислот ТТБКЬАБ (БЕф ГО N0: 19) и СГОВ3 имеет последовательность аминокислот Н^\VΒNΥРБΤ (БЕф ГО N0: 20), и (ίί) константную область легкой цепи человека или ее часть.

Далее, более предпочтительное антитело к РсгУ согласно настоящему изобретению может представлять собой антитело, содержащее по меньшей мере а)(1) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (У_Н) или ее фрагмент, последовательность которого включает гипервариабельные участки СЭРЕ СГОР2 и 0ΌΚ3, причем СГОР1 имеет последовательность аминокислот БIΤБ^ΥА\VN (БЕф ГО N0: 21), СГОР2 имеет последовательность аминокислот ΥIΤΥNС^ΤБΥNРБ^ΚБ (БЕф ГО N0: 22) и СГОР3 имеет последовательность аминокислот БΡNΥΥСА\VБАΥ (БЕф ГО N0: 23), и (ίί) константную область тяжелой цепи человека или ее фрагмент.

Затем, Ь) оно предпочтительно включает (ί) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (Уь), в которой СЭР1 имеет последовательность аминокислот КАБРУУСТТУА (БЕР ГО N0: 24), СГОР2 имеет последовательность аминокислот КАБТРНТ (БЕр ГО N0: 25) и СГОР3 имеет последовательность аминокислот РРУСББРБТ (БЕр ГО N0: 26), и (ίί) константную область легкой цепи человека или ее фрагмент.

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть получено в соответствии с обычным существующим методом получения с использованием РсгУ (природный вариант, рекомбинантный вариант или синтетический вариант и т.д.) в качестве иммуногена. В частности, вначале млекопитающее, предпочтительно мышь, крысу, хомяка, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, козу, овцу, осла, лошадь или жвачное (включая трансгенных животных, способных продуцировать антитела других животных, например, трансгенная мышь, продуцирующая антитела человека), более предпочтительно мышь, крысу, хомяка, морскую свинку или кролика, иммунизируют РсгУ, служащего иммуногеном, при

- 4 020544 необходимости, в комбинации с адъювантов Фрейнда путем однократной или многократных подкожных, внутримышечных, внутривенных, внутрибрюшинных инъекций или инъекций в лапу.

Обычно иммунизацию осуществляют от одного до четырех раз с интервалами приблизительно от 1 до 21 дней после первичной иммунизации; клетки животного, продуцирующие антитела, могут быть получены через от 1 до 10 дней после последней иммунизации. Количество иммунизации и интервалы между иммунизациями можно соответствующим образом менять в зависимости от свойства используемого иммуногена.

Примеры РсгУ, используемого в качестве иммуногена или гаптена, приведены ниже.

(A) Клетки, экспрессирующие РстУ на поверхность или искусственно созданные штаммы клеток, экспрессирующие РсгУ на поверхность, или рекомбинантные клетки, полученные с использованием технологии рекомбинантных генов, экспрессирующие РсгУ на поверхность;

(B) супернатант культуры, полученной путем культивирования рекомбинантных клеток, полученных с использованием технологии рекомбинантных генов, экспрессирующих РсгУ, или белковая фракция такого супернатанта, или РсгУ или его часть, выделенная из супернатанта культуры; или (C) химически синтезированный РсгУ или его часть.

Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть получена в соответствии с методом, описанным КоЫег и Μίΐδΐβίη (ИаЫге, 1975, νοί. 256, р. 495-497), или аналогичным способом. Т.е. гибридома может быть получена в результате слияния клеток, продуцирующих антитела, присутствующих в селезенке, лимфатических узлах, костном мозге, миндалинах и т.д., полученных из организма животного, иммунизированного, как описано выше, и клетки миеломы, лишенной способности продуцировать антитела, полученной предпочтительно из млекопитающего, такого как мышь, крыса, морская свинка, кролик или человек, предпочтительно из мыши, крысы или человека.

В качестве клетки миеломы для слияния могут быть использованы линии клеток, полученные из мыши, например мыши, устойчивой к 8-азагуанидину (получены из ВАЬВ/с) штамм миеломы Р3Х63А§8И.1 (Р3-И1) |Уе11оп, Ό.Ε. е1 а1., СиггеШ Торюз ίη МюгоЬЫоду апй 1ттипо1оду, 81, 1-7 (1978)], Р3/И§1/1-А§4-1(К§-1) [КоЫег, О е1 а1., Еигореап ί. 1ттипо1оду, 6, 511-519 (1976)], §Р2/О-Ад14 (§Р-2) [§Ьи1тап, Μ. е1 а1. Ка1нге, 276, 269-270 (1978)], Р3Х63А§8, 653(653) [Кеагпеу, ТЕ. е1 а1., I. 1ттипо1оду, 123, 1548-1550 (1979)], Р3Х63А§8(Х63) |НопЪа1а, К. апс! Натз, А.№. ЫаЫге, 256, 495-497 (1975)] и т.п.

Гибридому, которая продуцирует антитела, подвергают скринингу путем культивирования гибридомы, например, в микротитрационном планшете, измерения реактивности в отношении иммуногена, использованного для иммунизации мышей, описанной выше, в супернатанте культуры в лунке, в которой наблюдают пролиферацию с использование иммунологического метода измерения, такого как РИА или твердофазный ИФА, и отбора клона, который продуцирует моноклональное антитело, демонстрирующее специфичную аффинность в отношении иммуногена или гаптена. Затем обычно используют неконкурентный ИФА, в котором иммуноген находится в твердой фазе, а антитело в супернатанте культуры, которое связывается с иммуногеном, детектируют при помощи вторичных антител к антителам мыши, мыченых ферментом.

Продуцирование моноклональных антител гибиродомой может быть осуществлено путем культивирования гибридомы ш νίΙΐΌ или в асцитах мыши крысы, морской свинки, хомяка или кролика, предпочтительно мыши или кролика, или более предпочтительно мыши с последующим выделением супернатантов культур или асцитов млекопитающих. В случае культуры ш νίΙΐΌ гибридому можно культивировать в ивестной питательной среде или в питательных средах, полученных из известных базовых сред, используемых для размножения, поддержания или хранения гибридом и для продуцирования моноклональных антител в супернатант культуры, в зависимости от многих факторов, таких как вид культивируемых клеток, объект исследования и способ культивирования.

В качестве базовой среды могут быть использованы, например, среда с низким содержанием кальция, такая как среда как Нат'Р12, среда МСИВ153 или культуральная среда ΜΕΜ с низким содержанием кальция, а также среды с высоким содержание кальция, такие как среда Μί-ΌΡΚΗ, среда ΜΕΜ, среда ΌΜΕΜ, среда ΚРΜI1640, среда АР104 или среда ΚΌ, такие базовые среды могут содержать, например, сыворотку, гормон, цитокин и/или различные органические и неорганические вещества в зависимости от задачи. Выделение и очистка моноклонального антитела могут быть осуществлены путем обработки описанных выше супернатантов культур или асцитов насыщенным сульфатом аммония или проведения ионообменной хроматографии (например, ΩΕΛΕ или ΌΕ52), аффинной хроматографии на колонке, например, на колонке с антителами к иммуноглобулинам или на колонке с белком А и т.д.

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, представляющее собой рекомбинантное антитело, получают с использованием технологии рекомбинантных генов. Например, ген антитела клонируют из клетки, продуцирующей антитело, например гибридомы, и встраивают в подходящий вектор, и вектор вводят в клетку-хозяина (см., например, Саг1 е1 а1., ТНΕΚΛРΕυТIС ΜОNОС^ОNΛ^ АИТГВОПШЗ, опубл. в 1990).

В частности, из гибридомы, которая продуцирует целевое антитело, или из иммунной клетки, которая продуцирует антитело, например, из клетки, полученной путем иммортализации сенсибилизированных лимфоцитов, или подобных клеток при помощи ракового гена или подобным образом, выделяют

- 5 020544 мРНК, кодирующую вариабельную область (У-область) антитела. Из выделенной мРНК известным способом, например, путем ультрацентрифугирования с гуанидином (СЫтддап, ЕМ. е! а1., ВюсНетМгу (1979) 18, 5294-5299) или подобным способом, получают РНК, после чего готовят мРНК при помощи набора для очистки мРНК ιηΡΝΛ Рипйсайоп КН (можно приобрести в РНатташа) или подобных средств.

С использованием полученной мРНК синтезируют кДНК вариабельной области антитела с использованием обратной транскриптазы. Синтез кДНК можно осуществить с использованием набора АМУ Рсусгес Тгап8сг1р1а5е Р1т51-51гапй с^NА §уп1йе515 КН или подобного средства. Дополнительно, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор 5'-АтрН ΡΙΝΏΕΚ КАСЕКН (можно приобрести в С1опе!есН) и метод 5'-КАСЕ с использованием ПЦР (РтоНтап, М.А. е! а1., Ргос. №11. АсаН. §с1. И8А 1988, νοί. 85, р. 8998). Целевой фрагмент ДНК выделяют (очищают) из полученного продукта ПЦР и связывают с ДНК-вектором. Полученный таким образом рекомбинантный вектор вводят в Е. соН или подобный организм, отбирают колонию и получают нужный рекомбинантный вектор. Последовательность оснований ДНК для целевой ДНК проверяют известным методом, например, деокси-методом.

Получают ДНК, кодирующую вариабельную область целевого антитела, соединяют с ДНК, кодирующей константную область желательного антитела (С-область), и встраивают в вектор экспрессии. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая У-область антитела, может быть встроена в вектор экспрессии, содержащий ДНК С-области антитела. Для получения антитела согласно настоящему ген антитела встраивают в вектор экспрессии, в результате чего экспрессия указанного гена находится под контролем контрольной области, например энхансера/промотора. Затем клетку-хозяина трансформируют указанным вектором экспрессии, что обеспечивает экспрессию антитела.

Для экспресснирования гена антитела тяжелая цепь (Н-цепь) или легкая цепь (Ь-цепь) антитела могут быть встроены в вектор экспрессии по отдельности, либо клетка хозяин может быть трансформирована такими векторами одновременно, или ДНК, кодирующая Н-цепь и Ь-цепь, может быть встроена в один вектор экспрессии, после чего полученным вектором трансформируют хозяина (см. \УО 94/11523).

Моноклональное антитела согласно настоящему изобретению включает антитела, полученные при помощи методик рекомбинации генов, которые искусственно модифицицрованы с целью снижения гетерологичной антигенности в организме человека, например, химерные моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела или моноклональные антитела человека.

Химерное моноклональное антитело состоит из У-области, полученной из антитела млекопитающего, отличного от человека, и С-области, полученной из антитела человека, а гуманизированное антитело состоит из гипервариабельного участка, полученного из антитела млекопитающего, отличного от человека, и каркасного участка и С-области, полученных из антитела человека. Указанные антитела пригодны в качестве антител согласно настоящему изобретению, поскольку их антигенность для организма человека снижена. Такие модифицированные антитела могут быть получены известными методами.

Химерные моноклональные антитела получают путем присоединения ДНК, кодирующей, Уобласть антитела, полученной, как описано выше, с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, встраивания полученной ДНК в вектор экспрессии и введения полученного вектора экспрессии в хозяина, что обеспечивает продуцирование (например, \УО 95/14041). Используя описанный известный метод, можно получить моноклональные антитела согласно настоящему изобретению.

Гуманизированные моноклональные антитела получают путем трансплантации гипервариабельного участка (СОК) антитела млекопитающего, отличного от человека, например, мыши, в каркасный участок антитела человека. Общая технология рекомбинантных генов, которую можно использовать для этого, также известна (например, \УО 95/14041).

В частности, последовательность ДНК, сконструированная таким образом, что в ней соединены СОК антитела мыши и каркасный участок (РК) антитела человека, синтезируют методом ПЦР с нескольких олигонуклеотидов, содержащих перекрывающиеся участки на концах. Полученную ДНК соединяют с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, и встраивают вектор экспрессии, и полученный вектор экспрессии вводят в клетку-хозяина, что обеспечивает продуцирование (например, \УО 95/14041).

При встраивании в РК антитела человека гипарвариабельных участков СОК выбирают тот, в котором образуется хороший сайт связывания антигена. В случае необходимости, аминокислота каркасного участка в вариабельной области может быть заменена, причём полученный в результате такой замены СОК антитела человека образует подходящий сайт связывания антигена (8а1о, К. е! а1., Сапсег Кее. 1993, νο1. 53, р. 851). В химерном моноклональном антителе и гуманизированном моноклональном антителе используется С-область антитела человека. К предпочтительным вариантам С-области относится С#, например С#1, С#2, С#3 и С#4. Дополнительно, для улучшения стабильности антитела или продукции антитела может быть модифицирована С-область.

Моноклональное антитело человека состоит из У-области и С-области, полученных из антитела человека, и может быть получено путем иммунизации трансгенного животного, не являющегося человеком, продуцирующего антитела человека, например, трансгенной мыши, продуцирующей антитела человека, (например, \УО 94/25585) иммуногеном в соответствии с общим способом продуцирования моноклональных антител.

Согласно настоящему изобретению фраза часть моноклонального антител обозначает область

- 6 020544 указанного моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, которая обладает способностью специфично связываться с РсгУ аналогично моноклональному антителу (здесь и далее также фрагмент антитела).

В частности, можно указать РаЬ (антителосвязывающий фрагмент), Р(аЬ')2, РаЬ', одноцепочечное антитело (одноцепочечный Ρν; далее обозначается 8сРу), антитело, стабилизированное дисульфидными связями (Ρν, стабилизированный дисульфидными связями; здесь и далее άδΡν), фрагмент, включающий собой димеризованную У-область (здесь и далее диатело), пептид, содержащий, обладающий способностью к специфичному связыванию РсгУ (Ехрей ορίηίοη оп Шегареибс раЮпК νοί. 6, Νο. 5, ρ. 441-456, 1996).

РаЬ представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой около 50,000, обладающий антигенсвязывающей активностью, состоящий приблизительно из половины Ν-концевой части Н-цепи и целой Ь-цепи, полученный путем ферментативного разрушения с использованием фермента папаина части пептида выше двух дисульфидных связей (8-8 связь), поперечно сшивающих две Н-цепи в шарнирной области 1дС. РаЬ, используемый в настоящем изобретении, может быть получен путем обработки моноклонального антитела согласно настоящему изобретению папаином. В качестве альтернативы, РаЬ может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей РаЬ моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, в вектор экспрессии и введения указанного вектора в клетку с обеспечением экспрессии.

Р(аЬ')2 представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой около 100000, обладающий антигенсвязывающей активностью, образованный путем связывания двух фрагментов РаЬ' в шарнирной области. Указанные области РаЬ' получают путем разрушения пепсином ниже двух 8-8 связей шарнирной области 1дС. Р(аЬ')2 для использования в настоящем изобретении может быть получен путем обработки моноклонального антитела согласно настоящему изобретению пепсином. В качестве альтернативы, Р(аЬ')2 может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей Р(аЬ')2 моноклонального антитела в вектор экспрессии для клетки и встраивания полученного вектора в клетку Е. той, клетку дрожжей или животных, что обеспечивает экспрессию.

РаЬ' представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой приблизительно 50000, обладающий антигенсвязывающей активностью, получаемый путем разрезания связи 8-8 между шарнирными участками упомянутого выше Р(аЬ')₂. РаЬ', используемый в настоящем изобретении может быть получен путем обработки Р(аЬ')2 моноклонального антитела согласно настоящему изобретению восстанавливающим агентом, дитиотреитолом. В качестве альтернативы РаЬ' может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей РаЬ' моноклонального антитела, в вектор экспрессии для клетки и встраивания полученного вектора в клетку Е. той, клетку дрожжей или клетку животных, что обеспечивает экспрессию.

5сРу представляет собой пептид УН-Р-УЪ или УЬ-Р-УН, в котором одна цепь УН и одна цепь УЬ соединены подходящим пептидным ликером (здесь и далее Р), и является фрагментом антитела, обладающим антигенной активностью. УН и УЬ, входящие в состав 8сΡν, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. 8сΡν, используемый в настоящему изобретении, может быть получен путем выделения кДНК, кодирующей УН и УЪ, из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии 8сΡν и обеспечения экспрессии путем введения вектора экспрессии в клетку Е. той, дрожжей или животных.

ά8Ρν относится к фрагменту, полученному путем связывания полипептидов, в которых остаток аминокислоты в каждой из УЬ и УЬ заменен на остаток цистеина, 8-8 связью. Остаток аминокислоты для замены на остаток цистеина может быть выбран на основании предсказания третичной структуры антитела согласно методу, описанному Вейег е1 а1. (РгоЮш Епдшеегшд, 7, 697 (1994)). УН или УЬ, входящие в состав ά8Ρν, используемого в настоящем изобретении, могут быть получены из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. ά8Ρν, используемое в настоящем изобретении, может быть получено путем выделения кДНК, кодирующей УН и УЬ из гибридомы, продуцирующей антитело согласно настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии ά8Ρν путем встраивания указанной кДНК в подходящий вектор экспрессии и встраивания вектора экспрессии в клетку Е. той, дрожжей или животных.

Диатело представляет собой фрагмент антитела, являющееся димером 8сΡν, обладающим одинаковыми или разными специфичностями связывания антитела. Диатело представляет собой фрагмент антитела, обладающий бивалентной активностью связывания антигена в отношении одного или различных антигенов. Например, бивалентное антитело, которое специфично реагирует с моноклональным антителом, согласно настоящему изобретению может быть получено путем выделения кДНК, кодирующей УН и УЬ моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, конструирования ДНК, кодирующей 8сΡν, содержащий пептидный линкер из от 3 до 10 остатков, встраивания полученной ДНК в вектор экспрессии для клетки и обеспечения экспрессии диатела путем введения полученного вектора экспрессии в клетку Е. той, дрожжей или животных.

Пептид, содержащий ΟΌΚ, включает по меньшей мере один гипервариабельный участок УН или УЬ. Множество ΟΌΚ могут быть связаны непосредственно или через подходящий пептидный линкер. Пептид, содержащий ΟΌΚ, используемый в настоящем изобретении, может быть получен путем получе- 7 020544 ния кДНК, кодирующей УН и УЬ моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, конструирования ДНК, кодирующей встраивания полученной ДНК в вектор экспрессии для клетки экспрессии и обеспечения экспрессии путем введения полученного вектора экспрессии в клетку Е. сой, дрожжей или животных. Пептид, содержащий СЭВ, может также быть получен путем химического синтеза, например, методом с использованием Ртос (флуоренил метилоксикарбонил) или методом с использование !Вос (ΐбутилоксикарбонил).

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть могут быть модифицированы при условии сохранения возможности использования их в настоящем изобретении. Модифицированная форма антител, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой антитела, связанные с различными молекулами, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ) и т.д. Модификация антитела может представлять собой модификацию путем введения химической связи или модификацию аминокислотной последовательности антитела. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть также включает такие вещества, полученные путем модификации антител. Для получения такой модифицированной формы антитела можно подвергнуть модификации полученное антитело. Такие методики хорошо известны в данной области.

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению и его часть пригодны для использования в фармацевтической композиции. Соответственно, фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть, можно вводить системно или топически пероральным или парентеральным путем. В случае парентерального введения, например, можно использовать внутривенную инъекцию, такую как капельная ифузия, внутримышечную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, подкожную инъекцию, интраназальное введение, ингаляции и т.д. Однако, поскольку известно, что Ркеиботопак аетидшока поражает в первую очередь клетки эпителия легких и макрофаги альвеол легких, поскольку инфицирует дыхательные пути (Т. §а^а е! а1., ИаШте Мебюше, 1999, уо1. 5, р. 392), предпочтительными являются интраназальное введение и ингаляции.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят пациенту, страдающему от муковисцедоза или инфекции, вызванной Ркеиботопак аетидтока. Например, эффективную дозу выбирают в диапазоне от 0,01 до 100 мг на 1 кг массы тела за одно введение. В качестве альтернативы может быть выбрана доза от 1 до 1000, предпочтительно от 5 до 50 мг для каждого пациента. Однако, доза в фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть, не ограничена указанными дозами. Продолжительность введения может быть выбрана в соответствии с возрастом, симптомами и т.д. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также включать фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество в зависимости от пути введения.

Примеры таких носителей и дополнительных веществ включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат натрия, водорастворимый декстран, пектин, метилцеллюлозу, казеин, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, альбумин сыворотки человека (Н8Л), маннитол, сорбит, глюкозу и поверхностно-активные вещества, допустимые для применения в качестве фармацевтических добавок. Добавка для использования может быть выбрана из вышеперечисленных или их комбинаций в зависимости от лекарственной формы. Однако приведенный список не является ограничивающим.

Типичный пример

Получение рекомбинантного МаЫбб

Для осуществления сравнительного эксперимента получали МаЫбб (заявка на патент Японии № 2005-500250 и т.д.) в форме моноклонального антитела.

Вначале экстрагировали мРНК гибридомы, которая продуцирует антитело, относящееся к подклассу 1дО2а, и константные области тяжелой цепи и легкой цепи клонировали методом ПЦР в реальном времени. Каждый фрагмент, амплифицированный путем ПЦР, встраивали в сайт ЫЬеЕНоБ вектора рсПЫАЗТ (+) (можно приобрести в 1пуЦтодеп СогрогаБоп) и затем вводили сайт мультриклонирования для обеспечения возможности введения фрагмента ДНК вариабельной части.

Затем, после разделения последовательности генов вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи МаЫбб на четыре части синтезировали соответствующую смысловую ДНК и антисмысловую ДНК и подвергали ренатурации (отжигу). После ренатурации их связывали с использованием ДНК-лигазы их клонировали в участок М£е1-В1р1 для тяжелой цепи и в участок ЕсоВУ-ВБГС1 для легкой цепи.

Векторы тяжелой цепи и легкой цепи с идентифицированными последовательностями вводили в клетку НЕК 239Т с использованием Ыро1ес1ат1пе 2000 (можно приобрести в 1пуйтодеп СогрогаБоп) и через 48 ч собирали супернатант культуры клеток. Из полученного супернатанта выделяли МаЫбб с использованием колонки с белком О Рто1еш-0 (можно приобрести в Р1ЕКСЕ).

Ниже настоящее изобретение проиллюстрировано при помощи неограничивающих примеров. Если не указано другое, для получения антител использовали методики, описанные в БптипосйетЫгу ίη РгасБсе (В1аск\уе11 8с1епБйс РиЪйсаБопк). Если не указано другое, в качестве генноинженерной методики использовали метод, описанный в Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЪотаФгу Мапиа1, 2-е изд. (Со1б 8рБпд НагЪог БаЪогаЮгу).

- 8 020544

Пример 1

Получение антигена

Экстрагировали хромосомную ДНК стандартного штамма РАО1 Ркеийотоиак аегидшо8а, полученного из Университета Токаи, Японии, и амплифицировали ген, кодирующий белок РсгУ (8ЕС ГО N0: 2) методом ПЦР, используя ДНК в качестве матрицы. Создавали сайт распознавания ферментом рестрикции 8рЫ в праймере 5'-части, сайт распознавания ферментом рестрикции ΗίπάΙΙΙ в праймере З'-части (8ЕС ГО N0: 3, 4) и осуществляли модификацию вектора с введением цистеина для мечения биотином между гистидиновой меткой и старт-кодоном. Амплифицированный путем ПЦР фрагмент клонировали в вектор рЖЕ30 (можно приобрести в СЕ ЬеаЙЬсаге) в сайтах 8рЫ и ΗίηάΙΙΙ. После секвенирования вектор вводили в Е. сой ίΜ109, в результате чего получали рекомбинантную Е. сой (РсгУ-1М109). РсгУ-!М109 культивировали в 500 мл жидкой среде для культивирования ЬВ/ампицилин при 37°С и после достижения оптической плотности (0Ό) 600 0,5 добавляли ГРТС до конечной концентрации 0,75 мМ. После культивирования при 37°С в течение еще 1,5 ч бактериальные клетки центрифугировали и добавляли к ним 15 мл буфера А (25 мМ ТП8-НС1 (рН 8,0), 0,5 М №·ιίΤ 2 мМ МдС1₂), содержащего 0,5% лиозим (можно приобрести в 8щша). После инкубации при 0°С в течение 30 мин клетки обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования получали растворимую фракцию, которую наносили на колонку Ηΐ8Βίηά (можно приобрести в №уадеп), и затем элюировали буфером В (20 мМ фосфатный буфер (рН 7,4), 500 мМ №С1), содержащим 200 мМ имидазола. Конецную элюированную фракцию диализировали против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), чтобы заменить буфер.

Мечение антигена биотином

Экспрессированный и очищенный, как описано выше, белок РсгУ обрабатывали раствором меркаптоэтиламина в конечной концентрации 10 мМ при 37°С в течение 150 мин для восстановления остатка цистеина. Активированный РЕО-амлеимидом биотин (можно приобрести в РГЕКСЕ) добавляли в 20кратном молярном отношении к восстановленным группам 8Η и оставляли для протекания реакции на ночь при 4°С, после чего осуществляли диализ для удаления непрореагировавшего биотина.

Иммунизация антигеном

Каждой из семи самок мышей Ва1й/с в возрасте 4 недель интраперитонеально вводили 20 мкг очищенного антигена РсгУ с полным адъювантов Фрейнда. Поддерживающую иммунизацию осуществляли путем введения 20 мкг РсгУ в неполном адъюванте Фрейнда через 14 и 35 дней. Затем через 77 дней проводили конечную иммунизацию путем интраперитонеального введения 20 мкг РсгУ и введения 10 мкг РсгУ в хвостовую вену.

Получение гибридомы

Селезенку извлекали через 3 дня после последней иммунизации, собирали клетки селезенки. Осуществляли слияние клетки селезенки и клетки миеломы мыши (р3х63-А§8.И1, лаборатория массовых иммледований, Токио) с использование 50% полиэтиленгликоля 4000 и проводили селекцию в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин.

Селекция антитела к РсгУ

Через 8 дней после слияния клеток проводили скрининг клеток, продуцирующих специфичные антитела. Метод иммуноанализа применяли следующим образом. В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в Шпс) добавляли 200 мкл буфера 1П8 (50 мМ ТГ18-НС1, рН 7,5), содержащего 2 мкг антитела к !дС мыши (можно приобрести в 8ЫЬауад1) и оставляли для иммобилизации на 16 ч при 4°С. Указанные лунки дважды промывали 300 мкл промывочного раствора (солевой раствор, содержащий 0,1% Т\\ееп 20), а затем добавляли 300 мкл блокирующего раствора (50 мМ Тг18НС1 рН 7,5, 2% В1оскАсе (можно приобрести в Эайирроп 8итйото РЬагта Со., ЬЙ.), 10% сахарозы) и оставляли на 2 ч при комнатной температуре. После того как каждую лунку дважды промыли 300 мкл раствора для промывки, 50 мкл супернатанта культуры клеток разбавляли 150 мкл буфера С (50 мМ буфер ΪΓΪ8, рН 7,6, содержащий 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Тетееп80 и 25 мМ диэтилентримин-^^№,№',№'-пентауксусной кислоты), добавляли в каждую лунку и оставляли для протекания реакции на ночь при 4°С. После трехкратной промывки 300 мкМ раствора для промывки, 200 мкМ буфера С, содержащего 10 нг меченого Ей стрептавидина (можно приобрести в РЕРКГО ЕЬМЕК), добавляли 25 нг меченого биотином РсгУ и оставляли для протекания реакции на 1 ч при комнатной температуре. После завершения реакции, трехкратной промывки 300 мкл раствора для промывки, добавляли 200 мкл усиливающего реагента (1,39 г/л фталата калия, 19,3 мг/л три-п-октилфосфин оксида, 4,59 мг/л 2-нафтоилтрифторацетона, 1,0 г/л Тгйоп-Х100, 6,0 г/л уксусной кислоты) и измеряли флуоресценцию с временной разверткой.

В результате скрининга было отобрано 20 клонов, которые продемонстрировали высокую аффинность в отношении рекомбинантного РсгУ, и исследовали активность ингибирования цитотоксичности Р8еийотопа8 аегидшо8а, как описано в примере 4. В результате активность ингибирования цитотоксичности обнаружили у 10 клонов, затем эти клоны дважды клонировали методом ограниченного разбавления, часто обеспечивало отбор гибридом. Из полученных 10 клонов отобрали 4 клона, которые демонстрировали высокую активность ингибирования цитотоксичности, и обозначили 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7, соответственно. Для этих антител определяли подкласс с использованием набора для изотипирования на- 9 020544 бора для иммуноферментного анализа с антителами мыши (можно приобрести в ΒΌ В1О8С1епсе8) и обнаружили, что 1Р3 принадлежит к подклассу 1дС2а. 2А4 принадлежит к подклассу 1д02Ь, 6Р5 принадлежит к подклассу 1д02а, 7А7 принадлежит к подклассу 1д02а.

Клетки гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7, депонировали в Национальном Институте Передовой Промышленной Науки и Технологии, Международном Депозитарии Запатентованных Организмов (№ 6, 1-1-1, НщаЧю ТкикиЬа-кйц ΙΒΑΚΑΟΙ, .ΤΑΡΑΝ) 18 октября 2007 г., под номерами ΡΕΡΜ Ρ-21403, ΡΕΡΜ Р-21404, ΡΕΡΜ Ρ-21405 и ΡΕΡΜ Ρ-21406, соответственно.

Пример 2

Связывающая активность антител

Для измерения связывающей активности антител (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7) проводили конкурентный иммуноанализ. В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в Νιιικ) добавляли 100 мкл буфера ΐήδ (50 мМ ТЙ8-НС1, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг антитела Рс к антителам мыши (можно приобрести в .Гасккоп 1ттипоРе8еасй) и иммобилизовали в течение 16 ч при 4°С. Эти лунки дважды промывали 300 мкл раствора для промывки, а затем добавляли 300 мкл блокирующего раствора и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для обеспечения блокирования (твердофазный планшет с антителом к 1д0 мыши). После двукратной промывки 300 мкМ раствора для промывки добавляли 2 нг/лунку немеченого БсгУ в пяти концентрациях в серии 10-кратных разбавлений, начиная с 500 нг/лунку. Затем добавляли 5 нг/лунку биотинилированного БсгУ и оставляли для протекания реакции на ночь. После четырехкратной промывки 300 мкл жидкости для промывки и добавления 100 мкл/лунку усиливающего реагента (можно приобрести в Ρе^к^ηΕ1те^) измеряли флуоресценцию после перемешивания в течение 1 мин. В результате 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 продемонстрировали более высокую активность связывания в отношении БсгУ, чем ΜаЬ166 (фиг. 1).

Затем определяли аффинность 1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и ΜаЬ166 в отношении БсгУ методом поверхностного плазмонного резонанса. Антитела Рс к антителам 1д0 иммобилизовали на сенсорном чипе ΟΜδ с использованием набора для фиксации антител мыши Μои8е АпБЬобу Сар(иге Κίΐ (можно приобрести в ΒΙΑί',ΌΡΕ) на устройстве В1Асоге Т100. Затем фиксировали каждое антитело к БсгУ и добавляли рекомбинантный БсгУ для определения значений ΚΌ.

В результате каждый клон продемонстрировал более высокую аффинность, чем ΜаЬ166. Значения аффинности составили 3,7х10^-10 (М) для 1Р3, 3,5х10^-10 (М) для 2А4, 1,1х 10^-1(М) для 6Р5 и 1,1х10^-9 (М) для 7А7, в то время как аффинность ΜаЬ 166 составила 3,0х 10^-9 (М) (фиг. 2).

Пример 3

Сэндвич-иммуноанализ с ΜаЬ166

Чтобы подтвердить, что 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 распознают эиитоп, отличны от эпитопа, распознаваемого ΜаЬ 166, проводили сэндвич-ммуноанализ между каждым антителом и ΜаЬ 166.

Вначале ΜаЬ166 метили биотином. 100 мкг ΜаЬ166 и 7,853 мкг биотина ΝΗ8-ΡΕΟ₄ (можно приобрести в ΡΙΕΚΓΕ) смешивали в 0,1 М ФБР (рН 7,4), и оставляли для протекания реакции на 2 ч на льду. Затем биотинилированное моноклональное антитело очищали путем гель-хроматографии (колонка 020008Ψ (можно приобрести в ТО8ОН)) для удаления непрореагировавшего биотина из реакционного раствора.

Сэндвич-иммуноанализ проводили следующим образом. В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в №тс) добавляли 100 мкл раствора ФБР (-), содержащего 500 нг антитела БсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7), и иммобилизовали в течение 16 ч при 4°С. Эти лунки промывали один раз 300 мкМ раствора для промывки, после чего добавляли 300 мкл блокирующего раствора и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для блокирования. После того как каждую лунку дважды промыли 300 мкл раствора для промывки, добавляли 100 мкл буфера для анализа (можно приобрести в ^УаПас), содержащего 50 нг БсгУ и 50 нг меченого биотином ΜаЬ166, и оставляли на ночь для протекания реакции при 4°С. После трехкратной промывки промывочным раствором добавляли 100 мкл буфера для анализа, содержащего 50 нг меченного Ευ стрептавидина (можно приобрести в ХУаНасТ и оставляли для протекания реакции на 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки промывочным раствором и добавления 100 мкл усиливающего реагента и перемешивания в течение 1 мин осуществляли измерение флюоресценции с разрешением во времени.

В результате выяснили, что сэндвич-иммуноанализ возможен между любыми из антител 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 и ΜаЬ166, что указывает на то, что антитела согласно настоящему изобретению распознают эпитопы, отличные от ΜаЬ166 (фиг. 3).

Пример 4

Измерение активности ингибирования цитотоксичности антителами БсгУ

Для 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 измеряли активность ингибирования цитотоксичности. Измерения проводили следующим образом.

Вначале 1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 разбавляли в серии 2-кратных разбавлений, начиная с 32 мкг/мл и 10 мкл, и распределяли в каждую лунку 96-луночного микропланшета. Затем клетки миеломы мыши Ρ3υ 1 (из АТСС) доводили до концентрации 5х10⁶ клеток/мл или линию лейкоцитов человека υ937 (из АТСС)

- 10 020544 доводили до концентрации 1 χ 10⁶ клеток/мл в среде для культивирования клеток (КРМ11640, содержащей гидрокарбонат натрия и не содержащей Ь-глютамин и феноловый красный (можно приобрести в §1§та)) и добавляли по 100 мкл суспензии клеток в лунку 96-луночного микропланшета. Затем штамм 8К24 Ркенботопак аегидшока культивировали в течение ночи в дополненной катионами жидкой среде Мюллер-Хинтон (Όίίεο), доводили до концентрации 1х10⁸ КОЕ/мл в среде для культивирования клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. После перемешивания в течение 3 ч в каждую лунку добавляли по 10 мкл ^8Т-8 (можно приобрести в ΚίкЫба Сйет1са1 Со., Ыб.) и культивировали при 37°С в присутствии 5% в течение 3 ч в случае клеток миеломы Р3И1 или в течение 1 ч в случае вкеток И937. После завершения культивирования измеряли поглощение при 450 нм.

В результате установили, что в случае использования клеток лейкоцитов И937, активность ингибирования цитотоксичности (1С50) составила 5,3 нМ для 1Р3, 20,7 нМ для 2А4, 12,7 нМ для 6Р5 и 14,7 нМ для 7А7, в отличие от значений, превышающих 213 нМ, для МаЫ66, и в случае использования клеток миеломы И3Р1, активность ингибирования цитотоксичности (1С50) составила 4,0 нМ для 1Р3, 16 нМ для 2А4, 7,3 нМ для 6Р5 и 6,0 нМ для 7А7, в отличие от 54 нМ для МаЫ66. Т.е. 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 демонстрировали более высокую цитотоксичность в отношении обоих типов клеток, чем описанное ранее МаЫ66 (Ргаик е! а1., Тке 1оигпа1 о£ Шескоик Эхкеакек, 2002, уо1. 186, р. 66) (фиг. 4 и 5).

Пример 5

Получение укороченного РсгУ

Укороченный РсгУ (136-233) получали следующим образом.

Фрагмент, амплифицированный путем ПЦР с 5'-концевого праймера ССТССЛССЛТСССЛЛСССССТСЛСССС (8ЕЦ ГО N0: 5) и 3'-концевого праймера СТТЛЛССТТСТССЛЛССССТЛСТС (8ЕЦ ГО N0: 6) с использованием рЦЕ30-РсгУ, являющейся плазмидой экспрессии антигенного белка РсгУ, в качестве матрицы, обрабатывали ферментами рестрикции ВатН1 и Ηίη6ΙΙΙ и встраивали в рЕТ32Ь (можно приобрести в Шуадеп). После секвенирования вектор вводили в Е. сок штамма ВЬ21-ЭЕ3, в результате чего получали рекомбинантную Е. сок (укороченный РсгУ-ВЬ21). Полученный экспрессирующий штамм предварительно культивировали в течение всего дня и ночи при 37°С в 2 мл жидкой культуральной среды ЬВ/ампицилин. 2 мл предварительной культуры добавляли в 500 мл жидкой культуральной среды ЬВ/ампицилин и культивировали при 37°С, после достижения значения 0Ό600 = 0,5, культуральную среду выдерживали в течение 30 мин на льду. Добавляли 1РТС в конченой концентрации 0,75 мМ и культивировали при 15°С в течение ночи. Бактериальные клетки собирали путем центрифугирования при 4°С, х5000д в течение 30 мин. Супернатант переносили в тругую пробирку, к осадку добавляли 10 мл буфера X (25 мМ Тпк-НС1 (рН 7,5), 150 мМ №С1, 2 мМ МдС1), содержащего 0,1% лизоцима (можно приобрести в Зщта), и суспендировали, выдерживали на льду в течение 1 ч и после охлаждения льдом обрабатывали ультразвуком. Затем растворимую фракцию загружали на колонку Νί-ΝΓΆ (Цшадеп) и элюировали буфером Υ (25 мМ Тпк-НС1 (рН 7,5), 150 мМ №С1, 200 мМ имидазола). Элюируемую фракцию диализировали с 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,4).

Определение участка эпитопа

В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в Νιιικ) добавляли 150 мкл буфера ΐήδ (50 мМ ТЙ8-НС1, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг антитела Рс к 1§С мыши (можно приобрести в 1асккоп 1ттипоКе8еагск), и иммобилизовали в течение 16 ч при 4°С. Эти лунки дважды промывали 300 мкл промывочным раствором, а затем добавляли в них 300 мкл блокирующего раствора и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для блокирования. После того как каждую лунку промывали 300 мкл промывочной жидкости, в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора антитела к РсгУ, разбавленного до концентрации 80 нг/мл буфером С (50 мМ буфер ίτίδ, содержащий 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Т\\ееп 80 и 25 мкМ диэтилентриамина-НН№.№'.№'-пентауксусной кислоты, рН 7,6), после чего добавляли 50 мкл раствора меченого Ей страптавидина (можно приобрести в РЕККГО ЕЬМЕК), разбавленного до концентрации 200 нг/мл буфером С, 50 мкл укороченного булка РсгУ, разбавленного до заданной концентрации аналитическим буфером ЭЕКИЛ, и 50 мкл раствора биотинилированного РсгУ, разбавленного до концентрации 1,0 нг/мл буфером С, и оставляли для протекания реакции на ночь при 4°С. После трехкратной промывки 300 мкл раствора для промывки добавляли 200 мкл усиливающего реагента (можно приобрести в РЕККГО ЕЬМЕК) и измеряли флюоресценцию с временным разрешением (фиг. 6).

По результатам анализа антитела к РсгУ 1Р3, 2А4, 9Ό12, 12Н9 и рекомбинантное антитело МаЬ166, являющееся моделью типичного нейтрализующего антитела к РсгУ, описанного ранее, продемонстрировали реактивность с полноразмерным РсгУ (1-294). С другой стороны, хотя 1Р3 и 2А4 продемонстрировали реактивность с отношении РсгУ (136-233), МаЬ166, а также 9Ό12 и 12Н9, у которых отсутствует нейтрализующая активность, не продемонстрировали реактивности.

Также был проведен анализ связывания методом Вестерн-блот. Очищенное рекомбинантное антитело нанесли на ПААГ-δΌδ и затем переносили на мембрану из РУЭР. Мембрану блокировали ФБР, содержащем 2% реагента В1оск Асе (можно приобрести в Эаййрроп 8иткото Ркагта Со., Ыб.) при комнатной температуре в течение 2 при встряхивании. К мембране добавляли раствор антитела к РсгУ, раз- 11 020544 бавленный до 1 мкг/мл, и оставляли до протекания реакции на ночь при 4°С, и затем промывали промывочным буфером В (10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), 0,05% Т\уссп 20). К мембране добавляли раствор вторичного антитела, меченного пероксидазой хрена антитела к 1дС (можно приобрести в СЕ Неаййсате), и оставляли для протекания реакции на 2 ч при комнатной температуре. Затем мембрану промывали промывочным буфером В и детектировали сигнал с использованием системы ЕСЬ Р1ик \Уек1егп Βίοι Ое1ес11оп 8ук1ет (можно приобрести в СЕ НеаИйсате) (фиг. 7). Нейтрализующие антитела к РсгУ 1Р3 и 2А4 реагировали с полноразмерным белком РсгУ и укороченным РсгУ (136-233), МаЫбб, а 9Ό12 и 12Н9 реагировали только с полноразмерным РсгУ и не реагировали с укороченным РсгУ (136-233).

Эти результаты показывают, что эпитоп РсгУ, распознаваемым антителами 1Р3 и 2А4, соответствует остаткам аминокислот 136-233, а МаЫбб, 9Ό12 и 12Н9 распознают не только эпитоп, соответствующий остаткам аминокислот 136-233.

Пример 6

Корреляция между специфичным участком белка РсгУ и эффективностью цитотоксичности

Проводили тест на активность подавления цитотоксичности для антител 1Р3, 2А4 и МаЫ66 с использованием полноразмерного белка РсгУ (8ЕС ГО N0: 1) и укороченного белка РсгУ (имеющего последовательность аминокислот, соответствующую остаткам с 136 по 233 в 8ЕС ГО N0: 1). Тест осуществляли следующим образом.

Вначале 1Р3, 2А4 и МаЫ66 разбавляли до концентрации 1,56-6,25 нМ, 6,25-25 и 50-200 нМ, соответственно, и 10 мкл этих антител добавляли в 96-луночный планшет. Для каждого диапазона концентраций в 96-луночный планшет добавляли по 10 мкМ полноразмерного белка РсгУ или укороченного белка РсгУ в молярных отношениях х30, х10, х3, х1 и х0,3 и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем готовили клетки миеломы в концентрации 5х10⁶ клеток/мл в среде для культивирования клеток (КРМ11640, содержащая гидрокарбонат натрия и не содержащая Ь-глютамина и фенолового красного (можно приобрести в 81дта)) и добавляли по 70 мкл в лунки 96-луночного микропланшета. Затем жидкую культуру бактерий Ркеиботопак аегидтока. штамм 8К24, культивируемую в течение ночи в бульоне Мюллер-Хинтон (Όίίεο), доводили до концентрации 1х 10⁸ КОЕ/мл, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37°С в присутствии 5% С0₂. По истечении 3 ч добавляли по 10 мкл ^8Т-8 (можно приобрести в КЫйба СНет1са1 Со., Ыб.) и культивировали при 37°С в присутствии 5% СО2 в течение 3 ч. После завершения культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

По результатам описанного теста 1Р3 и 2А4 продемонстрировали более высокую активность ингибирования цитотоксичности, чем МаЫ66. При добавлении полноразмерного белка РсгУ ингибирующее действие анти-РсгУ антител подавлялось дозозависимым образом (фиг. 8). При добавлении укороченного белка РсгУ (136-233) ингибирующая активность 1Р3 и 2А4 также подавлялась дозозависимым образом. Ингибирующая активность МаЫ66, напротив, не изменялась при добавлении укороченного РсгУ (136-233) (фиг. 9).

Приведенные результаты указывают на то, что антитела, распознающие эпитоп, соответствующий остаткам аминокислот 136-233 (1Р3 и 2А4), обладают более высокой активностью ингибирования цитотоксичности, чем антитела, распознающие другие эпитопы (например, МаЫ66). Другими словами, можно сделать вывод, что активность ингибирования цитотоксичности зависит от области эпитопа, распознаваемой антителом к РсгУ, и антитело, реагирующее с участком 136-233 белка РсгУ, обладает более высокой нейтрализующей активностью.

Пример 7

Анализ последовательности аминокислот антитела к РсгУ (1Р3 и 2А4)

Из полученных клеток гибридомы выделяли РНК с использованием набора КИеаку Мш1 Κίΐ (можно приобрести в ρΐΑΟΕΝ). Из 1 мкг выделенной РНК амплифицировали фрагмент ДНК с использованием системы 5'КАСЕ для быстрой амплификации кДНК, версия 2,0 (можно приобрести в 1пуйгодеп). Для синтеза кДНК использовали праймеры ТАСАСТСАСССАССАСССАСТТСТ (8ЕО ГО N0: 7) для 1Р3, и ТССАСАСТТССААСТСАСАСТСАС (8ЕС ГО N0: 8) для 2А4. Праймеры, использованные в методе 5'КАСЕ: АССССССАСТССАТАСАСССАТСССССТСТ (8ЕО ГО N0: 9) для 1Р3, и АССССССАСТССАТАСАСТСАТСССССТСТ (8ЕС ГО N0: 10) для 2А4. Амплифицированные фрагменты клонировали с использованием набора ТОРО ТА С1ошпд Κίΐ (можно приобрести в 1пуйтодеп) и секвенировали на приборе Аррйеб Вюкук1етк 3130 Сепейс Апа1ухег (можно приобрести в Аррйеб ВюкукЮтк. Результаты анализа показаны на фиг. 10 для ΙΡ3 и на фиг. 11 для 2А4.

Промышленная применимость

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть такого антитела не только обладают высокой аффинностью к РсгУ, но также демонстрируют высокую активность ингибирования цитотоксичности Ркеиботопак аетидшока в отношении эукариотических клеток. Соответственно, фармацевтическая композиция, содержащая такое моноклональное антитело или его часть, пригодна в качестве лекарственного средства для лечения инфекций, связанных с Ркеиботопак аетидшока, которые в настоящее время считаются в медицине с трудом поддающимися лечению.

- 12 020544

195

200

205

А5Р

РКе

Ьеи

зег

с!у

Зег

РГО

ьуз

б!п

Зег

С1у

с!и

Ьеи

ьуз

б!у

ьеи

210

215

220

Зег

А5р

61 и

Туг

РГО

РЬе

б!и

Ьуз

Азр

Азп

Азп

Рго

Уа1

б1у

АЗП

РКе

225

230

235

240

А1а

тКг

тКг

Уа1

зег 245

АЗр

Агд

зег

Агд

РГО 250

ьеи

АЗП

Азр

ьуз

уа1 255

АЗП

С1и

ЬУ5

ТКг

ТЬг 260

ьеи

Ьеи

Азп

Азр

ТЬг 265

Зег

Зег

Агд

туг

Азп 270

5ег

А1а

Уа!

б!и

А1а

ьеи

А5П

Агд

РКе

Не

б!п

ьуз

Туг

АЗр

Зег

Уа!

ьеи

Агд

275

280

285

дзр Пе ьеи Зег А1а ιΐβ 290 <210> 2 <211> 885 <212> ДНК <213> РзеиОотопаБ аегид1поза <400> 2

ахддаадхса	дааассххаа	хдссдсхсдс	дадсхдххсс	хддасдадсх	ссхддссдсд	60
Хсддсддсдс	сХдссадхдс	сдадсаддад	даасХдсХдд	сссХдХХдсд	садсдадсдд	120
ахсдхдсхдд	сссасдссдд	ссадссдсхд	адсдаддсдс	аадхдсхсаа	ддсдсхсдсс	180
ХддХХдсХсд	еддсеаагсс	дхссдсдссх	седдддсадд	дссхсдаддх	асхссдсдаа	240
дхссхдсадд	сасдхсддса	дсссддхдсд	садхдддахс	хдсдсдадхх	ссхддхдхсд	300
дссХаХХХса	дссхдсасдд	дсдХсХсдас	даддаХдХса	ХсддхдХсХа	сааддахдхс	360
сХдсадассс	аддасддсаа	дсдсааддсд	схдсхсдасд	адсхсааддс	дсхдассдсд	420
дадххдаадд	ХсХасадсдХ	дахссадхсд	садахсаасд	ссдедсхдхс	ддссаадсад	480
ддсаХсадда	хсдасдсхдд	сддхахсдах	сХддХсдасс	ссасдсХаХа	ХддсХаХдсс	540
дхсддсдахс	ссаддхддаа	ддасадсссс	дадхахдсдс	ХдсХдадсаа	хсхддахасс	600
ххсадсддса	адсхдхсдах	сааддахххх	схсадсддсх	сдссдаадса	дадсддддад	660
схсаадддсс	Хсадсдахда	дхассссххс	дадааддаса	асаасссддх	сддсаахххс	720
дссассасдд	Хдадсдассд	сХсдсдХссд	сХдаасдаса	аддХсаасда	даадассасс	780
схдсхсаасд	асассадсхс	ссдсхасаае	хсддсддхсд	аддсдсхсаа	ссдсххсахс	840
садааахасд	асадсдхссх	дсдсдасахх	схсадсдсда	Хсхад		885

<210> 3 <211> 33 <212> ДНК <213> ПРАЙМЕР

- 13 020544 <400> 3 аххдсахдса Хддаадхсад ааассХХааХ дсс 33 <210> 4 <211> 33 <212> ДНК <213> ИСКУССТВЕНАЯ <22 0>

<223> снгсгутнг <400> 4 хахххсдаад аХсХадсдсд асХсХХасад сдс 33 <210> 5 <211> 27 <212> ДНК <213> ИСКУССТВЕННАЯ <22О>

<223> ПРАЙМЕР <400> 5 дсхсдаддах сссааддсдс Хдассдс 27 <210> 6 <211> 23 <212> ДНК <213> ИСКУССТВЕННАЯ <22О>

<223> ПРАЙМЕР <400> 6 дххаадсххс хсдаадддха схс 23 <210> 7 <211> 24 <212> ДНК <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> ПРАЙМЕР <400> 7 хададхсасс даддадссад ххдх 24 <210> 8 <211> 24 <212> ДНК <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> ПРАЙМЕР <400> 8 хссададххс саадхсасад хсас 24 <210> 9 <211> 30 <212> ДНК

- 14 020544 <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> ПРАЙМЕР <400> 9 аддддссадт ддаТадассд аТддддсТдТ <210> 10 <211> 30 <212> ДНК <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> ПРАЙМЕР <400> 10 аддддссадт ддаТадасТд аТдддддТдТ <210> 11 <211> 121 <212> РКТ <213> ИСКУССВТЕННАЯ <22О>

<223> УН οί АПТтЬоЙу 1РЗ <400» 11

οίη

Уа!

с! η

ьеи

οίη

С1п

Рго

б! у

а! а

о! и

ьеи

Уа!

Ьуз

РГО

01 у

а! а

1

5

10

15

5ег

Уа!

1_У5

ьеи 20

Зег

Суз

ЬУ5

А1а

Зег 25

01 у

туг

5ег

РНе

ТНг 30

Зег

Туг

Тгр

мет

Н15 35

тгр

Уа1

Ьуз

01 η

Агд 40

Рго

01 у

Οΐ η

01у

Ьеи 45

01 и

Тгр

Не

с1у

с! и 50

Пе

АЗП

РГО

Зег

АЗП 55

О1у

Агд

ТНг

АЗП

туг 60

АЗП

О1и

ьуз

РНе

АЗП

ТНг

Ьу5

а! а

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

ТНг

Зег

Зег

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

мет

с! η

Ьеи

5ег

Зег 85

Ьеи

ТНг

Зег

01 и

АЗр 90

5ег

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

Уа!

ьеи

туг

б1у

АЗП

Туг

Уа!

Уа!

туг

туг

тНг

мет

Азр

туг

тгр

б! у

100

105

110

С1п 01 у тНг Зег Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115 120 <210» 12 <211> 109 <212» РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ

- 15 020544 <22О>

<223> νί οΐ АпНЬобу 1РЗ <400> 12

СТп ΐΐе 1

Уа1

Ьеи

тКг СТп 5ег Рго ТКг Пе мет Зег АТа Зег ьеи

сТу

5

10

15

СТи

СТи

Пе

ТКг

|_еи

тКг

Суз

Зег

АТа

5ег

тКг

зег

УаТ

зег

туг

мет

20

25

30

с1и тгр Туг с1п сТп ьуз 5ег СТу тКг зег Рго Ьуз Пе Ьеи Пе Туг 35 40 45

ТКг

ТКг

Зег

ьуз

ьеи

АТа

зег

СТу

УаТ

РГО

эег

Агд

РКе

зег

сТу

Зег

50

55

60

СТу

зег

СТу

тКг

РКе

туг

5ег

ьеи

ТКг

Пе

Зег

Зег

УаТ

СТи

АТа

СТи

70 75 80

Азр А1а А1а Азр туг туг суз нтз сТп тгр Агд азп туг Рго РКе тКг 85 90 95

РКе СТу Зег СТу ТКг Ьуз Ьеи СТи Пе Ьуз Агд АТа Азр 100 105 <210> 13 <211> 120 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> УН οί АпТтЬобу 2А4 <400> 13

А5р

УаТ

СТп

Ьеи

СТп

СТи

5ег

сТу

РГО

сТу

ьеи

УаТ

ьуз

рго

зег

сТп

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи 20

тКг

Суз

тКг

УаТ

ТКг 25

сТу

Туг

Зег

Пе

тКг 30

Зег

Азр

Туг

АТа

Тгр

АЗП

Тгр

Пе

Агд

сТп

РКе

РГО

сТу

АЗП

ьеи

сТи

тгр

35

40

45

мет

СТу 50

Туг

Пе

ТКг

туг

АзП 55

СТу

Азр

ТКг

Зег

Туг 60

АЗП

РГО

Зег

Ьеи

1У5

Зег

Агд

Пе

Зег

Не

АТа

дгд

Азр

тКг

5ег

Ьуз

АЗП

сТп

РКе

РКе

65

70

75

80

Теи

сТп

ьеи

АЗП

5ег

Уа1

тКг

тКг

сТи

Азр

тКг

АТа

ТКг

Туг

Зег

Суз

85

90

95

АТа

сТу

зег

Агд

А5П

туг

туг

СТу

АТа

Тгр

РКе

АТа

туг

Тгр

СТу

СТп

- 1б 020544

100 105 110 с1у тЬг ьеи уа! ТКг Уа! вег А1а 115 120 <210> 14 <211> 110 <212> РКТ <213> ИСКУССВТЕННАЯ <220>

<223> VI. οί АПХтЬобу 2А4 <400> 14

Азр

11 е

Уа1

мех

тЬг

С1п

Вег

НТЗ

иув

РЬе

мех

Бег

тЬг

5ег

11 е

о! у

1

5

10

15

АЗР

Агд

Уа1

вег 20

11е

АЗП

туг

ьуз

а! а 25

Вег

С1п

Туг

уа1

С1у 30

тЬг

тЬг

Уа!

А1а

тгр

туг

с! η

е1п

ьуз

вег

С!у

Нтз

5ег

РГО

ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

туг

Агд 50

А1а

Вег

ТНг

Агд

Нтз 55

ТЬг

с! у

Уа!

Рго

Азр 60

Агд

РЬе

ТЪг

о! у

Вег

с1у

Вег

б1у

тЬг

Азр

рЬе

тЬг

Ьеи

АЗП

Не

Бег

Азп

Уа1

б1п

Вег

65

70

75

80

С! и

АЗр

ьеи

а! а

Азр

туг

РЬе

суз

с! η

С!п

туг

суз

Вег

5ег

РГО

Ьеи

85

90

95

ТНг

РЬе

С! у

а! а

С! у

тЬг

туг

ьеи

С1и

Уа!

ьуз

Агд

А! а

А5р

100

105

110

<210> 15 <211> 8 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> С0К1 οί 1РЗ Ьеауу сЬатп <400> 15

Вег РЬе тЬг Вег туг тгр мех нт 5 1 5

<210>	16
<211>	16
<212>	РКТ
<213>	ИСКУССТВЕННАЯ
<220> <223>	СЭК2 οί 1еЗ Ьеауу сЬат'п
<400>	16

- 17 020544 ιΊβ Азп рго 5ег Азп с!у Агд тНг А5П Туг Азл С1и ьуз РЬе Азп тНг 15 10 15 <210> 17 <211> 12 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <22О>

<22 3> СОКЗ οί 1РЗ Неауу сНатп <400> 17

Туг С1у Азп Туг Уа1 Уа! Туг Туг ТНг МеТ Азр Туг 15 10 <210> 18 <211> 10 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> СРК1 οί 1РЗ Ъ'дНт сИач'п <400> 18 вег А1а 5ег тпг Вег уа1 вег туг мет о1и 15 10 <210> 19 <211> 7 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> СОК2 οί 1ТЗ ΊίςΗτ сНатп <400> 19

ТНг тНг 5ег Ьуз Ьеи А1а Вег

5 <210> 20 <211> 9 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> сркЗ οί 1РЗ ЫдНт сНатп <400> 20

Н15 с1п тгр Агд Азп туг Рго РКе тНг 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <22О>

<223> Сок1 οί 2А4 Неауу сНатп

- 18 020544 <400> 21

Бег 11е ТНг Бег дзр туг а! а тгр абп 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> срк2 οί 2А4 Неауу сНатп <400> 22

Туг Пе ТНг Туг Абп С1у Азр ТНг Бег Туг Абп Рго Бег 1.еи 1у5 Бег 15 10 15 <210> 23 <211> 11 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <220>

<223> СОКЗ οί 2А4 Неауу сНатп <400> 23

Бег Агд Абп Туг Туг б! у А1а Тгр РНе А1а Туг 15 10 <210> 24 <211> 11 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <22О>

<223> СРК1 οί 2а4 ИдНт сНатп <400> 24

1-УБ А1а Бег б!п туг Уа! б!у тНг тНг Уа! А1а 15 10 <210> 25 <211> 7 <212> РКТ <213> ИСКУССТВЕННАЯ <22О>

<223> СОК 2 οί 2А4 ИдНг сНа1П <400> 25

Агд А1а Бег тНг Агд няб тНг 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> РКТ <213> искусгвенная <220>

<223> СЭКЗ οί 2А4 ТтдНх сНа1П <400> 26 с!η с1п Туг Су5 Бег Бег рго ьеи тКг

Claims (14)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) в вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельные участки, включающие следующие последовательности аминокислот: 8ΡΤ8Υ\ΜΗ (8ЕО ΙΌ N0: 15) для СОРТ; INР8NСΡΤNУNΕΚΡNΤ (8Е0 ΙΌ N0: 16) для С1)Н2; Υ(.ι\Υ\ΛΎΥΤ\1Ι)Υ (81 Υ) ΙΌ N0: 17) для 0ΌΚ3; и

1. Моноклональное антитело против РсгУ или обладающая способностью специфично связываться с РсгУ часть указанного антитела, которое имеет

2. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое способно инги- 19 020544 бировать 50% или более цитотоксичности РвеиНотопав аегидпова в отношении клеток лейкоцитов при концентрации от 1 до 200 нМ ш νίΙΐΌ.

2) в вариабельной области легкой цепи гипервариабельные участки, включающие следующие последовательности аминокислот: 8Α8Τ8У8ΥΜΕ (8Е0 ΙΌ N0: 18) для ΟΌΚΤ; ΤΤ8ΚΌΑ8 (8Е0 ΙΌ N0: 19) для ί'.’ΌΡ2; I ΙΟΑΉΥΥΙΤ'Τ (81Т) ΙΌ N0: 20) для 0ΌΡ3.

3. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое способно ингибировать 50% или более цитотоксичности РвеиНотопав аегидпова в отношении клеток миеломы при концентрации от 1 до 50 нМ ш νίΙΐΌ.

4. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое имеет константу диссоциации (КН) с РсгУ 2х 10^-9 (М) или меньше.

5. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое связывается с эпитопом в положениях с 136-233 последовательности аминокислот §ЕЦ ГО NО: 1.

6. Фармацевтическая композиция для профилактического или терапевтического лечения инфекции РвеиНотопав аегидпова, содержащая эффективное количество моноклонального антитела или части моноклонального антитела по любому из пп.1-5 в качестве активного ингредиента.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что указанная инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-7, отличающаяся тем, что указанная инфекция ассоциирована с муковисцидозом.

9. Применение моноклонального антитела или части моноклонального антитела по любому из пп.15 для профилактического или терапевтического лечения инфекции РвеиНотопав аегидпова.

10. Применение по п.9, отличающееся тем, что указанная инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей.

11. Применение по любому из пп.9-10, отличающееся тем, что указанная инфекция ассоциирована с муковисцидозом.

12. Применение моноклонального антитела или части моноклонального антитела по любому из пп.1-5 в изготовлении лекарственного средства для профилактического или терапевтического лечения инфекции РвеиНотопав аегидпова.

13. Применение по п.12, отличающееся тем, что указанная инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей.

14. Применение по любому из пп.12-13, отличающееся тем, что указанная инфекция ассоциирована с муковисцидозом.