JP4651495B2

JP4651495B2 - Ｉｓｇ１５タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ並びに癌およびウイルス感染の検出方法

Info

Publication number: JP4651495B2
Application number: JP2005300675A
Authority: JP
Inventors: 秀世安田; 泰裕瀬戸
Original assignee: Nippon Flour Mills Co Ltd
Current assignee: NIPPN Corp
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2025-10-14
Also published as: JP2007106716A

Description

本発明は、ＩＳＧ１５タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ並びに癌およびウイルス感染の検出方法に関する。

癌の診断方法として、腫瘍マーカーと総称される物質を測定することが行われている。
腫瘍マーカーとしては、例えば、癌胎児性抗原（Carcinoembryonic Antigen、ＣＥＡ）、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）等が知られている。
腫瘍マーカーは、必ずしも癌細胞のみで検出されるとは限らず、正常細胞においても検出されることがあり、優れた検出指標が求められている。
腫瘍マーカーを使用した癌の検出方法として、例えば肺非小細胞癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌を、抗ＡＫＲ１Ｂ１０
モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法で診断する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００５−１８９２２８号公報

本発明の目的は、癌やウイルス感染した細胞を検出するために有効な腫瘍マーカー及びこれを検出するために使用する前記腫瘍マーカーに特異的に反応するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び該モノクローナル抗体を使用した癌やウイルス感染した細胞の検出方法を提供することである。

本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果ＩＳＧ１５（interferon-stimulated gene 15）と称されるタンパク質を、癌やウイルス感染した細胞が産生していることを見出した。
さらに、前記ＩＳＧ１５は癌の腫瘍マーカーやウイルス感染した細胞のマーカーとして有効であることを見出し、前記ＩＳＧ１５に対する抗体を使用した免疫測定系を構築することにより、癌やウイルス感染した細胞の診断が可能であることを見出し本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、
（１）受託番号がＦＥＲＭ−ＡＰ２０６６９であるハイブリドーマにより産生される、ＩＳＧ１５タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体である。
（２）受託番号がＦＥＲＭ−ＡＰ２０６６９であるハイブリドーマである。
（３）前記モノクローナル抗体を使用し、癌又はウイルス感染した細胞由来のＩＳＧ１５タンパク質を検出することを特徴とする癌細胞およびウイルス感染細胞の検出方法である。

癌及びウイルス感染した細胞の検出に有用なモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを使用した検出方法により癌及びウイルス感染した細胞を簡便にかつ迅速に検出することが可能となる。
肝癌をはじめとしてある種の癌はウイルスの感染が原因となって発症することが知られており、細胞がウイルス感染した段階で感染の有無を発見できることは、早期の対応が可能となり予後の治療に大きく貢献すると考えられる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で細胞腫瘍マーカーとして使用するＩＳＧ１５は、細胞に各種のウイルスが感染することで該細胞からインターフェロンα／βが誘導され、それらの作用で各種インターフェロン誘導タンパク質がさらに誘導されるが、それらインターフェロンによって誘導されるタンパク質の一つである。
このＩＳＧ１５は分子量が約１５kDaで、その構造はユビキチンタンパク質が２個繋がったような構造になっており、ユビキチン様タンパク質の一つに数えられている。
このＩＳＧ１５は細胞内のタンパク質のターゲットタンパク質のリシン残基のεアミノ基にプロセシングにより生じたカルボキシル末端のグリシン残基を介してイソペプチド結合する。
しかしこのＩＳＧ１５が結合したタンパク質の運命、およびＩＳＧ１５の結合が持つ意味についてはいまだ明らかでない。
ただしこの結合がユビキチンの結合とは違いターゲットタンパク質をプロテアソームによる分解に導くことはないことが知られている。
このＩＳＧ１５のターゲットタンパク質への結合はユビキチンやユビキチン様タンパク質スモ等と同様にＥ１，Ｅ２，Ｅ３の３種の酵素が連続的に作用することによって触媒されると考えられている。
Ｅ1はＥ１Ｌタンパク質、Ｅ２はＵｂｃ８と知られているがＥ３についてはいまだ明らかになっていない。

［免疫原の調製］
本発明のモノクローナル抗体の免疫原として前記ＩＳＧ１５を用意する。
前記ＩＳＧ１５のアミノ酸配列（配列番号１）、及び該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号２）は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＹ１６８６４８として公開されている。
従って、ＩＳＧ１５はこのアミノ酸配列を利用して、例えば、固相ペプチド合成法等の公知の方法で合成することができる。
また、ｃＤＮＡを利用して、発現用プラスミドベクターに該遺伝子を組み込み、該プラスミドベクターにより大腸菌を形質転換して増殖した後、細胞を破壊し、タンパク質を精製する等の公知の遺伝子組換え手法により生産することができる。

［免疫及び抗体産生細胞の採取］
前記免疫原から抗体産生細胞を得る方法は、公知の抗体産生細胞を得る方法が使用できる。
例えば、免疫原をウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物の腹腔内等に適当量注入した後、数週間間隔で数回さらに注入を行い免疫を行う。
前記免疫した哺乳動物のリンパ節細胞、胸腺細胞、脾臓細胞等を取り出しこれらの組織を破壊し、ＰＢＳ、ＲＰＭＩ−１６４０等の緩衝液又は動物細胞培養用培地で懸濁し遠心分離を行い抗体産生細胞を得ることができる。
本発明には免疫反応を高めるため、フロイント完全アジュバント等のアジュバントを使用することができる。

［ハイブリドーマの作製］
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞を公知の方法で細胞融合し、ハイブリドーマを作製することができる。
使用するミエローマ細胞は免疫動物と同種のものが好ましく薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できるものが好ましい。
このようなものとしては、例えば８−アザグアニン耐性株を挙げることができる。
本発明では、上記の性質を有するミエローマ細胞として市販品を使用することができる。

前記抗体産生細胞とミエローマ細胞をＲＰＭＩ-１６４０等の培地中で１：１〜２０：１程度混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤を添加して融合反応を行いさらにミエローマ細胞に対応した選択培地で選択的に培養を行いハイブリドーマを得ることができる。

［ハイブリドーマの選択］
前記ハイブリドーマから抗体を産生しているハイブリドーマの選択を行う。
選択方法は、公知の抗体産生ハイブリドーマの選択方法を使用することができ、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等を使用することができる。

［ハイブリドーマのクローニング］
前記抗体を産生しているハイブリドーマを限界希釈法等を使用してクローニングを行い、増殖が良好で抗体産生能が高いクローンを選択してハイブリドーマを樹立する。
本発明のハイブリドーマは、ＩＳＧ１５タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するものである。
本発明者は、前記の方法で得られたハイブリドーマのうち特に増殖が良好で抗体産生能が高いハイブリドーマを選択し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、２００５年（平成１７年）９月２８日受託番号ＦＥＲＭＡＰ−２０６６９として寄託している。
前記寄託したハイブリドーマは、サブクラスＩｇＧ１（κ）のモノクローナル抗体を産生するものである。
本発明のハイブリドーマは、前記の方法によりＩＳＧ１５タンパク質に対する抗体を産生するものであれば寄託したハイブリドーマに限定されるものではない。

［モノクローナル抗体の調製］
確立したハイブリドーマを使用してモノクローナル抗体を得る方法は、公知の細胞培養法や腹水形成法を使用することができ、必要に応じて硫安塩析法、アフィニティクロマトグラフィー等を使用して精製を行うことができる。

［ＩＳＧ１５タンパク質の検出方法および癌又はウイルス感染した細胞の検出方法］
前記調製により得られたモノクローナル抗体は、ＩＳＧ１５タンパク質の検出方法に使用することができる。
さらに、癌又はウイルス感染した細胞由来のＩＳＧ１５タンパク質の検出に使用することができるので、癌又はウイルス感染した細胞の検出に使用することができる。
本発明のモノクローナル抗体を使用したＩＳＧ１５タンパク質の検出方法は、公知の抗体を使用した免疫学的測定法であれば特に限定されない。
例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法等を使用することができる。
本発明の検出方法の対象となる癌又はウイルス感染した細胞として、大腸癌、前立腺癌、腎癌等を挙げることができる。
被検対象としては、前記癌又はウイルス感染した細胞が産生するＩＳＧ１５タンパク質が含まれる可能性のあるサンプルであれば特に限定されず、例えば、臓器、組織、細胞、血液、尿、唾液等を挙げることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、前記癌又はウイルス感染した細胞の検出用キットとして、検出に必要な他の試薬等と共に検出用キットとすることができる。

以下本発明を実施例により具体的に説明する。
［実施例１］組換えＩＳＧ１５タンパク質の作製
ＩＳＧ１５遺伝子を発現用プラスミドベクターに組み込み、組換えＩＳＧ１５タンパク質を作製した。
ヒト大腸癌細胞株（ＨＴ-２９）より調製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応によりＩＳＧ１５遺伝子ＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片を制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴ１５ｂにフレームを合わせて連結させ、ｐＥＴ１５ｂ＋ＩＳＧ１５ベクターを得た。
ｐＥＴ１５ｂ＋ＩＳＧ１５ベクターを大腸菌ＢＬ２１に形質転換し形質転換菌を得た。
この大腸菌をＬＢ培地中で対数増殖期まで増殖させた後、ＩＰＴＧを添加し（終濃度０．２ｍＭ）、３７℃でさらに３時間培養を続け、ＩＳＧ１５タンパク質の発現誘導を行なった。
遠心分離により培養液から集菌し、緩衝液に懸濁し、超音波破砕機により細胞を破砕した。
破砕液の遠心分離により組換えＩＳＧ１５タンパク質を分離しイオン交換クロマトグラフィーにより組換えＩＳＧ１５タンパク質を精製した。
この組換えＩＳＧ１５タンパク質を免疫原として免疫に用いた。

［実施例２］マウスの免疫とハイブリドーマの作製
実施例１で得られた組換えＩＳＧ１５タンパク質を０．５ｍｇ／ｍlに調製し、等量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化した。
この乳化液４００μlをマウス腹腔内に注射した。
その後１０日毎に等量のタンパク質を追加免疫し、最終免疫の３日後にマウスの脾臓を摘出した。
脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中で断片化し、ピンセットで細胞を押し出し、遠心分離（１，０００rpｍ、５分間）した後、上清を捨てた。
ペレットを０．１７Ｍ塩化アンモニウム液で１０分処理し赤血球を破壊し、ＲＰＭＩ１６４０培地で遠心洗浄して融合用脾細胞とした。
上記脾細胞とあらかじめ培養していたマウス骨髄腫細胞を細胞数が脾細胞：骨髄腫細胞＝５：１になるように混合し、遠心分離（１，０００rpｍ、５分）した。
上清を取り除きペレットをよく解きほぐした後、３７℃で50％ポリエチレングリコール１５００溶液を1ｍl滴下し、チューブを1分間回転させることで混合した。
次に、３７℃に加温しておいたＲＰＭＩ１６４０培地を1分毎に1ｍlずつ数回加えた後、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて全量を１０ｍlとし遠心分離（１,０００rpｍ、５分）後、上清を捨てペレットをよく解きほぐし、ＨＡＴ培地を加えて全量を１００ｍlとした。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μl／ウェルずつ分注し、ＣＯ_２インキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）中、３７℃で約１０日間培養した。

［実施例３］ハイブリドーマの確立
抗ＩＳＧ１５抗体を産生しているハイブリドーマを選択するためにハイブリドーマ培養上清中に産生された抗体の有無を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で測定し調べた。
９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、組換えＩＳＧ１５タンパク質溶液（1μｇ／ｍl ＰＢＳ）を１００μlずつ分注し、４℃で一夜放置した。
０．１％ Tween２０／ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、５％スキムミルク／ＰＢＳを２００μl／ウェル分注し、室温で1時間放置した。
次に、ウェルに培養上清を１００μlずつ加え、室温で1時間反応させた。
ＰＢＳ−Ｔで3回洗浄した後、５％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで１，０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌずつ加え、室温で１時間反応させた。
反応終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、０.００６％過酸化水素及び０．９６ｍｇ／ｍlテトラメチルベンジジンを含む溶液１００μlを各ウェルに加え、室温で３０分間反応させた。反応後、各ウェルの６５５nｍにおける吸光度を測定した。
その結果抗ＩＳＧ１５モノクローナル抗体の産生が認められたハイブリドーマを２４穴プレートに移し、ＨＴ培地で培養した後、限界希釈法によりクローニングを行なった。
こうして得られたクローンの中から、増殖が良好で抗体産生能が高いクローンを選択し、抗ＩＳＧ１５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを確立した。
得られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは表１のとおりである。
モノクローナル抗体のサブクラス決定は、マウス・モノクローナル・アイソタイピング・キット（大日本製薬）を用いて、その説明書に従って行なった。
得られたモノクローナル抗体のうち特に増殖が良好で抗体産生能が高いクローンを抗体名を５Ｇ１１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、２００５年９月２８日に、受託番号ＦＥＲＭＡＰ−２０６６９として寄託した。

［実施例４］モノクローナル抗体の調製
１３週齢のＢＡＬＢ／c系マウスにプリスタン０．５ｍlを腹腔内注射し、１週間飼育した。
上記実施例３で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０⁶個を腹腔内移植した。
２週間後マウスから腹水を採取し、遠心分離で固形物を除去後、５０％硫安で塩析した。
沈澱を0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した。
この液を、あらかじめ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したプロテインＧ−アガロースカラムに通した。
モノクローナル抗体はカラム内に保持されるので、カラムを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄しその他の成分を除いた。
モノクローナル抗体の溶出は、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８５）により行なった。溶出されたモノクローナル抗体は、ＰＢＳに対して透析して精製抗体液を得た。

［実施例５］モノクローナル抗体の特異性測定
実施例１で調整した組換えＩＳＧ１５タンパク質とモノクローナル抗体の反応をウェスタンブロット法で測定した。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに組換えタンパク質溶液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。
ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
モノクローナル抗体：５％スキムミルク／ＰＢＳ＝１：１，０００（ｗ／ｖ）の溶液をつくり、室温で1時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分、３回）。
パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５％スキムミルク／ＰＢＳで１，０００倍に希釈し、室温で1時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分、３回）。
ECL Western Ｂlottinｇ Detection Systeｍ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、プロトコールに従い化学発光法で検出した。
図１に示すとおり、モノクローナル抗体は組換えＩＳＧ１５タンパク質と強く反応したので、本発明のモノクローナル抗体がＩＳＧ１５に特異的に反応することが確認できた。

［実施例６］モノクローナル抗体の活性測定
調製したモノクローナル抗体５Ｇ１１と大腸癌細胞株ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰのＩＳＧ１５タンパク質との反応をウェスタンブロット法で測定した。
それぞれの細胞を培養フラスコ中でコンフルエントまで培養し回収し、ＰＢＳで3回洗浄した。遠心分離で得られた細胞ペレットをＰＢＳに懸濁しＳＤＳ溶液を添加し溶解させることで、タンパク質溶液を得た。
また、ＨＴ−２９の細胞培養上清についても測定を行なうため、細胞培養上清液およびその１０倍濃縮液を調製した。
ポリアクリルアミドゲルのウェルにタンパク質溶液または細胞培養上清をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。
ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
モノクローナル抗体：５％スキムミルク／ＰＢＳ＝１：１，０００（ｗ／ｖ）の溶液をつくり、室温で1時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分、３回）。
パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５％スキムミルク／ＰＢＳで１，０００倍に希釈し、室温で1時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分、３回）。
ECL Western Ｂlottinｇ Detection Systeｍ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、プロトコールに従い化学発光法で検出した。
図２〜図４に示すとおり、モノクローナル抗体５Ｇ１１はすべての癌細胞株のＩＳＧ１５タンパク質と強く反応したが、３Ｆ１１、３Ｅ８などはすべての細胞とは反応せずまたは反応が弱かった。
５Ｇ１１は活性が高く、モノクローナル抗体として利用価値が高いと思われたが、その他の抗体は活性が低かったため検出用抗体の候補から除外した。よって、モノクローナル抗体５Ｇ１１を寄託した。
図５に示すとおり、ＨＴ−２９の細胞培養上清中のＩＳＧ１５タンパク質とモノクローナル抗体の反応が見られ、ＩＳＧ１５が細胞外へ分泌されることが確認された。

［実施例７］腎癌検体からの検出
モノクローナル抗体５Ｇ１１を用いて、ウェスタンブロット法により腎癌検体からＩＳＧ１５の検出を行なった。
腎癌患者３名から摘出した組織から癌部位とその周辺の正常部位を分け、TRIzol
reagent（インビトロジェン社）を用いプロトコールに従いタンパク質溶液を調製した。１レーン当たり全タンパク質量として２０μｇをアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動後、分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。
ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
モノクローナル抗体：５％スキムミルク／ＰＢＳ＝１：１，０００（ｗ／ｖ）の溶液をつくり、室温で1時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分、３回）。
パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５％スキムミルク／ＰＢＳで１，０００倍に希釈し、室温で1時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分、３回）。
ECL Western Ｂlottinｇ Detection Systeｍ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、プロトコールに従い化学発光法で検出した。
図６に示すとおり、抗ＩＳＧ１５モノクローナル抗体５Ｇ１１と腎癌患者の癌部位およびその周辺の正常部位から調製したタンパク質溶液との反応測定において、患者３名とも癌部位のＩＳＧ１５と反応したが正常部位とは反応しなかった。

ウエスタンブロット法による本発明のモノクローナル抗体と組換えＩＳＧ１５との反応を示す写真である。ウエスタンブロット法による本発明のモノクローナル抗体５Ｇ１１と大腸癌細胞株ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰのＩＳＧ１５タンパク質との反応を示す写真である。ウエスタンブロット法によるモノクローナル抗体３Ｅ８と大腸癌細胞株ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰのＩＳＧ１５タンパク質との反応を示す写真である。ウエスタンブロット法によるモノクローナル抗体３Ｆ１１と大腸癌細胞株ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰのＩＳＧ１５タンパク質との反応を示す写真である。ウエスタンブロット法による本発明のモノクローナル抗体５Ｇ１１と大腸癌細胞株ＨＴ−２９培養上清中のＩＳＧ１５タンパク質との反応を示す写真である。ウエスタンブロット法による本発明のモノクローナル抗体５Ｇ１１と腎癌患者から摘出した組織のうち癌部とその周辺の正常部位のタンパク質との反応を示す写真である。

Claims

受託番号がＦＥＲＭ−ＡＰ２０６６９であるハイブリドーマにより産生される、ＩＳＧ１５タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
受託番号がＦＥＲＭ−ＡＰ２０６６９であるハイブリドーマ。
請求項1に記載のモノクローナル抗体を使用し、癌又はウイルス感染した細胞由来のＩＳＧ１５タンパク質を検出することを特徴とする癌細胞およびウイルス感染細胞の検出方法。