JPH04503012A - Ｃ―ｅｒｂＢ―２外部ドメイン：ＧＰ７５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １０、プラスミドｐＦＲ３Ｖ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃである請求の範囲１記載 の組換えＤＮＡ分子。

１１、　ｇｐ７５のアミノ酸配列の少なくとも１部を有するたんばく質またはポ リペプチドの原核または真核性宿主細胞における発現を助ける目的で使用する精 製・単離されたＤＮＡ分子で、前記ＤＮＡが以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれる ＤＮＡ分子。

（ａ）　ｇｐ７５またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子、（ｂ）　（ ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ分子またはそのフラグメント、お よび （ｃ）遺伝子コードの縮退がなければ（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡに ハイブリダイズするＤＮＡ分子、１２、宿主が真核性生物である請求の範囲１１ 記載の精製単離されたＤＮＡ分子。

１３、組換えｇｐ７５たんばく質およびポリペプチド。

１４、グリコジル化された請求の範囲１３記載の組換えたんばく賞およびポリペ プチド。

１５、血清学的に活性な、すなわち免疫原性および、または抗原性を有する請求 の範囲１４記載の組換えｇｐ７５たんばく賞およびポリペプチド。

１６、実質的に純粋なｇｐ７５たんばく賞およびその全てのポリペプチド部分。

１７、請求の範囲１４記載の組換えｇｐ７５たんば←質およびポリペプチドに対 するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体。

１８、請求の範囲１７記載の抗体を投与することによる哺乳動物の悪性腫瘍の治 療方法。

１９、以下の工程を含むｇｐ７５たんばく賞および／またはポリペプチドの産生 方法。

ａ）単細胞宿主を請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換すること、 ｂ）該単細胞宿主を培養し、該ｇｐ７５たんばく賞および、またはポリペプチド を発現させること、及びＣ）　該ｇｐ７５たんばく賞および／またはポリペプチ ドを抽出および単離すること。

２０、哺乳動物の体液をｇｐ７５の存在について試験する方法であって、ｇｐ７ ５たんばく賞および、またはポリペプチドに対する抗体を含む組成物を哺乳動物 の体液サンプルに接触させ、該サンプル中のたんばく賞への該抗体の結合を測定 することを含む方法。

２１、　ＩＩ乳動物の体液が血清、精液、血漿、胸滲出物、尿唾液およびを髄液 からなる群から選ばれるヒトの体液である請求の範囲２０記載の方法。

２２６　ヒトの体液が血清、血漿および精液からなる群から選ばれる請求の範囲 ２１記載の方法。

２３、ヒトの体液が血清または血漿である請求の範囲２２記載の方法。

２４、ヒトの体液中のｇｐ７ｓを検出するために免疫検定法を用いるＣ　−ｅｒ ｂＢ　２増幅に関連する悪性疾患の診断方法。

２５、悪性疾患が分泌機能を有する器官の腫瘍である請求の範囲２４記載の方法 。

２６、悪性疾患が上皮起源の腫瘍である請求の範囲２４記載の方法。

２７、悪性疾患が唾液腺、胸腺、胸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、胃腸、尿道お よび肝臓からなる群から選ばれる組織の腫瘍に関するものである請求の範囲２４ 記載の方法。

２８、組織が胸部、卵巣および前立腺からなる群がら選ばれる請求の範囲２７記 載の方法。

２９、悪性疾患が胸部アデノカルシノーマおよび、または卵巣アデノカルシノー マである請求の範囲２４記載の方法。

３０．１つの抗体はヒトのかん細胞系列上の本来のｇｐ７５外部ドメインに対す るものであり、かつ別の抗体はＮＩＨ３Ｔ３を細胞系列上の本来のＪ！＋）７５ 外部ドメインに対するものを用いるサンドインチ検定法を使用することを含む請 求の範囲２０記載の方法。

３１、アビジン／ビオチン法を用いて増巾し得ないか、もしくは増巾し得るサン ドインチ検定法、イライザ検定法またはこれらと等価な検定法の使用を含む請求 の範囲２０記載の方法。

３２、請求の範囲１７記載の抗体を使用する哺乳動物体液中のｇｐ７５の存在を 測定する方法。

３３、ヒトの体液サンプル中の抗原が８２７５を認識する抗体への結合に関して ラベル化したｇｐ７５たんばく賞またはそのポリペプチドと競合する請求の範囲 ２０記載の方法。

３４、サンドインチ法をｇｐ７５たんばく賞および、またはポリペプチドに対す る抗体を用いて行う請求の範囲３３記載の方法。

３５、ヒトの体液中のｇ９７５を検定するテストキットで、以下のａ）及びｂ） を含むキット。

ａ）ｇｐ７５たんばく譬および／またはポリペプチドに対する抗体、および／ま たはＣ−ｅｒｂＢ　−２を発現する細胞全体に対する抗体、および ｂ）検出手段 ３６、ヒトの体液中のｇｐ７５たんばく賞および、またはポリペプチドを検定す るテストキットで、以下のａ）及びｂ）を含むキラａ）ｇｐ７５たんばく賞およ び、またはポリペプチドおよび、またはｇｐ７５たんばく賞、および、またはポ リペプチドに対する抗イデイオタイプ抗体、および ｂ）検出手段 ３７、生理学的に許容可能で無毒のベヒクル中に分散した１つ以上の実質的に純 粋なｇｐ７５たんばく質および、またはポリペプチドの免疫原的量、すなわちＣ −ｅｒｂＢ　−２の増幅に関する悪性疾患に対してヒトを免疫化するのに有効な 量を含むワクチン。

３８、生理学的に許容可能で無毒なベヒクル中に分散した表面にｇｐ７５を発現 する細胞膜の免疫原的量；すなわちＣ−ｅｒｂＢ　−２の増巾に関する悪性疾患 に対してヒトを免疫化するのに有効な量を含むワクチン。

３９、細胞膜がＣ−ｅｒｂＢ　−２を過剰生産するようトランスホームした細胞 またはヒトのかん細胞系列に由来する請求の範囲３８記載のワクチン。

４０、細胞膜が内部ドメインを切除した形のＣ−ｅｒｂＢ　−２を過剰発現する ようトランスホームした組換え宿主に由来する請求の範囲３９記載のワクチン。

４１、　ｇｐ７５たんばく賞および、またはポリペプチドとそれに結合するヒト には免疫原性を示さずかつヒト体液中の抗体とは一最に反応しないたんぽ（質ま たはポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合たんばく賞またはポリペプチド。

４２、　ｇｐ７５をコードするＤＮＡ配列を含む精製、単離したＤＮＡ分子。

４３、合成により調製したｇｐ７５たんばく質およびポリペプチド。

４４、悪性疾患のスクリーニング悪性疾患の診断、悪性疾患患者の病状のモニタ ーあるいは悪性疾患の経過の予知を行なう方法で、ｇｐ７５たんばく質および、 またはポリペプチド、ｇｐ７５たんばく質および、またはポリペプチドに対する 抗体、およびこれらの検出レベルに相関するＣ　−ｅｒｂＢ　−２に対するリガ ンドのレベルの検定および定量、および長期生存の可能性または再発の時期に関 する患者の分類を含む方法。

４５、　ｇｐ７５たんばく質／ポリペプチド、それらに対する抗体および、また はヒト体液におけるＣ　−ｅｒｂＢ　−２に対するリガンドの存在を転移の指標 とする腫瘍切除手術後に行なう請求の範囲４４記載の方法。

４６、生理学的に許容可能で無毒なベヒクル中に分散した治療効果量のｇｐ７５ たんばく質および、またはポリペプチドの投与を含むＣ−ｅｒｂＢ　−２の増幅 に関連する悪性疾患の治療方法。

４７、請求の範囲４６記載の方法で、さらにｇｐ７５たんばく質および、または ポリペプチドの投与と合せて治療効果量の化学療法試薬の投与を含む方法。

４８、化学療法試薬がアルキル化試薬である請求の範囲４７記載の方法。

４９、化学療法試薬がシスプラチン、カルポプラチン、およびメツアランからな る群から選ばれる請求の範囲４７記載の方法。

５０、生理学的に許容可能で無毒のベヒクル中に分散したｇｐ７５たんば（質お よび、またはポリペプチドに対するモノクローナル抗体に対する治療効果量の抗 イデイオタイプ抗体の投与を含むＣ−ｅｒｂＢ　−２の増幅に関する悪性疾患の 治療方法。

５１、　ｇｐ７５たんば（質および、またはポリペプチドをｇｐ７５たんばく質 および、またはポリペプチドに対するモノクローナル抗体に対する抗イデイオタ イプ抗体で置き換える請求の範囲３３記載の方法。

５２．３ＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で約７５キロダルトンの分子量を有するＣ　 −ｅｒｂＢ　−またんばく賞のエフトドメインである大賞的に純粋な糖たんばく 賞またはその一部分。

５３、組換えＤＮＡ分子法で生産される請求の範囲５２記載の糖たんばく賞。

５４、請求の範囲５２記載の糖たんばく質で、さらにグリコジル化され、かつ５ ＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で約９０キロダルトンの分子量を有する糖たんばく賞 。

５５、ヒトの体液巾約７５キロダルトンの分子量を有するＣ　−ｅｒｂＢ−２外 部ドメイン糖たんばく賞を過剰発現するヒト腫瘍細胞の存在を検出する診断方法 で、以下のａ）及びｂ）を含む方法。

ａ）該体液を該糖たんばく賞に特異性を有する抗体と接触させること、および ｂ）ｌ抗体に結合した糖たんばく賞の量を検出すること、ここで、正常細胞の結 合レベルを越えた結合レベルの増加はＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメインを過剰発現 する腫瘍細胞の存在を示すものである。

５６、抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲５５記載の方法。

５７、診断法がサンドインチ検定法、競争検定法、粒子検定法、放射能測定検定 法、酵素結合免疫吸看検定法、放射能免疫沈殿検定法または螢光検定法の様式を とる請求の範囲５５記載の方法。

５８、体液が血清、血漿、精液、胸部滲出液、唾液、尿またはを髄液である請求 の範囲５５記載の方法。

５９、がん細胞を有する疑いのあるヒト宿主の治療方法で、約７５キロダルトン のＣ−ｅｒｂＢ　−２エクトドメイン糖たんばく賞に対する治療効果量の抗体を 投与することを含む方法。

６０、　ｇｐ’７５たんばく質および、またはポリペプチドに対する抗体に対す る抗イデイオタイプ抗体。

６１、　ｇｐ７５たんばく質および／またはポリペプチドを用いたヒト体液中の Ｃ−ｅｒｂＢ　２に対するリガンドの検出ならびに定量方法。

６２、　ｇｐ７５たんばく賞および／またはポリペプチドを用いたヒト体液中の ｇｐ７５たんばく賞および、またはポリペプチドに対する抗体の検出ならびに定 量方法。

６３、　ｇｐ７５たんばく賞およびポリペプチドを用いたＣ−ｅｒｂＢ−２に対 するリガンドの精製方法。

６４、　Ｃ−ｅｒｂＢ　−２発１ｊ１．細胞の表面上にある完全ｇｐ７５に対す る抗体とは交叉反応しない請求の範Ｗ１７記載の抗体。

浄；（内Ｇに変更なし） 明細書 ＣｅｒｂＢ　２　６　ドメイン：　Ｇ　Ｐ’７５本発明は、生化学工学及び免疫 化学の分野におけるものである。

特に、本発明は適当な宿主生物に発現された＆１１換えＤＮＡ分子ならびにその ＤＮＡ分子から得られた新規な蛋白質及びポリペプチドに関するものであって、 かかる蛋白質及びポリペプチドは組換え的に、合成的に又は、生物学的に生産さ れた蛋白質及びポリペプチドをフラグメント化して生産することができるもので ある。

本発明の＆１１換えＤＮＡ分子は、ここで指定した糖蛋白質７５　（ｇｐ７５） であるＣ　−ｅｒｂＢ−２オンコジーンの外部ドメインから得られる蛋白質及び ポリペプチドをコード化するＤＮＡによって特徴付けられる。これら血清学的に 活性で、免疫原性及び／又は抗原性を有する蛋白質及びポリペプチドは、癌患者 の体液中にある１ｐ１５を免疫学的に検出するための試薬として有用であり、こ れらは診断医が患者の状態及び予後に関して重要な判断をすることを可能にする ものであり、さらにこれらの蛋白質及びポリペプチドは、抗体の産生及び親和力 による精製に用いる試薬として有用である０本発明の中心的な意義は、哺乳動物 の体液中のｇｐ７５を検出するよう設定した診断アッセイにある１発現され、ま たは合成的に若しくは生物学的に生産された本発明の蛋白質及びポリペプチドは 、腫瘍形成活性に対する癌患者及び二次的な腫瘍形成攻撃に対する回復癌患者の 免疫学的応答の増強を図るためのワクチンとして、さらに有用である。さらに、 前記ｇρ７５蛋白質及びポリペプチドは、Ｃ−ｅｒｂＢ　２発現細胞の１ｌｒＩ Ｉ形成活性を抑制する治療において有用である。

哺乳動物細胞の悪性ｌｌ蕩に関する機序は、これまでも、また現在も熾烈な研究 主題である。最も有望な領域の一つは、オンコジーンがいかにして発現し、また 発現を停止するかということを解明することである。オンコジーンの多数が、癌 の発生において重要な役割を演じていることが明らかにされている。オンコジー ンによってコード化されている蛋白質が異常に作用し、正常細胞の癌細胞への転 換において何らかの役割を演じているようである。

まず最初に、オンコジーンがレトロウィルス中に検出され、続いてそのウィルス のオンコジーン細胞同等物が見出された。まず、急速なガン発生に応答し易いレ トロウィルス遺伝子が１９７０年代始めにロウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウィルス（Ｒ ＳＶ）に同定された。

このウィルスは、ニワトリに癌を発生させるものであって、その遺伝子はｓａｒ ｃｏｍａ　（肉ＩＩ）にちなんでｓｒｃと命名された。１９７５年には、ウィル スの凪遺伝子（ｖ−ｓｒｃ）が、すべてのニワトリ細胞中にほぼ正確なコピーを 有することが見出された。ｖ−ｓｒｃの該細胞同等物は、Ｃ−ａｒＣである。

オンコジーンのスコア（ｓｃｏｒｅ）は、以前よりレトロウィルスから分離され ており、この分離の対象となったウィルスは、ニワトリ、他の鳥類、ラット、マ ウス、猫又は猿に、癌、肉腫、白血病又はリンパ種を起こさせるものである。そ れぞれの場合において、オンコジーンは宿主動物の正常遺伝子と密接に関係して おり、かつ正常蛋白質に類似のオンコジーン蛋白質をコードすることが見出され た。

また、オンコジーンは、大組織及び動物組織にも発見された。

多種のＩＩＩ蕩細胞のＤＮＡ中の遺伝子は、正常な培養細胞中にトランスフェク ションにより導入された場合、それらを癌細胞に転換する。このようなオンコジ ーンは、プロト−オンコジーンの事実上のコピーでもある。プロト−オンコジー ンをオンコジーンに転換する具体的な機序がいかなるものであろうとも、オンコ ジーンは、そのオンコジーンがコード化する蛋白質によって効果を発揮する、オ ンコジーンを誘導するプロト−オンコジーンの生成物は、細胞の成長及び分化の 調節及び初期発生において重大な役割を存するように思われる。形質転換蛋白質 は、細胞に関し根本的な効果を有する。というのは、それらは、基本的細胞プロ セスを妨害するからである。

アミノ酸へのリン酸分子の付加反応（リン酸化）を触媒する場合の酵素活性は、 蛋白質機能の制御に重要であることが知られている。蛋白質をリン酸化する酵素 は、蛋白質キナーゼ（ギリシア語Ｋｉｎｅｉｎ　“転位すること”に由来する。

）と呼ばれている。公知の全オンコジーンのほぼ１／３は、チロシン残基に特異 的な蛋白質キナーゼをコード化している。

表皮成長因子（ＥＧＦ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を、分裂していな い細胞の培養に加えた場合、細胞が分裂するよう刺激する。ＢＧＦ及びＰＤＧＦ は、細胞の原形質膜に埋め込まれている特異的な蛋白質レセプターに結合するこ とによって、そのシグナルを伝達する。ＥＧＦに対するレセプター蛋白質を分離 した際に、ＥＧＦ分子がそのレセプターと結合した時に刺激されるチロシンキナ ーゼ活性に関連していることが見出された０次いで、ＰＤＧＦレセプターも同じ 酵素機能があることが示された。

チロシンキナーゼ活性を有するヒトプロト−オンコジーンは、３つの研究グルー プによって確認された：センバ（Ｓｅｓｂａ）らのグループ、ＰＮＡＳ　（ＵＳ Ａ）、主１６４９７　（１９８４）（遺伝子Ｃ−ｅｒｂＢ　−２を示している） 　、Ｃｏｕｓｓｅｎｓらのグループ、とｎ匹紅ｌ主工：１１３２　（１９８５） （遺伝子ＨＥＲ２を示している）　ｂ　Ｋｉｎｇらのグループ、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２２９　：　９７４　（１９８５）（遺伝子ＭＡＣ１１７を示している）で ある、関連するラットの遺伝子（ｎｅｕで示される）について、シェクタ−（Ｓ ｃｈｅｃｔｅｒ）らにより報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：９７６　 （１９８５）。

遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現の増幅した翻訳が、腫瘍細胞及びセルライ ンにおいて観察されている。〔例えば、フクシゲ（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ）ら、　 Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、６：９５５　（１９８６）（遺伝子の増幅 及び発現（ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）　（ｍＲＮＡ）がＭＫＮ −７胃セルラインで観察されたことを記載）、コーセンス（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　 ）らの前記論文（遺伝子の転写（ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ−ｔｉ ｏｎ）が、肝芽細胞腫、ユーイング肉腫、横絞筋肉腫、２種の神経芽細胞腫及び ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）癌から得られたセルラインで観察されたことを記載） 、センバ（Ｓｅｍｂａ）らの前記論文（遺伝子が人唾液腺癌で増幅されたことを 記載）、キング（Ｋｉｎｇ）らの論文（増幅が乳ガンセルラインで観察されたこ とを記載）、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｌａｎｃｅｔ、　Ｉ：　７５６　（１ ９８６）　（遺伝子の増幅が胸部、腎臓及び胃の腺癌において観察されたことを 記載）及びタル（Ｔａｌ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、４８：１５１７　（１９ ８８）（遺伝子の散発性の増幅が各種組織の腺癌において見出されたことを記載 ）を参照のこと。〕 Ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプターは、ＥＧＦレセプターと密接に関連しているとはい え、相違もしている。ＥＧＦレセプターのように、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２蛋白質は 、細胞外ドメイン、２つの富システィン反復クラスター（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒ ｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ）を含む膜内外ドメイン及び細胞内キ ナーゼドメインを有するが、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２タンパクは１８５，０００ダル トン（１８５ｋｄ）の分子量を有するのに対して、ＥＧＦレセプターは約１７０ にの分子量を有すで、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２蛋白質（ｇｐ１８５）はＥＧＦレセプ ターのチロシンキナーゼ作用をまねるが、統制されていない方法においてである と仮定している。

チロシンキナーゼは、そのｃ−ｓｒｃ遺伝子の産生物がプロトタイプである機能 グループと、細胞表面レセプターとして機能する機能グループの２つの機能グル ープに分けることができる。細胞成長因子またはそれらのレセプターと関連した ものとして、少なくとも１２の哺乳動物のチロシンキナーゼが同定されている。

これらオンコジーンのうち３つは、成長因子〔血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） を伴うｃ−ｓｉｓ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を伴うｈＳｔ及びｉｎｔ　２ 　）と強い相同性を共有している。その他のものは、配位子が同定されている成 長因子レセプター〔表皮成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ）レセプターを伴うＣ−ｅｒｂＢ 、コロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）レセプターを伴うｆｍｓ）と強い相同性を共 有している。残りの７つ、即ち、ｅｐｈ、　Ｃ−ｅｒｂＢ−２，ｃ−ｋｉｔ、　 ｍｅｔ、　ｒｅｔ。

ｃ−ｒｏｓ及びｔｒｋは、配位子を伴うレセプターであるかも知れないが、現時 点ではその配位子は同定されていない。

今日、細胞のあるものは、それら細胞表面レセプターにおける変化によって腫瘍 を形成するようになるという証拠が明らかにされてきている。これらの変化は、 遺伝子の再配列、点突然変異またはＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパクレベルでの遺 伝子増幅からな上記で引用したレセプターは、正常細胞の表面に存在し、一定の オンコジーンの過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、腫瘍形成活性と 関連することが示されてきたとはいえ、そのようなことは、Ｃ−ｅｒｂＢ−２の 場合においてである。

今日、細胞を悪性化する能力を有するＣ　−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンが、非 常に高いレベルである腫瘍中に存在しているということが認められている〔ザラ 　（Ｚｈｏｕ）　ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ旦駐μｍ札工支ユニ６１２３　（１９８ ７）ｉバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ土８：１ ２３８　（１９８８）ｉクラウス（Ｋｒａｕｓ）ら、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕ ｒｎａｌ、６　（３）　：６０５　（１９８７）　；及びスラモン（Ｓｌａｓｏ ｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ＋　２３５　：　１７？　（１９８７）　）＊　Ｃ−ｅ ｒｂＢ−２オンコジーンの発現及び細胞の外膜におけるその所在は、ガンと密接 に関連していると思われ〔クラウス（Ｋｒａｕｓ）らの上記文献、スラモン（Ｓ ｌａｍｏｎ）らの上記文献、ドレビン（Ｄｒｅｂｉｎ）ら、釦旦、土上：６９５ 　（１９８５）；及びジ・フィオレ（Ｄｉ　Ｆｉｏｒｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ＋ １主工：１７８　（１９８７））、事実、それは、少なくともある場合において は、ガン発育の主要な事象であるかも知れない〔ミュラー（Ｍｕｌｌａｒ）　ら 、皿、１土：ｔｏｓ　（１９８８））、正常細胞表面上のＣ−ｅｒｂＢ　−２蛋 白質の過剰発現は、それら正常細胞を変化させるかまたはそうでなければ腫瘍細 胞として振舞うように思われる〔ドレビン（Ｄｒｅｂｉｎ）らの上記文献、ジ・ フィオレ（Ｄｉ　Ｆｉｏｒｅ）らの上記文献、及びフジ＋フク（Ｈｕｄｚａｉｋ ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　８土；７１５９　（１９８７））。

更に、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンが高いレベルで発現する患者は、非常に 乏しい臨床的予後しか有しないということが示されている〔スラモン（Ｓｌａｓ ｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５　：　１７７（１９８７））　−Ｃ−ｅｒｂ Ｂ　２の過剰発現と乏しい予後のこの関係は診断評価及び予後評価の両方の情報 を提供することができる〔クラウス（Ｋｒａｕｓ）ら、　ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕ ｒｎａｌ、６　：　６０５　（１９８７）　；及びスラモン（Ｓｌａ−ｏｎ）ら の上記文献〕、患者に要求される臨床治療の範囲の決定は、Ｃ−ｅｒｂＢ　２オ ンコジーンまたは蛋白質の過剰発現を測定できる能力に基づいて行なうことがで きる。

組織の薄片の評価または組織病理学によって腫瘍組織中に発現されたＣ　−ｅｒ ｂＢ　−２を検出するのに、抗体が使用され得る。有用な予後の指標が得られつ るということが、方法論によって実証（１９８８）；クラウス（Ｋｒａｕｓ）ら 、上記文献（１９８７）、及びスラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、上記文献〕。しか しながら、組織がすぐに手に入らないか、またはそれが望ましいものでないか、 または、腫瘍から組織を取り出すことができない場合が多い。従って、便利でか つ患者に傷を与えない迅速で正確な診断上の検査方法が、医療技術において必要 とされている。本出願で特許請求されている発明は、哺乳動物におけるＣ　−ｅ ｒｂＢ　−２の過剰発現を検出する、組織を傷つけることのない診断測定方法を 提供することによって、前記要求に応えるものである。

スミス（Ｓｏ＋１ｔｈ）らは、５ｃｉｅｎｃｅ、２３８　：１７０４　（１９８ ７）で、過剰の可溶性膜レセプター（ＣＤ４抗原）がＨＩＶ−１の感染力を遮断 することを報告している。

可溶性のＣＤ４の分泌型は、その膜内外ドメイン及び細胞質ドメインを欠いてい る多種のＣＤ４をコードするベクターとの哺乳動物細胞の形質移入（トランスフ ェクション）によって産生される。この産生した可溶性ＣＤ４は、ＨＩＶ−１の 膜糖タンパク（ｇｐ［ｏ）を完全なＣＤ４に匹敵する親和力と特異性で結びつけ ていると報告されている。

ウニバーとギル（Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｇ１１ｌ）は、５ｃｉｅｎｃｅ、２２４ 　＋２９４　（１９８４）で、培養したヒト表皮腫Ａ４３１細胞が、彼らがＥＧ Ｆレセプターの細胞表面ドメインと関連していると決定した可溶性１０５ｋｄ蛋 白質を生産することを報告した。彼らはさらに、可溶性１０５ｋｄ蛋白質は膜結 合完全レセプターからは得られないが、単独でその細胞によって生産されること を決定した。

ヒアリング等（Ｈｅａｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、）は、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ ３７　（１）：３７９　（１９８６）で、精製されたマウス黒色腫−特異性抗原 によるマウスの免疫化は、同系の宿主に、マウス黒色腫の二次的な接種に対する 耐性を与えることを証明した。

ベルナルト等（Ｂｅｒｎａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ、）は、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、 ８４：６８５４　（１９８７）で、外部ドメイン、膜内外アンカードメイン及び “ｎｅｕ”オンコジーンといわれるヒトＣ−ｅｒｂＢ　２ガン遺伝子と同等の約 ５０のアミノ酸のラット細胞内ドメインを発現する遺伝子組換えワタシニアウイ ルスは、マウスを免疫するために使用した時に、ｎｅｕ発現腫瘍細胞の二次的な 接種に対して防御をもたらすことを証明している。ラットのｎｅｕ蛋白質の外側 のドメイン（外部ドメイン）が、担ガンマウス（ＮＦＳ株）における高度に免疫 原性な決定因子であることが、そこでは注目される。

アロンソン等（Ａｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）の”　Ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎ ｅ　Ｒｅ１ａｔｅｄｔｏ　ｂｕｔ　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｆｒｏｍ　ＥＧＦ　Ｒｅ ｃｅｐｔｏｒ　Ｇｅｎｅ　”　（米国特許出願第６−８３６，４１４号；１９８ ６年３月５日出願）と題されたＮＴｌ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｃａ ｌ　Ｉｎｆｏｒｓ＋ａｔｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）出願では、遺伝子の族をコー ド化するチロシンキナーゼの１種であり、ヒト乳ガンにおいて増幅される、ｖ− ｅｒｂＢ関連ヒト遺伝子のクローニング、単離および部分的特性表示を記載して いる。前記の遺伝子はＣ−ｅｒｂＢ　２であると決定された。この出願はその目 的として、前記の遺伝子によってコードされた蛋白質生産物に向けられる抗体と 、腫瘍の検出のための前記の抗体を含む診断用キット；その遺伝子によってコー ドされた生産物；異種ベクターシステムにおいてその蛋白質を発現することが可 能なｃＤＮＡクローン；その遺伝子を発現することのできる形質転換細胞または 微生物；および前記の遺伝子または蛋白質を検出することのできる核酸プローブ および／または抗体試薬キットを提供することを記載している。

前記の出願はさらに、毒物と接合した遺伝子生産物に特異的な抗体の治療的用途 を示唆し、もし配位子がｖ−ｅｒｂＢ関連遺伝子に存在するならば、それをター ゲット物質として使うことができることを示唆している。

クライン等（Ｃ１ｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　）は、米国特許第４．６９９．８７７ 号（１９８４年１１月２０日出ＩＩ）で、オンコジーンの発現生産物を目的とし て、生理的試料が分析されることを特徴とする、腫瘍の存在を検出するための方 法と組成物を記載している。

ジ・フィオレ（Ｄｉ　Ｆｆｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　）は５ｃｉｅｎｃｅ、２３７ 　：　１７８（１９８７）で広範囲にわたる多様なヒト腫瘍が、増幅されたある いは過剰発現された（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）　ｅｒｂＢ　−２遺伝子を 含むことを指摘している。ｅｒｂＢ　−２蛋白質による形質転換に配位子−レセ プターの相互作用は必要ないことを確立するためにジ・フイオレ等は、ＮＨｔ− 末端の６２１個のアミノ酸（外部ドメインから）をコードする配列を除いた構造 物を作った。彼らの発見は、Ｎ　Ｈを−末端の切断が“何であっても、…Ｂ−２ 蛋白質の形質転換活性を増加することを示唆した（１８０頁に記載がある）。

アバウド−ピラツク等（Ａｂｏｕｔ−Ｐｉｒａｋ　ｅｔ　ａｌ、　）は、Ｊ、　 Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒｌｎｓｔ、、　８０　（２０）　：１６０５　（１９８８）でＥＧ Ｆレセプターの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が試験管内でヒトの 口の類表皮腫細胞のクローン形成を減少させることを報告している。抗−ＥＧＦ レセプター抗体をシスプラチンと共に添加した時、これらの物質の抗腫瘍効果は 生体内で相乗性を示した。

ベルガー等（Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）は、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　 ４８　：　１２３８（１９８８）で、原発性ヒト乳ガンからの５１個のＤＮＡ試 料のうち１３個（２６％）がＣ−ｅｒｂＢ　−２遺伝子の多コピーを含むことを 報告し、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２蛋白質の発現と乳ガンの予後に使われるパラメータ ー（結節の状態と核のグレード）の間に統計的に顕著な相関関係があることを観 察した。ベルガー等は、最近の研究が、検査された原発性乳ガンの３３％までに 、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２が増幅されており（Ｋｉｎｇ等、上記文献；　Ｓｌａｍｏ ｎ等、上記文献；ｖａｎ　ｄｅ　Ｖｉｊｖｅｒ等、肥肛虹：そしてＶｅｎｔｅｒ 等、Ｌａｎｃｅｔ　２　：　６９（１９８７）　）そして、ヒト乳ガンセルライ ンの２５％までに、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２が増幅されていることを［Ｋｒａｕｓ等 、上記文献〕示していることを指摘した。

スラモン等（Ｓｌａｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）は上記文献（１９８７）で、Ｃ− ｅｒｂＢ　−２遺伝子の増幅が、腋窩リンパ節のガンの存在と、乳ガン患者のニ ストロジエンレセプターの状態と乳ガン患者中の原発性腫瘍の大きさとに相関関 係を持つことを示した。その研究で、調査された１８９の原発性ヒト乳ガンうち ３０％に、Ｃ−ｅｒｂＢ−２が２倍から２０倍以上、増幅されていることが見出 された。

スラモン等は、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２遺伝子の増幅は、乳ガン患者において、生存 期間と再発までの時間の両方にとって顕著な予測指標となることを結論づけた。

患者の腫瘍からのＤＮＡ中に該遺伝子の多数のコピーを有する患者は、生存期間 が短いだけではなく、再発までの時間が短いため、より不幸な結末となった。

スラモンら（Ｓｌａｍｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　７／ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａ。

釘１μ郊ｏｆ　Ｈｕｍａｎ垣匹肛、ｐ、３７１）（コールドスプリングハーバ− ラボ、１９８９）は、ヒト乳癌腫瘍から産生される数種のｃＤＮＡクローンの配 列決定により、ラットｎｅｕ遺伝子と異なり。

膜内外ドメインにおける変異は遺伝子産物の変化に不可欠なものではないことが 示されたと報告した。その代わり、上記のデータは正常産物の過剰発現（ｏｖｅ ｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を含む変化と一致している。

ドレビンら（Ｄｒｅｂｉｎｅｔａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、４１　：６９５　（１９８ ５））は、ｎｅｕ　ｇｐｌ　８５に対するモノクローン抗体は±−形質転換ＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞を非形質転換表現型に復帰させることが、足場非依存性増殖により 明らかになったことを報告した。ドレビンら（Ｄｒｅｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ、２　：　３８７　（１９８８）　）は、ｇｐ１８５の細胞表面 外部ドメインと反応するモノクローン抗体は試験管内及び生体内で直接に腫瘍増 殖を禁止すると述べている。

マスコら（Ｍａｓｕｋｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊａｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、、　８　Ｑ　：　１０（１９８９））は、ヒトＣ−ｅｒｂＢ　−２遺伝 子−形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してモノクローン産生じたネズミＩｇＭにつ いて、胃癌、結腸癌及び肝臓癌細胞セルラインを含む上皮腫瘍セルラインの一部 と反応するが、いかなる非上皮セルラインとも反応しないと記載している。

ヤーデンとワインベルクは（Ｙａｒｄｅｎ　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　ＰＮ ＡＳ（ＵＳＡ）。

８６：３１７９　（１９８９））は、モデル系として±オンコジーンを用いて、 成長因子レセプターを想起させる構造を有するオンコジーンコード膜内外チロシ ンキナーゼに対する仮想的配位子の検出へのいくつかの実験的アプローチを開発 した。そこには、ｒｅｓオンコ遺伝子による形質転換された線維芽細胞が分泌し た以下の論文は、オンコジーンの一般的記載、治療薬としてのモノクローン抗体 の使用、及びＣ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンについての情報を提供する。ゾー ル（Ｄｅｒ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　３３　（５）：　６４１（１９８７） ）、ビシＥ！”／プ（Ｂｉｓｈｏｐ、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３５　：　３０５（ １９８７））、ヘンリツク及びウェスターマーク（Ｈｅｎｒｉｋ　ａｎｄＷｅｓ ｔｅｒｍａｒｋ、　Ｃｅ１１．　３７：　９　（１９８４））　；デュースベル ク（Ｄｕｅｓｂｅｒｇ、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８　：　６６９　（１９８５） 　）　；シベリ−（Ｓｈｉｖｅｌｙ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ、７　（１）：　ｌ　ｌ　２　（１９８４））；ファンデビジャ−（ｖａｎ 　ｄｅ　Ｖｉｊｖｅｒ、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ２　：　１７５　（１９８８）） ；及びハンター（Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｓｃｉ、　Ａｍ、　２５１　：　７０　（１ ９８４）　）。

発明の要旨 方法及び組成物はＣ−ｅｒｂＢ　−２を過剰発現する悪性腫瘍を同定するために 提供される。本出願により特許請求されている発明は、出願術（ｔｕｍｏｒ　ｂ ｕｒｄｅｎ）を運搬する哺乳類の生物的流体（ｂｉｏ−１ｎｇｉｃａｌ　ｆｌｕ ｉｄ）中におけるＣ　−ｅｒｂＢ　−２遺伝子によりコードされた外部ドメイン 糖タンパク質（ｇｐ７５）又はその部分の検出に基づく。該発明は、哺乳類の生 物的流体中のｇｐ７５を検出及び定量し、それにより腫瘍を検出しその増殖を定 量する特殊な治療検出法を提供し、また腫瘍性疾患の治療及び予後に価値のある 情報を提供する。宿主の体液中のｇｐ７５の上昇した値、即ち、正常ノくックグ ラウンドバインデング値以上の値は、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２の過剰発現を示す。（ 典型的なバックグラウンドバインデング値は、一連の正常ヒト血清に対して１． ６８％と図１Ｏには示されている。）Ｃ−ｅｒｂＢ　−２増殖と関係する他の癌 の中で乳癌又は卵巣腺癌のような腫瘍性疾患の患者の生存は、患者の生物的流体 をｇｐ７５又はその部分の存在について検査することにより決定できる。

さらに、本発明は患者の体液中のｇｐ７５タンパク／ポリペプチドに対する抗体 を検出及び定量する検査法を提供する。患者の体液中のｇｐ７５タンパク／ポリ ペプチドの値を測定する本発明の検査法の結果と特に相関する上記検査法の結果 は、診断し、患者の状態をモニターして治療方針を決定し、そして予後を作成す る際に重要な情報を提供する。

さらにまた、本発明は、患者の体液中のｇｐ７５・に対する仮想の配位子の値を 検出及び定量する検査法を提供する。同様に、本明細書で提供されるような、患 者の体液中のｇｐ７５タンパク／ポリペプチド及びその抗体の値を検出及び定量 する方法の結果と特に相関する上記の情報は、治療及び予後に重要であり、患者 の状態をモニターする際及び治療方針を決定する際に有用である。

上記の背景技術において示したように、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２の増幅は、長期間の 生存の可能性の減少及び疾患の再発時期の早期化と相関していることがわかって いる。本発明の検査法は手術の前後において有用である。上記のＣ−ｅｒｂＢ　 −２の増幅を示す患者は、疾患のかなりの初期の段階であっても、生存の可能性 を増加させるためにより厳密に治療する方がよいであろう。さらに、腫瘍を取り 除く手術後における患者の生物的流体中にｇｐ７５が存在することは、例えば、 系統的な化学療法又は放射線療法の介入をすぐに必要とする転移を示すものであ る。

本発明は、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）腫瘍の検出 についての非侵入性診断検定及び予診検定に関する上記の要求を満たすものであ る。

さらに、本発明はＣ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーン（以後、ｇｐ７５遺伝子とい う）の外部ドメインＤＮＡ配列又はそのフラグメントによりコードされる新規な 蛋白質及びポリペプチドに関するものであり、かつｇｐ７ｓ遺伝子又はそのフラ グメントを好適な発現ベクターに遺伝子組換えすること、このような発現ベクタ ーで宿主を形質転換すること、及び組換え、合成又は他の生物学的手段により８ ｐ７５蛋白質及びポリペプチドを生産することに関する。このような組換ｇｐ７ ５蛋白質及びポリペプチドはグリコジル化又は非グリコジル化のいずれをも行う ことができるが、グリコジル化するのが好ましい、又、ここに記載の方法により 実質的に純品となるまで精製することができる０本発明は、さらに合成又は生物 学的に製造したｇｐ’ｒｓ蛋白質及びポリペプチドに関する。

上記８ｐ７５蛋白質及びポリペプチドの用途の１つはワクチンである。さらに、 ｇｐ７５エピトープを免疫系に効率的に与えるワクチンは、ｇｐ７５又はｇｐ１ ８５を過剰発現する０強化細胞膜を含むことができる。このような細胞膜は、Ｃ −ｅｒｂＢ　−２を過剰発現させるために形質転換した組換宿主、好ましくはト ランケート内部ドメインを有する形にＣ−ｅｒｂＢ　−２を過剰発現するものか ら誘導、又は人癌細胞系から誘導することができる。さらに、本発明により提供 される抗イデイオタイプ抗体は、ワクチンとして有効である。

８ｐ７５蛋白質及びポリペプチドの別の用途は、腫瘍活性を弱める治療剤であり 、このものを単独で又は化学療法剤と組合せて使用することができる。

ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドのさらに別の用途は、親和性結合研究において Ｃ−ｅｒｂＢ　−２に対する推定上のりガント（配位子）を検出することである 。仮に哺乳動物の生物学的流体中に該リガンドが検出されると、次にこれを本発 明の、ｐ７５蛋白質及びポリペプチドを用いて精製できるかも知れない０例えば 、ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドは、遺伝子工学によって生産されたリガンド を精製する方法において使用できるかも知れない。

さらに、本発明は、ｇｐ７５蛋白質又はポリペプチドをコードするだけでなく、 人に対して免疫原性を有さすかつ大の体液中の抗体に典型的には反応しない蛋白 ｔ／ポリペプチドのアミノ酸配列をもコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ 分子に関する。このようなりＮＡ配列の例は、ベータガラクトシダーゼのアルフ ァペプチドコード領域である。さらに、本出願では、実質的に純粋で、かつ天然 生成物を含まない組換え融合蛋白質／ポリペプチドをクレームする。

さらに、本発明は、ｇｐ７５遺伝子又はそのフラグメントを含む精製、単離ＤＮ Ａ分子に関する。

さらに本発明は、８９７５蛋白質及びポリペプチドに対する抗体の診断及び治療 上の使用に関する。さらに本発明は、ｇｐ７５蛋白質及びポリペプチドに対する ような抗体に対する非イディオタイプ抗体に関する。

さらに本発明は、組換により、合成により又は他の生物学的方法により製造した 本発明のｇｐ７５蛋白質及びポリペプチド及び／又はこれに対する抗体を用いた ｇｐ７５用診断検定に関する。

本発明は、また、本発明の検定を具体化したテストキ７）を提供するものであり 、該テストキットは、抗体ｇｐ７５蛋白質／ポリペプチド及び／又はＣ−ｅｒｂ Ｂ　−２の無傷（１ｎｔａｃｔ　）外部ドメインに対する抗体を含む（ここで無 傷とは、ｇｐ７５が細胞表面で発現することを意味する。）。これらの検定は固 相検定とすることができるが、これに限定されるものではなく、液相形態でも行 うことができ、エリザ法に基づく粒状検定や、例えばアビジン／ビオチン法を用 いた増幅した又は非増幅の放射又は螢光検定とすることもできる。

本発明はさらに、本発明の診断検定におけるｇｐ１５蛋白質／ポリペプチドを置 換することができるｇｐ７５蛋白質／ポリペプチド認識モノクローナル抗体に対 する抗イデイオタイプを提供する。

図１は、ＣＨＯ細胞から発現した組換Ｃ−ｅｒｂＢ　−２細胞外ドメイン蛋白質 （ｇｐ７５）のイムノアフィニティークロマトダラムを示す、濃ｍｃＨ，ｏ上清 を０．５　Ｘ　５．　Ｏｃ＊のイムノアフィニティーカラムに流速０．２μｌ／ 分で流した０次に、カラム溶離液の２８０ｎｍ　（Ａ　２８０　ｎｍ）における 吸収がベースラインに到達するまでカラムにＰＢＳを０．５μｌ／分の速度で流 してカラムを洗浄した。特異結合物質が図中の矢印で示した、流速０．２μｍ／ 分、ＰＨ２，５の１００ｍＭグリシン−ＨＣｌの段階的グラジェントで溶離した 。

図２Ａは、図１に示した組換的に生産したＣ　−ｅｒｂＢ　−２ｇｐ７５のイム ノアフィニティーカラムフラクションのＳＯ５−ＰＡＧＥを示す、各フラクショ ンのサンプルをラムリ　（Ｌａｅｍ園１ｉ）サンプルバフファー中で調製し、１ ０％ポリアクリルアミドゲル上で行った。ゲルをコーマシー（Ｃｏｏｓａｇｓｉ ｅ　）ブルーＲ−２５０で染色した。

第２Ｂ図は、ウェスタンプロットである。第２Ａ図で使用したゲルと同じゲルを 使用し、分離したタンパク質は電気泳動により０．２２μｍのニトロセルロース 膜に移した。　Ｅ、　ｃｏｌｔで発現した組換フラグメントｇｐ１８５に対して 生起させたウサギポリクローナル抗体（抗体９２Ａ）を使用して膜をプローブ分 析した。ヤギ抗ウサギーホースラディツシュペルオキシダーゼ抱合体及びインド ファン基質（Ｖｉｏ−ｍｅｄｉｃｓ、　Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、　ＭＡ　）を使用 して特異的に結合した抗体を可視化した。各レーンには以下のように負荷した。

レーン１：濃縮ｃＨｏＨｏ上清；レーン２ニ予備骨子量標準（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、　ＭＤ　）　ｉ及びレーン３から７：免疫アフィニティ力ラムフラクション１ から５　（第２Ａ図に示したのと同ｔａ）。

第３図は、クローニングベクターｐＦ　ＲＳ　Ｖの部分制限地図である。このベ クターは、ＳＶ４０初期領域プロモーターによって駆動される転写ユニット及び 複製開始点（ｏｒｉｇｉｎ　）　、並びにＳＶ４０大Ｔ抗大技抗原挟持配列ｍＲ ＮＡスプライシング）及び初期領域ポリアデニル化部位を有している。第２の転 写カセットは、突然変移体ＤＨＦＲ遺伝子、即ちメトレキセード（ＭＴＸ）耐性 をコードする優勢選択マーカーを含んでいる。最初の５Ｖ４０ｏｒｉ／プロモー ターから下流に位置する唯一のＥｃｏＲ１部位に、前記２．２　ｋｂ　ｃ　−ｅ ｒｂＢ　−２ｓｅｃフラグメントをサブクローン化してｐＦ　ＲＳ　Ｖ　−ｃ　 −ｅｒｂＢ　−２ｓｅｃを生成した。

第４図は、以下のように各レーンに負荷した５ＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１ 及び９：Ｓｔｄ；レーン２から６：抗−ｃ　−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ２５２に結合 するために、ＮＩＨ３Ｔ３ｃｍｅｒｂＢ　２形質移入体により発現されたｃ　− ｅｒｂＢ　−２の可溶フラグメントをｇｐ７５と競合させる；レーン２から６　 ：ＮＩＨ３Ｔ３−ｃ−ｅｒｂＢ２からの細胞溶解物を増加量で１０μｇの抗−Ｃ −ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ　２５２と共に７時間インキュベートし、その後ｇｐ７５ 発現ＣＨＯ細胞から回収したｉｎ　ｖｉｔｒｏラベル化上清の４００μｌのイン キュベートを１０時間行った；レーン７：アイソトープ適合非特異的コントロー ルのマウスミエローマｍＡｂ　。

（ＩｇＧ１）により免疫沈降させたｉｎ　ｖＨｒｏラベル化ｇｐ’７５　ＣＩＯ クローンからの溶解物；レーン８：ＴＡｂ２５２により免疫沈降させたＣＨＯ− ｇｐ７５からの溶解物。

第５図は、組織培養上清からのｇｐ７５の放射活性免疫沈降を示す、レーン１及 び１２：分子量マーカー；レーン３から６：１２倍に濃縮され９．２ウサギポリ クローナルにより沈降された５ＫＢＲ３細胞からの上清−レーン３；レーン４： Ａ−２９ネズミ抗−Ｃ−ｅｒｂＢ　２ハイブリドーマペアレント；レーン５　： 　ＴＡｂ　２５２ネズミ抗−ｃ　−ｅｒｂＢ　２モノクローナル；レーン６　： 　Ａｍｅｒｓｈａｓネズミ抗−ＥＧＦレセプターモノクローナル：レーン７から １０：６倍に濃縮されたｃ　−ｅｒｂＢ　２１１！瘍遺伝子により形質転換され た３Ｔ３細胞からの上清；培地は沈降可能シグナルを可視化するのに充分なまで には濃縮しなかった。

第６図は、ｃ　−ｅｒｂＢ　−２陽性及び陰性細胞系からの上滑の放射活性免疫 沈降を示す、レーン１及び１２：分子量マーカー；レーン２及び４：１２倍に濃 縮されＴＡｂ２５２により沈降されたＭＤＡ４３５からの上清；レーン３及び５ 　：　Ａｓｅｒｓｈａ−抗−ＥＧＦレセプター抗体で沈降された同じ上清；レー ン６及び７．ＴＡｂ２５２及び抗−ＥＧＦレセプター抗体でそれぞれ沈降された ＭＤＡ４６８培養からの１２倍に濃縮された上清；レーン８及び９：無関係；レ ーン１０及び１１：１２倍に濃縮されＴＡｂ２５２及び抗−ＥＧＦレセプター抗 体で沈降された形質移入３Ｔ３細胞からのコントロール上清。

第７図は、ＴＡｂ２５９を捕獲抗体として、ＴＡｂ２５６を放射活性標識第２抗 体として使用したサンドウィッチＩ　ＲＭＡアッセイにおける、部分的に精製し たｇＰ１８５及びｇｐ７５タンパク質の標準曲線を示す、このアッセイにより、 形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞から部分的に精製した全ｃ　−ｅｒｂＢ　−２タ ンパク質並びに形質移入ＣＨＯ細胞の上清から精製された外部ドメインタンパク 質の両方を検出することができる。このアッセイは、部分精製ｇｐ７５を標準と して使用した場合、約１００倍感度が向上する。

第８図は、ＴＡｂ２５９／２５６サンドウインチＩ　ＲＭＡアフセイで試験した 場合における、ｃ　−ｅｒｂＢ　２形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された 腫瘍を有するヌードマウス血清中に出現した抗原の検出を示す、血清はすべて１ ：５（容量／容量）の希釈で試験し、このアッセイにおける血清の前（ブレ）腫 瘍プールのバンクグラウンド結合は１．７％である。このアッセイにおいてｇｐ ’ｙｓ蛋白質を使用した標準曲線は、第７図のものと同等のものである。マウス 中、シグナルは５００から１０００ｍ”の範囲の腫瘍サイズで検出することがで き、腫瘍が３０００から１０．０００ｆｉ３に達するまで増加し続ける。

第９図は、ｃ　−ｅｒｂＢ　−２遺伝子により形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞 により生起された腫瘍を有するＸウスから得られＴＡｂ２５２又はＰＢＳ又はＩ ｇＧ１により処理されＴＡｂ２５９／２５６サンドウイツチＩ　ＲＭＡで試験さ れたヌードマウス血清の分析を示す、血清は、１月の実験期間の間を通じて種々 の採血日から得、１：５の希釈において試験した。マウスは、その血清を試験し た時点において、ＴＡｂ２５．２、ｃ　−ｅｒｂＢ　−２の外部ドメインと反応 性を有するＭＡｂ、ＩｇＧ１又はＰＢＳによる２から８回の処理（１００−５０ ０μｇ／処理）を受けていた。アッセイにおいて６種の前腫瘍血清を試験し、平 均結合を調べた。

アッセイにおけるバンクグラウンドカットオフ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｃｕｔ −ｏｆｆ　）は、前腫瘍血清の平均＋２標準偏差分この平均より上、即ち２．２ ％と決定した。ＰＢＳ処理マウスは、１００１から３０００鶴３の腫瘍容量にお いて有意にバックグラウンドを上回る抗原を発生しくｎ＝７）、一方、ＴＡｂ２ ５２処理マウスは同じ腫瘍容量において掻くわずかの検出可能抗原しか発生しな かった（ｎ　−５）、より大きな腫瘍容量においても、ＴＡｂ処理マウスからの 血清における発生抗原の検出可能性は（ｎ−９）　、ＰＢＳ処理マウスからの血 清と比較して（ｎ＝８）、やはり抑制されている。

図１０は１：５の希釈度（容量／容量）において、ＴＡｂ２５９／２５６サンド ウインチＩＲＭＡにおける、正常な志願者からの１２人の血清に対する試験結果 を示す、これらの血清を使用し、１．６８％のバックグラウンドパインディング レベル（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｂｉｎｄｉｎｇ　１ｅｖｅｌ　）が決定される（ 平均＋２の標準偏差）。

図１１は１：５の希釈度において、ＴＡＢ　２５９／２５６１ＲＭＡ検定におけ る、２０人の乳癌患者からの連続的な出血に対する試験結果を示す、一連の試料 が疾患および治療の経過を通じて採取された。１−４の患者に対しては、腫瘍の 外科手術による切除の１日前の、最初の診断時に試料（ａ）が採取された。５− １０の患者の試料（ａ）は腫瘍の外科手術による切除の数日後に採取され、１１ −２０の患者の試料（ａ）は最初の、またはつぎの再発時に採取された。残余の 試料（ｂ−１）（各患者に対し４または５）は治療期間中いろいろな間隔で採取 され、疾患または治療に対する応答の特別な状態には相応しない、この検定に対 するバックグラウンドカットオフ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｃｕｔ−ｏｆｆ　） は１．６８％であった・ 〔図１２〕はＴＡｂ　２５９／２５６１ＲＭＡ検定における、乳癌患者からの３ 人の血清をｇｐ７５標準および正常な人の血清と比較した滴定曲線を示す、血清 はすべて１：５の希釈度において試験され、検定中のバックグラウンドカットオ フは１．６％である。

患者１９ａに対しては、初期の腫瘍が切除されて約１−％午後に患者１９に転移 があられれた時に血清の試料がとり出された。患者１９はこの試料が採取されて １−ｚ午後に死亡した。初期の腫瘍が診断された７ケ月後に肝臓および骨髄への 転移についての最初の減退があった時に患者７から７０の血清試料がとり出され た。

患者７は、この最後の試料がとり出された６日後に死亡した。患者４ｆの試料は 、初期の腫瘍が診断された２年後に肝臓および結節への転移についての最初の減 退があった時にとり出された。患者４はこの（ｆ）試料がとり出された６ケ月後 に死亡した。

図１３はＣ−ｅｒｂＢ　２遺伝子で形質移入（トランスフェクション）されるＮ ＩＨ３Ｔ３細胞から溶解物へのＴＡｂ２５１の結合に拮抗するいろいろな細胞溶 解液の能力が試験された拮抗検定結果を示す、５ＫＯＶ３、ＢＴ４７４およびＮ ＩＨ３Ｔ３ｔラインはすべてｇｐｔｓｓ蛋白質を過剰に表現し、これらのライン からの溶解物は増加する蛋白質濃度と拮抗する。対照のＮＩＨ３Ｔ３溶解物は拮 抗することがない。

図１４はＣ−ｅｒｂＢ　２遺伝子のｇｐ７ｓ部分でトランスフェクションされた ＣＨＯ細胞系からの上澄液がＮＩＨ３Ｔ３を細胞から溶解物へのＴＡｂ２５１の 結合と拮抗する拮抗検定に対する結果を示す、トランスフェクションされたＣＨ Ｏ細胞からの上澄液は拮抗することがない。

図１５はＣ−ｅｒｂＢ　−２でトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞に よって誘導された動物が持つ腫瘍からのヌードマウスの血清はＮＩＨ３Ｔ３を細 胞から溶解物へのＴＡｂ２５１の結合と拮抗し得ることを表わす試験結果を示す 、１１００ｍ”よりも大きなサイズの腫瘍を持ったマウス２−４は拮抗すること ができるが、マウス１の血清および血清のプレ腫瘍プールはこの検定において拮 抗しない。

図１６はＣ−ｅｒｂＢ　−２遺伝子の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を 示す、〔カラスセンス等、上記（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ。

劫μｍ））ｅｇρ７５外部ドメインは約アミノ酸ナンバー２２　（セリン；５ｅ ｒ−２２）から約アミノ酸ナンバー６５３　（セリン；５ｅｔ−６５３）までを 含む（このアミノ酸はそれらの上に黒わくで印がつけられている）。

本発明の多くの面を強調する概念は、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２で過剰発現された細胞 がＣ−ｅｒｂＢ　２外部ドメイン（ｇｐ７５）を宿主の哺乳動物の体液中に放つ ということの発見である。実施例１．４．５および６はこの発見に導く証拠を略 述する。可溶性のＣ−ｅｒｂＢ−２誘導体（ｇｐ７５）は安定して変形されｇｐ ７５で表現された細胞の上澄液中に見出された。この蛋白質は約７５にの分子量 を有することおよびＮＩＨ３Ｔ３ｔ　（Ｃ−ｅｒｂＢ−２で表現された細胞）中 に存在する蛋白質と拮抗することがわかった。（実施例１、）実施例４．５およ び７はＣ−ｅｒｂＢ　２外部ドメインに特有な親和性結合を育する発生した抗原 の検出を、それぞれＣ−ｅｒｂＢ−２トランスフエクシツンされたＮＩＨ３Ｔ３ 細胞（Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３ｔ）によって誘導されたヌードマウスの持つ腫瘍の血清 において、および人の腫瘍培養上澄液において、および乳癌患者からの人の血清 において、詳しく述べている。この発見は人および他の哺乳動物における腫瘍疾 患の診断および治療のための新規な方法および組成物の開発への道を開いた。

アッセイ 哺乳類、好ましくはヒトの体液中の三つの異なる実体を検出し、定量するための アッセイが、ここに提供される。この場合、これらの実体は、以下のとおりであ る＊ｇＰ７５タンパク質／ポリペプチド；ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの 抗体：及びＣ−ｅｒｂＢ−２に対する推定配位子（リガンド）、夫々のアッセイ は患者の症状に関する重要に情報を与え、且つ新生物性疾患に関して哺乳類をス クリーニングし、新生物性疾患を診断し、その疾患の進行を監視するのに個別に 有益であり、且つその疾患の進行を予測し、そして適切な治療プロトコルを決定 することに有益である。しかしながら、これらのアッセイの一つ以上からの結果 、好ましくは三つの全てに関する試験結果の相関関係は、患者の症状に関する最 良のプロフィールを与える。

例えば、患者は大きな腫瘍を示すことがあるが、患者のｇｐ７５の量は比較的少 ないことがある。読み取りの低さはｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の 患者による発生のためによるものであり得るが、腫瘍の小さいことのためではな い。

データを相関させる方法の別の例は、ｇｐ１５に対する推定リガンドの関係に関 して患者の状態の広範な所見を与える。患者は多量の循環ｇ９１５タンパク質／ ポリペプチドを示すことがあるが、患者が推定リガンドを生産していない場合に は、新生物性疾患を有していない、リガンドがない場合、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２細 胞表面レセプターはそれにより非制御増殖を開始するように刺激され得ない、こ うして、リガンド対ｇｐ７５の比は、プロトオンコジーンがオンコジーンに活性 化される機構であるリガンド／レセプター複合体のモデルのもとに有意である。

”の　７５タンパク　／ポリペプチドに　るアソ皇随 哺乳類、好ましくはヒトの体液中のｇｐ１５タンパク質／ポリペプチドを検出し 、その中のこのような８ｐ７５タンパク質／ポリペプチドの量を定量するための 非観血的診断アッセイが提供される。

ｇｐ７５タンパクｆ／ポリペプチドという用語は、この状況下で体液中の標的抗 原として使用される。何となれば、放出された（　５ｈｅｄ　）　ｇｐ７５タン パク質は患者の体液中で種々のフラグメントに分解されることがあり、これらの フラグメントがタンパク質（５０個より多いアミノ酸を有する）及びポリペプチ ド（５０個より少ないアミノ酸）を構成するからである。

このようなアッセイは、新生物性疾患の状態を監視する貴重な手段を与える。予 測を改良することに加えて、症状の知識は、担当医師が個々の患者に最適の治療 を選ぶことを可能にする０例えば、再発の高い可能性がある患者は、全身の化学 療法及び／または放射線療法を通常伴なって激しく治療し得る。再発の可能性が 少ない場合には、それ程積極的ではない治療が選択し得る。更に積極的な治療養 生によりひき起こされる重度の患者の窮迫のために、このような積極的な治療を 要するこれらの患者を高い確度でもって見分けることが望ましい。

本発明は、充実性腫瘍及び造血性癌の両人を含む多種の新生物性疾患をスクリー ニングするのに有益である。新生物性疾患の例は、腺癌及びメラノーマの如き癌 ；神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫の如き中胚葉腫瘍：アソステオサルコーマ（ａ ｓｏｓｔｅｏｓａｒｃｏ＋＊ａｓ　）　％ユーイングサルコーマ、及び種々の白 血病の如きサルコーマ；及びリンパ腫を含む、胸、卵巣、特に結腸及び胃を含む 胃腸管、肝臓、甲状腺、前立腺、脳、膵臓、尿管（膀胱を含む）、及び唾液腺の 腫瘍が、特に関係がある。前立腺、卵巣及び胸の腫瘍が、更に特別な関係がある 。更に詳しくは、胸及び卵巣の腺癌が広く研究され、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２を過剰 発現することを確かめられた。

本発明の方法によりｇｐ７５を分析するのに特に関係がある体液は、血清、精液 、胸部浸出液、唾液、尿、シトシル、血漿及び髄液を含む、血清が本発明の方法 によりスクリーニングするのに好ましい体液である。

Ｃ−ｅｒｂＢ　２オンコジーン（ｇｐ７５）の外部領域（外部ドメイン）の構造 を知るため、このタンパク質を特異的に認識する幾つかのモノクローナル抗体ま たはポリクローナル抗体が生成し得る０ｇｐ７５はＣ−ｅｒｂＢ　２増幅に関連 する腫瘍の表面から特異的且つ特別に放出され、しかも哺乳類の生体液中に自由 に存在するので、そのタンパク質の量を検出し定量することが可能である。

Ｃ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンの外部領域への特別につくられたモノクローナ ル抗体の結合を定量化し得る現行の抗体検出技術を利用して、癌患者の体液中の 外部領域の量を測定することができる。

このようなアッセイは腫瘍を検出し、それらの増殖を定量化し、ヒトの疾患の診 断及び予後を助けるのに使用し得る。そのアッセイは、哺乳類の体液中のｇｐ７ ５を検出し定量化するために適当にラベルし得るモノクローナル抗体またはポリ クローナル抗体の使用を伴なう。

本発明の主題は、宿主中の正常な細胞または宿主から新たに取り出された細胞の 群中の悪性細胞の存在の可能性を評価するための方法及び組成物を提供する。好 ましい方法は、第一段階として、精製量のＣ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンの外 部領域を得、それを免疫原として使用してマウスまたはその他の適当な宿主中で モノクローナル抗体を生成することを伴なう。モノクローナル抗体はｇｐ７５の エピトープと特異的に反応すべきである。また、膜表面でＣ−ｅｒｂＢ　−２を 発現する全無傷細胞が抗原源として使用し得る。

外部領域の異なるエピトープを認識するために多数のモノクローナル抗体を生成 することが可能であり、これらのモノクローナル抗体は単独で使用でき、または カクテルとして組合せて使用してアッセイの特異性及び悪魔を増大することがで きる。免疫原として全外部領域を使用することの他に、このタンパク質のフラグ メント、または組換えＤＮＡ手段により生成されたタンパク質が、また、特異的 なモノクローナル抗体を生成するのに使用し得る。

また、外部領域配列内の種々の配列に相当するポリペプチドが免疫原の源として 使用し得る。全ての場合、生成された抗体は、それらが腫瘍細胞及び非腫瘍細胞 の両方の表面に存在する他のタンパク質との極めて制限された交差反応性を有す るような特異性を有する。それらは、例えば、多くの正常細胞の表面に存在する ＥＧＦレセプターと反応しない０診断アッセイそのものは、典型的には、ヒト宿 主からの少量の体液、好ましくは血清を得ることを伴なう０次いで、血清中のＣ −ｅｒｂＢ　２外部領域の存在が、幾つかの良く特定された抗体診断アッセイを 用いて定量化し得る。

これらはウェスタンプロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＲＩＡ アッセイ　（放射性免疫測定法）、または二重抗体サンドイツチアンセイであつ てもよく、これらは全て診断業界で普通に使用される。全ての場合、結果の解釈 は、抗体または抗体の組合せがＣ−ｅｒｂＢ　２に無関係である血清中に存在す るその他のタンパク質及びタンパク質フラグメントと交差反応しないという仮定 に基く、これらの方法は、Ｃ−ｅｒｂＢ　２外部領域の存在がＵに上記されたよ うに腫瘍の存在と強い相関関係を有するという事実に蟇く、これらのアッセイは 腫瘍の存在を検出し、腫瘍の持続される増殖を検出し、癌転移の存在を検出し、 また外科手術、癌の化学療法また放射線療法後の全腫瘍組織の不在または除去を 確かめるのに使用し得る。更に、それは癌化学療法及び腫瘍再発を監視するのに 使用し得る。

実施例３は、本発明の好ましい診断方法−二重サンドインチ免疫ラジオメトリッ ク測定法（ＩＲＭＡ）のフォーマットを説明する０体液中のｇｐ７５の検出のた めの多くのその他のフォーマットが勿論利用でき、例えば酵素結合免疫吸着検定 法（ＥＬＩＳＡ）を含む、ＥＬＩＳＡ試験の一つの型の代表は、マイクロタイタ ブレートがｇｐタンパク質／ポリペプチドの抗体またはＣ−ｅｒｂＢ−２を発現 、好ましくは過剰発現する全細胞（即ち、無傷ｇｐ７５）の抗体で塗布され、こ れに患者の血清の試料が添加されるフォーマントである。抗原を抗体に結合させ るインキユベーシヨンの期間の後に、プレートが洗浄され、酵素に結合される別 の組の抗ｇｐ７５抗体が添加され、インキユベートされて反応を行ない、次いで プレートが再度洗浄される。その後、酵素基質がマイクロタイタブレートに添加 され、酵素が基質上で作用するのに充分な期間にわたってインキユベートされ、 最終調製物の吸光度が測定される。吸光度の大きな変化は陽性結果を示す。

また、ｇｐ７５タンパク質及び／またはポリペプチドの抗体が患者の体液中のｇ ｐ’ｙｓの存在を検出し定量化するのに使用し得ることが、診断アッセイの当業 者に明らかである。一つのこのような実施態様に於いて、競合イムノアッセイが 使用され、その場合、ｇｐ７ｓタンパク質／ポリペプチドがラベルされ、体液が 添加され、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに特異的な抗体へのラベルした、 ｐ７５の結合を競合する。このようなアッセイはｇｐ７ｓタンパク賀／ポリペプ チドを検出するのに使用し得る。

別の実施態様に於いて、イムノメトリックアッセイが使用でき、この場合、ｇｐ ７５タンパク質またはポリペプチドのラベルした抗体が使用される。このような アッセイに於いて、抗原結合された抗体と複合体形成するラベルした抗体の量は 体液中のｇｐ７５の量に直接比例する０本発明のアッセイに使用するためのモノ クローナル抗体は、当業界で公知の方法、特に　Ｎａｔｕｒｅ　、　２５６巻、 ４９５〜４９７頁（１９７５年）に記載されているコーラ−（Ｎｏｂｌｅｒ　） 及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）の方法により得ることができる。

このような診断方法は、哺乳類、好ましくはヒトの体液中のｇｐ７５に関して測 定するための試験キットで具体化でき、その場合、このような試験キットはｇｐ ７５タンパク質及び／またはポリペプチドのポリクローナル抗体及び／またはモ ノクローナル抗体、及び／またはＣ−ｅｒｂＢ−２を発現する全細胞（即ち、無 傷ｇｐ７５）の抗体を含むことができる。更に、このような診断試験キットは、 サンドインチフォーマットに関して別の組のポリクローナル抗体及び／またはモ ノクローナル抗体を含むことができ、その場合、前記の第二組の抗体が適当にラ ベルされる。

好適な特異性を有する抗体が一旦調製された時、多種の免疫測定法が特定の抗体 −抗原複合体の形成を測定するのに利用できる。

多数の競合タンパク質結合アフセイ及び非競合タンパク質結合アッセイが科学文 献及び特許文献に記載されており、多数のこのようなアッセイが商業的に利用で きる。血清抗原を検出するのに遺したイムノアッセイの例は、米国特許第３，７ ９１．９３２号；同第３．８１７．８３７号；同第３．８３９．１５３号：第３ ．８５０．７５２号；同第３．８５０．５７８号；同第３．８５３．９８７号； 同第３，８６７．５１７号；同第３．８７９．２６２号；第３．９０１．６５４ 号；同第３．９３５，０７４号；同第３．９８４．５３３号；同第３、９９６． ３４５号；同第４．０３４，０７４号；及び同第４，０９８，８７６号明細書に 記載されたアッセイを含む。

アッセイに使用される抗体は、ラベルされてもよく、またラベルされなくてもよ い、ラベルされていない抗体は凝集に使用でき、種々のラベルを用いてラベルさ れた抗体は多種のアッセイに使用し得る。

或種の技術では、抗体ではなく抗原またはそのフラグメントをラベルし、抗体に 関してラベルした抗原と試料中の抗原との間の競合を有することが有益である。

この状況下で、ラベルした抗原またはラベルしたフラグメントと最高の感度及び 精度を与える量の抗体との組合せを有するキットを提供することが普通である。

その他の状況下で、固体担体を有することが望ましく、この場合、抗原または抗 体が結合される。ポリエピトープ抗原が、担体に結合された抗体とアッセイ媒体 中のラベルした抗体との間のブリッジとして利用できる。また、制限量の抗体に 関して、ラベルした抗原と試料中の抗原との間の競合を有することができる。

好適な検出手段は、放射性核種、酵素、螢光物質、化学発光物質、酵素基質また はコファクター、酵素インヒビター、粒子、色素等の使用を含む、このようなラ ベルした試薬は、放射性免疫測定法、酵素イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ 、螢光イムノアッセイ、等の如き種々の公知のアッセイに使用し得る０例えば、 米国特許第３．７６６．１６２号；同第３．７９１，９３２号；第３，８１７． ８３７号；及び同第４．２３３．４０２号明細書を参照のこと。

７５　ンパク　ボ１ペプチドの　に　る上記の如く、患者の体液中のｇｐ７５タ ンパク質／ポリペプチドの抗体の量は、新生物性疾患についてスクリーニングし 、その疾患の進行を監視し、予測すること及び治療のコースを決めることに重要 なパラメータである。このような抗体を検出するのに代表的なアッセイは競合ア ッセイであり、その場合、ラベルしたｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドがｇｐ １５タンパク質／ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体と組合せて愚者血 清中の抗体により沈殿される。当業者は、上記のフォーマットのいずれかを適用 してｇｐ７５の抗体の定量化のために抗ｇｐ７５抗体を検出し得る。

Ｃ−ｅｒｂＢ　２の　リガンドに　るアッセイＣ−ｅｒｂＢ　２レセプターの推 定リガンドの量を検出し定量化するためのアッセイが、新生物性疾患を診断しス クリーニングし、その疾患及び治療スケジュールの進行を監視し予測するのに同 様に有益である。このようなアッセイは、ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチド及 びその抗体に関する上記のアッセイの一つと関連して、更に好ましくはこのよう なアッセイの両方に関連して特に有益である。

ｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドを利用するＣ　−ｅｒｂＢ　−２リガンドに 関するこのようなアッセイの代表的なフォーマントは、精製され、好ましくは実 質的に純粋なｇｐ７ｓタンパク質／ポリペプチドをプラスチック表面またはその 他の固体担体にこのような表面へのそれ自体の結合により、または補足抗ｇｐ７ ５抗体により付着することを伴なう、未知の量のラベルされていないリガンドと のラベルしたリガンドの競合アッセイを利用して、ｇｐ７ｓタンパク質／ポリペ プチドへの結合に関するラベルされていないリガンドの濃度が通常の診断器具使 用を利用して定量化し得る。

別のフォーマット、ラベリング、及び一般にその他の改良（これらはｇｐ７５タ ンパク質／ポリペプチドに関するアッセイについて上記されたように当業者の知 識の範囲内にある）がＣ−ｅｒｂＢ−２の推定リガンドを検出し定量化するため のアッセイに同様に通用する。

７５　ンパク　／ポリペプチドの　の　イーイオ　イブ生 ｇｐ１５タンパク質／ポリペプチドの抗体の抗イデイオタイプ抗体が更に本発明 の範囲内にある。上記のアッセイの夫々の場合に、このような抗イデイオタイプ 抗体がｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに代えて使用し得る。ｍヱの項目に更 に記載されるように、このような抗イデイオタイプ抗体は免疫原性薬剤として使 用し得る。

抗ｇｐ１５抗体の抗イデイオタイプ抗体は、方法の部、モノクロ−ナルＣ−ｅｒ ｂＢ　−２のｐに実質的に上記されたように調製され、その場合、初期免疫化は ＮＩＨ３Ｔ３を細胞ではなく適当な抗ｇ９７５抗体による。融合プロトコルは同 様にしてそれに従って行なわれる。スクリーニング方法は、免疫化に使用される もとの抗ｇ９Ｔ５モノクローナルへの結合に関する一部スクリーン、及び競合ア ッセイ、例えば、ラジオメトリソクアンセイを含む二次スクリーニングであり、 その場合、適当なｇ９７５タンパク質／ポリペプチドは放射能ラベルしたもとの 抗ｇｐ７５モノクローナルによる結合に関して融合中に生産された抗イデイオタ イプ抗体と競合する。

跋腋土ヱ上 上記のアッセイは試験キットの形態で具体化し得る。前記の試験キットはｇｐタ ンパク質／ポリペプチドの抗体及び無傷のｇρ７５（即ち、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ を発現する細胞の表面上にある）の抗体を含み得る。前記の抗体はポリクローナ ル及び／またはモノクローナルであり得る。更に、前記の試験キットはｇｐ７ｓ タンパク質／ポリペプチドを単独で、または上記の抗体と組合せて含み得る。

上記のように、抗ｇｐ７５抗体の抗イデイオタイプ抗体がこのような試験キット 中で適当なｇｐ７５タンパク質／ポリペプチドに代えて使用し得る。

例は指定リガンドに関して分析するためのキットであり、その場合、ｇｐ７５タ ンパク質／ポリペプチドが表面に塗布され、またはその上に捕捉されるか、ある いは抗ｇｐ７５抗体の抗イデイオタイプ抗体が表面上にそうして塗布される。ま た、このようなアッセイは上記のように競合アッセイとして処方し得る。勿論、 このようなアッセイは固相アッセイに限定されないが、液相フォーマ７）であっ てもよく、また酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、粒子アッセイ、例えば アビジン／ビオチン技術を用いて増幅され、または増幅されないラジオメトリフ クアソセイまたはフルオルメトリックアッセイに基いてもよい。

７５　ンバク　びボｌペプチドの 本発明のｇＰ７５タンパク質及びポリペプチドは種々の方法で調製し得る＊ｇｐ ７５タンパク質を調製するのに好ましい方法は組換え手段による０本発明の代表 的な組換え法は実施例１に後記される。

本発明のｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドは、更に合成法または生物学的法 により、即ち長いタンパク質及びポリペプチドを酵素及び／または化学的に切断 することにより調製し得る。前記の合成法及び生物学的法は、項目、　７５　ン バク　びそのポリペプチド。　のＡ　び　（」１匹ｈｅｔｉｃ　ａｔ桓Ｂｉｏｌ ｏ　ｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　７５　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐａ ｌ　ｅ　ｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎｓ　Ｔｈｅｒｅｏｆ　）のちとに詳細に後記さ れる。このような方法はｇｐ７５ポリペプチドを調製するのに好ましい。

７５１　たはそのフラグメントのクローニング実施例１に従ってつくられたプラ スミドｐＦＲ５Ｖ−ｃ　−ｅｒｂＢ−’１ｓｅｃは、本発明に従って調製し得る 多くの可能なりＮＡ組換え分子の代表にすぎない、使用される制限エンドヌクレ アーゼに応じて、ｃ　−ｅｒｂＢ　２外部領域配列の全部または一部が本発明に 従ってクローン化され、発現され、使用し得る。

本発明に有益な制限酵素は、生成されるＤＮＡフラグメントがｇρ７５配列の部 分を含むような方法でＤＮＡを切断する酵素を含んでもよい、好適な制限エンド ヌクレアーゼは、本発明の範囲から逸脱しないで本明細書に記載された因子を考 慮して当業者により選択し得る。

実施例１に使用された代表的なりローニングビヒクルはｐｓＶ７１８６である。

しかしながら、多種の宿主−クローニングビヒクルの組合せがｇｐ７５ＤＮＡを クローン化するのに有効に使用し得る０例えば、有益なりローニングビヒクルは 、ｐＢＲ３２２、その他のＥ、　ｃｏｌｔプラスミド及びそれらの誘導体の如き 種々の既知の細菌プラスミド及びＲＰ４の如き広範な宿主域プラスミド、ファー ジラムダの多数の誘導体、例えばＮＢ９８９の如きファージＤＮＡ及びファージ ＤＮＡ発現調節配列を使用するように修飾されたプラスミドのようにプラスミド とファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクターの如き、染色体ＤＮＡ配列、 非染色体ＤＮＡ配列及び合成りＮＡ配列を含んでもよい。

有益な宿主は、真核生物または原核生物、好ましくは真核生物であってもよく、 旦０匹旦株ＣＡＧ４５６、ＪＭ１０３、Ｎ４８３０、Ｘ１７７６、Ｘ２２８２、 ＨＢＩＯＩ及びＭＲＣＩ及びシュードモナス株、枯草菌及びその他のかん菌の株 、酵母及びその他の真菌類の如き細菌宿主、並びに培養中の動物細胞または植物 細胞、昆虫細胞の如き動物宿主または植物宿主及びその他の宿主を含む。本発明 の好ましい宿主は酵母細胞、培養中の哺乳類細胞、好ましくはサル細胞及びチャ イニーズハムスター卵巣（ＣＨ○）細胞である。好ましいサル細胞は細胞系Ｃ０ Ｓ７からの細胞であり、好ましいＣＨ○細胞は細胞系ＣＩＯ−（ｄｘｂｌｌ　） からの細胞である。勿論、宿主の全てが等しく有効であるとは限らない、宿主− クローニングビヒクルの組合せの特別な選択は、本発明の範囲から逸脱しないで 本明細書に記載された原理を考慮した後に当業者によりなし得る。

更に、夫々の特異的なベクター内で、種々の部位が単離された二本ｇＤＮＡの挿 入のために選択し得る。これらの部位は、通常、それらを切断する制限酵素また はエンドヌクレアーゼにより指示される。例えば、ｐＢＲ３２２では、Ｐｓｔ１ 部位はペニシリナーゼタンパク質のアミノ酸１８１及び１８２をコードするヌク レオチドトリブレット間のベリシリナーゼの遺伝子中に配置される。

選択されたＤＮＡフラグメントをクローニングビヒクルに挿入して組換えＤＮＡ 分子を生成するのに選ばれる特別な部位は、種々の因子により決定される。これ らは、発現されるタンパク質またはポリペプチドのサイズ及び構造、宿主細胞成 分による細胞内酵素分解に対する所望のタンパク質またはポリペプチドの感受性 及びそのタンパク質による汚染、開始コドン及び停止コドンの位置の如き発現特 性、及び当業者により認識されるその他の因子を含む、これらの因子のいずれも が単独では特別なタンパク質またはポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対 に制御しないが、むしろ選択部位はこれらの因子のバランスに影響し、全ての部 位が所定のタンパク質に等しく有効であるとは限らない。

勿論、クローニングビヒクルの選択された制限部位で挿入されるヌクレオチド配 列または遺伝子フラグメントは、所望のタンパク質の実際の構造遺伝子の部分で はないヌクレオチドを含んでもよく、あるいはその構造遺伝子のフラグメントの みを含んでもよいことが理解されるべきである。どのようなりＮＡ配列が挿入さ れようとも、形質転換宿主はｇρ７５のエピトープを示すタンパク質またはポリ ペプチドを生産することのみが必要とされる。

ハイブリッド遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子は、宿主（形質転換体）が構造遺伝 子またはそのフラグメントを発現しハイブリッドＤＮＡがコードするタンパク質 またはポリペプチドを生産することを可能にするように、宿主を形質転換するの に使用し得る。

また、組換えＤＮＡ分子は、複製後の宿主がｇｐ７５ＤＮＡ及びそのフラグメン トの源として別の組換えＤＮＡ分子を生産することを可能にするように、宿主を 形質転換するのに使用し得る。これらの使用のいずれかに適した宿主の選択は、 当業界により認識される幾つかの因子により制御される。これらは、例えば、選 択されたベクターとの適合性、同時生産物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔ　）の毒性、 所望のタンパク質またはポリペプチドの回収の容易なこと、発現特性、生物学的 安全性及びコストを含む、宿主の絶対的な選択は、これらの因子のいずれか単独 から特別な組換えＤＮＡ分子またはタンパク質もしくはポリペプチドに関して、 なし得ない、その代わり、これらの因子のバランスは、全ての宿主が特別な組換 えＤＮＡ分子の発現に等しくを効であるとは限らないという認識により見つける ことができる。

ンパク　ボッペプチドの 宿主細胞がＥ、　ｃｏｌｔの如き原核生物である場合、ＤＮＡ取込みの可能なコ ンピテント細胞は指数増殖後に回収され、続いて公知の操作により塩化カルシウ ム（ＣａＣ１ｚ）法により処理された細胞から調製される。また、形質転換は、 宿主細胞のプロトプラストを形成した後に行ない得る。

使用される宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム沈殿としてのＤＮＡの 形質移入法、マイクロインジェクシッンの如き通常の機械的操作、赤血球宿主ま たはリポソーム中に被包されたプラスミドの挿入、リゾホスファチジルコリンの 如き薬剤による細胞の処理またはウィルスベクターの使用等が使用し得る。

タンパク質またはポリペプチドの生産量は、二つの主要因子：その遺伝子または 細胞内でそれを暗号化コード化するＤＮＡ配列のコピー数及びこれらの遺伝子及 び配列のコピーが転写され翻訳される効率により支配される。転写及び翻訳（こ れらは−緒に発現を含む）の効率は、順に、通常所望の暗号配列の前方に配置さ れるヌクレオチド配列に依存する。

これらのヌクレオチド配列または発現調節配列は、特に、ＲＮＡポリメラーゼが 相互作用して転写を開始する位置（プロモーター配列）及びリポソームがｍＲＮ Ａ　（転写の生産物）を結合し、それと相互作用して翻訳を開始する位置を規定 する。このような発現調節配列の全てが等しい効率で作用するとは限らない、こ うして、所望のタンパク質に特別な暗号配列をそれらの隣接ヌクレオチド配列か ら分離し、高レベルの発現を有利にするように既知の発現調節配列に代えてそれ らを融合することが有利である。これが達成された場合、細胞内の遺伝子または 配列のコピー数を増加し、それにより発現タンパク質の収率を更に改良するため に、新たに処理されたＤＮＡフラグメントがマルチコピープラスミドまたはバク テリオファージ誘導体中に挿入し得る。

幾つかの発現調節配列が使用し得る。これらは、旦、　ｃｏｌｉのラクトースオ ペロンのオペレータ、プロモーター及びリポソーム結合配列及び相互作用配列（ シャインーダルガルノ（５ｈｉｎｅ　−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）配列の如き配列を 含む）（“Ｉａｃ系°）、旦９匹旦のトリプトファンシンセターゼ系の相当する 配列（“ｔｒｐ系”）、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーターの融合（“ｔａｃ系′″ ）、ファージ１の主要なオペレーター及びプロモーター領域（ＯＬＰＬ及び０ｍ Ｐ＋）、及びファージスコートタンパクの調節領域を含む、これらの配列を含む ＤＮＡフラグメントは、ｌａｃオペロンまたはｔｒｐオペロンを存する形質導入 ファージから分離されたＤＮＡまたはファージλもしくはｆｄのＤＮＡから制限 酵素による切断により切除される。

次いで、これらのフラグメントは、必須の調節配列が暗号配列の開始コドンの極 めて近くに、またはそのコドンと近位で接合し得るような分子の制限された集団 を得るために、操作される。

次いで、融合生産物が適当な宿主の形質転換のためのクローニングビヒクル中に 挿入され、抗原生産量が測定される。こうして、最も盲動な発現を示す細胞が選 択される。また、開始コドンに結合されるｌａｃ％ｔｒｐまたはλｐｔ［節糸を 有するクローニングビヒクルが使用されて、ｇｐ７５タンパク質またはポリペプ チドをコードする配列を含むフラグメントに融合されてもよく、その結果、その 遺伝子または配列がクローニングビヒクルの開始コドンから正確に翻訳される。

）５　ンパク　びそのポ１ペプチドフラグメントのへ反乏生艷笠呵生主 本発明のｇｐ７５タンパク質及びポリペプチドは、組換え手段によるだけでなく 、合成手段及びその他の生物学的手段によっても生成し得る。所望のポリペプチ ドまたはタンパク質を調製するためのその他の生物学的手段は、所望のアミノ酸 配列を含む長いｇｐ７５ポリペプチドまたはタンパク質を選択的タンパク質加水 分解にかけることである０例えば１．長いポリペプチドまたはタンパク質は化学 試薬または酵素により切断し得る。ポリペプチドまたはタンパク質の合成による 生成は、当業界で公知の方法によりアミノ酸の所望の鎖を化学的に合成すること を必要とする。

所望のアミノ酸配列を含む長いポリペプチドまたはタンパク質の部分は、下記の 操作のいずれかにより切除し得る。

（ａ）タンパク質加水分解酵素、特にその基質がアミノ酸の所望の配列の直ぐ隣 りの部位でタンパク質またはポリペプチドの切断を特異的に生じるこれらの酵素 によるタンパク質または長いポリペプチドの消化。

（ｂ）化学的手段によるタンパク質またはポリペプチドの切断、アミノ酸間の特 別な結合は、特定の試薬との反応により切断し得る。その例は、下記のものを含 む、メチオニンを伴なう結合は臭化シアンにより切断され；アスパラギニルグリ シン結合はヒドロキシルアミンにより切断され；二つのシスティン残基間のジス ルフィド結合は、例えばジチオスレイトールによる還元により切断される。

（ｃ）タンパク質加水分解変化と化学変化の組合せ、勿論、上記のように、合成 ポリペプチドをコー　ドするＤＮＡの小部分をクローン化して単細胞宿主による ペプチドの生産をもたらすことがまた可能であるべきである。

生物学的に、または合成的に生産されたタンパク質及び一旦生産されたポリペプ チドは、ゲル濾過、イオン交換または高速液体クロマトグラフィー、またはその 他の好適な手段により精製し得る。

ポリペプチドの化学合成は、下記の刊行物に記載されている。

メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　ら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　 Ｓｏｃ、８５巻、２１４９〜２１５６頁（１９６３）ｉケント（Ｋｅｎ　ｔ）ら 、“５ｙｎ−ｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　”　、２９ｆｆ、、アリタロ（Ａｌｉｔａｌｏ）　ら編集 、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　１９　Ｂ　５ 年）；ハウグ（Ｈａｕｇ）、　ＡＢ　Ｌ、４０〜４７頁（１９８７年、１月／２ 月）；アントリニーズ（Ａｎｄｒｅｗｓ）＋　Ｎａｔｕｒｅ　３１９巻、４２９ 〜４３０頁（１月３０日、１９８６年）；ケント、”ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏ ｌｙｓｅｒｓ’、２１３〜２４２頁、ゴールドバーブ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）ら編 集、（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８０年）；ミンチル（Ｍｉ　ｔｃｈ ｅｌ　１）ら、Ｊ。

Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　４３　ｔ’、２８４５〜２８５２頁（１９７８年）；タ ム（Ｔａｇ）　ら、　Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、、　４０３３〜４０３６頁（ １９７９年）；モジュソ゛フ（Ｍｏｊｓｏｖ）ら、　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ 、４５’Ｌ　５５５〜５６０頁（１９８０年）；タムら、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ、２８５１〜２８５４頁（１９８１年）；及びゲントら、”　Ｐｒｏｃｅｅｄ ｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＶＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 　ｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙ ｓｊｓ　（タンパク質配列分析の方法に関する第４回国際シンポジウムの会報） 　”　（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９８１年）。

上記の刊行物に記載された“メリフィールド固相操作”は、カルボキシル末端ア ミノ酸からアミノ末端アミノ酸までのし一アミノ酸の適当な配列をつくるのに使 用し得る。樹脂のクロロメチル基、ベンズヒドリルアミン基、またはその他の反 応基への化学結合により適当な樹脂に付着された適当なカルボキシル末端アミノ 酸から出発して、アミノ酸が夫々に関して下記の操作を用いて一つずつ付加され る。

（ａ）ペプチジル樹脂が塩化メチレンで洗浄される；（ｂ）その樹脂が塩化メチ レン中の５％（Ｖ／Ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（またはその他のヒンダ ード塩基）と室温で１０分間混合することにより中和される；（ｃ）その樹脂が 塩化メチレンで洗浄される；（ｄ）生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい 量のアミノ酸が、それを半分のモル数のカルボジイミド、例えばジシクロへキシ ルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドと０℃で１０分間合わせるこ とにより活性化されてアミノ酸の対称酸無水物を生成する。使用されるアミノ酸 は、ベンジルエステル（アスパラギン酸及びグルタル酸）、ベンジルエーテル（ セリン、スレオニン、システィン、チロシン）、ベンジルオキシカルボニル基（ リシン）またはペプチド合成に普通使用されるその他の保護基で保護された側鎖 を有するＮ−α−ブチルオキシカルボニル誘導体として最初に与えられるべきで ある；（ｅ）活性化されたアミノ酸が室温で２時間にわたってペプチジル樹脂と 反応させられて、成長するペプチド鎖の末端への新しいアミノ酸の付加を生じる ； （ｆ）その樹脂が塩化メチレンで洗浄される：（ｇ）　Ｎ−α−（ブチルオキシ カルボニル）基が塩化メチレン中の３０％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸と室温 で３０分間反応させることにより直前に付加されたアミノ酸から除去される；（ ｈ）その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；（ｉ）必要とされるペプチド配列が つくられるまで工程ａ　ｗ　ｈが繰返される０次いで、１０％（Ｖ／Ｖ）のアニ ソールを含む無水のフン化水素酸と反応させることにより、ペプチドが樹脂から 除去され、同時に側鎖保護基が除去される。続いて、ペプチドはゲル濾過、イオ ン交換、または高速液体クロマトグラフィー、またはその他の適当な手段により 精製し得る。

化学合成は固相樹脂を使用しないで行なうことができ、その場合、合成反応は完 全に溶液中で行なわれる０反応、及び最終生成物は、特別なことがない限り実質 的に同じである。

化学的ペプチド合成の技術は、自動ペプチド合成装置を使用すること、市販の保 護されたアミノ酸を使用することを含む、このような合成装置は、例えば、バイ オサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　（ＳａｎＲａｆａｅｌ、　ＣＡ）型式９５０ ０及び９６００、アプライド・バイオシステム・インコーポレーシツン（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）（Ｆｏｓ−ｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　 ＣＡ）型式４３０１及びミリゲン（ＭｉｌｌｉＧｅｎ）　（ミリポア社の一部門 ）型式９０５０を含む。更に、デュボンズ・ランプ（Ｄｕｐｏｎｔ’ｓ　Ｒａ■ ｐ）　（高速自動化多重ペプチド合成）を使用して約２５までのポリペプチドを 一度に手動で合成し得る。

本発明の合成ポリペプチドは、ｇＰ７５の一つ以上のエピトープを含むことが好 ましい、エピトープ（これは約３〜約１１個のアミノ酸、更に通常約５〜約１１ 個のアミノ酸であり得る）を形成するアミノ酸配列をその両側面にある少なくと も三つのアミノ酸に結合することによりこのようなポリペプチドを合成すること が可能である０両側面の三つのアミノ酸は天然のｇｐ７５配列中のものと同じア ミノ酸であってもよく、またその他のアミノ酸であってもよい。

鉦コ」ゴ列り生 本発明の組換体、合成もしくは天然のｇｐ７ｓタンパク質及びポリペプチドは、 診断アッセイだけでなく、ｇｐ７ｓタンパク質／ポリペプチドのアフィニティ精 製及び治療上の使用に関して用途を有する。背景に上記されたように、Ｃ−ｅｒ ｂＢ　−２の抗体は、試験管内及び生体内で腫瘍増殖を抑制することが示された 〔ドレビンらの上記の文献（１９８５年）を参照のこと〕。

ワクチン 本発明のｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドが腫瘍性疾患に対して防御免疫を 誘発でき、かつ腫瘍形成活性に対する抑制効果をもつワクチンに配合し得ること は容易に理解されよう。ポリペプチドは単量体または多量体形状で、ｇｐ７５の １種以上のエピトープに対応する１種以上のアミノ酸を含むように、組換え手法 であるいは生物学的に合成または調製することができる。次いで、これらのポリ ペプチドを、ｇｐ７５に対する防御免疫性を誘起することのできるワクチンに配 合できる。かかるポリペプチドの抗原性を高める方法は多量体構造への組込み、 免疫原性の高いタンパクキャリヤ、例えばキーホールリンブレットヘモシアニン （Ｋ　Ｌ　Ｈ）、またはジフテリア毒素などへの結合、およびアジュバントまた は任意の他の免疫応答のエンハンサとの組合せでの投与などを包含する。

更に、ｇｐ７５タンパク／ポリペプチドに対する抗体の抗イデオタイブ抗体もワ クチンとして有用であり同様に処方し得ることも理解されよう。

単量体または多量体形状のいずれかのｇｐ７５のエピトープに対応するアミノ酸 配列を、化学的合成手段により、あるいは遺伝的に修飾された微生物またはその 培養物を包含する生物起源から精製することにより得ることができる。〔シーナ ー（Ｌｅｒｎｅｒ）、“シンセティックバクシンズ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｖａ ｃｃｉｎｅｓ）”　、Ｓｃｉ、　Ａｔ、１９８３゜２４８　（２）、ｐｐ、６６ −７４参照〕。このポリペプチドは、例えば融合タンパクとして合成される場合 における如く、アミノ酸配列中で他のタンパクのフラグメントを含む他のポリペ プチドと結合するか、あるいは合成または天然起源の他の抗原性または非−抗原 性のポリペプチドに結合することができる。

“ｇｐ７５のエピトープに対応する”なる用語は以下のような実際上の可能性を 含むものと理解される。即ち、いくつかの例においては、天然にみられるタンパ クおよびポリペプチドのアミノ酸配列の変動は抗原性であり得、かつ腫瘍性疾患 に対する防御免疫および／または抗−腫瘍形成効果を与え得るという可能性を包 含する。起こり得る配列変動はアミノ酸の置換、伸長、欠落、端部切除（ｔｒｕ ｎｃａｔｉｏｎｓ）、挿入（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）およびこれらの組合 せを含むが、これに制限されない。このような変更は、これらの変更を含むタン パクまたはポリペプチドが免疫原性であり、しかもこのようなポリペプチドまた はタンパクが誘発する抗体が十分に天然に産するｇｐ７５タンパクおよびポリペ プチドと交叉反応して、ワクチンとして投与された場合に防御免疫性および／ま たは抗−腫瘍形成活性を与えるとすれば、本発明の意図する範囲内に含まれる。

このようなワクチン組成物は生理的に許容される媒体と組合せられ、該媒体とし ては免疫学的に許容される希釈剤および担体並びに一般的に使用されているアジ ユバント、例えばフロイント完全アジュバント、サポニン、ミョーバンなどが挙 げられる。投与はｇｐ７５タンパクまたはポリペプチドの免疫学的に有効量、好 ましくはレシピエンドの体重１ｋｇ当たり免疫学的に活性なｇｐ７５タンパクお よび／またはポリペプチド０．Ｏ１〜１Ｏ１０μｇなる単位投薬量を与えるよう な量で行われる。全予防投薬量は抗原０．１〜約１００μｇの範囲内であり得る 。

投与経路、抗原投与量、注入の回数および頻度は、当業者が最適化し得る範囲内 の事項である。

ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドの治療での使用本発明のｇｐ７５タンパク およびポリペプチドは、更に単独でもしくは化学療法薬と組合せて腫瘍性疾患の 治療において使用できる。Ｃ−ｅｒｂＢ　−２の外部ドメインが、完全な（ｉｎ ｔａｃｔ）分子として、体液中に注入されたという事実はそれ自体治療上の役に 立つ。

細胞に付着しない過剰のｇｐ７５は、重重の項で既に述べたように〔スミス（Ｓ ＋ｏｉ　ｔｈ）等、上記文献（１９８７））、ＣＤ４レセプタおよびＨＩＶ−１ のｇｐ１２０エンベロープタンパクに類似する様式で、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２に対 する推定リガンドのオンコジーンの細胞表面レセプタへの結合と競合し、かつこ れを妨害する可能性がある。ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチドの治療上の効 果を説明するためのもう一つの機序は、腫瘍形成を容易にするＣ　−ｅｒｂＢ− ２表現細胞間のレセプタ／レセプタ相互作用を阻害もしくは破壊することであり 得る。

このような治療法は、患者にＣ−ｅｒｂＢ　−２外部ドメイン物質、そのフラグ メントあるいはその配列の一部に由来するペプチドを投与することを含む、ｇｐ ７５タンパク／ポリペプチドの高い循環濃度は、上述の如く、腫瘍の成長を減衰 もしくは排除することを期待できた。このｇｐ７５タンパク／ポリペプチドは生 理的に許容される、非毒性の液状ビヒクルに分散させ、治療上有効な量で投与で きる。投与経路および投与量は上記の二久土ヱの項で述べたのと同様である。

定−葺 用語“ｇｐ７５”とは、ここでは分子量約１８５キロダルトン（ｋｄ）の糖タン パク（ｇｐ１８５）即ちＣ−ｅｒｂＢ　−２の外部ドメインを構成する、分子量 約７５ｋｄの糖タンパクを意味するものとする。用語“ｇｐ７ｓ”は正確には第 １６図に示されたそのヌクレオチドおよびアミノ酸配列により定義され、ｇｐ７ ５外部ドメインは大体アミノ酸番号２２（セリン；５ｅｔ−２２）からほぼアミ ノ酸番号６５３（セリン；５ｅｒ−６５３）までの領域（第１６図においてこれ らアミノ酸はその上部の黒丸でマークされている）を含み、これに対応するヌク レオチド配列をもつ、このアミノ酸配列はｇｐ７５のグリコジル化されていない バージラン（ｖｅｒｓｉｏｎ）を表し、およその分子量６９ｋｄを有するものと 思われる〔クッセンズ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）等の上記文献〕、用語″ｇｐ７５″ に含まれるものとしては、タンパク生成物の分子量に影響する種々の度合のグリ コジル化をもつ酵母および高等真核生物による組換え技術により生成される糖タ ンパクであり、例えば少量のｇＰ９０は、以下の実施例１で示されるように、安 定に形質転換されたｇｐ７ｓ−表現ＣＩＯ細胞中で生成された。

“完全ｇｐ　７５　（ｉｎｔａｃｔ　ｇｐ　７５　）なる表現は細胞表面に発現 されたｇ９７５外部ドメインを意味するものとしてここでは定義する。

従って、この完全ｇｐ７５は依然として膜内外領域を介して該細胞に付着してい る。

“ポリペプチド”とはペプチド結合によって共有結合的に結合したアミノ酸の鎖 であり、かつここでは５０以下のアミノ酸を含むものと考える。“タンパク０と は、ここでは５０以上のアミノ酸を含むポリペプチドであると定義する。

“ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチド゛なる表現は、ここでは、第１６図に示 したような１ｐ７５外部ドメインＤＮＡ配列（はぼ−５ｅｔ−２２乃至はぼ５ｅ ｔ−６５３をコードするヌクレオチド）により、あるいはｉｇｐ７５ＤＮＡ配列 のフラグメントによってコードされるタンパクおよびポリペプチドを意味するも のと定義する。

“ｇｐ７５タンパクおよびポリペプチド”なる表現は、該“ｇｐ７ｓタンパクお よびポリペプチド”と実質的に同一のアミノ酸配列および実質的に同一の生物学 的活性を有するタンパクおよびポリペプチドを包含するものと解釈すべきである 。

遺伝子コードの縮重のために、即ち１種以上のコドンが１種のアミノ酸をコード する〔例え、ば、コドンＴＴＡ％ＴＴＧＳＣＴＴ。

ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧは夫々アミノ酸のロイシン（Ｌ）をコードする〕こ とから、一つのコドンが他のコドンで置換されている第１６図のヌクレオチド配 列の変更は、本発明によれば実質的に等価なタンパクまたはポリペプチドを生成 するものと理解される。ｇｐ７５に対するヌクレオチド配列のこのようなすべて の変更は、本発明の範囲内にはいる。

更に、第１６図のｇｐ７５ＤＮＡ配列は天然に生ずるヌクレオチド配列の正確な 構造のみを示していることを理解すべきである。

僅かに修飾されたヌクレオチド配列が血清学的に類似の活性をもつ、免疫原性の および／または抗原性のタンパクおよびポリペプチドをコードすることが見出さ れ、もしくはこれらをコードすべく当分野で公知の技術によって修飾し得ること が予想され、このようなヌクレオチド配列並びにタンパク／ポリペプチドは本発 明の目的にとって等価であると考えられる。同等のコドンをもつＤＮＡは本発明 の範囲内にあり、例えば該ｇｐ７５ＤＮＡ配列に相同もしくは実質的に相同なタ ンパク／ポリペプチドをコードする合成りＮＡ配列およびｇｐ７５タンパク／ポ リペプチドをコードする配列とハイブリッド化されたＤＮＡ配列並びに遺伝子コ ードの縮重がなければｉｇｐ７５配列にハイブリッド化されるであろうこれらの 配列が含まれる。更に、ここでいう８ｐ７５配列に相補的なりＮＡ配列も本発明 の範囲内にある。ここで示したようなりＮＡ配列の上記の如き修飾並びに変更は 、ｇｐ７ｓ配列またはそのタンパクと実質上同一である配列を与えるものと考え られる。

典型的には、このような関連ヌクレオチド配列は、実質的に相同の定義にはいる ものと実質的に同一である。

更に、ｇｐ７５のアミノ酸配列は遺伝子技術により修飾し得ることを理解するで あろう、１種以上のアミノ酸を削除もしくは置換することができる。このような アミノ酸の変更は、特にこの変更がポリペプチドのエピトープ外の領域における ものである場合には、タンパクまたはポリペプチドの血清学的、抗原性および／ または免疫原性活性に何等検知し得る変化を生じ得ない、生成するタンパクまた はポリペプチドは実質的に同一のアミノ酸配列および実質的に同一の生物学的活 性を有し、かつ本発明の範囲内にある。

好ましくは、ｉｇｐ７５タンパク／ポリペプチドが化学療法薬と共に投与された 場合には、該薬品はアルキル化剤である。この方法にとって好ましい化学療法薬 はシスブチチン、カルポプラチンおよびメツアラン（ｍｅｐｈａ　ｌａｎ　）で ある。

略語 本明細書では以下のような略語を使用する。

ＡＴＣＣ：アメリカンティラスカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｆｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）ＢＣＡ　：ビシンコニン 酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）ＢＳＡ　：牛血清アルブミン ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣 ＤＡＢ　ニジアミノベンジン４塩酸塩 ＤＨＦＲニジヒドロフオレートリダクターゼＤＭＢＭ　：ドゥルベコ改良イーグ ル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ） ＥＤＴＡ　：エチレンジアミンテトラ酢酸ＢＧＦ　：表皮増殖因子 ＥＧＦｒ　：表皮増殖因子レセプタ ８ＧＴＡ　：エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、　Ｎ 、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラ酢酸ＢＬＩＳＡ　：酵素標識イムノソーベントアッ セイＦＡＣ３：フルオレセント活性化細胞選別（ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｃ ｔｉｖａｔｅｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）ＦＢＳ　：仔牛血清 ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネートＨＡＴ　：ハイポキサンチンアミ ノプテリンチミジンＨＢＳＳ　：ハンクス液 ＨＢＰＥＳ：　４−　（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スル ホン酸 ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフ ＨＲＰ　：セイヨウワサビベルオキシダーゼＩＲＭ＾　：イムノラジオメトリッ クアッセイ　（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｓ＋ｅｔｒｉｃａｓｓａｙ） ＭＥＭ　：最小必須培地 ＮＴＴ　：　３−　（４，５−ジメチルチアゾイル−２−イル）−２゜５−ジフ ェニルテトラゾリウムプロミドＭＴＸ　：メトトレキセート ＮＨ３：Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドＰＢＳ　ニリン酸緩衝塩水 ＰＥＧ　：ポリエチレングリコール ＰＭＳＦ　：フェニルメチルスルホニルフルオライドＰＮＰＰ　：　ｐ−ニトロ フェニルホスフェートＲＩＡ　ニラジオイムノアッセイ ＲＰＭＩ　ｎロスウェルバークメモリアルインスティチュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ 　Ｐａｒｋ　Ｍｅｓ＋ｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　１６４０培地Ｒ↑　 ：室温 ＳＤＳニドデシル硫酸ナトリウム ５Ｏ３−ＰＡＧＥ　ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動 Ｔａｂ−ＭＡｂ：モノクローナル抗体 ＴＣＡ：）リクロロ酢酸 ＴＭＢ　：テトラメチルベンジジン ＴＲｌ５　二）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンあるい番よアミノ−２− ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールセルライン 以下のセルラインを、以下に記載する実験で使用した。

５ＫＢＲ３：ヒト乳癌セルライン、転移胸膜滲出液として得られ、ＡＴＣＣカタ ログＮｏ、ＨＴＢ３０として得た。

５ＫＯＶ３　：ヒト卵巣癌セルライン。転移腹水滲出液として得られ、ＡＴＣＣ から得た。カタログＮＯ，ＨＴＢ７７゜ＭＣＦ７　：ヒト胸腺癌セルライン（胸 膜滲出液由来）。ＡＴＣＣから得た。カタログ！！１ＨＴＢ２２゜ＭＤＡ３６１ 　：脳への転移腫瘍由来のヒト乳癌セルライン。ＡＴＣＣから得た。カタログ１ ｂＨＴＢ２７゜ ＭＤＡ４３５　：転移胸膜滲出液由来のヒト乳癌セルライン。ＡＴＣＣから得ら れる。カタログＴｈＨＴ８１２９゜ＭＤＡ４６８　：転移胸膜滲出液由来で増幅 されたＥＧＦｒを含む乳癌セルライン。ＡＴＣＣから得た。カタログＴｈＨＴＢ １３２゜ＮＩＨ３Ｔ３　：Ｓ、アーロンソン（Ａａｒｏｎｓｏｎ）（ＮＩＢ）か ら得た二十日ネズミ繊維芽細胞セルライン（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７．２３７ ．ｐ、１７８）。

ＮＩＨ３Ｔ３ｔ　：　Ｃ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンと共に移入された二十日 ネズミ繊維芽細胞セルライン。Ｓ、アーロンソン（ＮＩ旧から入手した（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、１９８７．　２３７．　ｐ、１７８）。

ＨＢＬｌｏｏ　：この比較的正常なヒトミルク由来の乳癌セルラインは５Ｖ−４ ０で不死化されており、ＡＴＣＣから得た。

カタログ患ＨＴＢ　１２４゜ ＣＯ３７：５Ｖ−４０形質転換アフリカ産グリーンモンキー細胞。

ＡＴＣＣから入手した。カタログ丸ＣＲＬ　ｌ　６５１０ＣＨＯ−（ｄｘｂｌｌ 　）：チャイニーズハムスター卵巣細胞。ＵＣＳＦセルカルチャーファシリティ （Ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆａｃｉｌｉｔｙ）かここに記載する実験におけ る、指定したセルラインの増殖のために以下の増殖培地を使用した。

５ＫＢＲ３，：これらの細胞は最小必須培地（ＭＥＭ）　（ギブコバイオロＭＤ Ａ４６８．　ジカルズ社（Ｇｉｂｃｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）＋ Ｎ、Ｙ、　）　、１０％ＭＤＡ４３５　の熱失活させた仔牛血清、０．２９μｇ ／μｉのし一グルタミン中で培養した。

５ＫＯＶ３　：細胞は、イスコブズ改良ダルベフコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏ ｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＩＭＤＭ）　、１０％ 熱失活仔牛血清、０．２９μｇ／μＺＬ−グルタミン中で培養した。

ＭＤＡ３６１　：細胞は、ＲＰＭ１１６４０．１０％熱失活仔牛血清、１μｇ／ μｌ牛膵臓インシュリン、０．２９μｇ／μｌＬ−グルタミン中で培養した。

ＨＢＬｌｏｏ　：細胞はマツコイ（ＭｃＣｏｙｓ）　５　Ａ培地、１０％熱失活 仔牛血清、０．２９μｇ／μｊＬ−グルタミン中で培養した。

ＣＯ５７：細胞は、ｌＯ％仔牛血清（ギブコ）、１００μＭのし一グルタミン、 １００単位／　ｗ　ｌのペニシリンおよび１００μｇ／μｌのストレプトマイシ ンを補充したダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に定常的に保持した。

ＣＨＯ−（ｄｘｂｌｌ）　：細胞は１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物 質を補充したα−ＭＥＭ中に維持した。

ＮＩＨ３Ｔ３　：これら細胞はＤＭＥＭ＋４％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンＮ［３ τ３ｔ　中に維持した。

ＣＦ７ 叉−畝 以下の文献は本明細書中で、著名または編者および年号で言及した参照文献であ る。

アラステル（Ａｕｓｕｔｅｌ）等（編）、カレントブロトコールズ（Ｃｕｒｒ− ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ｉｎ　Ｍｏ１．　Ｂｉａｓ、、　ｖｏｌ、２． 　（ウィリーインクサイエンス（Ｗｉｌｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、 　１９８８　）。

・　クッセンズ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８５．２３ ０．　ｐ、１１３８・　ジフィオレ（Ｄｉ　Ｆｉｏｒｅ）等、１ｂｉｄ、　ｌ　 ９８７．　２３ユ、　ｐ、　１７８・　グラハム＆ファンデルニブ（Ｇｒａｈａ ｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　（編）。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　１９７３．　５２．　ｐ、４５６・　ホーラン−ハンド （Ｈｏｒａｎ−Ｈａｎｄ）等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、１９８３　。

４３．９．７２８ ・　ホルビッチ（Ｈｏｒｗｉｃｈ）等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　ｌ　 ９８５．　ｌ　ＯＯ。

ｐ、　１５１５ ・　スー（Ｈｓｕ）等、　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、、ｌ　９８１．　２９． 　ｐ、５７　？・　キング（Ｋｉｎｇ）等、　５ｃｉｅｎｃｅ、１９８５．　２ ２９．　ｐ、９７４・　ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｆ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９ ７０．　２２ユ、ｐ、６８０・　マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モレキ ュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニアラボラトリ− マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリン グハーバ−ラボラトリ。

ｌ　９８２ ・　マツコングローブ（ＭｃＣｏｎｇ　ｌｏｇｕｅ　）、哺乳類細胞用の遺伝子 伝達ベクタ（Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍ ａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ）、ｐｐ。

７９−８４　（ＣＳＨ出版、１９８７）・　スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）等、″ヒ ト乳癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕブロトーオンコジーヌの研究（Ｓｔｕｄｉｅ ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＨＥ　Ｒ−２／ｎｅｕ　ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｉ ｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ）″、癌細胞７／ヒト癌の分子論 的診断（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌ　７　／Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏ− ｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ）、ｐｐ、　３７１−３８４　、 　（ＣＳＨ，ＮＹ、　１９８９）・　トービン（Ｔｏｗｂｊｎ）等、ＰＮＡＳ、 ｌ　９７９．　７　Ｂ、　ｐ、４３５０・　シラー＆スミス（Ｚｏｌｌｅｒ　ａ ｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍｏｌ、。

１９８７、±５４．９．３２９ 以下の方法を下記実施例において使用した。

タンパク分析 ４％アクリルアミド濃縮用ゲルと、１０％解像ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇｇｅｌ ）　（両者共に０．２％ＳＤＳを含む）を使用して、ラエムリ（Ｌａｅ−ｍｍｌ ｉ）　［Ｎａｔｕｒｅ、１９７０．　２２７．　ｐｐ、６８０−６８５；この論 文を本発明の参考文献とする］により記載されたように、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ りタンパクを分析した。サンプルを５０μｌのサンプルバッフｙ（６３ｍＭのト リス（ＴＲＩ　Ｓ）　、　ｐＨ６，８，１０％のグリセロール、５％の２−メル カプトエタノール、および２．３％の５ＤＳ）中に適用し、２０ｍＡなる定電流 条件で４時間電気泳動させた。タンパクの分子量は既知の分子量をもつ標準タン パクに対する各タンパクの易動度から評価した。タンパクの濃度はクーマシー青 色色素−結合アッセイ（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンドＣＡ）を利用して測定した。

ウェスタンプロット 適当な抗体によって同定される抗原を特徴付けするために、トービン（Ｔｏｗｂ ｉｎ）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　、１９ ７９　。

工６．ｐｐ、４３５０−４３５４　；この論文を本発明の参考文献とする）によ り記載されたようなウェスタンプロット法の改良法を利用したが、ここではタン パクは５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースフィルタに移され、かつ適当 なモノクローナル抗体で同定された。ニトロセルロースフィルタに移した後、過 剰なタンパク結合サイトを、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に該フィルタを浸漬するこ とにより遮断した。１％のＢＳＡおよび１〜２Ｘ１０’カウント／分（ｃｐｍ） のヨウ素化抗体を含む３０μｌのＰＢＳ中で該シートを１時間インキュベートす ることによりこの抗原を配置させた。次いで、このフィルタを洗浄し、乾燥し、 かつオートラジオグラフィーに付した。（この手順により１００ピコグラム（ｐ ｇ）程度までのタンパクを検出することができる）。

抗体の調製 ポリクローナル抗体＝９２の調製 ニュージランド白兎を、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２タンパクの８１％のＮ−末端に該当 する旦、三旦組換え抗原５０〜２００μｇで免疫した。初期免疫はフロイント完 全抗原にＩ　：　ｌ　（ｖ／ｖ）の割合で乳化した該抗原からなっており、これ は２箇所の皮下部分に注射された。後の追加免疫は不完全アジュバントに乳化し た該抗原で２度に渡り２適間隔で行った。これら動物の耳静脈から２週毎に採血 し、ｇｐ１８５表現細胞溶解物に対しウェスタンプロット法で、（以下に述べる ）ＥＬＩＳＡを基に細胞に対する反応性により、放射性標識した細胞溶解物から のｇｐ１８５タンパクの免疫沈降により、および放射性標識したＡ４３１細胞溶 解物からのｇｐ１７Ｇタンパクの免疫沈降により該血清をアッセイした。これら の血清は２度の追加免疫後のウェスタンプロット法によりｇｐ１８５との強い反 応性をもつことが明らかとなりおよびＥＧＦレセプタタンパクとの交叉反応性を 示すことが立証された。

ポリクローナル抗体：９．２の調製 Ｃ−ｅｒｂＢ　−２タンパクのＣ−末端における１４アミノ酸からなるペプチド に対する兎ポリクローナル抗血清を作成した。上述と同様の免疫化を利用した。

この抗血清はＣ−ｅｒｂＢ　−２タンパクを発現する細胞の膜処方物から約１８ ５ｋｄのタンパクを特異的に沈殿させる。これは該ＥＧＦレセプタと交叉反応し ない。

モノクローナルＣ−ｅｒｂＢ　−２抗体の調製Ｃ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーン 、ＮＩＨ３Ｔ３ｔ　（親切にもＤｒ、　Ｓ。

アーロンソン（Ｎ　Ｉ　Ｈ）により提供された）を移入した２×１０ｅ〜ＩＸＩ 　Ｏ’　ＮＩＨ３Ｔ３細胞〔ディフィオレ（Ｄｉ　Ｆｉｏｒｅ）等。

５ｃｉｅｎｅ、１９８７，２３７．Ｄｐ、１７８−１８２）または完全フロイン ドアジュバント中に１　：　１　（ｖ／ｖ）の割合で乳化した同数の５ＫＢＲ３ 細胞のいずれかで、腹腔内および皮下経路でＢａ１ｂ／Ｃマウスを免疫した。こ れらの動物を、不完全アジュバントに乳化した細胞で２〜４週毎に追加免疫した 。２週毎に血清を集め、（以下に述べる）ＥＬＩＳＡアッセイで、ホルマリンで 固定したＮＩＨ３Ｔ３またはＮＩＨ３Ｔ３　を細胞に対する反応性につきテスト した。正の力価を示す動物を細胞のＰＢＳ溶液で腹腔内または静脈内経路で追加 免疫し、細胞融合のために４日後に動物を殺した。牌細胞を、ケーラー及ミルシ ュタイン（ＫＨｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅ−ｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ、１９ ７５．　２５６．　ｐｐ、４９５−４９７）の手順に記載されたようにＰＥＧ４ ０００を用いて、ｌ：ｌ〜７．５：１の比率でＰ３−Ｘ６３Ａｇ　８．６５３　 ミエローマ細胞と融合させた。

融合細胞を緩かに洗浄し、ＲＰＭＩ中で１〜４×ｌＯ“細胞／μｌの密度で９６ −ウェルをもつプレートに塗布した。融合の２４時間後にウェルをＨＡＴ培地で 満たし、次いで３日毎に２〜３週間に亘りこの操作を続けた。形成コロニーが肉 眼でみえるようになる１０〜１４日後に、培養上澄をＥＬＩＳＡアッセイにおけ る反応性についてテストした。良好な成長を示したクローンを２４ウエルを備え たプレートに展開し、７〜１０日後に再度スクリーニングした。次いで正のウェ ルを、流動選別解析（ｆｌｏｗ　ｓｏｒｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ）により生き たＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３　を細胞に対する外部ドメイン反応性につき アッセイした。ＥＬＩ　ＳＡアッセイおよび流動選別解析両方に対して正である ハイブリドーマ（親ハイブリドーマという）を、限界希釈クローニングまたは表 面免疫グロブリン表現の流動選別解析に基いた牌臓支持細胞を含む９６−ウェル を備えたプレートへの単一細胞付着によりクローニングした。成長がみられたウ ェルをＥＬ　Ｉ　ＳＡで再度テストし、更に１〜３回再クローニング処理した。

ハイブリドーマクローンからの上澄を、イソタイプおよびサブイソタイプ、流動 選別解析によるＮＩＨ３Ｔ３　を上での表面発現ｇｐ１８５に対する反応性、お よび移入細胞からの標識ｇｐ１８５プロティンの免疫沈降につきテストした。正 のハイブリドーマを育生し、ブリスタンで感作したＢａ１ｂ／ｃマウス、Ｂａ１ ｂ／　ｃヌードマウスまたはＩＲＣＦＩマウス中に腹水生産のために注入した。

腹水をベーカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）　Ａ　Ｂ　ｘカラム上でのＨＰＬ Ｃで精製し、精製されたモノクローナル抗体（ＴＡ　ｂ　＃という）をＰＢＳに 対して透析し、−２０℃にて保存した。全精製抗体を放射状免疫拡散法によるイ ソタイプおよびサブイソタイプにつき（１５％未満の汚染イソタイプ）、流動選 別解析による、ｇｐ１ｇ５表現セルラインの細胞表面染色性につき、移入または 非移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＥＬＩ　ＳＡアッセイ、標識Ｃ−ｅｒｂＢ−２ 発現セルラインからのｇｐ１８５の放射性免疫沈降、放射性標識されたＡ−４３ １細胞から放射性標識された１７０ＫＤタンパクが沈殿しなかったことによる密 接に関連したＥＧＦレセプタタンパクとの交叉反応性の欠如につきテストし、か つ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルデンシトメトリーによる解析を行った（全精製タ ンパクは９０％以上免疫グロブリンである）。すべてのモノクローナル抗体は、 ウェスタンプロット法によるｇｐ１８５タンパクの認識を示さなかった。今日ま でに発展したＭＡｂｓおよびその反応性の概要を第１表に総める。Ａ２９はモノ クローナル抗体、Ｔ　Ａ　Ｂ　２５０−２５４に対する親ハイブリドーマである 。初期のいくつかの実験においては、表に示したように、Ａ２９ハイブリドーマ からの上澄を使用した。

流動選別解析 Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３およびＮＩＨ３Ｔ３ｔ　（あるいは他のＣ−ｅｒｂＢ−２表 現セルライン）細胞を、ＤＭＥＭ＋４％ＦＢＳ中で８０％の集密度で育生した。

細胞をパックスベルセン（Ｐｕｃｋ’ｓ　Ｖｅｒｓｅｎｅ）で収穫し、２度冷Ｆ ＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ（フェノールレッドを含まない）、２％ＦＢＳ、０ ．２％ナトリウムアジド、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）で洗浄した。細胞を１２Ｘ７ ５ｍｍのガラス試験管当たり０．５〜１．０ＸｌＯ’細胞なる密度で分配しく細 胞は９０％以上生存性でなければならない）、ペレット化し、上澄を除去した。

これらの試験管を氷上に置き、試験管１本当たり１００μｌの上澄または精製抗 体を加えた。各抗体または上澄をＮＩＨ３Ｔ３細胞並びにＮＩＨ３Ｔ３を細胞両 方に対してテストした。

この抗体を氷上で１時間該細胞と共にインキュベートした。細胞を冷ＦＡＣＳバ ッファーで２度洗浄し、ｉｏｏμｌのＦ　Ｉ　ＴＣ−複合山羊抗一マウス二次抗 体を添加した。氷上に１時間放置した後、該細胞を２度ＦＡＣＳバッファーで洗 浄し、１０％中性緩衝ホルマリンで再懸濁して、５００μ！とした。この再懸濁 した細胞はホイルで包んで４℃にて３日まで保存できる。この標識細胞をクール タ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）Ｅ　Ｐ　Ｉ　ＣＳ　５４１流動選別機で分析し、平均ピー クチャンネル蛍光を５０００細胞につき測定した。ＮＩＨ３Ｔ３を細胞に対する 反応性の平均ピークを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する反応性の平均ピークと比較し た。ｇｐ１８５の外部ドメインタンパクと反応する抗体について、該ピークは非 重複性であった。

抗体アッセイ ポリスチレンプレート（９６−ウェル）を、ＰＢＳで希釈したＣ　−ｅｒｂＢ　 −２表現細胞からの溶解物１１００ｎを被覆した。この溶解物は、２〜３μｌの 冷溶解バッフｙ　（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ！、０．１％トライトン（Ｔｒｉｔｏ ｎ）　Ｘ　−１００、０，１％デオキシコレート、０、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ） リス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７，４，１ｍＭＰＭｓＦ）を２Ｘ１０’〜ｌＸｌ０’細 胞に加え、氷上で１５分間インキュベートすることにより調製した。溶解物を１ ０．０００ｇにて２０〜３０分間遠心処理し、上澄をタンパクについてアッセイ し、分割し、−２０℃で保存した。溶解物を加えたプレート（競合プレートとい う）を、室温にて一夜インキユベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。もう一つの ９６−ウェルプレート（インキュベーションプレート）を１％ＢＳＡ　（ＰＢＳ 溶液）で室温にて１時間遮断したく１００μｍ／ウェル）。これらのプレートを 洗浄し、抗原（ｇｐ７５表現ＣＨＯ細胞からの上澄、即ちマウス血清または細胞 溶解処方物）を該ウェル中にて５　ｎｇ／μｌとなるようにＴＡｂ２５１と混合 し、該プレートを室温にて２〜４時間インキュベートした。該競合プレートを同 様に１％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断し、洗浄し、１００μノの該インキュベーション 混合物を、該インキュベーションプレートから該競合プレートに移し、室温にて １時間インキュベートした。次いで、これらのプレートをＰＢＳｌｏ、０５％ツ イーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で洗浄し、ビオチン処理した（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔ ｅｄ）山羊抗−マウスＩｇＧ抗体をｌ：４００なる希釈率（Ｖ／　Ｖ　）でウェ ル当たり１００μｌ添加した。これらのプレートを室温にて３０分間インキュベ ートし、洗浄し、１００ｐｉのストレパビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）　− ＨＲＰコンジュゲートを１：８０００なる希釈率（Ｖ／Ｖ　）で加えた。更に室 温にて３０分間インキュベートした後、上記の如くアッシュ工程（ａｓｈ　５ｔ ｅｐ）を行い、ＴＭＢ基質を１００μｌ／ウエルで加えた。この基質は、５μｌ のＴＭＢ母液（ｌμｇ／μｌの３．３’、５．５’−テトラメチルベンジジンの メタノール溶液）と５μｌのシトレートバッファー、ｐＨ４，５および４μ！０ ３０％過酸化水素と混合することにより、使用の直前に調製した。室温にて暗所 で１５分間インキュベートした後、吸光度を４５ｏｎ−にて測定した。ＰＢＳと 共に予めインキュベートしたＴＡｂ２５１を不競合コントロールとして使用して 、溶解物で被覆した競合プレートに対する最大結合量をめた。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡアフセイ ポリスチレンの９６−ウェルプレートを、１００μｌ／ウエルの牛コラーゲン（ １μｇ／μｊ滅菌ＰＢＳ溶液）と共に３７℃にて２時間前処理した。ＮＩＨ３Ｔ ３またはＮＩＨ３Ｔ３を細胞をＤＭＥＭ＋４％ＰＢＳ中で８０％集密度で育生し 、温パックスベルセンで収穫し、洗浄し、予備処理した、かつ洗浄したコラーゲ ンプレート内で３７℃にて一夜ｌＸｌ０”細胞／μｌ、１００μｌ／ウエルにて 塗布した。プレートを穏やかに洗浄し、１００μｌの１０％中性緩衝ホルマリン で１時間処理した。プレートを再度ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７ ℃にて１時間遮断した０次いで、サンプルの上澄または抗体希釈物を、１００μ ｌ／ウエルで、該被覆し、遮断し、かつ洗浄したプレートに加え、該プレートを ３７℃にて２時間インキュベートした。更にＰＢＳ洗浄工程を経た後、ｔ：ｓｏ ｏなる希釈率のアルカリンホスファターゼ−複合山羊抗−マウスＩｇＧ　Ｆｃ− 特異的二次抗体を加え、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。最後 のＰＢＳ洗浄後、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）基質（ＰＮＰＰ＋ジェタノールア ミン）を加え、室温にて１０〜１５分間インキュベートした後、吸光度を４０５ ０禦で測定した。

イムノペルオキシ　−ゼ 使用したイムノペルオキシダーゼ染色法は、ヒユー（Ｈｅｕ）等のアビジン−ビ オチンイムノベルオキシダーゼ法（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、１９８１．　２９．　ｐｐ、５７７−５８０）およびホ ランーハンド（Ｈｏｒａｎ−Ｈａｎｄ　）等（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　ｌ　 ９８３　、土３．ｐｐ。

７２８−７３５）に記載の方法の改良法であった。これら文献を本発明の参考文 献とする。

以下の実施例は本発明の十分な理解を助け、かつ例示のみの目的で与えられる。

これらはいかなる意味においても本発明を何等限定するものではない。

実施例１ （ＣＨＯ細胞におけるＣ　−ｅｒｂＢ　−２の発現）（Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ベク ターの構築）推定上のＣ−ｅｒｂＢ　−またんばく質の細胞外ドメインをコード するＣ　−ｅｒｂＢ−２ｃＤＮＡの２．ＯｋｂフラグメントをＮｃｏｌおよびＡ ａｔＩ［を用いオカヤマ・バーブクローニングベクターｐＳＶ７１８６（ファル マシア社から市販、ｃａｔ　＃２７−４９４８−０１）から切り出し、Ｔ４ＤＮ Ａポリメラーゼで平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ−（ＮＥバイオラプス、ｃ ａｔ＃１０７８）とライゲーションした。このＣ−ｅｒｂＢ−２ｃＤＮＡはり、 スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）　（Ｕ　ＣＬ　Ａ）によって、胸にアデノカルシノー マを持つ女性の患者から始めて単離された（Ｃ−ｅｒｂＢ　−２の完全なヌクレ オチド配列は第１６図参照）。ＥｃｏＲ４リンカ−結合の部分Ｃ−ｅｒｂＢ−２ ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化したｐＦＲ４００のＳＶ４０に基づく誘導体であるｐ ＦＲ３Ｖ　（ホーウィック（Ｈｏｒｗｉｃｈ）等、１９８５）にサブクローン化 した。ｐＦＲ８Ｖを構築するためにｐＫｓＶｌＯ（ファルマシア社から市販、ｃ ａｔ　＃　２７−４９２６−〇ｌ）から２．６ｋｂのＰｖｕＩＩ／Ｈｐａｌフラ グメントを単離し、平滑末端化後ＰｖｕＩＩ消化したｐＦＲ４００にクローン化 した。

ｐＫＳＶ−１０のヌクレオチド５１０７番に位置するＢｇｌＩＩ部位を予め部位 特異的突然変異誘発（シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、　 １９８７　）でＥｃｏＲＩ部位とし、最終構築物ｐＦＲ８Ｖ中のユニークなＲＩ クローニング部位とする。またこのベクターは優性な選択可能マーカーＤＨＦＲ を含んでおり、それをｇｐ７５Ｃ−ｅｒｂＢ　−２誘導体の増巾に使用した。ｐ ＦＲ８Ｖ−Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ｓｅｃと命名した最終構築物（第３図）を大腸菌 ＭＣｌ０６１株にトランスホームし、そのプラスミドＤＮＡをマニアチス（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ）等（１９８２）の方法で単離した。

（ｐＦＲ８Ｖ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃのトランスフェクション）このプラスミ ドの発現をＣ０８７細胞およびリン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）　トランスフェ クション法（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびヴアンデルエブ（ｖａｎ　ｄｅｒ 　Ｅｂ）　１９７３　）を用いてモニターした。トランスフェクションの２４時 間前細胞を１００ｍｍ組織培養皿上ｌ：１０に分けた（約３０〜５０％集密度） 　０．４９μｍ２ＸＨｅＢＳ中の２０Ｍｇ（１０μｍ）のプラスミド構築物に０ ，５μｌの０．２５Ｍ　ＣａＣｌ！ｔをゆっくり加え（オースベル（Ａｕｓｕｂ ｅｌ）等線、１９８８参照）１０秒間ポルテックスした後２０〜３０分間室温に 放置し、ＤＮＡを沈殿化させた。それからこの沈殿をＣ０８７細胞の皿に加え、 その細胞／沈殿混合物を３７℃、５％ＣＯ７条件下１５時間インキュベーション した。リン酸緩衝液（ギブコ）で細胞から沈殿を洗い落とし、完全生育培地（Ｄ ＭＥＭ）中でインキュベーションしてからＤＮＡの導入後４８時間までＣ−ｅｒ ｂＢ　−２の発現を検定した。

ＣａＰＯ４）ランスフエクション法を用いることによりＣＨＯ細胞で安定したｐ 　ＦＲ３Ｖ−Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ｓｅｃの発現が得られた（上述）、ＤＮＡ沈殿 は２０μｇのプラスミドＤＮＡおよび４枚のＣＨＯ細胞の１００ｍ−ディンシュ を用い上述の方法で調製した。プラスミドの導入後７２時間、各トランスフェク ト化１００ｗ■ディツシュを１：２０に分け、１０％の透析化ウシ胎児血清およ び２０ｍＭ　ＭＴＸを含むａ−ＭＥＭ（ヌクレオシドおよびヌクレオチドなし） 中１８日間培養した０段階的増巾を開始し、細胞を６日毎ニ濃度を増やしたＭＴ Ｘ　（１００ｎＭ、２．５ｍＭ、１２．５ｗＭおよび５０ｍＭ）に曝した。ＭＴ Ｘ中２１日間の増殖後限界希釈によりＭＴＸ耐性集団をクローン化した。これら の集団の１つに由来する１０６個の細胞を以下のように増殖培地（上述）で希釈 した：２Ｘ１：１００、ついで２Ｘ１　：　１０で希釈し９６六マイクロプレー ト（コスタ−製）のウェル当りおよそｌ細胞とする。

この細胞を５０ｍＭＭＴＸ中に維持しながら３週間に渡り、２４穴および６六マ イクロプレートついで６０＋−ディツシュへと連続的に拡げていった。それから 放射能免疫沈殿法、免疫蛍光法、およびウェスタンプロット法を用いＭＴＸ耐性 クローンのｇｐ７５発現を検定した。

（免疫蛍光法） 抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ　２５２またはその親ハイプリドーマＡ２９の上清 を用い、ｇｐ７５の細胞内存在部分を検出した（上述の該ＭＡｂの調製注参照） 。ＰＢＳ１５ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させ、ＰＢＳで２回洗った後２ μｌの４％ｐ−ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中３７℃、１０分間処理して固定した 。この細胞をＰＢＳで洗浄後０．６％ｎ−オクチル−グルコシド／ＰＢＳ中室温 で５分間インキュベーションし、膜透過性としてから１０ＩＩ　ｇ／ｐ　ｇのい ずれかの抗−Ｃ−ｅｒｂＢ　２ＭＡｂを含む２％ＦＢＳおよび１０ｗＭ　ＨＥＰ ＥＳ　（ｐ！（７，０）からなるｌ　ｘＨＢｓｓに懸濁した。この−次抗体との インキュベーションは氷中６０分間行ない、ついでＰＢＳで２回洗浄した。それ がら細胞をＦＩＴＣＦ（ａｂ’）を抗マウスＩｇＧ（タボ製、カタログ＃４９５ ０）を含む１００μ！のＨＢＳＳに懸濁した。またトランスフェクトした細胞を 非特異的マウスミエローマＩｇＧ１（リトンバイオネティクス製）で染色した。

（放射能免疫沈殿法） 一時的トランスフエクション化または安定発現Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ｓｅｃ細胞を ６０ｍ−ディツシュで８０％集密度となるよう生育させてから、２μ！無システ ィン培地中１時間かけて飢餓化した。ついで細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下２ ００ｍＣ１の３５Ｓ−システィン（比活性−６００Ｃｉ／−霧Ｏ１；アマージャ ム社）で１５時間かけてラベル化した。その上清を回収しＬａ＋Ｍ　ＰＭＳＦ中 −２０℃で保存した。冷リン酸緩衝液で細胞を２回洗浄してからディツシュ当り ０．４μｌのＩ　ＸＲＩ　ＰＡバフフｙ　（０，１５Ｍ　ＮａＣＪ、１％トリト ンＸ−１００（１０μｌ／Ｌ＞　、１％デオキシコールａす）’Ｊウム（１０ｇ ／Ｌ）　、０．１％ＳＤＳ　（１ｇ／Ｌ）　、１０■ＭトリスｐＨ７，４，１ｍ ＭＰＭＳＦ）に溶かした。その溶解物をプロティンＡ−セファロースを用いて清 澄化した後（溶解物４００μ！当６０μｊ）、１０μｌの溶解物をＴＣＡ沈殿し て取込みをチェックした。この溶解物をサンプル当り４Ｘ１０’カウントで標準 化し、振とう器を用い４℃で１晩抗体とインキュベートした。この上清を濃縮し 、その等偏量を一晩抗体とインキュベートした（振とう器を用い、４℃で）、− 晩のインキュベーション後このサンプルを６０μｌのプロティンＡ−セファロー スを用い４℃、３０分間で沈殿化し、遠心で落とした後４回Ｉ　ＸＲＩＰＡでで 洗浄した。最後の洗浄後吸着した免疫複合体を３５μｌの２×レムリバツフアに 懸濁し、５分間煮沸してから７％アクリルアミドゲルで電気泳動した。このゲル を固定化し、乾燥後−晩のフィルム露光に使用した。

ウェスタンプロットには７％ＳＤＳアクリルアミドゲルで電気泳動し、トリス− グリシン−メタノールバッファを用いてニトロセルロースにブロッティングした 。ブロッキングおよびインキュベーションは１０％ミルクおよび２％ＢＳＡ中で 行った。検出には基質としてＤＡＢを用いたビオチン−アビジン法を使用した（ ０．１．Ｍトリス、０．０２％過酸化水素溶液中ジアミノベンジジンテトラヒド ロクロライド）。このプロットは０．０５Ｍトリス、０．２５Ｍ塩化ナトリウム （ＮａＣｊ７）３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％トウィーン２０溶液で洗浄した。

（ＣＩＯ細胞における可溶性Ｃ−ｅｒｂＢ　−２誘導体（ｇｐ７５）の検出） 先に述べたようにｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃ構築物を安定にＣＨＯｄ ＸＩ１株に導入し、ＭＴＸ濃度を段階的に増加して予期されるｇｐ７５の増巾の 後に細胞溶解物および上滑における抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡｂ　２５２との反 応性を検定した。先に示されたＲ［’分析を用い、細胞溶解物中にｇｐ７５の主 要部分が検出された。ｇｐ７５安定発現ＣＨＯ集団の上清には実質的により少な い量が検出された。免疫蛍光法を行なうことによりこの構築物が疎水性の膜透過 ドメインを含まないことからｇｐ７５が生成し、かつｇｐ７５安定トランスフェ クト化ＣＨＯの上滑に分泌される理由を決定した。免疫蛍光分析によって１つの トランスフェクト化ＣＨＯ集団のおよそ３０％および第２の集団の１０％が抗− Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ＴＡｂ　２５２と反応性を有し、またそのたんぽ（質が特定 のオルガネラ；たとえばリソソームや核に局在化していないことが示された。我 々は各々のｇｐ７５発現ＣＨＯ集団の限界希釈クローニングによるｇｐ７５の分 泌画分を増加し得たと考えている。

各ＭＴＸ耐性（５０ｍＭ）クローンを単離し、増巾後抗−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ＴＡ ｂ２５２を用いてｇｐ７５発現を検定した。免疫蛍光法、ＲＩＰ分析およびウェ スタン分析でｇｐ７５のクローニングおよび発現の成功が確認された。ＣＨＯク ローンからの分泌ｇｐ７５の発現レベルは非クローン化集団と比較して約１０〜 ２０倍大きかった。

Ｃ−ｅｒｂＢ　−２の“可溶性”誘導体がインビトロで生成する可能性を試すた め細胞外エピトープを認識する抗−Ｃ−ｅｒｂＢ　−２ＴＡｂ２５２に対する結 合の競争を行った。この実験に用いた２種の細胞は全長Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｃＤＮ Ａで安定にトランスフェクトしたＮＩＨ−３７３（キング（Ｋｉｎｇ）等、１９ ８５）および先に述べたｇｐ７５発現ＣＨＯの１つである。予め３５Ｓ−システ ィンを用いてラベル化したクローンから上清を回収した。競争は一定量の抗−〇 　−ｅｒｂＢ　−２抗体ＴＡｂ　２５２、一定量のラベル化ｇｌ）７５−ＣＨＯ 上清および種々の量の３　Ｔ　３−Ｃ−ｅｒｂＢ　−２非ラベル化細胞溶解物を 用いて行った。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより非ラベル化３　Ｔ　３−Ｃ−ｅｒｂＢ　 −２（ｇｐｌ　８５）濃度が増加するにつれて約７５ｋｄのＲＩＰバンドの強度 は逆比例して減少することが示された（第４図）。このことは“可溶型”がこの たんばく質の膜結合型を発現する細胞型から“放出“され、かつ種々の細胞型で グリコジル化に明確な不均一性が存在することを示している。ｇｐ７５発現ＣＨ Ｏ細胞の上清はその結合について旧Ｈ３Ｔ３　。

溶解物と競合した（第４図）。

（実施例２） （組換えＣ−ｅｒｂＢ　−またんばく質の精製）（プラスミドの精製） バクテリアの１リツトル培養において０Ｄ６００−０．８のとき細胞に２００μ ｇ／μｌのクロラムフェニコールを加えることによりプラスミドＤＮＡを増巾し た。３７℃、１晩のインキュベーシック後バクテリアをペレット化し、１０μｌ の５０−Ｍスクロース、２５ｍＭ）リス−ＨＣｊ　（ｐＨ８，０）　、１０■Ｍ 　ＥＤＴＡ溶液に懸濁した。この溶液１０ｕｊの１０μｇ／ｍｔｔリゾチーム溶 液を加え、室温で１００分間インキュページンした。この混合物に４０ｗａｌの ０．２　Ｍ　ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液をゆっくり添加し、水中で１０分間イン キエベーシッンした。それから３０■１０３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）を 加え、この混合物を水中でもう１０分間インキエベーシッンしてからベンクマン ５Ｗ２７または同等物を用い２０．　ＯＯＯｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した０ 等容量のイソプロパツールを上滑に加え、室温で２０分間放置して沈殿化し、そ の沈殿をソーバール（Ｓｏｒ　ｖａｌｌ）を用い室温、１２．０００ｇで３０分 間遠心して沈降させた。このペレットを２゜４鋤ｌのＴＥバッファ　（１０ｍＭ ）リスＨＣｊ、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁し、ついで４．２ｇ塩化 セシウム（ＣｓＣ１）および０．４■ｌエチジウムプロミド（ＥｔＢｒ）　（１ ０μｇ／１０と混合した。このサンプルをベックマンクイック−シールポリアロ マ−チューブ中ＣｓＣｊ溶液要約８ｍＪ　（密度＝１．４７０ｇ／ｍｊ、ｎ−１ ，３７８０）の下５／８　Ｘ　３のところにロードし、ソーバールＴ１２７中２ ０℃、５０．００　Ｏｒｐｍで１８時間遠心した。

（イムノアフィニティーゲルの調製） モノクローナル抗体ＴＡｂ　２５４　（該ＭＡｂの調製法については上記方法の セクション参照）を業者の指示に従がいＮＨ３活性化アフィニティーゲル（アフ ィ・プレツブ１０；バイオラフトラプス社、リッチモンド、ＣＡ）にカップリン グした。簡単に云うと精製抗体４．５μｇをカップリングバッファ（２０ｍＭ　 ＨＥＰＢＳ。

１）Ｈ＝７．５．１５０　ｍＭ　ＮａＣｆ　）に交換し限外濾過で最終容積１． ０鋤ｌに濃縮した。この溶液を水冷カップリングバッファで平衡化した２、０鋤 ｌのゲルに加え、このスラリーを４℃で一晩混合した。カップリング後、このゲ ルを焼結ガラスフィルターで回収し、カップリングバッファで洗浄した。濾液サ ンプル中のたんばく質をＢＣＡたんばく質検定法で検定した（ピアス社、ロック フォード、ＩＬ）。濾液全てから回収された総たんばく質は１．２μｇであった 。それゆえ１ｇＧ３．３μｇがゲルにカップリングしたと考えられる。

残存する反応部位を２−アミノエタノールでブロックした。カップリングバッフ ァ中１００ｍＭの２−アミノエタノール５．ｈｆ（ｐＨ８，５）をゲルに加え、 そのスラリーを室温で２時間混合した。それからこのゲルをＰＢＳで十分に洗浄 し、４℃で保存した。

アジ化ナトリウムを加え（最終濃度０．０２％Ｗ／Ｖ）、バクテリアの繁殖を防 いだ。

（Ｃ−ｅｒｂＢ−２細胞外ドメインの単離および精製）可溶性Ｃ−ｅｒｂＢ　− ２細胞外ドメインたんぽ（質を精製するための出発物質としてトランスフェクト 化ＣＨＯ上清の１０倍濃縮物を用いた。濃縮上清を融解し、以下に示す最終濃度 となるようにプロテアーゼインヒビターを加えた。０．２ｍＭ　ＰＭＳＦ、２． １μｇ／ｌ１１１アプロチニン、２２−５ｕ／ｊ！ペプスタチンＡ、１．０μｇ ／ｍｌｏイペプチン、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、上清のｐＨは１．　 ＯＮ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で７．０に調整した。

いくつかの実験では限外濾過を用い上滑をさらに４倍濃縮した。

さらに上清を濃縮すると濁りを生じ、この濁りはクロマトグラフィー前遠心で除 去した（ｌｏ、ｏｏＯＸｇ、２０分間）。

この上清を０．４５鵬請メンブレンで濾過した後２５４イムノアフイニテイーゲ ル（１，０ｍｆベッド容積）を充填した０、５Ｘ５ｃｍカラムにロードした。こ のカラムは毎分０．２鋤ｌの流速で運転した。

１０−Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，５００■Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣ１ ）で非特異的結合物質を洗い流した。洗浄は２８０ｎ−の吸収ベースラインが安 定するまで行った。特異的結合物質は流速０．２ｍｆ／ｓｉｎの１０（１＋Ｍグ リシン−ＨＣｊ　（ｐＨ２，５）のステップグラジェントで溶出した。各１．Ｏ ｍＪ！のフラクションを採取した。その後カラムはＰＢＳで十分に洗浄した。サ ンプルロード、洗浄および溶出は４℃で行った（第ＪＴＩ！Ｊ）。

カラムフラクション中のＣ−ｅｒｂＢ　−またんばく賞の存在は５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅおよびウェスタンプロット分析で測定した（第２Ａ図および第２Ｂ図参照）、 ウェスタンプロット分析の場合抗原はポリクローナル抗体９２Ａの１／２０００ 希釈物（この調製法は上述の方法のセクション参照）で検出した。ピーク反応性 を含むフラクションを回収し、上述のプロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳに 対して透析した。この透析物を限外濾過で濃縮した。

最終的たんばく賞収量は標準物質としてウシガンマグロブリン（バイオラドラプ ス社、リッチモンド、ＣＡ）を用いたＢＣＡたんばく質検定法で測定した。

１回のクロマトグラフィーサイクルからの総たんばく質収量は約９０μｇであっ た。このことはＩ　ＲＭＡで測定された１０倍濃縮上清５００鋤ｌ中の抗原活性 の約９０％に相当する。同じカラムで５回のサンプルロードおよび溶出サイクル を行つたが抗原結合容量のロスはなかった。溶出物プールの５ＤＳ−ＰＡＧＥは 約７５ｋＤの非常に接近した２つのバンドおよび９０ｋＤの１つのマイナーバン ドを示した。これらのサイズの差はたんばく質のグリコジル化の差またはたんば く質分解の差によるものであろう。

（実施例３） （イムノラジオメトリックサンドイッチアッセイ（ＩＲＭＡ））ヨードケン法を 用いＴＡｂ　２５１および２５５−２６５をｌＯ−１０−２Ｏ／μｇの比活性と なるよう放射能ラベルした。イムロンエリムーバル９６穴プレートをＰＢＳ　（ ｐＨ７，２）中ｌＯμｇ／ｍｌの以下のＴＡｂ：２５１．２５５−２６５の１つ を用い、４℃１晩でコーティングした。それからこのプレートをＰＢＳで洗浄し 、ついでＰＢＳ中１％ＢＳＡを用い、３７℃１時間でこれをブロックした。さら に洗浄した後、ＰＢＳで希釈した１００ａ＋ｆのサンプル（細胞溶解物または上 清、部分精製ｇｐｔａｓまたはｇｐ７５たんばく質または血清サンプル）をＴＡ ｂコーティングウェルに加え、このプレートを３７℃で２〜５時間インキュベー トした。プレート洗浄後ウェルに放射能ラベルしたトレーサー抗体（１％ＢＳＡ ／ＰＢＳで２００．０００ｃｐｍ／　ｌ　００ｉｌｌに調整したもの）を添加し た。室温での２〜２４時間のインキュベーション後、このプレートを洗浄し、各 ウェルをガンマカウンターで計数した。結合率（１％Ｂ）は以下の式で計算した 。

％Ｂ＝（サンプルｃｐｓ／全ｃｐｓ）　ｘ　ｌ　００アフイニテイー精製したｇ ｐ７５たんばく質（トランスフェクトＣＨＯ細胞系列由来）が使用可能な検定で はシグモイド曲線関数を用いて標準曲線を作製し、そこからｎｇ／ｉｆで表わさ れるｇｐ７５等価物として未知濃度を測定した。

第２表はモノクローナル抗体を組合せるとサンドイッチ・ＩＲＭＡ様式でｇｐ７ ５たんばく質を検出し得ることを示している。準精製ｇｌ）１８５もｇｐ７５標 準物質と同様にＩＲＭＡ様式のテストを行った、興味深いことに、捕獲抗体とし てＴＡｂ２５１およびラベル化抗体としてＴＡｂ２５５を用いたこの様式のテス トでＣ−ｅｒｂＢ−２発現細胞系列溶解物およびＣ−ｅｒｂＢ　−２オンコジー ンでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から部分精製したｇｐ１８５たんば く賞からのシグナルは検出できたがＣ−ｅｒｂＢ　−２誘導腫瘍を有するヌード マウス血清からのシグナルまたはｇｐ７５たんばく質は検出できなかった。第３ 表にまとめた競争検定法に基づくこれらのデータは最終的検定様式がヌーマウス 血清中のシグナルも検出するｇｐ７５たんばく質検出に必要であることを示して いる。

ｇｐｙｓ同様ｇｐ１８５に対しても適正な感度および特異性を示すこの最終的検 定様式は捕獲抗体としてＴＡｂ２５９およびトレーサー抗体としてＴＡｂ２５６ を用いる。この検定では０．５〜１　ｎｇ／−２の感度で部分精製したｇｐ７ｓ たんばく質が検出され、部分精製したｇｐｌ　８５、ｇｐｌ　８５を過剰発現す る細胞溶解物中およびヌードマウス血清中のシグナルが検出された（第３表にま とめた）。

Ｊｌｐ７５に対する感度を示す本検定の標準曲線を第７図に示す。

ＴＡｂ　２５６／２５９　ＩＲＭＡ検定を用いて細胞培養上清のシグナルを定量 した。Ｃ−ｅｒｂＢ　−またんばく質ポジティブの細胞系列はこのＩ　ＲＭＡ検 定で検出および定量される抗原を放出している。第４表は、コントロールＮＩＨ ３Ｔ３細胞系列の放出抗原レベルがバックグランドレベルであり、一方ｇｐ１ｓ ｓを過剰発現し、放射能免疫沈殿法で検出されるｇ９７５を上滑中に放出する細 胞系列もサンドイッチＩ　ＲＭＡで検出可能で２２〜７０ｎｇ／■ｌのｇｐ７５ 等価物として定量される抗原を放出することを示している。

放出される抗原のレベルは培養物の集密度およびＣ−ｅｒｂＢ　−２過剰発現の レベルに依存する。

この様式の方法を用いて全てのマウスおよびヒト血清サンプル、および細胞上清 および細胞溶解物を分析、定量した。競争およびサンドインチ検定の結果を第３ 表にまとめた。この結果は部分精製したｇｐ７°５外部ドメインたんばく質の検 出能とＣ−ｅｒｂＢ　−２誘導腫瘍を有するヌードマウス由来の血清サンプルま たはヒト胸部がん患者由来の血清サンプル中の放出抗原検出能の相関関係を示し ている。

第３表：血清サンプル中のｃ　−ｅｒｂＢ　−２外部ドメインおよび放出抗原の 検出における競争検定法およびＩ　ＲＭＡ検定法の比較 検定様式 ％式％ 一　バンクグランド以上のシグナルなし＋／−バンクグランド以上の弱いシグナ ル十　バンクグランド以上の検出可能なシグナル＋十　強（定量可能なシグナル ＮＤ　測定せず 表４　：　ＴＡｂ　２５９／２５６サンドイツチＩ　ＲＭＡ検定法を用いた種細 胞系列　集密度％　細胞培養上滑中のｇ９７５等価物、ｎｇ／ｍＡ ＮＩＨ３Ｔ３ｔ　１００　３２．７ ＮＩＢ３Ｔ３　１００　０．０６４ ＳＫＢＲ３１００７０，０ ＢＴ４７４　５０　２２．５ ネ培地コントロールのバンクグランドレベルは０．１　ｎｇ／　ｍ　ｊであった 。

（実施例４） （ヌードマウス腫瘍増殖および治療） 実験を開始する前にＢａ１ｂ／ｃヌードマウスを尾の静脈から放血させた。それ からこの動物に２００ｍｊのＰＢＳ中５ＸＩＯ”〜ｌＸｌ０’個のＮＩＨ３Ｔ３ ｔｔＭ胞を背中中央に沿って皮下注射した（θ８目）、これらの細胞のは９０％ 以上が注射後も生存していた。細胞注射から２〜３日後（ＩＩ腫瘍積が１００■ ３に達する前）この処理動物に２〜３日毎にＰＢＳ、１００〜５００μｇ／３０ ０ｓｊ！のＩｇＧコントロール抗体またはＴＡｂ抗体を腹腔注射した。バーニア キャリバーを用いて腫瘍の長さ、巾および高さを測定し、容積を計算することに より増殖を測定した。腫瘍は３−４日毎に測定した。１〜２週間毎に尾の静脈か ら放血させた。

この実験は２８〜３１日間続けた。実験の終りに最後の放血を行ない、腫瘍を測 定し、次の免疫組織学的実験に用いるためこれを切り取った。

（ヌードマウス血清中の放出抗原の検出）第８図では、ｌ：５血清希釈物（ｖ／ ｖ　）のＩＲＭＡ検定における結合シグナルの割合を血清採取時における腫瘍の 大きさに関してグラフ化した。これらの血清はｃ　−ｅｒｂＢ　−２）ランスフ ェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞によって誘導される腫瘍を有する動物に由来する。この 検定法は腫瘍サイズが約３０００＋ａｍ’になるまでシグナルが増加しつづけ、 その後一定になることを検出できた。非常に強いシグナルと血清量に限りがある ことから血清を１１５〜１／６２５（ｖ／ｖ）に希釈して分析した。一番高い希 釈率のときでもしばしば強いシグナルが検出できた。腫瘍含有マウスをＰＢＳま たはＩｇＧ１コントロール抗体で処理した場合Ｉ　ＲＭＡ検定法で検出されたシ グナルは未処理のマウスと同じであった（第９図）。しかし、この動物はＣ−ｅ ｒｂＢ　−２外部ドメインを認識するＴＡｂで処理したとき、この検定法で検出 可能な放出抗原量は腫瘍サイズが３０００ｍ＋”となるまで厳しく抑制された。

腫瘍サイズが＞３０００ｍ”のときでさえ、シグナルはテストした血清の約半分 に抑制された。これらのデータはｃ　−ｅｒｂＢ　−２の外部ドメインまたはそ の一部分を認識する抗体はサンドイッチＩＲＭＡ検定における検定可能シグナル のレベルを抑制することを示している。

またヌードマウス中で生育させたｇｐ１８５たんばく質を過剰発現するヒトの乳 腺または卵巣細胞系列も第５表に示したとおりＣ−ｅｒｂＢ　−２Ｉ　ＲＭＡ検 定で検出可能な抗原を放出した。このシグナルは腫瘍のサイズと相関関係を示し た。ＭＣＦ？誘導腫瘍は小さいままであり、ｃ　−ｅｒｂＢ　−２関連抗原を放 出しなかった。

ＭＤＡ４６８細胞系列は実質的な腫瘍増殖（＞２０００ｍｍ”　）を誘導し、実 質的量のＥＧＦｖを有していたがサンドイッチｒＲＭＡ検定で検出可能な抗原を 放出しなかった（第５表）。

表５：高および低ｃ　−ｅｒｂＢ　−２発現ヒト細胞系列により誘導される腫瘍 を有するヌードマウスに由来する血清中の放出抗原の定量 腫瘍化前　０　。

ＭＣＦ７　１　１９５　０ ＭＤＡ４６Ｂ　−１２４３６０ ＳＫＯＶ３　＋＋　１　５５３　１４．２９２０　１０．３ １６２５　２９．４ ２　１０３１　１０．２ ２０５２　１２．３ ３　５４０　６．８ ８９１　５．０ １２５０　１０．０ １２６０　？、７ ４　２６８１　１６．３ ４１２８　５１．９ ＭＤＡ３６１　＋＋　１　１９２４　２８．１３３９１　３４．４ ２　３３９１　？３．５ ４０００　１０４．８ ３　１２１１　１８．６ ８Ｂ２　２１．２ １１２０　２２．５ １２５２　１Ｂ、５ １５６０　２１．９ １６４０　２５．５ ４　４３２　７．４ ４００　？、８ １３０９　１２．２ この競争実験を使用しエフトドメイン反応性ＭＡｂであるＴＡｂ２５１の結合に ついてトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解物と競合するｇｐ７５抗原 を検出した。第１３図はヒトの乳腺細胞系列ＢＴ−４７４およびヒト卵巣細胞系 列５ＫＯＶ３などＣ−ｅｒｂＢ−２ｇｐ１８５を発現する細胞系列由来の溶解物 がＮ１）ｉ３Ｔ３を溶解物と同レベルにＮＩＨ３Ｔ３を溶解物への結合を競争し 得ることを示している。トランスフェクトされていないコントロール３Ｔ３細胞 は競争できなかった。同様に８２７５外部たんばく質でトランスフェクトしたＣ ＨＯ細胞の上清はＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３を溶解物への結合を争うことが示され（第１ ４図）、このことはＴＡｂ２５１がエフトドメインを認識し、かつこの結合だけ でＭＡｂのｇｐ１８５に対する結合と競争するのに十分であることを確証してい る。

ＮＩＨ３Ｔ３ｔ　）ランスフエクトした細胞によって誘導される大きな腫瘍を有 するマウス由来のヌードマウス血清は第１５図に示されているようにＮＩＨ３Ｔ ３　（ｃ−ｅｒｂＢ−２発現細胞）溶解物への結合を競争し得る。競争能は腫瘍 の大きさに相関しているが、この検定法ではｌ／１６０　（ｖ／ｖ）以下の血清 希釈物について非特異的妨害から区別できるシグナルを検出するのに十分な感度 は得られていない。

（実施例５） （ヒト腫瘍細胞培養上清における放出されたＣ　−ｅｒｂＢ　−２の検出） ヒト胸部腫瘍細胞系列をＴ１５０フラスコ中で培養し、１５μｌの無システィン および無メチオニン培地中４００ｍＣｆの３５Ｓ−システィンを用いてラベルし た（ダルベツコ修正イーグル培地、ＤＭＥ　Ｈ２１４，５ｇ＃グルコース含有） 。細胞は３７℃で一晩かけてラベルした。２４時間後、培地を回収し、プロテア ーゼインヒビター（ロイペプチンｌμｇ／μｌ、ベーリンガーマンハイム社、ア プロチニン２．１μｇ／μｌ、シグマ社；ペプスタチンＡ２．５μｇ／μｌ、ベ ーリンガーマンハイム社；およびＰＭＳＦｏ、１ｍＭ、シグマ社）を加えてから アミコンセントリブレツブ３０を用い４００μｌになるまで濃縮した。

免疫沈殿前、プロティンＡ−セファロースビーズの５０％スラリー１００μｌと ４℃で４時間インキュベーションすることにより非特異的プロティンＡ結合を取 り除いた。このビーズおよび非特異的結合物をマイクロフユージによる３０秒遠 心で除去し、その上清を新しいチューブに移した。それから抗体（約ｌＯμｌを 含む２０μ！りを加え、この混合物を振とう話中４℃で２４時間インキュベーシ ョンした。次の日、５０μｌのプロティンＡスラリーをこのサンプルに加え振と う話中４℃で４時間インキュベーションした。次にビーズをマイクロフユージの ３０秒遠心でペレット化し、氷冷ＲＩＰＡバッファ　（１００ｍＭ）リス−ＨＣ ｊ、ｐＨ１，５，１００ｍＭ　’ｔ４ａｃｌ、０．５％トリトンＸ−１００，０ ，５％デオキシコール酸塩、１０μｇ／μｌウシ血清アルブミン、０．２ｍＭ　 ＰＭＳＦ）で５回洗浄した。３回目と４回目の洗浄の間にチューブを交換した。

最後にベレフトを１％ベーターメルカプトエタノールを含むレムリサンプルバン ファ５０μｌに懸濁した。

このサンプルを７５℃で５分間加熱し、マイクロフユージの３０秒間遠心した後 ７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。

泳動は約１２０ｍＡ一時間で停止し、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノール溶 液で４５分〜１時間かけてゲルの固定を行った。蒸留水で素早（洗浄した後、そ のゲルを新鮮な蒸留水２５０μ！中に１時間浸した。このゲルに９０分間かけて ２５０μｌのエンハンス（デュポン社）を浸透させ、２％グリセリン溶液で平衡 化してから濾紙上で乾燥させた。この乾燥したゲルで一８０℃で３日間かけてコ ダックＸ−ＯＭＡＴ　ＡＲ−５Ｘ！！フィルムを感光させた。

（ヒト腫瘍細胞の培地上清中の可溶性Ｃ−ｅｒｂＢ　−２誘導体（ｇｐ７５）の 検出） 第５図は種々の抗体で濃縮沈殿化した５ＫＢＲ３細胞の組織培養上清のオートラ ジオダラムを示している。細胞外ドメインと反応するＣ　−ｅｒｂＢ　２抗体（ Ａ２９およびＴＡｂ２５２）で処理したこれらのサンプル中には明確な約７５ｋ ｄの単一バンドが存在した。一方、Ｃ−ｅｒｂＢ　−２Ｃ−末端ペプチドに対し て作製したウサギポリクローナル抗血清またはＥＧＦレセプターに対して特異的 なモノクローナル抗体（アマージャム社）のいずれかで処理した上清にはバンド は出現しなかった。さらに５ＫＢＲ３細胞由来の７５ｋｄのバンドの特異性はＣ −ｅｒｂＢ　２オンコジーンでトランスフェクトした３Ｔ３細胞由来の同一分子 量の分子種を沈殿化する同モノクローナル抗体、ＴＡｂ２５２の能力で示された （第６図）、また、ＭＤＡ４６８の上清由来の７５ｋｄバンドをＴＡｂ２５２が 沈殿させないことも第６図に示されている。その細胞系列は大量のＥＧＦレセプ ターを発現するが検出可能なレベルのＣ−ｅｒｂＢ　−２は発現しない、約１０ ５ｋｄのより大きな分子がこれらの細胞から抗ＥＧＦレセプターモノクローナル 抗体によって沈殿した。

沈殿化はＣ−ｅｒｂＢ　−２および検出可能なＥＧＦレセプターを発現しない上 滑でも行ったが（第６図）、７５ｋｄおよび１１０ｋｄのいずれにもバンドは検 出されなかった。

（実施例６） （ヒト血清中に放出された抗原の検出）連続的採血が可能な胸部がん患者の２０ 人のヒト血清をこの検定法で試験した。この検定で健康人の血清は１．６８％の バンクグランドレベルを示したが（第１０図）、３人の患者由来の血清（！Ａ者 ４．７および１９）は有意にバンクグランドレベル以上の放出抗原レベルを示し た（第１１図）、これらの血清のシグナルはｇ９７５標準物質と平行して希釈率 をあげるに従がい減少した（第１２図）、別に８８種の胸部がん血清もこの検定 法でテストし、そのうちの１３個の血清がバックグランドより有意に高い９．９ 〜１５１１ｎｇ／μＩｇｐ１５等価物のレベルでポジティブであることが示され た。サンドイッチｇｐ７５ＩＲＭＡで測定した放出抗原量とセントコア社から市 販されている診断検定法による値には相関関係はみられなかった（第６表）、セ ントコア検定法は数年間市販されてきているヒト胸部がん診断用のＦＤＡ認可の 検定法である。このセントコア検定法はムチンを測定するものでＩＲＭ＾ｇｐ７ ５検定でポジティブと判定された１３名の胸部がん血清の各々はこの方法でもポ ジティブであった。しかしＩ　ＲＭＡｇｐ７５検定は各患者でわずかに異なるｇ ｐ’ｒｓプロフィールを示すがムチンレベルのセントコア検定では各患者につい て差はでてこない０ｇｐ７５レベルの差は患者ごとの病状の差を示している。

（結論） ハイブリッド微生物、組換えＤＮＡ分子およびたんばく質／ポリペプチドおよび 本発明のこれらのものに適用し得る方法などは先に示した好ましい態様物で述べ たものに限定されないことを理解すべきである。ハイブリッド生物、組換えＤＮ Ａ分子およびたんばく質／ポリペプチドは生産の過程、またはその後に従来法に よってより利点の多いものに修正し得る。たとえばＣ−ｅｒｂＢ−２配列の転写 により存効なコントロール配列を使用する、望ましくない産物の合成を減少させ る変異も導入する、宿主内のプロテアーゼレベルを減少させる、Ｃ−ｅｒｂＢ　 −２配列を含む熱誘導可能なライソジェンを宿主染色体に組込む、あるいは細胞 中の配列コピー数を増加させるか、または目的とするたんばく質／ポリペプチド を生産する上で細胞の生産性を増加するその他の修正および操作を行ない得る。

これまで述べてきた事項に加えて本発明に種々の修正が可能なことはこれまでの 説明から当業者にとって明白であろう、このような修正は特許請求の範囲内にあ ると考える。

第６表、セントコア検定法と比較したＴＡｂ２５９／２５６サンドイ７チＩＲＭ Ａによるヒト胸部がん血清における放出抗原の定量 １　４３．７　１６４ ２　３８．４　＞２００ ３　７５．１　＜　２５ ４　３９、１　４３ ５　６０．１　＞２００ ６　３７．６　＞２００ ７　８１．９　３７ ８　１５１１．０　＞２００ ９　９．９　９８ １０　２７．８　４３ １　１　１０．０　＜２００ １２　１０４．６　１３９ １３　１９．８　７５ ”　５．１０ｎｇ／μｌ以下はネガティブ１　正常値は１３．９　＋　８ユニツ トと考えられている。

Ｃ−ｅｒｂＢ　−２外部ドメイン、ＧＰ７５概　要 Ｃ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーンを過剰発現する悪性腫瘍を同定するための方法 および組成物が提供される。悪性腫瘍の診断および予防に有用な方法で腫瘍を有 する哺乳動物の生物学的液体中のＣ−ｅｒｂＢ　−２の外部ドメイン、糖たんば （賞ｇｐ７５の検出およびｇｐ７５レベルの定量を行う方法が提供される。

さらにＣ−ｅｒｂＢ　−２オンコジーン（ｇｐ７５遺伝子）の外部ドメインＤＮ Ａ配列またはそのフラグメントによってコードされ、組換え的、合成的および他 の生物学的に生産される新しいたんぽく質およびポリペプチドが公開される。こ のようなｇｐ７５たんば（質は単独で、または化学療法試薬と組合せてがん治療 に用いられるワクチンとして有用である。また診断や治療に有用な１９７５たん ばく賞に対する抗体も公開される。さらに本発明の検定法を行うテストキットも 公開される。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、３ ａｔ　１ Ｆｉｇｕｒｅ　４ τＡｂ　２５２ ＮＩＨ３Ｔ３−ｃ−ｅｒｂＢ−２１ｙｓａｔｅ　＋　５３５１ａｂｅｌｅｄ　ｃ ｌ、４−３　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔＦｉｇｕｒｅ　５ ＲａｄｌｏｌｓＩＩＩｕｎｏｐｒｅｃｆｐｌｔａｔｌｏｎ　ｏｆ　ｇｐ７ｓ　ｆ ｒｏＩｌ’５ＫＢＲ３５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔＳＫＢＲ３１２１３Ｔ３　６Ｋ Ｆｉｇｕｒｅ　６ Ｒａｄｉｏ抽１ｎｏｐｒｅｃｆｐｉｔａｔ１ｏｎ　ｏｆ　５ｕｐｅｒｎａｔａｎ ｔｓ　Ｆｒｅｅ　Ｖａｒｉｏｕｓ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ浄書（内容に変更なし ） ０．０１　０．１０　１．００　！０．００　１００．００　１０Ｇ０．０Ｏ１ ００００，０Ｇ濃度　１　ｎｇ　／ｍｌ　） 腫瘍サイズ　ｉｍｍコ） 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、’） ０−１０００　１００１−３０００　＞３００１腫瘍容積（ｍｍＡ３） サンプル　＃ 浄Ｗ（内容に変更なし） 患者 浄書（内容に変更なし） Ｆ冒（３，１３ 競合溶解物（ｎｇ／ウェル） 上清希釈 φ　ａ：！　灸　ψ　リ　−−へ　＝　。

Ｃ５ＯＯＯＯ（ｉ　０　０　Ｃ’　０ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　平成２年特許願第５１３１６５ｍ（ＰＣＴ／ＵＳ　９０／　０ ４３４０ ２、発明の名称　Ｃ−ｅｒｂＢ　−２外部ドメイン：ＧＰ７５３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 ４、代理人 ５、補正命令の日付　自　発 国際調査報告 国際調査報告 ｌｌ、ｌＩ＠１１．Ａ、、ｌｌｌｌｔｍ−０ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０４３４０国 際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｃ−ｅｒｂＢ−２たんぱく質（ｇｐ７５）の外部ドメインまたは前記ｇｐ７ ５の１又はそれ以上の領域をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子であ って、前記ＤＮＡ配列が前記ＤＮＡ分子中の発現コントロール配列に機能的に結 合している組換えＤＮＡ分子。 ２．血清学的に活性な、すなわち抗原性および／または免疫原性を有する１又は それ以上の部分を含む前記ｇｐ７５の該１又はそれ以上の部分をコードする請求 の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子。 ３．請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した原核性または真核性の 単細胞宿主。 ４．真核性生物である請求の範囲３記載の単細胞宿主。 ５．前記組換えＤＮＡ分子が第１および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含 む組換えクローニングベヒクルであり、前記ＤＮＡ配列が該第１および第２の制 限部位の間に挿入されている請求の範囲３記載の単細胞宿主。 ６．大腸菌、シユードモナス、バチルス、イースト、他の菌類、および培養した 動物、昆虫および植物細胞からなる群から選ばれる請求の範囲３記載の単細胞宿 主。 ７．イーストおよび培養した哺乳類細胞からなる群から選ばれる請求の範囲４記 載の単細胞宿主。 ８．培養したモンキー細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞か らなる群から選ばれた哺乳類細胞である請求の範囲７記載の単細胞宿主。 ９．モンキー細胞が細胞系列ＣＯＳ７に由来し、またＣＨＯ細胞が細胞系列ＣＨ Ｏ−（ｄｘｂｌｌ）に由来する請求の範囲８記載の単細胞宿主。 １０．プラスミドｐＦＲＳＶ−Ｃ−ｅｒｂＢ−２ｓｅｃである請求の範囲１記載 の組換えＤＮＡ分子。 １１．ｇｐ７５のアミノ酸配列の少なくとも１部を有するたんぱく質またはポリ ペプチドの原核または真核性宿主細胞における発現を助ける目的で使用する精製 ・単離されたＤＮＡ分子で、前記ＤＮＡが以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれるＤ ＮＡ分子。 （ａ）ｇｐ７５またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子、（ｂ）（ａ） のＤＮＡ配列にハイプリダイズするＤＮＡ分子またはそのフラグメント、および （ｃ）遺伝子コードの縮退がなければ（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡに ハイプリダイズするＤＮＡ分子、１２．宿主が真核性生物である請求の範囲１１ 記載の精製単離されたＤＮＡ分子。 １３．組換えｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチド。 １４．グリコシル化された請求の範囲１３記載の組換えたんぱく質およびポリペ プチド。 １５．血清学的に活性な、すなわち免疫原性および、または抗原性を有する請求 の範囲１４記載の組換えｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチド。 １６．実質的に純粋なｇｐ７５たんぱく質およびその全てのポリペプチド部分。 １７．請求の範囲１４記載の組換えｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチドに対 するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体。 １８．請求の範囲１７記載の抗体を投与することによる哺乳動物の悪性腫瘍の治 療方法。 １９．以下の工程を含むｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドの産生 方法。 ａ）単細胞宿主を請求の範囲１記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換すること、 ｂ）該単細胞宿主を培養し、該ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチド を発現させること、及びｃ）該ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチド を抽出および単離すること。 ２０．哺乳動物の体液をｇｐ７５の存在について試験する方法であって、ｇｐ７ ５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体を含む組成物を哺乳動物 の体液サンプルに接触させ、該サンプル中のたんぱく質への該抗体の結合を測定 することを含む方法。 ２１．哺乳動物の体液が血清、精液、血漿、胸滲出物、尿唾液および脊髄液から なる群から選ばれるヒトの体液である請求の範囲２０記載の方法。 ２２．ヒトの体液が血清、血漿および精液からなる群から選ばれる請求の範囲２ １記載の方法。 ２３．ヒトの体液が血清または血漿である請求の範囲２２記載の方法。 ２４．ヒトの体液中のｇｐ７５を検出するために免疫検定法を用いるＣ−ｅｒｂ Ｂ−２増幅に関連する悪性疾患の診断方法。 ２５．悪性疾患が分泌機能を有する器官の腫瘍である請求の範囲２４記載の方法 。 ２６．悪性疾患が上皮起源の腫瘍である請求の範囲２４記載の方法。 ２７．悪性疾患が唾液腺、胸腺、胸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、胃腸、尿道お よび肝臓からなる群から選ばれる組織の腫瘍に関するものである請求の範囲２４ 記載の方法。 ２８．組織が胸部、卵巣および前立腺からなる群から選ばれる請求の範囲２７記 載の方法。 ２９．悪性疾患が胸部アデノカルシノーマおよび、または卵巣アデノカルシノー マである請求の範囲２４記載の方法。 ３０．１つの抗体はヒトのがん細胞系列上の本来のｇｐ７５外部ドメインに対す るものであり、かつ別の抗体はＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞系列上の本来のｇｐ７５外部 ドメインに対するものを用いるサンドイッチ検定法を使用することを含む請求の 範囲２０記載の方法。 ３１．アビジン／ビオチン法を用いて増巾し得ないか、もしくは増巾し得るサン ドイッチ検定法、イライザ検定法またはこれらと等価な検定法の使用を含む請求 の範囲２０記載の方法。 ３２．請求の範囲１７記載の抗体を使用する哺乳動物体液中のｇｐ７５の存在を 測定する方法。 ３３．ヒトの体液サンプル中の抗原がｇｐ７５を認識する抗体への結合に関して ラベル化したｇｐ７５たんぱく質またはそのポリペプチドと競合する請求の範囲 ２０記載の方法。 ３４．サンドイッチ法をｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対す る抗体を用いて行う請求の範囲３３記載の方法。 ３５．ヒトの体液中のｇｐ７５を検定するテストキットで、以下のａ）及びｂ） を含むキット。 ａ）ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドに対する抗体、および／ま たはＣ−ｅｒｂＢ−２を発現する細胞全体に対する抗体、および ｂ）検出手段 ３６．ヒトの体液中のｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドを検定す るテストキットで、以下のａ）及びｂ）を含むキット。 ａ）ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドおよび、またはｇｐ７５た んぱく質、および、またはポリペプチドに対する抗イディオタイプ抗体、および ｂ）検出手段 ３７．生理学的に許容可能で無毒のベヒクル中に分散した１つ以上の実質的に純 粋なｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドの免疫原的量、すなわちＣ −ｅｒｂＢ−２の増幅に関する悪性疾患に対してヒトを免疫化するのに有効な量 を含むワクチン。 ３８．生理学的に許容可能で無毒なベヒクル中に分散した表面にｇｐ７５を発現 する細胞膜の免疫原的量；すなわちＣ−ｅｒｂＢ−２の増巾に関する悪性疾患に 対してヒトを免疫化するのに有効な量を含むワクチン。 ３９．細胞膜がＣ−ｅｒｂＢ−２を過剰生産するようトランスホームした細胞ま たはヒトのがん細胞系列に由来する請求の範囲３８記載のワクチン。 ４０．細胞膜が内部ドメインを切除した形のＣ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現するよ うトランスホームした組換え宿主に由来する請求の範囲３９記載のワクチン。 ４１．ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドとそれに結合するヒトに は免疫原性を示さずかつヒト体液中の抗体とは一般に反応しないたんぱく質また はポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合たんぱく質またはポリペプチド。 ４２．ｇｐ７５をコードするＤＮＡ配列を含む精製、単離したＤＮＡ分子。 ４３．合成により調製したｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチド。 ４４．悪性疾患のスクリーニング悪性疾患の診断、悪性疾患患者の病状のモニタ ーあるいは悪性疾患の経過の予知を行なう方法で、ｇｐ７５たんぱく質および、 またはポリペプチド、ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する 抗体、およびこれらの検出レベルに相関するＣ−ｅｒｂＢ−２に対するリガンド のレベルの検定および定量、および長期生存の可能性または再発の時期に関する 患者の分類を含む方法。 ４５．ｇｐ７５たんぱく質／ポリペプチド、それらに対する抗体および、または ヒト体液におけるＣ−ｅｒｂＢ−２に対するリガンドの存在を転移の指標とする 腫瘍切除手術後に行なう請求の範囲４４記載の方法。 ４６．生理学的に許容可能で無毒なベヒクル中に分散した治療効果量のｇｐ７５ たんぱく質および、またはポリペプチドの投与を含むＣ−ｅｒｂＢ−２の増幅に 関連する悪性疾患の治療方法。 ４７．請求の範囲４６記載の方法で、さらにｇｐ７５たんぱく質および、または ポリペプチドの投与と合せて治療効果量の化学療法試薬の投与を含む方法。 ４８．化学療法試薬がアルキル化試薬である請求の範囲４７記載の方法。 ４９．化学療法試薬がシスプラチン、カルボプラチン、およびメファランからな る群から選ばれる請求の範囲４７記載の方法。 ５０．生理学的に許容可能で無毒のベヒクル中に分散したｇｐ７５たんぱく質お よび、またはポリペプチドに対するモノクローナル抗体に対する治療効果量の抗 イディオタイプ抗体の投与を含むＣ−ｅｒｂＢ−２の増幅に関する悪性疾患の治 療方法。 ５１．ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドをｇｐ７５たんはく質お よび、またはポリペプチドに対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイ プ抗体で置き換える請求の範囲３３記載の方法。 ５２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で約７５キロダルトンの分子量を有するＣ− ｅｒｂＢ−２たんぱく質のエクトドメインである実質的に純粋な糖たんぱく質ま たはその一部分。 ５３．組換えＤＮＡ分子法で生産される請求の範囲５２記載の糖たんぱく質。 ５４．請求の範囲５２記載の糖たんぱく質で、さらにグリコシル化され、かつＳ ＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で約９０キロダルトンの分子量を有する糖たんぱく質 。 ５５．ヒトの体液中約７５キロダルトンの分子量を有するＣ−ｅｒｂＢ−２外部 ドメイン糖たんぱく質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の存在を検出する診断方法で 、以下のａ）及びｂ）を含む方法。 ａ）該体液を該糖たんぱく質に特異性を有する抗体と接触させること、および ｂ）該抗体に結合した糖たんぱく質の量を検出すること、ここで、正常細胞の結 合レベルを越えた結合レベルの増加はＣ−ｅｒｂＢ−２外部ドメインを過剰発現 する腫瘍細胞の存在を示すものである。 ５６．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲５５記載の方法。 ５７．診断法がサンドイッチ検定法、競争検定法、粒子検定法、放射能測定検定 法、酵素結合免疫吸着検定法、放射能免疫沈殿検定法または蛍光検定法の様式を とる請求の範囲５５記載の方法。 ５８．体液が血清、血漿、精液、胸部滲出液、唾液、尿または脊髄液である請求 の範囲５５記載の方法。 ５９．がん細胞を有する疑いのあるヒト宿主の治療方法で、約７５キロダルトン のＣ−ｅｒｂＢ−２エクトドメイン糖たんぱく質に対する治療効果量の抗体を投 与することを含む方法。 ６０．ｇｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体に対する抗 イディオタイプ抗体。 ６１．ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドを用いたヒト体液中のＣ −ｅｒｂＢ−２に対するリガンドの検出ならびに定量方法。 ６２．ｇｐ７５たんぱく質および／またはポリペプチドを用いたヒト体液中のｇ ｐ７５たんぱく質および、またはポリペプチドに対する抗体の検出ならびに定量 方法。 ６３．ｇｐ７５たんぱく質およびポリペプチドを用いたＣ−ｅｒｂＢ−２に対す るリガンドの精製方法。 ６４．Ｃ−ｅｒｂＢ−２発現細胞の表面上にある完全ｇｐ７５に対する抗体とは 交叉反応しない請求の範囲１７記載の抗体。