CN104271761B - 癌症中的erbb3突变 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症中的体细胞ErbB3突变，包括ErbB3癌症的鉴定，诊断和预后方法，以及癌症的治疗方法，包括某些亚群的患者。

Description

癌症中的ERBB3突变
相关申请
本申请要求2011年11月30日提交的流水号61/629,951的美国临时申请依据35U.S.C.§119(e)的优先权和权益，通过述及将其完整收入本文。
发明领域
本发明涉及癌症中的体细胞ErbB3突变，包括ErbB3癌症的鉴定，诊断和预后方法，以及癌症的治疗方法，包括某些亚群的患者。
发明背景
受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族(也称作ERBB受体)由四个成员组成：EGFR/ERBB1/HER1，ERBB2/HER2，ERBB3/HER3和ERBB4/HER4(Hynes etal.Nature Reviews Cancer 5,341-354(2005)；Baselga et al.Nature Reviews Cancer9,463-475(2009))。ERBB家族成员含有胞外域(ECD)，单次跨越跨膜区，胞内酪氨酸激酶域和C端信号传导尾(Burgess et al.Mol Cell 12,541-552(2003)；Ferguson.AnnualReview of Biophysics 37,353-373(2008))。ECD是一种四结构域结构，由两个L结构域(I和III)和两个富含半胱氨酸结构域(II和IV)组成(Burgess et al.Mol Cell 12,541-552(2003)；Ferguson.Annual Review of Biophysics 37,353-373(2008))。ERBB受体受多种配体活化，包括表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGF-α)和神经调节蛋白(Yarden etal.Nat Rev Mol Cell Biol 2,127-137(2001))。所述受体的活化涉及一个配体分子同时结合结构域I和III，导致经由结构域II中二聚化臂发生的异二聚化或同二聚化(Burgesset al.Mol Cell 12,541-552(2003)；Ogiso et al.Cell 110,775-787(2002)；Cho.Science 297,1330-1333(2002)；Dawson et al.Molecular and Cellular Biology25,7734-7742(2005)；Alvarado et al.Cell 142,568-579(2010)；Lemmon et al.Cell141,1117-1134(2010))。在配体缺失下，结构域II二聚化臂经由结构域IV的分子内相互作用而隐藏起来，导致“系留的”，自我抑制构型(Burgess et al.Mol Cell 12,541-552(2003)；Cho.Science 297,1330-1333(2002)；Lemmon et al.Cell 141,1117-1134(2010)；Ferguson et al.Mol Cell 11,507-517(2003))。
虽然四种ERBB受体共享相似的结构域组织，但是功能和结构研究显示ERBB2不结合任何已知的ERBB家族配体且组成性处于适合于二聚化的“未系留的”(开放的)构象(Garrett et al.Mol Cell 11,495-505(2003))。相反，ERBB3，虽然能够进行配体结合，异二聚化和信号传导，但是具有受损的激酶结构域(Baselga et al.Nature Reviews Cancer9,463-475(2009)；Jura et al.Proceedings of the National Academy of Sciences106,21608-21613(2009)；Shi et al.Proceedings of the National Academy ofSciences 107,7692-7697(2010))。虽然ERBB2和ERBB3自身在功能上不完全，但是它们的异二聚体是细胞信号传导的有力活化物(Pinkas-Kramarski et al.The EMBO Journal 15,2452-2467(1996)；Tzahar et al.Molecular and Cellular Biology 16,5276-5287(1996)；Holbro et al.Proceedings of the National Academy of Sciences 100,8933-8938(2003))。
在ERBB受体是正常生长和发育的关键调节物的同时，还已经将它们的脱调节与癌症的发生和进展联系起来(Baselga et al.Nature Reviews Cancer 9,463-475(2009)；Sithanandam et al.Cancer Gene Ther 15,413-448(2008)；Hynes et al.CurrentOpinion in Cell Biology 21,177-184(2009))。特别地，已知在多种癌症中在ERBB2和EGFR中发生导致受体过表达的基因扩增和激活性体细胞突变(Sithanandam et al.CancerGene Ther 15,413-448(2008)；Hynes et al.Current Opinion in Cell Biology 21,177-184(2009)；Wang et al.Cancer Cell10,25-38(2006)；Yamauchi et al.Biomark Med3,139-151(2009))。这导致了多种基于小分子和抗体、靶向EGFR和ERBB2的治疗剂的开发(Baselga et al.Nature Reviews Cancer 9,463-475(2009)；Alvarez et al.Journal ofClinical Oncology 28,3366-3379(2010))。虽然尚未完全确立ERBB4在癌发生中的精确作用(Koutras et al.Critical Reviews in Oncology/Hematology 74,73-78(2010))，但是已经报告了在黑素瘤中ERBB4中的转化性体细胞突变(Prickett et al.Nature Genetics41,1127-1132(2009))。最近，鉴于ERBB3在ERBB2信号传导中发挥重要作用且还涉及促进对现有治疗剂的抗性，它已经成为潜在癌症治疗靶(Baselga et al.Nature Reviews Cancer9,463-475(2009)；Amin et al.Semin Cell Dev Biol 21,944-950(2010))。虽然知道一些癌症中的ERBB3扩增和/或过表达，但是只报告了ERBB3体细胞突变的零星发生，尽管尚未研究这些突变的功能意义。本文中提供的发明涉及人类癌症中频繁ERBB3体细胞突变的鉴定。
发明概述
本发明至少部分基于受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族的ERBB3受体中与各种人肿瘤(包括但不限于胃和结肠肿瘤)有关的体细胞突变事件的发现。认为这些突变倾向于和/或直接促成人肿瘤发生。确实，如本文中描述的，有证据表明一些突变在体内促进癌发生。
一方面，本发明提供ErbB3癌症检测剂。在一个实施方案中，该ErbB3癌症检测剂为ErbB3胃肠癌检测剂。在另一个实施方案中，该检测剂包含能够特异性结合ErbB3核酸序列中的ErbB3突变的试剂。在一个其它实施方案中，该ErbB3核酸序列包含SEQ ID NO:230或1。
在一些实施方案中，该试剂包含下式的多核苷酸
5’Xa-Y-Zb 3’ 式I，
其中
X为任何核酸且a介于约0和约250之间；
Y为ErbB3突变密码子；且
Z为任何核酸且b介于约0和约250之间。
在一个其它实施方案中，该突变密码子编码(i)SEQ ID NO:2中选自104，809，232，262，284，325，846，928，60，111，135，295，406，453，498，1089和1164的位置处的氨基酸；或(ii)位置193处的终止密码子。在一个其它实施方案中，该胃肠癌为胃癌或结肠癌。
另一方面，本发明提供测定受试者中ErbB3胃肠癌存在情况的方法。在一个实施方案中，该方法包括在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中该突变导致ErbB3氨基酸序列的至少一个位置处的氨基酸变化且其中该突变指示该受试者中的ErbB3胃肠癌。在另一个实施方案中，该导致氨基酸变化的突变位于SEQ ID NO:2中选自104，809，232，262，284，325，846，928，60，111，135，295，406，453，498，1089，1164和193的位置。在其它实施方案中，该胃肠癌为胃癌或结肠癌。
另一方面，本发明提供测定受试者中ErbB3癌症存在情况的方法。在一个实施方案中，该方法包括在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中氨基酸突变的存在或缺失，其中该突变导致SEQ ID NO:2中选自104，809，232，262，284，325，846，928，60，111，135，295，406，453，498，1089，1164，193，492和714的至少一个位置处的氨基酸变化，且其中存在该突变指示该受试者中的ErbB3癌症。在另一个实施方案中，该ErbB3癌症选自下组：胃，结肠，食道，直肠，盲肠，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)，肾癌，黑素瘤，卵巢，肺大细胞，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)，肺和胰腺。
在还有另一方面，该测定方法进一步包括下述额外步骤之一：对所述受试者施用治疗剂，鉴定有需要的受试者，自有需要的受试者获得样品，或其任何组合。在一个实施方案中，该治疗剂为ErbB抑制剂。在其它实施方案中，该ErbB抑制剂选自下组：EGFR拮抗剂，ErbB2拮抗剂，ErbB3拮抗剂，ErbB4拮抗剂和EGFR/ErbB3拮抗剂。在另一个实施方案中，该抑制剂为小分子抑制剂。在一个实施方案中，该拮抗剂为拮抗性抗体。在还有另一个实施方案中，该抗体选自下组：单克隆抗体，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，人源化抗体和抗体片段。
另一方面，该检测步骤包括扩增或测序。在一个实施方案中，该检测包括突变的扩增或测序及突变或其序列的检测。在另一个实施方案中，该扩增包括将扩增引物或扩增引物对与自该样品分离的核酸模板混合。在其它实施方案中，该引物或引物对与接近或包括所述突变的区域互补或部分互补，且能够在该核酸模板上启动由聚合酶进行的核酸聚合。在一个其它实施方案中，该扩增进一步包括在包含聚合酶和该模板核酸的DNA聚合反应中延伸引物以生成扩增子。在另一个实施方案中，在该扩增或测序中，通过包括下述一项或多项的过程来检测该突变：对自该生物学样品分离的基因组DNA中的该突变的测序，该突变或其扩增子对阵列的杂交，限制酶对该突变或其扩增子的消化，或该突变的实时PCR扩增。在还有另一个实施方案中，该扩增或测序进一步包括自该生物学样品分离的核酸中该突变的部分或完全测序。在其它实施方案中，该扩增包括实施聚合酶链式反应(PCR)，逆转录酶PCR(RT-PCR)，或连接酶链式反应(LCR)，在该PCR，RT-PCR，或LCR中使用自该生物学样品分离的核酸作为模板。
在一个其它方面，本发明提供在有需要的受试者中治疗胃肠癌的方法。在一个实施方案中，该方法包括a)在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中该突变导致ErbB3氨基酸序列中至少一个位置处的氨基酸变化且其中该突变指示该受试者中的ErbB3胃肠癌。在另一个实施方案中，该方法进一步包括b)对所述受试者施用治疗剂。在其它实施方案中，该导致氨基酸变化的突变位于SEQ ID NO:2中选自104，809，232，262，284，325，846，928，60，111，135，295，406，453，498，1089，1164和193的位置。在另一个实施方案中，该胃肠癌为胃癌或结肠癌。
一方面，本发明提供在受试者中治疗ErbB3癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括a)在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中氨基酸突变的存在或缺失，其中该突变导致SEQ ID NO:2中选自104，809，232，262，284，325，846，928，60，111，135，295，406，453，498，1089，1164，193，492和714的至少一个位置处的氨基酸变化，且其中所述突变的存在指示该受试者中的ErbB3癌症。在另一个实施方案中，该方法进一步包括b)对所述受试者施用治疗剂。在一些实施方案中，该ErbB3癌症选自下组的癌症：胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌，结直肠癌，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)癌，肾癌，黑素瘤，卵巢癌，肺大细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)癌，肺癌和胰腺癌。
另一方面，该治疗方法涉及ErbB3抑制剂。在一个别的实施方案中，该治疗剂为ErbB抑制剂。在另一个实施方案中，该ErbB抑制剂选自下组：EGFR拮抗剂，ErbB2拮抗剂，ErbB3拮抗剂，ErbB4拮抗剂和EGFR/ErbB3拮抗剂。在还有另一个实施方案中，该拮抗剂为小分子抑制剂。在一个实施方案中，该拮抗剂为拮抗性抗体。在其它实施方案中，该抗体选自下组：单克隆抗体，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，人源化抗体和抗体片段。
别的实施方案
一方面，本发明提供在受试者中测定ErbB3癌症存在情况的方法。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤，在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中氨基酸突变的存在或缺失，其中该突变导致选自M60，R193，A232，P262，V295，G325，M406，D492，V714，Q809，R1089，T1164的至少一个位置处的氨基酸变化。在另一个实施方案中，该方法进一步包括对该受试者施用治疗剂。在一个其它实施方案中，该方法进一步包括鉴定该有需要的受试者。在还有另一个实施方案中，该方法进一步包括自有需要的受试者获得该样品。在一个实施方案中，该ErbB3癌症选自下组的癌症：胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)，肾癌，黑素瘤，卵巢癌，肺大细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)癌，肺癌和胰腺癌。
另一方面，本发明提供在有需要的受试者中测定ErbB3胃肠癌存在情况的方法，包括在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中该突变导致选自V104，Y111，A232，P262，G284，T389和Q809的至少一个位置处的氨基酸变化。在另一个实施方案中，该方法进一步包括对该受试者施用治疗剂。在一个其它实施方案中，该方法进一步包括鉴定该有需要的受试者。在还有另一个实施方案中，该方法进一步包括自有需要的受试者获得该样品。在一个其它实施方案中，该ErbB3胃肠癌为胃癌或结肠癌。
在一个其它方面，本发明提供在有可能响应ErbB拮抗剂的有需要的受试者中鉴定ErbB3胃肠癌的方法，所述方法包括在自该受试者获得的胃肠癌中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中该突变位于至少一个选自V104，Y111，A232，P262，G284，T389和Q809的位置。在另一个实施方案中，该方法进一步包括对该受试者施用治疗剂。在一个其它实施方案中，该方法进一步包括自有需要的受试者获得该样品。在一个其它实施方案中，该ErbB3胃肠癌为胃癌或结肠癌。
另一方面，本发明提供在有需要的受试者中治疗ErbB3癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤，在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中氨基酸突变的存在或缺失，其中该突变导致至少一个选自M60，R193，A232，P262，V295，G325，M406，D492，V714，Q809，R1089，T1164的位置处的氨基酸变化。在另一个实施方案中，该方法进一步包括对所述受试者施用治疗剂。
另一方面，本发明提供在有需要的受试者中治疗ErbB3胃肠癌的方法。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤，在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中该突变导致至少一个选自V104，Y111，A232，P262，G284，T389和Q809的位置处的氨基酸变化。在另一个实施方案中，该方法进一步包括对所述受试者施用治疗剂的步骤。
在一个实施方案中，在本发明方法中施用的治疗剂为ErbB抑制剂。在另一个实施方案中，该ErbB抑制剂选自下组：EGFR拮抗剂，ErbB2拮抗剂，ErbB3拮抗剂，ErbB4拮抗剂和EGFR/ErbB3拮抗剂。在一个其它实施方案中，该抑制剂为小分子抑制剂。在一些实施方案中，该ErbB抑制剂为EGFR拮抗剂。在其它实施方案中，该ErbB抑制剂为ErbB2拮抗剂。在一个其它实施方案中，该ErbB抑制剂为ErbB3拮抗剂。在另一个实施方案中，该ErbB抑制剂为ErbB4拮抗剂。在一些实施方案中，该ErbB抑制剂为EGFR/ErbB3拮抗剂。在其它实施方案中，该拮抗剂为拮抗性抗体。在一些实施方案中，该抗体选自下组：单克隆抗体，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，人源化抗体和抗体片段。
另一方面，本发明的方法包括检测步骤，其中对自该样品获得的核酸序列分析该突变的存在或缺失。在一个实施方案中，该检测包括该突变的扩增或测序及该突变或其序列的检测。在另一个实施方案中，该扩增包括将扩增引物或扩增引物对与自该样品分离的核酸模板混合。在一个其它实施方案中，该引物或引物对与接近或包括所述突变的区域互补或部分互补，且能够在该核酸模板上启动由聚合酶进行的核酸聚合。在还有另一个实施方案中，该方法进一步包括在包含聚合酶和该模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以生成扩增子。在一些实施方案中，通过包括下述一项或多项的过程来检测该突变：对自该生物学样品分离的基因组DNA中的该突变的测序，该突变或其扩增子对阵列的杂交，限制酶对该突变或其扩增子的消化，或该突变的实时PCR扩增。在其它实施方案中，该方法包括自该生物学样品分离的核酸中该突变的部分或完全测序。在一个实施方案中，该扩增包括实施聚合酶链式反应(PCR)，逆转录酶PCR(RT-PCR)，或连接酶链式反应(LCR)，在该PCR，RT-PCR，或LCR中使用自该生物学样品分离的核酸作为模板。
附图简述
本专利的文件包含至少一幅彩色绘制的图。专利和商标局会在请求和支付必要费用后提供此专利带彩色图的拷贝。
图1。样品。提供人癌症中ERBB3的研究中使用的人组织样品的列表。
图2。代表性野生型ERBB3核酸序列(登录号NM_001982)(SEQ ID NO：1)。
图3。代表性野生型ERBB3氨基酸序列(登录号NP_001973)(SEQ ID NO：2)。
图4(a-f)。ERBB3体细胞突变。(a-b)显示源自ERBB3体细胞突变的蛋白质改变在ERBB3蛋白质结构域上的定位。在淡红色背景中以重复氨基酸变化描绘热点突变。突变残基周围的背景竖线的高度与该特定位置的突变频率成比例。(c-d)在ERBB3蛋白质结构域上描绘的ERBB3非同义体细胞突变(倒三角形；红色三角形描绘热点)。顶部的柱形图代表在这项研究和其它已发表研究中的样品中观察到的，在检测的每个位置处突变的计数(红色柱指示热点突变，而蓝色柱代表别的测试了活性的非热点突变体)。(e-f)图4(a-b)的扩充和补充视图。图4(a-f)提供ErbB3的线性视图，图4a，c和e显示N端一半，而图4b，d和f显示C端一半。
图5。ERBB3突变体结肠样品中ERBB3突变体的表达(A，B)和ERBB2的表达(B)，如使用RNA-seq data_ENREF_26(Seshagiri,S.et al.Comprehensive analysis of coloncancer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin fusions.(Mansuscript in Preparation 2011))评估的。
图6。多重序列比对ERBB3直向同系物，描绘突变位点间的保守性。使用Clustal W(ENREF_52)(Larkin,M.A.et al.Bioinformatics(Oxford,England)23,2947-2948(2007))比对人(H.sapiens)(NP_001973.2(以SEQ ID NO：126公开全长序列，以出现次序分别以SEQID NO：132-151公开各个区域))，黑猩猩(P.troglodytes)(XP_509131.2(以SEQ ID NO：130公开全长序列，以出现次序分别以SEQ ID NO：212-229公开各个区域))，灰狼(C.lupus)(XP_538226.2(SEQ ID NO：131))，牛(B.taurus)(NP_001096575.1(以SEQ ID NO：129公开全长序列，以出现次序分别以SEQ ID NO：192-211公开各个区域))，小家鼠(M.musculus)(NP_034283.1(以SEQ ID NO：127公开全长序列，以出现次序分别以SEQ ID NO：152-171公开各个区域))和褐家鼠(R.norvegicus)(NP_058914.2(以SEQ ID NO：128公开全长序列，以出现次序分别以SEQ ID NO：172-191公开各个区域))。在红色椭圆形背景中显示突变残基。
图7。频繁的(或热点)体细胞ECD突变以红色显示，定位到(A)“系留的”ERBB3ECD的晶体结构[pdb 1M6B](B)上，或(B)“未系留的”ERBB3/ERBB2ECD异二聚体的模型上，基于EGFR ECD二聚体(pdb 1IVO)，使用ERBB3[pdb 1M6B]和ERBB2[pdb 1N8Z]。ERBB3配体以灰色表面显示，基于EGF[pdb 1IVO](C)。ERBB3激酶域体细胞突变以红色显示，定位到ERBB3激酶域的结构[pdb 3LMG]上。*＝终止密码子。
图8。定位到ERBB3的ECD晶体结构(pdb 1M6B)(以结构域着色)上的ERBB3体细胞突变。
图9。在3D培养中ERBB3突变体支持MCF10A细胞不依赖EGF的增殖。单独地或与EGFR或ERBB2任一一起地稳定表达ERBB3突变体的MCF10A细胞显示不依赖EGF的增殖。在血清，EGF和NRG1缺失实施涉及MCF10A的研究。EV–空载体。
图10。ERBB3突变体促进不依赖EGF和血清、不依赖锚定的生长。显示了描绘由单独地或与EGFR或ERBB2组合地表达ERBB3的MCF10A形成的集落的代表性图像(a)。对于ERBB3突变体与EGFR(b)或ERBB2(c)的组合显示了来自(a)中描述的测定法的集落的定量。
图11。单独地(A)或与EGFR(B)或ERBB2(C)任一一起地稳定表达ERBB3突变体的MCF10A细胞显示升高的下游信号传导，如通过Western印迹评估的。在血清，EGF和NRG1缺失下实施涉及MCF10A的研究。EV--载体。
图12。在3D培养中ERBB3突变体支持MCF10A细胞不依赖EGF的增殖。与表达MCF10A细胞的ERBB3/ERBB2相比，单独地或与EGFR或ERBB2任一一起地稳定表达ERBB3突变体的MCF10A细胞显示大腺泡体系结构(large acinar architecture)，增强的Ki67染色和升高的迁移指数。数据代表三项独立实验的均值±SEM。在血清，EGF和NRG1缺失下实施涉及MCF10A的研究。EV--空载体。
图13A(a-b)显示表达所示ERBB3突变体连同ERBB2的MCF10A细胞在迁移测定法中自透孔迁移之后的代表性图像(a)，及这种迁移效应的的定量(b)。
图13B(a-e)显示ERBB3突变体支持IMCE结肠上皮细胞不依赖锚定的生长。与表达ERBB3-WT/ERBB2的IMCE细胞相比，表达ERBB3自身或与ERBB2组合的IMCE结肠上皮细胞显示不依赖锚定的生长(a)，升高的集落数目(b)，升高的磷酸信号传导(c，d)和体内生长(e)。EV--空载体。
图14。ERBB3突变体转化且促进BaF3细胞不依赖IL3的存活。单独地或与EGFR或ERBB2任一一起地稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞促进不依赖IL3的存活。在IL-3和NRG1缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图15A-C。ERBB3突变体转化BaF3细胞并促进BaF3细胞不依赖IL3的存活。单独地(A)或与EGFR(B)或ERBB2(C)任一一起地稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞促进ERBB3及其下游效应器磷酸化的升高。在IL-3和NRG1缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图16。单独地或与EGFR或ERBB2任一组合地稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞不依赖锚定的生长的代表性图像。在IL-3和NRG1缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图17。抗NRG1(一种NRG1中和性抗体)不影响BaF3细胞由与ERBB2共表达的ERBB3突变体促进的不依赖IL-3的存活。在IL-3和NRG1缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图18。在NRG1缺失下BaF3细胞中升高的ERBB3突变体/ERBB2异二聚体水平，如在使用BS3交联细胞表面蛋白之后衍生的免疫沉淀的材料中观察到的。在IL-3和NRG1缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图19。在NRG1缺失下BaF3细胞中升高的ERBB3突变体/ERBB2异二聚体水平，如在细胞表面上观察到的，使用邻近连接测定法40检测。在IL-3和NRG1缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图20A-C。ERBB3-ERBB2异二聚体的定量。使用Duolink图像软件工具(Uppsala，Sweden)分析来自邻近连接测定法的图像(图17)。对表达所示ERBB3和ERBB2组合的细胞来自5至6个图像视野的至少100个细胞分析源自ERBB2/ERBB3二聚体的信号(红色点)。用FLAG(ERBB3)和gD(ERBB2)抗体(A)或天然ERBB3和ERBB3抗体(B)实施测定法。以均值±SEM显示数据。图20C显示NRG1不能够支持单独表达ERBB3-WT或突变体的BaF3细胞的存活。
图21。ERBB3ECD突变体响应不同剂量的外源配体NRG1显示升高的不依赖IL-3的BaF3存活。在IL-3缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图22。ERBB3突变体促进癌发生且导致总体存活降低。植入有表达所示ERBB3突变体/ERBB2组合的BaF3细胞的小鼠分组的Kaplan-Meier存活曲线显示与对照BaF3(载体)细胞相比降低的总体存活(分支的n＝10；时序检验p<0.0001)。
图23。自接受表达各种ERBB3突变体/ERBB2-WT的带GFP标签的BaF3细胞的小鼠分离的总骨髓细胞(A)和脾细胞(B)的流式细胞术分析。
图24。显示了所示研究分支中小鼠(n＝3)的骨髓(A)和脾(B)中GFP阳性细胞的均值数目。
图25。描绘了所示研究分支中来自小鼠(n＝3)的脾(A)和肝(B)的均值重量。
图26。代表性的来自图21中分析的相同小鼠的骨髓(顶部)，脾(中部)和肝(底部)H&E染色切片。来自空载体动物的骨髓由正常造血细胞组成。*＝浸润性肿瘤细胞，R＝红髓，W＝白髓的淋巴样滤泡。在未标记的脾切片中，有浸润性肿瘤细胞破坏所致红/白髓体系结构的损失。刻度条对应于100μm。
图27。显示了来自移植有表达ERBB3突变体的BaF3细胞的小鼠的脾和肝的代表性图像。
图28。抗ERBB抗体和小分子抑制剂对ERBB3突变体的致癌活性的功效。图中显示靶向治疗剂对与ERBB2一起稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞不依赖IL-3的增殖的影响。
图29。靶向治疗对与ERBB2一起稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞不依赖锚定的生长的影响的代表性图像，如该图所示。
图30。描绘此研究中测试的各种靶向剂和ERBB受体的示意图。
图31。在体内抗ERBB3抗体有效靶向ERBB3突变体。10mg/kg QW曲妥单抗(Tmab)，50mg/kg QW抗ERBB3.1和100mg/kg QW抗ERBB3.2抗体在阻断由与ERBB2组合表达ERBB3突变体G284R(A)或Q809R(B)的BaF3细胞诱导的白血病样疾病方面的功效。对照抗体处理组(对照Ab)接受40mg/kg QW抗豚草抗体。
图32。靶向治疗剂对图中所示与ERBB2一起稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞的影响。用于治疗的抗体和小分子抑制剂的浓度与图27中所示相同。
图33。显示处理后8h BaF3中ERBB抗体和小分子抑制剂对ERBB3和下游信号传导分子磷酸化的影响。图30中显示这些相同药剂在24h时的影响。
图34。用图中所示抗体处理后骨髓(BM)和脾中表达突变体ERBB3，G284R(A)和Q809R(B)的浸润性BaF3细胞的比例。
图35。用所示抗体处理后来自植入有ERBB3突变体细胞，G284R(A)和Q809R(B)的动物的肝和脾重量。
图36。显示自移植有下述这些细胞的小鼠的脾和骨髓分离的表达ERBB3突变体的浸润性GFP阳性BaF3细胞。
图37A-H。ERBB3突变体转化且促进BaF3细胞不依赖IL3的存活。(A)单独地或与ERBB2或ERBB2-KD一起地稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞不依赖IL3的存活。(B)单独地或与ERBB2或ERBB2-KD任一组合地稳定表达ERBB3突变体的BaF3细胞不依赖锚定的生长的代表性图像。(C)显示由(B)中显示的表达ERBB3突变体连同ERBB2的BaF3细胞形成的集落的数目的柱图。单独地或与ERBB2-KD组合地表达ERBB3突变体的细胞形成非常少的集落。(D-F)显示单独地(D)或与ERBB2(E)或ERBB2-KD(F)组合地表达ERBB3突变体的BaF3细胞的pERBB3，pERBB2，pAKT和pERK状态的Western印迹。(G)抗NRG1(一种NRG1中和性抗体)不影响由与ERBB2共表达的ERBB3突变体所促进的BaF3细胞不依赖IL-3的存活。(H)ERBB3ECD突变体显示响应剂量渐增的外源NRG1升高的不依赖IL-3的BaF3存活。在IL-3(A-H)和NRG1(A-F)缺失下实施BaF3研究。EV＝空载体；M＝单体；D＝二聚体。
图38A-J。shRNA介导的ERBB3敲低延迟肿瘤生长。(A-J)稳定表达可诱导型ERBB3打靶shRNA的CW-2和DV-90在dox诱导后显示与未诱导细胞(A-F)或表达萤光素酶打靶shRNA的细胞(A-F，G，I)相比更低水平的ERBB3和pERK(A，B)，不依赖锚定的生长(C-F)和降低的体内生长(H，J)。(E，F)中的数据代表形成的不依赖锚定的集落的数目，自像(C，D)中显示的图像的多个视野定量。以均值±SEM显示数据。
图39提供ErbB3的核酸序列(SEQ ID NO：230)和氨基酸序列(SEQ ID NO：231)。以加框的氨基酸和加框/下划线的密码子指示本发明的突变。
发明详述
除非另有说明，本发明的实施会采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、和生物化学的常规技术，这些在本领域的技术范围内。文献中充分解释了此类技术，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd edition(Sambrook et al.,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”,4th edition(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds.,Blackwell Science Inc.,1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis etal.,eds.,1994)。
定义
除非另有定义，本文中所使用的所有技术术语，符号及其它科学术语意图具有本发明所属领域中技术人员通常所理解的含意。在有些情况中，为了清楚和/或便于提及，本文对具有通常所理解含意的术语给出了定义，而且本文中这些定义的内含不应必然解释为代表了与本领域通常所理解含意的实质差异。本文中所描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y中记载的广泛使用的分子克隆方法。适当时，涉及使用商品化试剂盒和试剂的规程一般依照制造商规定的方案和/或参数进行，除非另有记载。在描述所述方法、试剂盒及其用途前，应理解本发明不限于特定的方法学、方案、细胞系、动物种或属、构建体，且如此描述的试剂当然可以变化。还应理解本文中使用的术语学仅用于描述具体实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，这将仅由所附权利要求限制。
必须注意的是，如本文中和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地指示。
贯穿本说明书和权利要求书中，词“包含/包括”或其变体将理解为暗示纳入所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记成分偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文中使用的，“寡核苷酸”指短的单链多核苷酸，长度为至少约7个核苷酸且长度少于约250个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
术语“引物”指能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离3’-OH基团)的单链多核苷酸。
如本文中使用的，术语“基因”指经由其模板或信使RNA编码特定肽、多肽、或蛋白质特征性氨基酸序列的DNA序列。术语“基因”还指编码RNA产物的DNA序列。如本文中关于基因组DNA使用的，术语基因包括居间的非编码区以及调节区，而且可包括5'和3'末端。
术语“体细胞突变”或“体细胞变异”指身体细胞(与种系细胞相反)中获得的，核苷酸序列中的变化(例如一个或多个核苷酸的插入、删除、倒位、或替代)。除非另有说明，该术语还涵盖该核苷酸序列的互补物中的相应变化。
术语“氨基酸变异”指相对于参照序列，氨基酸序列中的变化(例如一个或多个氨基酸的插入、替代、或删除)，诸如内部删除或N或C端截短)。
术语“变异”指核苷酸变异或氨基酸变异任一。
术语“与体细胞突变对应的核苷酸位置处的遗传变异”、“与体细胞突变对应的核苷酸位置处的核苷酸变异”及其语法变化形式指多核苷酸序列中由所述体细胞突变占据的相对相应DNA位置处的核苷酸变异。除非另有说明，该术语还涵盖该核苷酸序列的互补物中的相应变异。
术语“阵列”或“微阵列”指可杂交阵列元件(优选多核苷酸探针，例如寡核苷酸)在基片上的有序排布。基片可以是固体基片，诸如玻璃载玻片，或半固体基片，诸如硝酸纤维素膜。
术语“扩增”指生成参照核酸序列或其互补物的一个或多个拷贝的过程。扩增可以是线性或指数性的(例如聚合酶链式反应(PCR))。“拷贝”不必然表示相对于模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物诸如脱氧肌苷、有意的序列改变(诸如经由包含与模板可杂交但不完全互补的序列的引物引入的序列改变)和/或扩增期间发生的序列错误。
术语“突变特异性寡核苷酸”指与靶核酸中包含核苷酸变异(通常是替代)的区域杂交的寡核苷酸。“体细胞突变特异性杂交”表示在突变特异性寡核苷酸与其靶核酸杂交时，突变特异性寡核苷酸中的核苷酸与所述核苷酸变异特异性碱基配对。能够关于特定核苷酸变异发生突变特异性杂交的体细胞突变特异性寡核苷酸被说成对该变异是“特异性的”。
术语“突变特异性引物”指突变特异性寡核苷酸是引物。
术语“引物延伸测定法”指如下测定法，其中将核苷酸添加至核酸，产生直接或间接检测的更长核酸或“延伸产物”。可以添加核苷酸以延伸所述核酸的5’或3’末端。
术语“突变特异性核苷酸掺入测定法”指如下引物延伸测定法，其中引物(a)与靶核酸在核苷酸变异3’或5’区域杂交并(b)由聚合酶延伸，由此将与所述核苷酸变异互补的核苷酸掺入延伸产物中。
术语“突变特异性引物延伸测定法”指如下引物延伸测定法，其中突变特异性引物与靶核酸杂交，并延伸。
术语“突变特异性寡核苷酸杂交测定法”指如下测定法，其中(a)突变特异性寡核苷酸与靶核酸杂交并(b)直接或间接检测杂交。
术语“5’核酸酶测定法”指如下测定法，其中突变特异性寡核苷酸与靶核酸的杂交容许对杂交后的探针进行核酸降解切割，产生可检测的信号。
术语“采用分子信标的测定法”指如下测定法，其中突变特异性寡核苷酸与靶核酸的杂交导致可检测信号的水平比由游离寡核苷酸发射的可检测信号的水平高。
术语“寡核苷酸连接测定法”指如下测定法，其中突变特异性寡核苷酸和第二寡核苷酸在靶核酸上彼此邻近杂交，并连接在一起(直接地或者经由居间核苷酸间接地)，并直接或间接检测连接产物。
一般而言，术语“靶序列”、“靶核酸”、或“靶核酸序列”指怀疑或已知其中存在核苷酸变异的感兴趣多核苷酸序列，包括通过扩增生成的此类靶核酸的拷贝。
术语“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。依照本发明诊断的癌症为特征在于存在ErbB3突变的、任何类型的癌症，具体包括转移性或局部晚期不可切除的癌症，包括不限于胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌，结直肠癌，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)，肾癌，黑素瘤，卵巢癌，肺大细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)癌，肺癌，头和颈癌和胰腺癌。
如本文中所使用的，“有风险”形成癌症的受试者可以具有或者不具有可检测的疾病或疾病症状，而且在本文所述诊断方法前可以展示或者不展示可检测的疾病或疾病症状。“有风险”表示受试者具有如本文中所描述的和本领域中已知的一种或多种风险因子，其是与癌症形成相关联的可测量参数。具有一种或多种这些风险因子的受试者比没有一种或多种这些风险因子的受试者具有更高的形成癌症的概率。
术语“诊断”在用于本文时指分子或病理状态、疾病或状况(例如癌症)的鉴定或分类。“诊断”还可以指特定亚型的癌症的分类，例如通过分子特征(例如以特定基因或核酸区域中的核苷酸变异表征的患者亚群)来进行。
术语“帮助做出诊断”在本文中用于指帮助进行关于特定类型的癌症症状或状况的存在或性质的临床确定的方法。例如，帮助做出癌症诊断的方法可以包括在来自个体的生物学样品中测量一种或多种指示癌症或具有癌症的风险升高的遗传标志物的存在或缺失。
术语“预后”在本文中用于指预测形成癌症的可能性。术语“预测”在本文中用于指患者会对一种药物或一组药物有好的或不好的响应的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者是否会在治疗(例如用特定治疗剂进行的治疗)后存活或改善且某段时间不复发疾病和/或会在治疗(例如用特定治疗剂进行的治疗)后存活或改善且某段时间不复发疾病的概率。本发明的预测方法在临床上可用于做出治疗决定，为任何特定患者选择最适宜的治疗形式。本发明的预测方法是有价值的工具，用于预测患者是否可能对治疗方案有好的响应，诸如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、手术干预、类固醇治疗等，或用于预测患者在治疗方案后是否可能长期存活。
如本文中所使用的，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或所处理细胞的自然进程的临床干预，并且可以在临床病理学进程前或者期间进行。治疗的期望效果包括预防疾病或其状况或症状的发生或复发、缓解疾病的状况或症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及实现免除或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于试图延迟疾病或病症的发展。
如本文中使用的，“癌症治疗剂”、“有效治疗癌症的治疗剂”、及其语法变化形式指在以有效量提供时已知、在临床上显示、或临床医师预期在具有癌症的受试者中提供治疗好处的药剂。在一个实施方案中，该短语包括作为在以有效量提供时预期会在具有癌症的受试者中提供治疗效果的临床可接受的药剂，由制造商销售，或以其它方式由得到许可的临床医师使用的任何药剂。在各种非限制性实施方案中，癌症治疗剂包括化疗剂，HER二聚化抑制剂，HER抗体，针对肿瘤相关抗原的抗体，抗激素化合物，细胞因子，EGFR靶向药物，抗血管发生剂，酪氨酸激酶抑制剂，生长抑制性药剂和抗体，细胞毒剂，诱导凋亡的抗体，COX抑制剂，法呢基转移酶抑制剂，结合癌胚抗原CA 125的抗体，HER2疫苗，Raf或ras抑制剂，脂质体多柔比星，拓扑替康，紫杉烷(taxene，taxane)，双重酪氨酸激酶抑制剂，TLK286，EMD-7200，帕妥珠单抗(pertuzumab)，曲妥单抗(trastuzumab)，厄洛替尼和贝伐单抗(bevacizumab)。
“化疗”指使用可用于治疗癌症的化学化合物。化疗中使用的化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTATM)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、AD 32、alcarubicin、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、GPX-100、伊达比星(idarubicin)、KRN5500、美诺立尔(menogaril)、dynemicin包括dynemicin A、埃斯波霉素(esperamicin)、新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂质体和脱氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)(leucovorin)；醋葡醛内酯(aceglatone)；抗叶酸(盐/酯)抗瘤剂，诸如LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氢叶酸还原酶抑制剂诸如甲氨喋呤(methotrexate)、抗代谢物类，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)及其前药诸如UFT、S-1和卡培他滨(capecitabine)，及胸苷酸合酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶抑制剂诸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEXTM,TDX)；二氢嘧啶脱氢酶抑制剂诸如恩尿嘧啶(eniluracil)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)( )；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)和紫杉烷类(taxenes,taxanes)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和多西他塞(docetaxel)(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂；铂类似物或基于铂的类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)长春花生物碱类(vinca alkaloid)；长春瑞滨(vinorelbine)能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
术语“药物配制剂”指其形式容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。
“药学可接受的载体”指药物配制剂中除活性组分以外的、对受试者无毒的组分。药学可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
“有效量”指以必要的剂量和时间段，有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗剂的“治疗有效量”可以随诸如疾病状态，个体的年龄、性别、和重量，及抗体在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过治疗剂的任何毒性或有害效果的量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。“预防有效量”指以必要的剂量和时间段，有效实现期望的预防结果的量。通常但不必要地，由于在疾病前或在疾病的较早阶段在受试者中使用预防剂量，预防有效量会小于治疗有效量。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文中所使用的，“患者亚群”及其语法变化形式指特征为具有一项或多项独特的可测量的和/或可鉴定的特征的患者子集，所述特征区别所述患者子集与其所属更宽疾病范畴中的其它子集。此类特征包括疾病亚类(disease subcategory)、性别、生活方式、健康史、所牵涉的器官/组织、治疗史等。在一个实施方案中，患者亚群以核酸标签表征，包括特定核苷酸位置和/或区域中的核苷酸变异(诸如体细胞突变)。
“对照受试者”指未诊断为具有癌症和未罹患任何与癌症有关的体征或症状的健康受试者。
如本文中所使用的，术语“样品”指自感兴趣的受试者获得或衍生的组合物，其含有要例如根据物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样品”及其各种变化形式指自感兴趣的受试者获得的任何样品，预期或已知其含有要表征的细胞和/或分子实体。
“组织或细胞样品”指从受试者或患者的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如血清、尿、痰、或唾液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品还可以是原代的或培养的细胞或细胞系。任选的是，组织或细胞样品是从疾病组织/器官获得的。组织样品可能含有在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。如本文中所使用的，“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样品”、“对照细胞”、或“对照组织”指获自已知来源或者认为不受本发明方法或组合物正用于鉴定所针对之疾病或状况影响的样品、细胞或组织。在一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞、或对照组织获自其中正使用本发明组合物或方法鉴定疾病或状况的同一受试者或患者的身体的健康部分。在一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞、或对照组织获自不是其中正使用本发明组合物或方法鉴定疾病或状况的受试者或患者的个体的身体的健康部分。
出于本文中的目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切下来的一薄片组织或细胞。应当了解，可以制作多片组织样品切片并依照本发明进行分析，前提是应当了解，本发明包括将组织样品的同一切片用于形态学和分子两个水平的分析或者针对蛋白质和核酸二者进行分析的方法。
“关联”或“联系”指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以将第一分析或方案的结果用于实施第二分析或方案和/或，可以使用第一分析或方案的结果来决定是否应当实施第二分析或方案。就基因表达分析或方案的实施方案而言，可以使用基因表达分析或方案的结果来决定是否应当实施特定治疗方案。
“小分子”或“有机小分子”在本文中定义为具有低于约500道尔顿的分子量的有机分子。
单词“标记物”在用于本文时指可检测的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化导致底物化合物或组合物变成可检测产物的化学改变。可充当可检测标记物的放射性核素包括例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、和Pd-109。
本文中提及“约”数值或参数包括(并描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书，其含有关于适应证、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌证和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明“结合”感兴趣抗原的抗体指以足够的亲和力结合抗原以使得该抗体作为靶向蛋白质或表达抗原的细胞或组织中的诊断剂和/或治疗剂是有用的抗体。关于抗体对靶分子的结合，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位或“对特定多肽或特定多肽靶上的表位特异性的”表示该结合可测量地不同于非特异性相互作用。特异性结合可以通过例如测定对分子的结合并与对对照分子的结合比较来测量。例如，特异性结合可通过与对照分子(其与靶物相似，例如过量的未标记靶物)的竞争来确定。在这种情况中，若经标记靶物对探针的结合受到过量的未标记靶物竞争性抑制，则指示特异性结合。在一个具体的实施方案中，“特异性结合”指抗体结合其规定靶HER受体且不结合其它规定的非靶HER受体。例如，抗HER3抗体特异性结合HER3但没有特异性结合EGFR，HER2，或HER4。EGFR/HER3双特异性抗体特异性结合EGFR和HER3但没有特异性结合HER2或HER4。
“HER受体”或“ErbB受体”是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1,HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)受体。HER受体通常将包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和含有数个可磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。优选的是，HER受体是天然序列人HER受体。“HER途径”指由HER受体家族介导的信号传导网络。
术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，指例如Carpenter等,Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中所披露的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(例如Ullrich等,Nature(1984)309:418425及Humphrey等,PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)，以及其变体，诸如EGFRvIII。EGFR的变体还包括删除、替代和插入变体，例如Lynch等,New England Journal of Medicine 2004,350:2129；Paez等,Science 2004,304:1497；及Pao等,PNAS 2004,101:13306中记载的那些。在本文中，“EGFR胞外结构域”或“EGFR ECD”指EGFR在细胞外的结构域，或是锚定于细胞膜或是在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，EGFR的胞外结构域可包含4个结构域：“结构域I”(大约第1-158位氨基酸残基)、“结构域II”(第159-336位氨基酸残基)、“结构域III”(第337-470位氨基酸残基)和“结构域IV”(第471-645位氨基酸残基)，其中边界是近似的，可以变化大约1-3个氨基酸。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Semba等,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等,Nature 319:230-234(1986)中记载的人HER2蛋白(Genebank编号X03363)。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因，而“neu”指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
在本文中，“HER2胞外结构域”或“HER2ECD”指HER2在细胞外的结构域，或是锚定于细胞膜或是在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER2的胞外结构域可包含4个结构域：“结构域I”(大约第1-195位氨基酸残基)、“结构域II”(大约第196-319位氨基酸残基)、“结构域III”(大约第320-488位氨基酸残基)和“结构域IV”(大约第489-630位氨基酸残基)(残基编号不包括信号肽)。参见Garrett等,Mol.Cell.11:495-505(2003)；Cho等,Nature421:756-760(2003)；Franklin等,Cancer Cell 5:317-328(2004)；及Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。
“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利第5,183,884号和第5,480,968号及Kraus等,PNAS(USA)86:9193-9197(1989)中所披露的受体多肽(还可见图2和3)。
在本文中，“HER3胞外结构域”或“HER3 ECD”或“ErbB3胞外结构域”指HER3在细胞外的结构域，或是锚定于细胞膜或是在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER3的胞外结构域可包含4个结构域：“结构域I”、“结构域II”、“结构域III”和“结构域IV”。在一个实施方案中，HER3 ECD包含氨基酸1-636(编号包括信号肽)。在一个实施方案中，HER3结构域III包含氨基酸328-532(编号包括信号肽)。
在本文中，术语“ErbB4”和“HER4”指例如欧洲专利申请第599,274号；Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:1746-1750(1993)；Plowman等,Nature 366:473-475(1993)中所披露的受体多肽，包括其同种型，例如1999年4月22日公布的WO99/19488中所披露的。
“HER配体”指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage等,J.Biol.Chem.247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等,Science223:1079-1082(1984))；双调蛋白(amphiregulin)，也称为施旺细胞瘤或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyab等,Science243:1074-1076(1989)；Kimura等,Nature 348:257-260(1990)；Cook等,Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991))；β细胞调节素(betacellulin)(Shing等,Science259:1604-1607(1993)；Sasada等,Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等,Science 251:936-939(1991))；上皮调节蛋白(epiregulin)(Toyoda等,J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995)；Komurasaki等,Oncogene15:2841-2848(1997))；α调蛋白(heregulin)(见下文)；神经调节蛋白(neuregulin)-2(NRG-2)(Carraway等,Nature 387:512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等,Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等,Oncogene 18:2681-89(1999))；和cripto(CR-I)(Kanmm等,J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β细胞调节素(betacellulin)、HB-EGF和上皮调节蛋白(epiregulin)。结合HER3的HER配体包括调蛋白和NRG-2。能够结合HER4的HER配体包括β细胞调节素、上皮调节蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。
“调蛋白”(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因编码的多肽，如美国专利第5,641,869号或Marchionni等,Nature 362:312-318(1993)中所披露的。调蛋白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等,Science 256:1205-1210(1992)；美国专利第5,641,869号)；neu分化因子(NDF)(Peles等,Cell 69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等,Cell 72:801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni等,Nature362:312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等,J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等,Oncogene 15:1385-1394(1997))。
“HER二聚体”在本文中指包含至少两个HER受体的非共价结合二聚体。在表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可形成这样的复合物，可通过免疫沉淀来分离并通过SDS-PAGE来分析，如例如Sliwkowski等,J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994)中所记载的。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基(例如gp130)可与二聚体结合。
“HER异二聚体”在本文中指包含至少两个不同HER受体的非共价结合异二聚体，诸如EGFR-HER2、EGFR-HER3、EGFR-HER4、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体。
“HER抑制剂”或“ErbB抑制剂”或“ErbB拮抗剂”指干扰HER活化或功能的药剂。HER抑制剂的例子包括HER抗体(例如EGFR、HER2、HER3或HER4抗体)；EGFR靶向药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016；反义分子(参见例如WO 2004/87207)；和/或结合下游信号分子诸如MAPK或Akt或干扰其功能的药剂。优选的是，所述HER抑制剂是结合HER受体的抗体。一般而言，HER抑制剂指那些特异性结合特定HER受体且阻止或降低其信号传导活性，但是不特异性结合其它HER受体的化合物。例如，HER3拮抗剂特异性结合以降低其活性，但是不特异性结合EGFR、HER2、或HER4。
“HER二聚化抑制剂”或“HDI”指抑制HER二聚体或HER异二聚体形成的药剂。优选的是，HER二聚化抑制剂是抗体。然而，HER二聚化抑制剂还包括抑制HER同或异二聚体形成的肽和非肽小分子，及其它化学实体。
“抑制HER二聚化”的抗体指抑制或干扰HER二聚体形成的抗体，不管根本的机制。在一个实施方案中，此类抗体在HER2的异二聚体结合位点处结合HER2。二聚化抑制性抗体的一个具体例子是Pertuzumab(Pmab)或MAb2C4。HER二聚化抑制剂的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806，MAb806，它结合活化的或“未系留的(untethered)”EGFR；参见Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利第6,417,168号)；反义二聚化抑制剂；等等。
如本文中使用的，“HER2拮抗剂”或“EGFR抑制剂”指那些特异性结合EGFR且阻止或降低其信号传导活性，而且不特异性结合HER2、HER3、或HER4化合物。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括如本文中使用的，“EGFR拮抗剂”或“EGFR抑制剂”指那些特异性结合EGFR且阻止或降低其信号传导活性，而且不特异性结合HER2、HER3、或HER4的化合物。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括单抗579(ATCC CRL HB 8506)、单抗455(ATCC CRL HB8507)、单抗225(ATCCCRL 8508)、单抗528(ATCC CRL8509)(见美国专利No.4,943,533,Mendelsohn等)及其变体，诸如嵌合化的225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab)；)和重构人225(H225)(见WO 96/40210,Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，即一种完全人的、EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化的和嵌合的抗体，如记载于美国专利No.5,891,996的；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(见WO98/50433,Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等Eur.J.Cancer32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗(matuzumab))，即一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α两者竞争EGFR结合(EMD/Merck)；人EGFR抗体HuMax-EGFR(GenMab)；称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3并记载于US 6,235,883的完全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)；和单抗806或人源化单抗806(Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。可以将抗EGFR抗体与细胞毒剂缀合，如此生成免疫缀合物(见例如EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子诸如记载于美国专利No:5,616,582,5,457,105,5,475,001,5,654,307,5,679,683,6,084,095,6,265,410,6,455,534,6,521,620,6,596,726,6,713,484,5,770,599,6,140,332,5,866,572,6,399,602,6,344,459,6,602,863,6,391,874,6,344,455,5,760,041,6,002,008和5,747,498，及下列PCT公开文本：WO98/14451,WO98/50038,WO99/09016和WO99/24037的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、埃罗替尼(erlotinib)，Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033、2-丙烯酰胺、N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-、二氢氯化物，Pfizer Inc.)；ZD1839、吉非替尼(gefitinib)4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁烯酰胺(butynamide))；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Sugen)；和AG1571(SU 5271；Sugen)。
“HER抗体”指结合HER受体的抗体。任选的是，HER抗体还干扰HER活化或功能。具体的HER2抗体包括pertuzumab和trastuzumab。具体的EGFR抗体的例子包括cetuximab和panitumumab。涉及HER抗体的专利公开文本包括：US 5,677,171,US 5,720,937,US 5,720,954,US 5,725,856,US 5,770,195,US 5,772,997,US 6,165,464,US 6,387,371,US 6,399,063,US2002/019221 IAl,US 6,015,567,US 6,333,169,US 4,968,603,US 5,821,337,US 6,054,297,US6,407,213,US 6,719,971,US 6,800,738,US2004/0236078A1,US 5,648,237,US6,267,958,US 6,685,940,US 6,821,515,WO98/17797,US 6,333,398,US6,797,814,US 6,339,142,US 6,417,335,US 6,489,447,WO99/31140,US2003/0147884A1,US2003/0170234A1,US2005/0002928A1,US 6,573,043,US2003/0152987A1,WO99/48527,US2002/0141993A1,WO01/00245,US2003/0086924,US2004/0013667A1,WO00/69460,WO01/00238,WO01/15730,US 6,627,196Bl,US 6,632,979Bl,WO01/00244,US2002/0090662A1,WO01/89566,US2002/0064785,US2003/0134344,WO04/24866,US2004/0082047,US2003/0175845A1,WO03/087131,US2003/0228663,WO2004/008099A2,US2004/0106161,WO2004/048525,US2004/0258685A1,US 5,985,553,US 5,747,261,US 4,935,341,US 5,401,638,US 5,604,107,WO 87/07646,WO 89/10412,WO 91/05264,EP 412,116 B1,EP494,135B1,US5,824,311,EP 444,181B1,EP 1,006,194 A2,US2002/0155527A1,WO 91/02062,US 5,571,894,US 5,939,531,EP 502,812B1,WO 93/03741,EP 554,441 B1,EP 656,367 Al,US 5,288,477,US 5,514,554,US5,587,458,WO 93/12220,WO 93/16185,US 5,877,305,WO 93/21319,WO93/21232,US 5,856,089,WO 94/22478,US 5,910,486,US 6,028,059,WO96/07321,US 5,804,396,US 5,846,749,EP 711,565,WO 96/16673,US5,783,404,US 5,977,322,US 6,512,097,WO 97/00271,US 6,270,765,US6,395,272,US 5,837,243,WO 96/40789,US 5,783,186,US 6,458,356,WO97/20858,WO 97/38731,US 6,214,388,US 5,925,519,WO 98/02463,US5,922,845,WO 98/18489,WO 98/33914,US 5,994,071,WO 98/45479,US6,358,682 B1,US 2003/0059790,WO 99/55367,WO 01/20033,US2002/0076695 Al,WO00/78347,WO 01/09187,WO 01/21192,WO 01/32155,WO 01/53354,WO 01/56604,WO 01/76630,WO02/05791,WO 02/11677,US6,582,919,US2002/0192652A1,US 2003/0211530A1,WO 02/44413,US2002/0142328,US 6,602,670 B2,WO 02/45653,WO 02/055106,US2003/0152572,US 2003/0165840,WO 02/087619,WO 03/006509,WO03/012072,WO 03/028638,US2003/0068318,WO 03/041736,EP1,357,132,US 2003/0202973,US 2004/0138160,US 5,705,157,US 6,123,939,EP 616,812B1,US 2003/0103973,US 2003/0108545,US 6,403,630B1,WO00/61145,WO 00/61185,US 6,333,348B1,WO 01/05425,WO 01/64246,US2003/0022918,US 2002/0051785Al,US 6,767,541,WO 01/76586,US2003/0144252,WO 01/87336,US 2002/0031515Al,WO 01/87334,WO02/05791,WO 02/09754,US 2003/0157097,US2002/0076408,WO 02/055106,WO 02/070008,WO 02/089842WO 11/076683和WO 03/86467。
“HER活化”指任何一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号转导(例如由HER受体胞内激酶结构域引起的信号转导，该激酶结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基)。HER活化可由结合包含目的HER受体的HER二聚体的HER配体介导。结合HER二聚体的HER配体可活化二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域，由此导致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽诸如Akt或MAPK胞内激酶中酪氨酸残基的磷酸化。
“磷酸化”指对蛋白质诸如HER受体，或其底物添加一个或多个磷酸基团。
HER2上的“异二聚体结合位点”指在HER2与EGFR、HER3或HER4形成二聚体时，与EGFR、HER3或HER4胞外结构域中某区域接触或形成介面的HER2胞外结构域中的区域。已发现所述区域在HER2的结构域II中。Franklin等,Cancer Cell 5:317-328(2004)。
“结合HER2的异二聚体结合位点的”HER2抗体结合结构域II中的残基(任选还结合HER2胞外结构域的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基)，且至少在一定程度上可在空间上阻碍HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体的形成。Franklin等,Cancer Cell5:317-328(2004)表征了存放在RCSB蛋白质数据库(ID Code IS78)的HER2-Pertuzumab晶体结构，图解了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基和任选HER2的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基。
“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种抗体时，意指已经鉴定且与/自表达它的细胞或细胞培养物分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原或还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然该多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“ErbB3癌症检测剂”指能够检测ERBB3核酸序列或氨基酸序列内与ErbB3癌症有关的突变的药剂。通常，检测剂包括能够特异性结合ERBB3序列的试剂。在一个优选的实施方案中，该试剂能够特异性结合ErbB3核酸序列中的ErbB3突变。在一个实施方案中，检测剂包括能够与ERBB3核酸序列(例如SEQ ID NO:1或230)特异性杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸是包含与包含突变的ErbB3序列特异性杂交的核酸序列的探针。在另一个实施方案中，检测剂包括能够特异性结合ERBB3氨基酸序列的试剂。在另一个实施方案中，该氨基酸序列包含本文中描述的突变。检测剂可进一步包含标记物。在一个优选的实施方案中，ErbB3癌症检测剂是ErbB3胃肠癌检测剂。
ErbB3体细胞突变
一方面，本发明提供在来自受试者的样品中检测与癌症有关的ErbB3体细胞突变的存在或缺失的方法，以及通过在来自受试者的样品中检测一种或多种这些体细胞突变的存在或缺失来诊断和预后癌症的方法，其中存在体细胞突变指示受试者具有癌症。与癌症风险有关的ErbB3体细胞突变是使用包括基因组范围关联研究，修饰物筛选和基于家族的筛选在内的策略鉴定的。
供本发明的方法使用的体细胞突变或变异包括ErbB3或编码这种蛋白质的基因中的变异。在一些实施方案中，体细胞突变在编码基因(或其调节区)的基因组DNA中。在各种实施方案中，体细胞突变是编码ErbB3的核酸(SEQ ID NO：1；登录号NM_001982)中的替代，插入，或删除。在一个实施方案中，变异是在ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2；登录号NP_001973)中的M60，G69，M91，V104，Y111，R135，R193，A232，P262，Q281，G284，V295，Q298，G325，T389，R453，M406，V438，D492，K498，V714，Q809，S846，E928，S1046，R1089，T1164和D1194中的一个或多个处导致氨基酸替代的突变。在一个实施方案中，替代是M60K，G69R，M91I，V104L，V104M，Y111C，R135L，R193*，A232V，P262S，P262H，Q281H，G284R，V295A，Q298*，G325R，T389K，M406K，V438I，R453H，D492H，K498I，V714M，Q809R，S846I，E928G，S1046N，R1089W，T1164A和D1194E中的至少一个(*指示终止密码子)。在各种实施方案中，至少一处变异是ErbB3中的氨基酸替代，插入，截短，或删除。在一些实施方案中，变异是氨基酸替代。
ErbB3突变的鉴定
在本发明的一个重要方面，将一簇ErbB3氨基酸残基鉴定为突变热点。特别地，发现在结构域I(SEQ ID NO:2的位置1至213)和II(SEQ ID NO:2的位置214至284)之间的界面中包含至少一处替代的ErbB3指示ErbB3癌症。特别地，在至少由ErbB3氨基酸残基104，232和284确定的结构域I/II界面处发现一簇值得注意的胞外域(ECD)体细胞突变。在一个实施方案中，该结构域进一步由氨基酸残基60确定。在另一个实施方案中，该簇体细胞突变包括V104变成L或M；A232变成V；和G284变成R。在一个其它实施方案中，该簇进一步包括M60变成K。
一方面，本发明提供在有需要的受试者中测定胃肠癌的存在的方法，其包括在自受试者获得的生物学样品中检测人ErbB3结构域II和III之间、由氨基酸位置104，232和284确定的界面处氨基酸突变的存在或缺失。该界面可进一步由位置60确定。
体细胞突变的检测
如本文中描述的任何检测方法中使用的，核酸可以是基因组DNA；自基因组DNA转录的RNA；或自RNA生成的cDNA。核酸可以自脊椎动物，例如哺乳动物衍生。若某核酸是直接自特定来源获得的，或者若该核酸是在该来源中找到的核酸的拷贝，则该核酸被说成“衍生自”该来源。
核酸包括核酸的拷贝，例如源自于扩增的拷贝。扩增在某些情况中可能是想要的，例如以便获得想要量的材料来检测变异。然后可以将扩增子进行变异检测方法(诸如那些下文所描述的)以测定所述扩增子中是否存在变异。
可以通过本领域技术人员已知的某些方法来检测体细胞突变或变异。此类方法包括但不限于DNA测序；引物延伸测定法，包括体细胞突变特异性核苷酸掺入测定法和体细胞突变特异性引物延伸测定法(例如体细胞突变特异性PCR、体细胞突变特异性连接链式反应(LCR)、和缺口-LCR)；突变特异性寡核苷酸杂交测定法(例如寡核苷酸连接测定法)；切割保护测定法，其中使用免受切割剂作用的保护来检测核酸双链体中的错配碱基；对MutS蛋白结合的分析；比较变异型和野生型核酸分子迁移率的电泳分析；变性梯度凝胶电泳(DGGE，如在例如Myers等(1985)Nature 313:495中的)；对RNA酶在错配碱基对处切割的分析；分析对异源双链DNA的化学或酶促切割；质谱术(例如MALDI-TOF)；遗传比特分析(genetic bitanalysis,GBA)；5’核酸酶测定法(例如TaqManTM)；和采用分子信标的测定法。这些方法中的某些在下文有更详细的讨论。
可以使用本领域中公知技术通过靶核酸的分子克隆和测序来实现靶核酸中变异的检测。或者，可以使用扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCR)来直接自来自肿瘤组织的基因组DNA制备物扩增靶核酸序列。然后可以测定扩增序列的核酸序列，并自此鉴定变异。扩增技术是本领域中公知的，例如聚合酶链式反应记载于Saiki等,Science 239:487,1988；美国专利号4,683,203和4,683,195。
还可以使用连接酶链式反应(其是本领域中已知的)来扩增靶核酸序列。参见例如Wu等,Genomics 4:560-569(1989)。另外，还可以修饰并使用称为等位基因特异性PCR的技术来检测体细胞突变(例如替代)。参见例如Ruano和Kidd(1989)Nucleic Acids Research17:8392；McClay等(2002)Analytical Biochem.301:200-206。在此技术的某些实施方案中，使用突变特异性引物，其中所述引物的3’端核苷酸与靶核酸中的特定变异互补(即能够与靶核酸中的特定变异发生特异性碱基配对)。若不存在所述特定变异，则观察不到扩增产物。还可以使用扩增受阻突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)来检测变异(例如替代)。ARMS记载于例如欧洲专利申请公开文本No.0332435,及Newton等,Nucleic Acids Research,17:7,1989。
对于检测变异(例如替代)有用的其它方法包括但不限于(1)突变特异性核苷酸掺入测定法，诸如单碱基延伸测定法(参见例如Chen等(2000)Genome Res.10:549-557；Fan等(2000)Genome Res.10:853-860；Pastinen等(1997)Genome Res.7:606-614；及Ye等(2001)Hum.Mut.17:305-316)；(2)突变特异性引物延伸测定法(参见例如Ye等(2001)Hum.Mut.17:305-316；和及Shen等Genetic Engineering News,卷23,2003年3月15日)，包括体细胞突变特异性PCR；(3)5’核酸酶测定法(参见例如De La Vega等(2002)BioTechniques 32:S48-S54(记载了TaqManTM测定法)；Ranade等(2001)Genome Res.11:1262-1268；和Shi(2001)Clin.Chem.47:164-172)；(4)采用分子信标的测定法(参见例如Tyagi等(1998)NatureBiotech.16:49-53；和Mhlanga等(2001)Methods 25:463-71)；和(5)寡核苷酸连接测定法(参见例如Grossman等(1994)Nuc.Acids Res.22:4527-4534；专利申请公开文本No.US2003/0119004A1；PCT国际公开文本No.WO 01/92579A2；和美国专利号6,027,889)。
还可以通过错配检测方法来检测变异。错配指不是100％互补的杂交的核酸双链体。缺乏完全互补性可能是由于删除、插入、倒位、或替代。错配检测方法的一个例子是错配修复检测(Mismatch Repair Detection,MRD)测定法，其记载于例如Faham等,Proc.NatlAcad.Sci.USA 102:14717-14722(2005)和Faham等,Hum.Mol.Genet.10:1657-1664(2001)。错配切割技术的另一个例子是RNA酶保护方法，其详细记载于Winter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7575,1985,和Myers等,Science 230:1242,1985。例如，本发明的方法可以牵涉与人野生型靶核酸互补的经标记核糖核酸探针的使用。将核糖核酸探针与自组织样品衍生的靶核酸一起退火(杂交)，随后用能够检测双链RNA结构中的一些错配的酶RNA酶A消化。若RNA酶A检测出错配，则其在错配位点处切割。如此，在电泳凝胶基质上将退火的RNA制备物分开时，若RNA酶A已经检测出并切割错配，则会看到比核糖核酸探针和mRNA或DNA的全长双链RNA小的RNA产物。核糖核酸探针不必是靶核酸的全长，而可以是靶核酸的一部分，前提是其涵盖怀疑具有变异的位置。
以类似的方式，可以使用DNA探针来检测错配，例如经由酶促或化学切割来实现。参见例如Cotton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397,1988；和Shenk等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:989,1975。或者，可以通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率的变动来检测错配。参见例如Cariello,Human Genetics,42:726,1988。用核糖核酸探针或DNA探针，可以在杂交前扩增怀疑包含变异的靶核酸。还可以使用Southern杂交来检测靶核酸中的变化，尤其若所述变化是总的重排，诸如删除和插入。
可以使用针对靶核酸或周围标志基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针来检测变异，例如插入或删除。还可以通过对靶核酸的克隆、测序和扩增来检测插入和删除。还可以使用单链构象多态性(Single stranded conformation polymorphism,SSCP)分析来检测体细胞突变的碱基变化变体。参见例如Orita等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2766-2770,1989,和Genomics,5:874-879,1989。可以修改SSCP来检测ErbB3体细胞突变。SSCP通过单链PCR产物的电泳迁移率的改变来鉴定碱基差异。可以通过加热或以其它方式使双链PCR产物变性来生成单链PCR产物。单链核酸可重折叠或形成部分依赖于碱基序列的次级结构。单链扩增产物的不同电泳迁移率与SNP位置处的碱基序列差异有关。变性梯度凝胶电泳(DGGE)根据多态性DNA内在的不同序列依赖性稳定性和解链特性及变性梯度凝胶中电泳迁移样式的相应差异来区分SNP等位基因。
还可以使用微阵列来检测体细胞突变或变异。微阵列指一种多路技术，其通常使用排列好的一系列数以千计的在高严格性条件下与例如cDNA或cRNA样品杂交的核酸探针。通常通过检测荧光团，银，或化学发光标记的靶物来检测和定量探针-靶物杂交以测定靶物中核酸序列的相对丰度。在典型的微阵列中，探针通过与化学基质的共价键附着至固体表面(经由环氧硅烷，氨基硅烷，赖氨酸，聚丙烯酰胺等等)。固体表面指例如玻璃，硅片，或显微珠。多种微阵列是商品化的，包括那些例如Affymetrix公司和Illumina公司制造的。
用于检测体细胞突变的另一种方法基于质谱术。质谱术利用DNA的四种核苷酸每种的独特质量。可以通过质谱术通过测量具有体细胞突变的核酸的质量差异来毫无疑义地分析潜在包含突变的ErbB3核酸。MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱术技术可用于极其精确地测定分子量，诸如包含体细胞突变的核酸的。已经开发了众多基于质谱术的核酸分析办法。例示性的基于质谱术的方法包括引物延伸测定法，其也可以与其它办法(诸如传统的基于凝胶的形式和微阵列)组合使用。
序列特异性核酶(美国专利No.5,498,531)也可用于根据核酶切割位点的形成或丢失来检测体细胞突变。可以通过核酸酶切割消化测定法或通过解链温度的差异来区分完全匹配序列与错配序列。如果突变影响限制酶切割位点，那么可通过限制酶消化样式的改变和通过凝胶电泳测定的核酸片段长度的相应变化来鉴定突变。
在本发明的其它实施方案中，使用基于蛋白质的检测技术来检测由具有本文中公开的遗传变异的基因编码的变体蛋白质。蛋白质的变体形式的存在的测定可使用本领域已知的任何合适技术来进行，例如电泳(例如变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，二维凝胶电泳，毛细管电泳和等电聚焦)，层析(例如分筛层析(sizing chromatography)，高效液体层析(HPLC)和阳离子交换HPLC)和质谱术(例如MALDI-TOF质谱术，电喷射电离(ESI)质谱术和串联质谱术)。参见例如Ahrer和Jungabauer(2006)J.Chromatog.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.841:110-122；及Wada(2002)J.Chromatog.B.781:291-301。可部分基于要检测的变异的性质来选择合适的技术。例如，在替代的氨基酸具有与初始氨基酸不同的电荷的情况中，可以通过等电聚焦来检测导致氨基酸替代的变异。多肽经由具有pH梯度的凝胶在高电压的等电聚焦根据蛋白质的pI将它们分开。可以将pH梯度凝胶与同时运行的含有野生型蛋白质的凝胶进行比较。在变异导致新的蛋白水解切割位点生成或现有的蛋白水解切割位点消除的情况中，可以对样品进行蛋白质水解消化，继以肽作图，使用适宜的电泳，层析，或质谱术技术来进行。也可以使用蛋白质测序技术来检测变异的存在，诸如Edman降解或质谱术的某些形式。
也可以使用本领域已知的、利用这些技术的组合的方法。例如，在HPLC-显微术串联质谱术技术中，对蛋白质实施蛋白水解消化，并通过反相层析分离将所得肽混合物分开。实施串联质谱术，并分析自其收集的数据(Gatlin等(2000)Anal.Chem.,72:757-763)。又例如，将非变性凝胶电泳与MALDI质谱术组合(Mathew等(2011)Anal.Biochem.416:135-137)。
在一些实施方案中，可以使用诸如特异性结合蛋白质的肽或抗体等试剂自样品分离蛋白质，并使用上文公开的任何技术进行进一步分析以测定遗传变异的存在或缺失。
或者，可以通过免疫亲和测定法(其基于对具有依照本发明的遗传变异的蛋白质特异性的抗体，即特异性结合具有变异的蛋白质但不结合该蛋白质缺乏该变异的形式的抗体)检测来样品中变体蛋白质的存在。可以通过本领域已知的任何合适技术来生成此类抗体。可使用抗体自溶液样品免疫沉淀特定蛋白质或免疫印迹通过例如聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质。免疫细胞化学方法也可用于检测组织或细胞中的特定蛋白质变体。也可以使用其它公知的基于抗体的技术，包括例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)，免疫放射剂量测定法(IRMA)和免疫酶促测定法(IEMA)，包括三明治式测定法，使用单克隆或多克隆抗体进行。参见例如美国专利No.4,376,110和No.4,486,530。
遗传标志物的鉴定
已经在癌症中调查了体细胞突变和种系突变之间的关系(参见例如Zauber等J.Pathol.2003Feb；199(2):146-51)。本文中公开的ErbB3体细胞突变可用于鉴定与癌症形成有关的遗传标志物。例如，本文中公开的体细胞突变可用于鉴定种系和任何别的连锁不平衡的SNP中的单核苷酸多态性(SNP)。确实，任何别的与第一SNP(其与癌症有关)连锁不平衡的SNP会与癌症有关。一旦证明给定SNP和癌症之间的关联，会有极大的兴趣去发现别的与癌症有关的SNP，从而提供此特定区域中SNP的密度。
用于鉴定别的SNP和进行连锁不平衡分析的方法是本领域公知的。例如，别的与本文中公开的SNP连锁不平衡的SNP的鉴定可涉及下述步骤：(a)自多数个体自包含或包围第一SNP的基因组区域扩增片段；(b)在包含或包围所述第一SNP的基因组区域中鉴定第二SNP；(c)在所述第一SNP和第二SNP之间进行连锁不平衡分析；并(d)选择与所述第一标志物连锁不平衡的所述第二SNP。可修改这种方法以包括步骤(a)之前的某些步骤，诸如自多数个体自包含或包围体细胞突变的基因组区域扩增片段，及在包含或包围所述体细胞突变的基因组区域中鉴定SNP。
ErbB3癌症检测剂
一方面，本发明提供ErbB3癌症检测剂。在一个实施方案中，检测剂包含能够特异性结合图39所示ErbB3序列(氨基酸序列SEQ ID NO：231或核酸序列SEQ ID NO:230)的试剂。在另一个实施方案中，检测剂包含能够与图2(SEQ ID NO：1)或图39(SEQ ID NO:230)所示ERBB3核酸序列特异性杂交的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，多核苷酸包含与图39(SEQ ID NO:230)所示包含突变的ErbB3核酸序列特异性杂交的核酸序列。
另一方面，ErbB3癌症检测剂包含具有特定式的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸式为
5’Xa-Y-Zb 3’ 式I，
其中
X为任何核酸且a介于约0和约250之间(即5’方向)；
Y代表ErbB3突变密码子；且
Z为任何核酸且b介于约0和约250之间(即3’方向)。
在另一个实施方案中，在5’(a的情况)或3’(b的情况)方向，a或b为约250或更少。在一些实施方案中，a或b介于约0和约250之间，a或b介于约0和约245之间，介于约0和约240之间，介于约0和约230之间，介于约0和约220之间，介于约0和约210之间，介于约0和约200之间，介于约0和约190之间，介于约0和约180之间，介于约0和约170之间，介于约0和约160之间，介于约0和约150之间，介于约0和约140之间，介于约0和约130之间，介于约0和约120之间，介于约0和约110之间，介于约0和约100之间，介于约0和约90之间，介于约0和约80之间，介于约0和约70之间，介于约0和约60之间，介于约0和约50之间，介于约0和约45之间，介于约0和约40之间，介于约0和约35之间，介于约0和约30之间，介于约0和约25之间，介于约0和约20之间，介于约0和约15之间，介于约0和约10之间，或介于约0和约5之间。
在一个其它实施方案中，a或b为约35或更少。在一些实施方案中，a或b介于约0和约35之间，介于约0和约34之间，介于约0和约33之间，介于约0和约32之间，介于约0和约31之间，介于约0和约30之间，介于约0和约29之间，介于约0和约28之间，介于约0和约27之间，介于约0和约26之间，介于约0和约25之间，介于约0和约24之间，介于约0和约23之间，介于约0和约22之间，介于约0和约21之间，介于约0和约20之间，介于约0和约19之间，介于约0和约18之间，介于约0和约17之间，介于约0和约16之间，介于约0和约15之间，介于约0和约14之间，介于约0和约13之间，介于约0和约12之间，介于约0和约11之间，介于约0和约10之间，介于约0和约9之间，介于约0和约8之间，介于约0和约7之间，介于约0和约6之间，介于约0和约5之间，介于约0和约4之间，介于约0和约3之间，或介于约0和约2之间。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置60处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自AAA和AAG。这对应于与结肠癌有关的M60K突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置104处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自ATG，CTT，CTC，CTA，CTG，TTA和TTG。这对应于与结肠癌，胃癌，卵巢癌和乳腺癌有关的V104M或V104L突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置111处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自TGT和TGC。这对应于与胃癌有关的Y111C突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置135处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CTT，CTC，CTA，CTG，TTA和TTG。这对应于与胃癌有关的R135L突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置193处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自TAA，TAG和TGA。这对应于与结肠癌有关的R193*(其中*为终止密码子)突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置232处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自GTT，GTC，GTA和GTG。这对应于与胃癌有关的A232V突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置262处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CAT，CAC，TCT，TCC，TCA，TCG，AGT和AGC。这对应于与结肠和/或胃癌有关的P262H或P262S突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置284处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CGT，CGC，CGA，CGG，AGA和AGG。这对应于与结肠或肺(NSCLC腺癌)癌有关的G284R突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置295处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自GCT，GCC，GCA和GCG。这对应于与结肠癌有关的V295A突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置325处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CGT，CGC，CGA，CGG，AGA和AGG。这对应于与结肠癌有关的G325R突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置406处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自ACT，ACC，ACA，ACG,AAA和AAG。这对应于与胃癌有关的M406K或M406T突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置453处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CAT和CAC。这对应于与胃癌有关的R453H突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置498处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自ATT，ATC和ATA。这对应于与胃癌有关的K498I突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置809处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CGT，CGC，CGA，CGG，AGA和AGG。这对应于与胃癌有关的Q809R突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置846处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自ATT，ATC和ATA。这对应于与结肠癌有关的S846I突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置928处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自GGT，GGC，GGA和GGG。这对应于与胃癌和乳腺癌症有关的E928G突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置1089处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y为TGG。这对应于与胃癌有关的R1089W突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置1164处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自GCT，GCC，GCA和GCG。这对应于与结肠癌有关的T1164A突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置492处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y选自CAT和CAC。这对应于与肺(NSCLC腺癌)癌有关的D492H突变。
在一个其它实施方案中，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:2位置714处的氨基酸的ErbB3核酸序列杂交，其中Y为ATG。这对应于与肺(NSCLC鳞癌)癌有关的V714M突变。
癌症的诊断、预后和治疗
本发明提供用于受试者中癌症的诊断或预后方法，其通过在来自受试者的样品中检测本文中公开的一处或多处与癌症有关的体细胞突变或变异的存在来进行。供本发明的方法使用的体细胞突变或变异包括ErbB3或编码这种蛋白质的基因中的变异。在一些实施方案中，体细胞突变在编码基因(或其调节区)的基因组DNA中。在各种实施方案中，体细胞突变是编码ErbB3的基因中的替代，插入，或删除。在一个实施方案中，变异是在ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的M60，G69，M91，V104，Y111，R135，R193，A232，P262，Q281，G284，V295，Q298，G325，T389，M406，V438，R453，D492，K498，V714，Q809，S846，E928，S1046，R1089，T1164和D1194中的一个或多个处导致氨基酸替代的突变。在一个实施方案中，替代是ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的M60K，G69R，M91I，V104L，V104M，Y111C，R135L，R193*，A232V，P262S，P262H，Q281H，G284R，V295A，Q298*，G325R，T389K，M406K，V438I，R453H，D492H，K498I，V714M，Q809R，S846I，E928G，S1046N，R1089W，T1164A和D1194E中的至少一个(*指示终止密码子)。在一个实施方案中，突变指示存在选自下组的ErbB3癌症：胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌，结直肠癌，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)，肾癌，黑素瘤，卵巢癌，肺大细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)癌，肺癌和胰腺癌。
在一个其它实施方案中，变异是在ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的M60，V104，Y111，R153，R193，A232，P262，V295，G325，M406，R453，D492，K498，V714，Q809，R1089和T1164中的一个或多个处导致氨基酸替代的突变。在另一个实施方案中，替代是ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的M60K，V104M，V104L，Y111C，R153L，R193*，A232V，P262S，P262H，V295A，G325R，M406K，R453H，D492H，K498I，V714M，Q809R，R1089W和D1194E中的至少一个(*指示终止密码子)。在一个实施方案中，突变指示存在选自下组的ErbB3癌症：胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌，结直肠癌，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)，肾癌，黑素瘤，卵巢癌，肺大细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)癌，肺癌和胰腺癌。
在一个其它实施方案中，变异是在ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的V104，Y111，R153，A232，P262，G284，T389，R453，K498和Q809中的一个或多个处导致氨基酸替代的突变。在另一个实施方案中，替代是ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的V104L，V104M，Y111C，R153L，A232V，P262S，P262H，G284R，T389K，R453H，K498I和Q809R中的至少一个。在一个实施方案中，ErbB3突变指示存在胃肠癌。在另一个实施方案中，胃肠癌是胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌和结直肠癌中的一种或多种。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于M60。在另一个实施方案中，该替代为M60K。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于V104。在另一个实施方案中，该替代为V104L或V104M。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌或结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于V111。在另一个实施方案中，该替代为V111C。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于R135。在另一个实施方案中，该替代为R135L。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于R193。在另一个实施方案中，该替代为R193*。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于A232。在另一个实施方案中，该替代为A232V。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于P262。在另一个实施方案中，该替代为P262S或P262H。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌或胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于G284。在另一个实施方案中，该替代为G284R。在一个其它实施方案中，该突变指示肺癌(非小细胞肺(NSCLC)腺癌)或结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于V295。在另一个实施方案中，该替代为V295A。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于G325。在另一个实施方案中，该替代为G325R。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于M406。在另一个实施方案中，该替代为M406K。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于R453。在另一个实施方案中，该替代为R453H。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌或结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于K498。在另一个实施方案中，该替代为K498I。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于D492。在另一个实施方案中，该替代为D492H。在一个其它实施方案中，该突变指示肺癌(非小细胞肺(NSCLC)腺癌)的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于V714。在另一个实施方案中，该替代为V714M。在一个其它实施方案中，该突变指示肺癌(非小细胞肺(NSCLC)鳞癌)的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于Q809。在另一个实施方案中，该替代为Q809R。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于S846。在另一个实施方案中，该替代为S846I。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于R1089。在另一个实施方案中，该替代为R1089W。在一个其它实施方案中，该突变指示胃癌的存在。
在一个实施方案中，该ErbB3替代位于T1164。在另一个实施方案中，该替代为T1164A。在一个其它实施方案中，该突变指示结肠癌的存在。
在各种实施方案中，至少一处变异是ErbB3中的氨基酸替代，插入，截短，或删除。在一些实施方案中，变异是氨基酸替代。任何一处或多处这些变异可用于下文描述的任何检测、诊断和预后方法。
在一个实施方案中，本发明提供在受试者中检测指示癌症的体细胞突变的存在或缺失的方法，其包括：(a)使来自受试者的样品与能够检测ErbB3基因中体细胞突变的存在或缺失的试剂接触；并(b)测定该突变的存在或缺失，其中存在该突变指示该受试者罹患癌症或有风险形成癌症。
供该方法使用的试剂可以是寡核苷酸，DNA探针，RNA探针和核酶。在一些实施方案中，该试剂是经过标记的。标记物可包括例如放射性同位素标记物，荧光标记物，生物发光标记物或酶标记物。可充当可检测标记物的放射性核素包括例如I-131，I-123，I-125，Y-90，Re-188，Re-186，At-211，Cu-67，Bi-212和Pd-109。
还提供在受试者中检测指示癌症的体细胞突变的方法，其包括：在来自受试者的生物学样品中测定ErbB3基因中体细胞突变的存在或缺失，其中存在该突变指示该受试者罹患癌症或有风险形成癌症。在该方法的各种实施方案中，一处或多处体细胞突变的存在的检测通过选自下组的过程来进行：直接测序，突变特异性探针杂交，突变特异性引物延伸，突变特异性扩增，突变特异性核苷酸掺入，5'核酸酶消化，分子信标测定法，寡核苷酸连接测定法，尺寸分析和单链构象多态性。在一些实施方案中，在测定一处或多处突变的存在之前自样品扩增核酸。
本发明进一步提供在受试者中诊断或预后癌症的方法，其包括：(a)使来自受试者的样品与能够检测ErbB3基因中体细胞突变的存在或缺失的试剂接触；并(b)测定该突变的存在或缺失，其中存在该突变指示该受试者罹患癌症或有风险形成癌症。
本发明进一步提供在受试者中诊断或预后癌症的方法，其包括：在来自受试者的生物学样品中测定ErbB3基因中体细胞突变的存在或缺失，其中存在该遗传变异指示该受试者罹患癌症或有风险形成癌症。
本发明还提供在受试者中诊断或预后癌症的方法，其包括：(a)自受试者获得含有核酸的样品，并(b)分析该样品以检测ErbB3基因中至少一处体细胞突变的存在，其中存在该遗传变异指示该受试者罹患癌症或有风险形成癌症。
在一些实施方案中，该诊断或预后方法进一步包括对该受试者进行一种或多种别的针对癌症的诊断性测试，例如筛选一种或多种别的标志物，或对该受试者进行成像规程。
进一步涵盖的是，任何上述方法可进一步包括根据该方法的结果针对癌症治疗该受试者。在一些实施方案中，上述方法进一步包括在该样品中检测至少一处体细胞突变的存在。在一个实施方案中，第一体细胞突变的存在与至少一处别的体细胞突变的存在一起指示与具有该第一体细胞突变且缺乏该至少一处别的体细胞突变的存在的受试者相比升高的癌症风险。
还提供鉴定具有升高的癌症诊断风险的受试者的方法，其包括：(a)在来自受试者的生物学样品中测定ErbB3基因中第一体细胞突变的存在或缺失；并(b)测定至少一处别的体细胞突变的存在或缺失，其中存在该第一和至少一处别的体细胞突变指示该受试者具有与缺乏该第一和至少一处别的体细胞突变的存在的受试者相比升高的癌症诊断风险。
还提供在受试者中帮助诊断和/或预后癌症亚表型的方法，该方法包括在自受试者衍生的生物学样品检测编码ErbB3的基因中体细胞突变的存在。在一个实施方案中，该体细胞突变导致ErbB3氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的氨基酸替代G284R，而且该癌症亚表型特征至少部分在于表达G284R突变体ErbB3的细胞中不依赖HER配体的信号传导。在另一个实施方案中，该体细胞突变导致ErbB3氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中的氨基酸替代Q809R，而且癌症亚表型特征至少部分在于表达Q809R突变体ErbB3的细胞不依赖HER配体的信号传导。
本发明进一步提供预测受试者对靶向ErbB受体的癌症治疗剂的响应的方法，其包括在自该受试者获得的生物学样品中检测导致ErbB3氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中氨基酸变异的体细胞突变，其中存在该体细胞突变指示对靶向ErbB受体的治疗剂的响应。在一个实施方案中，该治疗剂是ErbB拮抗剂或结合剂，例如抗ErbB抗体。
可以使用本领域技术人员已知的某些方法来获得供上文描述的任何方法使用的生物学样品。可以自脊椎动物获得生物学样品，特别是哺乳动物。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织。可以自组织样品或自其它身体样品(诸如血液，血清，尿，痰，唾液，粘液和组织)检测靶核酸(或所编码的多肽)中的变异。通过筛选此类身体样品，可以对疾病诸如癌症实现简单早期诊断。另外，通过对此类身体样品测试靶核酸(或所编码的多肽)中的变异可以更加容易地监测疗法的进展。在一些实施方案中，自怀疑具有癌症的个体获得生物学样品。
在确定受试者或自受试者获得的生物学样品包含本文中公开的体细胞突变之后，涵盖的是，可以对受试者施用有效量的适宜癌症治疗剂以治疗受试者中的癌症。
还提供用于在哺乳动物中帮助诊断癌症的方法，其通过依照上文描述的方法在包含ErbB3中体细胞突变的核酸中检测一处或多处变异的存在来进行。
在另一个实施方案中，提供用于预测具有癌症的受试者是否会响应治疗剂的方法，其通过依照上文描述的方法测定受试者是否包含ErbB3中的体细胞突变来进行。
还提供用于评估受试者形成癌症的素因(predisposition)的方法，其通过在受试者中检测ErbB3中的体细胞突变的存在或缺失来进行。
还提供在哺乳动物中细分癌症的方法，该方法包括检测ErbB3中的体细胞突变的存在。
还提供鉴定在患者亚群中有效癌症的治疗剂的方法，该方法包括将药剂的功效与ErbB3中的体细胞突变的存在关联起来。
在适宜使，别的方法提供对于确定适宜临床干预步骤有用的信息。因此，在本发明方法的一个实施方案中，根据本文中公开的与癌症有关的ErbB3体细胞突变的存在或缺失的评估结果，该方法进一步包括临床干预步骤。例如，适宜干预可涉及预防和治疗步骤，或根据通过本发明的方法获得的遗传信息调整任何当时现行的预后或治疗步骤。
正如对本领域技术人员显而易见的，在本文描述的任何方法中，虽然检测到体细胞突变的存在会确实地指示疾病的特征(例如疾病的存在或亚型)，但是通过提供疾病的逆表征(reciprocal characterization)，没有检测到体细胞突变也会提供信息。
还有别的方法包括在哺乳动物中治疗癌症的方法，其包括下述步骤：自哺乳动物获得生物学样品，对该生物学样品检查本文中公开的ErbB3体细胞突变的存在或缺失，并在测定所述组织或细胞样品中该突变的存在或缺失之后，对所述哺乳动物施用有效量的适宜治疗剂。任选地，该方法包括对所述哺乳动物施用有效量的靶向癌症治疗剂。
还提供在已知存在ErbB3体细胞突变的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括对受试者施用有效治疗癌症的治疗剂。
还提供治疗具有癌症的受试者的方法，该方法包括对受试者施用先前在至少一项临床研究(其中将该药剂施用于至少5名各自具有ErbB3体细胞突变的人受试者)中显示有效治疗所述癌症的治疗剂。在一个实施方案中，对于至少5名受试者的群体，该至少5名受试者总共具有两处或更多处不同体细胞突变。在一个实施方案中，对于至少5名受试者的整个群体，该至少5名受试者具有相同的体细胞突变。
还提供在属于特定癌症患者亚群的受试者中治疗癌症的方法，其包括对受试者施用有效量的治疗剂(其批准作为用于所述亚群的治疗剂)，其中该亚群特征至少部分在于与ErbB3体细胞突变有关。
在一个实施方案中，该亚群属于欧洲人血统。在一个实施方案中，本发明提供一种方法，其包括制造癌症治疗剂，并将该药剂与关于将该药剂施用于具有或认为具有癌症且具有ErbB3体细胞突变的受试者的说明书包装在一起。
还提供为使用癌症治疗剂的治疗选择患有癌症的患者的方法，其包括检测ErbB3体细胞突变的存在。
可以将用于治疗癌症的治疗剂掺入组合物中，该组合物在一些实施方案中适合于制药用途。此类组合物通常包含肽或多肽和可接受的载体，例如药学可接受的载体。“药学可接受的载体”包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、等等(Gennaro,Remington:The science and practice ofpharmacy.Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.(2000))。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、Finger氏溶液、右旋糖溶液、和5％人血清清蛋白。也可使用脂质体和非水媒介诸如不挥发性油。除非常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则就涵盖其在组合物中的使用。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
可以通过任何合适手段来施用本发明的治疗剂(和任何别的用于治疗癌症的治疗剂)，包括胃肠外，肺内，鞘内和鼻内，以及，如果想要进行局部治疗的话，损害内施用。胃肠外输注包括例如肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是简短的还是长期的，可以通过任何合适路径来进行剂量给药，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射。本文中涵盖各种剂量给药方案，包括但不限于各个时间点上的单次或多次施用，推注施用和脉冲输注。
可以凭经验确定用于施用癌症治疗剂的有效剂量和方案，而且做出此类决定在本领域技术范围内。可采用单个或多个剂量。当采用癌症治疗剂的体内施用时，正常剂量的变化范围可以是约10ng/kg直至100mg/kg哺乳动物体重或更多每天，优选约1μg/kg/天至10mg/kg/天，取决于施用路径。文献中提供了关于具体剂量和投递方法的指南；参见例如美国专利No.4,657,760；No.5,206,344；或No.5,225,212。
本发明的一个方面提供治疗具有通过本文中描述的一处或多处体细胞突变鉴定的HER3/ErbB3癌症的个体的方法。在一个实施方案中，该方法包括对个体施用有效量的HER抑制剂的步骤。在另一个实施方案中，该HER抑制剂为结合HER受体的抗体。在一个优选的实施方案中，该抗体结合ErbB3受体。在一个实施方案中，该HER抗体为包含特异性结合HER3和至少一种别的HER受体的抗原结合域的多特异性抗体，诸如Fuh等的WO10/108127中记载的那些，通过述及完整收入本文。在一个实施方案中，通过HER抑制剂治疗的ErbB3癌症包含表达HER3的细胞。在一个实施方案中，通过HER抑制剂治疗的癌症为胃癌，结肠癌，食道癌，直肠癌，盲肠癌，结直肠癌，非小细胞肺(NSCLC)腺癌，NSCLC(鳞癌)，肾癌，黑素瘤，卵巢癌，肺大细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)，肝细胞(HCC)癌，肺癌和胰腺癌。
本发明的另一个方面提供在个体中抑制HER受体的生物学活性的方法，其包括对个体施用有效量的HER抑制剂。在一个实施方案中，该HER受体是由个体中的癌细胞表达的HER3受体。在另一个实施方案中，该HER抑制剂是HER抗体，其包含至少特异性结合HER3的抗原结合域。
本发明的一个方面提供HER抗体，其用作药物。本发明的另一个方面提供HER抗体，其用于制造药物。在一个实施方案中，该药物可用于治疗通过本文中描述的一处或多处体细胞突变鉴定的ErbB3/HER3癌症。在一个实施方案中，该药物用于抑制HER3受体的生物学活性。在一个实施方案中，HER抗体包含特异性结合HER3，或HER3和至少一种别的HER受体的抗原结合域。
另一方面，本发明提供数种不同类型的、适合于该治疗方法的HER抑制剂。在一个实施方案中，HER抑制剂选自曲妥单抗-一种结合ERBB2结构域IV的抗ERBB2抗体；帕妥珠单抗-一种结合ERBB2结构域II且阻止二聚化的ERBB2抗体；抗ERBB3.1-一种阻断配体结合(结合结构域III)的抗ERBB3；抗ERBB3.2-一种结合结构域III且阻断配体结合的抗ERBB3抗体；MEHD7945A-一种阻断配体结合(结合EGFR和ERBB3的结构域III)的双重ERBB3/EGFR抗体；西妥昔单抗(cetuximab)-一种阻断配体结合(结合EGFR的结构域III)的EGFR抗体；拉帕替尼(Lapatinib)-一种双重ERBB2/EGFR小分子抑制剂；和GDC-094148-一种PI3K抑制剂。
另一方面，本发明提供抗癌治疗剂，其用于在受试者中治疗ErbB3癌症的方法，所述方法包括(i)在自受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中氨基酸突变的存在或缺失，其中该突变导致ErbB3氨基酸序列(如本文中描述的)中至少一个位置处的氨基酸变化，其中存在该突变指示获得该样品的受试者中存在癌症；并(ii)如果在核酸序列中检测到突变的话，对受试者施用有效量的抗癌治疗剂。
组合疗法
涵盖的是，可以在方法中采用组合疗法。组合疗法可包括但不限于施用两种或更多种癌症治疗剂。通常在限定的时间段(根据选择的组合，通常为几分钟，几小时，几天或几周)上进行组合中的治疗剂的施用。组合疗法意图涵盖以序贯方式施用这些治疗剂，就是说，其中在不同时间施用每一种治疗剂，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂，或治疗剂中的至少两种。
可以通过相同路径或通过不同路径来施用治疗剂。例如，可以通过静脉内注射来施用组合中的ErbB拮抗剂，而通过口服来施用组合中的化疗剂。或者，例如，根据具体的治疗剂，可以通过口服来施用所有两种治疗剂，或可以通过静脉内注射来施用所有两种治疗剂。施用治疗剂的顺序也根据具体的药剂而变化。
一方面，本发明提供治疗通过本文中描述的一种或多种体细胞突变鉴定的、具有HER3/ErbB3癌症的个体的方法，其中该治疗方法包括施用超过一种ErbB抑制剂。在一个实施方案中，该方法包括施用ErbB3抑制剂(例如ErbB3拮抗剂)和至少一种别的ErbB抑制剂(例如EGFR，ErbB2，或ErbB4拮抗剂)。在另一个实施方案中，该方法包括施用ErbB3拮抗剂和EGFR拮抗剂。在一个其它实施方案中，该方法包括施用ErbB3拮抗剂和ErbB2拮抗剂。在还有另一个实施方案中，该方法包括施用ErbB3拮抗剂和ErbB4拮抗剂。在一些实施方案中，ErbB拮抗剂中至少一种是抗体。在另一个实施方案中，ErbB拮抗剂中每一种是抗体。
试剂盒
为了在上文描述或提议的应用中使用，还提供了试剂盒或制品。此类试剂盒可以包含载体手段，其被隔室化以紧密约束方式容纳一个或多个容器手段，诸如管形瓶、管等，每个容器手段装有要在所述方法中使用的分开成分之一。例如，所述容器手段之一可以装有可检测标记或能可检测标记的探针。此类探针可以是对包含本文中公开的与癌症有关的ErbB3体细胞突变的多核苷酸特异性的多核苷酸。若试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸，则所述试剂盒还可以具有装有用于扩增所述靶核酸序列的核苷酸的容器和/或装有与报告分子(诸如酶标记物、荧光标记物、或放射性同位素标记物)结合的报告手段(诸如生物素结合蛋白，诸如亲合素或链霉亲合素)的容器。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括本文中描述的一种或多种ErbB3癌症检测剂。在一个优选的实施方案中，试剂盒包括本文中描述的一种或多种ErbB3胃肠癌检测剂或一种或多种ErbB3肺癌检测剂。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包括本文中描述的治疗剂(例如ErbB3抑制剂)。
在其它实施方案中，试剂盒可包括能够检测包含本文中公开的与癌症有关的ErbB3体细胞突变的多肽的经标记药剂。此类药剂可以是结合该多肽的抗体。此类药剂可以是结合该多肽的肽。试剂盒可包括例如结合包含本文中公开的遗传变体的多肽的第一抗体(例如附着至固体支持物)；和任选的结合该多肽或该第一抗体任一且与可检测标记物缀合的第二不同抗体。
典型地，试剂盒会包括上文所描述的容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者观点看需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插页。容器上可以存在标签以指出所述组合物用于特定疗法或非治疗性应用，而且还可以指出体内或体外使用的用法，诸如那些上文所描述的。试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂诸如能被酶标记物化学改变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。
另一方面，本发明提供ErbB3癌症检测剂在制造用于在受试者中检测癌症的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，ErbB3癌症的检测包含在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中氨基酸突变的存在或缺失，其中该突变导致ErbB3氨基酸序列中至少一个位置处的氨基酸变化(如本文中描述的)，其中存在突变指示获得样品的受试者中存在癌症。
销售方法
本文中的发明还涵盖一种用于销售所公开的癌症诊断或预后方法的方法，包括向目标受众广告、讲授、和/或详细说明所公开的方法的用途。
销售指经由非个人媒体进行的、通常付费的通讯，其中发起人受到鉴别且信息受到控制。为本文中目的的销售包括宣传(publicity)、公共关系(public relations)、产品布置(product placement)、赞助(sponsorship)、保险(underwriting)等等。该术语还包括出现在任何印刷传播媒体中的商业信息公告。
可以通过任何手段来实现本文中诊断方法的销售。用于传递这些信息的销售媒体的例子包括电视、电台、电影、杂志、报纸、因特网、和告示板，包括商业性的，即出现在广播媒体中的信息。
所使用的销售的类型会取决于许多因素，例如待传达的目标受众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士、和患者，以及成本考虑和管理药物和诊断学的销售的相关管辖权法律和条例。可以根据由服务相互作用和/或其它数据(诸如用户人口统计状况和地理位置)限定的用户表征使销售个性化或用户化。
仅仅出于例示目的而提供下述实施例，并非意图以任何方式限制本发明的范围。
据此通过述及完整收录本说明书中引用的所有专利和参考文献。
实施例
实施例-人癌症中的致癌ERBB3突变
鉴于ERBB3在人癌症中的重要性，我们系统地调查了人癌症并鉴定了经常性体细胞突变，而且还显示了这些突变是转化性的。另外，我们在ERBB3突变体驱动的动物癌症模型中评估了靶向治疗，而且显示了它们大多数有效阻断ERBB3突变体驱动的癌发生。
材料和方法
肿瘤DNA，突变和基因组扩增
自商业来源获得得到适当同意的原代人肿瘤样品(图1)。研究中使用的人组织样品在使用它们之前去标识(双重编码)，因此认为使用这些样品的研究不是美国健康和人类服务部规章和相关指南(45CFR 46部分)下的人受试者研究。通过病理检查确认所使用的所有肿瘤中的肿瘤内容物>70％。使用Qiagen组织简易试剂盒(Qiagen，CA)提取肿瘤DNA。使用下文表1中列出的引物扩增ERBB3的所有编码外显子(Applied Biosystems，CA)。使用标准PCR条件使用两对引物(一对外部的和一对内部的)生成PCR产物以提高特异性(表1)，使用3730xl ABI测序仪测序。使用Mutation Surveyor(Softgenetics，PA)和别的自动化序列比对程序对测序数据分析dbSNP数据库中不存在的变体的存在。通过初始肿瘤DNA的DNA测序或质谱术分析(Sequenom，CA)确认鉴定出的推定变体，接着通过应用于肿瘤DNA的相似过程确认它在邻近匹配正常DNA中的缺失。图2和3中分别提供代表性正常ERBB3核酸和氨基酸序列。
细胞系
IL-3依赖性小鼠原B细胞系BaF3和MCF10A(一种乳腺上皮细胞)购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)。在补充有10％(v/v)胎牛血清(Thermo FisherScientific，IL)，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素(完全RPMI)和2ng/mL小鼠IL-3的RPMI 1640中维持BaF3细胞。在补充有5％(v/v)马血清，0.5μg/ml氢化可的松，100ng/ml霍乱毒素，10μg/ml胰岛素，20ng/ml EGF，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM:F12中维持MCF10A细胞。
质粒和抗体
使用逆转录病毒载体pRetro-IRES-GFP(Jaiswal,B.S.et al.Cancer Cell16,463-474(2009))稳定表达C端带FLAG标签的ERBB3野生型和突变体。使用快速变化定点诱变试剂盒(Stratagene，CA)生成研究中使用的ERBB3突变体。使用pLPCX逆转录病毒载体(Clontech，CA)(Schaefer et al.J Biol Chem274,859-866(1999))来表达表达全长ERBB2的逆转录病毒构建体，其中在去除天然分泌信号序列之后，将糖蛋白D(gD)N端标签的单纯疱疹信号序列或EGFR与gD编码序列融合，如先前用ERBB2进行的。
研究中使用识别pERBB3(Y1289)，pEGFR(Y1068)，pERBB2(T1221/2)，pAKT(Ser473)，pMAPK，总MAPK和AKT(Cell Signaling Technology，MA)，gD(Genentech Inc.，CA)，β-ACTIN和FLAG M2(Sigma Life Science，MO)的抗体和缀合有HRP的二抗(PierceBiotechnology，IL)进行Western印迹。
稳定细胞系的生成
使用Fugene 6(Roche，Basal)将编码野生型或突变体ERBB3-FLAG和gD-EGFR或gDERBB2的逆转录病毒构建体转染入Pheonix兼性细胞。然后将所得病毒转导入BaF3或MCF10A细胞任一。基于逆转录病毒IRES驱动的GFP表达通过流式细胞术无菌分选空载体，野生型或ERBB3突变体逆转录病毒感染的细胞任一的前10％，并通过Western印迹表征蛋白质表达。为了生成与EGFR或ERBB2一起表达ERBB3突变体的稳定系，用野生型EGFR或ERBB2病毒任一感染FACS分选的表达ERBB3野生型或突变体的细胞。然后用1μg/ml嘌呤霉素选择受到感染的细胞7天。然后在进一步的研究中使用这些细胞的集合。
存活和增殖测定法
将单独地或与EGFR或ERBB2一起地稳定表达野生型和突变体ERBB3的BaF3细胞在PBS中清洗2次，并在不含IL3的完全RPMI培养基中在96孔板中进行8复孔实验，平行实验3次。根据需要，然后用不同浓度的NRG1和抗NRG1抗体或不同ERBB抗体，酪氨酸激酶或PI3K小分子抑制剂处理细胞以测试它们对存活或细胞增殖的影响，符合图中描绘的。使用CellTiter-Glo发光细胞存活力试剂盒(Promega Corp.，WI)和Synergy 2(Biotek Instrument，CA)发光读板仪测定0h和120h时的存活细胞。所有细胞数的数值针对0h数值标准化。为了评估增殖，将稳定表达ERBB3-WT或突变体的MCF10A在PBS中清洗2次，在无血清培养基中在96孔板中分配5000个细胞，进行8复孔实验，平行实验3次，并容许增殖5天。在第0天和第5天使用发光细胞存活力试剂盒测量细胞数。所呈现的数据显示相对于第0天而在第5天时的存活的均值±SEM。均值和统计显著性是使用GraphPad V软件(GraphPad，CA)确定的。
免疫沉淀和Western印迹
为了评估细胞表面上表达的异二聚体ERBB3-ERBB2受体复合物的水平，在免疫沉淀之前，我们使用不能渗透膜的交联剂二(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酯(BS3)(该rmoscientific，IL)交联细胞表面蛋白质。将有或无配体(NRG1)处理的BaF3细胞在冷50mMHEPES pH 7.5和150mM NaCl中清洗2次，用HEPES缓冲液中的1mM BS3于4℃处理60min。通过将细胞用50mM Tris-Cl和150mM NaCl，pH 7.5清洗2次来终止交联。然后在裂解缓冲液I(50mM TrisHCl pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100)中裂解细胞。为了免疫沉淀，将经过澄清的裂解物与偶联有抗FLAG-M2抗体的珠(Sigma，MO)一起于4℃温育过夜。使用裂解缓冲液I将FLAG珠清洗3次。在SDS-PAGE加载缓冲液中煮沸保留在珠上的免疫沉淀的蛋白质，在4-12％SDS-PAGE(Invitrogen，CA)上解析，并转移到硝酸纤维素膜上。使用适宜的一抗，缀合有HRP的二抗和化学发光超级信号West Dura化学发光检测底物(ThermoFisher Scientific，IL)检测免疫沉淀的蛋白质或来自裂解物的蛋白质。
为了Western印迹研究，将MCF10A细胞进行血清饥饿，并在EGF或NRG1缺失下培养。类似地，对在IL-3缺失下培养的BaF3细胞评估ERBB受体和下游信号传导成分的状态。
邻近连接测定法
将连同ERBB2稳定表达野生型或P262H，G284R和Q809R ERBB3突变体的BaF3细胞系培养至亚汇合。将细胞用PBS清洗2次，并在无IL3的RPMI培养基中温育过夜。制备这些细胞的细胞旋转制备物，风干并用4％低聚甲醛固定15min，然后用PBS中的0.05％Triton透化10min。用Duolink封闭溶液(ENREF_40)(Soderberg et al.Nat Methods3,995-1000(2006))封闭60min后，将细胞与抗FLAG(家兔)和抗gD(小鼠)或抗ERBB3(小鼠)(Labvision，CA)和抗ERBB2(家兔)(Dako，Denmark)抗体任一一起于室温温育1hr。遵循制造商的方案(ENREF_40)(Soderberg et al.Nat Methods3,995-1000(2006))使用Duolink抗家兔+和抗小鼠-PLA探针和Duolink II检测试剂(Uppsala，Sweden)远红实施Duolink染色。使用Axioplan2，Zeiss显微镜和对DAPI和德州红适宜的滤光片以63倍物镜进行图像获取。对于信号的定量测量，在应用用户定义的阈后，用Duolink图像工具软件分析tiff图像文件。
集落形成测定法
将稳定表达EGFR(2x 105个)或ERBB2(50,000个)连同ERBB3野生型或突变体的BaF3细胞与2ml无IL3甲基纤维素(STEMCELL Technologies，Canada)混合，分配到6孔板上，并在指示时，在分配之前用不同ERBB抗体或酪氨酸激酶或PI3K小分子抑制剂处理细胞。然后将板于37℃温育2周。为了MCF10A集落形成，20,000个单独地或与EGFR或ERBB2组合地稳定表达ERBB3-WT或突变体的MCF10A细胞与0.35％琼脂在缺乏血清，EGF和NRG1的DMEM:F12中混合，并分配到0.5％基础琼脂上。然后将板于37℃温育3周。使用凝胶计数成像仪(Oxford Optronix Ltd，UK)评估集落的存在。然后使用凝胶计数软件(Oxford OptronixLtd，UK)对每块板中的集落数目定量。
三维形态发生或腺泡形成测定法
遵循先前记载的方案(Debnath et al.Methods 30,256-268(2003))在8孔腔室载玻片中在生长因子减少的Matrigel(BD Biosciences，CA)上接种单独地或与EGFR或ERBB2任一组合地稳定表达ERBB3野生型或突变体任一的MCF10A细胞。在第12-15天使用Zeiss显微镜使用10倍物镜对腺泡的形态发生拍照。
如先前记载的那样(ENREF_51)(Lee et al.Nat Methods4,359-365(2007))实施第13天3D培养物的完全提取，固定和免疫染色。简言之，在提取后，用甲醇-丙酮(1；1)固定腺泡，并用大鼠抗α6整联蛋白(Millipore，Billerica MA)，家兔抗Ki67(Vector Labs，Burlingame，CA)和DAPI染色。在研究中使用山羊抗大鼠Alexa Fluor 647(Invitrogen，CA)和山羊抗家兔Alexa Fluor 532(Invitrogen，CA)二抗。使用Leica SPE共焦显微镜用40倍油浸物镜实施共焦成像。
透孔迁移研究
在8μm透孔(transwell)迁移槽(Corning，#3422)上接种稳定表达空载体，野生型ERBB3或各种ERBB3突变体(50,000个细胞)的MCF-10A细胞。容许细胞在无血清测定培养基中迁移20h。使用棉签刮取膜上部上的细胞，并在3.7％(v/v)低聚甲醛中固定迁移细胞，并用0.1％结晶紫染色。在相差显微镜下以20倍放大倍数对每一个透孔拍摄5个不同视野的图像，然后对迁移细胞的数目计数。还通过Hoechst染料对核的染色验证得到的数目。计算在表达ERBB3突变体的细胞中观察到的迁移与表达野生型ERBB3的细胞相比的倍数增加，并用prism pad软件实施Student t检验以检验显著性。
动物研究
通过尾静脉注射将与ERBB2一起表达ERBB3野生型或突变体的BaF3细胞(2x106个)植入8-12周龄Balb/C裸鼠。为了体内抗体功效研究，在植入细胞后在第4天开始用40mg/kgQW抗豚草(对照)，10mg/kg QW曲妥单抗，50mg/kg QW抗ERBB3.1和100mg/kg QW抗ERBB3.2处理小鼠。每种处理注射总共13只动物。其中，10只小鼠跟踪存活，3只用于第20天尸检以通过骨髓，脾和肝的组织学分析来评估疾病进展。还通过FACS分析对自这些动物获得的骨髓和脾单细胞悬浮液分析GFP阳性BaF3细胞的存在和比例。在可能时，解剖存活研究中死的或垂死的动物以确认死亡原因。还对这些动物进行脾，肝和骨髓的形态学和组织学分析。在10％中性缓冲的福尔马林中固定骨髓，脾和肝，然后在自动化组织加工仪(组织Tek，CA)中进行加工，并在石蜡中包埋。将4微米厚切片用H&E(Sigma，MO)染色，并组织学分析浸润性肿瘤细胞的存在。在配有Nikon DS-R照相机的Nikon 80i复合显微镜上拍摄组织学照片。所有动物研究是在Genentech科研动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下实施的。
统计分析
所呈现的误差条代表均值±SEM。使用GraphPad Prism 5.00(GraphPadSoftware，San Diego，CA)使用Student氏t检验(双尾)进行统计分析以比较处理组。认为P值<0.05是统计显著的(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。对于Kaplan-Meier存活分析方法，使用时序检验统计来检验存活差异。
结果
ERBB3突变的鉴定
在对70份原发性结肠肿瘤连同它们的匹配正常样品实施全外显子组测序时，我们鉴定出ERBB3中的体细胞突变(Seshagiri,S.et al.Comprehensive analysis of coloncancer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin fusions.(Mansuscript in Preparation 2011))。为了进一步了解ERBB3突变在人实体瘤中的流行性，我们对由102份(70份来自全外显子组筛选的样品(ENREF_26)(Seshagiri,S.etal.Comprehensive analysis of colon cancer genomes identifies recurrentmutations and R-spondin fusions.(Mansuscript in Preparation 2011))和32份别的结肠样品)结直肠，92份胃，74份非小细胞肺(NSCLC)腺癌(腺)，67份NSCLC(鳞癌)，45份肾癌，37份黑素瘤，32份卵巢，16份肺大细胞，15份食道，12份小细胞肺癌(SCLC)，11份肝细胞(HCC)和9份其它癌症[4份肺癌(其它)，2份盲肠，1份肺(神经内分泌)，1份胰腺和1份直肠癌症]组成的总共512份人原发性肿瘤样品中的ERBB3编码外显子进行了测序(图1)。我们在12％的胃(11/92)，11％的结肠(11/102)，1％的NSCLC(腺；1/74)和1％的NSCLC(鳞状；1/67)癌中发现了改变蛋白质的ERBB3突变(图4)。虽然先前的研究报告了NSCLC(鳞状；0.5％[3/188])，成胶质细胞瘤(1％[1/91])，激素阳性乳腺癌(5％[3/65])，结肠(1％[1/100])，卵巢癌(1％[3/339])，及头和颈癌(1％[1/74])中零星的改变蛋白质的ERBB3突变，但是无一报告屡发的突变，也没有评估这些突变在癌症中的功能相关性(图4，及表2和3)。经由别的测序和/或质谱术分析，通过测试它们在初始肿瘤DNA中的存在和在匹配邻近正常组织中的缺失，我们确认了此研究中报告的所有突变都是体细胞的。除错义突变外，我们还发现了三处同义(不改变蛋白质)突变，结肠癌，胃癌和卵巢癌每种中一处。而且，在结肠肿瘤中，使用RNA-seq数据(ENREF_26)(Seshagiri,S.et al.Comprehensive analysis of coloncancer genomes identifies recurrent mutations and R-spondin fusions.(Mansuscript in Preparation 2011))，我们确认了这些样品中ERBB3突变体的表达和ERBB2的表达(图5)。
大多数突变主要在ECD区中聚簇，尽管一些定位至ERBB3的激酶域和胞内尾。有趣的是，在ECD突变体中有四个位置(即V104，A232，P262和G284)包含在多份样品间屡发的替代，指示这些是突变热点。在我们的分析中鉴定出的四个ECD热点位置中的两个(即V104和G284)先前报告分别在卵巢和肺(腺癌)样品中是突变的(Greenman et al.Nature 446,153-158(2007)；Ding et al.Nature 455,1069-1075(2008))。而且，每个热点位置处的大多数屡发错义替代导致相同的氨基酸变化，指示这些突变的潜在驱动作用。当我们将我们的数据与先前发表的结肠癌中的单一ERBB3突变(Jeong et al.International Journalof Cancer 119,2986-2987(2006))组合时，我们还鉴定出激酶域中的热点突变，S846I。
有趣的是注意到大多数鉴定出的突变残基在ERBB3直向同系物(在图6中显示，以及SEQ ID NO:131的C.lupus(XP_538226.2)序列)间是保守的且一些残基在ERBB家族成员间是保守的，这进一步提示这些突变有可能具有功能影响。
为了进一步了解突变，我们将它们定位至已发表的ERBB3ECD7和激酶域(Jura etal.Proceedings of the National Academy of Sciences 106,21608-21613(2009)；Shiet al.Proceedings of the National Academy of Sciences107,7692-7697(2010))晶体结构(图7和图8)。有趣的是，V104，A232和G284处的热点突变在结构域I/II界面中聚簇。这三个位点在结构域II和III之间的界面处的聚簇提示它们可能通过共同的机制来起作用。结构域II包含数个像椎骨一样排列的富含半胱氨酸的模块。已经给这些半独立特征间的相关性的小变化指派了在家族成员间的功能重要性(ENREF_30)(Alvarado et al.Nature461,287-291(2009))。V104/A232/G284突变可引起一个或多个这些模块移位和表型改变。P262处的突变位于结构域II的基部，接近涉及系留的、闭合的构象所需要的结构域II/IV相互作用的Q271。残基809和846处的激酶域突变与接近EGFR激酶结构中的C端尾(该区段已经指派了在胞吞中的作用)采取的路径的位置同源。图8中显示其它突变的位点。
ERBB3突变体促进MCF10A乳腺上皮细胞不依赖配体的增殖
MCF-10A乳腺上皮细胞需要EGF来进行增殖(Soule,H.D.et al.Cancer Res 50,6075-6086(1990)；Petersen et al.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 89,9064-9068(1992))。癌基因在MCF10A细胞中表达时能使得它们不依赖EGF(Debnath et al.The Journal of cell biology 163,315-326(2003)；Muthuswamy et al.Nat Cell Biol 3,785-792(2001))。为了了解ERBB3突变的致癌潜力，我们测试了ERBB3突变体的一个选集支持细胞转化和增殖的能力。通过在MCF10A细胞中进行稳定表达，我们对6种(V104M，A232V，P262H，P262S，G284R和T389K)ERBB3ECD突变体(包括4种ECD热点突变体和两种(V714M和Q809R)ERBB3激酶域突变体)测试了它们对细胞增殖，信号传导，腺泡形成，不依赖锚定的生长和迁移的影响。因为ERBB家族成员在信号传导和细胞转化中作为异二聚体发挥功能，所以通过与野生型(WT)EGFR或ERBB2进行共表达，我们还测试了ERBB3突变体的功能影响。我们发现ERBB3突变体在外源ERBB3配体NRG1或EGF缺失下在MCF10A中单独表达时显示出与ERBB3-WT相比不依赖配体的增殖(图9)，集落形成(图10)或信号传导激活状态标志物像pERBB3，pAKT和pERK(图11A)的非常小的增强或升高。然而，ERBB3突变体与EGFR或ERBB2组合的表达显示出与ERBB3-WT相比增殖和集落形成的显著升高(图9和图10)。另外，大多数ERBB3突变体与EGFR或ERBB2组合时导致pERBB3、pAKT和pERK升高(图11B和C)。
MCF10A细胞在EGF存在下在重建的三维(3D)基底膜凝胶培养物上培养时形成腺泡细胞球状体(Muthuswamy et al.Nat Cell Biol 3,785-792(2001)；Muthuswamy BreastCancer Research 13,103(2011))。然而，一些癌基因的表达能使得它们不依赖EGF，而且还导致复杂的多腺泡结构(Debnath et al.The Journal of cell biology 163,315-326(2003)；Brummer et al.Journal of Biological Chemistry 281,626-637(2005)；Bundyet al.Molecular Cancer 4,43(2005))。在缺乏血清，EGF和NRG1的3D培养物研究中，与共表达ERBB3-WT及EGFR或ERBB2的MCF10A细胞相比，ERBB3突变体与EGFR或ERBB2组合在MCF10A细胞中的异位表达促进大腺泡结构(图12A)。自共表达ERBB3突变体/ERBB2的MCF10细胞衍生的腺泡中Ki67(一种增殖标志物)的染色在测试的所有突变体中显示出增殖升高(图12B)。而且，与ERBB3-WT/ERBB2细胞相比，表达ERBB3-突变体/ERBB2的一个子集的相同MCF10A细胞也显示出迁移升高(图12C和图13A)。这些结果一起确认ERBB3突变体的致癌性质。
ERBB3突变体促进结肠上皮细胞不依赖锚定的生长
IMCE是永生化的小鼠结肠上皮细胞，它能通过表达致癌性Ras来转化(D’Abaco etal.(1996).Mol Cell Biol 16,884-891；Whitehead et al.(1993).PNAS 90,587-591)。我们使用IMCE细胞并通过单独地或与ERBB2组合地稳定表达ERBB3突变体对ERBB3突变体测试不依赖锚定的生长，信号传导和体内肿瘤发生。如图13B(a-b)中显示的，我们发现ERBB3-WT或突变体自身在表达时不促进不依赖锚定的生长。然而，与ERBB3-WT不同，大多数ERBB3突变体在与ERBB2共表达时促进不依赖锚定的生长(图13B(a-b))。与观察到的不依赖锚定的生长一致，大多数表达ERBB3突变体连同ERBB2的IMCE细胞显示出pERBB3和/或pERBB2升高及伴随的pAKT和/或pERK升高(图13B(c-d))。虽然一些ERBB3突变体自身显示出升高的ERBB3突变体，但是它不促进不依赖锚定的生长或下游信号传导。为了进一步确认ERBB3突变体的致癌活性，我们对表达数种热点ECD突变体的细胞测试了它们在体内促进肿瘤生长的能力。与它们支持不依赖锚定的生长和信号传导的能力一致，与WT不同，共表达ERBB3V104M，P262H或G284R连同ERBB2的IMCE细胞促进肿瘤生长(图13B(e))。
ERBB3突变体促进不依赖IL3的细胞存活和转化
为了进一步确认ERBB3突变的致癌意义，通过在IL-3依赖性BaF3细胞中单独地或与EGFR或ERBB2组合地进行稳定表达，我们对ERBB3突变体测试了它们对信号传导，细胞存活和不依赖锚定的生长的影响。BaF3是一种白介素(IL)-3依赖性原B细胞系，广泛用于研究基因的致癌活性和开发靶向致癌驱动物的药物(Lee et al.(2006).PLoS medicine 3,e485；Warmuth et al.(2007)Current opinion in oncology 19,55-60)。虽然ERBB3突变体在单独表达时很小地或不促进BaF3细胞不依赖IL-3的存活，但是它们在与EGFR-WT或ERBB2-WT组合共表达时比远比WT-ERBB3更加有效(图14和图15A，B)。ERBB3突变体在与ERBB2共表达时在促进不依赖IL-3的存活方面比与EGFR共表达时更加有效～10-50倍(图14)。这与先前显示在活化后形成的ERBB3-ERBB2异二聚体是细胞信号传导最有力的激活物之一的研究(Pinkas-Kramarski et al.The EMBO journal 15,2452-2467(1996)；Tzaharet al.Molecular and cellular biology 16,5276-5287(1996)；Holbro et al.PNAS100,8933-8938(2003))一致。有趣的是，Q809R激酶域突变体在与ERBB2或EGFR组合时在促进BaF3细胞不依赖IL-3的存活方面比测试任何ECD突变体都更加有效。与观察到的不依赖IL-3的细胞存活活性一致，大多数ERBB3突变体在单独地或与ERBB2或EGFR组合地表达时显示出升高的磷酸化，即活性ERBB受体的签名(图15A-C)。而且，ERBB3突变体在与ERBB2共表达时显示出与ERBB3-WT相比升高的p-ERBB2(Y1221/2)(图15C)。还有，与EGFR或ERBB2组合时，大多数ERBB3突变显示出升高的p-AKT和p-ERK水平，与ERBB3突变体的组成性下游信号传导一致(图15B，C)。在确立ERBB3突变体促进BaF3细胞不依赖IL3的存活的能力之后，我们接着调查了这些突变体促进不依赖锚定的生长的能力。我们发现与ERBB3-WT相比，与ERBB2组合稳定表达P262H，G284R和Q809R ERBB3-突变体的BaF3细胞促进强力的不依赖锚定的生长(图16)。虽然数种突变体在与EGFR一起表达时促进一些不依赖锚定的生长，但是效果不像与ERBB2组合时观察到的那样明显。这与先前确立ERBB2介导的致癌性信号传导需要ERBB3的报告一致(Holbro et al.PNAS 100,8933-8938(2003)；Lee-Hoeflich et al.CancerResearch 68,5878-5887(2008))。
使用BaF3系统通过单独地或与ERBB2组合地稳定表达ERBB3突变体对数种ERBB3ECD突变体(V104M，A232V，P262H，P262S，G284R和T389K)(包括6种ECD-热点突变体和4种ERBB3激酶域突变体(V714M，Q809R，S846I和E928G))测试它们对不依赖IL-3的细胞存活，信号传导和不依赖锚定的生长的影响。ERBB3是激酶受损的，而且在配体结合后它优先与ERBB2形成异二聚体以促进信号传导(Holbro et al.(2003)supra；Karunagaran et al.(1996).The EMBO journal 15,254-264；Lee-Hoeflich et al.(2008)supra；Sliwkowskiet al.(1994)supra)。与此一致，在外源配体缺失下，ERBB3野生型(WT)和ERBB3突变体自身不促进BaF3细胞不依赖IL-3的存活(图37A)。然而，在外源ERBB3配体缺失下，与ERBB3-WT不同，ERBB3突变体在与ERBB2共表达时促进不依赖IL3的BaF3细胞存活(图37A)，指示ERBB3突变体可能以不依赖配体的方式发挥功能。ERBB3突变体的细胞存活活性在它们与激酶无用型(KD)ERBB2K753M突变体共表达时消除，确认需要激酶活性型ERBB2(图37A)。我们进一步对ERBB3突变体调查了它们促进不依赖锚定的生长的能力。正如在存活测定法中观察到的，ERBB3突变体自身不支持不依赖锚定的生长(图37B)。然而，我们发现与表达ERBB3-WT/ERBB2的BaF3细胞相比，测试的大多数ERBB3-突变体在与ERBB2组合时促进不依赖锚定的生长(图37B-C)。确认了由ERBB3促进的不依赖锚定的生长依赖于ERBB2的激酶活性，因为ERBB3突变体在与ERBB2-KD组合时不促进集落形成(图37B-C)。BaF3细胞的Western印迹分析显示了与ERBB3-WT相比，ERBB3突变体的表达在与ERBB2组合时导致pERBB3，pERBB2，pAKT和/或pERK升高(图37D-F)。与缺失细胞存活活性或不依赖锚定的生长一致，ERBB3突变体自身或与ERBB2-KD组合时不显示升高的pERBB2和/或pAKT/pERK(图37D-F)，尽管ERBB3突变体自身显示出一些升高的pERBB3水平，这有可能是由于由BaF3细胞表达的内源ERBB2。与ERBB2组合时，与其弱信号传导一致，ERBB3V714M激酶域突变体只显示适度的细胞存活活性且不显示不依赖锚定的生长(图37A-C)。比较而言，与ERBB3-WT相比，活性最高的Q809R突变体在与ERBB2组合时显示出强力的下游信号传导(图37A-C)。
ERBB3突变体不依赖配体的致癌性信号传导
在试图了解ERBB3突变体促进致癌性信号传导的机制时，我们使用我们的BaF3系统测试了ERBB3突变体的配体依赖性。
为了确立ERBB3突变体的不依赖配体的信号传导，我们测试了它们在剂量渐增的抗NRG1抗体，ERBB配体中和性抗体下促进不依赖IL-3的BaF3存活的能力。我们发现添加NRG1中和性抗体(ENREF_39)(Hegde et al.Manuscript submitted(2011))对ERBB3-突变体促进不依赖IL-3的存活或不依赖锚定的集落形成的能力没有不利影响(图17)。与此一致，在细胞表面受体交联后实施的免疫沉淀中，我们发现了与共表达ERBB3-WT和ERBB2的BaF3细胞相比在配体缺失下ERBB3-突变体/ERBB2异二聚体水平升高的证据(图18)。这得到了进一步确认，即使用邻近连接测定法(ENREF_40)(Soderberg et al.Nat Methods 3,995-1000(2006))(图19和图20A-B)，在IL-3或NRG1缺失下培养的表达ERBB3-突变体/ERBB2的BaF3细胞中的细胞表面异二聚体水平与表达ERBB3-WT/ERBB2的细胞相比升高。这些数据提示ERBB3突变体在与ERBB2组合时能够以不依赖NRG1的方式促进BaF3的IL-3存活。
在确立了ERBB3突变体能不依赖配体进行信号传导之后，我们测试了它们的活性是否能通过添加配体得到提升。我们发现NRG1不能够支持单独表达ERBB3-WT或突变体的BaF3细胞的存活(图20C)。然而，在测试的最高浓度，以与表达ERBB3-WT/ERBB2的细胞相似的方式提高表达大多数ERBB3突变体连同ERBB2的BaF3细胞不依赖IL-3的存活(图21)。有趣的是，与WT ERBB3一样，A232V ERBB3突变体显示出NRG1剂量依赖性的、不依赖IL-3的存活应答(图21)。比较而言，与表达这些突变体的未处理细胞相比，G284R和Q809R在添加配体后没有显示存活的显著升高。G284R ECD和Q809R激酶域突变体对添加配体的最小限度响应提示这些突变体不依赖配体的模式的信号传导的支配性作用(图21)。与此一致，在添加配体之后，虽然P262H和WT ERBB3显示出升高的异二聚体形成，但是G284R ECD突变体和Q809R激酶域突变体只显示与未刺激细胞相比适度的异二聚体形成升高(图18)。这些结果显示虽然ERBB3突变体均能够进行不依赖配体的信号传导，但是它们中的一些俄仍然能够响应配体刺激。
为了进一步了解ERBB3突变体促进致癌性信号传导的机制，我们在我们的BaF3系统中通过用剂量渐增的ERBB3配体中和性抗NRG1抗体(Hegde et al.(2011)supra)处理这些细胞测试了ERBB3突变体的配体依赖性。我们发现添加NRG1中和性抗体(同上)对ERBB3-突变体促进不依赖IL-3的存活的能力没有影响(图37G)。在图37H中，ERBB3ECD突变体响应剂量渐增的外源NRG1显示升高的不依赖IL-3的BaF3存活。
在体内ERBB3突变体促进癌发生
我们和其他人显示了通过异位表达癌基因使得不依赖IL-3的BaF3细胞在植入小鼠时促进白血病样疾病且导致降低的总体存活(Horn et al.Oncogene 27,4096-4106(2008)；Jaiswal et al.Cancer Cell 16,463-474(2009))。我们对与ERBB2组合表达ERBB3-WT，ECD-突变体(P262H或G284R)或激酶域ERBB3-突变体(Q809R)的BaF3细胞测试了它们促进白血病样疾病的能力。使用单独用ERBB3-WT或用ERBB2与空载体一起转化的BaF3细胞作为对照。我们发现了移植有与ERBB2一起地表达ERBB3突变体的BaF3细胞的小鼠显示出22至27天的中值存活(图22)。比较而言，接受单独表达ERBB3-WT或一起表达ERBB2与空载体任一的BaF3细胞的小鼠在60天研究期结束时均活着。然而，接受共表达ERBB3-WT和ERBB2的BaF3细胞的动物形成白血病样疾病，具有显著更长的潜伏期(39天；图22)。虽然ERBB3-WT/ERBB2BaF3细胞在体外不显示IL-3不依赖性，但是它们在动物模型中的活性有可能是由于存在体内环境中能活化ERBB3-WT/ERBB2二聚体的生长因子和细胞因子及部分由于关于ERBB3-ERBB2异二聚体报告的配体依赖性信号传导(ENREF_43)(Junttila et al.CancerCell 15,429-440(2009))。为了跟踪疾病进展，我们在20天时对一个另外分组(每种处理3只小鼠)进行了尸检。对来自这些动物的骨髓，脾和肝样品审查病理学异常。因为BaF3细胞带有eGFP标签，所以我们通过荧光激活细胞分选(FACS)对分离的骨髓和脾检查了浸润性细胞。与降低的存活一致，与来自接受ERBB3-WT或ERBB2/空载体对照细胞的小鼠的骨髓和脾相比，来自移植有表达ERBB3突变体/ERBB2的细胞的小鼠的骨髓和脾显示出显著比例的浸润性eGFP阳性细胞(图23-26)。而且，与观察到的更长的潜伏期一致，在来自接受ERBB3-WT/ERBB2-WT细胞的动物的肝和脾中检测到非常低水平的浸润性eGFP阳性细胞。还有，在20天时来自ERBB3突变体/ERBB2分支的动物显示出与空载体对照或ERBB3-WT/ERBB2相比升高的脾(图25A和图27)和肝(图25B和图27)尺寸和重量，进一步确认存在浸润性细胞。另外，对苏木精和曙红(H&E)染色的骨髓，脾和肝切片的组织学评估显示出在20天时具有表达ERBB3-突变体/ERBB2的细胞的动物中有与对照相比显著的胚细胞浸润(图26)。这些结果证明ERBB3突变体的体内致癌潜力。
靶向疗法有效针对ERBB3 突变体
多种直接靶向ERBB受体的药剂已经批准用于治疗多种癌症(Baselga and SwainNature Reviews Cancer 9,463-475(2009)；Alvarez et al.Journal of ClinicalOncology 28,3366-3379(2010))。数种别的靶向ERBB家族成员(包括ERBB3)和它们的下游成分的候选药物处于临床测试和开发的各种阶段(ENREF_22)(Alvarez et al.Journal ofClinical Oncology 28,3366-3379(2010))。我们使用BaF3系统对曲妥单抗--一种结合ERBB2结构域IV的抗ERBB2抗体(ENREF_43)(Junttila et al.Cancer Cell 15,429-440(2009))，帕妥珠单抗--一种结合ERBB2结构域II且阻止二聚化的抗ERBB2抗体体(ENREF_43)(Junttila et al.Cancer Cell 15,429-440(2009))，抗ERBB3.1--一种阻断配体结合(结合结构域III)的抗ERBB3(ENREF_44)(Schaefer,G.et al.Cancer Cell(2011))，抗ERBB3.2--一种结合结构域III且阻断配体结合的抗ERBB3抗体(ENREF_45)(Wilson etal.Cancer Cell 20,158-172(2011))，MEHD7945A--一种阻断配体结合(结合EGFR和ERBB3的结构域III)的双重ERBB3/EGFR抗体(ENREF_44)(Schaefer,G.et al.Cancer Cell(2011))，西妥昔单抗--一种阻断配体结合(结合EGFR的结构域III)的EGFR抗体(ENREF_46)(Li,S.et al.Cancer Cell 7,301-311(2005))，拉帕替尼--一种双重ERBB2/EGFR小分子抑制剂(ENREF_47)(Medina,P.J.&Goodin,S.Clin Ther 30,1426-1447(2008))和GDC-0941--一种PI3K抑制剂(ENREF_48)(Edgar,K.A.et al.Cancer Research 70,1164-1172(2010))测试了它们对阻断细胞增殖和集落形成的影响(图28，图29和图30)。我们还对抗体的一个子集测试了体内功效(图31)。我们发现在增殖和集落形成测定法二者中，小分子抑制剂拉帕替尼针对所有突变体是相当有效的，而GDC-0941针对测试的所有突变体是有效的，只是在测试的剂量对Q809R只是部分有效(图28和29)。在集落形成测定法中测试的抗体中，曲妥单抗，抗ERBB3.2和MEHD7945A均是针对测试的所有突变体有效的(图28和29)。然而，帕妥珠单抗，抗ERBB3.1和GDC-0941虽然在阻断由ERBB3 ECD突变体诱导的集落形成和增殖方面非常有效，但是针对Q809R激酶域ERBB3突变体只是适度有效(图28和29)。与此一致，在体外在共表达突变体ERBB3和ERBB2的BaF3细胞中，在有效时，这些药剂阻断或降低pAKT和/或pERK水平，还有ERBB3和/或pERBB3的水平(图32和图33)。
我们还使用BaF3系统在体内针对G284R和Q809R ERBB3突变体测试了曲妥单抗，抗ERBB3.1和抗ERBB3.2(图31，34和35)。正如在体外观察到的，曲妥单抗在接受表达G284R或Q809R ERBB3/ERBB2的BaF3的小鼠中在阻断白血病样疾病方面非常有效(图31A)。类似地，抗ERBB3.1和抗ERBB3.2均在接受共表达G284R ERBB3-ECD和ERBB2的BaF3的小鼠中阻断白血病样疾病形成(图31A)。然而，这些抗ERBB3抗体在接受表达Q809R ERBB3/ERBB2的BaF3细胞的小鼠中在阻断疾病形成方面只是部分有效，尽管与未处理对照动物相比，它们显著改善存活(图31B)。与对靶向疗法观察到的功效一致，我们发现脾和骨髓中表达ERBB3突变体的浸润性BaF3细胞显著降低(图34和图36)。与观察到的降低的BaF3细胞浸润一致，脾和肝重量在Balb/C裸鼠预期的正常范围内(图35和图25)。这些数据指示处于开发中的或已经批准用于人的多种疗法能有效针对ERBB3突变体驱动的肿瘤。
在这项研究中，我们报告结肠和胃癌中频繁的ERBB3体细胞突变的鉴定。我们鉴定出的数个突变发生于多份独立样品，形成致癌突变特征性的热点。
这些体外和体内功能研究证明ECD和激酶域ERBB3突变二者的致癌性质。而且，使用配体滴定实验，我们显示一些ECD突变体(即V104M，P262H，Q284R和T389K)在ERBB3配体NRG1缺失下是致癌的同时，能通过添加NRG1来进一步刺激。相对于WT，ECD突变可引起系留和不系留ERBB3ECD之间的平衡朝向不系留构象变化。
在对数种治疗剂测试它们在体外和在体内靶向ERBB3突变体驱动的致癌信号传导的效用之后，我们发现多种小分子抑制剂，抗ERBB2和抗ERBB3ECD抗体在阻断测试的大多数ERBB3突变体所致致癌信号传导方面是相当有效的。有趣的是，帕妥珠单抗，抗ERBB3.1和GDC-0941在阻断激酶域突变体Q809R方面不那么有效，指示这种突变体有不同的作用模式。先前的研究显示了帕妥珠单抗在阻断配体介导的ERBB3/ERBB2二聚化方面相当有效，而曲妥单抗在阻断不依赖配体的ERBB2/ERBB3二聚体形成方面更加有效(ENREF_43)(Junttila,T.T.et al.Cancer Cell 15,429-440(2009))。与此一致，不响应配体的激酶域ERBB3突变体Q809R对曲妥单抗所致抑制的响应性比帕妥珠单抗高得多，提示无配体的异二聚体复合物在Q809R ERBB3信号传导中的潜在作用。虽然PI3K抑制剂GDC-0941对测试的大多数ERBB3突变体相当有效，但是它在阻断激酶域突变体Q809R方面降低的功效提示除PI3激酶外还涉及其它下游信号传导分子。
shRNA介导的ERBB3敲低影响体内生长
在IMCE细胞中确立了ERBB3突变体的致癌活性之后，我们试图测试在肿瘤细胞系中敲低ERBB3的影响。一项最新的研究报告了分别表达ERBB3E928G和V104M突变体的CW-2(一种结肠细胞系)和DV90(一种肺系)。我们使用先前已发表的打靶构建体(Garnett etal.(2012)Nature 483,570-575)生成了表达多西环素(doxycycline)(dox)可诱导的shRNA(其靶向ERBB3)的稳定CW-2和DV90细胞系。我们还生成了表达dox可诱导的萤光素酶(luc)打靶序列的对照系。在dox诱导后，与luc shRNA表达系形成对比，表达ERBB3shRNA的细胞中ERBB3和pERK的水平降低(图38A-B)。与dox诱导后ERBB3的损失一致，DV90和CW-2均显示出与萤光素酶shRNA系或未诱导系相比降低的不依赖锚定的生长(图38C-F)。我们接着测试了在DV90和CW-2细胞中敲低ERBB3是否可能影响它们在体内形成肿瘤的能力。在dox介导的对ERBB3打靶shRNA的诱导之后，我们发现DV90和CW-2细胞均显示出与携带表达luc-shRNA的DV90或CW-2细胞或未诱导表达ERBB3 shRNA的动物相比显著降低的肿瘤生长(图38G-J)。这些数据一起进一步确认ERBB3突变在肿瘤发生中的作用。

Claims (30)

1.一种ErbB3胃肠癌检测剂，其包含能够特异性结合ErbB3核酸序列中的ErbB3突变密码子的试剂，其中所述突变密码子编码SEQ ID NO:2中第284位处的氨基酸突变，且其中所述氨基酸突变为G284R。
2.权利要求1的癌症检测剂，其中所述ErbB3核酸序列包含SEQ ID NO:230或1。
3.权利要求1的癌症检测剂，其中所述试剂包含下式的多核苷酸
5’ Xa-Y-Zb 3’ 式I，
其中
X为与ErbB3核酸序列互补的核酸序列且a介于0和250之间；
Y为ErbB3突变密码子；且
Z为与ErbB3核酸序列互补的核酸序列且b介于0和250之间。
4.权利要求1的癌症检测剂，其中所述检测剂是用可检测标记物标记的。
5.权利要求4的癌症检测剂，其中所述可检测标记物选自放射性同位素标记物、荧光标记物、生物发光标记物、和酶标记物。
6.权利要求1的癌症检测剂，其中所述胃肠癌为胃癌或结肠癌。
7.能够检测编码ErbB3的核酸序列中的突变的试剂在制备供一种测定受试者中ErbB3胃肠癌存在情况的方法使用的试剂盒中的用途，其中所述试剂是权利要求1的ErbB3胃肠癌检测剂，其中所述方法包括在自该受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中所述突变导致ErbB3氨基酸序列的至少一个位置处的氨基酸变化且其中所述突变指示所述受试者中的ErbB3胃肠癌，其中所述导致氨基酸变化的突变位于SEQ IDNO:2的第284位，且其中所述氨基酸突变为G284R。
8.权利要求7的用途，其中所述方法进一步包括对所述受试者施用治疗剂。
9.权利要求8的用途，其中所述治疗剂为ErbB抑制剂。
10.权利要求9的用途，其中所述ErbB抑制剂选自下组：EGFR拮抗剂，ErbB2拮抗剂，ErbB3拮抗剂，ErbB4拮抗剂和EGFR/ErbB3拮抗剂。
11.权利要求10的用途，其中所述抑制剂为小分子抑制剂。
12.权利要求10的用途，其中所述拮抗剂为拮抗性抗体。
13.权利要求12的用途，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，人源化抗体和抗体片段。
14.权利要求7的用途，其中所述方法进一步包括(i)鉴定有需要的受试者和/或(ii)自有需要的受试者获得样品。
15.权利要求7的用途，其中所述检测包括突变的扩增或测序及突变或其序列的检测。
16.权利要求15的用途，其中所述扩增包括将扩增引物或扩增引物对与自所述样品分离的核酸模板混合。
17.权利要求16的用途，其中所述引物或引物对与接近或包括所述突变的区域互补或部分互补，且能够在所述核酸模板启动由聚合酶进行的核酸聚合。
18.权利要求16的用途，其中所述方法进一步包括在包含聚合酶和所述模板核酸的DNA聚合反应中延伸所述引物或引物对以生成扩增子。
19.权利要求15的用途，其中通过包括下述一项或多项的过程来检测所述突变：对自所述生物学样品分离的基因组DNA中的所述突变的测序，所述突变或其扩增子对阵列的杂交，限制酶对所述突变或其扩增子的消化，或所述突变的实时PCR扩增。
20.权利要求15的用途，其中所述方法包括自所述生物学样品分离的核酸中所述突变的部分或完全测序。
21.权利要求15的用途，其中所述扩增包括实施聚合酶链式反应(PCR)，逆转录酶PCR(RT-PCR)，或连接酶链式反应(LCR)，在所述PCR，RT-PCR，或LCR中使用自所述生物学样品分离的核酸作为模板。
22.能够检测编码ErbB3的核酸序列中的突变的试剂在制备供一种在有需要的受试者中治疗胃肠癌的方法使用的制品中的用途，其中所述试剂是权利要求1的ErbB3胃肠癌检测剂，其中所述方法包括：
a)在自所述受试者获得的生物学样品中检测编码ErbB3的核酸序列中的突变，其中所述突变导致ErbB3氨基酸序列中至少一个位置处的氨基酸变化，其中所述导致氨基酸变化的突变位于SEQ ID NO:2的第284位，其中所述突变指示所述受试者中的ErbB3胃肠癌，且其中所述氨基酸突变为G284R；并
b)对所述受试者施用治疗剂。
23.权利要求22的用途，其中所述治疗剂为ErbB抑制剂。
24.权利要求23的用途，其中所述ErbB抑制剂选自下组：EGFR拮抗剂，ErbB2拮抗剂，ErbB3拮抗剂，ErbB4拮抗剂和EGFR/ErbB3拮抗剂。
25.权利要求24的用途，其中所述拮抗剂为小分子抑制剂。
26.权利要求24的用途，其中所述拮抗剂为拮抗性抗体。
27.权利要求26的用途，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，人源化抗体和抗体片段。
28.权利要求7或22的用途，其中所述胃肠癌为胃癌或结肠癌。
29.权利要求7或22的用途，其中所述检测剂是用可检测标记物标记的。
30.权利要求29的用途，其中所述可检测标记物选自放射性同位素标记物、荧光标记物、生物发光标记物、和酶标记物。
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