MXPA05000403A

MXPA05000403A - Metodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra erbb2.

Info

Publication number: MXPA05000403A
Application number: MXPA05000403A
Authority: MX
Inventors: Stephen Michael Kelsey
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2005-07-22
Also published as: CN102295703A; WO2004008099A3; RU2008128244A; IL219381A; AU2003273218A1; JP2014237667A; CA2490758A1; EP1585966A2; CN101711866A; ES2376165T3; ATE535254T1; JP5678005B2; NO337855B1; JP2012232987A; CY1113260T1; WO2004008099A2; WO2004008099A8; IL165952A0; NZ537660A; HUP0600340A3

Abstract

Se identifican tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra HER2 al detectar la presencia de un complejo proteinico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 o de fosforilacion de HER2 en una muestra de celulas tumorales. Los pacientes que padecen de un tumor que comprende heterodimeros HER2/HER1 y/o HER2/HER3 y/o fosforilacian de HER2 se tratan con anticuerpos contra HER2 tales como rhuMAb 2C4.

Description

METODOS PARA IDENTIFICAR TUMORES QUE RESPONDEN AL TRATAMIENTO CON ANTICUERPOS CONTRA ErbB2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para identificar un tumor que responde al tratamiento con anticuerpos contra HER2 , asi como métodos para tratar a pacientes que padecen de dichos tumores . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia ErbB de las tirosinas cinasas receptoras son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencias celulares . La familia de receptores incluyen cuatro miembros distintos que incluyen receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR o ErbBl) , HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2) . EGFR, codificado por el gen erbBl ha sido relacionado causalmente en cánceres malignos humanos. En particular, se ha observado expresión aumentada de EGFR en cánceres de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago así como en glioblastomas . Con frecuencia se relaciona una expresión aumentada del receptor EGFR con una producción aumentada del ligando EGFR, de factor de crecimiento transformante (TGF- ) mediante las mismas células tumorales que resultan en activación del receptor por una vía estimuladora autocrina. Baselga y Mendelsohn ' Pharmac . Ther., Ref. 161027 6¡4:127-154 (1994). Además, se ha descrito una protelna relacionada con el receptor de factor de crecimiento epidérmico (ERRP) en donde un clon de un fragmento de ADNc de 1583 pares de bases con 90-95% de homología de secuencia con EGFR de ratón y EGFR de rata truncado (patente de E.U.A. número 6,399,743; y publicación de E.U.A. número 2003/0096373). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra EGFR o sus ligandos, TGF-a' y EGF, se han evaluado como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales cánceres malignos. Véase, por ejemplo, Baselga y Mendelsohn., supra; Masui et al., Cáncer Research, 44:1002-1007 (1984); y Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995). El segundo miembro de la familia ErbB, pl85neu, fue identificado originalmente como el producto del gen transformante a partir de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del neu proto-oncogen resulta de una mutación puntual (valina a ácido glutámico) en la región transmembranal de la proteína codificada. Se observa amplificación del homólogo humano de neu (HER2) en cánceres de mama y ovario y se relaciona con un pronóstico pobre (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244 ·.707-712 (1989) ; y patente de E.U.A. número 4,968,603) . Hasta la fecha, no se ha reportado para tumores humanos un análogo de mutación puntual a esta en el proto-oncogen neu. La sobreexpresión de ErbB2 (con frecuencia, pero no de manera uniforme debido a amplificación del gen) también se ha observado en otros carcinomas que incluyen carcinomas del estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroide, páncreas y vejiga. Véanse, entre otros, ing et al., Science, 229 : 974 (1985); Yokota et al., Lancet, 1.-?65-?6? (1986); Fukushigi et al., Mol. Cell Biol . , 6:955-958 (19869; Geurin et al., Oncogene Res., 3_:21-31 (1988) ; Cohén et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cáncer Res., 51:1034 (1991) ; Borst et al., Gynecol . Oncol . , 3_8:364 (1990); Weiner et al., Cáncer Res., _5J):421-425 (1990) ; Kern et al., Cáncer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cáncer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., : 354 _357 (1990) ; Aasland et al., Br. J. Cáncer, 5J7:358-363 (1988) ; Williams et al., Pathiobiology, 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cáncer, 65:88-92 (1990) . ErbB2 se sobreexpresa en cáncer de próstata (Gu et al., Cáncer Lett., 99:185-9 (1996) ; Ross et al., Hum. Pathol., 2_8:827-33 (1997) ; Ross et al., Cáncer, 79:2162-70 (1997); y Sdasivan et al., J. Urol . , 150:126-31 (1993) ) . La sobreexpresión de ErbB2 puede generar a crecimiento de tumor por medio de activación independiente de ligando de ErbB2 u homodímeros de ErbB2. Se han descrito anticuerpos dirigidos contra pl85neu de rata y productos proteínicos de ErbB2 humano. Drebin y colaboradores han generado anticuerpos contra el producto del gen neu de rata, pl85 neu. Véase, por ejemplo, Drebin et al., Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al . , Meth. Enzym. , 198:277-290 (1991) y 094/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) reporta que las mezclas de anticuerpo reactivas con dos regiones distintas de pl85neu resultan en efectos antitumorales sinergísticos en células NIH-3T3 transformadas con neu implantadas en ratones atímicos. Véase también la patente de E.U.A. número 5,824,311 expedida el 20 de octubre de 1998. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol . , 9 (3) :1165-1172 (1989) describe la generación de un panel de anticuerpos contra ErbB2 los cuales fueron caracterizados utilizando la linea de células de tumor de mama humano SK-BR-3. La proliferación de células relativas de las células SK-BR-3 después de la exposición a anticuerpos se determina por tinción con cristal violeta de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este ensayo, se obtiene inhibición máxima con el anticuerpo denominado 4D5 el cual inhibe la proliferación celular por 56%. Otros anticuerpos en el panel reducen la proliferación celular en menor medida en este ensayo. El anticuerpo 4D5 se encuentra adicionalmente que se sensibiliza la sobreexpresión de ErbB2 de líneas de célula de tumor de mama para los efectos citotóxicos de TNF- . Véase también la patente de E.U.A. número 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997. Los anticuerpos contra ErbB2 discutidos por Hudziak et al., se caracterizan adicionalmente en Fendly et al., Cáncer Research, .50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro, 26(3) : 59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, _l:72-82 (1991); Separd et al., J. Clin. Immunol., 11 (3) :117-127 (1991); umar et al., Mol. Cell . Biol . , 11 (2) :979-986 (1991); Lewis et al., Cáncer I nunol. T nonother. , 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cáncer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem.r 269(20) .-14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. , 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cáncer Research, 56:1457-1465 (1996); y Schaefer et al., Oncogene, ]J5: 1385-1394 (1997). Una versión humanizada recombinante de anticuerpo contra ErbB2 , 4D5 (huMAb4D5-8 , rhuMAb HER2 o HERCEPTINMR; Patente de E.U.A. número 5,821,337) es clínicamente activo en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan ErbB2 que ha recibido tratamiento anticancérigeno previo extenso (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996)). HERCEPTINMR ha recibido aprobación comercial de la Food and Drug Administration el 25 de septiembre de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyo tumores sobreexpresan la proteina ErbB2. No obstante, no todos los tumores que sobreexpresan ErbB2 responden a HERCEPTINMR (Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001)). Además, los datos preclínicos sugieren que HERCEPTIN™ puede ser terapéuticamente eficaz para tratar cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) . La proteína HE 2 se sobreexpresa en 20-.66% de los tumores NSCLC extirpados y se ha demostrado que predice un resultado pobre en pacientes con una serie múltiple (Azzoli, C.G. et al., Se in. Oncol., 29 (Suppl 4) :59-65 (2002)). Otros anticuerpos contra ErbB2 con diversa propiedades se han descrito en Tagliabue et al., Int. J. Cáncer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogen, 4:543-548 (1989); Maier et al., Cáncer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3_:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) , 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cáncer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cáncer, 5_3:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al., Cáncer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cáncer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cáncer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cáncer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol . Chem. , 267:15160-15167 (1992); Patente de E.U.A. número 5,783,186 y Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997) . El anticuerpo monoclonal 2C4 se describe en WO 01/00245, el cual se incorpora en la presente como referencia. Se ha demostrado que 2C4 interrumpe la dimerización de HER2 con otros miembros de la familia del receptor ErbB (WO 01/00245) . El cribado en búsqueda de homología ha resultado en la identificación de otros dos miembros de la familia del receptor ErbB; ErbB3 (patentes de E.U.A. números 5,183,884 y 5,480,968 asi como Kraus et al., PNAS (USA), ¡36:9193-9197 (1989)) y ErbB4 (Solicitud de patente EP número 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90 : 1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos de estos receptores muestran expresión aumentada en por lo menos algunas líneas de células de cáncer de mama. Los receptores ErbB generalmente se encuentran en diversas combinaciones en células y se considera que la heterodimerización incrementan la diversidad de respuestas celulares a una variedad de ligandos ErbB (Earp et al., Breast Cáncer Research and Treatment, 3_5:115-132 (1995)). No obstante no se ha comprendido por completo el mecanismo mediante el cual estos receptores de agregan y la manera en que contribuyen a la transmisión de señales (Brennan, P.J. et al., Oncogene, 19:6093-6101 (2000)). Se encuentra EGFR por seis ligandos diferentes; factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) , factor a de crecimiento transformante (TGF-a) , amfirregulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF, por sus siglas en inglés), betacelulina y epirregulina (Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). Una familia de proteínas de herregulina que resulta del empalme alternativo de un gen único son los ligandos para ErbB3 y ErbB4. La familia de herregulina incluye herregulinas a, ß y ? (Holmes et al., Science, 256 : 1205-1210 (1992); Patente de E.U.A. número 5,641,859; y Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)), factor de diferenciación neu ( DF, por sus siglas en inglés) , factores de crecimiento de la glia (GGF, por sus siglas en inglés) ; actividad inductora de receptor de acetilcolina (ARIA, por sus siglas en inglés) ; y factor derivado de neuronas sensitivas y motoras (SMDF, por sus siglas en inglés). Para una revisión, véase Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell. Neurosci., 2: 247'-262 (1996) y Lee et al., Pharm. Rev. , 47:51-85 (1995) . Recientemente se identificaron tres ligandos ErbB adicionales; neurregulina-2 ( RG-2) , el cual se ha reportado que se une ya sea a ErbB3 o ErbB4 (Chang et al., Nature, 387 :509-512 (1997); y Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 el cual une ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94 (18) : 9562-7 (1997)); y neurregulina-4 el cual une ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epirregulina también se unen a ErbB4. Aunque EGF y TGFa no -unen ErbB2, EGF estimula a EGFR y ErbB2 para formar un heterodímero, el cual activa EGFR y resulta en la transfosforilación de ErbB2 en el heterodímero. La dimerización o fosforilación parece activar la tirosina cinasa ErbB2. Véase Earp et al., supra. De igual manera, la herregulina no une ErbB2 , pero cuando ErbB3 se coexpresa con ErbB2 , se forma un complejo de señalización activo (Nagy et al., Cytometry, 3_2:120-31 (1998). Los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de interrumpir este complejo (Sliwkowski et al., «J. Biol . Chem. , 269(20) :14661-14665 (1994)). ErbB3 es defectuoso en tirosina cinasa y por lo tanto requiere heterodimerización, preferiblemente con ErbB2 , para capacidades de traducción de señal (Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1995)). De manera adicional, la afinidad de ErbB3 por herregulina (HRG) se incrementa a un estado de afinidad superior cuando se coexpresa con ErbB2. Véase también Levi et al . , Journal of Neuoscience, 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 92:1431-1435 (1995); y Lewis et al.. Cáncer Res., 56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteina ErbB2-ErbB3. En realidad, ErbB2 es el asociado de heterodimerización preferido para EGFR y ErbB3 (Graus-Porta et al., supra) . ErbB4, al igual que ErbB3 , forma un complejo de señalización activo con ErbB2 (Carraway y Cantley, Cell, 7_8 :5-8 (1994) ) . La heterodimerización dependiente de ligando de ErbB2 con EGFR o ErbB3 puede promover el crecimiento de tumores que expresan ErbB2. La expresión de los receptores ErbB y herregulina y el estado de fosforilación de HER2 se ha investigado en especímenes de tumor para pacientes con cáncer de mama primario y carcinoma de vejiga urinaria (Esteva et al., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow et al., Clin. Cáncer Res., 1_:1S51-1362 (2001)). Se ha reportado la relación entre la señalización activa a través de Her2/neu y la clinicopatología y el resultado de pacientes en cáncer de mama por Thor et al., J". Clin. Oncology, 18^:3230-3239 (2000) y DiGiovanna et al., Cáncer Res., 62:6667-6673 (2002). SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para identificar un tumor que responde al tratamiento con anticuerpo contra HER2. Preferiblemente, el anticuerpo contra HER2 bloquea la activación del ligando de un heterodimero Erb3 que comprende HER2. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 2C4, de manera más preferible r uMAb 2C4. Se obtiene una muestra del tumor en presencia de un complejo proteínico HER2/HER3 y/o HER2/HERI y/o HER2/HER4 que se detecta en la muestra. Se identifica a un tumor y se considera que es capaz de responder al tratamiento con anticuerpo contra HER2 cuando se detecta un complejo. En una modalidad, se detecta la presencia de un complejo por inmumoprecipitación de cualquiera de los complejos proteínicos que comprenden HER2, con anticuerpo contra HER . Los complejos inmunoprecipitados después se ponen en contacto con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3 , anticuerpos contra HERI y anticuerpos contra HER4, y se determina cualquier unión. Se detecta el complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 si se determina que los anticuerpos contra HER3 o contra HERI o contra HER4 se unen a los complejos inmunoprecipitados . En otra modalidad, se detecta la presencia de complejo proteínico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 al poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo contra HER2 que comprende un primer fluoróforo . La muestra de tumor después se pone en contacto con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3, contra HERI o contra HER4, en donde el anticuerpo comprende un segundo fluoróforo. Las mediciones de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia después se realizan para determinar si el primer fluoróforo y el segundo fluoróforo están en proximidad cercana. La presencia de un complejo proteínico HER2/HER3, HER2/HER1 o HER2/HER4 se detecta si el primero y segundo fluoróforo se determinan que están en proximidad cercana. En otra modalidad adicional, se detecta la presencia del complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 al poner en contacto la muestra de tumor con un primer compuesto de unión. El primer compuesto de unión comprende una primera porción de unión objetivo que une específicamente HER2. La primera porción de unión objetivo preferiblemente es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HER2. El primer compuesto de unión comprende además una porción detectable que se une al primer dominio de unión por un enlazante susceptible de ser separado. La muestra de tumor se pone en contacto con un segundo compuesto de unión. El segundo compuesto de unión preferiblemente comprende una segunda porción de unión objetivo que une específicamente HER3 , HERI o HER4 y que preferiblemente no une HER2. En otra modalidad, el segundo compuesto de unión une HER3 o HERI y no une HER2 o HER4. En una modalidad adicional, la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra HER3 , contra HERI o contra HER4. El segundo compuesto de unión es capaz de separar un enlazante susceptible de ser separado en el primer compuesto de unión ante activación y de esta manera producir una porción detectable libre si el compuesto de unión y el segundo compuesto de unión están en proximidad cercana. Se detecta la presencia de un complejo proteínico HER2/HER3 , HER2/HER1 o HER2/HER4 cuando se identifica la presencia de la porción detectable libre. En una modalidad, se identifica por electroforesis capilar la presencia de la porción detectable libre. En otra modalidad, el primer compuesto de unión comprende un primer dominio de unión objetivo que une específicamente HERI, HER3 o HER4 , y el segundo compuesto de unión comprende un segundo dominio objetivo que une específicamente HER2.

En otra modalidad, se detecta la presencia de complejo proteínico HER2/HER3 , HER2/HER1 o HER2/HER4 y la activación resultante de HER2 al determinar la fosforilación del receptor ErbB, por ejemplo por inmunoprecipitación de la proteina HER2 seguido por inmunodetección por transferencia Western de fosfotirosina . La muestra de tumor que se analiza para determinar la presencia de complejos proteínicos HER2/HER3, HER2/HER1 o HER2/HER4 preferiblemente se obtiene de un paciente que padece del tumor. La muestra se puede obtener, por ejemplo por biopsia. En otra modalidad, la muestra se obtiene al purificar células tumorales circulantes del paciente. En otra modalidad adicional, la muestra se obtiene durante cirugía para extirpar el tumor del paciente. En otra modalidad, la muestra de tumor se obtiene de un mamífero diferente al paciente que originalmente desarrolló el tumor. Preferiblemente, la muestra se obtiene a partir de un ratón u otro roedor. De manera más preferible, el tumor es un tumor xenoinj ertado . El tumor xenoinj ertado preferiblemente se produce al transplantar un fragmento, de un tumor humano adentro de un tumor u otro roedor. En una modalidad, el tumor es un tumor pulmonar, de maneras preferible un tumor de cáncer pulmonar de células no pequeñas. En otra modalidad, el tumor es un tumor mamario. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para identificar células tumorales que responden al tratamiento con un anticuerpo que inhibe la asociación de HER2 con otro miembro de la familia de receptores ErbB, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra biológica que comprende células tumorales positivas para HE 2 ; y (b) detectar la fosforilación de un receptor ErbB en la muestra biológica, en donde la fosforilación indica que las células tumorales son responsables del tratamiento con el anticuerpo. En una modalidad, se detecta la fosforilación de un detector ErbB2 (HER2) . Justo como en lo anterior, el otro miembro relacionado con HER2 es HER3 , HERI o HER4, tal como HER2 o HERI. El método adicionalmente comprende una etapa de detectar la presencia de un complejo protexnico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4, esencialmente como se describe en lo anterior. En otro aspecto, la invención se relaciona adicionalmente con un método para predecir la respuesta de un sujeto a quien se le ha diagnosticado con un tumor positivo a HER2, con un tratamiento que inhibe la asociación de HER2 con otro miembro de la familia de receptor ErbB, al detectar la formación de complejos proteínicos HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 o la fosforilación del receptor ErbB en una muestra biológica obtenida del sujeto, que comprende células tumorales positivas a HER2. La presencia de tales complejos proteínicos o la fosforilación indica que el sujeto probablemente responda al tratamiento con el anticuerpo. En una modalidad, la detección de la fosforilación del receptor ErbB2 (HER2) indica que el sujeto es probable que responda al tratamiento con el anticuerpo. En otra modalidad adicional, la invención se relaciona con un método para identificar a un sujeto que responde al tratamiento con anticuerpo contra HER2 al detectar fosforilación de un receptor ErbB en células tumorales circulantes del sujeto. La presencia de tal fosforilación indica que es probable que el sujeto responda al tratamiento con anticuerpo contra HER2. En una modalidad se detecta la fosforilación de ErbB2 (HER2) . En otra modalidad el sujeto es un humano. En otra modalidad adicional, el método comprende además tratar al sujeto con un anticuerpo contra HER2 preferiblemente rhuMAb 2C4. En otro aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo el cual une HER2 e instrucciones para administrar el anticuerpo a un paciente que padece de un tumor. Preferiblemente, el tumor se ha determinado que comprende heterodímeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4. En una modalidad, el recipiente comprende un anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2. En otra modalidad, el recipiente comprende un anticuerpo monoclonal 2C4, de manera más preferible, rhuMAb 2C4. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo el cual une HER2. Preferiblemente el paciente sufre de un tumor el cual se ha determinado que comprende los heterodímeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4. En una modalidad, el anticuerpo bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2. En otra modalidad, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal 2C4, de manera más preferible rhuMAb 2C4. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo el cual une HER2. Preferiblemente el paciente que padece de un tumor el cual se ha determinado que tiene receptor ErbB fosforilado. En una modalidad, el receptor ErbB fosforilado es HER2. En otra modalidad, el anticuerpo bloquea la activación del ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2. En otra modalidad adicional, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 2C3, de manera más preferible rhuMAb 2C4.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB muestran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios variable ligero (VL, por sus siglas en inglés) (figura 1A) y variable pesado (VH, por sus siglas en inglés) (figura IB) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 1 y 2 respectivamente) ; los dominios VL y VH. de 2C4 humanizado versión 574 (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 3 y 4 respectivamente) e infraestructuras de consenso VL y VH humanas (hum ??, subgrupo kappa ligero I; humIII, subgrupo pesado III) (SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 5 y 6 respectivamente) . Los asteriscos identifican diferencias entre 2C4 humanizado versión 574 y anticuerpo monoclonal murino 2C4 o entre 2C4 humanizado versión 574 y la infraestructura humana. Las regiones determinadoras de complementariedad (CDR) están entre corchetes. Las figuras 2A y 2B muestran el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4, el anticuerpo HERCEPTIN^ o anticuerpo contra EGFR en asociación dependiente de herregulina (HRG) de ErbB2 con ErbB3 en células MCF7 que expresan niveles baj os/normales de ErbB2 (figura 2A) y células SK-BR-3 que expresan altos niveles de ErbB2 (figura 2B) ; véase ejemplo 2 posteriormente. La figura 3 es una inmunotransferencia que muestra la presencia de heterodímeros HER1/HER2 , y HER2/HER3 en extractos proteínicos de explantes de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células no pequeñas . La figura 4 es una inmunotransferencia que muestra la presencia de fosforilación HER2 en extractos de proteína de explantes de xenoinjerto de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA La presente invención se basa en parte en el hallazgo experimental de que la capacidad de respuesta al anticuerpo contra HER2 rhuMAb 2C4, se relaciona con la presencia de heterodímeros HER2/HER3 , HER2/HER1 o HER2/HER4 y/o la fosforilación de un receptor ErbB en células tumorales. De esta manera, se puede identificar un tumor capaz de responder al tratamiento con un anticuerpo contra HER2 particularmente un anticuerpo contra HER2 que tiene una o más de las actividades biológicas del anticuerpo contra HER2 , 2C4, en base en la presencia de heterodímeros HER2/HER3, HER2/HER1 o HER2/HER4 , y la fosforilación de un receptor ErbB. Los heterodímeros HER2/HER3, HER2/HER1 o HER2/HER4 y la fosforilación de receptor ErbB se pueden identificar por cualquier método conocido en la técnica. Al identificar tumores específicos y tipos de tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra HER2, se pueden identificar pacientes quienes probablemente sean los más beneficiados con tal tratamiento. Además, se pueden identificar pacientes quienes probablemente no se beneficien del tratamiento con el anticuerpo monoclonal 2C4. Definiciones Un "receptor ErbB" es una proteína tirosina cinasa receptora la cual pertenece a la familia de receptores ErbB e incluye a los receptores EGPR (ErbBl) , ERRP, ErbB2 , ErbB3 y ErbB4 y otros miembros de esta familia que se identifiquen en el futuro. El receptor ErbB generalmente comprende un dominio extracelular, el cual puede unir un ligando ErbB; un dominio transmembranal lipofílico; un dominio de tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de transmisión de señal carboxilo terminal que alberga varios residuos tirosina los cuales pueden ser fosforilados . El receptor ErbB puede ser una "secuencia nativa" del receptor ErbB o una "variante de secuencia de aminoácidos" del mismo. Preferiblemente, el receptor ErbB es la secuencia nativa del receptor ErbB humano. El consecuencia, un "miembro de la familia de receptor ErbB" es EGFR (ErbBl), ErbB2 , ErbB3 o ErbB4 o cualquier otro receptor ErbB conocido actualmente o que se identifique en el futuro. Preferiblemente, el miembro es EGFR (ErbBl), ErbB2, ErbB3 o ErbB4. Los términos " ErbBl", "receptor de factor de crecimiento epidérmico", "EGFR" y "HERI" se utilizan en la presente de manera intercambiable y se refieren a EGFR como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al., Ann. Rev.

Biochem, 56:881-914 (1987), que incluye las formas imitantes que se presentan de manera natural del mismo (por ejemplo, un mutante por supresión de EGFR como en Humphrey et al . , PNAS (USA), ^7:4207-4211 (1990)). El término erbBl se refiere a un gen que codifica para el producto proteinico EGFR. Los anticuerpos contra HERI se describen, por ejemplo, en urthy et al., Arch. Biochem. Biophys . , 252 : 549-560 (1987) y en el documento WO 95/25167. El término "ERRP", "proteína relacionada con el receptor EGF", "proteína relacionada con EGFR" y "proteína relacionada con el receptor de factor de crecimiento epidérmico" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a ERRP como se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 6,399,743 y en la publicación de E.U.A. número 2003/0096373. Las expresiones "ErbB2" y "HER2 " se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Serriba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al., Natuxe, 319:230-234 (1986) (número de acceso Genebank X03363) . El término "erbB2" se refiere a un gen que codifica para ErbB2 humano y "neu" se refiere a un gen que codifica para pl85neu de rata. La forma preferida de ErbB2 es la secuencia nativa humana de ErbB2. Los términos " ErbB3" y "HER3" se refiere a un polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 5,183,884 y 5,480,968 así como Kraus et al., PNAS (USA), 86 : 9193-9197 (1989). Los anticuerpos contra ErbB3 se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. números 5,183,884, 5,480,968 y en WO 97/35885. Los términos " ErbB4" y "HER4" en la presente se refieren al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente EP número 599,274; Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90 : 1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), que incluye las isoformas del mismo, por ejemplo como se describe en WO 99/19488, publicada el 22 de abril de 1999. Los anticuerpos contra HER4 se describen, por ejemplo, en WO 02/18444. Los anticuerpos para receptores ErbB están disponibles comercialmente de muchas fuentes e incluyen, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, E.U.A. Mediante el término "ligando de ErbB" se quiere significar un polipéptido el cual se une a, o activa un receptor ErbB. El ligando ErbB puede ser una secuencia nativa del ligando ErbB humano tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. , 247:7612-7621 (1972) ) ; factor alfa de crecimiento transformante (TGF-c ( arquardt et al., Science, 223 : 1079-1082 (1984)); la amfirregulina también conocida como schwanoma o factor de crecimiento autocrino de queratinocitos (Shoyab et al., Science, 243 : 1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990); y Cook et al., Mol. Cell. Biol . , 11:2547-2557 (1991)), betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. , 190 : 1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico que se une a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251 : 936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. , 270 : 7495-7500 (1995); y omurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); una herregulina (véase posteriormente); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387 : 512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3 ) (Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 94:9562-9567 (1997)), neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18_:2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) ( annan et al., J. Biol. Chem., 272 (6) :3330-3335 (1997)). Los ligandos de ErbB los cuales unen EGFR incluyen EGF, TGF-a, amfirregulina, betacelulina, HB-EGF y epirregulina. Los ligandos de ErbB los cuales unen ErbB3 incluyen erregulinas . Los ligandos de ErbB capaces de unir ErbB4 incluyen betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y herregulinas. El ligando ErbB también puede ser un ligando ErbB sintético. El ligando sintético puede ser específico para un receptor ErbB particular, o puede reconocer complejos receptores de ErbB particulares. Un ejemplo de un ligando sintético es la quimera birregulina de herregulina/egf sintética (véase, por ejemplo. Jones et al., FEBS etters, 447 ;227-231 (1999) , la cual se incorpora en la presente como referencia) . La "herregulina" (HRG) cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polipeptido codificado por el producto del gen para herregulina como se describe en la patente de E.U.A. número 5,641,869 o Marchionni et al., iVature, 362:312-318 (1993) . Los ejemplos de herregulinas incluyen herregulina-a, herregulina-ß?, herregulina^2 y herregulina-ß3 (Holmes et al., Science, 256 : 1205-1210 (1992); y la patente de E.U.A. número 5,641,869); el factor de diferenciación neu ( DF) (Peles et al., Cell, 69 : 205-216 (1992)); receptor de acetilcolina que induce actividad (ARIA) (Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993)), factores de crecimiento glial (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neuronas sensitivas y motoras (SMDF) (Ho et al., J. Biol . Chem. , 270:14523-14532 (1995)); ?-herregulina (Schaefer et al., Oncogene, 15 : 1385-1394 (1997)). El término incluye fragmentos biológicamente activos o variantes de secuencias de aminoácidos de una secuencia nativa para el polipeptido HRG, tal como el dominio similar a EGF o un fragmento del mismo (por ejemplo HRG 1177-244) . Un "heterooligómero de ErbB" en la presente es un oligómero asociado de manera no covalente que comprende por lo menos dos receptores ErbB diferentes. Un "dímero ErbB" es un oligómero asociado de manera no covalente que comprende dos receptores ErbB diferentes. Tales complejos se pueden formar cuando una célula que expresa dos o más receptores ErbB se expone a un ligando ErbB. Los oligómeros de ErbB, tales como los dímeros de ErbB se pueden aislar por inmunoprecipitación y se pueden analizar por SDS-PAGE como se describe en Sliwkovski et al., J. Biol . Chem. , 269 (20) : 14661-14665 (1994) , por ejemplo. Ejemplos de tales hetero-oligómeros de ErbB incluyen complejos EGFR-ErbB2 (también denominado como HER1/HER2) , ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) y ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4) . Además, el hetero-oligómero ErbB puede comprender dos o más receptores ErbB2 combinados con un receptor ErbB diferente, tales como ErbB3, ErbB4 o EGFR (ErbBl) . Se pueden incluir en el hetero-oligómero otras proteínas tales como una subunidad receptora de citocina (por ejemplo gpl30) . Por "activación de ligando de un receptor ErbB" se quiere significar transducción de señal (por ejemplo, la causada por un dominio de cinasa intracelular de residuos de tirosina que fosforilan el receptor ErbB en el receptor de ErbB o un polipéptido sustrato) mediado por ligando ErbB que se une a un hetero-oligómero ErbB que comprende el receptor de ErbB de interés. Generalmente, este involucrará la unión de un ligando ErbB a un hetero-oligómero ErbB el cual activa un dominio cinasa de uno o más de los receptores ErbB en el hetero-oligómero y de esta manera resulta en la fosforilación de residuos tirosina en uno o más de los receptores ErbB o la fosforilación de residuos tirosina en uno o varios polipéptidos de sustrato adicionales. La activación del receptor ErbB se puede cuantificar utilizando diversos ensayos de fosforilación de tirosina. Un polipéptido de "secuencia nativa" es aquel el cual tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo un receptor de ErbB o un ligando de ErbB) derivados de la naturaleza. Tales secuencias polipeptídicas se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sintéticos . De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano que se presente de manera natural, un polipéptido murino o un polipéptido de cualquier otra especie de mamífero. El término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierta medida de un polipéptido de secuencia nativa. Habitualmente , las variantes de secuencias de aminoácidos poseerán por lo menos aproximadamente 70% de homología con por lo menos un dominio de unión de receptor de un ligando ErbB nativo o con por lo menos un dominio de unión de ligando de un receptor ErbB nativo, y preferiblemente serán por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 90% homólogos con tal receptor o dominios de unión de ligando . Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia nativa de aminoácidos . La "homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si es necesario, para obtener el por ciento máximo de homología. Se conocen en la técnica los métodos y programas de computadora para la alineación. Uno de tales programas de computadora es "Align 2" de autoría de Genentech Inc . , el cual se presentó con documentación de usuario en la oficina de derechos reservados de los Estados Unidos, Washington, DC 20559 el 10 de diciembre de 1991. El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en su sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) formados de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, en la medida en que muestren la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presenten de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal las cuales incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en la medida en que se pueden sintetizar no contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y que no se construye requiriendo la producción del anticuerpo por un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para ser utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden elaborar por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256 : 95 (1975) o se pueden elaborar por métodos de ADN recombxnante (véanse, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222 :581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de una o varias de las cadenas son idénticas y homologas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, en la medida en que muestren la actividad biológica deseada (patente de E.U.A. número 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 81 : 6851-6855 (1984) ) . Los anticuerpos quiméricos de interés incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias que unen antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo el mono del viejo mundo, el chimpancé, etc.), y secuencias de la región constante humanas. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que preferiblemente comprende la región que une antígeno o la región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab 1 , F(ab')2 y Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecxficos formados de uno o varios fragmentos de anticuerpo. Un anticuerpo "intacto" es aquel el cual comprende una región variable que une antígeno así como un dominio constante (CL) de cadena ligera y dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante en la secuencia de aminoácidos del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras . Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la unión Clq; la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión de receptor Fe; la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación por disminución de los receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B; BCR), etc. En base en la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas , los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases". Existen cinco clases mayores de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en "subclases" (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las clases diferentes de anticuerpos se les denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad son configuraciones tridimensionales de clases diferentes de inmunoglobulinas y son bien conocidas. La " citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotoxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (por ejemplo las células citoliticas naturales (Natural Killer (NK) ) , neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula objetivo y en consecuencia provocan lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan únicamente FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FCYRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resumen en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede llevar a cabo un ensayo de ADCC in vitro tal como el descrito en la patente de E.U.A. número 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y células citolíticas naturales (NK) . De manera alternativa o adicional, se puede determinar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo en un modelo animal tal como el que se describe en Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1988). Las "células efectoras humanas" son leucocitos los cuales expresan uno o más de los FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos FCYRIII y realizan la función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos los cuales median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células citoliticas naturales (NK) , monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose los PBMC y las NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo de sangre o de PBMC, como se describe en la presente. Los términos "receptor Fe" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo, el FcR preferido es FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno el cual se une a un anticuerpo IgG (un receptor ?) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor") , los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citopl smico . El receptor inhibidor FCYRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M. en Daéron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9_:457-92 (1991); Capel et al., Tmmunometiiods, 4:25-34 (1994); y Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs que incluyen aquellos que se identificarán en el futuro y están abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal FcRn, el cual es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117 : 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)). La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula a lisar un objetivo en presencia de complemento. La vía de activación de complemento se inicia por la unión del primer compuesto del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) que forma complejo con un antígeno semejante. Para determinar la activación de complemento se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202 : 163 (1996) . Los "anticuerpos nativos" habitualmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por medio de un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos aminoácidos particulares forman un contacto entre los dominios variables de cadena libera y de cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que algunas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre anticuerpos y se utiliza en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos . Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se les denominan regiones de infraestructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas nativas pesada y ligera comprenden, cada uno, cuatro FR, que adoptan principalmente una configuración en lámina ß, conectados por tres regiones hipervariables, las cuales forman bucles que se conectan, y en algunos casos que forman parte de la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por los FR, y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras tales como participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente, se refiere a residuos aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos aminoácidos de una "región determinadora de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-36 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Los residuos de la "región de infraestructura" o "ER" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se definen en la presente . La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos que unen antigeno denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina genera un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios que unen antígeno y que es capaz de reticular antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo el cual contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región consiste de un d mero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no' covalente estrecha. En esta configuración en donde las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. No obstante, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tienen la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad menor que la totalidad del sitio de unión. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab1 difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en la parte carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual uno o varios residuos cisteína de los dominios constantes presentan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se producen como pares de fragmentos Fab' los cuales tienen bisagras de cisteínas entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a dos tipos claramente diferentes denominados kappa (?= y lambda (?) en base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazante polipeptídico entre los dominios VH y VL el cual permite que el scFv forme la estructura deseada para unión de antígeno. Para una revisión de scFv véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Los fragmentos scFv del anticuerpo contra ErbB2 se describen en el documento O 93/16185; la patente de E.U.A. número 5,571,894; y la patente de E.U.A. número 5,587,458. El término "diacuerpos" (diabodies) se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos los cuales comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH - VL) . Al utilizar un enlazante que es demasiado corto para permitir el pareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a acoplarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/11161; y en Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:5444-6448 (1993). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el cual los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de infraestructura (F ) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá por lo menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales véase Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 33_2:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Los anticuerpos humanizados contra ErbB2 incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2 , huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN™) , como se describe en la tabla 3 de la patente de E.U.A. número 5,821,337 que se incorpora de manera expresa en la presente como referencia; los anticuerpos humanizados 520C9 (WO 93/21319) y el anticuerpo humanizado 2C4 se describen en la presente posteriormente. Un anticuerpo "aislado" es aquel en el cual ha sido identificado y separado o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales interfieren con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado: (1) en más de 95% en peso del anticuerpo, determinado por el método de Lowry, y de manera más preferible más de 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante uso de un secuenciador de copa giratorio, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o preferiblemente tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes dado que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. No obstante, de manera habitual el anticuerpo aislado se preparará por al menos una" etapa de purificación. Un anticuerpo "el cual se une" a un antigeno de interés, por ejemplo el antigeno ErbB2 , es aquel capaz de unir dicho antígeno con afinidad suficiente de manera que el anticuerpo sea útil en dirigir una célula que expresa el antígeno. Cuando el anticuerpo es uno el cual une ErbB2, habitualmente de manera preferencial une ErbB2 en oposición a \ otros receptores ErbB, y puede ser uno el cual no de reacción cruzada significativa con otras proteínas tales como EGFR, ErbB3. o ErbB4. En tales modalidades, el grado de unión del anticuerpo para estas proteínas diferentes de ErbB2 (por ejemplo la unión de superficie celular a receptor endógeno) será menor de 10% determinado por análisis de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) o por radioinmunoprecipitación (RIA, por sus siglas en inglés) . Algunas veces, el anticuerpo contra ErbB2 no dará reacción cruzada significativa con la proteína neu de rata, por ejemplo como se describe en Schecter et al., Nature, 312:513 (1984) y Drebin et al., Nature, 312 : 545-548 (1984) . Un anticuerpo el cual "bloquea" la activación de ligando de un receptor ErbB es aquel el cual reduce o evita tal activación como se define en lo anterior, en donde el anticuerpo es capaz de bloquear la activación de ligando del receptor ErbB de manera sustancialmente más eficaz en -comparación con el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, aproximadamente tan eficaz como los anticuerpos monoclonales 7F3 o 2C4 o los fragmentos Fab de los mismos y de manera preferible aproximadamente tan eficaz como el anticuerpo monoclonal 2C4 o un fragmento Fab del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB puede ser uno el cual es aproximadamente 50-100% más eficaz que 4D5 para bloquear la formación de un heterooligómero ErbB. El bloqueo de activación de ligando de un receptor ErbB puede producirse por cualquier medio, por ejemplo, por interferencia con: unión de ligando a un receptor ErbB, formación de un complejo ErbB, actividad de tirosina cinasa de un receptor ErbB en un complejo de ErbB o fosforilación de uno o varios residuos de tirosina cinasa en o por un receptor ErbB. Los ejemplos de anticuerpos los cuales bloquean la activación de ligando de un receptor ErbB incluyen anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 (los cuales bloquean la activación de HRG de los hetero-oligómeros ErbB2/ErbB3 y ErbB2/ErbB4 ; y la activación de EGF, TGF-o¡, amf rregulina, HB-EGF o epirregulina de un hetero-oligómero EBGR/ErbB2) ; y los anticuerpos L26, L96 y L288 (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)), los cuales bloquean la unión EGF y NDF a células T47D las cuales expresan EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4. Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado, tal como el anticuerpo monoclonal designado 2C4, es aquel el cual posee una o más características biológicas de ese anticuerpo las cuales lo diferencian de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno (por ejemplo ErbB2) . Por ejemplo, un anticuerpo con característica biológica de 2C4 puede bloquear la activación de HRG de un hetero-oligómero ErbB que comprende ErbB2 y ErbB3, ErbBl o ErbB4 ; bloquear la activación de EGF, TGF-a, HB-EGF, epirregulina o amfirregulina de un receptor ErbB que comprende EGFR y ErbB2 ; bloquear la activación de EGF, TGF-a o la activación mediada por HRG de ????; o unir el mismo epítopo en el dominio extracelular de ErbB2 que el encontrado por 2C4 (por ejemplo el cual bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2) .

A menos que se indique de otra manera, la expresión "anticuerpo monoclonal 2C4" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de unión a antígeno o que se deriva del anticuerpo 2C4 murino de los ejemplos siguientes. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 2C4 puede ser un anticuerpo monoclonal murino 2C4 o una variante del mismo, tal como el anticuerpo 2C4 humanizado, que posee residuos de aminoácidos que unen antigeno de anticuerpo monoclonal murino 2C4. Los ejemplos de anticuerpos 2C4 humanizados se proporcionan en la presente y en el documento WO 01/00245, el cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. A menos que se indique de otra manera, la expresión "rhuMAb 2C4" cuando se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias ligera variable (VL) y pesada variable (VH) de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS 3 y 4, respectivamente, fusionadas a las secuencias de la región constante IgGl ligera y pesada humana (alotipo diferente de A) que opcionalmente se expresan por células de ovario de hámster chino (CHO) . A menos que se indique de otra manera, el término "anticuerpo monoclonal 4D5" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de unión a antígeno o que se deriva del anticuerpo 4D5 murino (ATCC CRL 10463) . Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser anticuerpo monoclonal murino 4D5 o una variante del mismo, tal como 4D5 humanizado, que posee residuos de unión de antígeno de anticuerpo monoclonal murino 4D5. Los anticuerpos 4D5 humanizados ejemplares incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3 , huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPT N^) como en la patente de E.U.A. número 5,821,337 y se prefiere huMAb4D5-8 (HERCEPTIN") como el anticuerpo 4D5 humanizado . Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición la cual" inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa ErbB ya sea in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno el cual reduzca significativamente el porcentaje de ErbB que expresa células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente de la fase S) tales como agentes que inducen la supresión de la fase Gl y la supresión de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores topo II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que supriman Gl también se dispersarán en supresión en la fase S, por ejemplo agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, meelorret mina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Se puede encontrar información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds, Chapter 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p.13. Los ejemplos de anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos los cuales se unen a ErbB2 e inhiben el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. Los anticuerpos contra ErbB2 inhibidores de crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de células de tumor de mama SK-BR-3 en cultivo celular en más de 20%, y preferiblemente más de 50% (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µ?/p??, en donde la inhibición de crecimiento se determina seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (véase la patente de E.U.A. número 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997). El ensayo de inhibición de crecimiento de células SK-BR-3 se describe con mayor detalle en esa patente y en este documento posteriormente. El anticuerpo preferido inhibidor de crecimiento es el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo 4D5 humanizado. Un anticuerpo el cual "induce la muerte celular" es aquel que provoca que una célula viable se vuelva no viable. La célula generalmente es aquella la cual expresa el receptor ErbB2 , especialmente cuando la célula sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferiblemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo una célula de mama, ovario, estomago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, una célula pancreática o de vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SK0V3. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia de complemento y células efectoras inmunológicas para diferenciar muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De esta manera, el ensayo para la muerte celular se puede realizar utilizando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunológicas. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir muerte celular, se evalúa la pérdida de integridad de membrana por captación de yoduro de propidio (PI, por sus siglas en inglés), azul de tripán (véase Moore et al., Cytotechnology, 17:1-11 (1995) o 7AAD en relación a células no tratadas . Los anticuerpos que inducen muerte celular preferidos son aquellos los cuales inducen captación de PI en el ensayo de captación de PI en células BT474 (véase abajo) . Un anticuerpo el cual "induce apoptosis" es aquel el cual induce muerte celular programada determinada por unión de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular o formación de vesículas de membrana (denominados cuerpos apoptósicos) . La célula habitualmente es aquella la cual sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferiblemente, la célula es una célula tutnoral, por e emplo una célula de mama, ovario, estomago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, una célula pancreática o de vesícula. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453 , MDA-MB-361 o SK0V3. Están disponibles diversos métodos para evaluar los sucesos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, se puede medir el desplazamiento de fosfatidilserina (PS, por sus siglas en inglés) mediante la unión de anexína; se puede evaluar la fragmentación de ADN a través de la reconstitución de la cadena doble (laddering) de ADN; y condensación nuclear/cromatina junto con fragmentación de ADN por un incremento en células hipodiploides . Preferiblemente, el anticuerpo el cual induce apoptosis es uno el cual resulta en una inducción de aproximadamente 2 a 50 veces, de manera preferible aproximadamente 5 a 50 veces, y de manera más preferible aproximadamente 10 a 50 veces de inducción de unión de anexina en relación con una célula no tratada en un ensayo de unión de anexina utilizando células BT474 (véase abajo) . Algunas veces el anticuerpo proapotosxco será uno el cual bloquee adicionalmente la activación del ligando ErbB de un receptor ErbB (por ejemplo un anticuerpo 7F3) ; es decir, el anticuerpo comparte una característica biológica con el anticuerpo monoclonal 2C4. En otras situaciones, el anticuerpo es uno el cual no bloquea de manera significativa la activación del ligando ErbB de un receptor ErbB (por ejemplo 7C2) . Además, el anticuerpo puede ser uno similar a 7C2 el cual, aunque induce apoptosis, no induce una reducción grande en el por ciento de células en fase S (por ejemplo, uno el cual únicamente induce aproximadamente una reducción de 0-10% en el por ciento de estas células en relación al control) . El "epítopo 2C4" en la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se une el anticuerpo 2C4. Con el fin de cribar buscando anticuerpos que se unan al epítopo 2C4, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado sistemático tal como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) . De manera alternativa, se puede utilizar un mapeo de epítopos para determinar si el anticuerpo se une al epítopo 2C4 de ErbB2 (por ejemplo, cualquiera de uno o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 22 a aproximadamente el residuo 584 de ErbB2 , inclusive; véanse las figuras 1A-B) . El "epítopo 4D5" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) . Este epítopo está cercano al dominio transmembranal de ErbB2. Para cribar en busca de anticuerpos que se unen al epltopo 4D5, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado sistemático tal como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) . De manera alternativa, se puede realizar un mapeo de epítopo para determinar si el anticuerpo se une al epítopo 4D5 de ErbB2 por ejemplo cualquiera de uno o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 529 a aproximadamente el residuo 625, inclusive; véanse figuras 1A-B) . El "epítopo 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se une el anticuerpo 3H4. Este epítopo incluye los residuos desde aproximadamente 451 hasta aproximadamente 599, inclusive, en la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular ErbB2; véanse las figuras 1A-B . El "epítopo 7C2/7F3" es la región en la parte N terminal del dominio extracelular de ErbB2 a la cual se unen los anticuerpos 7C2 o 7F3 (cada una depositada ante el ATCC, véase abajo) . Para realizar un cribado para encontrar los anticuerpos que se unen al epítopo 7C2/7F3, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado sistemático tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) . De manera alternativa, se puede realizar un mapeo de epítopos para establecer si el anticuerpo se une al epitopo 7C2/7F3 en ErbB2 (por ejemplo cualquiera de uno o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 22 a aproximadamente el residuo 53 de ErbB2 , véanse figuras 1A-B) . El término "mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye a humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológicos, de caza o mascotas tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano. Un tumor el cual "responde al tratamiento" muestra una mejoría estadísticamente significativa en respuesta al tratamiento con anticuerpos contra ErbB cuando se compara a la carencia de tratamiento o el tratamiento con placebo en un modelo animal reconocido o un ensayo clínico humano, o el cual responde al tratamiento inicial con anticuerpos contra ErbB pero crece conforme continúa el tratamiento. El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a medidas de tratamiento terapéutico profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es evitar o frenar (disminuir) un cambio fisiológico no deseado o un trastorno tal como el desarrollo o diseminación del cáncer. Para propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a alivio de los síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeore) , retraso o frenado del progreso de la enfermedad, disminución o paliación del estado de enfermedad y remisión (parcial o total) detectable o indetectable . El término "tratamiento" también significa prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen a los que ya se encuentran con la condición o el trastorno así como aquellos susceptibles a tener la condición o el trastorno o aquellos en los cuales debe evitarse dicha condición o trastorno. Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficia del tratamiento de la presente invención. Esto incluye desórdenes o enfermedades, crónicas y agudas, que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de desórdenes a ser tratados en la presente incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y cánceres malignos linfoides, en particular cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, pancreático, prostático o de vejiga; desórdenes neuronales, de la neuroglia, astrociticos , hipotalámicos y otros desórdenes glandulares, de los macrófagos, epiteliales, estromáticos y blastocélicos , así como desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos . Un trastorno preferido para ser tratado de acuerdo con la presente invención es un tumor maligno. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un medicamento eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, frenar en cierta medida y preferiblemente detener) la infiltración de las células cancerosas a órganos periféricos; inhibir (es decir, disminuir en cierta medida y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento del tumor; o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el medicamento puede evitar el crecimiento o destruir a las células cancerosas existentes, puede ser citostático o citotóxico. Para tratamiento de cáncer, se puede medir la eficacia, por ejemplo, al determinar el tiempo de progreso de la enfermedad ( PP, por sus siglas en inglés) o al determinar la tasa de respuesta ( R, por sus siglas en inglés) . Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente está caracterizada por crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o cánceres malignos linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas ("NSCLC", por sus siglas en inglés) , adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene así como cáncer de cabeza y cuello. Un "cáncer que expresa ErbB" es aquel que comprende células las cuales tienen proteína ErbB presente en su superficie celular. Un "cáncer que expresa ErbB2" es aquel el cual produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de las células del mismo, de manera tal que un anticuerpo contra ErbB se puede unir al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Un cáncer "caracterizado por activación excesiva" de un receptor ErbB es aquel en el cual el grado de activación del receptor ErbB en células cancerosas excede de manera signi icativa del nivel de activación de dicho receptor en células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Tal activación excesiva puede resultar de la sobreexpresion del receptor ErbB o niveles mayores a los normales de un ligando de ErbB disponible para activar el receptor ErbB en las células cancerosas. Tal activación excesiva puede provocar o puede ser causada por el estado maligno de una célula cancerosa. En algunas modalidades, el cáncer se someterá a un diagnóstico o un ensayo de pronóstico para determinar si la amplificación o sobreexpresion de un receptor de ErbB se está presentando, lo que resulta en tal activación excesiva del receptor ErbB. De manera alternativa o adicional, el cáncer se puede someter a un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si la amplificación o sobreexpresion de un ligando ErbB se presenta en el cáncer el cual se atribuye a activación excesiva del receptor. En un subconjunto de tales cánceres, la activación excesiva del receptor puede resultar de una vía estimuladora autocrin . En una vía estimuladora "autocrina", se produce la estimulación propia en virtud de que la célula cancerígena produce tanto el ligando ErbB como su receptor ErbB asociado. Por ejemplo, el cáncer puede expresar o sobreexpresar EGF y también puede expresar o sobreexpresar un ligando para EGFR (por ejemplo EGF, TGF-a o HB-EGF) . En otra modalidad, el cáncer puede expresar o sobreexpresar ErbB2 y también expresar o sobreexpresar una herregulina (por ejemplo ?-HRG) . Un cáncer el cual "sobreexpresa" un receptor ErbB es aquel el cual tiene niveles significativamente mayores de un receptor ErbB, tal como ErbB2 en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser causada por amplificación del gen o por un incremento en la transcripción o traducción. La sobreexpresión del receptor ErbB se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o pronóstico al evaluar niveles aumentados de proteína ErbB presentes en la superficie de una célula (por ejemplo vía un ensayo de inmunohistoquimica; IHC, por sus siglas en inglés) . De manera alternativa o adicional, uno puede medir los niveles de ácido nucleico que codifican para ErbB en la célula, por ejemplo, por medio de técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH, por sus siglas en inglés; véase WO 98/45479 publicada en octubre de 1998) , transferencia Southern o reacción en cadena de polimesasa PCR, por sus siglas en inglés) , tal como PCR. cuantitativa en tiempo real (RT-PCR, por sus siglas en inglés) . La sobreexpresión del ligando ErbB se puede determinar de manera diagnóstica al evaluar los niveles del ligando (o ácido nucleico que los codifican) en el paciente, por ejemplo, en una biopsia de tumor o por diversos ensayos de diagnóstico tales como IHC, FISH, transferencia Southern, PCR o ensayos in vivo como se describen en lo anterior. Uno también puede estudiar la sobreexpresión del receptor ErbB al medir el antigeno difundido (por ejemplo dominio extracelular ErbB) en un fluido biológico tal como suero (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 4,933,294 expedida el 12 de junio de 1990; WO 91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; patente de E.U.A. número 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol. Methods, 132 : 73-80 (1990)). Además de los ensayos anteriores, están disponibles para los expertos en la técnica diversos ensayos in vivo adicionales. Por ejemplo, uno puede exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo el cual opcionalmente está marcado con una marca detectable, por ejemplo un isótopo radioactivo, y la unión del anticuerpo a células en el paciente pueden ser evaluadas, por ejemplo, por exploración externa en búsqueda de radioactividad o' al analizar una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo. Los tumores que sobreexpresan HER2 se clasifican por calificaciones inmunohistoquímicas que corresponden al número de copias de moléculas HER2 expresadas por células y se pueden determinar bioquímicamente: 0 = o = 10,000 copias/célula 1+ = por lo menos aproximadamente 200,000 copias/célula, 2+ = por lo menos aproximadamente 500,000 copias/célula 3+ = por lo menos aproximadamente 2,000,000 copias/célula.

La sobreexpresion de HER2 en el nivel 3+ , lo que lleva a activación independiente de ligando de la tirosina cinasa (Hudziak et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 84 : 159-7163

[1987] ) , se produce aproximadamente en 30% de los cánceres de mama, y en estos pacientes, la supervivencia sin recaídas y la supervivencia total están disminuidas (Slamon et al., Science, 244 : 707-712

[1989]; Slamon et al., Science, 235 :177-182

[1987] ) . Por el contrario, un cáncer el cual "no está caracterizado por sobreexpresion del receptor ErbB2 " es aquel el cual, en un ensayo de diagnóstico, no expresa niveles mayores que los normales de receptor ErbB2 en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Un cáncer "independiente de hormona" es aquel en el cual la proliferación del mismo no depende de la presencia de la hormona la cual se une a un receptor expresado por las células - en el cáncer. Tales cánceres no experimentan regresión clínica ante la administración de estrategias farmacológicas o quirúrgicas que reduzcan la concentración de hormona en o cerca o del tumor. Los ejemplos de cánceres independientes de hormonas incluyen cáncer de próstata independiente de andrógenos, cáncer de mama independiente de estrógenos, cáncer de endometrio y cáncer de ovario. Tales cánceres pueden comenzar como tumores dependientes de hormona y avanzan desde una etapa sensible a hormonas hasta un tumor refractario a hormonas después del tratamiento antihormomal . El término "agente citotóxico", como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células o que provoca la destrucción de las células. El término está diseñado para incluir isótopos radioactivos (por ejemplo At211, 1131, 1125, ?90, Rel86, Rel88, Sml53, BÍ212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos o variantes de los mismos . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXA MR) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforomida y trimetilolmelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterone, drornostanolone, propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatone; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevunílico; amsacrina, bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquone; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúsido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; piarrubicina, ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK^; razoxane; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquone; 2 , 21 , 2 " -triclorotrietilamina; uretano; -vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitbl ; mitolactol ; pipobromano; gacitosina; arabinósido ( "Ara-C" ) ; ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAX0LMR, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTEREMR, Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo, gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas ; capecitabina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores tales como antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, (5) -imidazoles que inhiben aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston) ; y an i ndrógenos tales como flu mida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide y goserelina; y sales, ácidos o derivados f rmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . Como se utiliza en la presente, el término "medicamento dirigido a EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se une a EGFR y que opcionalmente inhibe la activación de EGFR. Los ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos los cuales se unen a EGFR incluyen Mab 579 (ATCC CRL HB 8506), Mab 455 (ATCC CRL HB 8507), ab 225 (ATCC CRL HB 8508) , Mab 528 (ATCC CRL HB 8509) (véase patente de E.U.A. número 4,943,533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBUTIX") y 225 humano reconformado (H225) (véase, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que unen EGFR imitante tipo II (patente de E.U.A. número 5,212,290); anticuerpos humanizados y quiméricos que unen EGFR como se describe en la patente de E.U.A. número 5,891,996; y anticuerpos humanos que unen" EGFR, tales como ABX-EGF (véase WO 98/50433, Abgenix) . El anticuerpo contra EGFR se puede conjugar con un agente citotóxico y de esta manera se genera un inmunoconjugado (véase, por ejemplo EP 659,439A2, Merck Patent GmbH) . Los ejemplos de moléculas pequeñas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinib (IRESSAMR; AstraZeneca) , CP-358774 (TARCEVAMR; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) . Un inhibidor de tirosina cinasa es una molécula la cual inhibe en cierta medida la actividad de tirosina cinasa de una tirosina cinasa tal como un receptor ErbB. Los ejemplos de tales inhibidores incluyen medicamentos dirigidos a EGFR indicados en el párrafo precedente sí como quinazolinas tales como PD 153035, 4- (3-cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706 y pirazolopirimidinas , 4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] -pirimidinas , curcumina (diferuoilmetano, 4 , 5-bis (4-fluoroanilino) ftalimida) , tirfostinas que contienen porciones nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber) ; moléculas antisentido (por ejemplo aquellas que se unen a ácido nucleico que codifica para ErbB) ; quinoxalinas (patente de E.U.A. número 5,804,396); trifostinas (patente de E.U.A. número 5,804,396); ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; inhibidores de pan-ErbB tales como CI-1033 (Pfizer) ; Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; mesilato de Imatinib (Gleevac; Novartis) ; PKI 166 (Novartis) ; GW2016 (Glaxo SmithKline) ; CI-1033 (Pfizer) ; EKB-5S9 (Wyeth) ; Semaxanib (Sugen) ; ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone) ; o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: patente de E.U.A. número 5,804,396; WO 99/09016 (American Cyanamid) ; WO 98/43960 (American Cyanamid) ; WO 97/38983 (Warner Lambert) ; WO 99/06378 (Warner Lambert) ; WO 99/06396 (Warner Lambert) WO 96/30347 (Pfizer, Inc) ; WO 96/33978 (Zeneca) ; WO 96/3397 (Zeneca) ; y WO 96/33980 (Zeneca) . Un "agente antiangiogénico" se refiere a un compuesto el cual bloquea o interfiere en cierto grado en el desarrollo de los vasos sanguíneos . El factor antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o un anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o un receptor de factor de crecimiento involucrado en promover la angiogénesis . El factor antiangiogénico preferido en la presente es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) . El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúa sobre otras células como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen a las hormonas del crecimiento tales como la hormona del crecimiento humano, la hormona del crecimiento humano N-metionilo y la hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteínicas tales como hormona estimulante de los folículos (FSH, por sus siglas en inglés) , hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés) y hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor a y ß de necrosis tumoral; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO, por sus siglas en inglés) ; factores de crecimiento de nervios tales como NGF-ß; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (los TGF, por sus siglas en inglés) , tales como TGF-a y TGF-ß; factores I y II de crecimiento similares a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos ; interferones tales como interferón a, ß y ?, factores estimuladores de colonias (CSF) tales como CCF de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés) ; granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF, por sus siglas en inglés) ; y granulocitos-CSF (G-CSF, por sus siglas en inglés) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL.lct, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNG-ß; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando de equipo (KL, por sus siglas en inglés) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de la secuencia nativa. El término "precursor" (profármaco o promedicamento) , como se utiliza en esta solicitud, se refiere a un precursor o una forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a células tumorales en comparación con el medicamento original y que es capaz de ser activado enzimáticamente o que se puede convertir en una forma original más activa. Véase, por ejemplo Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th eeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs"; A Chemical Approach to Targeted Drug Delivert, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los precursores de esta invención incluyen, pero no se limitan a precursores que contienen fosfato, precursores que contienen tiofosfato, precursores que contienen sulfato, precursores que contienen péptidos, precursores que contienen D-aminoácido modificado, precursores glucosilados, precursores que contienen ß-lactama, precursores que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o precursores que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, precursores de 5-fluorocitosina y otros precursores de 5-fluorourudina los cuales se pueden convertir en un medicamento libre citotóxico más activo. Los ejemplos de medicamentos citotóxicos que pueden ser derivatizados en una forma de precursor para uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a aquellos agentes quimioterapéuticos descritos en lo anterior. Un "liposoma" es una vesícula pequeña constituida de varios tipos de lipidos, fosfolípidos o tensioactivos los cuales son útiles para administración de un medicamento (tales como anticuerpos contra ErbB2 descritos en la presente y, opcionalmente , un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente están distribuidos en una formación de dos capas, similar a la distribución de lipidos de las membranas biológicas. El término "inserto de envase" se utiliza para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones o advertencias respecto al uso de tales productos terapéuticos. Un "cardioprotector" es un- compuesto o composición que impide o reduce la disfunción del miocardio (por ejemplo cardiomiopatía o fallo cardíaco congestivo) asociado con la administración de un medicamento, tal como un antibiótico de antraciclina o un anticuerpo contra ErbB2 , a un paciente. El cardioprotector puede, por ejemplo, bloquear o reducir el efecto cardiotóxico mediado por radicales libres o evitar o reducir el daño por tensión oxidativa. Los ejemplos de cardioprotectores abarcados por la presente definición incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28 : 1063-1072 (1994) ) ; un agente que disminuye lipidos o un antioxidante tal como probucol (Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol., 2_7: 1055-1063 (1995)); amifostina (éster de fosfato diácido de aminotiol 2- [ (3-aminopropil) amino] etanotiol , también denominado WR-2721, y la forma de captación celular desfosforilada del mismo denominada WR-1065) y ácido S-3-(3-metilaminopropilamino) propilfosforotioico (WR-15327) , véase Green et al., Cáncer Research, 54:738-741 (1994); digoxina (Bristo , M.R. En: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York:Elsevier 191-215 (1980)); bloqueadores beta tales como metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs 47 : Suppl 4:31-9 (1994); y Shaddy et al., Am. Heart J. , 129:197-9 (1995)); vitamina E, ácido ascórbico (vitamina C) ; eliminadores de radicales libres tales como ácido oleanólico; ácido ursólico y N-acetilcisteína (N7A.C) ; compuestos que atrapan giros tales como alfa-fenil-terbutilnitrona (PBN) ; (Paracchini et al., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)); compuestos selenoorgánicos tales como P251 (Elbesen) ; y similares . Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual habitualmente se asocia en la fuente natural del ácido nucleico para anticuerpo. Una molécula aislada de ácido nucleico es diferente en cuanto a la forma o el ámbito en el cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido nucleico por lo tanto se diferencian de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales . No obstante, una molécula aislada de ácido nucleico incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que habitualmente expresa el anticuerpo en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operablemente en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribozoma. Se conocen células eucarióticas que utilizan promotores, señales de poliadenilación y me oradores. El ácido nucleico está "unido operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretor se une operablemente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está unido operablemente a una secuencia codificante si altera la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribozoma está unido operablemente a una secuencia codificante si se coloca de manera que facilita la traducción. De manera general, el término "unido operablemente" significa que las secuencias de ADN que están unidas están contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los mejoradores no necesitan estar contiguos. La unión se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o enlazadores se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. Como se utiliza en la presente, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable y todas estas designaciones incluyen descendencia o progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen células objetivo primarias y cultivos derivadas de las mismas sin considerar el número de transferencias . También debe entenderse que toda la descendencia puede no ser precisamente idéntica en cuanto a contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye descendencia mutante que tenga la misma función o actividad biológica a la determinada en la célula transformada originalmente. En donde se pretendan designaciones diferentes, estas serán evidentes a partir del contexto.

Métodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra HER2 Fuentes de Tumores y Células Tumorales Los tumores pueden ser caracterizados como sensibles (que responden) al tratamiento con 2C4, o anticuerpos funcionalmente equivalentes, es decir, anticuerpos que tienen una o más de las características biológicas del anticuerpo 2C4, por ejemplo, los que se basan en la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 sobre la superficie celular, como una medida de la activación de HER2. Las muestras de tumor se pueden someter a ensayo para determinar la presencia de heterodímeros por cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, la presencia de heterodímeros se determina por uno o más de los métodos que se describen en lo siguiente. Dado que la activación de HER2 es el resultado de la heterodimerización y fosforilación de receptor, un método particularmente importante para identificar tumores que responden al tratamiento con 2C4, o anticuerpos funcionalmente equivalentes, es la detección de fosforilación del receptor ErbB, tal como la fosforilación del receptor ErbB2 (HER2) , como se describe posteriormente. Las fuentes de células tumorales que se pueden ensayar incluyen, pero no se limitan a biopsias de tumor, células tumorales circulantes, proteínas plasmáticas circulantes, fluido ascítico, tumores xenotransplantados u otros modelos de tumores y cultivos de células primarias o líneas de células derivadas de tumores o que muestran propiedades similares a tumores, sí como muestras de tumor conservadas tales como muestras de tumor embebidas en parafina y fijadas en formalina. El análisis sistemático de los paneles de diversos tipos de células tumorales en búsqueda de heterodímeros de EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 y la fosforilación del receptor ErbB se contemplan por la presente invención. Las células de tumor del mismo tipo que las células tumorales que dan prueba positiva para heterodímeros o fosforilación del receptor ErbB tales como el receptor ErbB2 (HER2) se pueden someter a tratamiento con 2C . Los modelos de tumores descritos en lo siguiente se proporcionan como ejemplos y no deben considerarse como limitantes de la invención. En una modalidad, las células tumorales que se originan con un paciente que actualmente padece de un tumor se someten a ensayo para determinar si responden, en base en la presencia de los heterodímeros HER2/HER3 o HER2/HER1 o por demostración de fosforilación del receptor ErbB, el paciente posteriormente puede ser tratado con un anticuerpo con una o más de las características biológicas de 2C4. Preferiblemente el paciente es tratado con rhuMAb 2C . En otra modalidad, las células tumorales de un tipo particular de tumor o células que se considera que tienen las características de un tipo particular de tumor se someten a ensayo para determinar la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3, o para la fosforilación del receptor ErbB, preferiblemente el receptor ErbB2 (HER2) . Si se detectan los heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 o la fosforilación del receptor ErbB, este tipo de tumor se considera que es un buen candidato para el tratamiento con anticuerpo contra ErbB2 con una o más de las características biológicas de 2C . Los pacientes que padecen de este tipo de tumor después se pueden tratar con dicho anticuerpo. Xenoinj ertos de Línea Celular Las células tumorales propagadas in vitro, tales como células tumorales que crecen en cultivo y líneas de células tumorales se pueden xenoin ertar en ratones al implantar células directamente en el sitio de interés. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se realizan ensayos en las células para identificar la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB-ErbB3 , o para la fosforilación del receptor ErbB, tales como la fosforilación del receptor ErbB2 (HER2) . En una modalidad, las células tumorales se implantan subcutáneamente en un ratón, preferiblemente un ratón atímico sin pelo. En otra modalidad, las células tumorales se implantan en un lugar fisiológicamente pertinente para crear un modelo de tumor in situ apropiado.

Por ejemplo, las células de una línea de células de cáncer de mama se pueden implantar a diversas concentraciones dentro de la almohadilla grasa mamaria de ratones atímicos para que el modelo sea más preciso respecto a la biología del cáncer de mama. Las células tumorales se pueden someter a ensayos para determinar la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB-ErbB3 , o para la fosforilación del receptor ErbB ya sea antes o después de la implantación. De manera preferible, las células tumorales se someten a ensayo después de que las células implantadas se han desarrollado en un tumor de un tamaño predeterminado. Los ratones también se pueden someter a tratamiento con 2C4 o un anticuerpo funcionalmente equivalente, en donde los ratones no tratados sirven como un control . Se pueden establecer modelos similares para cualquier tipo de tumor a partir del cual se han derivado células cultivadas o líneas de células. Los tipos de tumores incluyen, pero no se limitan a tumor de vejiga, cerebro, mama, colon, esófago, riñon, leucemia, hígado, pulmón, melanoma, ovario, páncreas, próstata, sarcoma, estomago, testículo y útero. En una modalidad, las células tumorales o las líneas de células que sobreexpresan ErbB2 se utilizan para implantación, mientras que en otra modalidad, las células tumorales o líneas de células que expresan cantidades normales o inferiores a las normales de ErbB2 se utilizan para implantación. En otra modalidad adicional, las células tumorales o lineas de células que no responden a HERCEPTINMR se utilizan para implantación. En una modalidad específica, se implantan en la almohadilla grasa de la gónada de ratón aproximadamente 20 millones de célula de tumor de mama MDA-175. La expresión de los dímeros HER2/HER1 o HER2/HER3 en la superficie de células xenoinj ertadas se determina, por ejemplo mediante uno de los métodos que se describen en lo siguiente . Los ratones implantados de esta manera también se pueden someter a tratamiento con 0.3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg o 100 mg/kg de 2C4. Otros regímenes de dosificación pueden encontrarse dentro de la determinación de una persona habitualmente experta en la técnica. Aunque la presente invención es adecuada para la clasificación de cualquier tumor que expresa HER2 , son particularmente adecuados para análisis y tratamiento siguiendo la presente invención los tumores sólidos como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de próstata y cáncer colorectal. Xenoinjertos de Tumores Se pueden obtener muestras de tumor de mamífero, preferiblemente muestras de tumor humano y se pueden implantar en ratones, preferiblemente ratones atímicos lampiños . Las muestras de tumor se pueden obtener por cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, las muestras o piezas de tumor se extirpan quirúrgicamente, por ejemplo como en una biopsia o en una cirugía para extirpar el tumor del mamífero. En otra modalidad, la muestra de tumor se obtiene al purificar células tumorales circulantes de la sangre del mamífero. En una modalidad específica se implantan cortes de tumor humano sólido de aproximadamente 5 x 5 x 0.5 a 1 mm de diámetro en los flancos de ratones atímicos lampiños, generalmente cuatro fragmentos por ratón. Cuando los tumores implantados alcanzan un diámetro mediano de aproximadamente 10-15 mm, se pueden hacer pasar en serie, generalmente utilizando fragmentos de tumor más pequeños. Los métodos para generar y estudiar xenoinjertos de tumor humano se describen en las siguientes referencias, que se incorporan en la presente en su totalidad: Fiebig et al., "Human Tumor Xenografts : Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents, " en Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Fiebig & Burger, eds . (Basel, Karger 1999), vol . 54, pp. 29-50; Berger et al., "Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice," en Immunodeficient Mice in Oncology, Fiebig & Berger, eds. (Basel, Karger 1992) , pp. 23-46; Fiebig & Burger, "Human Tumor Xenografts and Explants", en Models in Cáncer Research, Teicher, ed. (Humana Press 2002) pp. 113-137.

Los xenoinjertos humanos se consideran de gran valor diagnóstico del comportamiento del tumor dentro del paciente donador, dado que el xenoinjerto crece como un tumor sólido, se diferencia y desarrolla un estroma, vasculatura y necrosis central. En la mayor parte de los casos, los xenoinjertos retienen la mayor parte de las características moleculares, histológicas y patofisiológicas del tumor recién derivado del paciente. Las células tumorales de ratones que contienen el primer tumor o tumores que se han sometido a pasajes seriado se pueden analizar para determinar la presencia de heterodímeros EFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3, o para la fosforilación del receptor ErbB. Los ratones también se pueden someter a tratamiento con 2C4 o un anticuerpo funcionalmente equivalente. En una modalidad, se analiza un panel recién creado o establecidio de xenoinjertos de tumor humano para determinar la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 , o para la fosforilación del receptor ErbB. Fiebig & Burger, supra, describen un conjunto de más de 300 xenoinjertos de tumor humano establecidos de una diversidad de tipos de cánceres comunes, tales como cáncer de vejiga, cerebro, mama, colon, esófago, riñon, leucemia, hígado, pulmón, melanoma, ovario, páncreas, próstata, sarcoma, estómago, testículo y útero. En una modalidad, la totalidad del conjunto se analiza en búsqueda de heterodímeros o para determinar fosforilación del receptor de ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2) . Los subconjuntos de este grupo también se pueden analizar en búsqueda de heterodímeros, o para determinar fosforilación del receptor ErbB, en donde los subconj ntos se basan, por ejemplo, en el tipo de tejido, la expresión superior, inferior o normal de ErbB2, o una falta de respuesta a HERCEPTINMR. De esta manera, los tumores se pueden clasificar como candidatos para tratamiento con 2C4 base en la presencia de heterodímeros o al demostrar la fosforilación del receptor ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2) . De igual manera, los pacientes que tienen tumores calificados de esta manera se pueden considerar más rápidamente elegibles para tratamiento con 2C4 o un anticuerpo funcionalmente equivalente. Se pueden someter a ensayo dos muestras para determinar la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3, o para la fosforilación del receptor ErbB ya sea antes o después de la implantación. En una modalidad, aproximadamente un gramo de tumor de un primer xenoinjerto o un xenoinjerto que ha sido pasado de manera seriada se caracteriza de manera adicional moleculármente en búsqueda de heterodímeros o se congela rápidamente en nitrógeno líquido y se almacena a -80°C para caracterización posterior. Los tumores de xenoinjerto pueden ser analizados de manera adicional por un ensayo en agar suave en capa doble, también denominado un ensayo clonogénico, como se describe, por ejemplo, en Fiebig y Burger, supra. Los xenoinjertos de tumor humano sólido se disgregan mecánica y proteolíticamente en una suspensión de células solas, las cuales se siembran en placa, en placas de pozos múltiples estratificada con agar suave, como se ha descrito. El crecimiento de células tumorales in vi tro lleva a la formación de colonias las cuales pueden ser analizadas de manera adicional para determinar las características moleculares tales como heterodímeros o para fosforilación del receptor ErbB o para otras características histoquímicas o morfológicas. B. Detección de los heterodímeros EGFR-ErbB2 y ErbB2- ErbB3 Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para detectar heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2- ErbB3 en tumores . Se describen a continuación varios métodos preferidos. Estos métodos detectan interacciones no covalentes proteína-proteína o de alguna otra manera indica la proximidad entre proteínas de interés. Los métodos que se describen en lo siguiente se proporcionan como ejemplos y no deben considerarse como limitantes de la invención. Coinmunoprecipitación e inmunotransferencia Los métodos basados en inmunoafinidad, tales como inmunoprecipitación o ELISA, se pueden utilizar para detectar heterodímeros EGFR- ErbB2 o ErbB2- ErbB3. En una modalidad, se utilizan los anticuerpos contra ErbB2 para inmunoprecipitar complejos que comprenden ErbB2 de células tumorales, y el inmunoprecipitante resultante después se sondea para determinar la presencia de EGFR o ErbB3 por inmunotransferencia . En otra- modalidad se pueden utilizar anticuerpos EGFR o ErbB3 para la etapa de inmunoprecipitación y el inmunoprecipitante después se sondea con anticuerpos ErbB2. En una modalidad adicional, se pueden utilizar ligandos ErbB específicos para los complejos HERI, HER3, HER2/HER1 o complejos HER2/HER3 para precipitar los complejos, los cuales después se sondean para determinar la presencia de HER2. Por ejemplo, los ligandos se pueden conjugar con avidina y los complejos purificados en una columna de biotina. En otras modalidades, tales como la prueba de ELISA o los ensayos de tipo anticuerpo "interpuesto", se inmovilizan los anticuerpos para ErbB2 en un soporte sólido, se ponen en contactoo con células tumorales o lisado de células tumorales, se lavan y después se exponen a anticuerpo contra EGFR o ErbB3. La unión de este último anticuerpo, el cual se puede detectar directamente o por anticuerpo secundario conjugado a una etiqueta detectable, indica la presencia de heterodímeros . En ciertas modalidades, el anticuerpo para EGFR o ErbB3 se inmoviliza y se utiliza el anticuerpo para ErbB2 para la etapa de detección. En otras modalidades, se pueden utilizar ligandos del receptor ErbB en lugar de, o combinado con anticuerpos contra el receptor ErbB. La inmunoprecipitación con anticuerpos para EGFR, ErbB2 o ErbB3 puede ser seguida por un ensayo funcional para heterodímeros , como una alternativa o un suplemento a la inmunotransferencia . En una modalidad, la inmunoprecipitación con el anticuerpo para ErbB3 es seguida por un ensayo para determinar la actividad del receptor de tirosina cinasa en el inmunoprecipitante . Debido a que ErbB3 no tiene actividad intrínseca de tirosina cinasa, la presencia de actividad de tirosina cinasa en el inmunoprecipitante indica que ErbB3 muy probablemente esté asociado con ErbB2. Graus-Porta et al., EMBO J., 16:16437-55 (1997); Klapper et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 96:4995-5000 (1999). Este resultado se puede confirmar por inmunotransferencia con anticuerpos para ErbB2. En otra modalidad, la inmunoprecipitación con anticuerpo ErbB2 es seguida por un ensayo para la actividad de receptor de tirosina cinasa EGFR. En este ensayo, el inmunoprecipitante se pone en contacto con ATP radioactivo y el sustrato peptídico que imita al sitio in vivo de la transfosforilación de ErbB2 por EGFR. La fosforilación del péptido indica la coinmunoprecipitación y por lo tanto la heterodimerización de EGFR con ErbB2. Los ensayos de actividad de receptor de tirosina cinasa son bien conocidos en la técnica e incluyen ensayos que detectan la fosforilación de los sustratos objetivo, por ejemplo, por anticuerpo para fosfotirosina y activación de las vías de transducción de señal asociada tales como la via MAPK. Las variaciones de los métodos y ensayos anteriores serán evidentes fácilmente y son habituales para una persona con habilidad en la técnica. También se puede utilizar reticulación química o por radiación UV para unir covalentemente heterodímeros en la superficie de células vivas. Hunter et al., Biochem. J., 320 : 847-53. Los ejemplos de reticulantes químicos incluyen ditiobis (succinimidil) propionato (DSP, por sus siglas en inglés) y 3 , 31 -ditiobis (sulfosuccinimidil) propionato (DTSSP, por sus siglas en inglés) . En una modalidad, se analizan los extractos de células de células tumorales reticuladas químicamente por medio de SDS-PAGE y se someten a inmunotransferencia con anticuerpos para EGFR o ErbB3. Una banda superdesplazada del peso molecular apropiado que más probablemente representa a los heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2- ErbB3, tal como ErbB2 , es el asociado de heterodimerización preferido para EGFR y ErbB3.. Este resultado se puede confirmar por inmunotransferencia subsecuente con anticuerpos para ErbB2. FRET y métodos basados en fluorescencia La transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) también se puede utilizar para detectar heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2- ErbB3. FRET detecta cambios conformacionales proteinicos e interacciones proteína-proteína in vivo e in vitro, en base en la transferencia de energía desde un fluoroforo donador a un fluoroforo aceptor. Selvin, Nat. Struct. Biol., 2:730"34 (2000). La transferencia de energía se lleva a cabo únicamente si el fluoroforo donador se encuentra en proximidad suficiente con el fluoroforo aceptor. En un experimento típico de FRET, se marcan con sondas fluorescentes diferentes a dos proteínas o dos sitios en una proteína única. Una de las sondas, la sonda donadora, se excita a un estado de energía superior por luz incidente de una longitud de onda especificada. La sonda donadora después transmite su energía a una segunda sonda, la sonda aceptora, lo que resulta en una reducción en la intensidad de fluorescencia del donador y un incremento en la emisión de fluorescencia del aceptor. Para medir el grado de transferencia de energía, la intensidad del donador en una muestra marcada con sondas donadoras y aceptoras se comparan con su intensidad en una muestra marcada únicamente con la sonda donadora. Opcionalmente, se compara la intensidad del aceptor en el donador/aceptor y en muestras únicamente de aceptor. Las sondas adecuadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, colorantes permanentes de membrana, tales como fluoresceína y rodamina, colorantes orgánicos, tales como colorantes de cianina y átomos de lantánido. Selvin. Los métodos e instrumentación para detectar y medir la transferencia de energía también se conocen en el arte. Selvin, supra. Las técnicas basadas en FRET adecuadas para detectar y medir las interacciones proteína-proteína en células individuales también se conocen en el arte . Por ejemplo, la microscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de fotoblanqueado de donador (pbFRET, por sus siglas en inglés) y la microscopía de formación de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM, por sus siglas en inglés) se pueden utilizar para detectar la dimerizacion de los receptores de superficie celular. Selvin, supra; Gadella y Jovin, J". Cell. Biol . , 129 : 1543-58 (1995). En una modalidad, se utiliza pbFRET sobre células ya sea "en suspensión" o " in situ" para detectar y medir la formación de heterodímeros EGFR- ErbB2 o ErbB2-ErbB3, como se describe en Nagy et al., Cytometry, 3_2:120-131 (1998). Estas técnicas miden la reducción en el tiempo de vida de fluorescencia del donador debido a la transferencia de energía. En una modalidad particular, se puede utilizar la técnica FRET del tipo Foerster citométrico de flujo (FCET, por sus siglas en inglés) para investigar la heterodimerización de EGFR-ErbB2 y ErbB2-ErbB3, como se describe en Nagy et al., supra y Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001).

De manera preferible se utiliza FRET junto con técnicas de marcado inmunohistoquímico estándar. Ken orthy, Methods, 24:289-96 (2001) . Por ejemplo, los anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes adecuados se pueden utilizar como sondas para el marcado de dos proteínas diferentes. Si las proteínas están en proximidad entre sí, los colorantes fluorescentes actúan como donadores y aceptores para FRET. La transferencia de energía se detecta por medios estándar. La transferencia de energía se puede detectar por un medio citometrico de flujo o por sistemas de microscopía digital, tales como microscopía confocal o microscopía de fluorescencia de campo amplío acoplado a una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD, por sus siglas en inglés) . En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos para ErbB2 y los anticuerpos para EGFR o ErbB3 se marcan directamente con dos fluoróforos diferentes, por ejemplo como se describe en Magy et al, supra. Las células tumorales y los lisados de células tumorales se ponen en contacto con los anticuerpos marcados de manera diferenciada los cuales actúan como donadores y aceptores para FRET en presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3. De manera alternativa, se utilizan anticuerpos no marcados contra ErbB2 y ya sea EGFR o ErbB3 con anticuerpos secundarios marcados de manera diferencial que sirven como donadores y aceptores . Véase, por ejemplo, Brockhoff et al., supra. La transferencia de energía se detecta y la presencia de heterodímeros se determina si se encuentra que las etiquetas están en proximidad cercana. En otras modalidades, los ligandos de receptores de ErbB que son específicos para HER2 y ya sea para HERI o HER3 se marcan fluorescentemente y se utilizan para estudios FRET. En otras modalidades adicionales de la presente invención, se demuestra la presencia de heterodímeros en la superficie de células tumorales por la localización conjunta de ErbB2 ya sea con EGFR o ErbB3 utilizando técnicas de inmunofluorescencía directa o indirecta estándar y microscopía de exploración láser confocal . De manera alternativa, se utiliza la formación de imágenes por exploración láser (LSI, por sus siglas en inglés) para detectar unión de anticuerpo y colocalización de ErbB2 ya sea con EGFR o con ErbB3 en un formato de alto rendimiento, tal como una placa de micropozo, como se describe en Zuck et al, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 96:11122-27 (1999). En modalidades adicionales se determina la presencia de heterodímeros de EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 al identificar actividad enzimática que depende de la proximidad de los componentes del heterodímero . El anticuerpo ErbB2 se conjuga con una enzima y un anticuerpo para EGFR o ErbB3 se conjuga con una segunda enzima. Un primer sustrato de la primera enzima se agrega y la reacción produce un segundo sustrato para la segunda enzima. Esto genera una reacción con otra molécula para producir un compuesto detectable, tal como un colorante. La presencia de otra sustancia química que descompone al segundo sustrato, de manera que la reacción con la segunda enzima se evita a menos que la primera y segunda enzima y por lo tanto los dos anticuerpos, estén en proximidad cercana. En una modalidad particular, las células tumorales o los lisados celulares se ponen en contacto con un anticuerpo para ErbB2 que está conjugado con glucosa oxidasa y un anticuerpo para ErbB3 o ErbBl que está conjugado con peroxidasa de rábano. Se agrega glucosa a la reacción, junto con el precursor de colorante, tal como DAB y catalasa. Se determina la presencia de heterodímeros por el desarrollo de color cuando se tiñe para DAB. Sistema de ensayo eTag101 Se pueden detectar heterodímeros utilizando métodos basados en el sistema de ensayo eTagMR (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA) , como se describe, por ejemplo, en O 83502 y en la solicitud de patente de E.U.A. 2001/0049105, publicada el 6 de diciembre del 2001, las cuales se incorporan de manera expresa con referencia en su totalidad. Una eTagMR o una "etiqueta electroforética" comprende una porción indicadora detectable, tal como un grupo fluorescente. También puede comprender un "modificador de movilidad" el cual consiste esencialmente de una porción que tiene una movilidad electroforética única. Estas porciones permiten la separación y detecteccion de eTagm de una mezcla compleja bajo condiciones electroforéticas definidas, tal como electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés) . La porción de eTagMR que contiene la porción indicadora y, opcionalmente el modificador de movilidad se une a una primera porción de unión objetivo por un grupo de unión separable para producir un primer compuesto de unión. La primera porción de unión objetivo reconoce específicamente un primer objetivo particular, tal como un ácido nucleico o proteína. La primera porción de unión objetivo no se limita de manera alguna y puede ser, por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido. Preferiblemente, la primera porción de unión objetivo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. De manera alternativa, la primera porción de unión de objetivo puede ser un ligando receptor de ErbB o un fragmento competente de unión del mismo. El grupo enlazante preferiblemente comprende una porción susceptible de separarse, tal como un sustrato enzimático o cualquier enlace químico que se pueda separar bajo condiciones definidas. Cuando la primera porción de unión objetivo se une a su objetivo, el agente de separación se introduce o se activa y se separa el grupo enlazante y de esta manera se libera la porción de eTag1^ que contiene la porción indicadora y el modificador de movilidad. Por lo tanto, la presencia de e ag^ "libre" indica la unión de la porción de unión objetivo a su objetivo. Preferiblemente, un segundo compuesto de unión comprende un agente de separación y una segunda porción de unión objetivo que reconoce de manera específica al segundo objetivo. La segunda porción de unión a objetivo tampoco se limita de manera alguna y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o un ligando receptor de ErbB o un fragmento de ligando competente de unión. El agente de separación es tal que únicamente separará al grupo enlazante en el primer compuesto de unión si el primer compuesto de unión y el segundo compuesto de unión se encuentran en proximidad cercana . En una modalidad de la presente invención, un primer compuesto de unión comprende una eTagMR en la cual un anticuerpo para ErbB2 sirve como la primera porción de unión de objetivo. Un segundo compuesto de unión comprende un anticuerpo para EGFR o ErbB3 unido a un agente de separación capaz de separar el grupo enlazante de eTag"11. Preferiblemente, el agente de separación debe ser activado con el fin de ser capaz de separar el grupo enlazante. Las células tumorales o lisados de células tumorales se ponen en contacto con eTagMR, el cual se une a ErbB2 y con el anticuerpo para EGFR o ErbB3 modificado, el cual se une a EGFR o ErbB3 sobre la superficie celular. El compuesto de unión que no se haya unido preferiblemente se separa, y se activa el agente de separación, si es necesario. Si están presentes heterodímeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3, el agente de separación separará al grupo enlazante y liberará a eTagMR debido a la proximidad del agente de separación con el grupo enlazante. Se puede detectar eTagMR por cualquier método conocido en la técnica, tal como electroforesis capilar. En una modalidad, el agente de separación es una especie química activable que actúa sobre el grupo enlazante. Por ejemplo, el agente de separación se puede activar al exponer la muestra a la luz. En otra modalidad, se construye eTagMR utilizando un anticuerpo para EGFR o ErbB3 como la primera porción de unión objetivo, y el segundo compuesto de unión se construye a partir de un anticuerpo para ErbB2. Detección de fosforilación del receptor ErbB Se puede utilizar la presencia de fosforilación del receptor ErbB para demostrar la activación de HER2. En una modalidad, se puede realizar un ensayo para determinar la fosforilación de ErbB por inmunoprecipitación de uno o más receptores ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2) y el análisis de transferencia Western. Por ejemplo, se determina la condición positiva por la presencia de una banda fosfo-HER2 en el gel, utilizando un anticuerpo contra fosfotirosina para detectar uno o varios residuos tirosina fosforilados en uno o varios receptores ErbB inmunoprecipitados . Los anticuerpos contra fosfotirosina están disponibles comercialmente de PanVera (Madison, I) , una subsidaria de Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA) , o de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . La condición negativa se determina por la ausencia de la banda . En otra modalidad, se determina la fosforilación del receptor ErbB2 (HER2) por inmunohistoguimica utilizando un anticuerpo contra HER2 fosfoespecífico (clon PN2A; Thor et al., J. Clin. Oncol., 18 (18) :3230-3239 (2000)). Otros métodos para detectar la fosforilación de uno o varios receptores ErbB incluyen, pero no se limitan a KIRA ELISA (patentes de E.U.A. Nos. 5,766,863; 5,891,650; 5,914,237; 6,025,145; y 6,287,784), espectrometría de masas (comparación del tamaño de HER2 fosforilado y no fosforilado) y el ensayo de proximidad de eTagMR con un anticuerpo contra HER2 (por ejemplo, utilizando el equipo de ensayo de eTag™ disponible de Aclara BioSciences (Mountain View, CA) . Los detalles del ensayo eTagMR se describen en lo anterior. Producción de anticuerpos Sigue una descripción respecto a las técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico utilizados de acuerdo con la presente invención. Aunque la descripción generalmente se relaciona con la producción de anticuerpos contra ErbB2, una persona experta en la técnica puede adaptar fácilmente la descripción para producir anticuerpos contra cualquiera de los receptores ErbB . El antígeno ErbB2 que se va a utilizar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble de un dominio extracelular de ErbB2 o una porción de la misma, que contiene el epítopo deseado. De manera alternativa, se pueden utilizar células que expresen ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar ErbB2 ; o una línea de célula de carcinoma tal como las células SK-BR-3, véase Stancovski et al., PNAS (EUA) , _88: 8691-8695 (1991)) para generar anticuerpos . Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales preferiblemente se generan en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo hemocianiria de lapa de bocallave, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de frijol de soya utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, sulfosuccinimida éster de maleimidobenzoilo (conjugación a través de residuos cisteina) , N- idroxisuccinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, en donde R y Rl son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar, por ejemplo, 100 pg o 5 µg de proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después se realiza un refuerzo en los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. En un período de 7 a 14 días después, se extrae sangre de los animales y se realizan ensayos en el suelo para determinar el título de anticuerpos. Se administra un refuerzo a los animales hasta que el título alcanza una meseta. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también se pueden elaborar en cultivo de célula recombinante como fusiones proteínicas . Además, se pueden utilizar adecuadamente agentes agregantes tales como alumbre para mejorar la respuesta inmunológica .

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presenten de manera natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo el cual no es una mezcla de anticuerpos diferentes. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., IVature, 256:495 (1975), o se pueden elaborar por métodos de ADN recombinante (patente de E.U.A. No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describe en lo anterior para inducir linfocitos que produzcan o que sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína utilizada para inmunización. De ' manera alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos después se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT, por sus siglas en inglés) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT, por sus siglas en inglés) , sustancias las cuales impiden el crecimiento de células que carezcan de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, que soportan la producción estable a alto nivel del anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y que son sensibles a medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino tales como las derivadas de los tumores de ratón OPC-21 y MPC-11, disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J". I munol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). En medio de cultivo en el cual se hace crecer células de hibridoma se somete a ensayo para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. De manera preferible, se determina la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma mediante inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima ELISA. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980). Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y se pueden hacer crecer por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies ·. Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Un medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, un medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo en tumores de ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, el fluido ascítico o el suero por procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, proteina A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADM se puede colocar en vectores de expresión los cuales posteriormente se transfieren a células anfitrionas tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , o células de mieloma que de otra manera no producen la proteína de anticuerpo, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes . Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol. , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs. , 130 :151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348 : 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpo murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (en el intervalo de nM) por mezclado de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para reconstruir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouwe et al., Nuc. Acids. Res., 23^:2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicional para aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificante para los dominios constantes de la cadena pesada y la cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati Acad. Sci. EUA, _8_1:6851 (1984)), o por unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia codificante para un polipéptido diferente de inmunoglobulina . Típicamente, tales polipéptidos diferentes inmunoglobulina están sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o están sustituidos por los dominios variables de un sitio que combina antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que combina antígeno que tiene especificidad por un antígeno, y otro sitio que combina antígeno que tiene especificidad por un antigeno diferente. Anticuerpos humanizados Se han descrito en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente la cual es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se les denomina como residuos -"importados" los cuales típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332^:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Sciences, 239 : 1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de E.U.A. No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los cuales parte de los residuos de la región hipervariable y posiblemente parte de los residuos FR están sustituidos por residuos a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados los cuales se van a utilizar en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra la biblioteca completa de las secuencias de dominio variable humano conocido . La secuencia humana la cual está más cercana a la del roedor después se acepta como la región de infraestructura humana (FR, por sus siglas en inglés) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151 : 229S (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de infraestructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. La misma infraestructura se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 89:4285 (1992); Presta et al., J". Immunol., 151:2623 (1993)).

Es importante de manera adicional que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias tanto original como humanizada. Los modelos de inmunoglobulina tridimensional están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora los cuales ilustran y muestran las probables estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas representaciones permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de- residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unir su antigeno. De esta manera, se pueden seleccionar residuos FR y se pueden combinar con las secuencias receptora y de importación de manera que se obtenga la característica de anticuerpo deseada, por ejemplo una afinidad aumentada por uno o varios antígenos objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están involucrados de manera más directa y sustancial en la alteración de la unión a antígeno. Los anticuerpos humanizados ejemplares contra ErbB2 los cuales unen ErbB2 y bloquean la activación del ligando de un receptor ErbB se describen en WO 01/0245, la cual se incorpora en la presente como referencia. Los anticuerpos humanizados de interés particular en la presente bloquean la activación mediada por EGF, TGF-OÍ O HRG de MAPK esencialmente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento Fab del mismo) o se unen a ErbB2 esencialmente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento Fab del mismo) . Los anticuerpos humanizados en la presente pueden comprender, por ejemplo, residuos de la región hipervariable no humana incorporados en un dominio pesado variable humano y pueden comprender adicionalmente una sustitución en la región de infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) en una posición que se selecciona del grupo que consiste de 69H, 71H y 73H utilizando el sistema de numeración de dominio variable que se establece en abat et al . , Sequences of Proteins o Immunologícal Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) . En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones FR de dos o de la totalidad de las posiciones 69H, 71H y 73H. Un anticuerpo humanizado ejemplar de interés en la presente comprende los residuos determinadores de complementariedad del dominio pesado variable GFTFTDYTMX, en donde X preferiblemente es D o S (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7); DVNPNSGGSIYNQ FKG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8); o NLGPSFYFDY (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9), que opcionalmente comprende modificaciones de aminoácidos de aquellos residuos CDR, por ejemplo, en donde las modificaciones mantienen esencialmente o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de interés de anticuerpo puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 o aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos en las secuencias de CDR pesadas variables anteriores . Tales variantes de anticuerpo se pueden preparar por maduración de afinidad, por ejemplo como se describen en lo siguiente. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos del dominio pesado variable en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4 (figura IB) . El anticuerpo humanizado puede comprender residuos determinadores de complementariedad del dominio ligero variable KASQDVSIGVA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10) ,-SASYX1X2X3, en donde XI es preferiblemente R o L, X2 preferiblemente es Y o E y X3 es preferiblemente T o S (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11); o QQYYIYPYT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12), por ejemplo, además aquellos residuos CDR del dominio pesado variable en el párrafo precedente. Tales anticuerpos humanizados opcionalmente comprenden modificaciones de aminoácidos de los residuos CDR anteriores, por ejemplo en donde las modificaciones mantienen esencialmente o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de interés del anticuerpo puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 o aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos en las secuencias CDR ligeras variables anteriores. Tales variantes de anticuerpo se pueden preparar por maduración de afinidad, por ejemplo como se describe en lo siguiente. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos del dominio ligero variable en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 (figura 1A) . La presente solicitud también contempla anticuerpos madurados por afinidad los cuales unen ErbB2 y bloquean la activación de ligando de un receptor ErbB. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, por ejemplo, uno que comprende las secuencias ligera o pesada variables de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NÚMEROS: 3 y 4, respectivamente (es decir, la variante 574; figura 1A y B) . El anticuerpo madurado en afinidad preferiblemente se une al receptor ErbB2 con una afinidad superior a la de 2C4 murino o la variante 574 (por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro veces, o aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces de afinidad mejorada, por ejemplo, determinado utilizado una prueba de ELISA para el dominio extracelular ErbB2 (ECD) ) . Los residuos CDR pesados variables ejemplares para sustitución incluyen los H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, o combinaciones de dos o más (por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de estos residuos) . Los ejemplos de residuos CDR ligeros variables para alteración incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93 , L94 , L96, L97 o combinaciones de dos o más (por ejemplo dos o tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos) . Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado o de anticuerpo de afinidad madurada. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo de afinidad madurada puede ser un fragmento de anticuerpo tal como Fab, el cual opcionalmente esté conjugado con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunocon ugado . De manera alternativa, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo de afinidad madurada puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que, cuando se inmunizan, son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen para la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH, por sus siglas en inglés) en ratones quiméricos y mutantes de linea germinal resultan inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de línea germinal humano en tales ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos cuando se expongan a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EÜA, _90:2551 (1993): Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993): Bruggermann et al., Year in Immuno. , 1_:23 (1993); y patentes de E.U.A. Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. De manera alternativa, se puede utilizar la tecnología de presentación de fago ( cCafferty et al . , Nature, 348 :552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorio de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes para el dominio V de anticuerpo se clonan en marco ya sea en un gen para proteína de cubierta mayor o menor.de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección de un gen que codifica para el anticuerpo que presenta estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de los linfocitos V. La presentación de fagos e puede llevar a cabo en una diversidad de formatos; para su revisión véase, por e emplo, Johnson, evin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Stmctural Biology, 3:564-571 (1993) . Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de gen para V para la presentación de fago. Clackson et al., Nature, 352 :624-628 (1991) aisló un arreglo diverso de anticuerpos contra oxazolona a partir de una biblioteca de combinación aleatoria pequeña de genes para V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes para V a partir de donadores humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para un arreglo diverso de antigenos (que incluye antígenos propios) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al . , J". Mol. Biol., 222 : 581-597 (1991) o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) . Véase también, las patentes de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discute en lo anterior, los anticuerpos humanos también se pueden generar mediante linfocitos B activados in vitro (véanse las patentes de E.U.A. 5,567,610 y 5,229,275) . Los anticuerpos humanos contra ErbB2 se describen en la patente de E.U.A. No. 5,772,997 expedida el 30 de junio de 1998 y WO 97/00271 publicada el 3 de enero de 1997.

Fragmentos de anticuerpo Se han desarollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivan vía digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24 : 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). No obstante, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por células anfitrionas recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de fago de anticuerpos discutidas antes. De manera alternativa, los fragmentos Fab1 -SH se pueden recuperar directamente a partir de E. coli y se pueden acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')2 directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés) . Véase WO 93/16185; patente de E.U.A. No. 5,5751,894; y patente de E.U.A. No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,641,870, por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerops que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se puden unir a dos epítopos diferentes de la proteína ErbB2. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión ErbB2 con uno o varios sitios de unión para EGFR, ErbB3 o ErbB4. De manera alternativa, el brazo contra ErbB2 puede combinarse con un brazo el cual se una a una molécula de activación sobre un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo CD2 o CD3) , o receptores Fe para IgG (FCYR) , tales como FcyRI (CD64) , FCYRII (CD32) y FCYRIII (CD16) , de manera que se enfoquen los mecanismos de defensa celular para la célula que expresa ErbB2. También se pueden utilizar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos a células las cuales expresan ErbB2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a ErbB2 y un brazo el cual se une al agente citotóxico (por ejemplo saporina, antiinterferón-a, alcaloide vinca, cadena de ricina A, metotrexato o un hapteno de isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2.

El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico contra ErbB2/FcYRIII y la patente de E.U.A. No. 5,837,234 describe un anticuerpo biespecífico contra ErbB2/FcYRI. En el documento WO 98/02463 se muestra un anticuerpo biespecífico contra ErbB2/Fc . La patente de E.U.A. No. 5,821,337 describe un anticuerpo biespecífico contra ErbB2/CD3. Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305 : 537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, . estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales únicamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual habitualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, resulta más bien problemática y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares, en WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10_:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina . La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende por lo menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener una primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para unión de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados y se someten a transfección conjunta en un organismo anfitrión adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad al a ustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en modalidades cuando se utilizan proporciones diferentes de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción lo que proporciona los rendimentos óptimos. No obstante, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o para la totalidad de las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos una de las dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados o cuando las proporciones no son de importancia particular. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están constituidos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulinas no deseadas, dado que la presencia de la cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente la mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04S90. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos , véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de E.U.A. No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede someter a ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales se recuperan del cultivo de células recombinantes . El límite o contacto preferido comprende por lo menos parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, uno o más de las cadenas laterales de aminoácidos del límite de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes se generan en el límite de la segunda molécula de anticuerpo al sustituir cadenas laterales de aminoácidos grandes con más pequeños (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina y el otro a biot na. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente de E.U.A. No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar utilizando cualquier método de reticulado conveniente. Los agentes reticulante adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de E.U.A. No. 4,676,980, junto con numerosas técnicas de reticulado . Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos son separados proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de un agente de arsenito de sodio formador de complejo con ditiol para estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formación disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab 1 generados después se convierten a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB después se reconvierte a Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecífieos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas . El avance reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. cali, lo cual se puede acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecifico humanizada completamente. Cada fragmento Fab' se secreta por separado a partir de E. coli, y se somete a acoplamiento químico dirigidlo in vlt.ro para formar el anticuerpo biespecifico . El anticuerpo biespecifico formado de esta manera es capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, e igualmente inducir la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama. humano . También se han descrito diversas · técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivo de células recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de -leucina. Kostelny et al., J". Immunol., 148 (5) :1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina a partir de las proteínas Fos y Jun se unen a las porciones Fab ' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se reducen en la región de bisagra para formar monómeros y después se reoxidan para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo (diabody) " descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.Ü.A., 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) por un enlazante el cual es demasiado corto para permitir el acoplamiento o pareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento son obligados a parearse con dominios VL y VH complementarios de otro fragmento y de esta manera forman dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecífieos mediante el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv, por sus siglas en inglés) . Véase Gruber et al., J. Inmunol., 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias, por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecífieos . Tutt et al. J". Immunol., 147 : 60 (1991). Otras modificaciones en la secuencia de aminácidos Se contemplan una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos contra ErbB2. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión u otras propiedades biológicas de los anticuerpos. Las variantes en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos contra ErbB2 se preparan al introducir cambios nucleotídicos apropiados en el ácido nucleico para el anticuerpo contra ErbB2 o por síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo contra ErbB2. Se realiza cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para llegar al constructo final , con la condición de que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar el procedimiento postraduccional de los anticuerpos contra ErbB2 tales como cambio en el número de posición de los sitios de glucosilación.

Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones de los anticuerpos contra ErbB2 que son lugares preferidos para mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración con alanina" como se describe por Cunningham y Wells, Science, 244 : 1081-1085 (1989) . Aquí, un residuo o'' un grupo de los residuos objetivo se identifica (por ejemplo residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o con carga negativa (de manera más preferible alanina o polialanina) para alterar la interacción de los aminoácidos con el antigeno ErbB2. Aquellas posiciones de aminoácidos que muestren sensibilidad funcional a las sustituciones que se afinan por introducción de variantes adicionales o diferentes en o para los sitios de sustitución. Por lo tanto, mientras se predetermina el sitio para la introducción de una variación en la secuencia de aminoácidos, no necesita predeterminarse la naturaleza de la mutación por si misma. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo la exploración con ala o la mutagénesis aleatoria en el codón o la región objetivo y se someten a análisis las variantes de anticuerpo contra ErbB2 que se expresan en búsqueda de la actividad deseada. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen funciones de la parte amino o carboxilo terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cientos o más residuos, asi como inserciones dentro de la secuencia de residuos aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo contra ErbB2 con un residuo metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de las moléculas de anticuerpo contra ErbB2 incluyen la fusión en la parte N o C terminal de los anticuerpos contra ErbB2 a una molécula indicadora, una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido el cual incrementa la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos . Estas variantes tienen por lo menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo contra ErbB2 sustituida por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables , pero también se contemplan alteraciones FR. En la tabla 1 se muestran sustituciones conservadoras bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente en lo siguiente con referencia a las clases de aminoácidos, se pueden introducir y se pueden realizar análisis de los productos.

Tabla 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo al seleccionar sustituciones que difieren de manera significativa en su efecto para mantener: (a) la estructura de la infraestructura polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se presentan de manera natural se dividen en grupos que se basan en propiedades de cadena lateral común: (1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile ,· (2) hidrofilicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que alteran la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras incluirán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase . Cualquier residuo cisterna no involucrado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo contra ErbB2 también puede estar sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir reticulado aberrante. Inversamente, se pueden agregar uno o varios enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos en la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, una o varias variantes resultantes se seleccionan para desarrollo adicional y tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo original del cual se han generado. Una manera conveniente para generar tales variantes de sustitución involucra la maduración de afinidad utilizando presentación de fago. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en dicho sitio. Las variantes de anticuerpo generados de esta manera se muestran en una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones para el producto del gen III de MI3 empacado con cada partícula. Las variantes mostradas por fago después se analizan para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente. Con el fin de identificar sitios de regiones hipervariables candidatas para modificación, se puede llevar a cabo la mutagénesis de exploración de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión de antígeno. De manera alternativa o adicional, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y ErbB2 humano. Tales residuos de contacto y residuos adyacentes son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan dichas variantes, el grupo de variantes se somete a análisis como se describe en la presente y se pueden seleccionar para desarrollo posterior anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes . Otro tipo de variación de aminoácido altera el patrón de glucosilacion original del anticuerpo. Por alteración se quiere significar supresión de una o más porciones de carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo o la adición de uno o más sitios de glucosilacion que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilacion de anticuerpos típicamente está unida a N o unida a O. Unido a N se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagin -X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido genera un sitio de glucosilacion potencial. La glucosilacion unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glucosilacion al anticuerpo se lleva a cabo convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de manera tal que contiene una o más de las secuencias tripeptídicas descritas en lo anterior (para sitios de glucosilacion unidos a N) . La alteración también se puede realizar por la adición o sustitución de una o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (parásitos de glucosilacion unidos a O) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo contra ErbB2 se preparan por una diversidad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en la secuencia de aminácidos que se presenten de manera natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidios (o dirigida al sitio) , mutagénesis por PG y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo contra ErbB2. Puede ser deseable modificar los anticuerpos de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, de manera que se mejore la citotoxicidad mediada por células, dependiente de antigeno (ADCC, por sus siglas en inglés) o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) del anticuerpo. Esto se puede obtener al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. De manera alternativa o adicional, se pueden introducir uno o varios residuos cisteína en la región Fe y de esta manera se permite la formación de la unión disulfuro entre cadenas en estas región. El anticuerpo homodimerico generado de esta manera puede tener capacidad de internalización mejorada o una destrucción de célula mediada por complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés), mejoradas. Véase Carón et al., J". Exp Med. , 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B., J". Imunol., 148 : 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar utilizando reticulantes heterobifuncionales como se describen en Wolff et al., Cáncer Research, 53 :2560-2565 (1993). De manera alternativa, se pueden someter a ingeniería un anticuerpo el cual tiene regiones Fe dobles y de esta manera puede tener capacidades mejoradas de lisis por complemento y ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3_:219-230 (1989) . Para incrementar la vida media sérica del anticuerpo, uno puede incorporar un epítopo de unión a receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítopo de unión de receptor salvaje" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4) que sea responsable de incrementar la vida media sérica in vivo de la molécula IgG. Cribado en búsqueda de anticuerpos con las propiedades deseadas Se han descrito en lo anterior técnicas para generar anticuerpos. Uno puede seleccionar adicionalmente anticuerpos con ciertas características biológicas, según se desee . Para identificar un anticuerpo el cual bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB, se debe determinar la capacidad del anticuerpo para bloquear el ligando ErbB que se une a las células que expresan el receptor ErbB (por ejemplo junto con otro receptor ErbB con el cual el receptor ErbB de interés forma un hetero-oligómero ErbB) . Por ejemplo, las células que expresan de manera natural o que se transfectan para expresar receptores ErbB del hetero-oligómero ErbB se pueden incubar con el anticuerpo y después se exponen a ligando ErbB marcado. Después se puede evaluar la capacidad del anticuerpo contra ErbB2 para bloquear ligando que se une al receptor ErbB en el hetero-oligómero ErbB. Por ejemplo, se puede realizar la inhibición de la unión de H G a líneas de células de tumor de mama MCF7 por anticuerpos contra ErbB2 utilizando cultivos de monocapa de MCF7 en hielo, en un formato de placa de 24 pozos esencialmente como se describe en WO 01/00245. Se pueden agregar anticuerpos monoclonales contra ErbB2 a cada pozo y se incuban durante 30 minutos. Después se agrega 25 pm de G??Tß1177-224 marcada con 125I y la incubación puede continuar durante 4 a 16 horas. Se pueden preparar curvas de dosis versus respuesta y se puede calcular el valor CIS0 para el anticuerpo de interés. En una modalidad, el anticuerpo el cual bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB tendrá una CI50 para inhibir la unión de HRG a células MCF7 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menos, de manera más preferible 10 nM o menos. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab, la CI50 para inhibir la unión de HRG a células MCF7 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menos, de manera más preferible 50 nM o menos. De manera alternativa o adicional, se puede determinar la capacidad de un anticuerpo contra ErbB2 para bloquear la fosforilación de tirosina estimulada de ligando de ErbB de un receptor de ErbB presente en un hetero-oligómero de ErbB. Por ejemplo, las células que expresan de manera endógena receptores de ErbB o que se transfectan para expresarlo se pueden incubar con el anticuerpo y después se pueden realizar ensayos para determinar la actividad de fosforilación de tirosina dependiente de ligando ErbB utilizando un anticuerpo monoclonal contra fosfotirosina (el cual está opcionalmente conjugado vía una etiqueta detectable) . El ensayo de activación de receptor de cinasa descrito en la patente de E.U.A. No. 5,766,863 también está disponible para determinar la activación del receptor ErbB y bloquear dicha actividad por un anticuerpo. En una modalidad, uno puede realizar un cribado para un anticuerpo el cual inhibe la estimulación de H G de fosforilación de tirosina pl80 en células MCF7, esencialmente como se describe en el ejemplo 1 siguiente. Por ejemplo, las células CF7 se pueden sembrar en placas de 24 pozos y se pueden agregar anticuerpos monoclonales para ErbB2 a cada pozo y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente; después se agrega a cada pozo rHR^1177-244 hasta una concentración final de 0.2 nM y la incubación puede continuar durante 8 minutos . El medio se puede aspirar de cada pozo y las reacciones se pueden detener por la adición de 100 µ? de amortiguador de muestra SDS (SDS 5%, DTT 25 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 6.8) . Una cantidad de 25 µ? de cada muestra se puede someter a electroforesis en un gradiente en gel de 4-12% (Novex) y después se transfieren electroforáticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno . Se .pueden desarrollar inmunotransferencia de antifosfotirosina (a 1 yg/ml) y se puede cuantificar por densitometría de reflectancia la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr ~ 180,000. El anticuerpo seleccionado preferiblemente tendrá una estimulación para inhibir de manera significativa HRG de la fosforilación de tirosina pl80 a aproximadamente 0-35% del control en este ensayo. Una curva dosis-respuesta para inhibición de la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina pl80 determinada por densitometría de reflectancia se puede preparar y se puede calcular la CI50 para el anticuerpo de interés. En una modalidad, el anticuerpo el cual bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB tendrá un CI50 para inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina pl80 en este ensayo, de aproximadamente 50 nM o menos, de manera más preferible 10 nM o menos. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab, la CI50 para inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina pl80 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menos, de manera más preferible 50 nM o menos. Uno también puede determinar los efectos inhibidores de crecimiento del anticuerpo en células MDA-MB-175, por ejemplo esencialmente como se describe en Schaefer et al. Oncogene, 15:1385-1394 (1997). De acuerdo con este ensayo, las células MDA-MB-175 se pueden tratar con 10 g/ml de anticuerpo monoclonal contra ErbB2 durante 4 días y se tiñen con cristal violeta. La incubación con un anticuerpo contra ErbB2 puede mostrar un efecto inhibidor de crecimiento en esta línea de células similar al mostrado por el anticuerpo monoclonal 2C4. En una modalidad adicional, HRG exógeno no revertirá de manera significativa esta inhibición. Preferiblemente, el anticuerpo será capaz de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175 en un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente , en un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 7F3), tanto en presencia como en ausencia de HRG exógeno . En una modalidad, el anticuerpo de interés contra ErbB2 puede bloquear la asociación dependiente de herregulina de ErbB2 con ErbB3 tanto en células MCF7 como SK-BR-3, determinado en un experimento de coinmunoprecipitación tal como la que se describe en el Ejemplo 1 sustancialmente más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5 y de manera preferible sustancialmente de manera más eficaz que el anticuerpo monoclonal 7F3. Para identificar los anticuerpos contra ErbB2 inhibidores de crecimiento, uno puede realizar un análisis sistemático en búsqueda de anticuerpos que inhiban al crecimiento de células cancerosas que sobreexpresen ErbB2. En una modalidad, el anticuerpo de elección inhibidor de crecimiento es capaz de inhibir al crecimiento de células SK-BR-3 en cultivo celular en aproximadamente 20-100%, y de manera preferible en aproximadamente 50-100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 g/ml . Para identificar tales anticuerpos, se puede llevar a cabo el ensayo para SK-BR-3 descrito en la patente de E.U.A. No. 5,677,171. De acuerdo con este ensayo, se hacen crecer células SK-BR-3 en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina y penicilina estreptomicina. Las células SK-BR-3 se siembran en placas a 20,000 células en una caja de cultivo celular de 35 mm (2 ml/recipiente de 35 mm) . Se agregan por recipiente 0.5 a 30 µg/ml de anticuerpo contra ErbB2. Después de seis días, se realiza una cuenta del número de células, en comparación con células no tratadas, utilizando un contador de células COULTER™1 electrónico. Aquellos anticuerpos los cuales inhiben el crecimiento de células SK-BR-3 en aproximadamente 20-100% o aproximadamente 50-100% se pueden seleccionar como anticuerpos inhibidores de crecimiento. Para seleccionar anticuerpos los cuales inducen muerte celular, se puede determinar la pérdida de integridad de membrana como se indica, por ejemplo, por la captación de PI , azul de tripán o 7AAD, en relación al control. Los ensayos preferidos son el ensayo de captación de PI utilizando células BT474. De acuerdo con este ensayo, las células BT474 (las cuales se pueden obtener de American Type Culture Collection (Rockville, MD) ) se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM, por sus siglas en inglés) :Ham F-12 (50:50) suplementado con FBS inactivado por calor 10% (Hyclone) y L-glutamina 2 m . (De esta manera, el ensayo se realiza en ausencia de complemento y células efectoras inmunológicas) . Las células BT474 se siembran a una densidad de 3 x 106 por recipiente en recipientes de 100 x 20 mm y se permite que se unan durante la noche . El medio después se separa y se sustituye con medio fresco solo o con medio que contiene 10 µ9/p?1 del anticuerpo monoclonal apropiado . Las células se incuban durante un período de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se separan por tripsinización. Las células después se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 40°C, el sedimento se resuspende en 3 mi de amortiguador de unión de Ca2+ enfriado con hielo (Hepes 10 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM, CaCl2 2.5 mM) y se toman alícuotas en tubos de 12 x 75, con tapa apretada, de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la separación de los grumos de células. Los tubos después reciben 10 µg/ml de PI . Las muestras se pueden analizar un citómetro de flujo FACSCANMR y el programa (software) FACSCONVERTMR de CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos los cuales inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular, determinado por captación de PI, se pueden seleccionar como anticuerpos que inducen muerte celular. Con el fin de seleccionar anticuerpos los cuales inducen apoptosis está disponible un ensayo de unión de anexina utilizando células BT474. Las células BT474 se cultivan y siembran en recipientes como se discuten en el párrafo precedente. Después se retira el medio y se sustituye con medio fresco solo o con medio que contiene 10 µ9/p?1 del anticuerpo monoclonal . Después de un período de incubación de 3 días, las monocapas se lavan con PBS y se separan por tripsinización. Las células después se centrifugan, se resuspenden en amortiguador de unión con Ca2+ y se toman alícuotas en tubos como se discute antes para cada ensayo de muerte celular. Los tubos después reciben anexina marcada (anexina V-FTIC) (1 µ9/p?1) . Las muestras se pueden analizar utilizando el citómetro de flujo utilizando FACSCANMR y el programa software FACSCONVERTMR CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión de anexina en relación al control se seleccionan como anticuerpos que inducen apoptosis . Además del ensayo de unión de anexina, está disponible un ensayo de tinción de ADN utilizando células BT474. Para llevar a cabo este ensayo, las células BT474 las cuales han sido tratadas con el anticuerpo de interés como se describe en los dos párrafos precedentes se incuban con 9 g/ml de HOECHST 33342MR durante 2 h a 37 °C, y después se analiza en un citómetro de flujo EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) utilizando el programa (software) MODFIT LTm (Verity Software House) . Los anticuerpos los cuales inducen un cambio en el porcentaje de células apoptosicas el cual es dos veces o mayor (y preferiblemente 3 veces o mayor) en comparación con las células no tratadas (hasta 100% de células apoptósicas) se pueden seleccionar como anticuerpos proapoptosicos utilizando este ensayo. Para cribar (realizar un análisis sistemático) en búsqueda de anticuerpos los cuales se unan a un epítopo en ErbB2 unido por un anticuerpo de interés, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado sistemático tal como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . De manera alternativa o adicional, se puede llevar a cabo el mapeo de epítopos por métodos conocidos en el arte (véanse, por ejemplo, las figuras 1A y IB en la presente) .

Inmunoconjugados La invención también se relaciona con ' inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo unido a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, que incluye fragmentos o variantes de las mismas) , o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) . Se han descrito antes agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados . Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas tales como caliqueamicina, una maitansina (patente de E.U.A. No. 5,208,020), una tricotena y CC1065 también se contemplan en la presente . En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo se conjuga a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo) . La maitancina puede convertirse, por ejemplo, a May-SS- e la cual se puede reducir a May-SH3 y se puede hacer reaccionar con anticuerpo modificado (Chari et al., Cáncer Research, 52:127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado maitansinoide-anticuerpo . Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo contra ErbB2 conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de caliqueamicina de antibióticos son capaces de producir rupturas de ADN de cadena doble a concentraciones inferiores picomolar. Los análogos estructurales de caliqueamicina los cuales se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a ???, o¡2I, o¡3I, N-acetil-??? , PSAG y T?1 (Hinman et al., Cáncer Research, 53 -.3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Research, 58:2925-2928 (1998)). Véanse también las patentes de E.U.A. Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5,773,001 incorporadas de manera expresa en la presente como referencia. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas las cuales se pueden utilizar incluyen la cadena A de difteria, los fragmentos activos que no se unen de la toxina de difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, -sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos . Véase, por ejemplo, WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como desoxirribonucleasa; DNasa) . Están disponibles una diversidad de núclidos radioactivos para la producción de anticuerpos contra ErbB2 radioconjugados . Los ejemplos inlcuyen At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53 , BÍ212, P32 y núclidos radioactivos de Lu. Los conjugados de un anticuerpo y agente citotoxico se pueden elaborar utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento proteínico bifuncionales tales como N-succinimidil-3 - (2-piridiltiol) ropionato (SPDP, por sus siglas en inglés) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT, por sus siglas en inglés) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como clorhidrato de adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolieno) , y compuestos de fluorbis activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238 : 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase el documento O 94/11026. El enlazante puede ser un "enlazante separable" que facilita la separación del medicamento citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazante lábil por ácido, un enlazante sensible a peptidasa, un enlazante dimetilico o un enlazante que contenga disulfuro (Chari et al.. Cáncer Research, 52:127-131 (1992)). De manera alternativa, se puede elaborar una proteina de fusión que comprenda un anticuerpo contra ErbB2 y un agente citotóxico, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis peptidica.

En otra modalidad adicional, se puede conjugar un anticuerpo a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en predireccionamiento de tumores en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, posterior a la separación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente depurador y después la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) el cual se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . Tratamiento con precursor mediado por enzima dependiente de anticuerpo (ADEPT, por sus siglas en inglés) Los anticuerpos de la presente invención también se pueden utilizar en ADEPT al conjugar el anticuerpo en una enzima activadora de precursor la cual convierte un precursor (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, véase WO 81/01145) a un medicamento activo anticancerígeno. Véase, por ejemplo WO 88/07378 y patente de E.U.A. No. 4,975,278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un precursor de manera tal que la convierte en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a fosfatasa alcalina útil para convertir precursores que contienen fosfato en medicamentos libres; arilsulfatasa útil para convertir precursores que contienen sulfato en medicamentos libres; citosina desaminasa, útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en un medicamento anticancerígeno, 5-fluorouracilo,-proteasas tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L) , que son útiles para convertir precursores que contienen péptidos en medicamentos libres; D-alanilcarboxipeptidasas útiles para convertir precursores que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas separadas de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útil para convertir precursores glucosilados en medicamentos libres; ß-lactamasa útil para convertir medicamentos derivatizados con ß-lactamas en medicamentos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útil para convertir medicamentos derivatizados en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en medicamentos libres. De manera alternativa, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", se pueden utilizar para convertir los precursores de la invención en medicamentos activos libres (véase, por ejemplo Massey, ííature, 328 :457-458 (1987)). Se pueden preparar conjugados de anticuerpo-abzima como se describe en la presente para administrar la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de esta invención se pueden unir de manera covalente a anticuerpos contra ErbB2 por técnicas bien conocidas en el arte tales como el uso de reactivos reticulantes heterobifuncionales discutidos antes. De manera alternativa, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión a antigeno de un anticuerpo de la invención unido a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención se pueden construir utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984) . Otras modificaciones en los anticuerpos Se contemplan en la presente otras modificaciones de los anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a una de una diversidad de polímeros no proteináceos , por ejemplo polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol . El anticuerpo también puede estar unido de manera alternativa a una o más de una diversidad de porciones diferentes, tales como una marca fluorescente, una porción con una movilidad electroforética conocida, o una porción que sea susceptible de separar una molécula enlazante específica . El anticuerpo también puede ser atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coaservación o por polimerización interfacial (por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo) , respectivamente) , en sistemas coloidales de administración de medicamento (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed. , (1980). Los anticuerpos contra ErbB2 descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en el arte, tales como se describen en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. EUA, 77:4030 (1980); las patentes de E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la patente de E.U.A. No. 5, 013 , 556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE, por sus siglas en inglés) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab ' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. , 257:286-288 (1982) vía reacción de intercambio disulfuro. Opcionalmente está contenido un agente quimioterapéutico dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., J". National Center Inst., 81 (19) :1484 (1989). Vectores, células anfitrionas y métodos recombinantes La invención también proporciona ácido nucleico aislado que codifica para los anticuerpos, que incluye anticuerpos contra ErbB2 humanizados, vectores y células anfitrionas que comprenden al ácido nucleico así como técnicas recombinante para la producción del anticuerpo. Para la producción recombinante de un anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aisla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica para el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican con las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) . Están disponibles muchos vectores . Los componentes del vector incluyen de manera general, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mej orador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. Componente de la secuencia de señal Los anticuerpos contra ErbB2 se pueden producir de manera recombinante no solo directamente, sino también como polipéptidos de fusión con un polipéptido heterologo, el cual preferiblemente es una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de separación específico en la parte N terminal de la proteína o polipéptido maduros. La secuencia de señal heteróloga se selecciona preferiblemente como aquella que es reconocida y procesada (es decir, separada por una peptidasa de señal) por la célula anfitriona. Para células anfitrionas procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del anticuerpo contra ErbB2 nativa, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal procariótica que se selecciona, por ejemplo, del grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes de enterotoxina II termoestables. Para secreción en levadura la secuencia de señal nativa puede estar sustituida, por ejemplo, por el líder de invertasa de levadura, el líder de factor ex (que incluye los líderes de factor OÍ de Saccharomyces y Kluyveromyces) o un líder de fosfatasa acida, el líder de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como los líderes secretores virales, por ejemplo, están disponibles la señal gD de herpes simple.

El ADN para tal región precursora se liga en marco de lectura al ADN que codifica para el anticuerpo contra ErbB2. Origen del componente de replicación Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células anfitrionas seleccionadas. De manera general, en vectores de clonación esta secuencia es aquella que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico al anfitrión e incluye orígenes de replicación o secuencias replicantes de manera autónoma. Tales secuencias son bien conocidas por una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación para el plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2 µ es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonación de vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 típicamente se puede utilizar únicamente debido a que contiene el promotor temprano) . Componente de gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado como marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican para proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina racemasa para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un medicamento para suprimir el crecimiento de una célula anfitriona. Aquellas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al medicamento y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante utiliza los medicamentos neomicina, ácido micofenólico e higromicina . Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico para el anticuerpo contra ErbB2 , tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II, preferiblemente genes para metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen para selección de DHFR se identifican primero al cultivar la totalidad de los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR, una célula anfitriona apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo silvestre es la linea de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) deficiente en actividad DHFR . De manera alternativa, las células anfitrionas (particularmente anfitriones de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) , transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican para anticuerpo contra ErbB2 , proteína DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3 ' -fosfotransferasa (APH, por sus siglas en inglés) se pueden seleccionar por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de E.U.A. No. 4,965,199. Un gen de selección adecuado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282 -.39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 8_5:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula anfitriona de levadura proporciona de esta manera un ambiente eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptof no. De manera similar, se complementan cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) complementadas con plásmidos conocidos que tienen el gen para Leu2. Además, los vectores derivados del plásmido circular pKDl de 1.6 µtt? se pueden utilizar para transformación de levaduras de Kluyveromyces. De manera alternativa, se ha reportado paraa K. lactis un sistema de expresión para producción a gran escala de quimocina bovina recombinante . Van den Berg, Bio/Technology, _8:135 (1990). Los vectores de expresión de copias múltiples estables para secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito. Fleer et al., Bio/Technology, j3:968-975 (1991). Componente promotor Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo anfitrión y que está unido operablemente al ácido nucleico para el anticuerpo contra ErbB2. Los promotores adecuados para uso con anfitriones procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa, la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos . Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D. por sus siglas en inglés) unida operablemente al ADN que codifica para el anticuerpo contra ErbB2. Las secuencias promotoras se conocen para eucariotas . Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región con alta concentración de AT que se localiza aproximadamente 25 a 30 bases hacia el extremo 5' desde el sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia se encuentra 70 a 80 bases hacia el extremo 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es la región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de una cola poliA al extremo 3' de la secuencia codificante. La totalidad de estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucarióticos. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso en anfitriones de levadura incluyen promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucoliticas , tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa, exocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2 , isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes relacioandas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldeh£do-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en expresión de levaduras se describen adicionalmente en el documento EP 73,657. Los mej oradores de levadura también se pueden utilizar ventajosamente con promotores de levadura. La transcripción de anticuerpo contra ErbB2 de vectores en células anfitrionas de mamífero está controlado, por ejemplo, por promotores que se obtienen de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis B y de manera más preferible virus simio 40 (SV40) , a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor de acción o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células anfitrionas. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en anfitriones de mamífero utilizando el virus de papiloma bovino como un vector se describe en la patente de E.U.A. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de E.U.A. No. 4,601,978. Véase también Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) respecto a la expresión de ADNc para interferón ß humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa a partir de virus de herpes simple. De manera alternativa, la secuencia repetida terminal grande del virus de sarcoma de Rous se puede utilizar como el promotor. Componente de elemento mejorador En la transcripción de un ADN que codifica para un anticuerpo contra ErbB2 de esta invención por eucariotas superiores con frecuencia está incrementada al insertar una secuencia me oradora en el vector. Se conocen ahora muchas secuencias mej oradoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . No obstante, de manera típica uno utilizará un mej orador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el mej orador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pares de bases 100-270) , el mejorador del promotor temprano de citomegalovirus , el mejorador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y mej oradores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) o elementos mej oradores para activación de promotores eucarióticos . El mej orador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 31 respecto a la secuencia que codifica para el anticuerpo contra ErbB2 , pero preferiblemente se localiza en un sitio 5' del promotor. Componente de terminación de transcripción Los vectores de expresión utilizados en células hospedadores eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el AR m. Tales secuencias están disponibles desde la parte 5' y, ocasionalmente, 3', las regiones no traducidas de ADN o ADNc eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotidicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida de ARNm que codifica para el anticuerpo contra ErbB2. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Véase WO 94/11026 y el vector de expresión descrito en ese documento .

Selección y transformación de células anfitrionas Las células anfitrionas adecuadas para clonación o expresión de ADN en los vectores en la presente son las células procarióticas, de levadura o células eucarióticas superiores descritas antes. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias tales como organismos gramnegativos o grampositivos , por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimuriu , Serratia, por ejemplo Serratia marcescens y Shigella, asi como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes . Además de los procariotas, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son adecuados para clonación o expresión de anfitriones para vectores que codifican para el anticuerpo contra ErbB2. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadería común, es el utilizado más comúnmente entre los microorganismos anfitriones eucarióticos inferiores. No obstante, están disponibles comúnmente muchos otros géneros, especies y cepas y son útiles en la presente, tales como Eschizosaccaromyces pombe; anfitriones Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicheramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. termotolerans y K. marxianus; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y anfitriones de Aspergillus tales como A. nidulans y A. níger. Las células anfitrionas adecuadas para la expresión de anticuerpo contra ErbB2 glicosilado se deriva de organismos multinucleares . Los ejemplos de células invertebradas incluyen células vegetales y de insecto. Numerosas cepas baculovirales y variantes así como las células anfitrionas de insecto permisivas correspondientes de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosoph.Ha melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori se han identificado. Están disponibles públicamente una variedad de cepas para transfección, por ejemplo, la variante L-l de Autogropha californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden utilizar como los virus en la presente, de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda. Se pueden utilizar también como anfitriones cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, frijol de soya, petunia, tomate y tabaco. No obstante, el interés ha sido mayor en células de vertebrado y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento sistemático. Los ejemplos de líneas de células anfitrionas de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 3S-.59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (T 4, Mather, Biol . Reprod. , 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ,- células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci . , 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y la línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células anfitrionas se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en lo anterior para la producción de anticuerpo contra ErbB2 y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para promotores inductores, transformantes de selección o amplificación de los genes que codifican para las secuencias deseadas.

Cultivo de células anfitrionas Las células anfitrionas utilizadas para producir el anticuerpo contra ErbB2 de esta invención se pueden cultivar en una diversidad de medios . Son adecuados para cultivo de las células anfitrionas los medios disponibles comercialmente tales como FIO de Ham (Sigma) , medio esencial mínimo ( ( EM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio de Eagle modificado por Dulbecco ( (DMEM) , Sigma), cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. , 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. , 102:255 (1980), las patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; O 90/03430; WO 87/00195; o la patente de E.U.A. Re. 30,985 se puede utilizar como medio de cultivo para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como el medicamento GENTAMYCIN™) , elementos en trazas (definido como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir cualquier otro suplemento necesario en las concentraciones apropiadas como se conocen por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales ' como la temperatura, pH y similares son aquellas utilizadas previamente con la célula anfitriona seleccionada para expresión y serán evidentes para aquellos habitualmente expertos en la técnica.

Purificación del anticuerpo contra ErbB2 Cuando se utilizan técnicas recombinantes , los anticuerpos se pueden producir intracelularmente, en el espacio periplásmico o se secretan directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa se separan los residuos particulados, ya sean células anfitrionas o fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology', 1_0:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos los cuales son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se recalienta una pasta celular en presencia de acetato de sodio, pH 3.5, EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, por sus siglas en inglés) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares se pueden separar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente primero se concentran utilizando un filtro de concentración de proteina disponible comercialmente , por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de las etapas precedentes para inhibir la proteólisis y se pueden incluir anticuerpos para evitar el crecimiento de contaminantes oportunistas . La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. Lo adecuado de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio FC de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede utilizar proteína A para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas humanas ??, ?2 o ?4 (Lindmark et al., J". Immunol . Meth. 6_2:1-13 (1983)) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humana (Guss et al., EMBO J. , 5_: 15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad con mayor frecuencia es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices estables mecánicamente tales como poro de vidrio controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que se pueden obtener con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, es útil para purificación la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) . Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, CLAR en fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía en SEPHAROSEMR o una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también . están disponibles, dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar. Después de cualquiera de las etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se pueden someter a cromatografí de interacción hidrofóbica con pH bajo utilizando un amortiguador de elusión a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, realizado preferiblemente a bajas concentraciones de sal (por ejemplo de aproximadamente 0-0.25M de sal) .

Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los" anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento al mezclar un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ava. edición, Osol, A. Ed. (1980) ) , en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e incluyen amortiguadores tales - como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos ; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol ; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol ; y m-cresol) ,- polipéptidos de peso molecular bajo (menores de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ,- polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol , trihalosa o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) ; o tensioactivos no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones liofilizadas preferidas de anticuerpo contra ErbB2 se describen en WO 97/04801, incorporadas de manera expresa en la presente como referencia. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según se necesite para la indicación particular que sea tratada, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se neutralizan entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos los cuales se unan a EGFR, ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo el cual se una a un epítopo diferente en ErbB2) , ErbB3 o ErbB4, o factor endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) en una formulación. De manera alternativa o adicional, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citocina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente antihormonal, un medicamento dirigido a EGFR, un agente angiogénico o un cardioprotector . Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito que se desea. Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo) , respectivamente, en sistemas de administración de medicamento coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ava. edición, Osol, A. Ed. (1980) . Se pueden preparar en preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices las cuales están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas de microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) o poli (alcohol vanílico)), polilactidas (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tal como LUPRON ?????" (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones que se van a utilizar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril. Tratamiento con anticuerpos contra ErbB2 Se contempla que, de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar anticuerpos contra ErbB2 para tratar diversas enfermedades o desórdenes . Las condiciones o desórdenes ejemplares incluyen tumores benignos o malignos; leucemia y otros cánceres malignos linfoides; otros desórdenes tales como desórdenes neuronales, de la neuroglía, astrocíticos , hipotalámicos, glandulares, de los macrófagos, epiteliales, estromales, blastocoélicos, inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos . Preferiblemente, se utilizan anticuerpos contra ErbB2 para tratar tumores que se identifican que responden al tratamiento con tales anticuerpos por los métodos que se describen en la presente. Generalmente, la enfermedad o trastorno que se va a tratar es cáncer. Los ejemplos de cáncer que se van a tratar en la presente incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o cánceres malignos linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, así como cáncer de cabeza y cuello. Preferiblemente, el cáncer que se va a tratar se identifica como sensible al tratamiento con anticuerpos contra ErbB2 en base en la identificación de heterodímeros HER2/HER3 o HER2/HER1 o la fosforilación del receptor ErbB en una muestra de tumor. Un grupo particular de cánceres en donde se espera que se detecte en la formación del heterodímero HER2/HER3 o HER2/HER1 o bien la fosforilación del receptor ErbB incluye, sin limitación, cáncer de mama de pulmón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario que incluye cáncer de ovario avanzado, refractario o recurrente, cáncer de próstata, cáncer colorrectal y cáncer pancreático . El cáncer generalmente comprenderá células que expresan ErbB2 tales como el anticuerpo contra ErbB2 en la presente es capaz de unirse al cáncer. Aunque el cáncer se puede caracterizar por sobreexpresión del receptor ErbB2, la presente solicitud proporciona además un método para tratar cáncer el cual no se considera que sea un cáncer que sobreexpresa ErbB2. Para determinar la expresión de ErbB2 en el cáncer, están disponibles diversos ensayos de diagnóstico/pronóstico. En una modalidad se puede analizar la sobreexpresión de ErbB2 por IHC, por ejemplo utilizando HERCEPTESTMR (Dako) . Las secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia de tumor se pueden someter al ensayo IHC y, de acuerdo con el criterio de intensidad de tinción de proteína ErbB2 , como sigue: Calificación 0 no se observa tinción o la tinción de la membrana se observa en menos de 10% de células tumorales. Calificación 1+ se detecta tinción de la membrana ligera/escasamente perceptible en más de 10% de las células tumorales. Las células se tiñen únicamente en parte de su membrana. Calificación 2+ se observa una tinción de la membrana ligera a moderada completa en más de 10% de las células tumorales . Calificación 3+ se observa una tinción de la membrana moderada a completa fuerte en más de 10% de las células tumorales. Aquellos tumores con calificaciones 0 ó 1+ para la determinación de la sobreexpresión de ErbB2 se pueden caracterizar como que no sobreexpresan ErbB2 , mientras que aquellos tumores con calificaciones de 2+ o 3+ se pueden caracterizar como que sobreexpresan ErbB2. De manera alternativa o adicional, se pueden llevar a cabo ensayos FISH tales como INF0RMMR (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISIONMR (Vysis, Illinois) en tejido de tumor embebido en parafina y fijador con formalina para determinar el grado (si lo hay) de sobreexpresión de ErbB2 en el tumor. En una modalidad, el cáncer será uno el cual expresa (y puede, aunque no necesita sobreexpresar) EGFR. Los ejemplos de cánceres los cuales pueden expresar/sobreexpresar EGFR incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés) , adenocarcinoma del pulmón y carcinomas escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastomas , cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene así como cáncer de cabeza y cuello. La presente invención es adecuada específicamente para la identificación de cáncer de mama, cáncer de próstata, tal como el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC, por sus siglas en inglés) y pacientes con cáncer de ovario que probablemente respondan bien al tratamiento con anticuerpo contra HER2 que bloquea la activación de ligandos de un heterodímero ErbB que comprende HER2 , tal como el anticuerpo monoclonal 2C4 o rhuMAb 2C4. El cáncer que va a ser tratado en la presente puede ser uno caracterizado por activación excesiva de un receptor de ErbB, por ejemplo EGFR. Tal activación excesiva puede ser atribuible a la sobreexpresión o producción aumentada del receptor ErbB o un ligando ErbB. En una modalidad de la invención, se realizará un ensayo de diagnóstico . o de pronóstico para determinar si el cáncer del paciente está caracterizado por activación excesiva de un receptor ErbB. Por ejemplo, se puede determinar la amplificación de un gen para ErbB o la sobreexpresión de un receptor para ErbB en el cáncer. Están disponibles en la técnica diversos ensayos para determinar tal amplificación/sobreexpresión e incluyen IHC, FISH y ensayos de antígenos difundidos descritos antes. De manera alternativa o adicional, los niveles de un ligando ErbB tal como TGF- OÍ en o asociado con el tumor se pueden determinar de acuerdo con procedimientos conocidos . Tales ensayos pueden detectar la proteína o ácido nucleico que codifica en la muestra que se va a probar. En una modalidad, los niveles de ligando de ErbB en el tumor se pueden determinar utilizando inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) ; véase, por ejemplo Scher et al.,. Clin. Cáncer Research, jL:545-550 (1995) . De manera alternativa o adicional, uno puede evaluar los niveles de ácido nucleico que codifica para ligando de ErbB en la muestra que se va a probar; por ejemplo por medio de FISH, transferencia Southern o técnicas de PCR. Además, el receptor de ErbB o la sobreexpresión de ligando ErbB o amplificación se pueden evaluar utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo por administración de una molécula (tal como un anticuerpo) el cual une la molécula que se va a detectar y se etiqueta con una marca detectable (por ejemplo un núclido radioactivo) y se explora externamente el paciente para localización de la etiqueta. Cuando el cáncer que va a ser tratado es cáncer independiente de hormonas, se puede determinar la expresión de la hormona (por ejemplo andrógeno) o su receptor afín en el tumor, utilizando cualquiera de los diversos ensayos disponibles, por ejemplo, como se describe en lo anterior. De manera alternativa o adicional, al paciente se puede diagnosticar indicando que tiene cáncer independiente de hormona en donde ya no responde al tratamiento antiandrógenos . En algunas modalidades se administra al paciente un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo contra ErbB2 conjugado con un agente citotóxico. Preferiblemente, el inmunoconjugado o la proteína ErbB2 a la cual se une se internaliza por la célula, lo que resulta en una eficacia terapéutica aumentada del inmunoconjugado para destruir a la célula cancerosa a la cual se une. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Los ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen maitansinoides , caliqueamiciñas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. En una modalidad particular, el anticuerpo administrado es RhuMAb 2C4, o un equivalente funcional del mismo. RhuMAb 2C4 es un anticuerpo monoclonal humanizado que se basa en las secuencias de infraestructura IgGl humanas y que consiste de dos cadenas pesadas (449 residuos) y dos cadenas ligeras (214 residuos) . El anticuerpo RhuMAb 2C4 difiere significativamente de otros anticuerpos contra HER2 HERCEPTINMR (Trastuzumab) en las regiones de unión de epítopos de la cadena ligera y de la cadena pesada. Como un resultado, RhuMAb 2C4 se une a un epítopo completamente diferente en HER2. La presente invención proporciona métodos sensibles para identificar cánceres que responden al tratamiento con RhuMAb 2C4 o equivalentes funcionales del mismo. Se hace notar que tales cánceres que responden al tratamiento con RhuMAb 2C4 no se requiere que sobreexpresen HER2. Los anticuerpos contra ErbB2 o inmunoconjugados se administran a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo comó un bolo o bien por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, intraarticular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o por inhalación. Se prefieren la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo. Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración del anticuerpo contra ErbB2. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente existe un período de tiempo mientras que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. En una modalidad particular, el paciente se trata con dos anticuerpos diferentes contra ErbB2. Por ejemplo, el paciente puede ser tratado con un primer anticuerpo contra ErbB2 el cual bloquea la activación de ligando de un receptor de ErbB o un anticuerpo que tiene una característica biológica de anticuerpo monoclonal 2C4 así como un segundo anticuerpo contra ErbB2 el cual es inhibidor del crecimiento (por ejemplo HERCEPTINMR) , o un anticuerpo contra ErbB2 el cual induce apoptosis de una célula que sobreexpresa ErbB2 (por ejemplo 7C2, 7F3 o variantes humanizadas de los mismos) . Preferiblemente, tal politerapia (tratamiento combinado) resulta en un efecto terapéutico sinergístico . Uno puede tratar, por ejemplo, al paciente con HERCEPTINMR y posteriormente tratarlo con RhuMAb 2C4, por ejemplo cuando el paciente no responde al tratamiento con HERCEPTINMR. En otra modalidad, el paciente puede ser tratado primero con rhuMAb 2C4 y después recibe tratamiento con HERCEPTINMR. En una modalidad adicional, el paciente puede ser tratado tanto con rhuMAb 2C4 como HERCEPTINMR simultáneamente. También puede ser deseable combinar la administración de uno o varios anticuerpos contra ErbB2, con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado a tumor. En este caso, el otro anticuerpo puede unirse, por ejemplo, a EGFR, ErbB3 , ErbB4 o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) .

En una modalidad, el tratamiento de la presente invención involucra la administración combinada de uno o varios anticuerpos contra ErbB2 y uno o más agentes quimioterapeuticos o agentes inhibidores de crecimiento, que incluyen la administración conjunta de mezclas de agentes quimioterapeuticos diferentes. Los agentes quimioterapeuticos preferidos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) o antibióticos de antraciclina . Los protocolos de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapeuticos se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes o se pueden determinar empíricamente por una persona experta en la técnica. Los protocolos de preparación y dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El anticuerpo se puede combinar con un compuesto antihormonal; por ejemplo, un compuesto antiestrógeno tal como tamoxifeno; una antiprogesterona tal como onapristona (véase el documento EP 616 812) ; o un antiandrógeno tal como flutamida en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Cuando el cáncer que va a ser tratado es cáncer independiente de hormonas, el paciente puede haber sido sometido previamente a tratamiento antihormonal y, después de que el cáncer se vuelve independiente de las hormonas, se puede administrar al paciente los anticuerpos contra ErbB2 (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente) . Algunas veces puede ser benéfico administrar de manera conjunta también un cardioprotector (para evitar o reducir la disfunción miocárdica relacionada con el tratamiento) o una o más citocinas al paciente. Uno también puede coadministrar un medicamento dirigido a EGFR o un agente antiangiogénico . Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente se puede someter a extirpación quirúrgica de las células cancerosas o tratamiento por radiación. Los anticuerpos contra ErbB2 en la presente también se pueden combinar con un medicamento dirigido a EGFR tal como aquellos descritos en lo anterior en la sección de definiciones que resultan en un efecto complementario y potencialmente sinergístico y terapéutico. Los ejemplos de tales medicamentos adicionales los cuales se pueden combinar con el anticuerpo incluyen agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docitaxel) , gemcitabina, navelbina, cisplatino, oxaliplatino o . combinaciones de cualquiera de estos tales como carboplatino/docitaxel ; u otro anticuerpo contra HER2 (por ejemplo un anticuerpo contra HER2 inhibidor de crecimiento tal como HERCEPTINMR o un anticuerpo contra HER2 el cual induce apoptosis tal como 7C2 o 7P3 que incluye las variantes humanizada o de afinidad madurada de los mismos) un inhibidor de farnesil transferasa ; un agente anti ngiogénico (por ejemplo, un anticuerpo contra VEGF) ; un medicamento dirigido a EGFR (por ejemplo C225 o ZD1839) ; una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF) ; o combinaciones de los anteriores . Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son aquellas actualmente utilizadas y se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo contra ErbB2. Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a ser tratada, como se define en lo anterior, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, los tratamientos previos, los antecedentes clínicos del paciente y la respuesta al anticuerpo así como el criterio del médico que atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos . Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg o 15 mg/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) del anticuerpo es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o bien por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados antes . Para administraciones repetidas durante varios días o más prolongadas, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. La dosificación preferida del anticuerpo estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamen e 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) . Tales dosis se pueden administrar de manera intermitente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera tal que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo contra ErbB2) . Se puede administrar una dosis de carga superior inicial, seguida por una o más dosis inferiores . Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo contra ErbB2. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El avance de este tratamiento se puede verificar fácilmente por técnicas y ensayos convencionales . En una modalidad particular se administrar rhuMAb 2C4 en una dosis fija de 420 mg (equivalente a dosis de 6 mg/kg para un sujeto de 70 kg) cada tres semanas. El tratamiento puede iniciarse con una dosis de carga superior (por ejemplo 840 mg, equivalente a' 12 mg/kg de peso corporal) con el fin de obtener concentraciones séricas en estado estable con mayor rapidez. Los regímenes de dosificación específicos también se proporcionan en los ejemplos posteriores. Además de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo por terapia de genes. Tal administración de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo está abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo" . Véase, por ejemplo, WO 96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 respecto al uso de la terapia de genes para generar anticuerpos intracelulares . Existen dos enfoques principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) al interior de las células de un paciente; in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, habitualmente en el sitio en donde se requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas las cuales se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 4,892,538 y 5,283,187). Existe una diversidad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían en base en si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o in vivo en las células den anfitrión propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamífero in vitro incluye el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector utilizado habitualmente para la administración ex vivo del gen es un retrovirus . Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo preferidas actualmente incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus I de herpes simple o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirige a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o una célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. Cuando se utilizan liposomas, las proteínas las cuales se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis se pueden utilizar para dirigir o facilitar la captación, por ejemplo, las proteínas de capside o fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula particular, los anticuerpos para proteínas las cuales experimentan internalización en el ciclado y proteínas que se dirigen a una localización intracelular y que mejoran la vida media intracelular . La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al. , J. Biol. Chem., 262 : 4429-443 (1987) ; y Wagner et al. , Proc. Nati. Acad. Sci . USA, £7:3410-3414 (1990) . Para una revisión de los protocolos de marcado de genes y terapias de genes conocidos actualmente véase Anderson et al. , Science, 256 : 808-813 (1992) . Véase también WO 93/25673 y las referencias mencionadas en este documento. Artículos de Manufactura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de los desórdenes descritos en lo anterior. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o un inserto en el envase sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes se pueden conformar de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente tiene una composición la cual es eficaz para tratar la condición y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo contra ErbB2. La etiqueta o el inserto del empaque indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección, tal como cáncer. En una modalidad, la etiqueta o el inserto del empaque indica que la composición comprende que el anticuerpo el cual se une a ErbB2 y puede ser utilizado para tratar a un paciente que padece de un tumor en el cual se ha identificado la presencia de los complejos HER2/HER1, HER2/HER3 o HER2/HER4 o bien se ha detectado la fosforilación del receptor ErbB. Además, el articulo de manufactura puede comprender: (a) un .primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un primer anticuerpo el cual se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de células cancerosas las cuales sobreexpresan ErbB2 ; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo el cual une ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB. El artículo de manufactura de esta modalidad de la invención puede comprender adicionalmente un inserto de empaque que indica que la primera y segunda composiciones de anticuerpo se pueden utilizar para tratar cáncer caracterizado por la presencia de los heterodimeros HER2/HER1, HER2/HER3 o HER2/HER4 o por la fosforilación del receptor ErbB. Además, el inserto del envase puede instruir al usuario de la composición (que comprende un anticuerpo el cual une ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB) para tratamiento combinado con el anticuerpo en cualquiera de los tratamientos adyuvantes descritos en la sección precedente (por ejemplo un agente quimioterapéutico, un medicamento dirigido a EGFR, un agente antiangiogénico, un compuesto antihormonal, un cardioprotector o una citocina) . De manera alternativa o adicional, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés) , solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Los anticuerpos también se pueden utilizar en ensayos de diagnóstico. Generalmente, los anticuerpos se marcan como se describe en los métodos anteriores . Por conveniencia, los anticuerpos de la presente invención se pueden proporcionar en un equipo, es decir, una combinación empacada de reactivos en condiciones predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo se marca con una enzima, el equipo incluirá sustratos y cofactores que se requieren por la enzima (por ejemplo un precursor de sustrato el cual proporciona el cromóforo o fluoroforo detectable) . Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizantes, amortiguadores (por ejemplo un amortiguador de bloqueo o un amortiguador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos las cuales sustancialmente optimizarán la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, habitualmente liofilizados que incluyen excipientes los cuales, cuando se disuelven, proporcionarán una solución de reactivo que tenga la concentración apropiada . Depósito de Materiales Se han depositado en las siguientes lineas de células de hibridoma ante el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Designación ATCC No. Fecha de Depósito de Anticuerpo 7C2 ATCC HB-12215 17 de octubre de 1996 7F3 ATCC HB-12216 17 de octubre de 1996 4D5 ATCC CRL 10463 24 de mayo de 1990 2C4 ATCC HB-12697 8 de abril de 1999 Se considera que la especificación escrita precedente es suficiente para permitir a una persona experta en la técnica llevar a la práctica la invención. La presente invención no se limita en cuanto alcance por los constructos depositados, dado que las modalidades depositadas se pretende que ilustren únicamente algunos aspectos de la invención y cualquier constructo que sea funcionalmente equivalente está dentro del ámbito de esta invención. El depósito de material en la presente no constituye un reconocimiento de que la descripción escrita contenida en la presente es inadecuada para habilitar en la práctica de cualquier aspecto de la invención, que incluye el mejor modo de la misma y debe considerarse como limitante del alcance de las reivindicaciones. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en este documento se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción siguiente y se encontrarán dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se entiende que la solicitud de las enseñanzas de la presente invención a un problema o situación específico está dentro de las capacidades de una persona con habilidad habitual en la técnica, en base en las enseñanzas contenidas en este documento. Los detalles adicionales de la invención se ilustran por los siguientes ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan de manera expresa en la presente como referencia. Ejemplo 1 La Asociación, que depende de HRG de ErbB2 con ErbB3 se bloquea por el anticuerpo monoclonal 2C4 El anticuerpo monoclonal murino 2C4, el cual se une específicamente al dominio extracelular de ErbB2 se describe en O 01/89566, cuya descripción se incorpora de manera expresa como referencia en su totalidad. La capacidad de ErbB3 para asociarse con ErbB2 se prueba en un experimento de coinmunoprecipitación. Se siembran 1.0 x 10s células MCF7 o SK-BR-3 en placas de cultivo de seis pozos en 50:50 de DMEM/medio F12 de Ham que contiene suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) , 10% y HEPES 10 m , pH 7.2 (medio de crecimiento) y se permite que se unan durante la noche. A las células se les retiran los nutrientes dos horas en medio de crecimiento sin suero antes de comenzar el experimento . Las células se lavan brevemente con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y después se incuba ya sea con 100 nM del anticuerpo indicado diluido en albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés), 0.2% p/v, medio RPMI con HEPES 10 mM, pH 7.2 (amortiguador de unión) o con amortiguador de unión solo (control) . Después de una hora a temperatura ambiente se agrega HRG a una concentración final de 5 nM a la mitad de los pozos (+) . Se agrega un volumen similar de amortiguador de unión a los otros pozos (-) . Se continúa la incubación durante aproximadamente 10 minutos. Se retiran los sobrenadantes por aspiración y las células se lisan en RPMI, HEPES 10 mM, pH 7.2, TRITON X-lOO1^ 1.0% v/v, CHAPS (amortiguador de lisis) 1.0% p/v que contiene PMSF 0.2 mM, 10 ug/ml de leupeptina y 10 TU/ml aprotinina. Los Usados se purifican de material insoluble por centrifugación. Se inmunoprecipit n ErbB2 utilizando un anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente a un gel de afinidad (Affi-Prep 10, Bio-Rad) . Este anticuerpo (Ab-3, Oncogene Sciences, USA) reconoce un epítopo de dominio citoplásmico . La inmunoprecipitación se realiza al agregar 10 µ? de suspensión de gel que contiene aproximadamente 8.5 de anticuerpo inmovilizado para cada lisado y se permite que las muestras se mezclen a temperatura ambiente durante 2 horas. Los geles después se recolectan por centrifugación. Los geles se lavan por lotes tres veces con amortiguador de lisis para separar el material no unido. Después se agrega el amortiguador de muestra SDS y las muestras se calientan brevemente en un baño maría en ebullición. Los sobrenadantes se corren en geles de poliacrilamida 4-12% y se someten a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa . Se determina la presencia de ErbB3 al sondear las manchas con un anticuerpo policlonal contra un epítopo de dominio citoplásmico del mismo (c-17, Santa Cruz Biotech) . Las manchas se visualizan utilizando un sustrato quimiolumuniscente (ECL, Amersham) . Como se muestra en los carriles de control de las figuras 2A y 2B, para las células CF7 y SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 está presente en un inmunoprecipitado de ErbB2 únicamente cuando las células son estimuladas con HRG. Si las células se incuban primero con anticuerpo monoclonal 2C4, se suprime la señal ErbB3 en células MCF7 (figura 5A, carril 2C4+) o se reducen sustancialmente .en SK-BR-3 (figura 5B, carril 2C4+) . Como se muestra en las figuras 2A-B, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la asociación dependiente de herregulina de ErbB3 con ErbB2 en células tanto MCF7 como SK-BR-3, sustancialmente de manera más eficaz que HERCEPTINMR. La preincubacion con HÉRCEPTINMR disminuye la señal ErbB3 en Usados MCF7 que tienen poco o nulo efecto sobre la cantidad de ErbB3 que coprecipita a partir de Usados de SK-BR-3. La preincubación con un anticuerpo contra el receptor EGF (Ab-1, Incogene Sciences, USA) no tiene efecto en la capacidad de ErbB3 para coinmunoprecipitarse con ErbB2 en cualquiera de las lineas celulares . Ejemplo 2 Capacidad de respuesta de la línea de células y de los modelos de xenoinjerto de tumor humano a 2C4 Se han probado aproximadamente 40 modelos de tumor para determinar la capacidad de respuesta a 2C4. Estos modelos representan cánceres mayores tales como de mama, pulmón, próstata y colon. Un porcentaje de 50-60% de los modelos responden al tratamiento con 2C . La tabla 1 muestra listas seleccionadas de modelos de tumor probadas para determinar su capacidad de respuesta a 2C4. Brevemente, los fragmentos de xenoinjerto de tumor humano de un tamaño de aproximadamente 3 mm se transplanta debajo de la piel de ratones atímicos lampiños. De manera alternativa, las células tumorales humanas que se hacen crecer in vitro se separan de los recipientes de cultivo, se resuspenden en solución salina amortiguada con fosfato y se inyecta subcutáneamente en el matraz de los ratones inmunocomprometidos . Se verifica el crecimiento de los tumores cada 2 a 3 días utilizando un calibrador eléctrico. Cuando los tumores alcanzan un tamaño de aproximadamente 30 a 100 mm los animales son distribuidos aleatoriamente en grupos diferentes tanto de tratamiento como control. Se administra 2C4 por inyección intraperitoneal una vez cada semana. Los animales control reciben volúmenes iguales de solución de vehículo que no contiene anticuerpo en el mismo programa que los grupos de tratamiento. El estudio finaliza después de aproximadamente 3-6 semanas, cuando los tumores del grupo control alcanzan un tamaño de aproximadamente 1000-1500 mm3. La capacidad de respuesta al tratamiento se define como >50% de reducción en el volumen del tumor. Tabla 1: Modelos de xenoinjerto Modelo # Modelo de tumor Capacidad de respuesta Referencia a 2C4 1 LXFA 289 No (Fiebig et al., 1999) 2 LXFA 297 Si 3 LXFA 526 No (Fiebig et al., 1999) 4 LXFA 629 Si (Fiebig y Burger, 2002) 5 LXFA 1041 No 6 LXFE 211 No (Fiebig et al., 1999) 7 LXFE 397 No (Fiebig et al., 1999) 8 LXFL 529 No (Burger et al., 2001) 9 LXFL 1072 Si (Fiebig et al., 1999) 10 Calu-3 Si (Stein et al., 2001) 11 NCI-H522 Si (Yamori et al., 1997) 12 NCI-H322 No (Zou et al., 2001) 13 NCI-H441(KAM) Si (Gridley et al., 1996) 14 MAXF MXI No 15 MAXF 401 No (Fiebig et al.., 1999) 16 MAXF 449 Si (Burger et al., 2001) 17 MAXF 713 No (Burger et al., 1992) 18 MAXF 857 No (Fiebig et al., 1999) Los modelos representan dos tipos de tumores principales, específicamente el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC; modelos # 1-13) y cáncer mamario (modelos #14-18) . Nueve de los modelos NSCLC (#1-9) y todos los modelos de cáncer de mama se derivan por el pasaje in vivo seriado de los fragmentos de tumor humano en ratones inmunodef icientes . Los modelos NSCLC remanentes (#10-13) son modelos basados en célula en los cuales el crecimiento de tumor in vivo es inducido por la implantación de células propagadas in vitro dentro de ratones inmunodeprimidos . Berger, D. P., Winterhalter , B. R. and Fiebig, H. H. (1992) . Est bl i shment and Characteri zation of Human Tumor Xenograft in Thmus-Aplastic Nude Mice . In Inmunodeficient Mice in Oncology, H. H. Fiebig and D. P. Berger, eds . (Basel : Karger) , PP . 23-46. Burger, A. M . Hartung, G., Stehle, G . , Sinn, H., and Fiebig, H. H. (2001) . Pre-clinical evaluation of a methotrexate-albumin conjúgate (MTX-HSA) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Cáncer, 92 : 718 -24. Fiebig, H. H . , and Burger, A. M. (2002) . Human Tumor Xenografts and Explants. In Tumor Models in Cáncer Research, B. A. Teicher, ed (Totowa, New Jersey:Humana Press) pp. 113-137. Fiebig, H. H., Dengler, W. A., and Roth, T. (1999). Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents. In Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, H. H. Fiebig and A. M. Burger, eds . (Basel : Karger) , pp. 29-50. Gridley, D. S., Andrés, M. L., Garner, C, Mao, X.

W., and Slater, J. M. (1996). Evaluation of TNF-alpha effects on radiation efficacy in a human lung adenocarcinoma model . Oncol Res., 8_:485-95. Stein, R., Govindan, S. V., Chen, S., Reed, L. , Spiegelman, H.( Griffiths, G. L., Hansen, H. J. , and Goldenberg, D. M. (2001). Successful therapy of a human lung cáncer xenograft using MAb RS7 labeled with residualizing radioiodine. Crit. Rev. Oncol. Hematol . , 39 :173-80. Yamori, T., Sato, S., Chikazawa, H. , and Kadota, T. (1997) . Anti-tumor efficacy of paclitaxel againts human lung cáncer xenografts. Jpn. J. Cáncer Res., 88 : 1205-10. Zou, Y., Wu, Q. P., Tansey, ., Chow, D., Hung, M. C, Charnsangavej , C, Wallace, S., and Li, C. (2001). Effectiveness of water soluble poly (L-glutamic acid) -camptothcin conjúgate against resistant human lung cáncer xenografted in nude mice. Int. J. Oncol . 18 : 331-6. Ejemplo 3 Detección de heterodímeros por inmunoprecipitación en tumores que responden a 2C4 Los tumores que responden y que no responden a 2C4 se someten a inmunoprecipitación con anticuerpos contra ErbB2 para realizar ensayos para determinar la presencia de heterodímeros ErbB2-ErbB3 y EGFR-ErbB2. A menos que se establezca de otra manera, los métodos se realizan de acuerdo con Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. Se seleccionan anticuerpos contra HER2 y contra HER3 así como contra HERI de manera que no den reacción cruzada. Para determinar si los anticuerpos dan reacción cruzada, los receptores HERI, HER2 , HER3 y HER4 se expresan en células 293 de riñon embriónico humano (HEK, por sus siglas en inglés) . Las células se lisan utilizando TritonMR X100 (1% en peso por volumen) que contiene amortiguador HEPES, pH 7.5. Aproximadamente 20 g de la proteína de células totales de las células control y células que expresan HERI, HER2 , HER3 y HER4 se separan en un gel de SDS y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa por medio de un procedimiento de transferencia semiseco. Después de bloquear con gelatina, se prueban una diversidad de anticuerpos contra HERI, contra HER2 y contra HER3 para determinar su reactividad cruzada contra otros receptores de ErbB . Los anticuerpos seleccionados para uso en los experimentos que se describen posteriormente no muestran ninguna reactividad cruzada significativa. Se trituran mecánicamente en hielo muestras de tumor frescas y se lisan en un amortiguador que contiene HEPES 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, MgCl2 1.5 mM, EDTA 1 mM, glicerol 10% (p/v) , TritonMR X-100 1% (p/v) , PMSF 1 mM, 10 g/ml de aprotinina y ortovanadato 0.4 mM . Los tumores _ lisados completamente se centrifugan varias veces hasta que el sobrenadante es completamente transparente. La inmunoprecipitación procede al combinar listado de tumores depurados (5-7 mg de proteina por lisado) , 5 \ig de anticuerpo contra ErbB2 (ab-3, monoclonal de ratón; Cat.#OP15, Oncogene Inc., USA) y 50 µ? de agarosa acoplada a proteína G en tubos de reacción Eppendorf de 1.5 mi. Ante la adición de uno de los dos volúmenes de amortiguador HEPES 50 mM, pH 7.5 que contiene TritonMR X-100 0.1% (p/v), los tubos se hacen girar durante 3-4 horas a 4°C seguido por centrifugación. Los sedimentos se lavan dos o tres veces más con 500 µ? de amortiguador HEPES 50 mM, pH 7.5 que contiene TritonMR X-100 0.1% (p/v) . Se agrega un volumen igual de amortiguador de muestra Lámmli 2x al inmunoprecipitado lavado y las muestras se calientan durante 5 min a 95°C. Las muestras se separan por SDS-PAGE y se transfieren a nitrocelulosa . Se determina la presencia de heterodímeros EGFR-ErbB2 y ErbB2-ErbB3 al sondear las manchas con anticuerpos contra EGFR (anticuerpo policlonal de conejo contra EGFR, Upstate Inc. , USA; Cat . # 06-847 ) y ErbB3 (anticuerpo policlonal contra ErbB3 ; Santa Cruz Inc., USA; Cat. #SC-285) . Se utiliza como un anticuerpo secundario un anticuerpo contra Fe de conejo marcado con peroxidasa (POD) (Bio-Rad Laboratories Inc. USA) . Las manchas se visualizan utilizando un sustrato de guimioluminiscencia (ECL plus, Amersham) . La figura 3 muestra los resultados de estos experimentos. Se puede ver la presencia de los heterodímeros ErbB2-ErbB3 o EGFR-ErbB2. Se observa una correlación entre la capacidad de respuesta de 2C4, como se muestra en la tabla 1, y la presencia de heterodímeros ErbB2-ErbB3 o EGFR-ErbB2.

Ejemplo 4 Relación de la capacidad de respuesta de rhuMAb 2C4 con. la fosforilación de HER2 Se estudia el efecto de rhuMAb 2C4 en el crecimiento de tumores en 14 tumores humanos explantados en ratones (9 cánceres de pulmón y 5 cánceres de mama) . La explicación del tumor y tratamiento se realiza como se describe en el ejemplo 2. Se detectan heterodimeros de HER2 , como se describe en el ejemplo 3. La fosforilación de HER2 se determina por inmunoprecipit ación de HER2 y análisis de transferencia Western. Se determina la condición positiva por la presencia de la banda fosfo-HER2 del gel . Se determina la condición negativa por la ausencia de la banda. Se confirma la fosforilación de HER2 por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo contra HER2 fosfoespecífico (clon PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol . , !L8_:3230-9 (2000) . En 5 de los tumores probados (3 de pulmón y 2 de mama) , se observa una inhibición significativa del crecimiento de tumor, lo que se relaciona con la presencia de het erodimeros detectables de HER2 ya sea con HERI o con HER3 , y con fosforilación fuerte de HER2 en todos los casos . En 9 tumores en los cuales no se observa una respuesta significativa al tra miento con rhuMAb 2C4, los heterodímeros no se detectan y está ausente la fosforilación de HER2. La presencia de la heterodimerización de HER2 o la fosforilación significativa de HER2 es un elemento de predicción fuerte de la respuesta al tratamiento de rhuMAb 2C4 en modelos no clínicos. Se han realizado observaciones similares con xenoinjertos generados a partir de líneas de células tumorales.

Ej em lo 5 Detección de fosforilación de HER2 en tumores que responden a 2C4 Se determina la eficacia de rhuMAb 2C4 en 9 modelos de tumor xenoinj ert do de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) establecido de los modelos de tumor (LXFE 211, LXFA 289 , LXFA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFL 529, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Friburgo, Alemania) . Los xenoinjertos de tumor humano se consideran como los modelos más pertinentes para el desarrollo de medicamentos ant i cancerígenos dado que los tumores del paciente están creciendo como un tumor sólido, se desarrollan como una estroma, vasculatura o necrosis central y muestra la diferenciación en domo. Además, los modelos de tumor xenoinj ertados se parecen muy estrechamente .a los tumores originales tanto en histología como en guimiosensibilidad . Se determina la inhibición del crecimiento como se describe en el ejemplo 2. La actividad inhibidora de crecimiento significativa se define como inhibición de crecimiento >50% del grupo de tratamiento en relación al grupo control . En tres de los modelos NSCLC (LXFA 297, LXFA 629 y LXFL 1072 ), se observa una respuesta inhibidora de crecimiento significativa al tratamiento con rhuMAb 2C4. También se han investigado varios puntos notables de HER2 activado por ligando a nivel de proteína. Como se muestra en la figura 4, HER2 puede ser inmunoprecipitado a partir de extractos de tumor de ocho a nueve tumores NSCLC. Para determinar el estado de activación de HER2 , estos puntos después se someten a sondeo con un anticuerpo contra fosfotirosina (contra PY) . Como se muestra en el panel inferior de la figura 4, los tres tumores sensibles (LXFA 297, LXFA 629 y 1072) muestran una activación fuerte para HER2.

Ej emplo 6 Estudio clínico para identificar pacientes con cáncer de pulmón para tratamiento con rhu Ab 2C4 mediante la detección de heterodímeros de HER2 Se identifica a un paciente el cual presenta cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , que responde al tratamiento con rhuMAb 2C4 si un tumor del paciente se encuentra que comprende los complejos HER2/HER3, HER2 /HERI o HER2 /HER4. Se obtiene una muestra de tumor por biopsia o durante extirpación quirúrgica del tumor. Después la muestra se analiza para determinar la presencia de heterodímeros HER2/HER3, HER2 /HERI o HER2 /HER4. Las células tumorales o los Usados celulares se ponen en contacto con eTagMR que une específicamente HER2. El compuesto eTagMR comprende una porción detectable y una primera porción de unión que es específica para HER2. La porción detectable se une a la primera porción de unión con un enlazante susceptible de ser separado. Después de permitir el tiempo de unión, se retira eTagMR. Las células tumorales o lisados celulares se ponen en contacto con un segundo compuesto de unión que une específicamente HERI o HER3 o HER . El compuesto no unido se retira por lavado. Después se activa el segundo compuesto de unión. Si el primer compuesto de unión y el segundo compuesto de unión están en proximidad cercana, el segundo compuesto de unión activado separa en enlazante susceptible de ser separado en eTagMR para producir una porción detectable libre. La identificación de la porción detectable libre en la muestra indica que el tumor comprende he erodímeros HER2/HER1, HER2 /HER3 o HER2 /HER4. Ante la determinación de que el paciente presenta un tumor que comprende los heterodímeros HER2/HER1, HER2/HER3 o HER2 /HER , se administra rhuMAb 2C4 por vía intravenosa (IV) semanalmente o cada tres semanas, a 2 o 4 mg/kg, respectivamente, hasta el mejoramiento de la enfermedad. El anticuerpo se suministra como una formulación líquida de dosis múltiples (20 mi llenados a una concentración de 20 mg/ml o una concentración superior) . Los puntos finales primarios para eficacia incluyen la tasa de respuesta y la seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: supervivencia general, tiempo de mejoramiento de la enfermedad, calidad de vida o duración de respuesta.

Ejemplo 7 Estudio clínico para identificar a pacientes con cáncer para tratamiento con rhuMAb 2C4 Se obtiene una muestra biológica que comprende células cancerosas de candidatos para el tratamiento, por ejemplo mediante biopsia o tejido tumoral , aspiración de células tumorales de fluido ascitico o por cualquier otro método conocido en la práctica clínica. La muestra biológica se analiza para determinar fosforilación de HER2 , por ejemplo mediante inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western o para determinar la presencia de heterodímeros HER2/HER3, HER2 /HERI o HER2/HER4 por cualquiera de las técnicas descritas en lo anterior. Los sujetos cuya muestra biológica es positiva para fosforilación de HER2 o para la presencia de heterodímeros HER2/HER3, HER2 /HERI o HER2/HER4, es probable que muestren una mejor respuesta al tratamiento con rhuMAb 2C4 en comparación con los pacientes cuya muestra de tumor no muestra fosforilación de HER2 o en donde no se detecta heterodímero . Por ejemplo, a los sujetos a quienes se les diagnóstica cáncer de ovario experimentarán una biopsia de tejido de tumor o aspiración de células tumorales de fluido ascitico. Este tejido será analizado para determinar fosforilación de HER2 mediante inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western. Esto requerirá un mínimo de aproximadamente 250 mg de tejido de tumor. Ante la determinación de que el paciente padece de cáncer (tal como cáncer de próstata resistente a castración- CRPC , por sus siglas en inglés, o cáncer de ovario) que es positivo para la fosforilación de HER2 , el paciente recibirá una dosis de carga de 840 mg de rhuMAb 2C4 en el día 1 del ciclo 1 (primer período de tratamiento de 21 días) seguido por 420 mg en el día 1 de cada ciclo subsecuente de 21 días, como infusión intravenosa continua. El tratamiento continúa por infusión intravenosa cada tres semanas hasta por un año (17 ciclos) , para pacientes quienes no muestran evidencia de progreso de enfermedad. El tratamiento se puede suspender en cualquier momento anterior, por falta de respuesta, efectos adversos u otras razones, a criterio del médico. Todas las referencias mencionadas en esta descripción y las referencias que se mencionan en la presente se incorporan de manera expresa en la presente como referencia . Aunque la presente invención se describe con referencia a ciertas modalidades, la invención no está limitada a estas. Una persona experta en la técnica apreciará que son posibles diversas modificaciones sin alterar sustancialmente la invención. La totalidad de tales modificaciones, las cuales se pueden realizar sin experimentación indebida, se considera que están dentro del alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para identificar un tumor como sensible a tratamiento con un anticuerpo contra HER2, caracterizado porque comprende: a) detectar la presencia de complejo proteínico

HER2/HER3 o HER2/HERI en una muestra del tumor; c) identificar un tumor como sensible a tratamiento con anticuerpo contra HER2 cuando se detecta un complej o . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo contra HER2 bloquea la activación de ligando de un heterodímero de ErbB que comprende HER2.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo contra HER2 es el anticuerpo monoclonal 2C .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo contra HER2 es rhuMAb 2C4.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue la presencia de un complejo proteinico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 se detecta por: a) inmunoprecipitación de cualquier complejo proteinico que comprenda a HER2 con un anticuerpo contra HER2 ; b) poner en contacto los complejos inmunoprecipitados con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3 y anticuerpos contra HERI ; y c) determinar si un anticuerpo contra HER3 y/o contra HERI se une a los complejos inmunoprecipitados, en donde se detecta un complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 si se determina que los anticuerpos contra HER3 y/o contra HERI se unen a los complejos inmunoprecipitados.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia de un complejo proteinico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 se detecta por: a) poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo contra HER2 que comprende un fluoroforo,- b) poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3 y contra HERI, en donde el anticuerpo comprende un segundo fluoroforo; c) determinar si el primer fluoroforo y el segundo fluoroforo están en proximidad cercana al medir la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, en donde la presencia de un complejo proteínico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 se detecta en el primero y segundo fluoróforo y se determina que están en proximidad cercana.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia de un complejo proteinico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 se detecta al: a) poner en contacto la muestra de tumor con un primer compuesto de unión, en donde el primer compuesto de unión comprende una primera porción de unión objetivo que une específicamente HER2 y que comprende además una porción detectable unida a la primera porción de unión objetivo mediante un enlazante separable,- b) poner en contacto la muestra de tumor con un segundo compuesto de unión, en donde el segundo compuesto de unión comprende una segunda porción de unión objetivo que une específicamente HER3 o HERI y un agente de separación activable ,- c) activar el agente de separación de manera tal que si el primer compuesto de unión y el segundo compuesto de unión están en proximidad cercana, el segundo compuesto de unión separa el enlazante separable en el primer compuesto de unión para producir una porción detectable libre; y d) identificar la presencia de la porción detectable libre, en donde se detecta la presencia del complejo proteínico HER2/HER3 o HER2/HERI cuando se identifica la porción detectable libre.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la primera porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HER2.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la primera porción de unión objetivo comprende un ligando receptor de HER2.

10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HER3.

11. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un ligando receptor HER3.

12. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HERI.

13. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un ligando receptor de HERI.

14. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la muestra se obtiene de un paciente que padece del tumor.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la muestra se obtiene de una biopsia del tumor .

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la muestra se obtiene al purificar células tumorales que circulan en la sangre del paciente.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la muestra se obtiene durante cirugía para extirpar el tumor del paciente.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de tumor se obtiene de un ratón.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el tumor es un tumor xenoin ertado .

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el tumor xenoinj ertado se produce al transplantar un fragmento de un tumor humano en un ratón.

21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un tumor de pulmón.

22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un tumor mamario.

23. Un método para identificar células tumorales como sensibles al tratamiento con un anticuerpo que inhibe la asociación de HER2 con otro miembro de la familia de receptor ErbB, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una muestra biológica que comprende células tumorales positivas par HER2 ; y (b) detectar la fosforilación de un receptor ErbB en la muestra biológica, en donde la fosforilación indica que las células tumorales responden al tratamiento con el anticuerpo.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque se detecta la fosforilación de un receptor ErbB2 (HER2) .

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el otro miembro se selecciona del grupo que consiste de HER3 , HERI y HER .

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo une HER2.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo contra HER2 bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo es rhuMAb 2C4.

29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo une HER3.

30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo une HERI.

31. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo une HER4.

32. El método de conformidad con la reivindicación 23 caracterizado porque comprende adicionalmente detectar la presencia de por lo menos un complejo proteinico que se selecciona del grupo que consiste de HER2/HER3, HER2/HER1 y HER2/HER4 en la muestra.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la presencia del complejo o complejos proteínicos se detecta por: a) inmunoprecipitar cualquier complejo proteinico que comprende a HER2 con un anticuerpo contra HER2 ,- b) poner en contacto el complejo inmunoprecipitado con por lo menos un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3, contra HERI y contra HER4 ; y c) determinar si el anticuerpo contra HER3 , contra HERI y/o contra HER4 se une al complejo inmunoprecipi ado, en donde se detecta el complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 si se determina que los anticuerpos contra HER3 y/o contra HERI y/o contra HER4 se unen al complejo inmunoprecipitado.

34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la presencia del complejo o complejos proteinicos se detecta por: a) poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo contra HER2 que comprende un fluoróforo,- b) poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3 , contra HERI y contra HER4,. en donde el anticuerpo comprende un segundo fluoróforo; c) determinar si el primer fluoróforo y el segundo fluoróforo están en proximidad cercana al medir la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, en donde la presencia del complejo proteínico HER2/HER3 o HER2/HER1 o HER2/HER4 se detecta si se determina que el primero y segundo fluoróforo están en proximidad cercana.

35. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la presencia del complejo o complejos proteinicos se detecta por: a) poner en contacto la muestra de tumor con un primer compuesto de unión, en donde el primer compuesto de unión comprende una primera porción de unión objetivo que une específicamente HER2 y que comprende además una porción detectable unida a la primera porción de unión objetivo por un enlazante separable; b) poner en contacto la muestra de tumor con un segundo compuesto de unión, en donde el segundo compuesto de unión comprende una segunda porción de unión objetivo que une específicamente HER3 o HERI o HER4 y un agente de separación activable ; c) activar el agente de separación de manera que si el primer compuesto de unión y el segundo compuesto de unión están en proximidad cercana, el segundo compuesto de unión separa el enlazante separable en el primer compuesto de unión para producir una porción detectable libre; y d) identificar la presencia de la porción detectable libre, en donde se detecta la presencia del complejo proteínico HER2/HER3, HER2/HER1 o HER1/HER4 cuando se identifica la porción detectable libre.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la primera porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HER2 , o un ligando receptor de HER2.

37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra HER3 o un ligando receptor de HER3.

38. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HERI o un ligando receptor de HERI .

39. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra HER4 , o un ligando receptor HER .

40. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la muestra biológica es tejido que se obtiene de una biopsia de tumor.

41. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la muestra biológica es un fluido biológico que comprende células tumorales circulantes y/o proteínas plasmáticas circulantes.

42. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el tumor se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorectal y cáncer de ovario.

43. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la fosforilación del receptor ErbB se determina por inmunoprecipitación del receptor ErbB y análisis de transferencia Western.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la fosforilación del receptor ErbB está indicada por la presencia de una banda de fosfo-receptor ErbB en el gel .

45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porgue comprende además la etapa de confirmar la fosforilación del receptor ErbB por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo receptor contra ErbB fosfoespecifico .

46. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la fosforilación del receptor ErbB se determina por inmunohistoquímica.

47. Un método para predecir la respuesta de un sujeto a quien se le diagnostica con un tumor positivo para HER2 para el tratamiento con un anticuerpo que inhibe la asociación de HER2 con otro miembro de la familia del receptor ErbB, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una muestra biológica que se obtiene del sujeto, que comprende células tumorales positivas a HER2; y (b) detectar la fosforilación de un receptor ErbB en la muestra biológica, en donde la fosforilación indica que el paciente es probable que responda al tratamiento con el anticuerpo.

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el receptor ErbB es ErbB2 (HER2) .

49. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el otro miembro se selecciona del grupo que consiste de HER3 , HERI y HER4.

50. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el anticuerpo une HER2.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo contra HER2 bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2. .

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el anticuerpo es r uMAb 2C4.

53. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el anticuerpo une HER3.

54. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el anticuerpo une HERI.

55. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el anticuerpo une HER4.

56. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque comprende adicionalmente detectar la presencia de por lo menos un complejo proteínico que se selecciona del grupo que consiste de HER2/HER3, HER2/HER1 y HER2/HER4 en la muestra.

57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque se detecta la presencia del complejo proteínico por: a) inmunoprecipitación de cualquier complejo proteínico que comprende HER2 con un anticuerpo contra HER2 ; b) poner en contacto los complejos inmunoprecipitados con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3 , contra HERI y contra HER4 ,- y c) determinar si un anticuerpo contra HER3 , contra HERI y/o contra HER4 se une a los complejos inmunoprecipitados , en donde se detecta el complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 si se determina que los anticuerpos contra HER3 y/o contra HERI y/o contra HER4 se unen a los complejos inmunoprecipitados.

58. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque se detecta la presencia del complejo proteinico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 por: a) poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo contra HER2 que comprende un fluoroforo; b) poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos contra HER3, contra HERI y contra HER4 , en donde el anticuerpo comprende un segundo fluoroforo; c) determinar si el primer fluoroforo y el segundo fluoroforo están en proximidad cercana al medir la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, en donde se detecta la presencia del complejo proteinico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 si se determina que el primero y segundo fluoroforo están en proximidad cercana.

59. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque se detecta la presencia de el complejo proteínico HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 por : a) poner en contacto la muestra de tumor con un primer compuesto de unión, en donde el primer compuesto de unión comprende una primera porción de unión objetivo que une específicamente HER2 y que comprende además una porción detectable unida a la primera porción de unión objetivo por un enlazante separable; b) poner en contacto la muestra de tumor con un segundo compuesto de unión, en donde el segundo compuesto de unión comprende una segunda porción de unión objetivo que une específicamente HER3 o HERI o HER4 y un agente de separación activable; c) activar el agente de separación de manera que si el primer compuesto de unión y el segundo compuesto de unión están en proximidad cercana, el segundo compuesto de unión separa el enlazante separable en el primer compuesto de unión para producir una porción detectable libre; y d) identificar la presencia de la porción detectable libre, en donde se detecta la presencia del complejo proteínico HER2/HER3 o HER2/HER1 o HER1/HER4 cuando se identifica la porción detectable libre.

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la primera porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo contra HER2, o un ligando receptor de HER2.

61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra HER3 o un ligando receptor de HER3.

62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra HERI o un ligando receptor de HERI .

63. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque la segunda porción de unión objetivo comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra HER4 , o un ligando receptor de HER4.

64. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la muestra biológica es tejido que se obtiene de una biopsia de tumor.

65. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la muestra biológica es un fluido biológico que comprende células tumorales circulantes o proteínas plasmáticas circulantes.

66. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el tumor se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorectal y cáncer de ovario.

67. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la fosforilación del receptor ErbB se determina por inmunoprecipi ación del receptor ErbB y análisis de transferencia Western.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la fosforilación del receptor ErbB está indicada por la presencia de una banda de fosfo-receptor ErbB en el gel .

69. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque comprende además la etapa de confirmar la fosforilación del receptor ErbB por inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo receptor contra ErbB fosfoespecífico .

70. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la fosforilación del receptor ErbB se determina por inmunohistoquimica .

71. Un método para identificar a un sujeto que responde al tratamiento con un anticuerpo contra HER2, caracterizado porque comprende: a) detectar la fosforilación de un receptor ErbB en células tumorales circulantes del sujeto, y b) determinar que el sujeto es probable que responda al tratamiento con un anticuerpo contra HER2 si se detecta la fosforilación.

72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque se detecta la fosforilación de ErbB2 (HER2) .

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el sujeto es un humano.

74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque comprende además tratar al sujeto con un anticuerpo contra HER2.

75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el anticuerpo contra HER2 es rhuMAb 2C4.

76. Un método para tratar a un paciente caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo el cual une HER2 , en donde el paciente padece de un tumor el cual se ha determinado que tiene heterodímeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4.

77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2.

78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 2C4.

79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es rhuMAb 2C4.

80. Un articulo de manufactura caracterizado porque comprende un recipiente que comprende un anticuerpo el cual une HER2 e instrucciones para administrar el anticuerpo a un paciente quien padece de un tumor en donde el tumor se ha determinado que comprende heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER .

81. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2.

82. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el recipiente comprende anticuerpo monoclonal 2C4.

83. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el recipiente comprende rhuMAb 2C . 8 . Un método para tratar un paciente caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo el cual une HER2 , en donde el paciente padece de un tumor el cual se ha determinado que tiene un receptor ErbB fosforilado. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el receptor ErbB es HER2. 86. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la activación de ligando de un heterodímero ErbB que comprende HER2. 87. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 2C . 88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el anticuerpo es rhuMAb 2C4.