PL214010B1 - Rekombinowane humanizowane przeciwcialo 2C4 i zastosowanie tego przeciwciala - Google Patents

Rekombinowane humanizowane przeciwcialo 2C4 i zastosowanie tego przeciwciala

Info

Publication number
PL214010B1
PL214010B1 PL377743A PL37774303A PL214010B1 PL 214010 B1 PL214010 B1 PL 214010B1 PL 377743 A PL377743 A PL 377743A PL 37774303 A PL37774303 A PL 37774303A PL 214010 B1 PL214010 B1 PL 214010B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
erbb2
antibodies
cells
her2
Prior art date
Application number
PL377743A
Other languages
English (en)
Other versions
PL377743A1 (pl
Inventor
Hans Koll
Birgit Bossenmaier
Hans-Joachim Müller
Mark X. Sliwkowski
Stephen Michael Kelsey
Original Assignee
Genentech Inc
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=30118578&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL214010(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc, Hoffmann La Roche filed Critical Genentech Inc
Publication of PL377743A1 publication Critical patent/PL377743A1/pl
Publication of PL214010B1 publication Critical patent/PL214010B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego humanizowanego przeciwciała 2C4 i zastosowania tego przeciwciała. Wynalazek opisuje także sposoby identyfikowania nowotworu, jako nowotworu wrażliwego na leczenie przeciwciałami anty-HER2 praż pozwala na opracowanie sposobów leczenia pacjentów cierpiących na takie nowotwory.
Tło wynalazku
Rodzina receptorowych kinaz tyrozynowych ErbB stanowi ważne mediatory komórkowego wzrostu, różnicowania i przeżycia. Ta rodzina receptorów obejmuje czterech różnych przedstawicieli włączając receptor naskórkowego czynnika wzrostowego (epidermal growth factor - EGFR lub ErbB1), HER2 (ErbB2 lub pl85neu), HER3 (ErbB3) oraz HER4 (ErbB4 lub tyro2).
EGFR kodowany przez gen erbB1 został wskazany, jako przyczynowo związany ze złośliwieniem nowotworów u ludzi. W szczególności, obserwowano podwyższoną ekspresję EGFR w nowotworze piersi, pęcherza, płuc, głowy, szyi oraz żołądka jak również wglejaku. Podwyższona ekspresja receptora EGFR często związana jest z podwyższoną produkcją ligandu EGFR, transformującego czynnika wzrostowego alfa (ang. transforming growth factor alpha - TGF-α) przez te same komórki nowotworowe, co powoduje aktywację receptora przez autowydzielniczą ścieżkę stymulatorową. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). Dodatkowo, opisane zostało białko pokrewne receptorowi naskórkowego czynnika wzrostowego (ERRP) zawarte w sklonowanym fragmencie cDNA o wielkości 1583 par zasad z 90-95% homologią sekwencji do mysiego EGFR i skróconego szczurzego EGFR (Patent USA Nr 6399743; oraz Publikacja USA Nr 2003/0096373). Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko EGFR lub jego ligandom, TGF-α oraz EGF zostały określone jako czynniki terapeutyczne w leczeniu takich nowotworów złośliwych. Patrz np. Baselga and Mendelsohn., jak wyżej; Masui i wsp., Cancer Research, 44: 1002-1007 (1984); oraz Wu i wsp., J. Clin. Invest„ 95: 1897-1905 (1995).
Drugiego przedstawiciela rodziny ErbB, pl85neu, początkowo zidentyfikowano jako produkt genu transformującego z nerwiaka szczurów traktowanych chemicznie. Aktywowana postać protoonkogenu neu jest rezultatem mutacji punktowej (zamiana waliny na kwas glutaminowy) w domenie transbłonowej kodowanego białka. Obserwuje się amplifikację ludzkiego homologu genu neu (HER2) w nowotworach piersi i jajników, i jest to skorelowane ze złym rokowaniem (Slamon i wsp., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon i wsp., Science, 244: 707-712 (1989); oraz Patent USA Nr 4968603). Dotychczas nie odnotowano żadnej mutacji punktowej analogicznej do tej w protoonkogenie neu dla ludzkich nowotworów. Nadmierną ekspresję ErbB2 (często, ale nie jedynie, spowodowaną amplifikacją genu) obserwowano także w innych rakach włączając raka żołądka, śluzówki macicy, ślinianek, płuc, nerek, okrężnicy, tarczycy, trzustki i pęcherza. Patrz, między innymi, King i wsp., Science, 229: 974 (1985); Yokota i wsp., Lancet, 1: 765-767 (1986); Fukushigi i wsp., Mol Celi Biol., 6: 955-958 (1986); Geurin i wsp., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen i wsp., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura i wsp., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst i wsp., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner i wsp., Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern i wsp., Cancer Res., 50: 5184 (1990); Park i wsp., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau i wsp., Mol. Carcinog., 3: 354-357 (1990); Aasland i wsp., Br. J. Cancer, 57: 358-363 (1988); Wiliams i wsp., Pathobiology, 59: 46-52 (1991); oraz McCann i wsp., Cancer, 65: 88-92 (1990). ErbB2 może ulec nadmiernej ekspresji w nowotworze prostaty (Gu i wsp., Cancer Lett., 99: 185-9 (1996); Ross i wsp., Hum. Pathol., 28: 827-33 (1997); Ross i wsp., Cancer, 79: 2162-70 (1997); oraz Sadasivan i wsp., J. Uroi., 150: 126-31 (1993)). Nadmierna ekspresja ErbB3 może prowadzić do wzrostu nowotworu przez niezależną od ligandu aktywację ErbB2 lub homodimerów ErbB2.
Opisano przeciwciała skierowane przeciwko produktom białkowym szczurzego pl85neu i ludzkiego ErbB2. Drebin i współpracownicy zgłosili przeciwciała przeciwko produktowi szczurzego genu neu, pl85neu. Patrz, na przykład, Drebin i wsp., Celi, 41: 695-706 (1985); Myers i wsp., Meth. Enzym., 198: 277-290 (1991), oraz WO94/22478. Drebin i wsp., Oncogene, 2: 273-277 (1988) donoszą, że mieszaniny przeciwciał reagujących z dwoma odrębnymi rejonami pl85neu mają w rezultacie synergistyczne anty-nowotworowe oddziaływania na komórki NIH-3T3 stransformowane neu, zaimplantowane do myszy bez grasicy. Patrz także Patent USA 5824311 złożony 20 października 1998.
Hudziak i wsp., Mol. Celi. Biol., 9(3): 1165-1172 (1989), opisują wytwarzanie panelu przeciwciał anty-ErbB2, które były charakteryzowane z użyciem linii komórkowej SK-BR-3 ludzkiego nowotworu piersi. Względną proliferację komórek SK-BR-3 po wystawieniu na działanie przeciwciał określano za
PL 214 010 Β1 pomocą barwienia fioletem krystalicznym pojedynczych warstw komórek po 72 godzinach. Przy użyciu tego oznaczenia ustalono maksymalne zahamowanie przy użyciu przeciwciała zwanego 4D5, które hamuje proliferację komórkową w 56%. Inne przeciwciała w tym oznaczeniu w panelu obniżały proliferację komórkową w mniejszym stopniu. Przeciwciało 4D5 okazało się następnie uwrażliwiać linie komórkowe nowotworu piersi z nadmierną ekspresją ErbB2 na cytotoksyczne wpływy TNF-α. Patrz także Patent USA Nr 5677171 złożony 14 października 1997. Przeciwciała anty-ErbB2 dyskutowane w Hudziak i wsp., są dalej charakteryzowane w Fendly i wsp., Cancer Research, 50: 1550-1558 (1990); Kotts i wsp., In Vitro, 26(3): 59A (1990); Sarup i wsp., Growth Regulation, 1: 72-82 (1991); Shepard i wsp., J. Clin. Immunol., 11(3): 117-127 (1991); Kumar i wsp., Mol. Celi. Biol., 11(2): 979-986 (1991); Lewis i wsp., Cancer Immunol. Immunother., 37: 255-263 (1993); Pietras i wsp., Oncogene, 9: 1829-1838 (1994); Vitetta i wsp., Cancer Research, 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski i wsp., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994); Scott i wsp., J. Biol. Chem., 266: 14300-5(1991); D'souza i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 7202-7206 (1994); Lewis i wsp., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996); oraz Schaefer i wsp., Oncogene, 15:1385-1394 (1997).
Zrekombinowana humanizowana wersja mysiego przeciwciała 4D5 anty-ErbB2 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 lub HERCEPTIN®; Patent USA Nr 5,821,337) jest aktywna klinicznie u pacjentów z nowotworami piersi, z nadmierną ekspresją ErbB2, w stadium przerzutów, którzy wcześniej otrzymywali szeroką terapię anty-nowotworową (Baselga i wsp., J. Clin. Oncol., 14: 737-744 (1996)). HERCEPTIN® uzyskał zgodę na wprowadzenie do obrotu przez Food and Drug Administration 25 września 1998 w zakresie leczenia pacjentów z przerzutowym nowotworem piersi, których nowotwory miały nadmierną ekspresją białka ErbB2. Jednakowoż nie wszystkie nowotwory z nadekspresją ErbB2 reagują na HERCEPTIN® - (Brockhoff i wsp., Cytometry., 44: 338-48 (2001)). Dodatkowo przedkliniczne dane sugerują, że HERCETNIN® może być terapeutycznie skuteczny w leczeniu niedrobnokomókowego nowotworu płuc (ang. non smali celi lung kancer, NSCLC). Białko HER2 nadmiernie ulega ekspresji w 20-66% wyciętych nowotworów NSCLC i wykazano, w wielokrotnych seriach pacjentów, złe rokowania (Azzoli, C. G. i wsp., Semin. Oncol., 29 (Suppl. 4): 59-65 (2002)). Inne przeciwciała anty-ErbB2 z różnymi właściwościami opisano wTagliabue i wsp., Int. J. Cancer, 47: 933-937 (1991); McKenzie i wsp., Oncogene, 4: 543-548 (1989); Maier i wsp., Cancer Res., 51: 53615369 (1991); Bacus i wsp., Molecular Carciaogenesis, 3: 350-362 (1990); Stancovski i wsp., PNAS (USA), 88: 8691- 8695 (1991); Bacus i wsp., Cancer Research, 52: 2580-2589 (1992); Xu i wsp., Int. J. Cancer, 53: 401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk i wsp., Cancer Research, 52: 2771-2776 (1992); Hancock i wsp., Cancer Res., 51: 4575-4580 (1991); Shawver i wsp., Cancer Res., 54: 13671373 (1994); Arteaga i wsp., Cancer Res., 54: 3758-3765 (1994); Harwerth i wsp., J. Biol. Chem., 267: 15160-15167 (1992); Patent US Nr 5,783,186 oraz Klapper i wsp., Oncogene, 14: 2099-2109 (1997). Przeciwciało monoklonalne 2C4 opisano w publikacji WO 01/00245, która jest tutaj zacytowana jako odniesienie. Wykazano, że 2C4 niszczy tworzenie dimerów HER2 z innymi przedstawicielami rodziny receptorów ErbB (WO 01/00245).
W wyniku przeszukiwania homologów, zidentyfikowano dwóch innych przedstawicieli rodziny receptorów ErbB: ErbB3 (Patenty USA Nr 5183884 oraz 5480968 jak również Kraus i wsp., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989) oraz ErbB4 (EP Aplikacja Pat. Nr 599,274: Plowman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); oraz Plowman i wsp., Naturę, 366: 473-475 (1993)). Oba te receptory wykazują podwyższoną ekspresję przynajmniej w niektórych liniach komórkowych nowotworu piersi.
Receptory ErbB są na ogół znajdowane w różnych połączeniach w komórkach i uważa się, że heterodimeryzacja podnosi zróżnicowanie odpowiedzi komórkowych na różne Ugandy ErbB (Earp i wsp., Breast Cancer Research and Treatment, 35: 115-132 (1995)). Jednakże, mechanizm za pomocą, którego receptory łączą się oraz sposób, w jaki wpływa to na sygnalizację nie jest w pełni zrozumiały (Brennan, P. J. i wsp., Oncogene, 19: 6093-6101 (2000)). Z EGFR łączy się sześć różnych ligandów: naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF), transformujący czynnik wzrostowy alfa (TGF-a), amfiregulina, naskórkowy czynnik wzrostowy łączący się z heparyną (HB-EGF), betacelulina oraz epiregulina (Groenen i wsp., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). Rodzina białek heregulinowych powstałych w wyniku alternatywnego składania pojedynczego genu stanowi ligandy dla ErbB3 i ErbB4. Do rodziny heregulin należą alfa, beta i gamma hereguliny (Holmes i wsp., Science, 256: 1205-1210 (1992); Patent USA Nr 5641869; oraz Schaefer i wsp., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)); czynniki różnicowania neu (NDFs), czynniki wzrostu komórek glejowych (GGF); receptor acetylocholinowy indukujący aktywność (ARIA); oraz czynnik pochodzący z neuronów czuciowych i motoneuro
PL 214 010 Β1 nów (SMDF). Patrz praca przeglądowa Groenen i wsp., Growth Factors, 11:235-257 (1994); Lemke,G., Molec.& Celi. Neurosci., 7: 247-262 (1996) oraz Lee i wsp., Pharm. Rev., 47: 51-85 91995). Ostatnio zidentyfikowano trzy dodatkowe ligandy ErbB: neuregulina-2 (NRG-2), dla której wykazano, że wiąże się z ErbB3 jak i ErbB4 (Chang i wsp., Naturę, 387: 509-512 (1997); oraz Carraway i wsp., Naturę, 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3, która wiąże się z ErbB4 (Zhang i wsp., PNAS (USA), 94(18): 9562-7 (1997)); oraz neuregulina-4, która wiąże się z ErbB4 (Harari i wsp., Oncogene, 18: 2681 -89 (1990)) HB-EGF, batacelulina i epiregulina także wiążą się z ErbB4.
Podczas gdy EGF i TGFa nie wiążą się z ErbB2, EGF stymuluje EGFR i ErbB2 do tworzenia heterodimeru, który aktywuje EGFR i powoduje transfosforylację ErbB2 w heterodimerze. Dimeryzacja i/lub fosforylacja okazuje się aktywować kinazę tyrozynową ErbB2. Patrz Earp i wsp., powyżej. Podobnie, heregulina nie wiąże się z ErbB2, ale gdy ErbB3 ulega ko-ekspresji z ErbB2, tworzony jest kompleks o aktywnej sygnalizacji (Nagy i wsp., Cytometry, 32: 120-31 (1998). Przeciwciała skierowane przeciwko ErbB2 są zdolne do niszczenia tego kompleksu (Sliwkowski i wsp., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). ErbB3 jest defektywne pod względem kinazy tyrozynowej a tym samym wymaga heterodimeryzacji, korzystnie z rbB2, do zdolności trasdukcji sygnału. (Graus-Porta i wsp., EMBOJ., 16:1647-55 (1995)). Dodatkowo, powinowactwo ErbB3 do hereguliny (HRG) wzrasta do silniejszego powinowactwa, gdy ulega ko-ekspresji z ErbB2. Patrz także Levi i wsp., Journal of Neuroscience, 5: 1329-1340 (1995); Morrissey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1431-1435 (1995); oraz Lewis i wsp., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) w odniesieniu do kompleksu białkowego ErbB2-ErbB3. Istotnie, ErbB2 jest korzystnym partnerem do heterodimeryzacji zarówno dla EGFR jak i ErbB3. (Graus-Porta i wsp., powyżej). ErbB4 podobnie jak ErbB3 tworzy aktywny kompleks sygnalny z ErbB2 (Carraway and Cantley, Celi, 78:5-8 (1994)). Zależna od liganda heterodimeryzacja ErbB2 z EGFR lub ErbB3 może przyczyniać się do wzrostu nowotworów ligania ekspresją ErbB2.
Ekspresja receptorów ErbB i hereguliny oraz fosforylacja HER2 była badana w materiale nowotworowym pochodzącym od pacjentów z pierwotnym rakiem piersi i rakiem pęcherza (Esteva i wsp., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow i wsp., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001)). Korelację pomiędzy aktywnym przekazywaniem sygnału przez Her2/neu a rezultatami badań klinikopatologicznych oraz badań pacjentów z rakiem piersi odnotowywali Thor i wsp., J. Clin. Oncology, 18: 32303239 (2000) i DiGiovanna i wsp., Cancer Res., 62: 6667-6673 (2002).
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowane humanizowane przeciwciało 2C4 (rhuMAb 2C4) do zastosowania w sposobie leczenia raka jajnika, raka sutka, raka płuc, lub raka gruczołu krokowego, przy czym rhuMAb 2C4 zawiera sekwencje aminokwasowe zmienną lekką i zmienną ciężką odpowiednio o SEQ ID nr 3 i 4, oraz sekwencję lekką i sekwencję ciężką regionu stałego ludzkiej lgG1 (allotypu nie-A) i przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w stałej dawce 420 mg co trzy tygodnie.
W korzystnym rozwiązaniu, rekombinowane humanizowane przeciwciało charakteryzuje się tym, że rhuMAb 2C4 ulega ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO).
Rekombinowane humanizowane przeciwciało korzystnie jest przeznaczone do podawania w dawce wysycającej 840 mg na początku leczenia.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie rekombinowanego humanizowanego przeciwciała 2C4 (rhuMAb 2C4) do wytwarzania leku do leczenia raka jajnika, raka sutka, raka płuc, lub raka gruczołu krokowego, przy czym rhuMAb 2C4 zawiera sekwencje aminokwasowe zmienną lekką i zmienną ciężką odpowiednio o SEQ ID nr 3 i 4, oraz sekwencję lekką i sekwencję ciężką regionu stałego ludzkiej lgG1 (allotypu nie-A) i przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w stałej dawce 420 mg co trzy tygodnie.
Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku rhuMAb 2C4 ulega ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO).
W bardziej korzystnym rozwiązaniu lek jest do leczenia raka, przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w dawce wysycającej 840 mg na początku leczenia.
Wynalazek pozwala także na wdrożenie sposobu wykrywania nowotworu, który jest wrażliwy na leczenie przeciwciałem anty-HER2. Przeciwciało anty-HER2 blokuje aktywację przez ligand heterodimeru ErbB zawierającego HER2.
W tym celu pozyskiwana jest próbka nowotworu i wykrywana jest w niej obecność kompleksu białkowego HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4. Nowotwór jest identyfikowany jako wrażliwy na leczenie przeciwciałem anty-HER2, jeżeli wspomniany kompleks zostanie wykryty.
PL 214 010 Β1
Obecność kompleksu wykrywana jest przez immunoprecypitację jakichkolwiek kompleksów białkowych zawierających HER2 z przeciwciałem anty-HER2. Wytrącone kompleksy są następnie poddawane kontaktowi z przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z przeciwciał anty-HER3, przeciwciał anty-HER1 oraz przeciwciał anty-HER4, po czym oznacza się jakiekolwiek wiązanie. Kompleks HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 jest wykryty, jeśli wykazane jest, że przeciwciała anty-HER3 i/lub anty-HER1 i/lub anty-HER4 wiąże się z wytrąconymi kompleksami.
W innym wykonaniu, obecność kompleksu białek HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 wykrywana jest przez mieszanie próbki nowotworowej z przeciwciałem anty-HER2 zawierającym pierwszy fluorofor. Następnie, próbka nowotworowa jest mieszana z przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z przeciwciał anty-HER3 i/lub anty-HER1 i/lub anty-HER4, gdzie wzmiankowane przeciwciało zawiera drugi fluorofor.
Następnie dokonywany jest pomiar przenoszenia energii rezonansu fluorescencyjnego celem określenia czy pierwszy i drugi fluorofor znajdują się w dużej bliskości. Obecność kompleksu białek HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 wykrywana jest, o ile wykazane zostanie, że pierwszy i drugi fluorofor znajdują się w dużej bliskości.
W jeszcze innym wykonaniu, obecność kompleksu HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 wykrywana jest przez mieszanie próbki nowotworowej z pierwszym związkiem wiążącym. Pierwszy związek wiążący zawiera część wiążącą pierwszą cząsteczkę docelową, która swoiście wiąże HER2. Część wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową jest korzystnie przeciwciałem anty-HER2 lub fragmentem przeciwciała. Pierwszy związek wiążący zawiera następnie wykrywalną domenę, połączonąz pierwszą domeną wiążącą możliwym do przecięcia łącznikiem.
Próbka nowotworowa mieszana jest z drugim związkiem wiążącym. Drugi związek wiążący korzystnie zawiera część wiążącą drugą cząsteczkę docelową, która swoiście wiąże HER3 lub HER1 lub HER4 i korzystnie nie wiąże HER2. W innym wykonaniu, drugi związek wiążący wiąże HER3 lub HER1 i nie wiąże HER2 i HER4. W kolejnym wykonaniu, część wiążąca drugą cząsteczkę docelową zawiera przeciwciało lub fragment przeciwciała anty-HER3 lub anty-HER1 lub anty-HER4. Zaktywowany drugi związek wiążący ma zdolność cięcia możliwego do przecięcia łącznika w pierwszym związku wiążącym, dostarczając w ten sposób wolnej wykrywalnej domeny, jeśli pierwszy związek wiążący i drugi związek wiążący znajdują się w dużej bliskości. Obecność kompleksu białkowego HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 jest wykrywany, jeśli zidentyfikowana zostanie wolna wykrywalna domena. W jednym z wykonań, obecność wolnej wykrywalnej domeny jest identyfikowana metodą elektroforezy kapilarnej.
W innym wykonaniu, pierwszy związek wiążący zawiera część wiążącą pierwszą cząsteczkę docelową, która specyficznie wiąże HER1 lub HER3 lub HER4, a drugi związek wiążący zawiera część wiążącą drugą cząsteczkę docelową, która specyficznie wiąże HER2.
W jeszcze innym wykonaniu, obecność kompleksu białkowego HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 i wynikła aktywacja HER2, wykrywana jest przez oszacowanie fosforylacji receptora ErbB, na przykład przez immunoprecypitację białka HER2, po której następuje immunodetekcja fosfotyrozyny techniką typu Western biot.
Próbka nowotworu analizowana na obecność kompleksów białkowych HER2/HER3 oraz/lub HER2/HER1 oraz/lub HER2/HER4 jest korzystnie uzyskiwana od pacjenta cierpiącego na nowotwór. Próbka może być na przykład pozyskiwana przez biopsję. W innym wykonaniu próbka jest uzyskiwana przez oczyszczenie krążących w organizmie pacjenta komórek nowotworowych. W jeszcze innym wykonaniu próbkę uzyskuje się podczas operacji usuwania nowotworu z ciała pacjenta.
W innym wykonaniu próbkę nowotworu uzyskuje się od ssaka innego niż pacjent, u którego pierwotnie rozwinął się nowotwór. Korzystnie, próbkę uzyskuje się z myszy lub innego gryzonia. Korzystniej, nowotwór jest heteroprzeszczepionym nowotworem. Heteropszeczepiony nowotwór jest korzystnie wytwarzany przez transplantację fragmentu ludzkiego nowotworu do myszy lub innego gryzonia.
W jednym z wykonań jest to nowotwór płuc, korzystniej nowotwór płuc nie-drobnokomórkowy. W innym wykonaniu jest to nowotwór sutka.
Wynalazek pozwala na rozwinięcie sposobu identyfikacji komórek nowotworowych jako wrażliwych na leczenie za pomocą przeciwciała hamującego łączenie się HER2 z innym członkiem rodziny receptorów ErbB, obejmując etapy (a) dostarczenia biologicznej próbki zawierającej komórki nowotworowe HER2 pozytywne; oraz (b) wykrywania fosforylacji receptora ErbB w próbce biologicznej, gdzie
PL 214 010 Β1 wzmiankowana fosforylacja wskazuje na to, że komórki nowotworowe, są wrażliwe na leczenie przeciwciałem. W jednym z wykonań wykrywa się fosforylację receptora ErbB2 (HER2).
Tak jak uprzednio, inny członek związany z HER2 to HER3, HER1 i/lub HER4, tak jak HER2 i/lub HER1. Sposób może dodatkowo obejmować etap wykrywania obecności kompleksów białkowych HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4, zasadniczo jak to opisano powyżej.
Wynalazek pozwala również na opracowanie metody przewidywania odpowiedzi osobnika poddanego leczeniu, zdiagnozowanego z nowotworem HER2 pozytywnym, na leczenie przeciwciałem hamującym łączenie HER2 z innym członkiem rodziny receptorów ErbB, przez wykrywanie tworzenia kompleksów białkowych HER2/HER3 i/lub HER2/HER11 i/lub HER2/HER4 i/lub fosforylacji receptora ErbB w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, zawierającej komórki nowotworowe HER2 dodatnie. Obecność takich kompleksów białkowych i/lub wspomnianej fosforylacji wskazuje na to, że prawdopodobnie pacjent zareaguje na leczenie przeciwciałem. W jednym z wykonań fosforyzacji, wykrycie fosforylacji receptora ErbB2 (HER2) wskazuje na to, że osobnik poddany leczeniu prawdopodobnie zareaguje na leczenie przeciwciałem.
W oparciu o wynalazek można opracować sposób identyfikacji osobnika badanego reagującego na leczenie przeciwciałem anty-HER2, przy użyciu wykrywania fosforylacji receptora ErbB w krążących komórkach nowotworowych osobnika badanego. Obecność takiej fosforylacji wskazuje na to, że osobnik badany prawdopodobnie zareaguje na leczenie przeciwciałem anty-HER2. W jednym z wykonań wykrywa się fosforylację ErbB2 (HER2), przy czym osobnikem badanym jest człowiek. W oparciu o opisaną powyżej identyfikację, można wdrożyć leczenie osobnika badanego przeciwciałem anty-HER2, korzystnie rhuMAb 2C4.
Przeciwciało według wynalazku może być zawarte w wyrobie fabrycznym zawierającym pojemnik w którym jest przeciwciało wiążące się z HER2 oraz instrukcje podawania przeciwciała pacjentowi cierpiącemu na nowotwór. Korzystnie, ustalono, że nowotwór zawiera heterodimery HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4. Pojemnik taki może zawierać przeciwciało blokujące aktywację przez ligand heterodimery ErbB zawierającego HER2. W innym wykonaniu pojemnik może zawierać przeciwciało monoklonalne 2C4, korzystniej rhuMAb 2C4.
Wynalazek dostarcza także sposobu leczenia pacjenta, obejmujący dostarczanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała, które wiąże się z HER2, przy czym pacjent cierpi na nowotwór, który określono jako zawierający heterodimery HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4.
Przeciwciało według wynalazku blokuje aktywację przez ligand heterodimeru ErbB zawierającego HER2. W innym wykonaniu przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem 2C4, korzystniej rhuMAb 2C4.
W innym aspekcie wynalazek pozwala na opracowanie sposobu leczenia pacjenta obejmującego dostarczanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała wiążącego się z HER2. Korzystnie pacjent cierpi na nowotwór, który określono, jako posiadający ufosforylowany receptor ErbB.
W jednym z wykonań ufosforylowanym receptorem ErbB jest HER2. W innym wykonaniu przeciwciało blokujące aktywację przez ligand heterodimera ErbB zawiera HER2. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem 2C3, korzystniej rhuMAb 2C4.
Wynalazek został zilustrowany na następujących rysunkach.
Figura 1A i 1 B przedstawiają przyrównanie sekwencji aminokwasowych domen zmiennej łańcucha lekkiego (VL) (Fig. 1A) i zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) (Fig. 1B) mysiego monoklonalnego przeciwciała 2C4 (odpowiednio SEK. ID. NR 1 i 2); domeny VL i VH humanizowanej wersji 2C4 (odpowiednio SEK. ID. NR 3 i 4) oraz konsensusowe rejony zrębowe ludzkiego VL i VH (hum k1 , podgrupa łańcucha lekkiego kappa I; humlll, podgrupa III łańcucha ciężkiego) (odpowiednio SEK. ID. NR 5 i 6). Gwiazdki pokazują różnice pomiędzy wersją 574 humanizowanego 2C4 a mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 lub pomiędzy wersją 574 humanizowanego 2C4 a ludzkim rejonem zrębowym. Rejony Determinujące Dopasowanie (ang. Complementary Determining Regions - CDRs) są w nawiasach.
Figury 2A i 2B przedstawiają wpływ monoklonalnego przeciwciała 2C4, przeciwciała HERCEPTIN® lub przeciwciała anty-EGFR na zależne od hereguliny (HGR) wiązanie ErbB2 z ErbB3 w komórkach MCF7 z ekspresją na niskich/normalnych poziomach ErbB2 (Fig. 2A) i komórkach SK-BR-3 z ekspresją na wysokich poziomach ErB2 (Fig. 2B); patrz Przykład 2 poniżej.
Figura 3 przedstawia immunoblot ukazujący obecność heterodimerów HER1/HER2 i HER2/HER3 w ekstraktach białkowych z heteroprzeszczepu nie-drobnokomórkowego nowotworu płuc (NSCLC).
PL 214 010 Β1
Figura 4 przedstawia immunoblot ukazujący obecność fosforylacji HER2 w ekstraktach białkowych z hetero przeszczepów nie-drobnokomórkowego raka płuc (NSCLC).
Szczegółowy opis wynalazku i rozwiązania korzystne
Niniejszy wynalazek w części oparty jest na spostrzeżeniach dokonanych na podstawie doświadczeń, takich że wrażliwość na anty-HER2 przeciwciało rhuMAb 2C4 koreluje z obecnością heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 i/lub fosforylacją receptora ErbB w komórkach nowotworowych. Zatem nowotwór może być zidentyfikowany jako wrażliwy na leczenie przeciwciałem anty-HER2, w szczególności przeciwciałem anty-HER2, które posiada aktywność biologiczną przeciwciała anty-HER2 2C4, w oparciu na obecności heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 i/lub ufosforylowanego receptora ErbB. Heterodimery HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 oraz/lub fosforylacja receptora ErbB może być zidentyfikowana jakimkolwiek sposobem znanym w dziedzinie. Przez zidentyfikowanie specyficznych nowotworów i rodzajów nowotworów, które są wrażliwe na leczenie przeciwciałami anty-HER2, można zidentyfikować pacjentów, którzy prawdopodobnie skorzystają najbardziej z takiego leczenia. Dodatkowo zidentyfikowani mogą być pacjenci, którzy prawdopodobnie nie zyskają na terapii przeciwciałem monoklonalnym 2C4.
Definicje „Receptor ErbB jest receptorowym białkiem kinazy tyrozynowej należącym do rodziny receptorów ErbB i obejmuje receptory EGFR (ErbB1), ERRP, ErbB2, ErbB3 oraz ErbB4 oraz innych członków tej rodziny, którzy zostaną zidentyfikowani w przyszłości. Receptor ErbB zawiera na ogół domenę zewnątrzkomórkową, która może łączyć się z ligandem ErbB; lipofilową domenę transbłonową; konserwowaną wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej oraz karboksylo-końcową domenę sygnalną zawierającą kilka aminokwasów tyrozynowych, które mogą być fosforylowane. Receptor ErbB może być receptorem ErbB o „natywnej sekwencji lub jej „wariantem sekwencji aminokwasowej. Korzystnie receptor ErbB jest ludzkim receptorem ErbB o natywnej sekwencji. Zgodnie z tym „członkiem rodziny receptorów ErbB jest EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 lub każdy inny receptor ErbB znany obecnie lub zidentyfikowany w przyszłości. Korzystnie, członkiem jest EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 lub ErbB4.
Określenia „ErbB1, „receptor naskórkowego czynnika wzrostowego, „EGFR i „HER1 są tu używane zamiennie i odnoszą się do EGFR w postaci opisanej np. w Carpenter i wsp., Ann. Rev. Blochem., 56:881-914 (1987), włączając naturalnie występujące formy jego mutantów (np. mutant z delecją EGFR jak u Humphrey i wsp., PNAS (USA), 87: 4207-4211 (1990)). ErbB1 odnosi się do genu kodującego białkowy produkt EGFR. Przeciwciała przeciwko HER1 opisano na przykład w Murthy i wsp., Arch. Biochem. Biophys., 252: 549-560 (1987) i w WO 95/25167.
Określenie „ERRP, „białko pokrewne receptorowi EGF, „białko pokrewne EGFR oraz „białko pokrewne receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu używane są tutaj zamiennie i odnoszą się do ERRP jak opisano to na przykład w Patencie USA Nr 6399743 oraz Publikacji Pat. Nr 2003/0096373.
Wyrażenia „ErbB2 i „HER2 używane są tutaj zamiennie i odnoszą się do białka HER2 opisanego na przykład w Semba i wsp., PNAS (USA), 82: 6497-6501 (1985) i Yamamoto i wsp., Naturę, 319: 230-234 (1986) (Numer dostępu w Genebank Χ03363). Określenie „ErbB2 odnosi się do genu kodującego ludzki ErbB2, a „neu odnosi się do genu kodującego szczurze pl85neu. Korzystnie ErB2 stanowi ludzkie ErbB2 o natywnej sekwencji.
„ErbB3 oraz „HER3 odnoszą się do polipeptydów receptorowych opisanych na przykład w Patentach USA Nr 5183884 i 5480968 jak również Kraus i wsp., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989). Przeciwciała przeciwko ErbB3 są znane w dziedzinie i opisane na przykład w Patentach USA Nr 5183884 oraz 5480968 i w WO 97/35885.
Określenia „ErbB4 i „HER4 odnoszą się tutaj do polipeptydów receptorowych jak zostało to opisane na przykład w Aplikacji Pat. EP Nr 599274; Plowman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); i Plowman i wsp., Naturę, 366: 473-475 (1993), włączając jego izoformy np. jak opisano to w WO 99/19488 opublikowanym 22 kwietnia 1999. Przeciwciała przeciwko HER4 opisano na przykład w WO 02/18444.
Przeciwciała dla receptorów ErbB są dostępne handlowo z różnych źródeł włączając na przykład Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.
Przez „ligand ErB rozumie się polipeptyd, który wiąże się do i/lub aktywuje receptor ErbB. Ligand ErbB może stanowić ludzki ligand ErbB o natywnej sekwencji, taki jak naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) (Savage i wsp., J. Biol. Chem., 247: 7612-7621 (1972)); transformujący czynnik wzro
PL 214 010 Β1 stówy alfa (TGF-α) (Marquardt i wsp., Science, 223: 1079-1082 (1984)); amfiregulyna znana także jako autowydzielniczy czynnik wzrostu keratynocytów lub komórek Schwana (Shoyabet i wsp., Science, 243: 1073-1076 (1989); Kimura i wsp., Naturę, 348: 257-260 (1990); i Cook i wsp., Mol. Celi. Biol., 11: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing i wsp., Science, 259: 1604-1607 (1993); oraz Sasada i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); naskórkowy czynnik wzrostowy wiążący heparynę (HB-EGF) (Higashiyama i wsp., Science, 251: 936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda i wsp., J. Biol. Chem., 270: 7495-7500 (1995); oraz Komurasaki i wsp., Oncogene, 15: 2841-2848 (1997)); heregulina (patrz poniżej); neuregulina-2 (NGR-2) (Carraway i wsp., Naturę, 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 (NGR-3) (Zang i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NGR-4) (Harari i wsp., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)) lub kripto (CR-1) (Kannan i wsp., J. Biol. Chem., 272(6): 3330-3335 (1997)). Ligandy ErbB, które wiążąsię z EGFR obejmująTGF-α, amfiregulinę, betacelulinę, HB-EGF i epiregulinę. Ligandy ErbB, które wiążąsię z ErbB3 obejmują hereguliny. Ligandy ErbB zdolne do wiązania ErbB4 obejmują betacelulinę, epiregulinę, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 i hereguliny. Ligand ErbB może także być syntetycznym ligandem ErbB. Syntetyczny ligand może być specyficzny dla szczególnego receptora ErbB lub może rozpoznawać szczególne kompleksy receptora ErbB. Przykładem syntetycznego liganda jest syntetyczna chimera heregulina/egf biregulina (patrz, na przykład, Jones i wsp., FEBS Letters, 447: 227-231 (1991), przedstawiony tutaj w postaci referencji).
„Heregulina (HGR) użyta tutaj odnosi się do polipeptydu kodowanego przez produkt genowy hereguliny jak zawarty w Patencie USA Nr 5641869 lub Marchionni i wsp., Naturę, 362: 312-318 (1993). Przykłady heregulin obejmują heregulinę-a, heregulinę-βΐ, heregulinę-32 oraz heregulinę-33 (Holmes i wsp., Science, 256: 1205-1210 (1992); oraz Patent USA Nr 5641869); czynnik różnicujący neu (NDF) (Peles i wsp., Celi, 69: 205-216 (1992)); aktywator indukujący receptor acetylocholiny (ARIA) (Falls i wsp., Celi, 72: 801-815 (1993)); czynniki wzrostu komórek glejowych (GGF) (Marchionni i wsp., Naturę, 362: 312-318 (1993)); czynnik pochodzący z neuronów czuciowych i motoneuronów (SMDF) (Ho i wsp., J. Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); γ-heregulina (Schaefer i wsp., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)). Określenie obejmuje biologicznie aktywne fragmenty i/lub odmiany sekwencji aminokwasowych polipeptydu HRG o natywnej sekwencji, takie jak jego fragment domeny podobnej do EGF (np., HRGpl 177-244).
„Hetero-oligomer ErbB jest tutaj niekowalencyjnie połączonym oligomerem zawierającym, co najmniej dwa różne receptory ErbB. „Dimer ErbB jest niekowalencyjnie połączonym oligomerem zawierającym dwa różne receptory ErbB. Kompleksy takie mogą powstawać, gdy komórka z ekspresją dwóch lub więcej receptorów ErbB wystawiona jest na działanie ligandu ErbB. Oligomery ErbB, takie, jak dimery ErbB, mogą być izolowane za pomocą immunoprecypitacji i analizowane za pomocą SDSPAGE jak to opisano na przykład w Sliwkowski i wsp., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Przykłady takich hetero-oligomerów ErbB obejmują kompleksy EGFR-ErbB2 (odnoszący się także do HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) oraz ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Ponadto, heterooligomer ErbB może zawierać dwa lub więcej receptorów ErbB2 związanych z innym receptorem ErbB, takim jak ErbB3, ErbB4 lub EGFR (ErbB1). Inne białka, takie jak podjednostka receptora cytokiny (np. gpl30) mogą być włączone w hetero-oligomer.
Przez „aktywację przez ligand receptora ErbB rozumie się przekazywanie sygnału (np. wywołane przez wewnątrzkomórkową domenę kinazową receptora ErbB fosforylujące reszty tyrozynowe w receptorze ErbB lub polipeptydzie substratowym) z udziałem wiązania liganda ErbB do heterooligomeru ErbB zawierającego, będący przedmiotem zainteresowania, receptor ErbB. Na ogół, obejmuje to wiązanie liganda ErbB do hetero-oligomeru, co powoduje aktywację kinazowej domeny jednego lub więcej receptorów ErbB w hetero-oligomerze i w wyniku czego dochodzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w jednym lub więcej receptorze ErbB i/lub fosforylacji reszt tyrozynowych w dodatkowym polipeptydzie(ach) substratowym. Aktywację receptora ErbB można ująć ilościowo przy zastosowaniu rozmaitych oznaczeń fosforylacji tyrozyny.
Polipeptyd o „sekwencji natywnej to taki, który ma identyczną sekwencję aminokwasową, jak polipeptyd (np. receptor ErbB lub ligand ErbB) pozyskany z organizmu żywego. Takie polipeptydy o sekwencji natywnej można wyizolować z organizmu żywego bądź otrzymać metodą rekombinacji lub syntezy. Zatem polipeptyd o sekwencji natywnej może mieć sekwencję aminokwasową naturalnie występującego polipeptydu ludzkiego, polipeptydu mysiego lub polipeptydu pochodzącego od jakiegokolwiek gatunku ssaka.
PL 214 010 Β1
Pojęcie „wariant sekwencji aminokwasowej odnosi się do polipeptydów, których sekwencja aminokwasowa różni się do pewnego stopnia od polipeptydu o sekwencji natywnej. Zazwyczaj, warianty sekwencji aminokwasowej będą wykazywały co najmniej około 70% homologię z przynajmniej jedną domeną wiążącą receptor natywnego liganda ErbB lub z co najmniej jedną domeną wiążącą ligand natywnego receptora ErbB, a korzystnie, będą wykazywały przynajmniej około 80%, bardziej korzystnie, przynajmniej około 90% homologii z takimi domenami wiążącymi receptor lub ligand. Warianty sekwencji aminokwasowej wykazują podstawienia, delecje i/lub insercje w niektórych pozycjach sekwencji aminokwasowej natywnej sekwencji aminokwasowej.
„Homologia jest określana jako procent reszt w wariancie sekwencji aminokwasowej, które są identyczne po przyrównaniu sekwencji i, o ile to konieczne, wprowadzeniu przerw celem uzyskania maksymalnej procentowej homologii. Sposoby oraz programy komputerowe do zestawiania sekwencji są powszechnie znane w tej dziedzinie. Jednym z takich programów komputerowych jest „Align 2, autoryzowany przez Genetech, Inc., który został skatalogowany z dokumentacją użytkownika w United States Copyright Office, Washington, DC 20559, dnia 10 grudnia, 1991.
Termin „przeciwciało jest tutaj stosowane w szerokim pojęciu i specyficznie oznacza nieuszkodzone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np., przeciwciała dwuspecyficzne) utworzone z co najmniej dwóch nieuszkodzonych przeciwciał i fragmentów przeciwciał, tak długo, jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną.
Pojęcie „przeciwciało monoklonalne zastosowane tutaj, odnosi się do przeciwciała pozyskanego z populacji w znacznym stopniu homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne z wyjątkiem naturalnie pojawiających się, możliwych mutacji, występujących w pomniejszej ilości. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, jako skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Co więcej, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Dodatkowo, oprócz swojej specyficzności, przeciwciała monoklonalne mają tę zaletę, że można syntetyzować je bez zanieczyszczeń innymi przeciwciałami. Określenie „monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała, jako otrzymanego z w znacznym stopniu homogennej populacji przeciwciał, i nie ma być interpretowane, jako wymagające do produkcji przeciwciała jakiegoś wyszczególnionego sposobu. Na przykład, przeciwciała monoklonalne możliwe do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem można wyprodukować metodą hybrydomy, opisaną po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Naturę, 256: 495 (1975) lub metodami rekombinacji DNA (patrz, np., Patent USA Nr 4816567). „Przeciwciała monoklonalne mogą również być wyizolowane z fagowych bibliotek przeciwciał przy zastosowaniu technik opisanych np., w Clackson i wsp., Naturę, 352: 624-628 (1991) i Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991).
Do przeciwciał monoklonalnych specyficznie zalicza się tu przeciwciała „chimerowe, w których część ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha jest identyczna z, lub homologiczna do odpowiednich sekwencji przeciwciał pozyskanych ze zwierzęcia danego gatunku lub należących do poszczególnych klas lub podklas przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha (łańcuchów) jest identyczna z, lub homologiczna do odpowiednich sekwencji przeciwciał pozyskanych z innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również zalicza się fragmenty takich przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (Patent USA Nr 4816567; i Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984). Przeciwciała chimerowe, będące tu przedmiotem zainteresowania, obejmują przeciwciała „prymityzowane zawierające sekwencje domen zmiennych wiążących antygen pochodzące nie od człowieka (np., Małpy Starego świata, itp.) i ludzkie sekwencje rejonu stałego.
„Fragmenty przeciwciała zawierają część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie zawierającą ich rejon wiążący antygen lub rejon zmienny. Przykłady takich fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 oraz Fv; dwuciała, przeciwciała liniowe, cząsteczki przeciwciał o jednym łańcuchu; i przeciwciała multispecyficzne utworzone z fragmentu(ów) przeciwciał.
Przeciwciało „niezmienione to takie, które zawiera zmienny rejon wiążący antygen, jak również stałą domenę łańcucha lekkiego (CL) oraz stałe domeny łańcuchów ciężkich, CH1, CH2 i CH3. Domeny stałe mogą być domenami stałymi o sekwencjach natywnych (np., ludzka stała domena o sekwencji natywnej) lub ich wariantami pod względem sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, przeciwciało niezmienione posiada jedną lub więcej funkcji efektorowych.
„Funkcje efektorowe przeciwciała odnoszą się do tych aktywności biologicznych, które są właściwe dla rejonu Fc (sekwencja natywna rejonu Fc lub wariant rejonu Fc pod względem sekwencji
PL 214 010 Β1 aminokwasowej) przeciwciał. Przykłady efektorowych funkcji przeciwciał obejmują wiązanie Clq; cytotoksyczność zależną od dopełniacza; wiązanie receptora Fc; cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC); fagocytozę; regulację w dół receptorów powierzchniowych komórek (np., receptora limfocytów B; BCR), itd.
W zależności od aminokwasowej sekwencji domen stałych łańcuchów ciężkich niezmienione przeciwciała można przypisać do różnych „klas. Istnieje pięć głównych klas przeciwciał niezmienionych: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można następnie podzielić na „podklasy (izotypy), np., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA i lgA2.
Domeny stałe łańcuchów ciężkich odpowiadające różnym klasom przeciwciał nazwano odpowiednio α, δ, ε, γ i μ. Budowa podjednostek oraz trójwymiarowe kształty immunoglobulin różnych klas są dobrze znane.
„Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał oraz „ADCC odnosi się do reakcji z udziałem komórek, w której niespecyficzne komórki cytotoksyczne wykazujące ekspresję receptorów Fc (FcRs) (np., komórki NK, neutrofile i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na komórcedocelowej, a następnie powodują lizę komórki docelowej, Główne komórki, które pośredniczą w ADCC, komórki NK, wykazują jedynie ekspresję FcyRIII, podczas gdy monocyty wykazują ekspresję FcyRI, FcyRII oraz FcyRIII. Ekspresja FcR na komórkach hematopoetycznych streszczona jest w Tabeli 3 na stronie 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). W celu oznaczenia aktywności ADCC badanej cząsteczki, można przeprowadzić test ADCC in vitro taki, jak opisany w Patencie USA nr 5500362 lub 5821337. Przydatne do takich oznaczeń komórki efektorowe obejmują obwodowe komórki jednojądrzaste krwi (PBMC) oraz komórki NK.
Alternatywnie lub dodatkowo, aktywność ADCC badanej cząsteczki można oznaczyć in vivo, np., w modelu zwierzęcym takim, jak ujawniony w Clynes i wsp., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).
„Ludzkie komórki efektorowe to leukocyty, które wykazują ekspresję jednego lub więcej FcR i wykazują funkcje efektorowe. Korzystnie, komórki wykazują ekspresję co najmniej FcyRIII i wykazują efektorową funkcję ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC obejmują obwodowe komórki jednojądrzaste krwi (PBMC), komórki NK, monocyty, cytotoksyczne limfocyty T oraz neutrofile; przy czym komórki PBMC i komórki NK są preferowane. Komórki efektorowe mogą zostać wyizolowane z ich naturalnego źródła, np. z krwi lub PBMC jak to opisano tutaj.
Pojęcia „receptor Fc lub „FcR stosowane są do opisania receptora wiążącego się do rejonu Fc przeciwciała. Preferowanym FcR jest ludzki FcR o sekwencji natywnej. Ponadto, preferowanym FcR jest taki, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory podklas FcyRI, FcyRII i FcyRIII, wliczając warianty allelowe i alternatywnie złożone formy tych receptorów. Do receptorów FcyRII zalicza się FcyRIlA („receptor aktywujący) i FcyRIIB („receptor hamujący), które mają podobne sekwencje aminokwasowe różniące się przede wszystkim w swych domenach cytoplazmatycznych. Aktywujący receptor FcyRIlA zawiera w swej domenie cytoplazmatycznej aktywujący motyw immunoreceptora oparty na tyrozynie (ITAM). Hamujący receptor FcyRIIB zawiera w swej domenie cytplazmatycznej hamujący motyw immunoreceptora oparty na tyrozynie (ITIM). (Patrz praca przeglądowa M. w Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Przegląd receptorów FcR zawarty jest w Ravetch i Kinet, Annę. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel i wsp., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); i de Haas i wsp., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Inne receptory FcR, wliczając te, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości, objęte są tu pojęciem „FcR. Pojęcie to obejmuje również receptor obecny u noworodków, FcRn, odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer i wsp., J. Immunol., 117:587 (1976) i Kim i wsp., J. Immunol., 24:249 (1994)).
„Cytotoksyczność zależna od dopełniacza lub „CDC odnosi się do zdolności cząsteczki do lizy komórki docelowej w obecności dopełniacza. Ścieżka aktywacji dopełniacza jest rozpoczynana poprzez wiązanie się pierwszego składnika układu dopełniacza (Clq) do cząsteczki (np., przeciwciała) tworzącej kompleks z odpowiednim antygenem. W celu oznaczenia aktywacji układu dopełniacza można przeprowadzić test CDC, np., w sposób opisany w Gazzano-Santoro i wsp., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).
„Przeciwciała natywne są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masie około 150000 daltonów, złożonymi z dwóch jednakowych łańcuchów lekkich (L) i dwóch jednakowych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, zaś pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów przeciwciał liczba wiązań dwu siarczkowych jest zmienna. Każdy ciężki i lekki łańcuch ma także regularnie rozmieszczone wewnątrz łańcucha mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki ma na jednym końcu domenę
PL 214 010 Β1 zmienną (VH), za którą leży duża liczba domen stałych. Każdy łańcuch lekki ma na jednym końcu domenę zmienną (VL) oraz domenę stałą na końcu drugim. Domena stała łańcucha lekkiego leży równolegle w stosunku do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego leży równolegle w stosunku do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą połączenie pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i ciężkiego.
Określenie „zmienny odnosi się do faktu, że pewne części domen zmiennych różnią się znacznie sekwencją pomiędzy przeciwciałami i stosowane są w wiązaniu i specyficzności danego przeciwciała względem swoistego dla niego antygenu. Jednakże zmienność nie jest równomiernie rozłożona w obszarze domen zmiennych przeciwciał. Mieści się w trzech segmentach zwanych rejonami superzmiennymi w domenach zmiennych zarówno lekkiego, jak i ciężkiego łańcucha. Bardziej konserwowane części domen zmiennych zwane są rejonami zrębowymi (FRs). Domeny zmienne natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają po cztery FRs, przeważnie przyjmujące konfigurację β-kartki, połączone za pomocą trzech rejonów superzmiennych, które tworzą połączenia pętli i w niektórych przypadkach tworzące część struktury β-kartki. Rejony superzmienne w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w ścisłej bliskości poprzez FRs i, wraz z rejonami superzmiennymi z innego łańcucha, przyczyniają się do tworzenia w przeciwciałach miejsca wiążącego antygen (patrz Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-te wydanie, Public Health Service, National Insitutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała do antygenu, ale wykazują wiele funkcji efektorowych, takich jak udział przeciwciała w cytotoksycznej odpowiedzi komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC).
Określenie „rejon superzmienny używane tutaj odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które odpowiedzialne są za wiązanie antygenu. Na ogół rejon superzmienny zawiera reszty aminokwasowe z „rejonu determinującego dopasowanie lub „CDR (np. reszty aminokwasowe 24-34 (L1), 50-56 (L2) oraz 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 31-35 (H1), 50-65 (H2) oraz 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5te wydanie, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub reszty aminokwasowe z pętli „superzmiennej (np. reszty aminokwasowe 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). „Rejon zrębowy lub reszty aminokwasowe „FR to reszty aminokwasowe domeny zmiennej inne niż reszty aminokwasowe rejonu superzmiennego zdefiniowanego tutaj.
W wyniku trawienia przeciwciał papainą powstają dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, zwane fragmentami „Fab, każdy z pojedynczym miejscem wiązania antygenu oraz fragment „Fc, którego nazwa odzwierciedla zdolność do natychmiastowej krystalizacji. Trawienie pepsyną dostarcza fragmentu F(ab')2, który ma dwa miejsca wiążące antygen i nadal jest zdolny do krzyżowego wiązania antygenu.
„Fv jest najmniejszym fragmentem przeciwciała, zawierającym kompletne miejsce rozpoznające antygen i wiążące antygen. Rejon ten składa się z dimeru tworzonego przez jedną domenę zmienną łańcucha ciężkiego i jedną domenę zmienną łańcucha lekkiego w ścisłym niekowalencyjnym wiązaniu. To właśnie w tym ułożeniu następuje oddziaływanie pomiędzy trzema superzmiennymi rejonami każdej domeny zmiennej, co determinuje miejsce wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Razem, sześć superzmiennych rejonów składa się na specyficzność wiązania antygenu przez przeciwciało. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv obejmująca tylko trzy superzmienne rejony specyficzne względem antygenu) ma zdolność do rozpoznawania i wiązania antygenu, choć z mniejszym powinowactwem niż w przypadku pełnego miejsca wiążącego.
Fragment Fab także zawiera domenę stałą łańcucha lekkiego oraz pierwszą stałą domenę (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab kilkoma dodatkowymi resztami na końcu karboksylowym domeny CH1 łańcucha ciężkiego wliczając jedną lub więcej cystein z rejonu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH jest tutaj określeniem dla Fab', w którym cysternowa (-owe) reszta(-y) domeny stałej wyposażone są w co najmniej jedną wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab')2 przeciwciała zostały najpierw wytworzone jako pary fragmentów Fab', posiadające pomiędzy sobą zawiasowe cysteiny. Inne rodzaje chemicznego parowania fragmetów przeciwciał są także znane.
„Łańcuchy lekkie przeciwciał pochodzące z jakiegokolwiek gatunku kręgowca mogą być, na podstawie sekwencji aminokwasowej ich domen stałych, przypisane do jednego z dwóch wyraźnie odmiennych typów, zwanych kappa (k) i lambda (λ).
PL 214 010 Β1 „Jednołańcuchowe Fv lub fragmenty przeciwciał „scFv zawierają domeny VH i VL przeciwciała, przy czym domeny te obecne są w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd Fv zawiera polipeptydowy łącznik pomiędzy domenami VH i VL, co umożliwia scFv utworzenie pożądanej struktury dla związania antygenu. Celem przeglądu literatury dotyczącej scFv patrz Pluckthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, red. Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994). Fragmenty scFv przeciwciał anty-ErbB2 opisano w WO93/16185; Patent U.S.A nr 5571894; i Patent U.S.A nr 5587458.
Określenie „dwuciała odnosi się do małych fragmentów przeciwciał z dwoma miejscami wiążącymi antygen, których fragmenty obejmują ciężką domenę zmienną (VH) połączoną z lekką domeną zmienną (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki by umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, domeny zmuszone są parować z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzyć dwa miejsca wiązania antygenu. Bardziej całościowo dwuciała opisane są np., w EP 404097; WO93/11161; oraz Holiinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
„Humanizowane formy, innych niż ludzkie, przeciwciał (np., przeciwciał gryzoni) to przeciwciała chimerowe zawierające najmniejszą sekwencję pochodzącą z immunoglobulin innych niż ludzkie. W większości, przeciwciała humanizowane to immunoglobuliny ludzkie (przeciwciało biorcy), w których reszty z rejonu superzmiennego biorcy zostały zastąpione resztami pochodzącymi z superzmiennych rejonów gatunku innego niż ludzki (przeciwciało dawcy) takiego, jak mysz, szczur, królik lub inny niż człowiek gatunek naczelnego, posiadającymi pożądaną specyficzność, powinowactwo i wydajność. W pewnych przypadkach reszty z rejonu zrębowego (FR) ludzkich immunoglobulin zastąpione są odpowiadającymi im resztami innego niż ludzki gatunku. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, których brak jest w przeciwciele biorcy lub przeciwciele dawcy. Modyfikacje te są dokonywane celem dalszego ulepszania działania przeciwciał. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie zawierało w istocie wszystkie spośród co najmniej jednej, a zwykle dwóch, domen zmiennych, w których wszystkie lub w istocie wszystkie spośród superzmiennych pętli odpowiadają pętlom immunoglobuliny innej niż ludzka oraz wszystkie lub w istocie wszystkie spośród rejonów FR mają sekwencję immunoglobuliny ludzkiej. Przeciwciało humanizowane będzie opcjonalnie zawierało co najmniej część rejonu stałego immunoglobuliny (Fc), zwykle immunoglobuliny ludzkiej. Celem zapoznania się z dalszymi szczegółami, patrz Jones i wsp., Naturę, 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp., Naturę, 332:323-329 (1988); oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Humanizowane przeciwciała anty-ErbB2 obejmują huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®), jak opisano w Tabeli 3 Patent U.S.A Nr 5821337 załączonej tutaj w formie odnośnika; humanizowane przeciwciało 520C9 (WO 93/21319) i humanizowane przeciwciało 2C4, jak poniżej opisano.
Przeciwciało „wyizolowane to takie, które zidentyfikowano i oddzielono i/lub odzyskano ze składnika ich naturalnego środowiska. Składniki zanieczyszczające środowiska naturalnego przeciwciał to materiały, które zakłócałyby diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowanie przeciwciała i mogą obejmować enzymy, hormony oraz inne białkowe lub niebiałkowe substancje rozpuszczone. W preferowanych wykananiach, przeciwciało będzie oczyszczone (1) w stopniu większym niż 95% masy przeciwciała, co określane jest sposobem Lowry'ego, a najbardziej korzystnie większym niż 99% masy, (2) w stopniu wystarczającym do uzyskania co najmniej 15 reszt N-końcowej lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej przy zastosowaniu urządzenia do sekwencjonowania metodą naczynia przędzalniczego (ang. spinning cup) lub (3) do osiągnięcia homogeniczności metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących przy zastosowaniu barwienia błękitem Coomassiego lub korzystnie, barwienia srebrowego. Przeciwciało wyizolowane obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, o ile co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała będzie usunięty. Zazwyczaj jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie przygotowane w co najmniej jednym etapie oczyszczania.
Przeciwciało, „które wiąże badany antygen, np., antygen ErbB2, to takie, które jest zdolne do wiązania tego antygenu z wystarczającym powinowactwem, tak, że przeciwciało jest przydatne w rozpoznawaniu komórki wykazującej ekspresję tego antygenu. W przypadku, gdy przeciwciałem jest takie, które wiąże się z ErbB2, zazwyczaj będzie ono preferencyjnie wiązać ErbB2 w przeciwieństwie do innych receptorów ErbB, i może być tym, które nie wchodzi w znaczący sposób w reakcje krzyżowe z innymi białkami takimi jak EGFR, ErbB3 lub ErbB4. W takich wykonaniach, zakres wiązania przeciwciała do owych białek niebędących ErbB2 (np., wiązanie się do endogennego receptora na
PL 214 010 Β1 powierzchni komórki) stanowić będzie mniej niż 10%, jak ustalono za pomocą analizy sortowania komórek zaktywowanych fluorescencyjnie (FACS) lub radioimmunoprecypitacji (RIA). Czasami przeciwciało anty-ErbB2 nie będzie w znacznym stopniu reagować krzyżowo ze szczurzym białkiem neu, np., jak opisano w Schecter i wsp., Naturę, 312: 513 (1984) oraz Drebin i wsp., Naturę, 312: 545-548 (1984).
Przeciwciało „blokujące aktywację receptora ErbB ligandem, to takie, które obniża lub zapobiega takiej aktywacji, jak to zostało powyżej zdefiniowane, przy czym przeciwciało ma zdolność blokowania aktywacji receptora ErbB ligandem zasadniczo bardziej skutecznie niż monoklonalne przeciwciało 4D5, np., mniej więcej tak skutecznie, jak monoklonalne przeciwciała 7F3 lub 2C4 lub ich fragmenty Fab i korzystnie mniej więcej tak skutecznie, jak monoklonalne przeciwciało 2C4 lub jego fragment Fab. Na przykład, przeciwciało blokujące aktywację receptora ErbB ligandem może być tym, które jest około 50-100% bardziej skuteczne niż 4D5 w blokowaniu tworzenia hetero-oligomeru ErbB. Blokowanie aktywacji receptora ErbB ligandem może przejawiać się w różny sposób, np. przez zakłócanie: wiązania liganda do receptora ErbB, tworzenia kompleksu ErB, aktywności kinazy tyrozynowej receptora ErbB w kompleksie ErbB i/lub fosforylacji reszt(y) kinazy tyrozynowej w lub przez receptor ErbB. Przykłady przeciwciał blokujących aktywację receptora ErbB ligandem obejmują monoklonalne przeciwciała 2C4 i 7F3 (które blokują aktywację hetero-oligomerów ErbB2/ErbB3 i ErbB2/ErbB4 przez HRG; oraz aktywację hetero-oligomeru EGFR/ErbB2 przez EGF, TGF-α, amfiregulynę, HB-EGF i/lub epiregulinę); oraz przeciwciała L26, L96 i L288 (Klapper i wsp., Oncogene, 14: 2099-2109 (1997)), które blokują wiązanie EGF i NDF do komórek T47D wykazujących ekspresję EGFR, ErbB2, ErbB3 i ErbB4.
Przeciwciało posiadające „biologiczną właściwość oznaczonego przeciwciała takie, jak przeciwciało monoklonalne oznaczone jako 2C4, to takie, które posiada jedną lub więcej właściwości biologicznych tego przeciwciała, odróżniających je od innych przeciwciał wiążących się do tego samego antygenu (np. ErbB2). Na przykład, przeciwciało o biologicznej właściwości 2C4 może blokować aktywację przez HRG hetero-oligomeru ErbB zawierającego ErbB2 i ErbB3, ErbB1 lub ErbB4; blokować aktywację receptora ErbB zawierającego EGFR i ErbB2 przez EGF, TGF-α, HB-EGF, epiregulynę i/lub amfiregulynę; blokować aktywację MAPK z udziałem EGF, TGF-α i/lub HRG; i/lub wiązać ten sam epitop w domenie zewnątrzkomórkowej ErbB2, jak ten wiązany przez 2C4 (np. co blokuje wiązanie przeciwciała monoklonalnego 2C4 do ErB2).
O ile nie wskazano inaczej, określenie „przeciwciało monoklonalne 2C4 odnosi się do przeciwciała posiadającego reszty aminokwasowe wiążące antygen wchodzące skład, lub pochodzące z mysiego przeciwciała 2C4 opisanego w Przykładach, poniżej. Na przykład, przeciwciało monoklonalne 2C4 może być mysim przeciwciałem monoklonalnym 2C4 lub jego wariantem takim, jak humanizowane przeciwciało 2C4 posiadające reszty aminokwasowe wiążące antygen pochodzące z mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4. Przykłady humanizowanych przeciwciał 2C4 są zamieszczone tutaj oraz wWO 01/00245, który został tu zamieszczony w formie odniesienia w całości. O ile nie wskazano inaczej, wyrażenie „rhuMAb 2C4, zastosowane tutaj, odnosi się do przeciwciała zawierającego zmienną lekką (VL) i zmienną ciężką (HV) sekwencję SEK. ID. NR 3 i 4 odpowiednio, połączone z sekwencjami rejonów stałych ludzkiego lekkiego i ciężkiego lgG1 (allotyp nie-A) opcjonalnie ulegających ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO).
O ile nie wskazano inaczej, określenie „przeciwciało monoklonalne 4D5 odnosi się do przeciwciała posiadającego reszty aminokwasowe wiążące antygen wchodzące w skład, lub pochodzące z mysiego przeciwciała 4D5 (ATCC CRL 10463). Na przykład, przeciwciało monoklonalne 4D5 może być mysim przeciwciałem monoklonalnym 4D5 lub jego wariantem takim, jak humanizowane 4D5 posiadające reszty wiążące antygen z mysiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Przykładowe humanizowane przeciwciała 4D5 obejmują huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, nuMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tak, jak w Patencie USA nr 5821337, przy czym huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) jest preferowanym humanizowanym przeciwciałem 4D5.
„Czynnik hamujący wzrost zastosowany tutaj, odnosi się do związku lub kompozycji, hamujących wzrost komórki, szczególnie komórki nowotworowej wykazującej ekspresję ErbB albo in vitro, albo in vivo. Zatem, czynnik hamujący wzrost może być tym, który znacząco obniża procent komórek wykazujących ekspresję ErbB w fazie S. Przykłady czynników hamujących wzrost obejmują czynniki blokujące postęp cyklu komórkowego (w miejscu innym niż faza S) takie, jak czynniki indukujące zatrzymanie w fazie G1 i zatrzymanie w fazie M. Klasyczne blokery fazy M obejmują winki (winkrystynę i winblastynę), taksany i inhibitory topo II takie, jak doksorubicyna, epirubicyna, daunorubicyna, etopozyd i bleomycyna. Czynniki zatrzymujące w fazie G1 wpływają także na zatrzymanie w fazie S, na
PL 214 010 Β1 przykład czynniki alkilujące DNA takie, jak tamoksyfen, prednison, dakarbazyna, mechloretamina, cisplatyna, metotreksanian, 5-fluorouracyl i ara-C. Dalsze informacje można znaleźć w The Molecular Basis of Cancer, red. Mendesohn i Israel, rozdział 1 zatytułowany “Celi cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs Murakami i wsp., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), szczególnie str. 13.
Przykładami przeciwciał „hamujących wzrost są te, które wiążą się do ErbB2 i hamują wzrost komórek nowotworowych wykazujących nadekspresję ErbB2. Preferowane przeciwciała anty-ErbB2 hamujące wzrost hamują wzrost komórek nowotworu piersi SK-BR-3 w hodowli komórkowej o więcej niż 20% i korzystnie więcej niż 50% (np., od 50% do około 100%) przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około 0,5 do 30 pg/ml, przy czym hamowanie wzrostu ustala się sześć dni po wystawieniu komórek SK- BR-3 na działanie przeciwciała (patrz patent USA nr 5677171 złożony 14 października 1997). Test hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 opisano bardziej szczegółowo w tym patencie oraz tutaj, poniżej. Preferowanym przeciwciałem hamującym wzrost jest monoklonalne przeciwciało 4D5, np. humanizowane 4D5.
Przeciwciało „indukujące śmierć komórkową to takie, które powoduje, że komórka żywa staje się nieżywa. Komórką jest na ogół ta, która wykazuje ekspresję receptora ErbB2, szczególnie, jeżeli komórka wykazuje nadekspresję receptora ErbB2. Korzystnie, jeżeli komórka jest komórką nowotworową, np., komórką piersi, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, ślinianek, płuca, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza. In vitro komórka może być komórką SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB453, MDA-MB-361 i SKOV3. Śmierć komórek in vitro może zostać określona przy braku układu dopełniacza i komórek efektorowych układu odpornościowego, w celu wyosobnienia śmierci komórkowej indukowanej cytotoksycznością komórek zależną od przeciwciał (ADCC) lub cytotoksycznością zależną od dopełniacza (CDC). Zatem, oznaczenie śmierci komórek może zostać przeprowadzone przy zastosowaniu surowicy inaktywowanej termicznie (tj. przy braku elementów układu dopełniacza) i przy braku komórek efektorowych układu odpornościowego. W celu określenia czy przeciwciało ma zdolność indukcji śmierci komórkowej, można oznaczyć utratę integralności błony komórkowej poprzez ocenę wychwytu jodku propidyny (PI), błękitu trypanu (patrz Moore i wsp., Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)) lub 7AAD w porównaniu z komórkami niczym nie traktowanymi. Preferowane przeciwciała indukujące śmierć komórkową to takie, które indukują wychwyt PI w teście wychwytu PI w komórkach BT474 (patrz poniżej).
Przeciwciało „indukujące apoptozę to takie, które indukuje zaprogramowaną śmierć komórki, co oceniane jest poprzez wiązanie anneksyny V, fragmentację DNA, kurczenie się komórki, rozszerzanie się siateczki wewnątrzplazmatycznej, fragmentację komórki i/lub tworzenie się pęcherzyków błonowych (zwanych ciałkami apoptotycznymi). Komórkąjest zazwyczaj komórka wykazująca nadekspersję receptora ErbB2. Korzystnie, komórkąjest komórką nowotworową, np. komórką piersi, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, ślinianki, płuca, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza. In vitro, komórka może być komórką SK-BR-3, BT474, komórką Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 lub komórką SKOV3. Dostępne są rozmaite sposoby oceny wydarzeń towarzyszących apoptozie komórki. Na przykład można mierzyć translokację fosfatydyloseryny poprzez wiązanie anneksyny; fragmentację DNA można ocenić poprzez drabinkowanie DNA; oraz jądrową/chromatynową kondensację wraz z fragmentaryzacją DNA ocenić można poprzez przyrost w komórkach hipodiploidalnych. Korzystnie, przeciwciało indukujące apoptozę to takie, które wywołuje około 2 do 50 razy, korzystnie 5 do 50 razy i najkorzystniej 10 do 50 razy większą indukcję wiązania anneksyny w porównaniu z niczym nie traktowanej komórki w teście wiązania anneksyny przy zastosowaniu komórek BT474 (patrz poniżej). Czasami przeciwciało pro-apoptotyczne będzie tym, które następnie blokuje aktywację receptora ErbB ligandem ErbB (np. przeciwciało 7F3); tj. przeciwciało posiada właściwość biologiczną przeciwciała monoklonalnego 2C4. W innych sytuacjach, przeciwciało jest tym, które nie blokuje w znaczący sposób aktywacji receptora ErbB ligandem ErbB (np. 7C2). Ponadto, przeciwciało może być takie, jak 7C2, które indukując apoptozę, nie wywołuje dużego obniżenia procentowego udziału komórek w fazie S (np. takie, które indukuje jedynie 0-10% obniżenie procentowego udziału tych komórek w odniesieniu do kontroli).
,,Epitop 2C4 to rejon w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, do którego wiąże się przeciwciało 2C4. W celu przeszukiwania przeciwciał, które wiążą się z epitopem 2C4, można wykonać rutynowy test krzyżowego blokowania taki, jak opisano w Antibodies, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopowe w celu ustalenia czy przeciwciało wiąże się z epitopem 2C4 na ErbB2 (np. jakakolwiek jedna
PL 214 010 Β1 lub więcej reszt aminokwasowych w rejonie od około 22 do około 584 reszty aminokwasowej ErbB2, włącznie; patrz Fig. 1A-B).
„Epitop 4D5 to rejon w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, do którego wiąże się przeciwciało 4D5 (ATCC CRL 10463). Epitop ten znajduje się w pobliżu domeny transbłonowej ErbB2. W celu przeszukiwania przeciwciał, które wiążą się z epitopem 4D5, wykonać można rutynowy test blokowania krzyżowego taki, jak opisano w Antibodies, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).
Alternatywnie, przeprowadzić można mapowanie epitopowe w celu ustalenia czy przeciwciało wiążę się z epitopem 4D5 na ErbB2 (np. jakakolwiek jedna lub więcej reszt aminokwasowych w rejonie od około 529 do około 625 reszty aminokwasowej włącznie; patrz Fig. 1 A-B).
„Epitop 3H4 to rejon w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, do którego wiąże się przeciwciało 3H4. Epitop ten obejmuje reszty aminokwasowe od około 541 do około 599 włącznie, w sekwencji aminokwasowej zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2; patrz Fig. 1 A-B.
„Epitop 7C2/7F3 to rejon na N końcu zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, do którego wiążą się przeciwciała 7C2 i/lub 7F3 (każde złożone z ATCC, patrz poniżej). W celu przeszukiwania przeciwciał, które wiążą się z epitopem 7C2/7F3, wykonać można rutynowy test blokowania krzyżowego taki, jak opisano w Antibodies, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopowe w celu ustalenia, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 7C2/7F3 na ErbB2 (np. jakakolwiek jedna lub więcej reszt aminokwasowych w rejonie od około 22 do około 53 reszty aminokwasowej ErbB2; patrz Fig. 1 A-B).
„Ssak dla celów leczenia odnosi się do każdego zwierzęcia sklasyfikowanego jako ssak, wliczając ludzi, zwierzęta udomowione i hodowlane oraz zwierzęta przebywające w zoo, wykorzystywane do sportów oraz domowe takie, jak psy, konie, koty, krowy itd. Korzystnie, ssakiem jest człowiek.
Nowotwór, który jest „wrażliwy na leczenie wykazuje statystycznie znaczącą poprawę w odpowiedzi na leczenie przeciwciałem anty-ErbB w porównaniu z brakiem leczenia lub leczeniem placebo w określonym modelu zwierzęcym lub ludzkiej próbie klinicznej, lub początkowo reaguje na leczenie przeciwciałami anty-ErbB, lecz rozwija się w trakcie kontynuacji leczenia.
Określenia „leczyć lub „leczenie odnoszą się zarówno do leczenia terapeutycznego, jak i profilaktycznych lub zapobiegawczych pomiarów, których zadaniem jest zapobieżenie lub spowolnienie (zmniejszenie) niepożądanej fizjologicznej zmianie lub schorzeniu takiemu, jak rozwój lub rozprzestrzenianie się nowotworu. Dla celów niniejszego wynalazku, korzystne lub pożądane efekty obejmują, ale nie są ograniczone do, złagodzenia objawów, zmniejszenia rozległości choroby, ustabilizowania (tj. nie pogorszenia) stanu choroby, opóźnienia lub spowolnienia postępu choroby, polepszenia lub uśmierzenia stanu choroby oraz ustąpienia (częściowego czy też całkowitego) objawów, wykrywalnych czy też niewykrywalnych. „Leczenie może także oznaczać wydłużone przeżycie w porównaniu z oczekiwanym przeżyciem przy braku leczenia. Osoby potrzebujące leczenia obejmują osoby, u których już wystąpił stan chorobowy lub zaburzenia, jak również osoby narażone na wystąpienie stanu chorobowego lub zaburzenia lub osoby, u których należy przeciwdziałać wystąpieniu stanu chorobowego lub zaburzeniu.
„Zaburzenie to każdy stan, który może ulec poprawie dzięki leczeniu według niniejszego wynalazku. Obejmuje to zaburzenia przewlekłe i ostre lub choroby obejmujące takie stany patologiczne, które predysponują ssaka do wystąpienia omawianego zaburzenia. Niewyczerpane przykłady zaburzeń nadających się tutaj do leczenia obejmują nowotwory łagodne i złośliwe; białaczki i nowotwory limfatyczne, w szczególności nowotwór piersi, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, ślinianek, płuca, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki, prostaty oraz pęcherza; zaburzenia neuronalne, glejowe, astrocytalne, podwzgórza i innych gruczołów, makrofagowe, naskórkowe, stromalne oraz blastoceliczne; zaburzenia zapalne, naczyniowe oraz immunologiczne. Preferowanym zaburzeniem nadającym się do leczenia według niniejszego wynalazku jest nowotwór złośliwy.
Określenie „ilość terapeutycznie skuteczna odnosi się do ilości leku skutecznej w leczeniu choroby lub zaburzenia u ssaka. W przypadku nowotworu, terapeutycznie skuteczna ilość leku może obniżyć liczbę komórek nowotworowych; zredukować rozmiar nowotworu, zahamować (tj. spowolnić do pewnego stopnia, a korzystnie zatrzymać) naciekanie komórek nowotworowych do narządów obwodowych; zahamować (tj. spowolnić do pewnego stopnia, a korzystnie zatrzymać) tworzenie się przerzutów nowotworowych; zahamować, do pewnego stopnia, wzrost nowotworu; i/lub do pewnego stopnia złagodzić jeden lub więcej spośród objawów towarzyszących nowotworowi. Do pewnego stopnia lek może zapobiec wzrostowi i/lub zabić istniejące komórki nowotworowe, może być cytostatyczny
PL 214 010 Β1 i/lub cytotoksyczny. W terapii nowotworowej, skuteczność może być na przykład mierzona przez ocenę czasu do postępu choroby (TTP) i/lub ustalenie stopnia odpowiedzi (RR).
Określenia „nowotwór i „nowotworowy odnoszą się do lub opisują stan fizjologiczny u ssaków, który typowo charakteryzuje się nieuregulowanym wzrostem komórkowym. „Nowotwór składa się z jednej lub więcej komórek nowotworowych. Przykłady nowotworów obejmują, ale nie ograniczają się do, raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka oraz białaczki lub nowotworów limfatycznych. Bardziej szczegółowe przykłady takich nowotworów obejmują nowotwór płaskokomórkowy (np. nabłonkowy rak płaskomórkowy), nowotwór płuc wliczając drobnokomórkowy nowotwór płuc, nie-drobnokomórkowy nowotwór płuc („NSCLC), gruczolakoraka płuc i nowotwór płaskokomórkowy płuc, nowotwór otrzewnej, nowotwór wątrobowokomórkowy, nowotwór żołądka lub żołądkowy wliczając nowotwór żołądkowojelitowy, nowotwór trzustki, glejaka, nowotwór szyjki macicy, nowotwór jajnika, wątroby, pęcherza, wątrobiak, nowotwór piersi, nowotwór okrężnicy, nowotwór odbytu, nowotwór jelita grubego, rak śluzówki macicy lub rak macicy, rak ślinianek, nowotwór nerki lub nerkowy, nowotwór prostaty, nowotwór sromu, nowotwór tarczycy, rak wątrobowy, rak odbytu, rak prącia, jak również nowotwór głowy i szyi.
„Nowotwór wykazujący ekspresję ErbB to nowotwór zawierający komórki wykazujące na swej powierzchni obecność białka ErbB. „Nowotwór wykazujący ekspresję ErbB2 to nowotwór, który wytwarza ErbB2 na powierzchni swych komórek na poziomie wystarczającym, by przeciwciało antyErbB2 mogło związać się do nich i wykazywać względem nowotworu efekt terapeutyczny.
Nowotwór „charakteryzujący się nadmierną aktywacją receptora ErbB to nowotwór, w którym nadmierna aktywacja receptora ErbB w komórkach nowotworowych znacząco przekracza poziom aktywacji tego receptora w komórkach nienowotworowych tkanki tego samego typu. Taka nadmierna aktywacja może wynikać z nadekspresji receptora ErbB i/lub wyższego niż normalnie poziomu Uganda dla ErbB mogącego przez swą dostępność aktywować receptor ErbB w komórkach nowotworowych. Taka nadmierna aktywacja może spowodować i/lub być spowodowana złośliwym stadium komórki nowotworowej. W niektórych wykonaniach, nowotwór będzie poddany diagnostycznym lub prognostycznym testom celem określenia czy nastąpiła amplifikacja i/lub nadekspresja receptora ErbB, powodująca taką nadmierną aktywację receptora ErbB. Alternatywnie lub dodatkowo, nowotwór można poddać diagnostycznym lub prognostycznym testom w celu określenia czy w nowotworze nastąpiła amplifikacja i/lub nadekspresja Uganda dla ErbB, właściwa dla nadmiernej aktywacji receptora. W przypadku takich nowotworów nadmierna aktywacja receptora wynikać może ze stymulującego oddziaływania autokrynnego.
W stymulującym oddziaływaniu „autokrynnym, następuje samopobudzanie spowodowane działaniem komórek nowotworowych wytwarzających zarówno Ugand dla ErbB, jak i odpowiadający mu receptor ErbB. Na przykład, nowotwór może wykazywać ekspresję lub nadekspresję EGFR, jak również wykazywać ekspresję lub nadekspresję Uganda dla EGFR (np., EGF, TGF-α lub HB-EGF). W innym wykonaniu, nowotwór może wykazywać ekspresję lub nadekspresję ErbB2, jak również ekspresję lub nadekspresję hereguliny (np., γ-HRG).
Nowotwór wykazujący „nadekspresję receptora ErbB, to nowotwór wykazujący znacząco wyższy poziom receptora ErbB takiego, jak ErbB2, na powierzchni swych komórek w porównaniu z nie nowotworowymi komórkami tkanki tego samego typu. Taka nadekspresja może być spowodowana amplifikacją genu lub podwyższoną transkrypcją lub translacją. Nadekspresja receptora ErbB może zostać oznaczona w diagnostycznym lub prognostycznym teście poprzez ocenę podwyższonego poziomu białka ErbB na powierzchni komórki (np. metodą immunohistochemiczną; IHC). Alternatywnie lub dodatkowo, można zmierzyć w komórce poziom kwasu nukleinowego kodującego ErbB, np. metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH; patrz WO 98/45479 opublikowane w październiku, 1998), metodą typu Southern biot lub technikami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) takimi, jak ilościowy test PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Nadekspresja Uganda dla ErbB może zostać diagnostycznie określona u pacjenta poprzez ocenę poziomu Uganda (lub kodującego go kwasu nukleinowego), np. poprzez biopsję nowotworu lub za pomocą rozmaitych diagnostycznych testów takich, jak IHC, FISH, biot typu Southern, PCR lub opisane powyżej testy in vivo. Nadekspresję receptora ErbB można także badać mierząc wolną formę antygenu (np. zewnątrzkomórkową domenę ErbB) wpłynie biologicznym takim, jak surowica (patrz np. Patent U.S.A Nr 4933294 złożony 12 czerwca, 1990; WO 91/05264 opublikowany 18 kwietnia, 1991; Patent U.S.A Nr 5401638 złożony 28 marca 1995; oraz Sias i wsp., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). Poza opisanymi powyżej testami, specjalistom dostępne są rozmaite inne testy in vivo. Na przykład, komórki w ciele pacjenta można wystawić na działanie przeciwciała opcjonalnie wyznakowanego wykrywalnym znacznikiem, np. izoto
PL 214 010 Β1 pem radioaktywnym i ocenić wiązanie przeciwciała do komórek pacjenta, np. metodą zewnętrznego badania radioaktywności lub poprzez analizę biopsji pobranej od pacjenta uprzednio wystawionego na działanie przeciwciała.
Nowotwory wykazujące nadekspresję HER2 są oceniane poprzez punktację immunohistochemiczną odpowiadającą liczbie kopii ulegających ekspresji cząsteczek HER2 na komórkę i mogą być określane biochemicznie: 0 = 0-10000 kopii/komórkę, 1+ = co najmniej około 200000 kopii/komórkę, 2+ = co najmniej około 500000 kopii/komórkę, 3+ = co najmniej około 2000000 kopii/komórkę. Nadekspresja HER2 na poziomie 3+, prowadząca do niezależnej od liganda aktywacji kinazy tyrozynowej (Hudziak i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7159-7163 [1987]), pojawia się w przybliżeniu w 30% przypadków nowotworu piersi i u tych pacjentów przeżywalność bez nawrotów choroby oraz przeżywalność całkowita jest obniżona (Slamon i wsp., Science, 244: 707-712 [1989]; Slamon i wsp., 235: 177-182 [1987]).
Przeciwnie, nowotwór „nie charakteryzujący się nadekspresją receptora ErbB2 to nowotwór, który w teście diagnostycznym nie wykazuje ekspresji wyższej niż poziom normalny receptora ErbB2 w porównaniu z nie nowotworową komórką tkanki tego samego typu.
Nowotwór „niezależny od hormonów to nowotwór, którego proliferacja nie zależy od obecności hormonu wiążącego się do receptora ulegającego ekspresji w komórkach nowotworu. Nowotwory takie nie ulegają regresji klinicznej po zastosowaniu leczenia farmakologicznego lub operacyjnego obniżającego stężenie hormonu w nowotworze lub jego bliskości. Przykłady nowotworów niezależnych od hormonów obejmują niezależny od androgenów nowotwór prostaty, niezależny od estrogenów nowotwór piersi, nowotwór śluzówki macicy i nowotwór jajnika. Takie nowotwory mogą powstawać jako nowotwory zależne od hormonów i w następstwie terapii przeciw hormonalnej rozwinąć się od stadium wrażliwego na hormony do nowotworu opornego na działanie hormonów.
Pojęcie „czynnik cytotoksyczny zastosowany tutaj, odnosi się do substancji hamującej lub zapobiegającej funkcjonowaniu komórek i/lub niszczący komórki. Pojęcie ma obejmować izotopy radioaktywne (np. At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, ΒΪ212, P32 oraz radioaktywne izotopy Lu), czynniki chemoterapeutyczne i toksyny takie, jak toksyny małocząsteczkowe lub enzymatycznie aktywne toksyny pochodzące z bakterii, grzybów, roślin lub zwierząt, wliczając ich fragmenty i/lub warianty.
„Czynnik chemoterapeutyczny to związek chemiczny mający zastosowanie w leczeniu nowotworu. Przykłady czynników terapeutycznych obejmują leki alkilujące takie, jak tiotepa i cyklofosfamid (CYTOXAN™); sulfoniany alkilu takie, jak busulfan, improsulfan oraz piposulfan; azirdyny takie, jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etyleniminy i metylamelaminy wliczając altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforamid, trietylenotiofosforamid oraz trimetylolomelaminę; iperyty azotowe takie, jak chlorambucyl, chlomaphazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melphalan, novembichin, phenestryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylu; nitromoczniki takie, jak carmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna; antybiotyki takie, jak aklacynomyzyna, aktomycyna, authramycyna, azaseryna, bleomycyny, kaktinomycyna, kalicheamycyna, karabycyna, karminomycyna, karzinofilina, chromomycyna, daktynomycyna, daunorubycyna, detorubycyna, 6-diazo-5-okso-L-norleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, esorubicyna, idarubicyna, marcellomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, quelamycyna, rodorubycyna, streptonigryna, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zynostatyna, zorubycyna; anty-metabolity takie, jak metotreksanian i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego takie, jak dentopterina, metotreksanian, pteropteryna, trimetreksanian; analogi puryn takie, jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamiprina, tioguanina; analogi pirymidynowe takie, jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, carmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, fluoksyurydyna, 5-FU; androgeny takie, jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; przeciwnadnerczowe takie, jak aminoglutetymid, mitotan, trilostan; uzupełniacze kwasu foliowego takie jak kwas frolinowy; acetoglaton; aldofosfamid glikozydu; kwas aminolewulinikowy; amsacrinina; bestrabucil; bisantren; edatraksat, defofamina; demokolcina; diaziquon; elfornitynna; octan ellyptyny; etoglucid; azotan galu; hydroksymocznik; lentinan; lonidamina; mitoguazon; mitoksantron, mopidamol; nitrancrin; pentostatyna; pirarubicyna; kwas podofilinowy; 2-etylo hydrazyd; prokarbazyna; PSK®; razoksan; sizofiran; spirogermanium; kwas tenuazonowy; triaziquon; 2,2',2-trójchlorotrójetyloamina; uretan; windezyna; dakarbazyna; mannomustyna; mitobronitol, mitolaktol; pipobroman; gacytozyna; arabinozyd („Ara-C); cyklofosfamid; tiotepa; taksany np. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Pinceton, NJ) oraz docetaksel (TAXOTERE® Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, France); chlorambucil; gemcitabina;
PL 214 010 Β1
6-tioguanina; merkaptopuryna, metotreksat; analogi platyny takie jak cisplatyna i carboplatyna; winblastyna; platinum, etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitomycyna C; mitoksantron, winkristina, winorelbina, nawelbina, nowantrona; tenipozyd, daunomycyna; aminopteryna; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomerazowy RFS 2000; difluorometyloornityna (DMFO), kwas retionowy, esperamycyny; kapecitabina; oraz sole dopuszczalne farmaceutycznie, kwasy lub pochodne których kolwiek z powyższych. W definicji tej zawierają się także czynniki anty-hormonalne, które działają w celu uregulowania lub zahamowania działania hormonów na nowotwory, takie jak anty-estrogeny włączając na przykład tamoksifen, raloksifen, hamujące aromatazę 4(5)-imidazole, 4-hydroksytamoxifen, trixifen, keoxifen, LY117018, onapriston oraz toremifen (Fareston); oraz anty-androgeny takie jak flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid i goserelina oraz farmaceutycznie akceptowane sole, kwasy i pochodne jakichkolwiek z powyższych.
Stosowany tutaj termin „lek działający na EGFR odnosi się do czynnika terapeutycznego wiążącego się do EGFR i opcjonalnie hamującego aktywację EGFR. Przykłady takich czynników obejmują przeciwciała oraz małe cząsteczki wiążące się z EGFR. Przykłady przeciwciał wiążących się z EGFR obejmują Mab 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (patrz Patent USA Nr 4943533, Mendelshon i wsp.) oraz różne ich odmiany, takie jak zchimeryzowane 225 (C225 lub Cetuximab; ERBUTIX®) oraz ludzkie 225 (H225) o zmienionym kształcie (patrz, WO 96/40210, Imclone Systems Inc); przeciwciała wiążące mutanta typu II EGFR (Patent USA Nr 5212290); humanizowane i chimeryczne przeciwciała wiążące się z EGFR jak to opisano w Patencie USA Nr 5891996; oraz ludzkie przeciwciała wiążące się z EGFR, takie jak ΑΒΧ-EGF (patrz WO 98/50433, Abgenix). Przeciwciało anty-EGRF może być połączone z czynnikiem cytotoksycznym tworząc zatem immunokonjugat (patrz np., EP 659439A2, Patent Merck GmbH). Przykłady małych cząsteczek wiążących się z EGFR obejmują ZD1839 lub Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), CP-358774 (TARCEVA™; Genentech/OSI) i AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen). „Inhibitor kinazy tyrozynowej to cząsteczka hamująca do pewnego stopnia aktywność kinazy tyrozynowej spośród takich kinaz tyrozynowych jak receptory ErbB. Przykłady takich inhibitorów obejmują leki działające na EGFR wspomniane w poprzednim akapicie jak również quinazoliny takie jak PD 153035, 4-(3-chloroanilino) quinazolina, piridopirymidyny.pririmidopirymidyny, pirolopirymidyny, takie jak CGP 59326, CGP 60261 i CPG 62706 oraz pirazolopirymidyny, 4-(fenyloamino)-7Hpirrolo[2,3-d] pirymidyny, kurkumina (diferuloilometan, 4,5-bis (4-fluoroanilino) ftalimid), tyrfostiny obejmujące części nitrotiofenowe; PD-0183805 (Warner-Lamber); cząsteczki antysensowne (np. wiążące się z kwasem nukleinowym kodującym ErbB); chinoksaliny (Patent USA Nr 5804396); tr/ostyny (patent USA nr 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novatris/Schering AG); inhibitory pan-ErbB takie, jak CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); imatinib mesylanianu (Gleevac; Novatris); PKI 166 (Novatris); GW2016 (Glaxo Smith Kline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novatris/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); lub jak to opisano w którejkolwiek spośród następujących publikacji patentowych: Patent USA Nr 5804396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); i WO 96/33980 (Zeneca).
„Czynnik przeciwangiogeniczny odnosi się do związku blokującego lub do pewnego stopnia zakłócającego tworzenie naczyń krwionośnych. Czynnikiem przeciwangiogenicznym może być, na przykład, mała cząsteczka lub przeciwciało, które wiąże się do czynnika wzrostu lub receptora dla czynnika wzrostu zaangażowanego w rozwój angiogenezy. Korzystnie, czynnikiem przeciwangiogenicznym jest tutaj przeciwciało wiążące się do czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF).
Określenie „cytokina jest to ogólne pojęcie odnoszące się do białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które działają na inne komórki jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin sąlimfokiny, monokiny oraz tradycyjne hormony polipeptydowe. Pośród cytokin znajdują się hormony wzrostu takie, jak ludzki hormon wzrostu, ludzki N-metionylowowany hormon wzrostu oraz bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczycy; tyroksyna; insulina; proinsulina; relaksyna; prorelaksyna; hormony glikoproteinowe takie, jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyreotropowy (TSH) i hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostu; czynnik wzrostu fibroblastów; prolaktyna; laktogen łożyskowy; czynnik martiwcy nowotworów a i β; substancja hamująca mullerynę; mysi peptyd związany z gonadotropiną; nhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyń; integryna; trombopoetyna (TPO); czynniki wzrostu neuronów takie, jak NGF-β; płytkowy czynnik wzrostu; transformujące czynniki wzrostu (TGF) takie, jak TGF-α i TGF-β; insulinopodobny czynnik wzrostu I oraz II;
PL 214 010 Β1 erytropoetyna (EPO); czynniki osteo-indukujące; interferony takie, jak interferon-α, -β i -γ, czynniki stymulujące tworzenie się kolonii (CSF) takie, jak CSF makrofagów (M-CSF); MCF granulocytów i makrofagów (GM-CSF); oraz CSF granulocytów (G-CSF); interleukiny (II) takie, jak IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; czynnik nekrozy nowotworów taki, jak TNF-a lub TNF-β; i inne czynniki polipeptydowe wliczając LIF i ligand kit (KL). Stosowane tutaj, pojęcie cytokiny obejmuje białka pochodzenia naturalnego lub z hodowli zrekombinowanych komórek oraz biologicznie aktywne ekwiwalenty naturalnych sekwencji cytokinowych.
Określenie „prolek stosowane w niniejszej aplikacji odnosi się do prekursorowej lub pochodnej formy substancji farmaceutycznie aktywnej, która jest mniej cytotoksyczna względem komórek nowotworowych w porównaniu z lekiem macierzystym i jest zdolna do enzymatycznej aktywacji lub przemiany w bardziej aktywną formę macierzystą. Patrz np., Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) i Stella i wsp., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt i wsp., (wyd), str. 247-267, Humana Press (1985). Proleki według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do, proleków zawierających fosforan, proleków zawierających tiofosforan, proleków zawierających siarczan, proleków zawierających peptyd, proleków zmodyfikowanych aminokwasami D, proleków glikozylowanych, proleków zawierających β-laktam, proleków zawierających opcjonalnie podstawnik fenoksyacetamidowy lub proleków zawierających opcjonalnie podstawnik fenylacetamidowy, 5-fluorocytozyny i innych proleków 5-fluorourdynowych, które mogą ulec przemianie do bardziej aktywnych wolnych leków cytotoksycznych. Przykłady leków cytotoksycznych, które mogą być derywatyzowane do formy proleku do zastosowania w tym wynalazku obejmują, lecz nie są ograniczone do tych czynników chemoterapeutycznych opisanych powyżej.
„Liposom jest małym pęcherzykiem składającym się z rozmaitych rodzajów lipidów, fosfolipidów i/lub czynnika powierzchniowo czynnego, który znajduje zastosowanie w procesie dostarczania ssakowi leku (takiego, jak m przeciwciała anty-ErbB2 ujawnione tutaj i, opcjonalnie, czynnika chemoterapeutycznego). Składniki liposomu są zwykle ułożone w formie dwuwarstwy, podobnej do ułożenia lipidów błon biologicznych.
Pojęcie „wkład do pakunku zastosowany jest w odniesieniu do instrukcji zwyczajowo dołączonej do handlowych opakowań produktów terapeutycznych, która zawiera informacje co do wskazówek, stosowania, dawek, podawania, przeciwwskazań i/lub ostrzeżeń dotyczących stosowania takich produktów terapeutycznych.
„Kardioprotektant to związek lub kompozycja zapobiegająca lub obniżająca nieprawidłowe funkcjonowanie mięśnia sercowego (t.j. kardiomiopatię i/lub zastoinową niewydolność serca) towarzyszącego podawaniu pacjentowi leku takiego, jak antybiotyk antracyklina i/lub przeciwciało anty-ErbB2. Kardioprotektant może na przykład, hamować lub redukować kardiotoksyczny wpływ wolnych rodników i/lub zapobiegać lub obniżać uraz stresu utleniającego. Przykłady kardioprotektantów w pojęciu niniejszej definicji obejmują czynniki chelatujące żelazo (ICRF-187) (seifert i wsp., The Annals of Pharmacotherapy, 28: 1063-1072 (1994)); czynniki obniżające poziom tłuszczu i/lub antyoksydanty takie jak probucol (Singal i wsp., J. Mol. Celi Cardiol., 27: 1055-1063 (1995)); amifostina (ester aminotiolo 2-[(3-aminopropylo)amino]etanotiolo-dihydrogenofosforanu, zwany także WR-2721, oraz jego defosforylowana, pobierana komórkowo postać zwana WR-1065) oraz kwas S-3-(3-metyloaminopropylamino)-propylofosforawotiolowy (WR-151327), patrz Green i wsp., Cancer Research, 54: 738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R. w Bristow MR, wyd. Drug Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)); beta-blokery takie jak metoprolol (Hjalmarson i wsp., Drugs 47:supl.4: 31-9 (1994); oraz Shaddy i wsp., Am. Hert J., 129: 197-9 (1995)); witamina E, kwas askorbinowy (witamina C); akceptory wolnych rodników takie jak kwas oleanolowy, kwas ursolowy i N-acetylocysteina (NAC); związki pułapkujące spin, takie jak alfa-fenylo-tert-butylo nitron (PBN); (Paracchini i wsp., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)); związki selenoorganiczne takie jak P251 (Elbesen) i tym podobne.
Wyizolowaną cząsteczką kwasu nukleinowego jest cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest zidentyfikowana i oddzielona od co najmniej jednej zanieczyszczającej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą jest zwykle połączona w naturalnym źródle kwasu nukleinowego przeciwciała. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest inna niż w postaci lub położeniu, w którym znajduje się w naturze. Wyizolowane cząsteczki kwasów nukleinowych tym samym są różne od cząsteczki kwasu nukleinowego, jaki występuje w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego zawartą w komórkach, w których zwykle ulega
PL 214 010 Β1 ekspresji przeciwciało, gdzie na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu chromosomalnym różniącym się od tego z naturalnych komórek.
Wyrażenie „sekwencje kontrolne odnosi się do sekwencji DNA niezbędnych do ekspresji funkcjonalnie połączonej sekwencji kodującej w szczególnym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolne odpowiednie dla procaryota obejmują na przykład, promotor, opcjonalnie sekwencje operatora i miejsce wiązania rybosomu. Wiadomo, że eukariotyczne komórki wykorzystują promotory, miejsca poliadenylacji i wzmacniacze.
Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie połączony, gdy jest umieszczony w funkcjonalnej bliskości z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, DNA pre-sekwencji lub lidera wydzielniczego jest funkcjonalnie dołączone do DNA polipeptydu, jeżeli ulega on ekspresji w postaci pre-białka, które bierze udział w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub wzmacniacz jest funkcjonalnie połączony do sekwencji kodującej, jeżeli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomalnego jest funkcjonalnie połączone do sekwencji kodującej, jeżeli znajduje się w pozycji ułatwiającej translację. Na ogół „funkcjonalnie połączony oznacza, że sekwencje DNA będące połączone są przyległe, a w przypadku lidera wydzielniczego, przylegające i w ramce odczytu. Jednakże, wzmacniacze nie muszą przylegać.
Łączenie dokonuje się za pomocą ligacji w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeżeli takie miejsca nie istnieją, stosowane są syntetyczne adaptery oligonukleotydowe lub łączniki zgodnie z warunkami praktyki.
Stosowane tutaj wyrażenia „komórka, „linia komórkowa i „hodowla komórkowa stosowane są zamiennie i wszystkie takie oznaczenia obejmują potomstwo. Zatem, słowa „transformanty i „komórki stransformowane obejmują początkowo badaną komórkę i hodowle uzyskane z niej w odniesieniu do liczby transferów. Zrozumiałe jest także, że całe potomstwo może nie być dokładnie takie samo w odniesieniu do DNA, z powodu rozmyślnych lub przypadkowych mutacji. Włączone jest potomstwo mutacyjne, które ma taką samą funkcję lub właściwość biologiczną jak ta przeszukiwana w pierwotnie transformowanej komórce. W przypadku, gdy wymagane są różne oznaczenia, będzie to jasno wynikało z kontekstu.
Sposoby identyfikowania nowotworów, które są wrażliwe na leczenie przeciwciałami anty-HER2 Źródła nowotworów i komórek nowotworowych
Nowotwory mogą być scharakteryzowane jako wrażliwe na leczenie z zastosowaniem 2C4, lub funkcjonalnie równoważnymi przeciwciałami, to jest przeciwciałami posiadającymi jedną lub więcej właściwości biologicznych przeciwciała 2C4, np., w oparciu o obecność heterodminerów EGFR-ErbB2 i/lub ErbB2-ErbB3 na powierzchni komórkowej, jako miary aktywacji HER2. Próbki nowotworowe mogą być oznaczone na obecność heteromiderów za pomocą każdego znanego w dziedzinie sposobu. Korzystnie, obecność heterodimerów ustala się za pomocąjednego lub więcej sposobów opisanych poniżej.
Jako, że aktywacja HER2 jest wynikiem heterodmimeryzacji i fosforylacji receptora, szczególnie ważnym sposobem identyfikacji nowotworów wrażliwych na leczenie z zastosowaniem 2C4, lub funkcjonalnie równoważnych przeciwciał, jest wykrywanie fosforylacji receptora ErbB, takiej jak fosforylacja receptora ErbB2 (HER2), jak to opisano poniżej.
Źródła komórek nowotworowych, które mogą być analizowane obejmują, ale nie ograniczają się do, biopsji nowotworów, krążących komórek nowotworowych, krążących białek osocza, płynu puchlinowego, nowotworów heteroprzeszczepionych i innych modeli nowotworowych oraz pierwotnych hodowli komórkowych i linii komórkowych pochodzących z nowotworów lub ukazujących właściwości podobne do nowotworowych, jak również zachowanych próbek nowotworowych takich jak utrwalone formaliną, zatopione w parafinie próbki nowotworowe. Rozważane jest w niniejszym wynalazku przeszukiwanie paneli różnych typów komórek nowotworowych pod kontem heterodimerów EGFR-ErbB2 i/lub ErbB2-ErbB3 i/lub fosforylacji receptora ErbB. Komórki nowotworowe takiego samego rodzaju jak komórki nowotworowe, które wypadły dodatnio w teście dla heterodmierów i/lub fosforylacji receptora ErbB, takiego jak receptor ErbB2 (HER2), mogą być poddane terapii z zastosowaniem 2C4. Modele nowotworowe opisane poniżej dostarczone są, jako przykłady i nie powinny być rozpatrywane jako ograniczające wynalazek.
W jednym z wykonań, komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta obecnie cierpiącego na nowotwór, analizowane są pod kontem wrażliwości na leczenie z udziałem 2C4. Jeżeli ustalono, że komórki są wrażliwe, w oparciu o obecność heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 lub przez ukazanie fosforylacji receptora ErbB, pacjent może następnie być leczony przeciwciałem z jedną lub więcej właściwościami 2C4. Korzystnie, pacjent leczony jest z udziałem rhuiMAb 2C4.
PL 214 010 Β1
W innym wykonaniu komórki nowotworowe z szczególnych rodzajów nowotworów lub komórki, które uważa się, że mają właściwości szczególnego rodzaju nowotworu analizowane są pod kontem obecności heterodimerów EGFR-ErbB2 i/lub ErbB2-ErbB3 lub fosforylacji receptora ErbB, korzystnie receptora ErB2 (HER2). W przypadku wykrycia heterodimerów EGFR-ErbB2 i/lub ErbB2-ErbB3 i/lub fosforylacji receptora ErbB, uważa się, że jest to rodzaj nowotworu dobrze nadający się do leczenia przeciwciałem anty-ErbB2 z jedną lub więcej właściwościami biologicznymi 2C4. Pacjenci cierpiący na ten rodzaj nowotworu mogą być leczeni takim przeciwciałem.
Heteroprzeszczepy linii komórkowych
Komórki nowotworowe utrzymywane in vitro, takie jak komórki nowotworowe wzrastające w hodowli i nowotworowych liniach komórkowych, mogą być heteroprzeszczepiane do myszy za pomocą wszczepiania komórek bezpośrednio w miejsce będące przedmiotem zainteresawania. Sposoby takie są dobrze znane specjalistom. Komórki oznacza się w celu identyfikacji obecności heterodimerów EGFR-ErbB2 i/lub ErbB2-ErbB3 lub fosforylacji receptora ErbB, takiej jak fosforylacja receptora ErbB2 (HER2).
W jednym z wykonań, komórki nowotworowe wszczepia się podskórnie do myszy, korzystnie myszy pozbawionych grasicy. W innym wykonaniu, komórki nowotworowe wszczepia się w fizjologicznie odpowiednie miejsce w celu stworzenia odpowiedniego nowotworowego modelu in situ. Na przykład komórki z linii komórkowej nowotworu piersi można wszczepiać w różnym stężeniu w ciało tłuszczowe sutka myszy pozbawionych grasicy w celu odpowiedniejszego wymodelowania biologii nowotworu piersi. Komórki nowotworowe można oznaczyć na obecność heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3 lub fosforylacji receptora ErbB zarówno przed jak i po wszczepieniu. Korzystnie, komórki nowotworowe analizuje się po tym jak wszczepione komórki wytworzyły guz o ustalonej wcześniej wielkości. Myszy można także poddawać leczeniu z 2C4 lub funkcjonalnie równoważnym przeciwciałem, z myszami niepoddanymi leczeniu jako kontroli.
Podobne modele można ustalić dla każdego rodzaju nowotworu, z którego wyprowadzono hodowlane komórki lub linie komórkowe. Rodzaje nowotworu obejmują, ale nie ograniczają się do, pęcherza, mózgu, piersi, okrężnicy, przełyku, nerki, białaczki, wątroby, płuca, czerniaka, jajnika, trzustki, prostaty, mięsaka, żołądka, jąder i macicy. W jednym z wykonań stosowane do wszczepiania są komórki nowotworowe lub linie komórkowe z nadekspresją ErbB2, podczas gdy w innym wykonaniu stosowane są do wszczepiania komórki nowotworowe lub linie komórkowe z ekspresją normalną lub obniżoną ilością ErbB2. W jeszcze innym wykonaniu, stosowane są do wszczepiania komórki nowotworowe lub linie komórkowe nie reagujące na HERCEPTIN®.
W szczególnym wykonaniu około 20 milionów komórek nowotworu piersi MDA-175 wszczepia się do gonadowej poduszeczki tłuszczowej. Ekspresję dimerów HER2/HER1 i/lub HER2/HER3 na powierzchni komórek z heteroprzeszczepu ustala się tak jak według jednego ze sposobów opisanych poniżej. W ten sposób zaimplantowane myszy można poddawać leczeniu z 0,3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg lub 100 mg/kg 2C4. Inne dawkowania pozostajądo ustalenia przez osobę wykwalifikowaną.
Ponieważ niniejszy wynalazek jest odpowiedni do klasyfikowania nowotworu z ekspresją HER2, guzy lite takie jak nowotwór piersi, jajnika, płuca, prostaty oraz jelita grubego, są szczególnie odpowiednie do analizy i leczenia.
Heteropszeszczepy nowotworowe
Próbki ssaczego nowotworu, korzystnie próbki ludzkiego nowotworu, można uzyskać i wszczepić do myszy, korzystnie myszy pozbawionych grasicy. Próbki nowotworowe można uzyskać za pomocą każdej metody znanej w tej dziedzinie. W jednym z wykonań próbki nowotworowe są chirurgicznie wycinane, tak jak podczas biopsji lub podczas zabiegu usuwania nowotworu ze ssaka. W innym wykonaniu próbka nowotworowa jest uzyskiwana przez oczyszczanie komórek nowotowrowych krążących we krwi ssaka.
W szczególnym wykonaniu, skrawki ludzkiego guza litego o średnicy około 5x5x0,5 do 1 mm są wszczepiane w boki myszy pozbawionych grasicy, na ogół cztery fragmenty na mysz. Gdy wszczepione guzy osiągną średnicę około 10-15 mm, można je seryjnie pasażować, stosując na ogół mniejsze fragmenty guza. Sposoby wytwarzania i badania heteroprzeszczepów ludzkich nowotworów opisano w następujących odnośnikach, załączonych tutaj w całości: Fiebig i wsp., „Humań Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents, w „Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Modelsa for Anticancer Drug Development, Fiebig & Burger, wyd. (Basel, Karger 1999), tom. 54, str. 29-50; Berger i wsp., „Establishment and Characterization of Humań Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nudę Mice, w Immunodeficient Mice in oncology, Fiebig & Berger,
PL 214 010 Β1 wyd. (Basel, Karger 1992), str. 23-46; Fiebig & Burger, „Humań Tumor Xenografts and Explants w Models in Cancer Research, Teicher, wyd. (Humana Press 2002) str. 113-137.
Heteroprzeszczepy ludzkie rozpatrywane są jako wysoko przewidywalne pod względem zachowania nowotworu u pacjenta donora, jako, że heteroprzeszczep rośnie jako guz, różnicuje się i tworzy zrąb, układ naczyniowy oraz centralną martwicę. W większości przypadków, heteroprzeszczepy utrzymują większość właściwości molekularnych, histologicznych i patofizjologicznych świeżego pochodzącego od pacjenta nowotworu. Komórki nowotworowe z myszy zawierających pierwsze lub seryjnie pasażowane nowotwory mogą być analizowane na obecność heterodimerów EGFR-ErbB2 i/lub ErbB2-ErbB3 lub na fosforylację receptora ErbB. Myszy można także poddawać leczeniu z udziałem 2C4 lub funkcjonalnie równoważnego przeciwciała.
W jednym z wykonań, nowo utworzony lub opracowany panel ludzkich heteroprzeszczepów jest przeszukiwany na obecność heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3 lub fosforylację receptora ErbB. Fiebig & Beger, powyżej, opisują panel ponad 300 heteroprzeszczepów ludzkich nowotworów opracowanych z różnorodnych typów powszechnych nowotworów takich, jak nowotwory pęcherza, mózgu, piersi, okrężnicy, przełyku, nerek, białaczka, wątroby, płuca, czerniak, jajnika, trzustki, prostaty, mięsak, żołądka, jąder i macicy. W jednym z wykonań, cały panel jest przeszukiwany na obecność heterodimerów lub fosforylacji receptora ErbB takiego, jak receptor ErbB2 (HER2). Podgrupy tego panelu mogą być również przeszukiwane na obecność heterodimerów lub fosforylacji receptora ErbB, przy czym podgrupy tego panelu oparte są na przykład na rodzaju tkanki, nadmiernej, obniżonej lub normalnej ekspresji ErbB2 lub niezdolności do odpowiedzi na HERCEPTIN®. W ten sposób, nowotwory mogą zostać zakwalifikowane jako nadające się do leczenia za pomocą 2C4 na podstawie obecności heterodimerów lub przez wykazanie fosforylacji receptora ErbB takiego, jak receptor ErbB2 (HER2). Podobnie, pacjenci z tak zakwalifikowanym nowotworem mogą zostać szybciej uznani za nadających się do leczenia za pomocą 2C4 lub funkcjonalnie równoważnego przeciwciała.
Próbki nowotworu mogą być analizowane na obecność heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2ErbB3 lub na fosforylację receptora ErbB albo przed albo po wszczepieniu. W jednym z wykonań, w przybliżeniu jeden gram nowotworu z pierwszego i/lub seryjnie pasażowanego heteroprzeszczepu jest następnie molekularnie oznaczany na obecność heterodimerów lub poddany szybkiemu mrożeniu w ciekłym azocie i przechowywany w-80°C do dalszych oznaczeń. Heteroprzeszczepy nowotworów mogą być dalej analizowane za pomocą dwuwarstwowego oznaczenia w miękkim agarze, zwanego także oznaczeniem klonogenicznym, jak opisano na przykład w Fiebig & Burger, powyżej. Heteroprzeszczepy ludzkich guzów nowotworowych są mechanicznie i proteolitycznie rozdzielane do zawiesiny pojedynczych komórek, która jest nakładana na wielodołkową płytkę pokrytą warstwą miękkiego agaru, jak to opisano. Wzrost komórek nowotworu in vitro prowadzi do tworzenia kolonii, które mogą być dalej analizowane pod względem molekularnych właściwości takich, jak heterodimery lub na fosforylację receptora ErbB lub pod względem innych histochemicznych lub morfologicznych właściwości.
B. Wykrywanie Heterodimerów EGFR-ErbB2 i ErbB2-ErbB3
Do wykrywania heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2- ErbB3 w nowotworach można zastosować każdy sposób znany w dziedzinie. Kilka preferowanych sposobów jest opisanych poniżej. Sposoby te wykrywają niekowalencyjne oddziaływania białko-białko lub w inny sposób wskazują bliskość pomiędzy badanymi białkami. Sposoby te opisane poniżej są dostarczone jako przykłady i nie powinny być interpretowane, jako ograniczające wynalazek.
Ko-immunoprecypitacja oraz immunobloting
Sposoby oparte na immuno-powinowactwie takie, jak immunoprecypitacja lub ELISA mogą być zastosowane do wykrywania heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3. W jednym z wykonań, przeciwciała anty-ErbB2 zastosowane są do immunoprecypitacji kompleksów zawierających ErbB2 z komórek nowotworu, a powstały immunoprecypitat jest następnie sondowany na obecność EGFR lub ErbB3 metodą immunoblotingu. W innym wykonaniu, przeciwciała przeciw EGFR lub ErbB3 mogą być zastosowane na etapie immunoprecypitacji, po czym immunoprecypitat jest sondowany z przeciwciałami ErbB2. W dalszym wykonaniu, ligandy ErbB specyficzne względem kompleksów HER1, HER3, HER2/HER1 lub kompleksów HER2/HER3 mogą być zastosowane do precypitacji kompleksów, sondowane następnie na obecność HER2. Na przykład, ligandy mogą być sprzężone z awidyną i kompleksy oczyszczone na kolumnie biotynowej.
W innych wykonaniach, oznaczeniach takich jak ELISA lub typu „kanapkowego, przeciwciała przeciw ErbB2 są unieruchomione na podstawie stałej, kontaktującej się z komórkami nowotworu lub z lizatem komórek nowotworu, płukane, a następnie wystawione na działanie przeciwciała przeciw
PL 214 010 Β1
EGFR lub ErbB3. Związanie drugiego przeciwciała, które może zostać wykryte bezpośrednio lub za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z wykrywalnym znacznikiem, wskazuje na obecność heterodimerów. W pewnych wykonaniach, przeciwciało EGFR lub ErbB3 jest unieruchomione, a przeciwciało ErbB2 zastosowane jest na etapie detekcji. W innych wykonaniach, ligandy receptora ErbB mogą być zastosowane zamiast lub w kombinacji z przeciwciałami przeciwko receptorowi ErbB.
Po immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciwko EGFR, ErbB2 lub ErbB3 może nastąpić funkcjonalne oznaczenie na obecność heterodimerów, jako rozwiązanie alternatywne lub dodatkowe względem immunoblotingu. W jednym z wykonań po immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciw ErbB3 następuje oznaczenie na aktywność kinazy tyrozynowej receptora w immunoprecypitacie. Ponieważ ErbB3 nie ma własnej aktywności tyrozynowej, aktywność kinazy tyrozynowej w immunoprecypitacie wskazuje, że ErbB3 jest najprawdopodobniej związany z ErbB2. Graus-Porta i wsp., EMBO J„ 16: 1647-55 (1997); Klapper i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 4995-5000 (1999). Wynik ten można potwierdzić przez immunoblotting z przeciwciałami przeciw ErbB2. W innym wykonaniu, po immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciw ErbB2 następuje oznaczenie aktywności kinazy tyrozynowej receptora EGFR. W oznaczeniu tym immunoprecypitat kontaktuje się z radioaktywnym ATP I substratem peptydowym naśladującym działanie miejsca transfosforylacji ErbB2 przez EGFR in vivo. Fosforylacja peptydu wskazuje ko-immunoprecypitację, a zatem heterodimeryzację EGFR z ErbB2. Oznaczenia aktywności kinazy tyrozynowej receptora są dobrze znane w dziedzinie i obejmują oznaczenia umożliwiające wykrywanie fosforylacji substratów docelowych, na przykład za pomocą przeciwciała przeciw fosfotyrozynie, oraz aktywacji pokrewnych ścieżek transdukcji sygnału takiej, jak ścieżka MAPK.
Zmiany powyższych sposobów i oznaczeń będą z łatwością widoczne i rutynowe dla specjalistów.
Chemiczne lub pod wpływem UV tworzenie wiązań poprzecznych także może być stosowane do kowalencyjnego wiązania heterodimerów na powierzchni żyjących komórek. Hunter i wsp., Blochem. J., 320: 847-53. Przykłady związków chemicznych tworzących wiązania poprzeczne obejmują propionian ditiobis(sukcynoimidylowy) (DSP) oraz propionian 3,3'ditiobis(sulfosukcynoimidylowy) (DTSSP). W jednym z wykonań, komórkowe ekstrakty pochodzące z komórek nowotworowych poddanych chemicznemu tworzeniu wiązań poprzecznych są analizowane za pomocą SDS-PAGE i poddane immunoblotingowi z przeciwciałami przeciw EGFR i/lub ErbB3. Przesunięty w górę prążek o odpowiedniej masie cząsteczkowej najprawdopodobniej odpowiada heterodimerom EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3, jako że ErbB2 jest cząsteczką uprzywilejowaną w heterodimeryzacji dla EGFR i ErbB3. Wynik ten można potwierdzić przez późniejszy immunoblotting z przeciwciałami przeciw ErbB2. FRET i Sposoby Oparte na Fluorescencji.
Transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) może także być zastosowany do wykrywania heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3. FRET wykrywa zmiany w konformacji białek oraz oddziaływania białko-białko in vivo i in vitro na podstawie przenoszenia energii z fluoroforu donora na fluorofor akceptora. Selvin, Nat. Struct. Boi., 7: 730-34 (2000). Transfer energii ma miejsce jedynie, jeśli fluorofor donora znajduje się w wystarczającej bliskości względem fluoroforu akceptora. W przypadku typowego doświadczenia FRET, dwa białka lub dwa miejsca na pojedynczym białku wyznakowane są różnymi sondami fluorescencyjnymi. Jedna z sond, sonda donora, wzbudzana jest do wyższego stanu energetycznego przez padające światło o określonej długości fali. Sonda donora przenosi następnie jego energię na drugą sondę, sondę akceptora, w wyniku czego intensywność fluorescencji donora ulega obniżeniu, zaś emisja fluorescencji akceptora wzrasta. Celem pomiaru rozpiętości transferu energii, intensywność świecenia donora w próbce wyznakowanej sondami donora i akceptora porównywana jest z jego intensywnością w próbce wyznakowanej jedynie sondą donora. Opcjonalnie, intensywność akceptora porównywana jest z próbkami donor/akceptor oraz tylko akceptor. Dogodne sondy są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, na przykład, barwniki przechodzące przez błonę takie, jak fluoresceina i rodamina, barwniki organiczne takie, jak barwniki cyjaninowe i atomy lantanowców. Selvin, powyżej. Sposoby oraz oprzyrządowanie do wykrywania i pomiaru energii transferu są także znane w dziedzinie. Selvin, powyżej.
Oparte na FRET techniki dogodne do wykrywania i pomiaru oddziaływań białko-białko w poszczególnych komórkach są także znane w tej dziedzinie. Na przykład, mikroskopia transferu energii rezonansu fluorescencyjnego odbielającego donora (pbFRET) oraz fluorescencyjna mikroskopia odwzorowowania długości życia (FLIM) mogą być stosowane do wykrywania dimeryzacji receptorów powierzchni komórkowej. Selvin, powyżej; Gadella and Jovin, J. Celi. Biol., 129: 154358 (1995). W jednym z wykonań, pbFRET stosuje się do komórek zarówno „w zawiesinie jak
PL 214 010 Β1 i „in situ w celu wykrycia i pomiaru tworzenia heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3, jak to opisano w Nagy i wsp., Cytometry, 32: 120-131 (1998). Techniki te mierzą redukcję długości życia fluorescencji donorowej spowodowanej transferem energii. W szczególnym wykonaniu można stosować technikę przepływu cytometrycznego FRET typu Foerster, w celu sprawdzenia heterodimeryzacji EGFR-ErbB2 i ERB2-ErbB3, jak to opisano w Nagy i wsp., powyżej oraz Brockhoff i wsp., Cytometry, 44: 338-48 (2001).
Korzystnie FRET stosuje się w połączeniu ze standardowymi technikami barwienia immunohistochemicznego. Kenworthy, Methods, 24: 289-96 (2001). Na przykład przeciwciała połączone z odpowiednimi barwnikami fluoroscencyjnymi można stosować jako sondy w barwieniu dwóch różnych białek. Jeżeli białka znajdują się blisko siebie, barwniki fluororescencyjne działają jako donory i akceptory dla FRET. Transfer energii wykrywa się za pomocą standardowych metod. Transfer energii można wykrywać za pomocą sposobów przepływu cytometrycznego lub za pomocą systemów mikroskopii cyfrowej, takich jak mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego-pola sprzężonej z detektorem CCD (and. Ćharge-coupled devide (CCD) camera).
W jednym z wykonań niniejszego wynalazku, przeciwciała przeciw ErbB2 oraz przeciwciała przeciw EGFR i ErbB3 są bezpośrednio wyznakowane dwoma odmiennymi fluoroforami, na przykład jak opisano w Nagy i wsp., powyżej. Komórki nowotworowe lub lizaty komórek nowotworowych poddane są kontaktowi z odmiennie wyznakowanymi przeciwciałami, które pełnią funkcję donorów i akceptorów dla FRET w obecności heterodimerów EGFR-ErbB2 lub ErbB2-ErbB3. Alternatywnie, niewyznakowane przeciwciała przeciw ErbB2 i albo EGFR albo ErbB3 stosowane są razem z odmiennie wyznakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi służącymi jako donory i akceptory. Patrz, na przykład Brockhoff i wsp., powyżej. Wykrywany jest transfer energii i określana jest obecność heterodimerów, o ile znaczniki znajdują się w dużej bliskości.
W innych wykonaniach, ligandy dla receptora ErbB, które są specyficzne względem HER2 i albo HER1 albo HER3, są wyznakowane fluorescencyjnie i stosowane do badań FRET.
W jeszcze innych wykonaniach niniejszego wynalazku, obecność heterodimerów na powierzchni komórek nowotworowych wykazywana jest przez ko-lokalizację ErbB2 z EGFR lub ErbB3 przy zastosowaniu standardowych bezpośrednich lub pośrednich technik fluorescencyjnych oraz mikroskopii skaningowej wykorzystującej laser konfokalny. Alternatywnie, obrazowanie laserem skaningowym (LSI) stosowane jest do wykrywania wiązania przeciwciał i ko-lokalizacji ErbB2 z EGFR lub ErbB3 w formacie wysokoprzepustowym takim, jak płytki mikrodołkowe, jak opisano wZuck i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11122-27 (1999).
W dalszych wykonaniach, obecność EGFR-ErbB2 i/lub heterodimerów ErbB2-ErbB3 określana jest przez ustalenie enzymatycznej aktywności zależnej od bliskości komponentów heterodimera. Przeciwciało przeciw ErbB2 jest sprzężone z jednym enzymem, zaś przeciwciało EGFR lub ErbB3 jest sprzężone z drugim enzymem. Dodawany jest pierwszy substrat dla pierwszego enzymu i w wyniku reakcji produkowany jest drugi substrat dla drugiego enzymu. Prowadzi to do reakcji z jeszcze inną cząsteczką, co generuje związek wykrywalny taki, jak barwnik. Obecność innego związku powoduje rozpad drugiego substratu, co zapobiega zachodzeniu reakcji z drugim enzymem, o ile pierwszy i drugi enzym, a zatem dwa przeciwciała, nie znajdują się w dużej bliskości. W szczególnym wykonaniu, komórki nowotworowe lub lizaty komórkowe poddawane są kontaktowi z przeciwciałem przeciw ErbB2 sprzężonym z oksydazą glukozy i przeciwciałami przeciw ErbB3 lub ErbB1 sprzężonymi z peroksydazą chrzanową. Dodawana jest glukoza wraz z prekursorem barwnika takim, jak DAB lub katalaza. Obecność heterodimerów określana jest dzięki wystąpieniu koloru pod wpływem znakowania na DAB.
Układ oznaczania eTag™
Heterodimery mogą zostać wykryte przy zastosowaniu sposobów opartych na układzie oznaczania eTag™ (Aciara Bio Sciences, Mountain View, CA), jak opisano, na przykład wWO 83502 i w Aplikacji Patentowej U.S. 2001/0049105, opublikowanej 6 grudnia 2001, obu załączonych w całości formie odnośników. eTag™ lub „elektroforetyczny tag zawiera wykrywalną część reporterowątaką, jak grupa fluorescencyjna. Może także zawierać „modyfikator ruchliwości, który składa się głównie z części mającej charakterystyczną ruchliwość elektroforetyczną. Części te pozwalają na oddzielenie i wykrywanie eTag™ ze złożonej mieszaniny w określonych warunkach elektroforetycznych takich, jak elektroforeza kapilarna (CE). Cząsteczka eTag™ zawierająca część reporterową i, opcjonalnie, modyfikator ruchliwości, połączona jest z częścią wiążącą pierwszą cząsteczkę docelową możliwą do przecięcia grupą łączącą, co razem tworzy pierwszy związek wiążący. Część wiążąca
PL 214 010 Β1 pierwszą cząsteczkę docelową specyficznie rozpoznaje swoistą pierwszą cząsteczkę docelową taką jak kwas nukleinowy lub białko. Część wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową nie jest w żaden sposób ograniczona i może być na przykład polinukleotydem lub polipeptydem. Korzystnie, część wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Alternatywnie, część wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową może być ligandem dla receptora ErbB lub jego fragmentem wiążącym.
Grupa łącząca korzystnie zawiera możliwą do przecięcia część taką, jak substrat enzymatyczny lub jakiekolwiek wiązanie chemiczne, które można przeciąć w określonych warunkach. Gdy część wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową wiąże się do swojej cząsteczki docelowej, wprowadzany i/lub aktywowany jest czynnik przecinający i grupa łącząca ulega przecięciu uwalniając tym samym część eTag™ zawierającą część reporterową i modyfikator mobilności. W ten sposób, obecność „wolnego eTag™ wskazuje na związanie części wiążącej cząsteczkę docelowąz jej cząsteczką docelową.
Korzystnie, drugi związek wiążący zawiera czynnik przecinający i część wiążącą drugą cząsteczkę docelową specyficznie rozpoznającą drugą cząsteczkę docelową. Część wiążąca drugą cząsteczkę docelową także nie jest w żaden sposób ograniczona i może być na przykład, przeciwciałem, fragmentem przeciwciała lub ligandem dla receptora ErbB lub wiążącym fragmentem ligandu. Czynnik przecinający to taki, który będzie przecinał jedynie grupę łączącą w pierwszym związku wiążącym, o ile pierwszy związek wiążący i drugi związek wiążący znajdują się w dużej bliskości.
W wykonaniu według niniejszego wynalazku, pierwszy związek wiążący zawiera eTag™, w którym przeciwciało przeciw ErbB2 służy jako domena wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową. Drugi związek wiążący obejmuje przeciwciało przeciw EGFR lub ErbB3 połączone z czynnikiem przecinającym zdolnym do przecięcia grupy łączącej eTag™. Korzystnie, czynnik przecinający musi zostać zaktywowany w celu uzyskania zdolności do cięcia grupy łączącej. Komórki nowotworowe lub lizaty komórek nowotworowych poddane są kontaktowi z eTag™, które wiąże się z ErbB2 oraz ze zmodyfikowanym przeciwciałem przeciw EGFR lub ErbB3, które wiąże się z EGFR lub ErbB3 na powierzchni komórkowej. Niezwiązany związek wiążący, korzystnie, jest usuwany, a czynnik przecinający ulega aktywacji, o ile jest to konieczne. Jeśli obecne są heterodimery EGFR-ErbB2 i ErbB2-ErbB3, czynnik przecinający będzie przecinał grupę łączącą i uwalniał eTag™, co spowodowane jest bliskim położeniem czynnika przecinającego względem grupy łączącej. Wolny eTag może zostać wówczas wykryty za pomocą jakiegokolwiek sposobu znanego w dziedzinie takiego, jak elektroforeza kapilarna.
W jednym z wykonań, czynnik przecinający jest ulegającym aktywacji związkiem chemicznym oddziaływującym na grupę łączącą. Na przykład, czynnik przecinający może być aktywowany przez wystawienie próbki na działanie światła.
W innym wykonaniu, eTag™ zbudowany jest przy zastosowaniu przeciwciała przeciw EGFR lub ErbB3 jako części wiążącej pierwszą cząsteczkę docelową, zaś drugi związek wiążący zbudowany jest z przeciwciała przeciw ErbB2.
Wykrywanie fosforylacji receptora ErbB
Fosforylacja receptora ErbB może być zastosowana w celu wykazania aktywacji HER2.
W jednym z wykonań, fosforylację receptora ErbB oznacza się za pomocą immunoprecypitacji jednego lub więcej receptorów ErbB takich, jak receptor ErbB2 (HER2) oraz analizy Western biot. Na przykład, wynik pozytywny określany jest poprzez obecność prążka fosfo-HER2 na żelu, przy zastosowaniu przeciwciała anty-fosfotyrozynowego w celu wykrycia ufosforylowanych reszt tyrozynowych w immunoprecypitowanym receptorze (-ach) ErbB. Przeciwciała anty-fosfotyrozynowe są handlowo dostępne z PanVera (Madison, Wl), przedsiębiorstwa kontrolowanego przez lnvitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA) lub Upstate Biotechnology (Lakę Placid, NY). Wynik negatywny określany jest poprzez nieobecność prążka.
W innym wykonaniu, fosforylację receptora ErbB2 (HER2) oznacza się immunohistochemicznie przy zastosowaniu fosfo-specyficznego przeciwciała anty-HER2 (klon PN2A; Thor i wsp., J. Clin. OnCOl., 18(18):3230-3239 (2000)).
Inne sposoby wykrywania fosforylacji receptora(ów) ErbB obejmują, ale nie ograniczają się do, KIRA ELISA (Patentów USA Nr 5766863; 5891650; 5914237; 6025145; i 6287784), spektroskopii masowej (porównywanie wielkości ufosforylowanego i nieufosforylowanego HER2) i oznaczenia bliskości e-tag z zastosowaniem przeciwciała anty-HER2: (np. przy zastosowaniu zestawu do oznaczenia eTag™ dostępnego z Aclara BioSciences (Mountain View, CA). Szczegóły oznaczenia eTag™ opisane są powyżej.
PL 214 010 Β1
Wytwarzanie przeciwciał
Następujący opis stanowi przykład technik stosowanych do wytwarzania leczniczych i diagnostycznych przeciwciał stosowanych według niniejszego wynalazku. Jako że opis odnosi się ogólnie do wytwarzania przeciwciał anty-ErbB2, specjalista w tej dziedzinie może z łatwością przystosować ujawnioną procedurę do wytwarzania przeciwciał przeciwko każdemu spośród receptorów ErbB.
Antygen ErbB2 stosowany do wytwarzania przeciwciał może być, np. rozpuszczalną formą zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2 lub jego częścią zawierającą pożądany epitop. Alternatywnie, do wytwarzania przeciwciał mogą być zastosowane komórki wykazujące na swojej powierzchni ekspresję ErbB2 (np., komórki NIH-3T3 transformowane w celu nadekspresji ErbB2; lub rakowa linia komórkowa taka, jak komórki SK-BR-3, patrz Stancovski i wsp., PNAS (USA), 88: 8691-8695 (1991)). Inne formy ErbB2 przydatne do wytwarzania przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.
Przeciwciała poliklonalne
Przeciwciała poliklonalne są korzystnie wytwarzane w zwierzętach poprzez wielokrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie stosownego antygenu i adjuwanta. Przydatnym może być sprzężenie stosownego antygenu z białkiem, które jest immunogenne dla gatunku immunizowanego, np. hemocyjaniną skałoczepu Megathura crenulata, albuminą surowicy, tyreoglobuliną bydlęcą lub inhibitorem trypsyny sojowej przy zastosowaniu czynnika dwufunkcyjnego lub derywatyzującego, na przykład estru maleimidobenzoylosulfosukcynimidu (sprzężenie poprzez reszty cysteinowe), N-hydroksysukcynimidu (poprzez reszty lizynowe), aldehydu glutarowego, bezwodnika kwasu bursztynowego, SOCI2 lub RIN=C=NR, gdzie R oraz R1 są różnymi grupami alkilowymi.
Zwierzęta immunizowane są antygenem, koniugatem immunogennym lub związkami pochodnymi poprzez połączenie, np. 100 pg lub 5 pg białka lub koniugatu (odpowiednio, dla królika i myszy) z 3 objętościami kompletnego adjuwantu Freunda i śródskórne wielomiejscowe wstrzyknięcie roztworu. Miesiąc później zwierzęta są eksponowane na dawkę będącą 1/5 do 1/10 uprzedniej ilości peptydu lub koniugatu w kompletnym adjuwancie Freunda poprzez podskórny zastrzyk wielomiejscowy. Siedem do 14 dni później zwierzętom pobiera się krew, a miano przeciwciał oznaczane w surowicy. Zwierzęta są eksponowane do czasu, gdy miano osiągnie plateau.
Korzystnie, jeżeli zwierzę eksponowane jest na koniugat tego samego antygenu, lecz sprzężonego z innym białkiem i/lub poprzez inny związek tworzący wiązania krzyżowe. Koniugaty mogą być także wykonane w hodowli komórek rekombinowanych jako fuzje białek. Czynniki agregujące takie, jak ałun są także dogodne do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej.
Przeciwciała monoklonalne
Przeciwciała monoklonalne uzyskiwane są z populacji przeciwciał o znacznej homologii tj. pojedyncze przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne z wyjątkiem możliwych mutacji pojawiających się w sposób naturalny, które mogą występować w mniejszych ilościach. Zatem modyfikator „monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała jako nie współtworzącego mieszaniny odrębnych przeciwciał.
Na przykład, przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane przy zastosowaniu metody hybrydomowej opisanej po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Naturę, 256: 495 (1975) lub mogą być wytwarzane za pomocą sposobów rekombinacji DNA (Patent USA Nr 4816567).
W metodzie hybrydomowej, mysz lub inne odpowiednie zwierzę będące gospodarzem, takie jak chomik, immunizowane jest w sposób opisany powyżej w celu pobudzenia limfocytów wytwarzających przeciwciała lub zdolnych do wytwarzania przeciwciał, które będą się specyficznie wiązać z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Następnie, limfocyty są łączone w postaci fuzji z komórkami szpiczaka przy zastosowaniu odpowiedniego czynnika fuzyjnego takiego, jak glikol polietylenowy, do wytworzenia komórki hybrydomowej (Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Komórki hybrydomowe sporządzone w ten sposób są posiewane i hodowane w odpowiedniej pożywce hodowlanej, która korzystnie zawiera jedną lub więcej substancji hamujących wzrost lub przeżycie niepołączonych jako fuzja rodzicielskich komórek szpiczaka. Na przykład, jeśli rodzicielskie komórki szpiczaka nie posiadają enzymu transferazy hipoksantynoguanino-fosforybozylowej (HGPRT lub HPRT), pożywka hodowlana dla hybrydom będzie typowo zawierać hipoksantynę, aminopterynę lub tymidynę (pożywka HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek nie posiadających HGPRT.
Preferowane komórki szpiczaka to takie, które skutecznie ulegają fuzji, wspomagają stabilną wysoką produkcję przeciwciała przez wyselekcjonowane komórki produkujące przeciwciało oraz są wrażliwe na pożywkę taką, jak pożywka HAT. Spośród powyższych preferowanymi liniami komórek
PL 214 010 Β1 szpiczaka są mysie linie szpiczaka takie, jak uzyskane z nowotworów mysich MOPC-21 i MPC-11 dostępne w Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, California USA i komórki SP-2 lub Χ63Ag8-653 dostępne wAmerican Type Culture Colection, Rockville, Maryland USA. Ludzkie i mysioludzkie linie komórek heteroszpiczaka także zostały opisane w celu wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); i Brodeur iwsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Pożywka hodowlana, w której wzrastają komórki hybrydomy oznaczane jest pod względem wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenowi. Korzystnie, specyficzność wiązania monoklonalnych przeciwciał wytwarzanych przez komórki hybrydomy ustala się za pomocą immunoprecypitacji lub za pomocą testu wiązania in vitro takiego, jak test radioimmunologiczy (RIA) lub test immunoabsorpcji enzymozależnej (ELISA).
Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego można na przykład ustalić za pomocą analizy Scatchard'a Munson i wsp., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Po zidentyfikowaniu komórek hybrydomowych wytwarzających przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony mogą być subklonowane za pomocą procedur rozcieńczeń granicznych i hodowane za pomocą sposobów standardowych (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986)). Dogodne do tego celu pożywki hodowlane obejmują na przykład pożywki MEM lub RPMI-1640. Dodatkowo, komórki hybrydomy mogą być hodowane in wYojako nowotwory puchliny brzusznej w zwierzęciu.
Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony są w sposób odpowiedni oddzielane od pożywki hodowlanej, płynu puchlinowego lub surowicy za pomocą konwencjonalnych procedur oczyszczania przeciwciał takich, jak na przykład Sepharose-białko A, chromatografia na hydroksyapatycie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa.
DNA kodujący przeciwciała monoklonalne jest w łatwy sposób izolowane i sekwencjomowane przy zastosowaniu procedur konwencjonalnych (np., przy zastosowaniu oligonukleotydowych sond zdolnych do specyficznego wiązania się z genami kodującymi łańcuchy ciężkie i lekkie łańcuchy mysich przeciwciał). Komórki hybrydomy służą jako preferowane źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu DNA można wstawić do wektorów ekspresyjnych, które następnie transfekowane są do komórek gospodarza takich, jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które nie wytwarzają żadnego białka przeciwciał, w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Przeglądowe artykuły dotyczące rekombinowanej ekspresji DNA kodującego przeciwciało w bakteriach obejmują Skerra iwsp., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) i Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151 -188 (1992).
W kolejnym wykonaniu, przeciwciała monoklonalne lub fragmenty przeciwciał mogą być wyizolowane z fagowych bibliotek przeciwciał wytworzonych przy zastosowaniu technik opisanych w McCafferty i wsp., Naturę, 348: 552-554 (1990). Clackson i wsp., Naturę, 352: 624-628 (1991) oraz Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) opisują izolację odpowiednio mysich i ludzkich przeciwciał stosując biblioteki fagowe. Dalsze publikacje opisują wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nM) przez tasowanie łańcuchowe (Marks iwsp., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), jak również kombinatoryczną infekcję oraz rekombinację in wYojako strategie dla konstrukcji bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse iwsp., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Zatem, techniki te są dobrymi alternatywami dla tradycyjnych technik hybrydomowych przeciwciał monoklonalnych do izolacji przeciwciał monoklonalnych.
DNA można także modyfikować, na przykład, przez podstawienie sekwencji kodującej dla domen stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (Patent USA Nr 4816567; oraz Morrison iwsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6851 (1984)) lub przez kowalencyjne wiązanie z sekwencjami kodującymi immunoglobuliny całości lub części sekwencji kodującej polipeptyd nie-immunoglobulinowy.
Zazwyczaj takie nie-immunoglobulinowe polipeptydy podstawiane są w miejsce domen stałych przeciwciał lub są podstawiane w miejsce domen zmiennych miejsca wiążącego antygen, celem wytworzenia chimerowego dwuwartościowego przeciwciała zawierającego jedno miejsce wiążące antygen specyficzne względem antygenu oraz inne miejsce wiążące antygen specyficzne względem innego antygenu.
Przeciwciała humanizowane
Sposoby humanizowania przeciwciał nie pochodzących od człowieka opisane są w tej dziedzinie.
Korzystnie, humanizowane przeciwciało ma jedno lub więcej wstawionych reszt aminokwasowych nie pochodzących od człowieka. Te nie pochodzące od człowieka reszty aminokwasowe, często
PL 214 010 Β1 zwane „zapożyczonymi, zazwyczaj pobierane są z „zapożyczonej domeny zmiennej. Zasadniczo, humanizacja może być przeprowadzona według sposobu Wintera i współpracowników (Jones i wsp., Naturę, 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp., Naturę, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i wsp., Science, 239: 1534-1536 (1988)) przez podstawienie sekwencji rejonu superzmiennego w miejsce odpowiadającej mu sekwencji ludzkiego przeciwciała. Odpowiednio, takie „humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (Patent USA Nr 4816567), w których zasadniczo mniej niż ludzka nietknięta domena zmienna zostało podstawionych przez odpowiednią sekwencję pochodzącą z gatunku innego niż ludzki. W praktyce, przeciwciała humanizowane zwykle są ludzkimi przeciwciałami, w których niektóre reszty rejonu superzmiennego oraz prawdopodobnie niektóre reszty FR zostały podstawione resztami pochodzącymi z analogicznych miejsc przeciwciał gryzoni.
Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno lekkich, jak i ciężkich, które mają być zastosowane do wykonania przeciwciał humanizowanych, jest bardzo ważny z uwagi na redukcję immunogenności. Zgodnie z tak zwanym sposobem „najlepszego dopasowania, sekwencja domeny zmiennej przeciwciała pochodzącego od gryzonia jest sprawdzana względem całkowitej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domen zmiennych. Ludzka sekwencja najbliższa sekwencji gryzonia jest następnie przyjmowana, jako ludzki rejon zrębowy (FR) dla przeciwciała humanizowanego (Sims i wsp., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia i wsp., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Inny sposób wykorzystuje zastosowanie szczególnego rejonu zrębowego pochodzącego ze wspólnej dla wszystkich ludzkich przeciwciał sekwencji pewnej podgrupy lekkich lub ciężkich łańcuchów. Ten sam rejon zrębowy może być zastosowany w kilku różnych przeciwciałach humanizowanych (Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta i wsp., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
Dalej, niezwykle istotne jest, by przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa względem antygenu oraz innych korzystnych właściwości biologicznych. Dla osiągnięcia tego celu, zgodnie z preferowanym sposobem, humanizowane przeciwciała przygotowywane są w procesie analizy sekwencji rodzicielskich oraz rozmaitych konceptualnych produktów humanizowanych przy zastosowaniu trójwymiarowych modeli sekwencji rodzicielskich i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe ilustrujące i pokazujące prawdopodobne trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych sekwencji immunoglobin kandydujących. Przegląd tych zobrazowań pozwala na analizę prawdopodobnej roli reszt w funkcjonowaniu sekwencji immunoglobulin kandydujących, tj. analizę reszt wpływających na zdolność immunoglobulin kandydujących do wiązania antygenu. W ten sposób, reszty FR mogą zostać wybrane i połączone z sekwencji biorcy i sekwencji zapożyczanych tak, by osiągnąć pożądaną cechę przeciwciała taką, jak zwiększone powinowactwo względem docelowego antygenu(ów). Na ogół, reszty rejonów superzmiennych są bezpośrednio i w największym stopniu zaangażowane w oddziaływanie na wiązanie antygenu.
Przykładowe humanizowane przeciwciała anty-ErbB2 wiążące ErbB2 i blokujące aktywację receptora ErbB przez ligand opisane sąw WO 01/0245, załączonym tutaj w formie odnośnika. Przeciwciała humanizowane, będące tutaj przedmiotem szczególnego zainteresowania, blokują aktywację MAPK z udziałem EGF, TGF-α i/lub HRG w zasadzie tak wydajnie, jak mysie przeciwciało monoklonalne 2C4 (lub jego fragment Fab). Humanizowane przeciwciała mogą tutaj, na przykład obejmować reszty rejonu superzmiennego pochodzące z gatunku innego niż ludzki włączone do ludzkiej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i dalej, mogą obejmować podstawnik rejonu zrębowego (FR) w pozycji wybranej z grupy składającej się z69H, 71H i 73H stosując system numerowania domen zmiennych określony w Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). W jednym z wykonań, humanizowane przeciwciało obejmuje podstawniki FR w dwóch lub wszystkich pozycjach 69H, 71H i 73H.
Przykładowe, badane tutaj humanizowane przeciwciało zawiera reszty decydujące o komplementarności domeny zmiennej łańcucha ciężkiego GFTFTDYTMX, gdzie X korzystnie jest D lub S (SEK. ID. NR: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEK. ID. NR: 8); i/lub NLGPSFYFDY (SEK. ID. NR: 9), opcjonalnie zawierające modyfikacje aminokwasowe tych reszt CDR, np. gdzie modyfikacje zasadniczo powodują utrzymanie lub zwiększenie powinowactwa przeciwciała. Na przykład, badany wariant przeciwciała może posiadać od około jednego do około siedmiu lub około pięciu podstawień aminokwasowych w powyższych sekwencjach CDR domen zmiennych łańcuchów ciężkich. Takie warianty przeciwciała można sporządzić metodą dojrzewania powinowactwa, np. jak to opisano poniżej. Najkorzystniejsze humanizowane przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego w SEK. ID. NR:4 (Rysunek 1B).
PL 214 010 Β1
Przeciwciało humanizowane może zawierać reszty decydujące o komplementarności domeny zmiennej łańcucha lekkiego KASQDVSIGVA (SEK. ID. NR:10); SASYX1X2X3, gdzie X1 to korzystnie R lub L, X2 to korzystnie Y lub E, aX3 to korzystnie T lub S (SEK. ID. NR:11); i/lub QQYYIYPYT (SEK. ID. NR:12), np. dodane do tych reszt CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego opisanych w uprzednim akapicie. Takie humanizowane przeciwciała opcjonalnie zawierają modyfikacje aminokwasowe powyższych reszt CDR np., gdzie modyfikacje zasadniczo powodują utrzymanie lub zwiększenie powinowactwa przeciwciała. Na przykład, badane warianty przeciwciała mogą zawierać od około jednego do około siedmiu lub do około pięciu aminokwasowych podstawień w powyższych sekwencjach CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego. Takie warianty przeciwciała można wytworzyć metodą dojrzewania powinowactwa np., w sposób opisany poniżej. Najkorzystniejsze humanizowane przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego w SEK. ID. NR:3 (Rysunek 1 A).
Niniejsze zgłoszenie dotyczy także przeciwciał dojrzałych pod względem powinowactwa, które wiążąERBB2 i blokują aktywację receptora ErbB ligandem. Przeciwciało rodzicielskie może być przeciwciałem ludzkim lub przeciwciałem humanizowanym np., przeciwciałem zawierającym sekwencje zmiennych domen łańcuchów lekkich i/lub ciężkich o odpowiednio SEK. ID. NR: 3 i 4 (tj. wariant 574; Rysunek 1A i B). Przeciwciało dojrzałe pod względem powinowactwa korzystnie wiąże się do receptora ErB2 z powinowactwem większym niż powinowactwo mysiego 2C4 lub wariantu 574 (np., od około dwóch lub około czterech razy do około 100 lub około 1000 razy większym powinowactwem, np., jak to jest określane przy zastosowaniu metody ELISA dla zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2 (ECD) ELISA). Przykładowe reszty CDR domen zmiennych łańcucha ciężkiego ulegające podstawieniu obejmują H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 lub kombinacje dwóch lub więcej (np. dwóch, trzech, czterech, pięciu, sześciu lub siedmiu takich reszt). Przykłady reszt CDR domen zmiennych łańcucha lekkiego ulegające zmianie obejmują L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 lub kombinacje dwóch lub więcej (np., od dwie do trzech, czterech, pięciu lub do około dziesięciu takich reszt).
Rozważane są różne odmiany humanizowanych przeciwciał lub przeciwciał dojrzałych pod względem powinowactwa. Na przykład, przeciwciało humanizowane lub przeciwciało dojrzałe pod względem powinowactwa może być fragmentem przeciwciała takim, jak Fab, który opcjonalnie sprzężony jest z jednym lub więcej czynnik(ów) cytotoksycznych w celu wytworzenia immunokoniugatu. Alternatywnie, przeciwciało humanizowane lub przeciwciało dojrzałe pod względem powinowactwa może być przeciwciało nienaruszone takie, jak nienaruszone przeciwciało IgGI.
Ludzkie przeciwciała
Jako alternatywa dla humanizacji wytwarzać można ludzkie przeciwciała. Na przykład, możliwe jest obecnie wytwarzanie zwierząt transgenicznych (np. myszy) zdolnych, pod wpływem immunizacji, do wytwarzania pełnego zakresu ludzkich przeciwciał przy braku wytwarzania immunoglobulin endogennych. Na przykład opisano, że homozygotyczna delecja genu rejonu łączącego w łańcuchu ciężkim (JH) przeciwciała w mutantach chimerycznych oraz mutantach linii zarodkowej myszy powoduje całkowite zahamowanie wytwarzania endogennych przeciwciał. Przeniesienie matrycy genów immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej do takich mysich mutantów linii zarodkowej spowoduje wytwarzanie ludzkich przeciwciał pod wpływem wystawienia na działanie antygenu. Patrz, np. Jakobovits i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 2551 (1993); Jakobits i wsp., Naturę, 362: 255-258 (1993); Bruggemann i wsp., Year in Immuno., 7:33 (1993); oraz Patenty USA Nr 5591669, 5589369 oraz 5545807.
Alternatywnie, fagowa technologia obrazowania (McCafferty i wsp., Naturę, 348: 552-553 (1990)) może zostać zastosowana do wytwarzania ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał in vitro z zestawów genów dla domen zmiennych (V) immunoglogulin pochodzących od nieimmunizowanych dawców. Zgodnie z tą techniką geny dla domen V przeciwciała klonowane są w ramce odczytu do głównego lub pomniejszego genu białka otoczki bakteriofaga włókienkowatego takiego, jak M13 lub fd i prezentowane są, jako funkcjonalne fragmenty przeciwciał na powierzchni cząsteczki faga. Ponieważ cząsteczka włókienkowata zawiera kopię jednoniciowego DNA genomu faga, selekcja oparta na funkcjonalnych właściwościach przeciwciała, powoduje także selekcję genu kodującego przeciwciało wykazujące takie właściwości. Zatem, fagi naśladują niektóre właściwości limfocytu B.
Przedstawianie fagów można przeprowadzić na różne sposoby; w celu przeglądu patrz np., Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology, 3: 564-571 (1993). Do przedstawienia faga zastosowanych może być kilka źródeł segmentów genów V. Clackson i wsp., Naturę, 352: 624-628 (1991) wyizolowali zróżnicowaną matrycę przeciwciał przeciw oksazolonowi z niewielkiej losowej kombinatorycznej biblioteki genów V uzyskanych ze śledzion immunizowanych
PL 214 010 Β1 myszy. Stworzyć można zestaw genów V od nieimmunizowanych ludzkich dawców i wyizolować przeciwciała skierowane przeciw zróżnicowanej matrycy antygenów (wliczając antygeny własne) postępując zasadniczo według technik opisanych przez Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) lub Griffith i wsp., EMBO J., 12: 725-734 (1993). Patrz także Patenty USA Nr 5565332 i 5573275).
Jak omówiono powyżej, ludzkie przeciwciała mogą być także wytwarzane przez aktywowane in vitro limfocyty B (patrz Patenty USA 5567610 i 5229275).
Ludzkie przeciwciała anty-ErbB2 opisane są w Patencie USA Nr 5772997 złożonym 30 czerwca, 1998 oraz WO 97/00271 opublikowanym 3 stycznia, 1997 r.
Fragmenty przeciwciał
Powstało wiele rozmaitych technik do wytwarzania fragmentów przeciwciał.
Tradycyjnie, fragmenty te otrzymywano drogą proteolitycznego trawienia przeciwciał nienaruszonych (patrz, np. Morimoto i wsp., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); oraz Brennan i wsp., Science, 229: 81 (1985)). Jednakże, fragmenty te mogą być obecnie wytwarzane bezpośrednio przez zrekombinowane komórki gospodarza. Na przykład, fragmenty przeciwciał mogą być wyizolowane z fagowych bibliotek przeciwciał omówionych powyżej. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH mogą być bezpośrednio odzyskane z E. coli i chemicznie sparowane w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2 (Carter i wsp., BioTechnology, 10: 163-167 (1992)). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab')2 mogą być wyizolowane bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek gospodarza. Pozostałe techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów. W innych wykonaniach, wybrane przeciwciało jest fragmentem Fv o pojedynczym łańcuchu (scFv). Patrz WO 93/16185; Patent USA Nr 5571894; oraz Patent USA Nr 5587458. Fragment przeciwciała może być także przeciwciałem liniowym, np. jak opisano w Patencie USA Nr 5641870. Takie fragmenty przeciwciała liniowego mogą być jendospecyficzne lub dwuspecyficzne.
Przeciwciała dwuspecyficzne
Przeciwciała dwuspecyficzne to przeciwciała mające specyficzność wiązania względem, co najmniej dwóch różnych epitopów. Przykładowe przeciwciała dwuspecyficzne mogą wiązać się do dwóch różnych epitopów białka Erb32. Inne takie przeciwciała mogą łączyć miejsce wiązania ErbB2 z miejscem wiązania (miejscami wiązania) dla białek EGFR, ErbB3 i/lub ErbB4. Alternatywnie, ramię anty-ErbB2 może być połączone z ramieniem wiążącym cząsteczkę wyzwalającą na leukocycie taką, jak cząsteczka receptora limfocytów T (np., CD2 lub CD3) lub receptory Fe dla IgG (FcyR) takie, jak FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) oraz FcyRIII (CD16) tak, by skierować mechanizmy obrony komórkowej na komórkę wykazującą ekspresję ErbB2. Przeciwciała dwuspecyficzne mogą także być zastosowane do nakierowania czynników cytotoksycznych na komórki wykazujące ekspresję ErbB2. Przeciwciała te posiadają ramię wiążące ErbB2 oraz ramię wiążące czynnik cytotoksyczny (np., saporynę, antyinterferon-α, alkaloid winka, łańcuch rycyny A, metotreksanian lub radioaktywny izotop haptenu). Przeciwciała dwuspecyficzne mogą być sporządzone, jako przeciwciała o pełnej długości lub fragmenty przeciwciał (np., dwuspecyficzne przeciwciała F(ab')2).
WO 96/16673 opisuje dwuspecyficzne przeciwciało anty-ErbB2/anty-FcyRIII a Patent USA Nr 5837234 ujawnia dwuspecyficzne przeciwciało anty-ErbB2/anty-FcyRI.
Dwuspecyficzne przeciwciało anty-ErbB2/Fca przedstawione jest w WO 98/02463. Patent USA Nr 5821337 przedstawia dwuspecyficzne przeciwciało anty-ErbB2/anty-CD3.
Sposoby wytwarzania przeciwciał dwuspecyficznych znane są w tej dziedzinie. Tradycyjne wytwarzanie pełnej długości przeciwciał dwuspecyficznych oparte jest na koekspresji dwóch par łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobulin, gdzie oba łańcuchy wykazują odmienną specyficzność (Millstein i wsp., Naturę, 305: 537-539 (1983)). Z powodu losowej segregacji łańcuchów lekkich i ciężkich immunoglobulin, hybrydomy te (kwadromy) wytwarzają potencjalną mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedno ma właściwą dwuspecyficzną strukturę. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, zwykle wykonywane w kolejnych etapach chromatografii powinowactwa, jest raczej niewygodne, a wydajność produktu niska.
Podobne procedury ujawnione są w WO 93/08829 oraz w Traunecker i wsp., EMBO J., 36553659 (1991).
Zgodnie z odmiennym podejściem, domeny zmienne przeciwciała o pożądanej specyficzności wiązania (miejsca wiązania przeciwciało-antygen) połączone są z sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Korzystnie, połączenie powstaje z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, obejmującej, co najmniej część zawiasu, rejonów CH2 i CH3. Korzystne jest by mieć pierwszy rejon stały łańcucha ciężkiego (CH1) zawierający miejsce niezbędne do wiązania łańcucha lekkiego,
PL 214 010 Β1 obecny co najmniej w jednej z fuzji. DNA kodujące połączenia łańcucha ciężkiego immunoglobulin oraz, jeśli potrzeba, łańcucha lekkiego immunoglobulin, wstawiane są do oddzielnych wektorów ekspresyjnych i kotransfekowane są do dogodnego organizmu gospodarza. Dostarcza to ogromnej styczności w dostosowywaniu wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydów w wykonaniach, w których nierówny stosunek ilościowy trzech łańcuchów polipeptydowych zastosowanych do budowy przeciwciała daje optymalną wydajność. Jest jednak możliwe, by wstawić sekwencje kodujące dla dwóch lub wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, gdy ekspresja, co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równym stosunku ilościowym daje w wyniku wysoką wydajność lub gdy stosunki ilościowe nie mają szczególnego znaczenia.
W preferowanym wykonaniu tego podejścia, dwu specyficzne przeciwciała złożone są z łańcucha ciężkiego immunoglobuliny hybrydowej z pierwszą specyficznością wiązania na jednym ramieniu i parą łańcuch ciężki - łańcuch lekki immunoglobuliny hybrydowej (dostarczającej drugiej specyficzności wiązania) na drugim ramieniu. Wykazano, że taka asymetryczna budowa ułatwia oddzielenie pożądanego dwuspecyficznego związku od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulin, jako że obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny tylko w jednej połowie cząsteczki dwuspecyficznej dostarcza dogodnej metody rozdzielania. Podejście to ujawnione jest w WO 94/04690. Dalsze szczegóły wytwarzania przeciwciał dwuspecyficznych patrz, na przykład Suresh i wsp., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Zgodnie z innym podejściem opisanym w Patencie USA Nr 5731168, połączenie pomiędzy parą cząsteczek przeciwciał może zostać wykonane w taki sposób, by maksymalnie zwiększyć procentowy udział heterodimerów, odzyskiwanych z hodowli zrekombinowanych komórek. Preferowane połączenie obejmuje, co najmniej część domeny CH3 domeny stałej przeciwciała. W ten sposób, jeden lub więcej małych łańcuchów bocznych aminokwasów części łączącej cząsteczki pierwszego przeciwciała zastąpionych jest większym łańcuchem bocznym (np., tyrozynowym lub tryptofanowym). Wyrównujące „zagłębienia o rozmiarze identycznym lub podobnym do dużego łańcucha(-ów) bocznego(-ych) tworzone są na części łączącej cząsteczki drugiego przeciwciała przez zastąpienie dużych łańcuchów bocznych aminokwasów mniejszymi (np., alaninowym lub treoninowym). Dostarcza to mechanizmu podwyższającego wydajność pozyskiwania heterodimeru w stosunku do innych niepożądanych produktów końcowych takich, jak homodimery.
Przeciwciała dwuspecyficzne obejmują przeciwciała połączone krzyżowo lub przeciwciała „heterosprzężone. Na przykład, jedno z przeciwciał w heterokoniugacie może zostać połączone z awidyną, inne z biotyną. Proponowaną funkcją takich przeciwciał jest, na przykład nakierowywanie komórek układu odpornościowego na niepożądane komórki (Patent USA Nr 4676980) i leczenie infekcji HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Przeciwciała heterosprzężone mogą być wytwarzane przy zastosowaniu jakiegokolwiek dogodnego sposobu wiązania krzyżowego. Dogodne czynniki biorące udział w tworzeniu wiązań krzyżowych są dobrze znane w dziedzinie i są ujawnione w Patencie USA Nr 4676980, wraz z dużą liczbą technik tworzenia wiązań krzyżowych.
Techniki wytwarzania przeciwciał dwuspecyficznych z fragmentów przeciwciał również zostały opisane w literaturze. Na przykład, przeciwciała dwuspecyficzne mogą być wytworzone przy zastosowaniu wiązania chemicznego. Brennan i wsp., Science, 229:81 (1985) opisuje procedurę, w której nienaruszone przeciwciała są proteolitycznie przecinane w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2. Fragmenty te redukowane są w obecności związku kompleksującego ditiole, arseninu sodu, w celu stabilizowania sąsiadujących ditioli i zapobiegania tworzenia międzycząsteczkowych dwusiarczków. Wytworzone fragmenty Fab' są następnie przekształcane do pochodnych tionitrobenzoesanu (TNB). Jedna z pochodnych Fab'-TNB jest następnie z powrotem przekształcana do Fab'-tiolu przez redukcję merkaptoetylaminą i mieszana z równomolarną ilością drugiej pochodnej Fab'-TNB celem wytworzenia przeciwciała dwuspecyficznego. Wytworzone przeciwciała dwuspecyficzne mogą być zastosowane jako związki do selektywnej immobilizacji enzymów.
Ostatnio osiągnięty postęp ułatwił bezpośrednie odzyskiwanie z E. coli fragmentów Fab'-SH, które mogą być chemicznie parowane w celu wytworzenia przeciwciał dwuspecyficznych. Shalaby i wsp., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisuje wytwarzanie całkowicie humanizowanej cząsteczki dwuspecyficznego przeciwciała F(ab')2. Każdy fragment Fab' był oddzielnie wydzielany przez E. coli i poddawany bezpośredniemu chemicznemu parowaniu in vitro w celu wytworzenia przeciwciała dwuspecyficznego. Dwuspecyficzne przeciwciało w ten sposób wytworzone miało zdolność wiązania się do komórek wykazujących nadekspresję receptora ErbB2 oraz normalnych ludzkich limfocytów T, jak
PL 214 010 Β1 również wyzwalania litycznej aktywności ludzkich limfocytów cytotoksycznych skierowanej przeciw ludzkim nowotworom piersi.
Opisano także wiele rozmaitych technik wytwarzania i izolacji fragmentów dwuspecyficznych przeciwciał bezpośrednio z hodowli komórek zrekombinowanych. Na przykład, przeciwciała dwuspecyficzne były wytwarzane przy zastosowaniu łączników leucynowych. Kostelny i wsp., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Peptydy łącznika leucynowego pochodzące z białek Fos i Jun zostały połączone z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzję genową. Homodimery przeciwciał były redukowane w rejonie zawiasowym w celu wytworzenia monomerów i następnie ponownie utleniane w celu wytworzenia heterodimerów przeciwciał. Sposób ten może być wykorzystywany także do wytwarzania homodimerów przeciwciał. Technologia „dwuciał opisana przez Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) dostarczyła alternatywnego mechanizmu do wytwarzania fragmentów przeciwciał dwuspecyficznych. Fragmenty obejmują domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną ze zmienną domeną łańcucha lekkiego (VL) łącznikiem zbyt krótkim by umożliwiał parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha. Odpowiednio, domeny VH i VL jednego fragmentu zmuszone są parować z komplementarnymi domenami VL i VH innego fragmentu, tworząc w ten sposób dwa miejsca wiązania antygenu.
Istnieją także doniesienia o innej strategii wytwarzania fragmentów przeciwciał dwuspecyficznych przez zastosowanie jednołańcuchowych dimerów Fv (sFv). Patrz Gruber i wsp., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Przewidziane są przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach. Na przykład, wytworzyć można przeciwciała trójspecyficzne. Tutt i wsp., J. Immunol., 147:60 (1991).
Inne modyfikacje sekwencji aminokwasowej
Przewidziana jest modyfikacja(e) sekwencji aminokwasowej przeciwciał anty-ErbB2. Na przykład, pożądane może być zwiększenie powinowactwa wiązania i/lub innych biologicznych właściwości przeciwciał. Warianty aminokwasowej sekwencji przeciwciał anty-ErbB2 sporządzane są przez wprowadzenie odpowiednich zmian nukleotydowych do kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-ErbB2 lub przez syntezę białkową. Modyfikacje takie obejmują, na przykład delecje z i/iub wstawienia do i/lub podstawienia reszt w aminokwasowych sekwencjach przeciwciała anty-ErbB2. Jakakolwiek kombinacja delecji, wstawienia i podstawienia może być wykonana w celu uzyskania końcowego konstruktu pod warunkiem, że konstrukt końcowy posiada pożądane właściwości. Zmiany aminokwasowe mogą również dotyczyć post-translacyjnych zmian procesu syntezy przeciwciał antyErbB2 takich, jak zmiana liczby lub położenia miejsc glikozylacji.
Przydatny sposób do identyfikacji niektórych reszt lub rejonów przeciwciał anty-ErbB2, będących preferowanymi miejscami do mutagenezy zwany jest „mutagenezą skanowania alaninowego, jak opisano przez Cunningham i Wells, Science, 244:1081 -1085 (1989).
Tutaj, reszta lub grupa reszt docelowych jest identyfikowana (np., reszty niosące ładunek takie, jak arg, asp, his, lys i glu) i zastępowana przez aminokwasy obojętne lub naładowane ujemnie (najbardziej korzystnie alaninę lub polialaninę) w celu wywarcia wpływu na oddziaływanie aminokwasów z antygenem ErbB2. Te miejsca aminokwasowe, które wykazują funkcjonalną wrażliwość na podstawienia są następnie udoskonalane przez wprowadzanie dalszych lub innych wariantów w lub względem miejsc podstawienia. Zatem, podczas gdy miejsce wprowadzenia zmiany w sekwencji aminokwasowej jest z góry określone, natura samej mutacji nie musi być wcześniej określona. Na przykład, w celu przeanalizowania wpływu mutacji wdanym miejscu, przeprowadzane jest skanowanie lub mutageneza losowa w docelowym kodonie lub rejonie, a ulegające ekspresji warianty przeciwciała antyErbB2 są przeszukiwane pod względem pożądanej aktywności.
Wstawki do sekwencji aminokwasowej obejmują połączenia na amino- i/lub końcu karboksylowym o długości od jednej reszty do polipeptydów zawierających sto lub więcej reszt, jak również wstawki międzysekwencyjne pojedynczych lub wielu reszt aminokwasowych. Przykłady wstawek na końcach sekwencji obejmują przeciwciało anty-ErbB2 z N-końcową resztą metionylową lub przeciwciało połączone z polipeptydem cytotoksycznym. Pozostałe warianty wstawek w cząsteczkach przeciwciała anty-ErbB2 obejmują połączenie z N- lub C-końcem przeciwciał anty-ErbB2 cząsteczki reporterowej, enzymu (np. ADEPT) lub polipeptydu przedłużającego okres półtrwania przeciwciała w surowicy.
Innym typem wariantu jest wariant podstawienia aminokwasowego. Warianty te mają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce przeciwciała anty-ErbB2 zastąpioną przez inną resztę. Najbardziej korzystne miejsca do mutagenezy podstawienia obejmują rejony superzmienne, choć
PL 214 010 Β1 przewidziane są również zmiany FR. Podstawienia konserwowane przedstawione są w Tabeli 1 pod nagłówkiem „podstawienia preferowane. Jeśli podstawienia takie powodują zmianę w biologicznej aktywności, wówczas bardziej istotne zmiany, nazwane „podstawieniami przykładowymi w Tabeli 1 lub jak poniżej opisano w odniesieniu do klas aminokwasów, mogą zostać wprowadzone, a produkty przeszukiwane.
Tabela 1
Pierwotna reszta aminokwasowa Przykładowe podstawienia Podstawienia preferowane
Ala (A) val; leu ;ile Val
Arg (R) lys; gin; asn Lys
Asn (N) gin; his;asp,lys;arg Gin
Asp (D) glu;asn Glu
Cys (C) ser; ala Ser
Gin (Q) asn;glu Asn
Glu (E) asp; gin Asp
ciy (G) Ala Ala
His (H) asn; gin; lys; arg Arg
He O) leu; val; met; ala; phe; norleucyna Leu
Leu (L) norleucyna; ile; val; met; ala; phe Ile
Lys (K) arg; gin; asn Arg
Met (M) leu; phe; ile Leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) tyr; phe Tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser Phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucyna Leu
Istotne modyfikacje właściwości biologicznych przeciwciała uzyskuje się przez wybieranie podstawień, które różnią się znacząco w swoim wpływie na utrzymywanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w obszarze podstawienia, na przykład jako konformacji kartki lub helisy (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Naturalnie występujące reszty aminokwasowe podzielone są na grupy oparte na wspólnych właściwościach łańcucha bocznego:
(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile;
(2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr;
(3) kwasowe: asp, glu;
(4) zasadowe: asn, gin, his, lys, arg;
(5) reszty aminokwasowe wpływające na ułożenie łańcucha: gly, pro; oraz (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.
Podstawienia niekonserwowane będą pociągać za sobą zmianę przynależności z jednej klasy do innej klasy.
Każda reszta cysteinowa nie zaangażowana w utrzymywanie odpowiedniej konformacji przeciwciała anty-ErbB2 także może zostać podstawiona, na ogół przez serynę, w celu poprawienia oksydacyjnej stabilności cząsteczki i zapobieżenia nieprawidłowym wiązaniom krzyżowym. Odwrotnie, wiązanie(a) cysteinowe mogą być dodawane do przeciwciała w celu poprawienia jego stabilności (szczególnie, gdy przeciwciało jest fragmentem przeciwciała takim, jak fragment Fv).
PL 214 010 Β1
Szczególnie korzystny rodzaj wariantów podstawieniowych obejmuje podstawienie jednej lub więcej reszt aminokwasowych rejonu superzmiennego przeciwciała rodzicielskiego (np., przeciwciała humanizowanego lub ludzkiego). Na ogół, otrzymany(e) wariant(y) wyselekcjonowane do dalszego rozwoju będą miały lepsze właściwości biologiczne w porównaniu z przeciwciałem rodzicielskim, na bazie którego zostały wytworzone. Dogodny sposób wytwarzania takich wariantów podstawieniowych obejmuje dojrzewanie pod względem powinowactwa przy zastosowaniu wskaźnika fagowego. W skrócie, kilka miejsc rejonu superzmiennego (np., 6-7 miejsc) jest mutowanych w celu wytworzenia wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych w każdym miejscu. Tak wytworzone warianty przeciwciał przedstawiane są w sposób jednowartościowy z cząsteczek bakteriofaga włókienkowego, jako fuzja z produktem genu III M13 upakowanego w każdej cząsteczce. Warianty przedstawiane w fagach są następnie przeszukiwane pod kątem swojej aktywności biologicznej (np. powinowactwa wiązania), jak tutaj ujawniono. W celu zidentyfikowania miejsc rejonu superzmiennego nadających się do modyfikacji, przeprowadzić można skanowanie mutagenezy alaninowej w celu identyfikacji reszt aminokwasowych rejonu superzmiennego mających znaczący udział w wiązaniu antygenu. Alternatywnie lub dodatkowo, korzystne może być przeanalizowanie struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało w celu identyfikacji miejsc styku pomiędzy przeciwciałem a ludzkim ErbB2. Takie reszty styku i reszty sąsiadujące nadają się do podstawienia zgodnie z technikami tutaj opracowanymi. Po wytworzeniu takich wariantów, zestaw wariantów poddawany jest przeszukiwaniu w sposób tu opisany, a przeciwciała wykazujące właściwości lepsze w jednym lub kilku testach mogą być wybrane do dalszego opracowywania.
Inny rodzaj odmiany aminokwasowej zmienia oryginalny wzór glikozylacji przeciwciała. Przez zmianę rozumiane jest usunięcie jednej lub więcej części węglowodanowych znajdujących się w przeciwciele i/lub dodanie jednego lub więcej miejsc glikozylacji, które nie są obecne w przeciwciele.
Glikozylacja przeciwciał zachodzi zazwyczaj przez N-wiązanie lub O-wiązanie. N-wiązanie odnosi się do przyłączenia domeny węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. Trójpeptydowe sekwencje asparagina-X-seryna oraz asparagina-X-treonina, gdzie X oznacza każdy aminokwas z wyjątkiem proliny, stanowią sekwencje rozpoznawane w enzymatycznym przyłączaniu domeny węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Zatem, obecność każdej spośród tych trójpeptydowych sekwencji w polipeptydzie, tworzy potencjalne miejsce glikozylacji.
O-wiązanie odnosi się do przyłączenia jednego z cukrów N-acetylogalaktozoaminy, galaktozy lub ksylozy do kwasu hydroksyaminowego, najczęściej seryny lub treoniny, choć 5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna także mogą być zastosowane.
Dodanie miejsc glikozylacji do przeciwciała dogodnie osiągane jest przez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, że zawiera ona jedną lub więcej spośród opisanych powyżej sekwencji trójpeptydowych (dla N-połączonych miejsc glikozylacji). Zmiana może być również dokonana przez dodanie lub podstawienie przez jedną lub więcej reszt serynowych lub treoninowych w sekwencji pierwotnego przeciwciała (dla O-wiązanych miejsc glikozylacji).
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące odmiany sekwencji aminokwasowych przeciwciała anty-ErbB2 sporządzane są rozmaitymi sposobami znanymi w dziedzinie. Sposoby te obejmują, choć nie ograniczają się do, izolacji ze źródła naturalnego (w przypadku naturalnie występujących wariantów sekwencji aminokwasowych) lub uzyskiwanie przez mutagenezę z udziałem oligonukleotydów (lub ukierunkowaną miejscowo), mutagenezę PCR oraz mutagenezę kasetową uprzednio sporządzonych, odmiennych lub nie, wersji przeciwciała anty-ErbB2.
Pożądane może być modyfikowanie przeciwciała zgodne z wynalazkiem pod względem funkcji efektorowej, np. celem wzmocnienia cytotoksyczności komórkowej zależnej od antygenu (ADCC) i/lub cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) przeciwciała. Można to osiągnąć przez wprowadzenie jednego lub więcej podstawień aminokwasowych w rejonie Fc przeciwciała. Alternatywnie lub dodatkowo, wprowadzić można resztę(y) cysteinową(e) do rejonu Fc, co umożliwia utworzenie pomiędzy łańcuchami wiązania dwusiarczkowego w tym rejonie. W ten sposób wytworzone przeciwciało homodimeryczne może wykazywać lepszą zdolność internalizacji i/lub podwyższoną zdolność zabijania komórek przy udziale dopełniacza oraz komórkową cytotoksyczność zależną od przeciwciała (ADCC). Patrz Caron i wsp., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) oraz Shopes B., J. Immunol., 148: 29182922 (1992). Przeciwciała homodimeryczne o podwyższonej aktywności przeciwnowotworowej mogą także być wytworzone przy zastosowaniu bifunkcjonalnych łączników poprzecznych, jak opisano w Wolff i wsp., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternatywnie, można zaprojektować prze
PL 214 010 Β1 ciwciało, które ma podwójny rejon Fc, w związku, z czym może mieć zwiększoną zdolność lizy z udziałem dopełniacza i ADĆC. Patrz Stevenson i wsp., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
Celem wydłużenia okresu połowicznego rozpadu przeciwciała w surowicy, można wprowadzić do przeciwciała (a szczególnie fragmentu przeciwciała) ratunkowy epitop wiążący receptor, jak opisano na przykład w Patencie US Nr 5 739 277. Zastosowane tu pojęcie „ratunkowy epitop wiążący receptor odnosi się do epitopu rejonu Fc cząsteczki IgG (np., lgG1, lgG2, lgG3 lub lgG4), odpowiedzialnego za wzrost in vivo okresu połowicznego rozpadu cząsteczki IgG w surowicy.
Przeszukiwanie przeciwciał wykazujących pożądane właściwości
Techniki wytwarzania przeciwciał zostały opisane powyżej. Można następnie wybrać przeciwciała o pewnych, pożądanych właściwościach biologicznych.
W celu identyfikacji przeciwciała, które blokuje aktywację receptora ErbB ligandem, określić można zdolność przeciwciała do blokowania wiązania ligandu dla ErbB do komórek wykazujących ekspresję receptor ErbB (np., w połączeniu z innym receptorem ErbB, z którym badany receptor ErbB tworzy hetero-oligomer ErbB). Na przykład, komórki naturalnie wykazujące ekspresję lub transfekowane w celu wykazywania ekspresji receptorów ErbB hetero-oligomeru ErbB można inkubować z przeciwciałem, a następnie eksponować na znakowany Ugand dla ErbB. Następnie ocenić można zdolność przeciwciała anty-ErbB do blokowania wiązania ligandu do receptora ErbB w heterooligomerze ErbB.
Na przykład, można przeprowadzić hamowanie wiązania HRG do linii komórek nowotworu piersi MCF7 przez przeciwciała anty-ErbB2 przy zastosowaniu jednej warstwy MCF7 hodowanej w lodzie w formacie płytki 24-dołkowej, jak to zostało zasadniczo opisane wWO 01/00245. Monoklonalne przeciwciała anty-ErbB2 mogą zostać dodane do każdego dołka i inkubowane przez 30 minut. Następnie, można dodać znakowane 1251 rHRG3 1177-224 (25 pm) i kontynuować inkubację przez 4 do 16 godzin. Przygotować można krzywe wzorcowe odpowiedzi zależnej od dawki i wyliczyć wartość IC50 dla badanego przeciwciała. W jednym z wykonań, IC50 przeciwciała, które blokuje aktywację ligandem receptora ErbB, będzie dla hamowania wiązania HRG do komórek MCF7 wynosiło w tym oznaczeniu około 50 nM lub mniej, bardziej korzystnie 10 nM lub mniej. Jeśli przeciwciało jest fragmentem przeciwciała takim, jak Fab, IC50 dla hamowania wiązania HRG do komórek MCF7 może w tym oznaczeniu wynosić, na przykład około 100 nM lub mniej, bardziej korzystnie 50 nM lub mniej.
Alternatywnie lub dodatkowo może zostać oznaczona zdolność przeciwciała anty-ErbB2 do blokowania stymulowanej ligandem dla ErbB fosforylacji tyrozynowej receptora ErbB obecnego w heterooligomerze ErbB. Na przykład, komórki endogennie wykazujące ekspresję receptora ErbB lub transfekowane w celu wykazywania ich ekspresji, mogą być inkubowane z przeciwciałem i następnie oznaczane pod względem aktywności fosforylacji tyrozynowej zależnej od liganda dla ErbB przy zastosowaniu przeciwciała przeciw fosfotyrozynie (które jest opcjonalnie sprzężone z wykrywalnym znacznikiem). Test aktywacji receptora kinazowego, opisany w Patencie US Nr 5766863, jest również dostępny do określania aktywacji receptora ErbB i blokowania tej aktywacji przez przeciwciało.
W jednym z wykonań, przeszukiwać można komórki MCF7 pod względem przeciwciała hamującego stymulację HRG fosforylacji tyrozyny w pozycji 180, zasadniczo jak opisano w Przykładzie 1, poniżej. Na przykład, komórki MCF7 mogą być naniesione na 24-dołkowe płytki, do każdego dołka dodać można monoklonalne przeciwciała przeciw ErbB2 i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej; następnie do każdego dołka dodać można rHRG3 1177-244 tak, by stężenie końcowe wynosiło 0,2 nM, a inkubacja może być prowadzona dalej przez 8 minut. Podłoża mogą być zebrane z każdego dołka, a reakcja zatrzymana przez dodanie 100 pi próbki buforu SDS (5% SDS, 25 mM DTT oraz 25 mMTris-HCI, pH 6,8). Każda próbka (25 μΙ) może zostać poddana elektroforezie w 4-12% żelu gradientowym (Novex), po czym elektroforetycznie przeniesiona na błonę dwufluorku winylidenu.
Immunobloty antyfosfotyrozynowe (1 pg/ml) mogą zostać wywołane i można wyliczyć intensywność najbardziej promieniotwórczego prążka przy Mr-180 000 za pomocą densytometrii współczynnika odbicia. Korzystnie, wybrane przeciwciało będzie znacząco hamować stymulację HRG fosforylacji tyrozyny w pozycji 180 do około 0-35% wartości dla kontroli w tym oznaczeniu. Sporządzić można krzywą odpowiedzi w zależności od dawki dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozyny w pozycji 180 przez HRG, co zostało określone metodądensytometrii współczynnika odbicia, i wyliczyć IC50 dla badanego przeciwciała. W jednym z wykonań, IC50 przeciwciała blokującego aktywację ligandem receptora ErbB będzie dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozyny w pozycji 180 przez HRG w tym oznaczeniu wynosiło około 50 nM lub mniej, bardziej korzystnie 10 nM lub mniej. Jeśli przeciwciało jest fragmentem przeciwciała takim, jak fragment Fab, IC50 dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozy
PL 214 010 Β1 ny w pozycji 180 przez HRG może w tym oznaczeniu wynosić, na przykład około 100 nM lub mniej, bardziej korzystnie 50 nM lub mniej.
Można także oszacować wpływ przeciwciała na hamowanie wzrostu komórek MDA-MB-175, np. zasadniczo tak, jak to opisano w Schaefer i wsp., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997). Zgodnie z tym oznaczeniem, komórki MDA-MB-175 można traktować monoklonalnym przeciwciałem anty-ErbB2 (10 pg/ml) przez 4 dni i wyznakować fioletem krystalicznym. Inkubacja z przeciwciałem anty-ErbB2 może wykazać hamujący wpływ na tę linię komórkową, podobny do tego, który wykazuje monoklonalne przeciwciało 2C4. W dalszym wykonaniu, egzogenny HRG nie będzie w sposób znaczący odwracał tego hamowania. Korzystnie, przeciwciało będzie miało zdolność do hamowania proliferacji komórek MDAMB-175 w stopniu większym niż monoklonalne przeciwciało 4D5 (i opcjonalnie w większym stopniu niż monoklonalne przeciwciało 7F3), zarówno w obecności, jak i przy braku obecności egzogennego HRG.
W jednym z wykonań, badane przeciwciało anty-ErbB2 może blokować zależne od hereguliny łączenie ErbB2 z ErbB3 zarówno w komórkach MCF7, jak i SK-BR-3, jak określono w doświadczeniu z zastosowaniem ko-immunoprecypitacji takim, jak opisano w Przykładzie 1, wyraźnie bardziej efektywnie, niż monoklonalne przeciwciało 4D5 i korzystnie, wyraźnie bardziej efektywnie niż monoklonalne przeciwciało 7F3.
W celu identyfikacji przeciwciał anty-ErbB2 hamujących wzrost, poszukiwać można przeciwciał, które hamują wzrost komórek nowotworowych wykazujących nadekspresję ErbB2. W jednym z wykonań, wybrane przeciwciało hamujące wzrost ma zdolność hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 w hodowli o około 20-100%, a korzystnie o około 50-100%, przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około 0,5 do 30 pg/ml. W celu zidentyfikowania takich przeciwciał, przeprowadzić można oznaczenie SK-BR-3, opisane w Patencie USA Nr 5677171. Zgodnie z tym oznaczeniem, komórki SK-BR-3 hodowane są w mieszaninie F12 i pożywki DMEM 1:1 z dodatkiem 10% surowicy cielęcej, glutaminy i penicyliny/streptaomycyny. Komórki SK-BR-3 nanoszone są w liczbie 20000 komórek na 35 mm płytkę do hodowli komórek (2ml/35mm płytkę). Dodawane jest 0,5 do 30 pg/ml przeciwciała antyErbB2 na płytkę. Po sześciu dniach liczona jest liczba komórek w porównaniu z komórkami nietraktowanymi przeciwciałem, przy zastosowaniu elektronicznego licznika komórek COULTER™. Te przeciwciała, które zahamowały wzrost komórek SK-BR-3 o około 20-100% lub około 50-100% mogą zostać wybrane jako przeciwciała hamujące wzrost.
W celu wybrania przeciwciał, które indukują śmierć komórkową, oznaczyć można utratę integralności błony, na co wskazuje pobieranie np., PI, błękitu trypanu lub 7AAD w odniesieniu do kontroli.
Preferowanym oznaczeniem jest oznaczenie pobierania PI przy zastosowaniu komórek BT474. Zgodnie z tym oznaczeniem, komórki BT474 (które można otrzymać z American Type Culture Collection (Rockville, MD)) hodowane są w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM): HanTs F-12 (50:50) z dodatkiem 10% FBS inaktywowanego przez ogrzewanie (Hyclone) i 2 mM L-glutaminy. (Zatem oznaczanie przeprowadzane jest przy braku obecności dopełniacza i efektorowych komórek układu odpornościowego). Komórki BT474 wysiewane są przy gęstości 3 x 106 na płytkę w 100 x 20 mm płytkach, po czym umożliwia się im przylgnięcie do podłoża przez noc. Następnie, pożywka jest usuwana i zastępowana świeżą pożywką bez dodatków lub pożywką zawierającą 10 pg/ml odpowiedniego przeciwciała monoklonalnego. Komórki są hodowane przez okres 3 dni. Następnie w każdym przypadku, pojedyncze warstwy są przepłukiwane PBS i odczepiane od podłoża, przez trypsynizację. Następnie komórki są wirowane przy 1200 rpm przez 5 minut w 4°C, osad jest ponownie zawieszany w 3 ml zimnego buforu wiążącego Ca2+ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCI, 2,5 mM CaCI2) i wlewane do wyposażonych w 35 mm filtr probówek 12 x 75 (1 ml na probówkę, 3 probówki na grupę) w celu usunięcia agregatów zlepionych komórek. Do próbek dodawany jest następnie PI (10 pg/ml). Próbki mogą być analizowane przy zastosowaniu cytometrii przepływowej FACSCAN™ oraz oprogramowania FACSCONVERT™ CellÓuest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które indukują w znaczącym stopniu śmierć komórek, co określone jest za pomocą wychwytu PI mogą zostać wybrane, jako przeciwciała indukujące śmierć komórkową.
W celu wybrania przeciwciał, które indukują apoptozę, dostępne jest oznaczenie wiązania aneksyny przy zastosowaniu komórek BT474. Komórki BT474 hodowane są i wysiewane na płytki opisane w poprzednim akapicie. Pożywka jest następnie usuwana i zastępowana świeżą pożywką bez dodatków lub pożywką zawierającą 10 pg/ml przeciwciała monoklonalnego. Po okresie trzydniowej inkubacji jednokomórkowe warstwy komórek przemywano PBS i oddzielano za pomocą trypsynizacji. Komórki są następnie odwirowywane, zawieszane z buforze wiążącym Ca2+ i rozdzielane do probówek jak to opisano powyżej, w celu przeprowadzenia oznaczenia śmierci komórkowej. Następnie, do
PL 214 010 Β1 probówek dodawana jest wyznakowana anneksyna (np., anneksyna V-FTIC) (1 pg/ml). Próbki mogą być analizowane z zastosowaniem cytometru przepływowego FACSCAN™ oraz oprogramowania FACSCONVERT™ CellOuest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które wzbudzają statystycznie znaczące poziomy wiązania anneksyny w porównaniu z kontrolą, są wybierane, jako przeciwciała indukujące apoptozę.
Dodatkowo do oznaczenia wiązania anneksyny, dostępne jest oznaczenie znakowania DNA z zastosowaniem komórek BT474. W celu przeprowadzenia takiego oznaczenia komórki BT474, traktowane przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania, jak to opisano w poprzednich dwóch akapitach, inkubowane są z 9 pg/ml HOECHST 33342™ przez 2 godziny w 37°C, a następnie analizowane na cytometrze przepływowym EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) stosując oprogramowanie MODFIT LT™ (Verity Software House). Przeciwciała indukujące zmianę w udziale procentowym komórek apoptotycznych, który jest 2-krotnie lub większy (i korzystnie 3-krotnie lub większy) niż komórek niczym nie traktowanych (do 100% komórek apoptotycznych) mogą być wybrane jako przeciwciała proapoptotyczne, stosując to oznaczenie.
W celu przeszukiwania pod względem przeciwciał, które wiążą się do epitopu na ErbB2 związanym z przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie krzyżowego blokowania, takie jak opisano wAntibodies, A Labolaroty Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternatywnie lub dodatkowo można przeprowadzić mapowanie epitopowe za pomocą sposobów znanych w tej dziedzinie (patrz zamieszczone tutaj np., Fig. 1A i 1B).
Immunokoniugaty
Wynalazek odnosi się także do immunokoniugatów zawierających przeciwciało połączone z czynnikiem cytotoksycznym takim jak czynnik chemoterapeutyczny, toksyna (np., mała cząsteczkowa toksyna lub enzymatycznie aktywna toksyna pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego włączając ich fragmenty i/lub warianty), lub izotop radioaktywny (tj. radiokoniugat).
Czynniki chemoterapeutyczne użyteczne w wytwarzaniu takich immunokoniugatów opisano powyżej. Koniugaty przeciwciała i jednej lub więcej małych cząsteczkowych toksyn takich jak kalicheamycyna, maytansyna (Patent USA Nr 5208020), trichotyna i CC1065 również są tutaj rozważane.
W jednym z korzystnych wykonań według niniejszego wynalazku, przeciwciało połączone jest z jedną lub więcej cząsteczką maitansyny (np., około 1 do około 10 cząsteczek maitansyny na cząsteczkę przeciwciała). Maytansyna może być na przykład przekształcona z Mai-SS-Me, która może być zredukowana do May-SH3 i reagować ze zmodyfikowanym przeciwciałem (Chari i wsp., Cancer Research, 52:127-131 (1992)) w celu wytworzenia immunokoniugatu maitansynoid-przeciwciało.
Inny immunokoniugat będący przedmiotem zainteresownia zawiera przeciwciało anty-ErbB2 połączone z jedną lub więcej cząsteczką kalicheamycyny. Kalicheamycynowa rodzina antybiotyków zdolna jest do wytwarzania przerw dwuniciowego DNA przy subpikomolarnych stężeniach. Strukturalne analogi kalicheamycyny, które mogą być zastosowane obejmują, ale nie ograniczają się do, γ11, α2Ι, α3Ι, N-acetylo-y11, PSAG oraz ΘΙ1 (Hinman i wsp., Cancer Resarch, 53: 3336-3342 (1993) oraz Lode i wsp., Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998)). Patrz także, Patent USA Nr 5 714 586; 5 712 374; 5 264 586; oraz 5 773 001 zawarte tutaj w postaci odnośnika.
Enzymatycznie aktywne toksyny oraz ich fragmenty, które mogą być zastosowane obejmują łańcuch A toksyny błonicy, niewiążące aktywne fragmenty toksyny błonicy, łańcuch A eksotoksyny (z Pseudomonas aruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modeccyny, alfasarcynę, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolaca americana (PAPI, PAPU oraz PAP-S), inhibitor Momordica charantia, curcynę, crotynę, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellinę, restriktocynę, fenomycynę, enomycynę oraz trikotecenes. Patrz na przykład WO 93/21232 opublikowany 28 października 1993.
Niniejszy wynalazek dotyczy dalej immunokoniugatów utworzonych pomiędzy przeciwciałem oraz związkiem o aktywności nukleolitycznej (np., rybonukleazą lub endonukleazą DNA takąjak deoksyrybonukleaza; DNaza).
Rozmaite izotopy radioaktywne dostępne są do wytwarzania radiokoniugatów przeciwciał antyErbB2. Przykłady obejmują At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm 153, ΒΪ212, P32 oraz radioaktywne izotopy Lu.
Koniugaty przeciwciała i czynnika cytotoksycznego mogą być wytworzone z zastosowaniem rozmaitych czynników łączących białka bifunkcjonalne, takich jak N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditiolo) propionian (SPDP), sukcynoimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-2-karboksyl, iminotiolan
PL 214 010 Β1 (IT), bifunkcjonalne pochodne imdoestrów (takie jak dimetylo adipimidan HCL), aktywne estry (takie jak disukcylinimidylo suberat), aldehydy (takie jak glutaraldehyd), związki bis-azydowe (takie jak bis (pazydobenziolo)heksanodiamina), pochodne soli bis-diazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniumbenzo-ilo)etylenodiamina), diizocjaniaty (takie jak tolileno 2,6-diizocjanat) oraz związki bis-aktywne fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na przykład, immunotoksyna rycynowa może być przygotowana jak to opisano w Vitetta i wsp., Science, 238: 1098(1987). Znakowany węglem-14 kwas 1 -izotiocjanatobenzylo-3-metylodietyleno triaminopanta-octanowy (MX-DTPA) stanowi przykładowy czynnik chelatujący dla łączenia radionukleotydów do przeciwciała. Patrz WO 94/11026. Łącznikiem może być łącznik możliwy do przecięcia ułatwiający uwolnienie cytotoksycznego leku w komórce. Na przykład zastosowane mogą być: łącznik kwasowo-nietrwały, łącznik wrażliwy na peptydazę, łącznik dimetylowy lub łącznik zawierający dwusiarczek (Chari i wsp., Cancer Research, 52:127-131 (1992)).
Alternatywnie białko fuzyjne zawierające przeciwciało anty-ErbB2 oraz czynnik cytotoksyczny może być wytworzone np., za pomocą technik rekombinacyjnych lub syntezy białkowej.
W jeszcze innym wykonaniu, przeciwciało może być połączone z „receptorem (takim jak streptawidyna) w celu wykorzystania do pierwotnego dotarcia do nowotworu, gdzie koniugat przeciwciałoreceptor podawany jest pacjentowi, następnie z krążenia usuwany jest koniugat niezwiązany, z zastosowaniem czynnika czyszczącego, a następnie podawany jest „ligand (np. awidyna), który jest połączony z czynnikiem cytotoksycznym np., radionukleotydem).
Zależna od przeciwciała terapia prolekowa z udziałem enzymu (ADEPT)
Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być także zastosowane w ADEPT przez połączenie przeciwciała z enzymem aktywującym, prolek, który przekształca prolek (np., peptydylowy czynnik chemoterapeutyczny, patrz WO 81/01145) w aktywny lek przeciwnowotworowy. Patrz, na przykład, WO 88/07378 oraz Patent USA Nr 4975278.
Komponent enzymatyczny immunokoniugatu użytecznego dla ADEPT obejmuje każdy enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, że przekształca go w jego bardziej aktywną cytotoksyczną postać.
Enzymy, które są przydatne w sposobie opisanym w niniejszym opisie wynalazku obejmują, lecz nie są ograniczone do: alkalicznej fosfatazy użytecznej w przekształcaniu proleków zawierających fosforan w wolne leki; arylosulfatazy użytecznej w przekształcaniu nietoksycznej 5-fluorocytozyny w lek przeciwnowotworowy 5-fluorouracyl; proteazy takiej jak proteaza pałeczek jelitowych, termolizyna, subtylizynya, karboksypeptydaza i katepsyna (takie jak katepsyna B i L), które są użyteczne w przekształcaniu proleków zawierających peptyd w wolne leki; D-alanylokarboksypeptydazy, użytecznej w przekształcaniu proleków zawierających podstawienia D-aminokwasowe; enzymów trawiących węglowodory takich jak β-galaktozydaza oraz neurominidaza użytecznych w przekształcaniu glikozylowanych proleków w wolne leki; β-laktamazy użytecznej w przekształcaniu leków derywatyzowanych z β-laktamami w wolne leki; i amidazy penicyliny, takie jak amidaza V peniciliny lub amidaza penicyliny, użyteczne w przekształcaniu leków derywatyzowanych w ich pozycjach azotów aminowych odpowiednio grupami fenoksyacetylowymi lub fenyloacetylowymi, w wolne leki. Alternatywnie, przeciwciała z aktywnością enzymatyczną, znane także w dziedzinie jako „abzymy mogą być stosowane do przekształcania proleków według niniejszego wynalazku w wolne aktywne leki (patrz np., Massey, Naturę, 328: 457- 458 (1987)). Koniugaty przeciwciało-abzym mogą być przygotowane jak to opisano tutaj, w celu dostarczenia abzymu do populacji komórek nowotworowych.
Enzymy opisane w niniejszym wynalazku mogą być kowalencyjnie połączone z przeciwciałami anty-ErbB2 za pomocą technik dobrze znanych w dziedzinie takich jak zastosowanie heterobifunkcjonalnych czynników łączących krzyżowo opisanych powyżej. Alternatywnie, białka fuzyjne zawierające co najmniej rejon wiążący antygen przeciwciała według wynalazku połączony z co najmniej funkcjonalnie aktywną częścią enzymu według wynalazku mogą być skonstruowane z zastosowaniem technik rekombinacji DNA dobrze znanych w dziedzinie (patrz np., Neuberger i wsp., Naturę, 312: 604-608 (1984).
Inne modyfikacje przeciwciał
Rozważane są tutaj inne modyfikacje przeciwciał. Na przykład, przeciwciało może być połączone z jednym spośród rozmaitych polimerów niebiałkopodobnych np., glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym, polioksyalkilenami lub kopolimerami glikolu polietylenowego lub glikolu polipropylenowego.
Przeciwciało może także lub alternatywnie być połączone z jednym lub więcej spośród rozmaitych różnych cząsteczek zdolnych do trawienia specyficznej cząsteczki łączącej.
PL 214 010 Β1
Przeciwciało może także być zamknięte w mikrokapsułkach przygotowanych na przykład za pomocą technik koacerwacji lub za pomocą polimeryzacji międzyfazowej (na przykład odpowiednio, hydroksymetylocelulozowe lub żelatynowe mikrokapsułki i poli-(metylometacylowe) mikrokapsułki), w układzie koloidalnego dostarczenia leku (na przykład liposomy, mikrosfery albuminowe, mikroemulsje, nanocząsteczki i nanokapsułki) lub w makroemulsjach. Takie techniki zawarte są w Remingtońs Pharmaceutical Sciences, wydanie 16te, Oslo, A., Ed., (1980).
Przeciwciała anty-ErbB2 mogą także być wytworzone jako immunoliposomy. Liposomy zawierające przeciwciało przygotowywane są za pomocą sposobów znanych w dziedzinie, tak jak opisano to w Epstein i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Patenty USA Nr 4485045 oraz 4544545 oraz WO 97/38731 opublikowany 23 października 1997. Liposomy ze zwiększonym czasem cyrkulacji zawarte są w Patencie USA Nr 5013556.
Szczególnie użyteczne liposomy mogą być wytworzone za pomocą sposobu odparowywania o odwróconej fazie z mieszaniną lipidową zawierającą fosfatydylocholinę, cholesterol oraz fosfatydyloetanoloaminowa pochodną PEG (PEG-PE). Liposomy są przepuszczane przez filtry o zdefiniowanej wielkości porów w celu zgromadzenia liposomów o pożądanej średnicy. Fragmenty Fab' przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być połączone z liposomami jak to opisano w Martin i wsp., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) przez reakcję wzajemnej wymiany dwusiarczku. Czynnik chemoterapeutyczny opcjonalnie zawarty jest w liposomie, patrz Gabizon i wsp., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989). Wektory, komórki gospodarza i sposoby rekombinacji.
Wynalazek opisuje także wyizolowany kwas nukleinowy kodujący przeciwciała, włączając przeciwciała humanizowane anty-ErbB2, wektory i komórki gospodarza zawierające kwas nukleinowy oraz techniki rekombinacji dla wytwarzania przeciwciała. Dla rekombinowanej produkcji przeciwciała, kwas nukleinowy je kodujący jest wyizolowany i wstawiony do wektora ulegającego replikacji, w celu dalszego klonowania (amplifikacji DNA) lub w celu uzyskania ekspresji. DNA kodujący przeciwciało monoklonalne jest z łatwością izolowany i sekwencjonowany z zastosowaniem tradycyjnych procedur (np., przez stosowanie sond oligonukleotydowych zdolnych do specyficznego wiązania z genem kodującym łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała. Dostępnych jest wiele wektorów. Do składników wektora na ogół zaliczane są, ale nie ograniczają się do, jedna lub więcej spośród następujących: sekwencja sygnałowa, miejsce inicjacji replikacji, jeden lub więcej genów markerowych, element wzmacniający, promotor oraz sekwencja terminacji transkrypcji.
Składnik sekwencji sygnałowej
Przeciwciała anty-ErbB2 mogą być wytworzone rekombinacyjnie nie tylko bezpośrednio, ale także jako polipeptydy fuzyjne z heterologicznym polipeptydem, który korzystnie jest sekwencją sygnałową lub innym polipeptydem posiadającym specyficzne miejsce trawienia na N-końcu dojrzałego białka lub polipeptydu. Wybrana heterologiczna sekwencja sygnałowa korzystnie stanowi taką, która jest rozpoznawana i trawiona (tj. cięta za pomocą peptydazy sygnałowej) przez komórkę gospodarza. Dla prokariotycznych komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie trawią natywnej sygnałowej sekwencji przeciwciała anty-ErbB2, sekwencja sygnałowa podstawiona jest prokariotyczną sekwencją sygnałową wybraną na przykład z grupy obejmującej alkaliczną fosfatazę, penicylinazę, Ipp lub temperaturo-stabilne sekwencje liderowe enterotoksyny II. Dla wydzielania drożdżowego, natywna sekwencja sygnałowa może być podstawiona przez np., lider drożdżowej inwertazy, lider czynnika a (włączając lidery czynnika a Saccharomycetes i Kluyveromyces) lub lider fosfatazy kwasowej, lider glukoamylazy C. albicans, lub sekwencję sygnałową opisaną w WO 90/13646. W ssaczej ekspresji komórkowej dostępne są zarówno ssacze sekwencje sygnałowe jak i wirusowe lidery wydzielnicze, na przykład sygnał gD Herpes simplex.
DNA dla takiego rejonu prekursorowego ligowany jest w ramce odczytu z DNA kodującym przeciwciało anty-ErbB2.
Składnik inicjacji replikacji
Zarówno wektory ekspresyjne jak i klonujące zawierają sekwencję kwasu nukleinowego umożliwiającą wektorowi replikację w jednej lub więcej wybranych komórkach gospodarza. Na ogół, w wektorach klonujących sekwencja ta umożliwia wektorowi replikację niezależna od gospodarzowego chromosomowego DNA i obejmuje miejsce inicjacji replikacji lub sekwencje replikujące autonomicznie. Sekwencje takie są dobrze znane dla wielu bakterii, drożdży i wirusów. Miejsce inicjacji replikacji z plazmidu pBR322 jest dogodne dla większości bakterii gram negatywnych, miejsce inicjacji replikacji plazmidowego 2μ dogodne jest dla drożdży oraz wiele wirusowych miejsc inicjacji replikacji
PL 214 010 Β1 (SV40, wirus poliomy, adenowirus, VSV lub BPV) jest dogodnych dla wektorów klonujących w komórkach ssaczych. Na ogół, składnik miejsca inicjacji replikacji nie jest niezbędny dla ssaczych wektorów ekspresyjnych (miejsce inicjacji replikacji SV40 może typowo być stosowane jedynie, dlatego, że zawiera wczesny promotor).
Składnik genu selekcyjnego
Wektory klonujące i ekspresyjne mogą zawierać gen selekcyjny, nazywany także markerem selekcyjnym. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny np., ampicylinę, neomycynę, metotreksan, lub tetracyklinę, (b) komplementują niedobory auksotroficzne lub (c) dostarczają niezbędnych składników odżywczych niedostępnych z kompleksowej pożywki np. gen kodujący reacemazę D-alaniny dla Bacilli.
Jeden przykład spośród schematu selekcyjnego wykorzystuje lek w celu zatrzymania wzrostu komórki gospodarza. Te komórki, które są skutecznie stransformowane heterologicznym genem, wytwarzają białko zapewniające oporność na lek i tym samym przeżywają selekcję. Przykłady takiej selekcji dominującej wykorzystują leki: neomycynę, kwas mykofenolowy oraz higromycynę.
Inne przykłady odpowiednich markerów selekcyjnych dla komórek ssaczych to te, które umożliwiają identyfikację komórek kompetentych do pobierania kwasu nukleinowego przeciwciała antyErbB2, takie jak DHFR, kinaza tymidynowa, metalotioneina I oraz II, korzystnie geny pierwszorzędowe metalotioneina, dezaminaza adenozyny, dekarboksylaza ornityny, etc.
Na przykład komórki stransformowane za pomocą genu selekcyjnego DHFR są początkowo identyfikowane przez hodowlę wszystkich transformantów w pożywce hodowlanej zawierającej metotreksan (Mtx), kompetetywny antagonista DHFR. Odpowiednią komórką gospodarza, gdy wykorzystany jest dziki typ DHFR, jest linia komórkowa jajnika chomika chińskiego (CHO) nieposiadająca aktywności DHFR.
Alternatywnie, komórki gospodarza (szczególnie gospodarze dzikiego typu, którzy zawierają endogenne DHFR) transformowane lub ko-transformowane sekwencjami DNA kodującymi przeciwciało anty-ErbB2, dziki typ białka DHFR i inny marker selekcyjny taki jak 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (APH) mogą być wyselekcjonowani przez wzrost komórkowy w pożywce zawierającej czynnik selekcyjny dla markera selekcyjnego taki jak antybiotyk aminoglikozydowy, np., kanamycynę, neomycynę lub G418. Patrz Patent USA Nr 4965199.
Odpowiednim genem selekcyjnym do zastosowania w drożdżach jest gen trp1 obecny na plazmidzie drożdżowym YRp7 (Stinchcomb i wsp., Naturę, 282: 39 (1979)). Gen trp1 dostarcza markera selekcyjnego dla szczepu mutanta drożdżowego nieposiadającego zdolności do wzrostu w nieobecności trytofanu na przykład ATCC nr 44076 lub PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Obecność uszkodzenia trp1 w genomie komórek gospodarza drożdżowego zapewnia wtedy skuteczne środowisko do wykrycia transformacji przez wzrost w nieobecności tryptofanu. Podobnie, szczepy drożdżowe z uszkodzonym Leu2 (ATCC 20,622 lub 38,626) ulegają komplementacji przez znane plazmidy zawierające gen Leu2.
Dodatkowo, wektory otrzymane z 1,6 pm kołowego plazmidu pKD1 mogą być stosowane do transformacji drożdży Kluyveromyces. Alternatywnie, opisano system ekspresyjny do celów produkcji na dużą skalę rekombinowanej cielęcej podpuszczki dla K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Wykryte zostały również stabilne wielokopijne wektory ekspresyjne do wydzielania dojrzałej rekombinowanej ludzkiej albuminy osocza przez szczepy przemysłowe Kluyveromyces. Fleer i wsp., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).
Składnik promotora
Wektory ekspresyjne i klonujące zazwyczaj zawierają promotor, który jest rozpoznawany przez organizm gospodarza i który jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym przeciwciała antyErbB2. Promotory odpowiednie do zastosowania z gospodarzami prokariotycznymi obejmują promotor phoA, β-laktamazowe i laktozowe układy promotorowe, układ promotorowy alkalicznej fosfatazy i tryptofanu (trp), oraz promotory hybrydowe takie jak promotor tac. Jednakże, inne znane bakteryjne promotory są odpowiednie. Promotory do zastosowania w układach bakteryjnych będą także zawierały sekwencję Shine-Dalgarno (SD) funkcjonalnie połączoną z DNA kodującym przeciwciało anty-ErbB2.
Sekwencje promotorowe znane są dla Eukaryota. Faktycznie wszystkie geny eukariotyczne posiadają rejon bogaty w AT znajdujący się około 25 do 30 par zasad powyżej miejsca inicjacji transkrycji. Inną sekwencją znajdowaną 70 do 80 par zasad powyżej miejsca inicjacji transkrypcji wielu genów jest rejon CNCAAT, gdzie N może być każdym nukleotydem. Na końcu 3' większości genów eukariotycznych znajduje się sekwencja AATAAA, która może być sygnałem do dodania ogona poli-A do
PL 214 010 Β1
3' końca sekwencji kodującej. Wszystkie te sekwencje są odpowiednio wstawione do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych.
Przykłady odpowiednich sekwencji promotorowych do zastosowania w gospodarzach drożdżowych obejmują promotory dla kinazy 3-fosfoglicerynianowej lub innych enzymów glikolitycznych takich jak enolaza, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa, heksakinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukoza-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triosefosforanowa oraz glukokinaza.
Innymi promotorami drożdżowymi, będącymi promotorami indukowalnymi posiadającymi dodatkową przewagę transkrypcji kontrolowanej przez warunki wzrostowe, są rejony promotorowe dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, fosfatazy kwasowej, enzymów degradujących związanych z metabolizmem azotu, metalotionein, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiednie wektory i promotory do zastosowania w ekspresji drożdżowej są dalej opisywane w EP 73657. Także drożdżowe wzmacniacze są korzystnie stosowane z promotorami drożdżowymi.
Transkrypcja przeciwciała anty-ErbB2 z wektorów w ssaczych komórkach gospodarza jest kontrolowana na przykład przez promotory otrzymane z genomów wirusowych takich jak wirus poliomy, wirus ptasiej ospy, adenowirus (taki jak adenowirus 2), bydlęcy wirus brodawczaka, wirus mięsaka ptasiego, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby B oraz najkorzystniej małpi wirus 40 (SV40), z heterologicznych ssaczych promotorów, np., promotora działającego lub promotora immunoglobulin, z promotorów szoku cieplnego, pod warunkiem, że takie promotory są kompatybilne z układami komórki gospodarza.
Wczesne i późne promotory wirusa SV40 są dogodnie uzyskiwane jako fragmenty restrykcyjne SV40, które zawierają także wirusowe miejsce inicjacji replikacji SV40. Natychmiastowy wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa jest dogodnie uzyskiwany z fragmentu restrykcyjnego Hindlll E. Układ do ekspresji DNA w gospodarzach ssaczych z zastosowaniem bydlęcego wirusa brodawczaka jako wektora opisano w Patencie USA Nr 4419446. Modyfikacja tego układu zawarta jest w Patencie US NrA 4601978. Patrz także Reyes i wsp., Naturę, 297: 598-601 (1982) na temat ekspresji ludzkiego β-interferonowego cDNA w mysich komórkach pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej z wirusa Herpes Simplex. Alternatywnie, jako promotor mogą być zastosowane długie końcowe powtórzenia z wirusa mięsaka Rousa.
Składnik wzmacniacza
Transkrypcja DNA kodującego przeciwciało anty-ErbB2 według niniejszego wynalazku przez wyższe eucariota często jest podwyższana przez wstawienie sekwencji wzmacniającej do wektora. Wiele sekwencji wzmacniających jest znanych z genów ssaczych (globin, elastazy, albuminy, a-fetoproteiny i insuliny). Typowo, jednakże, stosuje się wzmacniacze z wirusa komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują wzmacniacz SV40 na uprzednim miejscu inicjacji replikacji (pz 100-270), wzmacniacz wczesnego promotora cytomegalowirusa, wzmacniacz wirusa poliomy w uprzednim miejscu inicjacji replikacji, oraz wzmacniacze adenowirusowe. Patrz także Yaniv, Naturę, 297: 17-18 (1982) na temat elementów wzmacniających dla aktywacji promotorów eukariotycznych. Wzmacniacz może być wstawiony w wektor w pozycji 5' lub 3' od sekwencji kodującej przeciwciała anty-ErbB2, ale korzystnie umieszczony jest w pozycji 5' od promotora.
Składnik terminacji transkrypcji
Wektory ekspresyjne stosowane w komórkach gospodarzy eukariotycznych (drożdże, grzyby, owady, rośliny, zwierzęta, ludzie lub komórki jądrzaste z innych organizmów wielokomórkowych) będą zawierały także sekwencje potrzebne do terminacji transkrypcji oraz stabilizacji mRNA. Takie sekwencje są zwykle dostępne z 5' oraz okazjonalnie 3' rejonów nieulegających translacji z eukariotycznych lub wirusowych DNA lub cDNA. Rejony te zawierają segmenty nukleotydowe transkrybowane jako fragmenty poliadenylowane w części nieulegającej translacji mRNA kodującego przeciwciało antyErbB2. Jednym przydatnym elementem terminacji transkrypcji jest rejon poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu. Patrz WO 94/11026 i wektor ekspresyjny tam zawarty.
Selekcja i transformacja komórek gospodarza
Odpowiednie komórki gospodarza do klonowania lub wykazywania ekspresji DNA w wektorach tutaj zawartych są komórkami prokariotycznymi, drożdżowymi lub wyższych eukariotów opisanymi powyżej. Odpowiednie prokarioty do tego celu obejmują eubakterie takie jak Gram dodatnie lub Gram ujemne organizmy na przykład Enterobakterie takie jak Escherichia np. E. coli, Etnerobakter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella np. Salmonella typhimurium, Serratia np., Serratia marcescans oraz
PL 214 010 Β1
Shigella\ak również Bacillus taki jak B. subtilis i B. licheniformis (np. B. licheniformis 41P ujawniony w DD 266710 opublikowanym 12 kwietnia 1989), Pseudomonas takie jak P. aeruginosa i Streptomyces. Jednym z korzystnych gospodarzy do klonowania jest E. coli 294 (ATCC 31,446) jednakże inne szczepy, takie jak E. coliB, E. coliXh776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 7,325) są odpowiednie. Przykłady te są raczej ilustrujące niż ograniczające.
Oprócz prokariotycznych, mikroby eukariotyczne takie jak grzyby nitkowate lub drożdże są odpowiednimi gospodarzami do klonowania lub ekspresji dla wektorów kodujących przeciwciało antyerbB2. Spośród niższych eukariotycznych mikroorganizmów gospodarzy najczęściej stosowane są Saccharomyces cerevsiae lub zwyczajne drożdże piekarskie. Jednakże wiele innych rodzin, gatunków i szczepów jest zwykle dostępnych i użytecznych tutaj, takich jak Schizosaccharomyces pombe', gospodarze Kluyveromyces tacy jak np. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans i K. Marxianus', yarrowia (EP 402,226); Piehia pastoris (EP 183,070); Candida; Triehoderma reesia (EP 244,234); Neurosora crassa\ Schwanniomyces takie jak Schwaniomyces occidentalis i grzyby nitkowate takie jak Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i gospodarze Aspergillus tacy jak A. nidulans i A. niger.
Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji glikozylowanych przeciwciał anty-ErbB2 dostarczane są z organizmów wielokomórkowych. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki roślinne i owadzie. Zidentyfikowano wiele szczepów bakulowirusowych i odmian oraz odpowiednich tolerancyjnych owadzich komórek gospodarza od gospodarzy takich jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aedes aegypti (komar), Aedes albopictus (komar), Drosophila melanogaster (muszka owocowa) oraz Bombyx mori. Rozmaite szczepy wirusowe do transfekcji są ogólnie dostępne np., odmiana L-1 Autographa californica NPV oraz szczep Bm-5 Bombyx moriNPY i takie wirusy mogą być zastosowane jak tutaj zawarte wirusy według niniejszego wynalazku, szczególnie do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda.
Roślinne hodowle komórkowe bawełny, kukurydzy, ziemniaków, soi, petunii, pomidorów i tytoniu mogą także służyć, jako gospodarze.
Jednakże największym zainteresowaniem cieszą się komórki kręgowców i utrzymywanie komórek kręgowców w hodowli (hodowla tkankowa) co stało się procedurą rutynową. Przykłady użytecznych linii komórkowych ssaczych gospodarzy to linia nerki małpiej CV1 transformowana SV40 (COS7, ATCC CRL 1451); ludzka embrionalna linia nerkowa (293 lub komórki 293 subklonowane dla wzrostu w hodowli zawieszonej, Graham i wsp., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); komórki nerkowe noworodka chomika (BHK, ATCC CCL 10); komórki jajnika chomika chińskiego - DHFR (CHO, Urlaub i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); mysie komórki podporowe (TM4, Mather Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)), małpie komórki nerkowe (CV1 ATCC CCL 70); komórki nerkowe afrykańskiej małpy zielonej (VERO-76, ATCC CRL-1587); komórki ludzkiego raka szyjki macicy (HELA, ATCC CCL 2); psie komórki nerki (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura bawolego (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuc (W 138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); mysie komórki nowotworowe sutka (MMT 060562, ATCC CCL51); komórki TRI (Mather i wsp., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); komórki MRC 5; komórki FS4; oraz ludzka linia wątrobiakowa (Hep G2).
Komórki gospodarza są transformowane powyżej opisanymi wektorami ekspresyjnymi lub klonującymi dla wytwarzania przeciwciała anty-ErbB2 i hodowane w pożywce z konwencjonalnymi składnikami pokarmowymi zmodyfikowanej jak to jest odpowiednie do indukcji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów kodujących pożądane sekwencje.
Hodowla komórek gospodarza
Komórki gospodarza stosowane do wytwarzania przeciwciała anty-ErbB2 według wynalazku, mogą być hodowane w rozmaitych podłożach. Handlowo dostępne podłoża takie jak Ham's F10 (Sigma), Minimal Essentials Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) oraz Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) są odpowiednie do hodowli komórek gospodarza. Dodatkowo, każde z podłóż opisanych w Ham i wsp., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes i wsp., Anal. Biochem., 102:255 (1980), Patenty USA Nr 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; lub 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195 lub Patent USA Re. 30985 mogą być stosowane, jako podłoża hodowlane dla komórek gospodarza. Każde z tych podłóż może być uzupełnione w razie konieczności hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostu (takimi jak insulina, transferyna lub nabłonkowy czynnik wzrostu), solami (takimi jak chlorek sodu, wapnia, magnezu i fosforany), buforami (takimi jak HEPES), nukleotydami (takimi jak
PL 214 010 Β1 adenozyna i tymidyna), antybiotykami (takimi jak lek GENTAMICIN®), elementami śladowymi (określanymi jako związki nieorganiczne zazwyczaj obecne w stężeniach końcowych z zakresu mikromolarnego) oraz glukozą lub równoważnym źródłem energii. Każde inne potrzebne uzupełnienia mogą być także załączane w odpowiednich stężeniach znanych specjalistom. Warunki hodowlane, takie jak temperatura, pH, i podobne, to takie jak uprzednio stosowane dla komórki gospodarza wybranej do ekspresji, i będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.
Oczyszczanie przeciwciała anty-ErbB2
W przypadku stosowania technik rekombinacyjnych, przeciwciała mogą być wytwarzane wewnątrzkomórkowa w przestrzeni periplazmatycznej lub bezpośrednio wydzielane do podłoża. W przypadku, gdy przeciwciało wytwarzane jest wewnątrzkomórkowo, jako pierwszy etap usuwany jest osad złożony z cząsteczek bądź komórek gospodarza bądź zlizowanych fragmentów, na przykład za pomocą wirowania lub ultrafiltracji. Carter i wsp., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992) opisuje procedurę izolacji przeciwciał, wydzielanych do przestrzeni periplazmatycznej E. coli. W skrócie, osad komórkowy zawieszany jest w obecności octanu sodu (pH 3,5), EDTA, fenylometylosulfonylofluorek (PMSF) ponad około 30 minut. Osad komórek może być usuwany za pomocą wirowania. W przypadku, gdy przeciwciało wydzielane jest do podłoża, nadsącz z takiego układu ekspresyjnego jest na ogół początkowo zagęszczany z zastosowaniem handlowo dostępnego filtru do zagęszczania białek, na przykład jednostki ultrafiltracyjnej Amicon lub Milipore Pellicon. Inhibitor proteaz taki jak PMSF może być włączony w każdy z kolejnych etapów w celu zahamowania proteolizy, a antybiotyki mogą być dodawane w celu zapobieżenia wzrostowi dodatkowych zakażeń.
Kompozycja przeciwciała przygotowana z komórek może być oczyszczana z zastosowaniem, na przykład, chromatografii hydroksyapatytowej, elektroforezy żelowej, dializy oraz chromatografii powinowactwa, która stanowi preferowaną technikę. Przydatność białka A jako ligandu powinowactwa zależy od gatunku i izotypu domeny Fc immunoglobuliny obecnej w przeciwciele. Białko A może być stosowane do oczyszczania przeciwciał opartych na ludzkich łańcuchach ciężkich γ1, γ2 lub γ4 (Lindmark i wsp., J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). Białko G polecane jest dla wszystkich mysich izotypów oraz ludzkiego γ3 (Guss i wsp., EMBO J., 5: 1567-1575 (1986)). Macierz, do której przyłączony jest ligand powinowactwa to najczęściej agaroza, ale dostępne są inne materiały. Mechanicznie stabilne matryce takie jak szkło o kontrolowanej wielkości porów lub poli(styrenodiwinylo)benzen umożliwiają szybsze tempo przepływu i krótszy czas procedury, niż ten, który można osiągnąć stosując agarozę. Gdy przeciwciało zawiera domenę CH3, do oczyszczania użyteczne jest złoże Bakerbond ΑΒΧ™ (J. T. Baker, Phillipsurg, NJ). Inne techniki oczyszczania białka takie jak frakcjonowanie na kolumnie jonowymiennej, strącanie etanolem, chromatografia HPLC o odwróconej fazie na krzemionce, chromatografia na SEPHAROSE™ heparynowej, chromatografia na złożu aniono- lub kationo-wymiennym (takie jak kolumna kwasu poliaspoaraginianowego), chromatoogniskowanie, SDS-PAGE, strącanie siarczanem amonu, są także dostępne w zależności od przeciwciała, które ma zostać odzyskane.
Następnie po każdym wstępnym etapie(ach) oczyszczania, mieszanina zawierająca przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczenia może być poddawana chromatografii oddziaływań hydrofobowych w niskim pH, z zastosowaniem buforu elucyjnego o pH pomiędzy 2,5-4,5, korzystnie przygotowanego w niskich stężeniach soli (np., sól od około 0-0,25 M).
Preparaty farmaceutyczne
Preparaty lecznicze przeciwciał stosowane według niniejszego wynalazku przygotowywane są do przechowywania za pomocą mieszania przeciwciała posiadającego pożądany stopień czystości z dowolnymi farmaceutycznie akceptowanymi nośnikami, rozczynnikami lub stabilizatorami (Remington^ Pharmaceutical Science wydanie 16te, Oslo, A. Ed. (1980)), w postaci preparatów liofilizowanych lub roztworów wodnych. Akceptowane nośniki, rozczynniki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w podawanych dawkach i stężeniach i zawierają bufory takie jak fosforanowy, cytrynianowy i innych kwasów organicznych; przeciwutleniacze włączając kwas askorbinowy i metionina; konserwanty (takie jak oktadecylodimetylobenzyl, cholerk amonu, chlorek heksametonium, chlorek benzalkonium, chlorek benzetonium, fenol, alkohol butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe takie jak paraben metylowy lub propylowy; katechol, rezorcyna; cykloheksanol; 3-pentanol; oraz m-krezol); polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt aminokwasowych) białka takie jak albumina osocza, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany włączając glukozę, mannozę lub dekstryny; czynniki chelatujące takie jak EDTA; cukry takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; przeciwjony tworzące sól
PL 214 010 Β1 takie jak sód; związki metali (np. związki białko-Zn); oraz/lub niejonowe związki powierzchniowo czynne takie jak TWEEN™, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG). Preferowane liofilizowane preparaty przeciwciała anty-ErbB2 opisane sąw WO 97/04801, w całości zawarte tutaj w formie referencji.
Preparat może zawierać także więcej niż jeden związek aktywny, jako konieczny dla konkretnego wskazania do leczenia, korzystnie te z aktywnościami dopełniającymi, które nie wpływają na siebie niekorzystnie. Na przykład pożądane może być dalej dostarczenie przeciwciał wiążących EGFR, ErbB2 (np. przeciwciało, które wiąże inny epitop na ErbB2), ErbB3, ErbB4 lub naczyniowy czynnik śródbłonkowy (VEGF), w jednym preparacie. Alternatywnie lub dodatkowo kompozycja może dalej zawierać czynnik chemoterapeutyczny, czynnik cytotoksyczny, cytokinę, czynnik hamujący wzrost, czynnik przeciwhormonalny, lek skierowany w EGFR, czynnik przeciw angiogenezie i/lub kardioprotektant. Cząsteczki takie są odpowiednio obecne w połączeniu w ilościach skutecznych dla zamierzonego celu.
Składniki aktywne także mogą być zamknięte w mikrokapsułki przygotowane, na przykład, za pomocą technik koacerwacyjnych lub za pomocą polimeryzacji międzyfazowej, na przykład, odpowiednio, w mikrokapsułki hydroksymetylocelulozowe lub żelatynowe oraz poli-(metylometacylowe) mikrokapsułki, w koloidalnych układach dostarczania leku (na przykład, liposomach, mikrosferach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząsteczkach i nanokapsułkach) lub w makroemulsjach. Techniki takie zawarte sąw Remington' s Pharmaceutical Sciences wydanie 16te, Oslo, A. Ed. (1980).
Przygotowane mogą być preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne macierze stałych hydrofobowych polimerów zawierające przeciwciało, które to macierze sąw postaci cząsteczek ukształtowanych np. błonek lub mikrokapsułek. Przykłady macierzy o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (na przykład poli-(2-hydroksyetylo-metakrylan) lub poli(winyloalkohol)), polilaktydy (Patent USA Nr 3773919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i yetylo-L-glutaminianu, nieulegający rozkładowi etyleno-winylo-octan, ulęgające rozkładowi kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy takie jak LUPRON DEPOT™ (dające się wstrzykiwać mikrokuleczki zbudowane z kopolimerów kwas mlekowykwas glikolowy oraz octanu leuprolidu) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.
Preparaty stosowane in vivo muszą być jałowe. Z łatwością można tego dokonać za pomocą filtracji przez jałowe membrany filtracyjne.
Leczenie przeciwciałami anty-ErbB2
Zakłada się, że zgodnie z niniejszym wynalazkiem, przeciwciała anty-ErbB2 mogą być zastosowane do leczenia rozmaitych chorób oraz zaburzeń. Przykładowe stany lub zaburzenia obejmują łagodne i złośliwe nowotwory; białaczki i nowotwory układu limfatycznego; inne zaburzenia takie, jak zaburzenia neuronalne, glejowe, podwzgórzowe, gruczołowe, makrofagowe, nabłonkowe, stromalne, blastoceliczne, zapalne, naczyniowe oraz immunologiczne. Korzystnie, przeciwciała anty-ErbB2 stosowane są do leczenia nowotworów rozpoznanych jako wrażliwe na leczenie takimi przeciwciałami za pomocą sposobów tutaj ujawnionych.
Na ogół, chorobą lub zaburzeniem nadającym się do leczenia jest nowotwór. Przykłady nowotworów nadających się tutaj do leczenia obejmują, choć nie ograniczają się do raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka oraz białaczki lub nowotworów limfatycznych. Bardziej szczegółowe przykłady takich nowotworów obejmują nowotwór płaskokomórkowy (np., nabłonkowy rak płaskokomókowy), nowotwór płuc wliczając drobnokomórkowy nowotwór płuc, nie-drobnokomórkowy nowotwór płuc, rak gruczołowy płuc oraz płaskokomórkowy nowotwór płuc, nowotwór otrzewnej, nowotwór wątrobowo-komórkowy, nowotwór żołądka lub gruczołu żołądka wliczając nowotwór odcinka żołądkowo-jelitowego, nowotwór trzustki, glejaka, nowotwór szyjki macicy, nowotwór jajnika, nowotwór wątroby, nowotwór pęcherza, wątrobiaka, nowotwór piersi, nowotwór okrężnicy, nowotwór odbytu, nowotwór jelita grubego, raka trzonu macicy lub raka macicy, raka gruczołu ślinowego, nowotwór nerek, nowotwór prostaty, nowotwór sromu, nowotwór tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia, jak również nowotwór głowy i szyi. Korzystnie, nadający się do leczenia nowotwór jest rozpoznawany, jako wrażliwy na leczenie przeciwciałami antyErbB2 na podstawie identyfikacji heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 lub fosforylacji receptora ErbB w próbce nowotworu. Szczególna grupa nowotworów, w których spodziewane jest wykrycie tworzenia się heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub fosforylacji receptora ErbB obejmuje, bez ograniczeń, nowotwór piersi, nowotwór płuc, nowotwór jajnika, wliczając zaawansowaną, oporną lub nawrotową formę nowotworu jajnika, nowotwór prostaty, nowotwór jelita grubego oraz nowotwór trzustki.
Nowotwór będzie na ogół zawierał komórki wykazujące ekspresję ErbB2 takie, że niniejsze przeciwciało anty-ErbB2 ma zdolność wiązania się do nowotworu. Podczas gdy nowotwór cechować może nadekspresja receptora ErbB2, niniejsza aplikacja dostarcza dodatkowo sposobu leczenia
PL 214 010 Β1 nowotworu, który nie jest rozpatrywany jako nowotwór wykazujący nadekspresję ErbB2. Do określenia ekspresji ErbB2 w nowotworze dostępne są rozmaite diagnostyczne/prognostyczne oznaczenia. W jednym z wykonań nadekspresja ErbB2 może być analizowana metodą IHC, np. przy zastosowaniu HERCEPTEST® (Dako). Parafinowe skrawki tkanki pochodzącej z biopsji nowotworu mogą zostać poddane oznaczeniu IHC i ocenione zgodnie z kryteriami intensywności znakowania białka ErbB2 w następujący sposób: Wynik 0 znakowanie nie jest widoczne lub widoczne jest znakowanie błonowe u mniej niż 10% komórek nowotworu.
Wynik 1 + wykrywane jest słabo/prawie nie zauważalne znakowanie błonowe u mniej niż 10% komórek nowotworowych. Komórki wyznakowane są jedynie w części swej błony.
Wynik 2+ widoczne jest słabe do umiarkowanego znakowanie całej błony u więcej niż 10% komórek nowotworowych.
Wynik 3+ widoczne jest umiarkowane do silnego znakowania całej błony u więcej niż 10% komórek nowotworowych.
Nowotwory, których wynik nadekspresji ErbB2 wyniósł 0 lub 1+ mogą być uznane, jako niewykazujące nadekspresji ErbB2, zaś nowotwory, których wynik wyniósł 2+ lub 3+ mogą zostać uznane za wykazujące nadekspresję ErbB2.
Alternatywnie lub dodatkowo, oznaczenia FISH takie, jak INFORM™ (sprzedaż przez Ventana, Arizona) lub PATHVISION™ (Vysis, Illinois) mogą zostać przeprowadzone na utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie tkance nowotworu w celu określenia stopnia (jeśli w ogóle) nadekspresji ErbB2 w nowotworze.
W jednym z wykonań, nowotwór będzie nowotworem wykazującym ekspresję (i może, choć nie musi, wykazywać nadekspresję) EGFR. Przykłady nowotworów, które mogą wykazywać ekspresję/nadekspresję EGFR obejmują nowotwór płaskokomórkowy (np., nowotwór płaskokomórkowy nabłonka), nowotwór płuc wliczając drobnokomórkowy nowotwór płuc, niedrobnokomórkowy nowotwór płuc (NSCLC), raka gruczołowego płuc oraz raka płaskokomórkowego płuc, nowotwór otrzewnej, raka wątrobokomórkowego, nowotwór żołądka wliczając nowotwór żołądkowo-jelitowy, nowotwór trzustki, glejaka, nowotwór szyjki macicy, nowotwór jajnika, nowotwór wątroby, nowotwór pęcherza, wątrobiaka, nowotwór piersi, nowotwór okrężnicy, nowotwór odbytu, nowotwór jelita grubego, raka trzonu macicy lub macicy, raka gruczołu ślinowego, nowotwór nerek, nowotwór prostaty, nowotwór sromu, nowotwór tarczycy, raka wątroby, raka odbytu, raka prącia, jak również nowotwór głowy oraz szyi.
Niniejszy wynalazek jest szczególnie przydatny do rozpoznawania pacjentów cierpiących na nowotwór piersi, nowotwór prostaty taki, jak oporny na kastrację rak prostaty (CRPC) oraz nowotwór jajnika, co do których istnieje prawdopodobieństwo, że będą wrażliwi na leczenie przeciwciałem antyErbB2 blokującym aktywację ligandem heterodimeru ErbB zawierającego HER2 takim, jak monoklonalne przeciwciało 2C4 lub rhuMAb 2C4.
Nowotwór nadający się tutaj do leczenia może cechować nadmierna aktywacja receptora ErbB, np. przez EGFR. Taka nadmierna aktywacja może być przypisana nadekspresji lub podwyższonemu wytwarzaniu receptora ErbB lub liganda dla ErbB. W jednym z wykonań wynalazku, przeprowadzone będzie oznaczenie diagnostyczne lub prognostyczne w celu określenia czy nowotwór pacjenta cechuje nadmierna aktywacja receptora ErbB. Na przykład, określić można amplifikację genu ErbB i/lub nadekspresję receptora ErbB w nowotworze. W dziedzinie dostępnych jest wiele testów do określania takich amplifikacji/nadekspresji i obejmują one IHC, FISH oraz opisane powyżej oznaczenia wolnego antygenu.
Alternatywnie lub dodatkowo, zgodnie ze znanymi procedurami oznaczyć można poziomy liganda dla ErbB takiego, jak TGF-α wewnątrz nowotworu lub towarzyszącego nowotworowi. Testy takie wykrywać mogą w badanej próbce białko i/lub kodujący je kwas nukleinowy. W jednym z wykonań, poziomy liganda dla ErbB w nowotworze mogą zostać określone przy zastosowaniu immunohistochemii (IHC); patrz na przykład, Scher iwsp., Clin. Cancer Research, 1:545-550 (1995). Alternatywnie lub dodatkowo, w próbce badanej ocenić można poziomy kwasu nukleinowego kodującego ligand dla ErbB; np., za pomocą technik FISH, southern blotting lub PCR.
Co więcej, nadekspresję lub amplifikację receptora ErbB lub liganda dla ErbB ocenić można przy zastosowaniu testu diagnostycznego in vivo, np. przez podanie cząsteczki (takiej, jak przeciwcia
PL 214 010 Β1 ło), która wiąże wykrywaną cząsteczkę i jest znakowana wykrywalnym znacznikiem (np., izotopem radioaktywnym) i zewnętrzne badanie pacjenta celem lokalizacji znacznika.
W przypadku, gdy leczony nowotwór jest nowotworem niezależnym od hormonów, oznaczać można ekspresję hormonu (np., androgenu) i/lub jego receptora w nowotworze przy zastosowaniu jakiegolkwiek spośród rozmaitych dostępnych testów, np. jak opisane powyżej. Alternatywnie lub dodatkowo, pacjent może zostać zdiagnozowany jako cierpiący na nowotwór niezależny od hormonów przez fakt, że nie jest już wrażliwy na leczenie przeciw-androgenowe.
W pewnych wykonaniach, pacjentowi podaje się immunokoniugat zawierający przeciwciało anty-ErbB2 sprzężone ze związkiem cytotoksycznym. Korzystnie, immunokoniugat i/lub białko ErbB2, do którego jest on związany jest/są internalizowane do komórki, w wyniku czego wzrasta terapeutyczna skuteczność immunokoniugatu w zabijaniu komórek nowotworowych, do których się on wiąże. W preferowanym wykonaniu, związek cytotoksyczny docelowo wiąże się lub zakłóca działanie kwasu nukleinowego komórki nowotworowej. Przykłady takich cytotoksycznych związków obejmują majtansinoidy, kalichemicyny, rybonukleazy i endonukleazy DNA.
W szczególnym wykonaniu, dostarczonym przeciwciałem jest rhuMAb 2C4, lub jego funkcjonalny ekwiwalent. RhuMAb 2C4 jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym opartym na sekwencjach zrębowych ludzkiej lgG1 i składającym się z dwóch łańcuchów ciężkich (449 reszt aminokwasowych) i dwóch łańcuchów lekkich (214 reszt aminokwasowych). RhuMAb 2C4 różni się znacząco od innego przeciwciała anty-HER2 HERCEPTIN© (Trastuzumab) w rejonach wiążących epitop łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. W rezultacie, rhuMAb 2C4 wiąże się do całkowicie innego epitopu na HER2. Niniejszy wynalazek dostarcza czułych sposobów rozpoznawania nowotworów wrażliwych na leczenie rhuMAb2C4 lub jego funkcjonalnymi ekwiwalentami. Należy zaznaczyć, że takie nowotwory wrażliwe na leczenie rhuMAb 2C4 nie muszą wykazywać nadekspresji HER2.
Przeciwciała anty-ErbB2 lub immunokoniugaty dostarczane są pacjentowi zgodnie ze znanymi sposobami takimi, jak podanie dożylne, np. dawki początkowo wysokiej lub przez nieprzerwany wlew przez czas określony, drogą domięśniową, dootrzewnową, do mózgowo-rdzeniową, podskórną, wewnątrzstawową, wewnątrzmaziówkową, dokanałową, doustną, miejscowo lub drogą wziewną. Korzystne jest dostarczanie przeciwciała dożylnie lub podskórnie.
Inne tryby leczenia mogą być połączone z podawaniem przeciwciała anty-ErbB2. Podawanie łączone obejmuje podawanie jednoczesne przy zastosowaniu oddzielnych preparatów lub jednego farmaceutycznego preparatu oraz sukcesywne podawanie w jakiejkolwiek kolejności, przy czym korzystnie, jest określony czas, gdy oba (lub wszystkie) czynniki aktywne równocześnie wykazują swoje działanie biologiczne.
W jednym ze szczególnych wykonań, pacjent traktowany jest dwoma różnymi przeciwciałami anty-ErbB2. Na przykład, pacjent może być traktowany pierwszym przeciwciałem anty-ErbB2, które blokuje aktywację receptora ErbB ligandem lub przeciwciałem posiadającym właściwości biologiczne przeciwciała monoklonalnego 2C4, jak również drugim przeciwciałem anty-ErbB2, które jest przeciwciałem hamującym wzrost (np. HERCEPTIN®) lub przeciwciałem anty-ErbB2, które indukuje apoptozę komórek wykazujących nadekspresję ErbB2 (np. 7C2, 7F3 lub ich humanizowane warianty). Korzystnie, taka terapia łączona wywołuje synergistyczny skutek leczniczy. Można na przykład leczyć pacjenta HERCEPTIN®, a następnie leczyć rhuMAb 2C4, np., gdy pacjent nie reaguje na leczenie HERCEPTIN®. Winnym z wykonań, pacjent może być początkowo leczony rhuMAb 2C4, a następnie otrzymywać leczenie HERCEPTIN®. W jeszcze kolejnym wykonaniu, pacjent może być leczony zarówno rhuMAb 2C4, jak i HERCEPTIN® równocześnie.
Pożądane może być także łącznie podawania przeciwciała lub przeciwciał anty-ErB2 z podawaniem przeciwciała skierowanego przeciwko innemu antygenowi związanemu z nowotworem. Inne przeciwciało w tym przypadku może na przykład wiązać się z EGFR, ErbB3, ErbB4 lub naczyniowym śródbłonkowym czynnikiem wzrostu (VEGF).
W jednym według wykonań, leczenie według niniejszego wynalazku obejmuje łączone podanie przeciwciała (lub przeciwciał) anty-ErbB2 i jednego lub więcej czynników chemoterapeutycznych lub czynników hamujących wzrost, włączając wspólne podawanie mieszanin różnych czynników chemoterapeutycznych. Preferowane czynniki chemoterapeutyczne obejmują taksany (takie jak paklitaksel i doketaksel) i/lub antybiotyki antracyklinowe. Harmonogramy przygotowania i dawkowania dla takich czynników chemoterapeutycznych można stosować według instrukcji producenta lub jak to zostało ustalone empirycznie przez wykwalifikowanego lekarza. Harmonogramy przygotowania i dawkowania
PL 214 010 Β1 dla takich czynników chemoterapeutycznych opisano także w Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).
Przeciwciało można łączyć ze związkiem przeciwhormonalnym; np., związkiem przeciwestrogenowym takim jak tamoxifen; przeciw- progesteronowym takim jak onapriston (patrz, EP 616812) lub przeciw- androgenowym takim jak flutamid, w dawkach znanych dla takich cząsteczek. W przypadku, gdy nowotwór przeznaczony do leczenia jest nowotworem niezależnym hormonalnie, pacjent mógł wcześniej być poddany leczeniu przeciw-hormonalnemu, i po tym jak nowotwór stał się hormonalnie niezależny, pacjentowi może być dostarczone przeciwciało anty-ErbB2 (i opcjonalnie inne czynniki jak to tutaj opisano).
Czasami, korzystne może być także wspólne podawanie pacjentowi kardioprotektanta (w celu zapobieżenia lub zmniejszenia dysfunkcji mięśnia sercowego związanej z terapią) lub jednej lub więcej cytokin. Można także wspólnie podać lek nakierowany na EGFR lub czynnik anty- angiogenetyczny. W dodatku do powyższych trybów leczenia, pacjent może być poddany chirurgicznemu usunięciu komórek nowotworowych i/lub terapii radiacyjnej.
Przeciwciała anyt-ErbB2 mogą tutaj być także połączone z lekami nakierowanymi na EGFR takim jak te omawiane powyżej w części z definicjami, wywołując uzupełniający i potencjalnie synergistyczny, leczniczy skutek.
Przykłady dodatkowych leków, które mogą być połączone z przeciwciałem obejmują czynniki chemoterapeutyczne takie jak karboplatyna, taksany (paklitaksel lub doketaksel), gemcitabina, nawelbina, cisplatina, oksaliplatina lub kombinacje każdego z tych, takie jak karboplatyna/doketaksel; inne przeciwciało anty-HER2 (np. przeciwciało anty-HER2 hamujące wzrost takie jak HERCEPTIN® lub przeciwciało anty-HER2, które indukuje apoptozę takie jak 7C2 lub 7F3; włączając ich odmiany humanizowane lub o dojrzałym powinowactwie); inhibitor transferazyfarnezylu; czynnik przeciw- angiogenetyczny (np., przeciwciało anty-VEGF); lek nakierowany na EGFR (np. C225 lub ZD1839); cytokina (np., IL-2, IL-12, G-CSF lub GM-CSF); lub kombinacje powyższych.
Dogodnymi dawkami każdego z powyższych współpodawanych czynników są te stosowane obecnie i mogą być zmniejszane dzięki połączonemu działaniu (synergii) czynnika i przeciwciała anty-ErbB2.
W celu zapobieżenia lub leczenia choroby odpowiednia dawka przeciwciała będzie zależała od rodzaju leczonej choroby, jak to określono powyżej, ciężkości i przebiegu choroby, zapobiegawczego lub leczniczego celu podawania przeciwciała, poprzedniego leczenia, historii klinicznej pacjenta wrażliwości na przeciwciało oraz rozwagi lekarza prowadzącego. Przeciwciało jest podawane pacjentowi w sposób odpowiedni, jednorazowo lub wielokrotnie. W zależności od rodzaju i ciężkości przebiegu około 1 pg/kg do 15 mg/kg (np. 0,1 - 20 mg/kg) przeciwciała stanowi wstępną proponowaną dawkę do podawania pacjentowi, czy też, na przykład, przez jedno lub więcej oddzielnych podań lub przez ciągłą infuzję. Typowa dawka dzienna może wahać się od 1 pg/kg do 100 mg/kg lub więcej, w zależności od czynników wspomnianych powyżej. Dla podań powtarzanych, w zależności od stanu, przez kilka dni lub dłużej, leczenie jest kontynuowane do momentu pojawienia się pożądanego zahamowania objawów choroby. Preferowana dawka przeciwciała będzie wynosiła w zakresie od około 0,05 mg/kg do około 10 mg/kg. Zatem, jedna lub więcej dawek wynosząca około 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg lub 10 mg/kg (lub każda ich kombinacja) może być podawana pacjentowi. Takie dawki mogą być podawane w sposób nieciągły, np., co tydzień lub co trzy tygodnie (np., w taki sposób, że pacjent otrzymuje od około dwóch do około dwudziestu, np. około sześciu dawek przeciwciała anty-ErbB2). Podana może być wyższa wstępna dawka obciążająca, po której następuje jedna lub więcej niższych dawek. Przykładowy tryb dawkowania obejmuje podanie wstępnej dawki obciążającej wynoszącej około 4 mg/kg, po której następuje tygodniowo utrzymywana dawka wynosząca około mg/kg przeciwciała anty-ErbB2. Jednakże, inne tryby dawkowania mogą być przydatne. Postęp tego leczenia w łatwy sposób jest monitorowany konwencjonalnymi technikami i oznaczeniami.
W szczególnym wykonaniu podawane jest rhuMAb 2C4 w ustalonej dawce 420 mg (równoważnej dawce 6 mg/kg dla osoby o masie 70 kg) przez 3 tygodnie. Leczenie może być rozpoczęte wyższą dawką obciążającą (np., 840 mg, równoważnej 12 mg/kg ciężaru ciała) w celu szybszego osiągnięcia stabilnego stężenia w surowicy. Specyficzne tryby dawkowania dostarczono także w Przykładach poniżej.
Poza podawaniem pacjentowi białka przeciwciała, niniejsza aplikacja uwzględnia podawanie przeciwciała metodą terapii genowej. Takie podawanie kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało jest objęte wyrażeniem „podawanie terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała. Patrz, na przykład, WO 96/07321 opublikowane 14 marca, 1996 dotyczące zastosowania terapii genowej do wytwarzania przeciwciał wewnątrz komórkowych.
PL 214 010 Β1
Istnieją dwa główne sposoby dostarczenia kwasu nukleinowego (opcjonalnie zawartego w wektorze) do komórek pacjenta; in vivo oraz ex vivo. Przy podawaniu in vivo, kwas nukleinowy jest wstrzykiwany bezpośrednio pacjentowi, zwykle w miejscu, w którym potrzebne jest przeciwciało. Przy leczeniu ex vivo, izolowane są komórki pacjenta, kwas nukleinowy jest wprowadzany do tych izolowanych komórek, po czym zmodyfikowane komórki są podawane pacjentowi bezpośrednio lub, na przykład zamykane w zawierających pory membranach, które są implantowane pacjentowi (patrz, np. Patent USA Nr 4892538 i 5238187). Istnie wiele różnych dostępnych technik do wprowadzania kwasów nukleinowych do żywych komórek. Techniki różnią się między sobą w zależności od tego, czy kwas nukleinowy przenoszony jest do hodowanych komórek in vitro lub in vivo do komórek przeznaczonego do tego celu gospodarza. Dogodne techniki do transferu kwasu nukleinowego do komórek ssaczych in vitro obejmują zastosowanie liposomów, elektroporacji, mikroiniekcji, fuzji komórek, dekstranu DEAE, sposobu precypitacji fosoforanem wapnia itd. Powszechnie stosowanym do dostarczania genu ex vivo wektorem jest retrowirus.
Obecnie preferowane techniki transferu kwasu nukleinowego in vivo obejmują transfekcję za pomocą wektorów wirusowych (takich, jak adenowirus, wirus herpes simplex I lub wirus towarzyszący adenowirusowi) oraz układów opartych na błonach (lipidami przydatnymi do transferu genu z udziałem lipidów są, na przykład DOTMA, DOPE i DC-Chol). W niektórych sytuacjach pożądane jest dostarczenie źródła kwasu nukleinowego wraz z czynnikiem skierowanym do komórek docelowych takim, jak przeciwciało specyficzne względem białka błony powierzchni komórkowej lub komórki docelowej, liganda dla receptora na komórce docelowej itd. W przypadku, gdy wykorzystywane sąliposomy, białka, które wiążą się z białkiem błonowej powierzchni komórkowej związanym z endocytozą, mogą być zastosowane do nakierowania i/lub ułatwiania pobierania, np. białek kapsydu lub ich fragmentów tropowych względem komórki szczególnego typu, przeciwciał dla białek przechodzącym internalizację w cyklu komórkowym oraz białek skierowanych do miejsc wewnątrzkomórkowych i wzmacniających okres półtrwania wewnątrzkomórkowego. Technika endocytozy z udziałem receptora opisana jest na przykład przez Wu i wsp., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); oraz Wagner i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Celem przeglądu znanych obecnie protokołów znakowania genów i terapii genowej patrz Anderson i wsp., Science, 256: 808-813 (1992). Patrz także WO 93/25673 oraz tutaj cytowane odnośniki.
Wyroby fabryczne
W wynalazku opisuje się także wyrób fabryczny zawierający materiały użyteczne do leczenia zaburzeń opisanych powyżej.
Wyrób fabryczny zawiera pojemnik i etykietę lub wkład do pakunku umieszczony na, lub dołączony do pojemnika. Dogodne pojemniki obejmują, na przykład butelki, fiolki, strzykawki itd. Pojemniki mogą być wytworzone z rozmaitych materiałów takich, jak szkło lub plastik. Pojemnik zawiera kompozycję skuteczną w leczeniu stanu chorobowego i może zawierać jałowe miejsce zapewniające dostęp (na przykład pojemnik może być torebką zawierającą roztwór dożylny lub fiolką zawierającą korek przekłuwany igłą do wstrzyknięć podskórnych). Co najmniej jednym związkiem czynnym w kompozycji jest przeciwciało anty-ErbB2. Etykietka lub wkład do pakunku wskazuje, że kompozycja jest stosowana do leczenia wybranego stanu chorobowego takiego, jak nowotwór. W jednym z wykonań, etykietka lub wkłady do pakunku wskazują, że kompozycja zawierająca przeciwciało wiążące ErbB2 może być zastosowany do leczenia pacjentów cierpiących na nowotwór, w którym stwierdzono obecność kompleksów HER2/HER1 i/lub HER2/HER3 i/lub HER2/HER4 i/lub wykryto fosforylację receptora ErbB. Co więcej, wyrób fabryczny może zawierać (a) pierwszy pojemnik z zawartą wewnątrz kompozycją, gdzie kompozycja obejmuje pierwsze przeciwciało, które wiąże ErbB2 i hamuje wzrost komórek nowotworowych, wykazujących nadekspresję ErbB2; oraz (b) drugi pojemnik z zawartą wewnątrz kompozycją, gdzie kompozycja zawiera drugie przeciwciało wiążące ErbB2 i blokujące aktywację receptora ErbB ligandem. Wyrób fabryczny w tym wykonaniu wynalazku może ponadto zawierać wkład do pakunku wskazujący, że kompozycje pierwszego i drugiego przeciwciała mogą być zastosowane do leczenia nowotworu charakteryzującego się obecnością heterodimerów HER2/HER1 i/lub HER2/HER3 i/lub HER2/HER4 i/lub fosforylacją receptora ErbB.
Co więcej, wkład do pakunku może instruować użytkownika kompozycji (zawierającej przeciwciało, które wiąże ErbB2 i blokuje aktywację receptora ErbB ligandem) co do łączenia leczenia z przeciwciałem i jakąkolwiek terapią pomocniczą opisaną w poprzednim rozdziale (np. czynnikiem chemoterapeutycznym, lekiem skierowanym przeciw EGFR, czynnikiem przeciwangiogenicznym, związkiem przeciwhormonalnym, związkiem kardioprotekcyjnym i/lub cytokiną).
PL 214 010 Β1
Alternatywnie lub dodatkowo, wyrób fabryczny może ponadto zawierać drugi (lub trzeci) pojemnik zawierający farmaceutycznie dopuszczalny bufor taki, jak bakteriostatyczna woda do zastrzyków (BWFI), roztwór soli w buforze fosforanowym, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Może ponadto zawierać inne składniki pożądane z punktu widzenia handlowego i stanowiska użytkownika, wliczając inne bufory, rozpuszczalniki, filtry, igły i strzykawki.
Przeciwciała mogą także być stosowane w testach diagnostycznych. Na ogół przeciwciała są wyznakowane w sposób opisany powyżej. Celem udogodnienia, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być dostarczone w zestawie, tj. spakowanym połączeniu odczynników w ustalonych z góry ilościach wraz z instrukcjami do przeprowadzania testu diagnostycznego. O ile przeciwciało wyznakowane jest enzymatycznie, zestaw będzie zawierał substraty i kofaktory wymagane do działania enzymu (np., prekursor substratu, który dostarcza wykrywalnego chromoforu lub fluoroforu). Dodatkowo, dołączone mogą być inne substancje dodatkowe takie, jak stabilizatory, bufory (np. bufor blokujący lub bufor lizujący) i tym podobne. Względne ilości rozmaitych odczynników mogą być bardzo zróżnicowane, w celu zapewnienia takich stężeń w roztworze odczynników, które znacząco optymalizują czułość oznaczenia. W szczególności, odczynniki mogą być dostarczone w postaci suchych proszków, zwykle liofilizowanych, łącznie z rozczynnikiem, który przy rozpuszczaniu będzie dostarczał roztwór odczynnika o odpowiednim stężeniu.
Materiały przedłożone
Następujące linie komórek hybrydomowych zostały przedłożone w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Nazwa przeciwciała Nr ATCC Data Przedłożenia
7C2 ATCC HB-12215 17 października, 1996
7F3 ATCC HB-12216 17 października, 1996
4D5 ATCC CRL 10463 24 maja, 1990
2C4 ATCC HB-12697 8 kwietnia, 1999
Powyższa pisemna specyfikacja uznana jest za wystarczającą, aby umożliwić specjaliście w tej
dziedzinie zastosowanie wynalazku w praktyce. Niniejszy wynalazek nie ma być ograniczony do zakresu przedłożonych konstruktów, jako, że przedłożone wykonania mają jedynie ilustrować pewne aspekty wynalazku i jakiekolwiek konstrukty funkcjonalnie równoważne, znajdują się w zakresie niniejszego wynalazku. Zawarte tu przedłożenie materiałów, nie tworzy dopuszczenia, że pisemny opis tu zawarty, jest niewystarczający do umożliwienia realizacji jakiegokolwiek aspektu wynalazku, wliczając jego najlepszy rodzaj, ani nie ma być interpretowany jako ograniczający zakres zastrzeżeń. Faktycznie, różne modyfikacje według wynalazku dodatkowe do przedstawionych i opisanych tutaj będą na podstawie powyższego opisu oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie i znajdują się w zakresie dołączonych zastrzeżeń.
Zrozumiałe jest, że zastosowanie pouczeń niniejszego wynalazku w przypadku specyficznego problemu lub sytuacji będzie w zakresie możliwości specjalisty w tej dziedzinie w świetle zawartych tu pouczeń.
Dalsze szczegóły wynalazku zilustrowane są za pomocą następujących, nie ograniczających Przykładów. Ujawnienia wszystkich cytacji w specyfikacji zawarte są w całości w postaci odnośników.
Przykład 1
Zależna od HRG asocjacja ErbB2 z ErbB3 jest blokowana przez przeciwciało monoklonalne 2C4 Mysie przeciwciało monoklonalne 2C4, swoiście wiążące zewnątrzkomórkową domenę ErB2 opisano w WO 01/89566, ujawnienie, którego jest tutaj w całości umieszczone w postaci odnośnika.
Zdolność ErbB3 do łączenia się ErbB2 testowano w eksperymencie ko-immunoprecypitacji. 1,0x106 komórek MCF7 lub SK-BR-3 hodowano na sześciostudzienkowych płytkach do hodowli tkankowych w pożywce 50:50 DMEM/HanTs F12 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10 mM HEPES, pH 7,2 (pożywka wzrostowa), i pozwalano im przywrzeć do podłoża przez noc. Komórki głodzono przez dwie godziny w pożywce hodowlanej bez surowicy przed rozpoczęciem eksperymentu.
Komórki krótko przemywano roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), a następnie inkubowano bądź z 100 nM wskazanego przeciwciała rozcieńczonego w 0,2% w/v bydlęcej albuminy osocza krwi (BSA), pożywce RRMI, z 10 mM HEPES, pH 7,2 (bufor wiążący), bądź z samym buforem wiążącym (kontrola). Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej, dodawano HGR do końcowego stężenia 5 nM do połowy studzienek (+). Podobną objętość buforu wiążącego dodawano do pozostałych studzienek (-). Inkubacje kontynuowano przez w przybliżeniu 10 minut.
PL 214 010 Β1
Nadsącz usuwano przez wysycanie, a komórki lizowano wRPMI, 10 mM HEPES, pH 7,2, 1% v/v TRITON Χ-100™, 1,0% w/v CHAPS (bufor lizujący), zawierający 0,2 mM PMSF, 10 pg/ml leupeptyny i 10 TU/ml aprotoniny. Lizaty oczyszczano z nierozpuszonego materiału przez wirowanie.
ErbB2 poddawano immunoprecypitacji z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego połączonego kowalencyjnie z żelem powinowactwa (Affi-Prep 10, Bio Rad). Przeciwciało to (Ab-3, Oncogene Sciences, USA) rozpoznaje epitop domeny cytoplazmatycznej. Immunoprecypitację przeprowadzono przez dodawanie 10 pi zawiesiny żelowej zawierającej w przybliżeniu 8,5 pg unieruchomionego przeciwciała, do każdego lizatu, a próbki mieszano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Żele były następnie zbierane przez wirowanie. Żele przemywano porcjami, trzykrotnie, buforem lizującym w celu usunięcia materiału niezwiązanego. Następnie, dodawano próbkę buforu SDS i próbki krótko ogrzewano w łaźni z wrzącą wodą.
Supernatanty puszczano na 4-12% żelach poliakrylamidowych i elektroforetycznie przenoszono na błony nitrocelulozowe. Obecność ErbB3 była ustalana przez sondowanie biotów poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw epitopowi jego domeny cytoplazmatycznej (c-17, Santa Cruz Biotech). Bioty uwidaczniano przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego (ECL, Amersham).
Jak widać na ścieżkach kontrolnych na Fig. 2A i 2B odpowiednio dla komórek MCF7 i SK-BR-3, ErbB3 obecne było w immunoprecypitacie ErbB2 tylko w przypadku, gdy komórki stymulowano HRG. Jeśli komórki były najpierw inkubowane z monoklonalnym przeciwciałem 2C4, sygnał ErbB3 w komórkach MCF7 był zniesiony (Fig. 5A, ścieżka 2C4+) lub znacząco zredukowany w komórkach SK-BR-3 (Fig. 5B, ścieżka 2C4+). Jak pokazano na Fig. 2A-B, monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje zależne od hereguliny łączenie się ErbB3 z ErbB2 zarówno w komórkach MCF-7, jak i SK-BR-3 znacząco bardziej skutecznie niż HERCEPTIN®. Preinkubacja z HERCEPTIN® obniża sygnał ErbB3 w lizatach MCF-7, ale ma niewielki lub nie ma żadnego, wpływ na ilość współwytrąconego ErbB3 z lizatów SK-BR-3. Preinkubacja z przeciwciałem skierowanym przeciw receptorowi EGF (Ab-1, Oncogen Sciences, USA) nie miała żadnego wpływu na zdolność ErbB3 do współwytrącania się z ErbB2 w każdej z linii.
P rzy kład 2
Modele wrażliwości linii komórkowych i heteroprzeszczepów ludzkich nowotworów na 2C4
W przybliżeniu 40 modeli nowotworów zostało przebadanych pod względem wrażliwości na 2C4. Modele te stanowią reprezentację głównych nowotworów takich, jak nowotwór piersi, płuc, prostaty oraz okrężnicy. 50-60% modeli jest wrażliwych na leczenie 2C4. Tabela 1 poniżej przedstawia listę wybranych modeli nowotworowych badanych pod względem wrażliwości na 2C4. W skrócie, fragmenty heteroprzeszczepów ludzkich nowotworów o rozmiarze około 3 mm przeszczepiano pod skórę nie posiadających grasicy obnażonych myszy. Alternatywnie, ludzkie komórki nowotworowe wyhodowane in vitro odłączano od powierzchni szalek hodowlanych, ponownie zawieszano w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej i podskórnie wstrzykiwano do boku myszy o upośledzonej odporności. Wzrost nowotworu sprawdzano, co 2 do 3 dni przy zastosowaniu elektrycznego cyrkla. Kiedy nowotwór osiągnął rozmiar około 30 do 100 mm, zwierzęta losowo przydzielano do różnych grup poddawanych leczeniu i kontrolnych, 2C4 podawano za pomocą zastrzyku dootrzewnowego jednokrotnie każdego tygodnia. Zwierzęta kontrolne otrzymywały jednakowe objętości roztworu cieczy nośnej niezawierającej żadnych przeciwciał w ten sam sposób, jak grupy doświadczalne. Badanie kończono po w przybliżeniu 3-6 tygodniach, kiedy nowotwory grupy kontrolnej osiągały rozmiar około 1000-1500 mm3. Wrażliwość na leczenie definiowano jako redukcję objętości nowotworu o >50%.
Tabela 1: Modele heteroprzeszczepów
Model # Model nowotworu Wrażliwość na 2C4 Referencje
1 2 3 4
1 LXFA 289 Nie (Fiebig i wsp., 1999)
2 LXFA 297 Tak
3 LXFA 526 Nie (Fiebig i wsp., 1999)
4 LXFA 629 Tak (Fiebig i Burger, 2002)
5 LXFA 1041 Nie
6 LXFE 211 Nie (Fiebig i wsp., 1999)
PL 214 010 Β1 cd. tabeli 1
1 2 3 4
7 LXFE 397 Nie (Fiebig i wsp., 1999)
8 LXFL 529 Nie (Burger i wsp., 2001)
9 LXFL 1072 Tak (Fiebig i wsp., 1999)
10 Calu-3 Tak (Stein i wsp., 2001)
11 NCI-H522 Tak (Yamori i wsp., 1997)
12 NCI-H322 Nie (Zou i wsp., 2001)
13 NCI-H441 (KAM) Tak (Gridley i wsp., 1996)
14 MAXF ΜΧ1 Nie
15 MAXF 401 Nie (Fiebig i wsp., 1999)
16 MAXF 449 Tak (Burger i wsp., 2001)
17 MAXF713 Nie (Berger i wsp., 1992)
18 MAXF 857 Nie (Fiebig i wsp., 1999)
Modele stanowią reprezentację dwóch głównych rodzajów nowotworu, mianowicie niedrobnokomórkowego nowotworu płuc (NSCLC; modele #1-13) oraz nowotworu sutka (modele #14-18). Dziewięć spośród modeli NSCLC (#1-9) oraz wszystkie modele nowotworu piersi otrzymano drogą seryjnych pasaży in vivo fragmentów ludzkich nowotworów w myszach cierpiących na niedobór odporności. Pozostałe modele NSCLC (#10-13) są modelami opartymi na komórkach, w których wzrost nowotworu in vivo wywoływany jest przez wszczepienie reprodukowanych in vitro komórek do myszy obniżonej odporności.
Berger, D. P., Winterhalter, B. R. i Fiebig, Η. H. (1992). Establishment and Characterization of Humań Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nudę Mice. W Immunodeficient Mice in Oncology, Η. H. Fiebig i D. P.Berger, wyd. (Basel: Karger), str. 23-46.
Burger, A.M., Hartung, G., Stehle, G., Sinn, H. i Fiebig, Η. H. (2001). Pre-clinical evaluation of methotrexate-albumin conjugate (ΜΤΧ-HSA) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Cancer, 92: 718-24.
Fiebig, Η. H. i Burger, A.M. (2002). Human Tumor Xenografts and Explants. W Tumor Models in Cancer Research, B.A. Teicher, wyd. (Totowa, New Jersey: Humana Press), str. 113-137.
Fiebig, Η. H., Dengler, W. A. i Roth, T. (1999). Human Tumor Xenografts: Predicitivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents. W Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Η. H. Fiebig i A. M. Burger, wyd. (Basel: Karger), str. 29-50.
Gridley, D. S., Andres, M. L., Garner, C., Mao, X. W. i Slater, J. M. (1996). Evaluation of TNFalpha effects on radiation efficacy in a human lung adenocarcinoma model. Oncol Res., 8:485-95.
Stein, R., Govindan, S. V., Chen, S., Reed, L., Spiegelman, H., Griffiths, G. L., Hansen, H. J. i Goldenberg, D. M. (2001). Successful therapy of a human lung cancer xenograft using Mab RS7 labeled with residualizing radioiodine. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 39:173-80.
Yamori, T., Sato, S., Chikazawa H. i Kadota, T. (1997). Anti-tumor efficacy of paclitaxel against human lung cancer xenografts. Jpn. J. Cancer Res., 88:1205-10.
Zou, Y., Wu, Q. P., Tansey, W., Chow, D., Hung, M. C., Charnsangavej, C., Wallace, S. i Li, C. (2001). Effictiveness of water soluble poly(L-glutamic acid)- camptothecin conjugate against resistant human lung cancer xenografted in nudę mice. Int. J. Oncol., 18:331 -6.
P rzy kład 3
Wykrywanie heterodimerów w nowotworach wrażliwych na 2C4 za pomocą immunoprecypitacji
Nowotwory wrażliwe i niewrażliwe na 2C4 poddawano immunoprecypitacji z przeciwciałami antyErbB3 w celu oznaczenia obecności heterodimerów ErbB2-ErbB3 i EGFR- ErbB2. O ile nie jest to zaznaczone inaczej, sposoby stosowane były według Maniatis T. i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.
Wybierano przeciwciała anty-HER2, anty-HER3 i anty- HER1 nie reagujące krzyżowo. W celu ustalenia czy przeciwciała reagują krzyżowo, receptory HER1, HER2, HER3 i HER4 poddawano ekspresji w ludzkich embrionalnych komórkach nerki 293 (HEK). Komórki lizowano przy zastosowaniu
PL 214 010 Β1
Triton™ Χ100 (1% ciężaru na objętość) zawierający bufor HEPES (pH 7,5). W przybliżeniu 20 pg całkowitego białka komórkowego z komórek kontrolnych oraz komórek wykazujących ekspresję HER1, HER2, HER3 i HER4 rozdzielano w żelu SDS i przenoszono na błonę nitrocelulozową za pomocą procedury półsuchego transferu na filtr. Po zablokowaniu żelatyną, rozmaite przeciwciała anty-HER1, anty-HER2 i anty-HER3 testowano pod kątem ich zdolności do krzyżowego reagowania z innymi receptorami ErbB. Przeciwciała wybrane do zastosowania w doświadczeniach opisanych poniżej nie wykazywały żadnej znaczącej reaktywności krzyżowej.
Świeże próbki nowotworu rozbijano mechanicznie na lodzie i poddawano lizie w buforze zawierającym 50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCI, 1,5 mM MgCI2, 1 mM EDTA, 10% (masa/objętość) glicerol, 1% (masa/objętość) Triton™X-100, 1 mM PMSF, 10 pg/ml aprotyniny i 0,4 mM ortowanadanu. Całkowicie zlizowane nowotwory poddane były kilkukrotnemu wirowaniu do momentu, gdy supernatanty były całkowicie klarowne. Immunoprecypitacja zachodziła przez połączenie klarownych lizatów nowotworów (5-7 mg białka na lizat), 5 pg przeciwciała anty-ErbB2 (ab-3, mysie monoklonalne; Kat. OP15, Oncogene Inc., USA) i 50 pi agarozy związanej z białkiem G w 1,5 ml probówkach Eppendorfa. Po dodaniu od jednej do podwójnej objętości 50 mM buforu HEPES, pH 7,5 zawierającego 0,1% (masa/objętość) Triton Χ-100, probówki były wytrząsane przez 3-4 godziny w 4°C, po czym poddawane odwirowywaniu. Osad płukano dwa do trzech razy 500 pi 50 mM buforu HEPES o pH 7,5 zawierającym 0,1% (masa/objętość) Triton™X-100. Do przepłukanych osadów dodawano równą objętość próbki buforu 2x Lammli, po czym próbki ogrzewano przez 5 minut w 95°C. Próbki poddawano rozdziałowi za pomocą SDS- PAGE i przenoszono na błonę nitrocelulozową. Obecność heterodimerów EGFR-ErbB2 oraz ErbB2-ErbB3 była oceniana przez sondowanie filtrów przeciwciałami skierowanymi przeciw EGFR (królicze poliklonalne przeciwciało przeciw EGFR, Upstate., USA; Cat. 06-847) i ErbB3 (poliklonalne przeciwciało przeciw ErbB3; Santa Cruz Inc., USA; Cat. SC-285). Wyznakowane peroksydazą (POD) przeciwciało przeciw króliczemu Fe (BioRad Laboratories Inc. USA) było stosowane jako przeciwciało drugorzędowe. Filtry były uwidaczniane przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego (ECL plus, Amersham).
Rysunek 3 przedstawia wyniki tych doświadczeń. Widoczna jest obecność heterodimerów ErbB2-ErbB3 i/lub EGFR-ErbB2. Zaobserwowano korelację pomiędzy wrażliwością na 2C4, co przedstawiono w Tabeli 1, a obecnością heterodimerów ErbB2-ErbB3 i/lub EGFR-ErbB2.
P rzy kład 4
Korelacja pomiędzy wrażliwością na rhuMAb 2C4 a fosforylacją HER2
Wpływ rhuMab 2C4 na wzrost nowotworu badano na 14 ludzkich nowotworach przeszczepionych do myszy (9 nowotworów płuc i 5 nowotworów piersi). Przeszczep nowotworu i leczenie przeprowadzano w sposób opisany w Przykładzie 2. Heterodimery HER2 wykrywano w sposób opisany w Przykładzie 3.
Fosforylacja HER2 była oceniana przez immunoprecypitację HER2 i analizę Western biot. Wynik pozytywny określano przez stwierdzenie prążka fosfo-HER2 na żelu. Wynik negatywny był określany przez stwierdzenie braku obecności prążka. Fosforylacja HER2 była potwierdzana immunohistochemicznie przy zastosowaniu fosfo-specyficznego przeciwciała anty-HER2 (clone PN2A, Thor i wsp., J. Clin. Oncol., 18:3230-9 (2000)).
W 5 spośród badanych nowotworach (3 nowotwory płuca i 2 piersi), obserwowano znaczące zahamowanie wzrostu nowotworu, co korelowało z obecnością wykrywalnych heterodimerów HER2 zHER1 lub HER3 oraz z silną fosforylacją HER2 we wszystkich przypadkach. W 9 nowotworach, w których nie obserwowano znaczącej wrażliwości na leczenie rhuMab 2C4, nie wykryto heterodimerów i brak było fosforylacji HER2. Obecność heterodimeryzacji HER2 lub znaczącej fosforylacji HER2 jest istotnym prognostykiem wrażliwości na leczenie rhuMab 2C4 w modelach nieklinicznych. Podobne obserwacje poczyniono w przypadku heteroprzeszczepów wytworzonych z linii komórek nowotworowych.
P rzy kład 5
Wykrywanie fosforylacji HER2 w nowotworach wrażliwych na 2C4
Skuteczność rhuMAb 2C4 oceniana była w dziewięciu ustalonych modelach heteroprzeszczepów nowotworów niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC) (LXFE 211, LXFA 289, LXFA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFL 529, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Frieburg, Niemcy). Heteroprzeszczepy ludzkich nowotworów uważane są za najbardziej stosowne modele dla rozwoju leków przeciwnowotworowych, ponieważ nowotwory pacjentów hodowane są w postaci stałej, wykształcają zrąb, układ naczyń, wykazują martwicę części środkowej oraz różnicowanie w zewnętrz
PL 214 010 Β1 nej części. Ponadto, modele heteroprzeszczepów nowotworowych bardzo przypominają pierwotne nowotwory pod względem histologii i chemowrażliwości.
Zahamowanie wzrostu oceniano w sposób opisany w Przykładzie 2. Znacząca aktywność hamowania wzrostu była określana jako >50% hamowania wzrostu w grupie doświadczalnej względem grupy kontrolnej. W trzech spośród modeli NSCLC (LXFA 297, LXFA 629 oraz LXFL 1072) obserwowano znaczącą wrażliwość na leczenie rhuMab 2C4 przejawiającą się hamowaniem wzrostu. Kilka właściwości aktywowanego ligandem HER2 było także badanych na poziomie białka. Jak pokazano na Rysunku 4, HER2 mógł być immunoprecypitowany z ekstraktów nowotworowych w ośmiu spośród dziewięciu nowotworów NSCLC. W celu określenia stanu zaktywowania HER2, bioty te były następnie sondowane przeciwciałem przeciw fosfotyrozynie (anty-PY). Jak przedstawiono w niższej części Rysunku 4, trzy wrażliwe nowotwory (LXFA 297, LXFA 629 oraz LXFL 1072) wykazywały silną aktywację HER2.
Przykład 6
Badanie kliniczne mające na celu rozpoznanie pacjentów z nowotworem płuc nadających się do leczenia rhuMab 2C4 przez wykrywanie heterodimerów HER2
Pacjent rozpoznawany jest, jako mający niedrobnokomórkowy nowotwór płuc (NSCLC) wrażliwy na leczenie rhuMab 2C4, o ile okaże się, że nowotwór pacjenta zawiera kompleksy HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4.
Próbka nowotworu pozyskiwana jest metodą biopsji lub podczas chirurgicznej resekcji nowotworu. Próbka jest następnie analizowana pod względem obecności heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4.
Komórki nowotworu lub lizaty komórek poddawane są kontaktowi z eTag™, który specyficznie wiąże HER2. eTag™ zawiera wykrywalną domenę oraz pierwszą domenę wiążącą która jest specyficzna względem HER2. Wykrywalna domena połączona jest z pierwszą domeną wiążącą za pomocą możliwego do przecięcia łącznika. Po upływie czasu przeznaczonego na wiązanie, nadmiar eTag™ jest usuwany.
Komórki nowotworu lub lizaty komórek poddawane są kontaktowi z drugim związkiem wiążącym, który specyficznie wiąże HER1 lub HER3 lub HER4. Związek niezwiązany usuwany jest przez płukanie.
Następnie aktywowany jest drugi związek wiążący. Jeśli pierwszy związek wiążący oraz drugi związek wiążący znajdują się w dużej bliskości, zaktywowany drugi związek wiążący przecina możliwy do przecięcia łącznik w eTag™, z wytworzeniem wolnej wykrywalnej domeny. Stwierdzenie w próbce wolnej wykrywalnej domeny wskazuje na to, że nowotwór zawiera heterodimery HER2/HER1 lub HER2/HER3 lub HER2/HER4.
Po stwierdzeniu, że pacjent cierpi na nowotwór zawierający heterodimery HER2/HER1 i/lub HER2/HER3 i/lub HER2/HER4, dożylnie (IV) podaje się rhuMab 2C4 co tydzień lub co trzy tygodnie w dawce odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, do momentu postępu choroby. Przeciwciało jest dostarczane w formie wielodawkowego płynnego preparatu (napełnionego w 20 mL w stężeniu 20 mg/mL lub wyższym). Pierwszorzędowe punkty końcowe dla skuteczności obejmują tempo odpowiedzi oraz bezpieczeństwo. Drugorzędowe punkty końcowe obejmują: ogólne przeżycie, czas do postępu choroby, jakość życia i/lub czas trwania odpowiedzi.
Przykład 7
Badanie kliniczne mające na celu rozpoznanie pacjentów nowotworowych nadających się do leczenia rhuMab 2C4
Próbka biologiczna zawierająca komórki nowotworu, pozyskiwana jest od osób, będących kandydatami do leczenia, np. metodą biopsji tkanki nowotworu, odessania komórek nowotworowych z płynu puchlinowego lub jakiegokolwiek innego sposobu znanego w praktyce klinicznej. Próbka biologiczna analizowana jest pod względem fosforylacji HER2, np. przez immunoprecypitację oraz analizę Western biot i/lub pod względem obecności heterodimerów HER2/HER3, HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 jakąkolwiek spośród technik opisanych powyżej. Osoby, których próbki biologiczne okazały się pozytywne pod względem fosforylacji HER2 i/lub obecności heterodimerów HER2/HER3, HER2/HER1 i/lub HER2/HER4, prawdopodobnie wykazują większą wrażliwość na leczenie za pomocą rhuMab 2C4 niż pacjenci, których próbki nowotworów nie wykazały fosforylacji HER2, lub w których nie wykryto żadnego heterodimeru.
Na przykład, osoby, u których zdiagnozowano nowotwór jajnika poddane zostaną biopsji tkanki nowotworowej lub odsysaniu komórek nowotworowych z płynu puchlinowego. Tkanka ta będzie analizowana pod względem fosforylacji HER2 metodą immunoprecypitacji i analizy Western biot. Wymaga to minimum 250 mg tkanki nowotworu.
PL 214 010 Β1
Po stwierdzeniu, że pacjent cierpi na nowotwór (taki, jak nowotwór prostaty oporny na kastrację - CRPC lub nowotwór jajnika), który jest pozytywny pod względem fosforylacji HER2, pacjent otrzyma obciążającą dawkę 840 mg rhuMab 2C4 1 dnia pierwszego cyklu (pierwszy 21 dniowy kres leczenia), po czym 420 mg 1 dnia każdego następnego 21 dniowego cyklu, w formie ciągłej dożylnej infuzji. Leczenie kontynuowane jest przez dożylne infuzje co trzy tygodnie przez okres do jednego roku (17 cykli) u pacjentów, u których nie stwierdza się postępu choroby. Leczenie może zostać przerwane wcześniej w którymkolwiek momencie z powodu braku wrażliwości, szkodliwych działań ubocznych lub z innych powodów, pod kontrolą i rozwagą lekarza.
39766-0114PCseq.txt
WYDRUK SEKWENCJI <110> Genenrech, inc.
Koli, Hans
Bossenmaier, Birgit
Muller, Hans-Joachim sliwkowski, Mark Kelsey, Stephen <120;Sposoby identyfikowania nowotworów, które są wrażliwe na leczenie przeciwciałami anty-ErbB <130> 39766-0114PC <150> US 60/396,290 <151> 2002-07-15 <150> US 60/480,043 <151> 2003-06-20 <160> 6 <170> FastSEQ dła Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 1
ASp Thr Val Met Thr Gin Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser val Gly
1 5 10 15
ASp Arg val ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp val Ser 30 Ile Gly
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Ł. J Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg phe Thr Gly
50 55 60
ser Gly Ser Gly Thr ASD Phe Thr Phe Thr ile Ser Ser Val Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Tyr ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 2
Glu val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
ser val L/s Ile Ser cys Lys Ala 5er Gly phe Thr Phe Thr ASp Tyr
20 25 30
Thr Met ASp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly ASP val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Arg Phe
50 55 60 Ile val
Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr val Asp Arg Ser Ser Arg Tyr
Page 1
PL 214 010 Β1
39766-O114PCseq.txt
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr val Ser ser
115
<210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 3
Asp ile Gin Met Thr Gin Ser pro ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15
ASp Arg val Thr Ile Thr Cys Lys Ala oc Ser Gin Asp val ser a Λ Ile Gly
val Ala Trp Tyr Gin G1 n Lys pro Ir J Gly Lys Ala Pro Lys JU Leu Leu Ile
3S 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly val Pro ser Arg Phe ser Gly
50 55 60
ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr ας Tyr Tyr cys G1 n Gin on Tyr Tyr Ile Tyr Pro qc Tyr
Thr Phe Gly Gin O J Gly Thr Lys val G1 u -7 U Ile Lys
100 105 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 4
G1 u Val Gin Leu val G1 u Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Thr ASp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe ASp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu val Thr Val Ser Ser
115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 5
Asp Ile Gin Met Thr Gin ser Pro ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly
10 15
PL 214 010 Β1
val Ile 397 66-0 114P Cseq . txt
Asp Arg Thr Thr Cys Arg Ala Ser Gin ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Asn Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu Ile Lys
100 105 <210> 6 <21L> 119 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 6
Glu val G1 n Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val
35 40 45
Ala val ile ser Gly Asp Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr ser Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu val Thr val Ser Ser 115

Claims (6)

1. Rekombinowane humanizowane przeciwciało 2C4 (rhuMAb 2C4) do zastosowania w sposobie leczenia raka jajnika, raka sutka, raka płuc, lub raka gruczołu krokowego, przy czym rhuMAb 2C4 zawiera sekwencje aminokwasowe zmienną lekką i zmienną ciężką odpowiednio o SEQ ID nr 3 i 4, oraz sekwencję lekką i sekwencję ciężką regionu stałego ludzkiej lgG1 (allotypu nie-A) i przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w stałej dawce 420 mg co trzy tygodnie.
2. Rekombinowane humanizowane przeciwciało do zastosowania według zastrz. 1, znamienne tym, że rhuMAb 2C4 ulega ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO).
3. Rekombinowane humanizowane przeciwciało do zastosowania według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w dawce wysycającej 840 mg na początku leczenia.
4. Zastosowanie rekombinowanego humanizowanego przeciwciała 2C4 (rhuMAb 2C4) do wytwarzania leku do leczenia raka jajnika, raka sutka, raka płuc, lub raka gruczołu krokowego, przy czym rhuMAb 2C4 zawiera sekwencje aminokwasowe zmienną lekką i zmienną ciężką odpowiednio o SEQ ID nr 3 i 4, oraz sekwencję lekką i sekwencję ciężką regionu stałego ludzkiej lgG1 (allotypu nie-A) i przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w stałej dawce 420 mg co trzy tygodnie.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że rhuMAb 2C4 ulega ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO).
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że lek jest do leczenia raka, przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w dawce wysycającej 840 mg na początku leczenia.
PL377743A 2002-07-15 2003-07-11 Rekombinowane humanizowane przeciwcialo 2C4 i zastosowanie tego przeciwciala PL214010B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39629002P 2002-07-15 2002-07-15
US48004303P 2003-06-20 2003-06-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL377743A1 PL377743A1 (pl) 2006-02-20
PL214010B1 true PL214010B1 (pl) 2013-06-28

Family

ID=30118578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL377743A PL214010B1 (pl) 2002-07-15 2003-07-11 Rekombinowane humanizowane przeciwcialo 2C4 i zastosowanie tego przeciwciala

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20040106161A1 (pl)
EP (2) EP2263691B1 (pl)
JP (3) JP5069843B2 (pl)
CN (2) CN101711866A (pl)
AT (1) ATE535254T1 (pl)
AU (2) AU2003273218C1 (pl)
BR (1) BR0312534A (pl)
CA (1) CA2490758C (pl)
CY (2) CY1112631T1 (pl)
DK (2) DK2263691T3 (pl)
ES (2) ES2376165T3 (pl)
HK (1) HK1082687A1 (pl)
HU (1) HUP0600340A3 (pl)
IL (2) IL165952A (pl)
MX (1) MXPA05000403A (pl)
NO (1) NO337855B1 (pl)
NZ (1) NZ537660A (pl)
PL (1) PL214010B1 (pl)
PT (2) PT1585966E (pl)
RU (2) RU2338751C2 (pl)
WO (1) WO2004008099A2 (pl)

Families Citing this family (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
US7625859B1 (en) * 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
DK1282443T3 (da) 2000-05-19 2010-01-04 Genentech Inc Gendetektionsassay til at forbedre sandsynligheden for et effektivt respons på en ErbB-antagonist cancerterapi
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20090111127A1 (en) * 2002-05-21 2009-04-30 Monogram Biosciences Inc. Surface Receptor Complexes as Biomarkers
US20040229294A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
CA2521082A1 (en) * 2003-04-01 2004-10-28 Monogram Biosciences, Inc. Surface receptor complexes as biomarkers
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
US20100291594A1 (en) * 2003-07-17 2010-11-18 Laboratory Corporation Of America Holdings ErbB Surface Receptor Complexes as Biomarkers
WO2005019470A2 (en) * 2003-08-11 2005-03-03 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
EP1681983A4 (en) 2003-10-14 2008-12-10 Monogram Biosciences Inc RECEPTOR TYROSINE KINASE SIGNAL PATH ANALYSIS FOR DIAGNOSIS AND THERAPY
US7329495B2 (en) 2004-06-09 2008-02-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Mutations in KIT confer imatinib resistance in gastrointestinal stromal tumors
SV2006002143A (es) * 2004-06-16 2006-01-26 Genentech Inc Uso de un anticuerpo para el tratamiento del cancer resistente al platino
JP2008507520A (ja) 2004-07-22 2008-03-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ２抗体組成物
EP1807106A2 (en) * 2004-10-05 2007-07-18 Oregon Health and Science University Compositions and methods for treating disease
US20080261243A1 (en) * 2004-10-06 2008-10-23 Wellstat Biologics Corporation Detection of Elevated Levels of Her-2/Neu Protein on Circulating Cancer Cells and Treatment
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006045991A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Astrazeneca Ab Method to predict whether a tumor will react to a chemotherapeutic treatment
ZA200704796B (en) * 2004-12-07 2008-11-26 Genentech Inc Selecting patients for therapy with a HER inhibitor
CN102580084B (zh) 2005-01-21 2016-11-23 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药
CN103251946A (zh) * 2005-02-23 2013-08-21 健泰科生物技术公司 使用her二聚化抑制剂在癌症患者中延长病情进展前时间或存活
WO2006096861A2 (en) * 2005-03-08 2006-09-14 Genentech, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS RESPONSIVE TO TREATMENT WITH HER DIMERIZATION INHIBITORS (HDIs)
JP2006316040A (ja) 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）補助療法
MY157955A (en) * 2005-07-06 2016-08-30 Hoffmann La Roche Detection of a target antigen irrespective of the presence or absence of a corresponding therapeutic antibody
PE20070207A1 (es) 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
US7700299B2 (en) * 2005-08-12 2010-04-20 Hoffmann-La Roche Inc. Method for predicting the response to a treatment
CA2646497A1 (en) * 2006-04-18 2007-10-25 Wellstat Biologics Corporation Detection of circulating endothelial cells
WO2007121465A2 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Wellstat Biologics Corporation Detection of proteins from circulating neoplastic cells
CN101478998B (zh) * 2006-06-27 2012-02-08 旭化成株式会社 生物学液体处理用基材
BRPI0717416A2 (pt) 2006-09-21 2013-11-12 Prometheus Lab Inc Método para realizar um imunoensaio complexo de alta produtividade, e, arranjo
WO2008104183A2 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
SI2132573T1 (sl) * 2007-03-02 2014-07-31 Genentech, Inc. Napovedovanje odziva na inhibitor dimerizacije HER na osnovi nizke ekspresije HER3
WO2008150485A2 (en) * 2007-05-29 2008-12-11 Wyeth Erbb2 binding proteins and use thereof
US20090304590A1 (en) * 2007-05-29 2009-12-10 Wyeth Therapeutic compositions and methods
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
ES2583377T3 (es) 2007-06-08 2016-09-20 Genentech, Inc. Marcadores de expresión génica de la resistencia tumoral al tratamiento con inhibidor de HER2
ES2526211T3 (es) * 2007-07-13 2015-01-08 Nestec S.A. Selección de fármacos para la terapia del cáncer de pulmón utilizando matrices basadas en anticuerpos
RU2491095C2 (ru) * 2007-11-09 2013-08-27 Новартис Аг Применения анти-cd40-антител
US8975382B2 (en) 2007-11-27 2015-03-10 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against HER2 and polypeptides comprising the same for the treatment of cancers and/or tumors
CA2711843C (en) 2007-12-20 2018-11-13 Laboratory Corporation Of America Holdings Her-2 diagnostic methods
CN101932333A (zh) 2007-12-26 2010-12-29 瓦西尼斯公司 抗c35抗体联合疗法和方法
US20140127200A1 (en) * 2008-01-03 2014-05-08 The Scripps Research Institute Multispecific Antibody Targeting and Multivalency Through Modular Recognition Domains
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
NZ617520A (en) 2008-02-25 2015-05-29 Nestec Sa Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
JP5800454B2 (ja) * 2008-05-23 2015-10-28 株式会社ノエビア 皮膚外用剤、経口剤、抗酸化剤、抗老化剤、及び免疫賦活剤
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
EP2313780B1 (en) 2008-07-08 2015-05-20 George Mason Research Foundation, Inc. Phosphorylated c-erbb2 as a superior predictive theranostic marker for the diagnosis and treatment of cancer
MX367196B (es) * 2008-08-05 2019-08-08 Alm Holding Co Proceso para el reciclamiento frio en el sitio utilizando asfalto en espuma y aditivo de lubricacion.
AU2009287163B2 (en) 2008-08-29 2014-11-13 Les Laboratoires Servier Recombinant anti-Epidermal Growth Factor Receptor antibody compositions
SG177252A1 (en) 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
KR20110120890A (ko) * 2009-01-15 2011-11-04 래버러토리 코포레이션 오브 아메리카 홀딩스 Ｈｅｒ－２ 발현의 측정에 의한 환자 반응의 결정 방법
CN102460152B (zh) 2009-01-15 2014-11-26 美国控股实验室公司 通过测量Her-3确定患者反应的方法
SG174378A1 (en) 2009-03-20 2011-10-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
NZ616755A (en) * 2009-05-14 2015-05-29 Nestec Sa Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
CA2761280A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
JP5795311B2 (ja) 2009-07-15 2015-10-14 ネステク ソシエテ アノニム 抗体ベースのアレイを使用する胃癌療法のための薬物選択
EP2536748B1 (en) 2010-02-18 2014-08-20 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
WO2012009705A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Zyngenia, Inc. Ang-2 binding complexes and uses thereof
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US9155802B2 (en) * 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
WO2012069466A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Novartis Ag Multispecific molecules
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
US9719995B2 (en) 2011-02-03 2017-08-01 Pierian Holdings, Inc. Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling
WO2012162561A2 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
CA2842375A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Erica Jackson Neuregulin antibodies and uses thereof
KR101851425B1 (ko) 2011-09-02 2018-04-23 네스텍 소시에테아노님 치료 효능 결정을 위한 신호 경로 단백질의 프로파일링
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
ES2694153T3 (es) 2011-09-30 2018-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos anti-ErbB3 y usos de los mismos
WO2013052745A1 (en) * 2011-10-06 2013-04-11 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Predicting tumor response to anti-erbb3 antibodies
AU2012322797B2 (en) 2011-10-14 2016-04-21 Genentech, Inc. Uses for and article of manufacture including HER2 dimerization inhibitor Pertuzumab
US9327023B2 (en) 2011-10-25 2016-05-03 The Regents Of The University Of Michigan HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells
CN104093743B (zh) 2011-11-23 2018-04-24 医学免疫有限责任公司 特异于her3的结合分子及其用途
RU2014126098A (ru) 2011-11-30 2016-01-27 Дженентек, Инк. МУТАЦИИ ErbB3 ПРИ РАКЕ
WO2013083810A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of non-responders to her2 inhibitors
WO2013148315A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
AU2013255537B2 (en) 2012-05-02 2018-02-15 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
TWI641619B (zh) 2012-06-25 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
EP2719706A1 (en) 2012-10-15 2014-04-16 Universität Zürich Bispecific HER2 ligands for cancer therapy
AU2013331763B2 (en) 2012-10-15 2018-02-15 Universitat Zurich Bispecific HER2 ligands for cancer therapy
CN104813168B (zh) 2012-11-30 2017-10-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 需要pd‑l1抑制剂综合疗法的患者的鉴定
US10150800B2 (en) 2013-03-15 2018-12-11 Zyngenia, Inc. EGFR-binding modular recognition domains
WO2014165855A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Laboratory Corporation Of America Holdings Systems and methods for facilitating diagnosis, prognosis and treatment of cancer based on detection of her3 activation
CN105121471A (zh) 2013-04-16 2015-12-02 豪夫迈·罗氏有限公司 帕妥珠单抗变体及其评估
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
EP3087394A2 (en) 2013-12-27 2016-11-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
WO2015157634A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb antibodies and methods of use thereof
WO2015164665A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Genentech, Inc. Methods of treating early breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1 and pertuzumab
CN105985435B (zh) * 2015-01-30 2019-10-15 嘉和生物药业有限公司 全人源her2抗体的突变抗体及其编码基因和应用
JP6822980B2 (ja) 2015-05-30 2021-01-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｈｅｒ２陽性転移性乳癌の治療方法
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
WO2017087280A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive cancer
JPWO2017141987A1 (ja) * 2016-02-19 2018-12-06 コニカミノルタ株式会社 実験動物検体を定量評価することを特徴とする、非臨床試験方法
US20190151346A1 (en) 2016-05-10 2019-05-23 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
US10377833B2 (en) 2016-07-22 2019-08-13 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Bispecific anti-HER2 antibody
CN107446045A (zh) 2016-07-22 2017-12-08 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗her2的抗体、其药物组合物及用途
AU2017355432A1 (en) 2016-11-04 2019-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of HER2-positive breast cancer
CN110099926A (zh) 2016-12-28 2019-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 晚期her2表达性癌症的治疗
CN110167594B (zh) 2017-01-17 2023-11-21 豪夫迈·罗氏有限公司 皮下her2抗体配制剂
KR20230144110A (ko) 2017-03-02 2023-10-13 제넨테크, 인크. Her2-양성 유방암 어쥬번트 치료
EP3615695A1 (en) 2017-04-24 2020-03-04 Genentech, Inc. Erbb2/her2 mutations in the transmebrane or juxtamembrane domain
WO2019241599A1 (en) * 2018-06-14 2019-12-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods for predicting responsiveness of lung cancer patients to her2-targeting therapies
KR20210035854A (ko) 2018-07-23 2021-04-01 트레비 테라퓨틱스, 인코포레이티드 만성 기침, 무호흡증 및 호흡곤란의 치료
CN112714649A (zh) 2018-09-06 2021-04-27 第一三共株式会社 新型环状二核苷酸衍生物及其抗体药物偶联物
BR112021005670A2 (pt) 2018-10-08 2021-06-22 Universität Zürich polipeptídeos tetraméricos de ligação a her2
WO2021188578A1 (en) * 2020-03-16 2021-09-23 University Of Southern California Screening methods to identify small molecule compounds that promote or inhibit the growth of circulating tumor cells, and uses thereof
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
CA3212691A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Glycan, and method for producing medicine containing glycan

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US126818A (en) * 1872-05-14 Improvement in carpet-stretchers
US229380A (en) * 1880-06-29 John charles
US190689A (en) * 1877-05-15 Improvement in car-brakes
US229293A (en) * 1880-06-29 Swinging can
US229294A (en) * 1880-06-29 woolnoug-h
US197835A (en) * 1877-12-04 Improvement in dovetailing and grooving machines
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4474683A (en) 1981-08-10 1984-10-02 Armour-Dial, Inc. Soap making process
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
IL74201A0 (en) 1984-01-30 1985-04-30 Icrf Patents Limited Polypeptides for the detection and control of mammalian cell growth
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
WO1991003489A1 (en) 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
JP3208427B2 (ja) 1989-09-29 2001-09-10 オー・エス・アイ・ファーマシューテイカルズ・インコーポレイテッド ヒトの生物学的流体中のｎｅｕ関連タンパク質の検出及び定量
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2102511A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 Paul J. Higgins Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
AU4528493A (en) 1992-06-04 1994-01-04 Regents Of The University Of California, The In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
CA2120745A1 (en) 1992-06-30 1994-01-06 Philip G. Kasprzyk A combination of anti-erbb-2 monoclonal antibodies and method of using
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
US5811098A (en) * 1992-11-24 1998-09-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to HER4, human receptor tyrosine kinase
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
PT616812E (pt) 1993-03-24 2000-04-28 Berlex Biosciences Combinacao de compostos anti-hormonais e moleculas de ligacao no tratamento do cancro
AU6527894A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Prevention of tumors with monoclonal antibodies against (neu)
DE69408541T2 (de) 1993-11-23 1998-08-06 Genentech Inc Kinaserezeptoraktivierungstest
AU697142B2 (en) 1993-11-23 1998-10-01 Genentech Inc. Protein tyrosine kinases named Rse
US6287784B1 (en) 1993-11-23 2001-09-11 Genentech, Inc. Kinase receptor activation assay
ATE207366T1 (de) 1993-12-24 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
CZ292061B6 (cs) 1994-03-17 2003-07-16 Merck Patent Gmbh Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
CN1068323C (zh) 1994-07-21 2001-07-11 阿克佐诺贝尔公司 环酮过氧化物配制剂
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
WO1996016673A1 (en) 1994-12-02 1996-06-06 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK0817775T3 (da) 1995-03-30 2001-11-19 Pfizer Quinazolinderivater
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
EP2258726A1 (en) 1995-06-14 2010-12-08 The Regents of the University of California High affinity human antibodies to c-erbB-2
CN1151842C (zh) 1995-07-27 2004-06-02 基因技术股份有限公司 稳定等渗的冻干蛋白制剂
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
CN1214044C (zh) 1996-03-27 2005-08-10 基因技术股份有限公司 ErbB3抗体
US5968511A (en) * 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
SI0892789T2 (sl) 1996-04-12 2010-03-31 Warner Lambert Co Ireverzibilni inhibitorji tirozin kinaz
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
WO1999019488A1 (en) 1997-10-15 1999-04-22 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
AU760560B2 (en) * 1998-02-12 2003-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
US6417168B1 (en) * 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6627400B1 (en) * 1999-04-30 2003-09-30 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed measurement of membrane protein populations
US6514700B1 (en) 1999-04-30 2003-02-04 Aclara Biosciences, Inc. Nucleic acid detection using degradation of a tagged sequence
US7049410B2 (en) 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
US6399743B1 (en) 1999-05-14 2002-06-04 Dept. Of Veterans Affairs Isolation and characterization of a rat epidermal growth factor related protein
US7041292B1 (en) * 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
EP1191944A2 (en) * 1999-06-25 2002-04-03 Genentech, Inc. METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
CH694589A5 (de) 1999-06-25 2005-04-15 Genentech Inc Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern.
KR100816958B1 (ko) * 1999-07-30 2008-03-26 메다렉스, 인코포레이티드 항-Ｆｃ 수용체 결합제를 포함하는 치료 화합물
NZ517150A (en) * 1999-08-27 2005-01-28 Genentech Inc Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
DK1282443T3 (da) 2000-05-19 2010-01-04 Genentech Inc Gendetektionsassay til at forbedre sandsynligheden for et effektivt respons på en ErbB-antagonist cancerterapi
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
WO2002087619A1 (fr) * 2001-04-27 2002-11-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Methode de prevention et de traitement du cancer
JP2004002211A (ja) * 2001-04-27 2004-01-08 Takeda Chem Ind Ltd 癌の予防・治療方法
US20030190689A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-09 Cell Signaling Technology,Inc. Molecular profiling of disease and therapeutic response using phospho-specific antibodies
US20040229293A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui Surface receptor complexes as biomarkers
US20040229294A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
AU2003251597A1 (en) * 2002-06-19 2004-01-06 Abgenix, Inc. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
AU2003259175B2 (en) * 2002-07-25 2010-08-12 Monogram Biosciences, Inc. Detecting receptor oligomerization
CN102580084B (zh) * 2005-01-21 2016-11-23 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药

Also Published As

Publication number Publication date
PT1585966E (pt) 2012-02-20
EP2263691B1 (en) 2012-08-29
EP1585966B1 (en) 2011-11-30
NO337855B1 (no) 2016-07-04
JP5069843B2 (ja) 2012-11-07
JP2014237667A (ja) 2014-12-18
PT2263691E (pt) 2012-11-12
RU2005103824A (ru) 2005-08-27
IL165952A (en) 2012-06-28
WO2004008099A2 (en) 2004-01-22
DK2263691T3 (da) 2012-10-22
HUP0600340A2 (en) 2006-08-28
AU2010200692A1 (en) 2010-03-18
AU2003273218A1 (en) 2004-02-02
IL219381A0 (en) 2012-06-28
RU2008128244A (ru) 2010-01-20
AU2003273218B2 (en) 2009-11-26
NO20050775L (no) 2005-02-14
CN101711866A (zh) 2010-05-26
CA2490758C (en) 2014-09-23
JP2012232987A (ja) 2012-11-29
AU2003273218C1 (en) 2019-01-17
RU2338751C2 (ru) 2008-11-20
CN102295703A (zh) 2011-12-28
ATE535254T1 (de) 2011-12-15
CA2490758A1 (en) 2004-01-22
ES2392525T3 (es) 2012-12-11
DK1585966T3 (da) 2012-02-20
ES2376165T3 (es) 2012-03-09
EP2263691A1 (en) 2010-12-22
WO2004008099A8 (en) 2005-02-17
US20040106161A1 (en) 2004-06-03
PL377743A1 (pl) 2006-02-20
EP1585966B8 (en) 2012-03-07
EP1585966A2 (en) 2005-10-19
CY1112631T1 (el) 2016-02-10
JP2006508336A (ja) 2006-03-09
BR0312534A (pt) 2007-03-13
NZ537660A (en) 2008-12-24
IL219381A (en) 2014-11-30
EP1585966A4 (en) 2007-02-21
MXPA05000403A (es) 2005-07-22
IL165952A0 (en) 2006-01-15
US20110117096A1 (en) 2011-05-19
HUP0600340A3 (en) 2011-06-28
JP5678005B2 (ja) 2015-02-25
WO2004008099A3 (en) 2005-09-01
CY1113260T1 (el) 2016-04-13
HK1082687A1 (en) 2006-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2490758C (en) Dosage form of recombinant humanized monoclonal antibody 2c4
KR100850389B1 (ko) 인간화 항-ＥｒｂＢ2 항체 및 항-ＥｒｂＢ2 항체를 사용한치료 방법
KR100754049B1 (ko) 전립선암을 치료하기 위한 약제 제조에 사용되는 항-ErbB2 항체 및 조성물
KR20070038557A (ko) Ｈｅｒ２ 항체 조성물
ZA200500126B (en) Method for identifying tumors that are responsive to treatment with ANTI-ERBB2 antibodies
KOLL et al. Patent 2490758 Summary
NO20151725L (no) Rekombinant, humanisert antistoff 2C4 (rhuMab 2C4) for anvendelse sammen med et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff i en fremgangsmåte for behandling av kreft i en pasient og anvendelse derav for fremstilling av et medikament