PT1585966E - Tratamento de cancro com o anticorpo anti-erbb2 rhumab 2c4 - Google Patents

Description

ΕΡ 1 585 965/PT

DESCRIÇÃO "Tratamento de cancro com o anticorpo anti-ErbB2 rhuMAb 2C4"

Campo do invento 0 presente invento refere-se a anticorpo anti-HER2 humanizado recombinante 2C4 (rhuMab 2C4) para utilização num método de tratar doentes que sofram de tumores.

Antecedentes do invento A família ErbB de receptores tirosina quinase são mediadores importantes de crescimento, diferenciação e sobrevivência celulares. A família de receptores inclui quatro membros distintos incluindo o receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR ou ErbBl), HER2 (ErbB2 ou pl85^eu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2). EGFR, codificado pelo gene erbBl, tem sido causalmente implicado em malignidades humanas. Nomeadamente tem-se observado expressão aumentada de EGFR em cancros de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago assim como em glioblastomas. A expressão aumentada do receptor EGFR está muitas vezes associada com produção aumentada de ligando EGFR, factor de crescimento por transformação alfa (TGF-a) pelas mesmas células de tumor, resultando em activação de receptor por uma via de estimulação autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. , _6/kl27-154 (1994). Além disso, descreveu-se uma proteína relacionada com receptor de factor de crescimento epidérmico (ERRP) em que um clone de fragmento de ADNc com 1583 pares de bases com 90-95% de homologia de sequência com EGFR de ratinho e um EGFR truncado de rato (patente US n° 6 399 743; e publicação US n° 2003/0096373) . Avaliaram-se anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR ou os seus ligandos, TGF-α e EGF, como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignidades. Consultar, e.g., Baselga e Mendelsohn., supra; Masui et al., Câncer Research, 44:1002-1007 (1984); e Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995). 2

ΕΡ 1 585 966/PT Ο segundo membro da família ErbB, pl85neu, foi originalmente identificado como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma activada do proto-oncogene neu resulta de uma mutação pontual (valina para ácido glutâmico) na região transmembranar da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu (HER2) é observada nos cancros de mama e dos ovários e correlaciona-se com um prognóstico fraco (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al.,

Science, 244:707-712 (1989); e patente US n° 4 968 603). Até à data, não foi descrito para tumores humanos, qualquer análogo com a mutação pontual do proto-oncogene neu. A sobrexpressão de ErbB2 (frequentemente mas não uniformemente devida a amplificação génica) também tem sido observada noutros carcinomas incluindo carcinomas do estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas e bexiga. Consultar, entre outros, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet, ^1: 765-767 (1986); Fukushigi et al. , Mol Cell Bíol. , _6:955-958 (1986);

Geurin et al., Oncogene Res., 3g21-31 (1988); Cohen et al.,

Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Câncer Res., .51:1034 (1991); Borst et al. , Gynecol. Oncol. , 3_8:364 (1990); Weiner et al., Câncer Res., 5_0:421-425 (1990); Kern et al., Câncer Res., 5_0:5184 (1990); Park et al., Câncer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3_: 354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Câncer, 57_:358-363 (1988);

Williams et al., Pathiobiology, .59:46-52 (1991); e McCann et al., Câncer, _65:88-92 (1990) . ErbB2 pode ser sobrexpresso em cancro da próstata (Gu et al., Câncer Lett. , _99gl85-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. , 2_8:827-33 (1997); Ross et al., Câncer, 19_:2162-1Q> (1997); e Sadasivan et al., J. Urol. , 150:126-31 (1993)). A sobrexpressão de ErbB2 pode levar a crescimento de tumor através de activação independente de ligando de ErbB2 ou homodímeros ErbB2.

Descreveram-se anticorpos dirigidos contra os produtos de proteína pl85neu de rato e ErbB2 humano. Drebin e colaboradores desenvolveram anticorpos contra o produto génico neu de rato, pl85neu. Consultar, por exemplo, Drebin et al., Cell, 4_1: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. , 198:277-290 (1991); e W094/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:213-211 (1988) relatam que misturas de anticorpos reactivos 3 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ com duas regiões distintas de pl85neu resultam em efeitos sinérgicos anti-tumor em células NIH-3T3 transformadas com neu implantadas em ratinhos nus. Consultar também patente U.S. 5 824 311 concedida a 20 de Outubro de 1998.

Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3) :1165-1172 (1989) descrevem a geração de um painel de anticorpos anti-ErbB2 que foram caracterizados utilizando a linha celular SK-BR-3 de tumor de mama humano. Determinou-se a proliferação celular relativa de células SK-BR-3 após exposição aos anticorpos por coloração com violeta de cristal das monocamadas após 72 horas. Utilizando este ensaio, obteve-se inibição máxima com o anticorpo denominado 4D5 que inibiu proliferação celular em 56%. Outros anticorpos do painel reduziram a proliferação celular em menor extensão neste ensaio. Verificou-se adicionalmente que o anticorpo 4D5 sensibilizava linhas celulares de tumor de mama que sobrexpressam ErbB2 para os efeitos citotóxicos de TNF-α. Consultar também patente U.S. n° 5 677 171 concedida a 14 de Outubro de 1997. Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos em Hudziak et al. são caracterizados adicionalmente em Fendly et al., Câncer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. , In Vitro, 2 6(3) :59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3) :117-127 (1991); Kumar et al., Mol.

Cell. Biol., 11(2) :979-986 (1991); Lewis et al., Câncer

Immunol. Immunother. , 3_7 :255-263 (1993); Pietras et al.,

Oncogene, _9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Câncer

Research, U4:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol.

Chem., 269 (20):14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol.

Chem., 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad

Sei.; ^1:7202-7206 (1994); Lewis et al., Câncer Research, .56:1457-1465 (1996); e Schaefer et al., Oncogene, 15:1385- 1394 (1997).

Uma versão humanizada recombinante do anticorpo anti-ErbB2 murino, 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 ou HERCEPTIN®; patente U.S. n° 5 821 337) é clinicamente activa em doentes com cancros de mama metastáticos que sobrexpressam ErbB2 e que receberam terapia anti-cancro extensiva anterior (Baselga et al., J. Clin Oncol., 14:737-744 (1996)). HERCEPTIN® recebeu licença de comercialização da Food and Drug Administration a 25 de Setembro de 1998 para o tratamento de 4

ΕΡ 1 585 966/PT doentes com cancro de mama metastático cujos tumores sobrexpressam a proteína ErbB2. Contudo, nem todos os tumores que sobrexpressam ErbB2 são sensíveis a HERCEPTIN® (Brockhoff et al., Cytometry, _£4:338-48 (2001)). Além disso, dados pré-clínicos sugerem que HERCEPTIN® pode ser terapeuticamente eficaz no tratamento de cancro de pulmão de não pequenas células (NSCLC). A proteína HER2 é sobrexpressa em 20-66% de ressecções de tumores NSCLC e mostrou-se que tem prognóstico fraco para o doente em séries múltiplas (Azzoli, C.G. et al., Semin. Oncol., 29(supl 4):59-65 (2002)).

Descreveram-se outros anticorpos anti-ErbB2 com diferentes propriedades em Tagliabue et al., Int. J. Câncer, 4_7:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4_:543-548 (1989); Maier et al., Câncer Res., Ul :5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3^:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 8_8:8 691-8 695 (1991); Bacus et al., Câncer Research, 52_: 2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Câncer, 53:401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk et al., Câncer Research, 52_: 2771-277 6 (1992); Hancock et al., Câncer Res., 5_1:4575-4580 (1991); Shawver et al, Câncer Res., 5/k 1367-1373 (1994); Arteaga et al., Câncer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Blol. Chem., 267:15160-15167 (1992); patente U.S. n° 5 783 186; e Klapper et al., Oncogene, 1_4: 2099-2109 (1997) . 0 anticorpo monoclonal 2C4 é descrito em WO 01/00245. Verificou-se que 2C4 destrói a dimerização de HER2 com outros membros da família de receptores ErbB (WO 01/00245). O rastreio de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família de receptores ErbB; ErbB3 (patentes U.S. n° 5 183 884 e 5 480 968 assim como Kraus et al., PNAS (USA), 8_6: 9193-9197 (1989)) e ErbB4 (pedido de patente EP n° 599 274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al. , Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos estes receptores apresentam expressão aumentada em pelo menos algumas linhas celulares de cancro de mama.

Os receptores ErbB encontram-se geralmente em várias combinações em células e pensa-se que a heterodimerização aumenta a diversidade de respostas celulares a vários ligandos ErbB (Earp et al., Breast Câncer Research and 5 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ

Treatment, 35:115-132 (1995)). Contudo, não se compreende totalmente o mecanismo pelo qual estes receptores agregam e como tal contribui para a sinalização (Brennan, P.J. et al., Oncogene, 1_9:6093-6101 (2000)). O EGFR está ligado a seis ligandos diferentes; o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento por transformação alfa (TGF-a), anfirregulina, factor de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al., Growth Factors, 1JL :235-257 (1994)). Uma família de proteínas heregulina resultante de splicing alternativo de um único gene são ligandos para ErbB3 e ErbB4. A família heregulina inclui as heregulinas alfa, beta e gama (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); patente U.S. n° 5 641 869; e Schaefer et al. , Oncogene, 135:1385-1394 (1997)); os factores de diferenciação neu (NDF), factores de crescimento glial (GGF); actividade indutora de receptor de acetilcolina (ARIA); e factor derivado de neurónios sensoriais e motores (SMDF) . Para uma revisão, consultar Groenen et al., Growth Factors, 1Α:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell.

Neurose!., 1_: 247-262 (1996) e Lee et al., Pharm. Rev. , 47:51-85 (1995) . Recentemente identificaram-se três ligandos ErbB adicionais; neurorregulina-2 (NRG-2) que se relata que liga ErbB3 ou ErbB4 (Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); e

Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neurorregulina-3 que liga ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18) : 9562-7 (1997)); e neurorregulina-4 que liga ErbB4 (Harari et al., Oncogene, l_8:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina e epirregulina também se ligam a ErbB4.

Enquanto EGF e TGFa não ligam ErbB2, EGF estimula EGFR e ErbB2 para formarem um heterodímero, que activa EGFR e resulta em transfosforilação de ErbB2 no heterodímero. A dimerização e/ou transfosforilação parece activar a ErbB2 tirosina quinase. Consultar Earp et al., supra. De igual forma, a heregulina não liga ErbB2 mas quando ErbB3 é co-expressa com ErbB2, forma-se um complexo de sinalização activa (Nagy et al., Cytometry, 32_:120-31 (1998). Os anticorpos dirigidos contra ErbB2 são capazes de destruir este complexo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). ErbB3 é deficiente em tirosina quinase e assim requer heterodimerização, preferentemente com ErbB2, para apresentar capacidades de transdução de sinal. 5

ΕΡ 1 585 955/PT (Graus-Porta et al. , EMBO J. , 1_6: 1647-55 (1995)).

Adicionalmente, a afinidade de ErbB3 para heregulina (HRG) aumenta para um estado de afinidade mais elevada quando se co-expressa com ErbB2. Consultar igualmente, Levi et al., Journal of Neuroscience, ]J5:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, _92:1431-1435 (1995); e Lewis et al., Câncer Res., 5_6:1457-1465 (1996) relativamente ao complexo de proteína ErbB2-ErbB3. De facto, ErbB2 é o parceiro de heterodimerização preferido para EGFR e para ErbB3 (Graus-Porta et al., supra) . ErbB4, tal como ErbB3, forma um complexo de sinalização activo com ErbB2 (Carraway e Cantley, Cell, 7_8:5-8 (1994)). A heterodimerização dependente de ligando de ErbB2 com EGFR ou ErbB3 pode promover o crescimento de tumores que expressam ErbB2. A expressão dos receptores ErbB e heregulina e o estado de fosforilação de HER2 foi investigada em espécimes de tumor de doentes de cancro de mama primário e em carcinoma urinário da bexiga (Esteva et al., Pathol. Oncol. Res., Ί_:1Ί1-1ΊΊ (2001) ; Chow et al., Clin. Câncer Res., 7_:1957-1962 (2001)). A correlação entre sinalização activa através de Her2/neu e patologia clínica e resultado no doente em cancro de mama foi relatada por Thor et al., J. Clin. Oncology, 18:3230-3239 (2000), e DiGiovanna et al., Câncer Res., 62:6667-6673 (2002) .

Descreve-se aqui um método de identificar um tumor que é sensível a tratamento com um anticorpo anti-HER2, rhuMAb 2C4.

Obtém-se uma amostra do tumor e detecta-se a presença de um complexo de proteínas HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 na amostra. Identifica-se que um tumor é sensível a tratamento com o anticorpo anti-HER2 quando o complexo é detectado.

Pode detectar-se a presença de um complexo por imunoprecipitação de quaisquer complexos de proteína que compreendem HER2 com um anticorpo anti-HER2. Os complexos imunoprecipitados são então postos em contacto com um anticorpo seleccionado do grupo que consiste de anticorpos anti-HER3, anticorpos anti-HERl e anticorpos anti-HER4 e determina-se a existência de qualquer ligação. Detecta-se um 7

ΕΡ 1 585 955/PT complexo HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 caso se determine que os anticorpos anti-HER3 e/ou anti-HERl e/ou anti-HER4 se ligam aos complexos imunoprecipitados.

Pode detectar-se a presença de um complexo de proteína HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 pondo em contacto a amostra de tumor com um anticorpo anti-HER2 que compreende um primeiro fluoróforo. A amostra de tumor é então posta em contacto com um anticorpo seleccionado do grupo que consiste de anticorpos anti-HER3 e/ou anti-HERl e/ou anti-HER4, em que o referido anticorpo compreende um segundo fluoróforo. Efectuam-se então medidas de transferência de energia de ressonância de fluorescência para determinar se o primeiro fluoróforo e o segundo fluoróforo estão próximos. Detecta-se a presença de complexo de proteína HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 caso se determine que o primeiro e segundo fluoróforos estão próximos.

Pode detectar-se a presença de um complexo HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 pondo em contacto a amostra de tumor com um primeiro composto de ligação. 0 primeiro composto de ligação compreende uma primeira parte de ligação ao alvo que liga especificamente HER2. A primeira parte de ligação ao alvo é preferentemente um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-HER2. 0 primeiro composto de ligação compreende adicionalmente uma parte detectável que está ligada ao primeiro domínio de ligação através de um ligante clivável. A amostra de tumor é posta em contacto com um segundo composto de ligação. 0 segundo composto de ligação compreende preferentemente uma segunda parte de ligação ao alvo que liga especif icamente HER3 ou HER1 ou HER4 e preferentemente não liga HER2. 0 segundo composto de ligação pode ligar HER3 ou HER1 e não ligar HER2 ou HER4 ou a segunda parte de ligação ao alvo pode compreender um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-HER3 ou anti-HERl ou anti-HER4. 0 segundo composto de ligação á capaz de clivar o ligante clivável no primeiro composto de ligação após activação, produzindo assim uma parte detectável livre se o primeiro composto de ligação e o segundo composto de ligação estiverem próximos. A presença de um complexo de 8

ΕΡ 1 585 966/PT proteína HER2/HER3 ou HER2/HER1 ou HER2/HER4 é detectada quando se identifica a presença de uma parte detectável livre. A presença de uma parte detectável livre pode ser identificada por electroforese capilar. 0 primeiro composto de ligação pode compreender um primeiro domínio de ligação ao alvo que liga especificamente HER1 ou HER3 ou HER4 e o segundo composto de ligação pode compreender um segundo domínio de ligação ao alvo que liga HER2 especificamente. A presença de um complexo de proteína HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 e activação resultante de HER2, pode detectar-se por avaliação de fosforilação de receptor ErbB, por exemplo por imunoprecipitação da proteína HER2 seguido por imunodetecção de fosfotirosina por transferência "Western". A amostra de tumor que é analisada relativamente à presença de complexos de proteína HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 é obtida de preferência a partir de um doente que sofre do tumor. A amostra pode ser obtida, por exemplo, por biópsia ou por purificação de células de tumor em circulação a partir do doente ou durante cirurgia de remoção do tumor do doente.

Pode obter-se a amostra de tumor a partir de um mamífero diferente do doente que desenvolveu originalmente o tumor. Preferentemente obtém-se a amostra a partir de um ratinho ou de outro roedor. Com maior preferência o tumor é um tumor xenoenxertado. 0 tumor xenoenxertado é preferentemente produzido por transplante de um fragmento de tumor humano para um ratinho ou outro roedor. 0 tumor pode ser um tumor de pulmão, com maior preferência um tumor de cancro de pulmão de não pequenas células. 0 tumor pode ser um tumor mamário.

Descreve-se aqui um método para identificar células de tumor como sensíveis a tratamento com um anticorpo que inibe a associação de HER2 com outro membro da família de receptores ErbB, compreendendo as etapas de (a) proporcionar 9

ΕΡ 1 585 966/PT uma amostra biológica compreendendo células de tumor positivas para HER-2; e (b) detectar a fosforilação de um receptor ErbB na amostra biológica, em que a referida fosforilação indica que as células de tumor são sensíveis a tratamento com o anticorpo. Pode detectar-se a fosforilação de um receptor ErbB2 (HER2).

Tal como anteriormente, o outro membro associado com HER2 é HER3, HER1 e/ou HER4, tal como HER2 e/ou HER1. 0 método pode compreender adicionalmente uma etapa de detecção da presença de um complexo de proteína HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4, essencialmente como descrito anteriormente.

Descreve-se aqui um método para prever a resposta de um indivíduo diagnosticado com um tumor positivo para HER2 ao tratamento com um anticorpo rhuMAb 2C4 que inibe a associação de HER2 com outro membro da família de receptores ErbB, por detecção da formação de complexos de proteína HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 e/ou a fosforilação de um receptor ErbB numa amostra biológica obtida do indivíduo, compreendendo células de tumor positivas para HER2. A presença de tais complexos de proteína e/ou da referida fosforilação é indicativa que é provável que o indivíduo responda ao tratamento com o anticorpo. A detecção da fosforilação do receptor ErbB2 (HER2) pode indicar que é provável que o indivíduo responda a tratamento com o anticorpo.

Descreve-se aqui um método para identificar um indivíduo sensível a tratamento com um anticorpo anti-HER2 rhuMAb 2C4 por detecção de fosforilação de um receptor ErbB em células de tumor em circulação no indivíduo. A presença de tal fosforilação indica que é provável que o indivíduo responda a tratamento com o anticorpo anti-HER2. Pode detectar-se a fosforilação de ErbB2 (HER2). 0 indivíduo pode ser um humano.

Também se descreve um artigo de fabrico compreendendo um recipiente compreendendo um anticorpo rhuMAb 2C4 e instruções para administrar o anticorpo a um doente que sofre de um tumor. De preferência, determinou-se que o tumor compreende heterodímeros HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4. 10

ΕΡ 1 585 955/PT

Sumário do invento O presente invento é definido nas reivindicações.

Descrição sucinta dos esquemas

As figuras IA e 1B representam alinhamentos das sequências de aminoácidos dos domínios variável de cadeia leve (VL) (figura IA) e variável de cadeia pesada (VH) (figura 1B) do anticorpo monoclonal 2C4 murino (SEQ ID N° 1 e 2, respectivamente); domínios VL e VH da versão humanizada de 2C4 574 (SEQ ID N° 3 e 4, respectivamente) e esqueletos consensuais humanos VL e VH (hum κΐ, leve capa subgrupo I; humIII, pesada subgrupo III) (SEQ ID N° 5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identificam diferenças entre a versão humanizada de 2C4, 574 e anticorpo monoclonal 2C4 murino ou entre versão humanizada de 2C4, 574 e esqueleto humano. As regiões determinantes da complementaridade (CDR) estão entre parêntesis.

As figuras 2A e 2B apresentam o efeito de anticorpo monoclonal 2C4, anticorpo HERCEPTIN® ou de um anticorpo anti-EGFR sobre a associação de ErbB2 com ErbB3 dependente de heregulina (HRG) em células MCF7 que expressam níveis baixos/normais de ErbB2 (figura 2A) e células SK-BR-3 que expressam níveis elevados de ErbB2 (figura 2B) ; consultar exemplo 2 seguidamente. A figura 3 é uma transferência imunológica que mostra a presença de heterodímeros HER1/HER2 e HER2/HER3 em extractos de proteína de explantes xenoenxertados de cancro de pulmão de não pequenas células. A figura 4 é uma transferência imunológica que mostra a presença de fosforilação HER2 em extractos de proteína de explantes xenoenxertados de carcinoma de pulmão de não pequenas células (NSCLC).

Descrição detalhada da concretização preferida

Descreve-se aqui a revelação experimental que a sensibilidade ao anticorpo anti-HER2 rhuMAb 2C4 se 11

ΕΡ 1 585 966/PT correlaciona com a presença de heterodímeros HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e ou HER2/HER4 e/ou com a fosforilação de um receptor ErbB em células de tumor. Assim, um tumor pode ser identificado como sensível a tratamento com o anticorpo anti-HER2, com base na presença de heterodímeros HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 e/ou na fosforilação de um receptor ErbB. Podem identificar-se heterodímeros HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 e/ou fosforilação de receptor ErbB por qualquer método conhecido na especialidade. Por identificação de tumores e tipos de tumor específicos que são sensíveis a tratamento com anticorpos anti-HER2, podem identificar-se doentes que provavelmente beneficiaram mais com tal tratamento. Além disso, podem identificar-se quais os doentes que provavelmente não beneficiariam de terapia com anticorpo monoclonal 2C4.

Definições

Um "receptor ErbB" é uma proteína tirosina quinase receptora pertencente à família de receptores ErbB e inclui receptores EGFR (ErbBl), ERRP, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 e outros membros desta família a serem identificados no futuro. 0 receptor ErbB compreenderá geralmente um domínio extracelular que pode ligar um ligando ErbB; um domínio transmembranar lipofílico; um domínio tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização carboxilo-terminal apresentando vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O receptor ErbB pode ser um receptor ErbB de "sequência nativa" ou um seu "variante de sequência de aminoácidos". De preferência, o receptor ErbB é um receptor ErbB humano de sequência nativa. Assim, um "membro da família de receptores ErbB" é EGFR (ErbBl), ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou qualquer outro receptor ErbB actualmente conhecido ou a ser identificado no futuro. Preferentemente o membro é EGFR (ErbBl), ErbB2, ErbB3 ou ErbB4.

As expressões "ErbBl", "receptor de factor de crescimento epidérmico", "EGFR" e "HER1" são aqui utilizadas indiferentemente e referem-se a EGFR tal como revelado, por exemplo, em Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914 (1987), incluindo as suas formas mutantes de ocorrência natural (e.g., um mutante de deleção EGFR tal como em 12 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ

Humphrey et al., PNAS (USA), 87:4207-4211 (1990)). ErbBl refere-se ao gene que codifica o produto de proteína EGFR. Descrevem-se anticorpos contra HER1, por exemplo, em Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560 (1987) e em WO 95/25167. A expressão "ERRP", "proteína relacionada com receptor EGF", "proteína relacionada com EGFR" e "proteína relacionada com o receptor de factor de crescimento epidérmico" são aqui utilizadas indiferentemente e referem-se a ERRP tal como revelado, por exemplo em patente U.S. n° 6 399 743 e publicação U.S. n° 2003/0096373.

As expressões "ErbB2" e "HER2" são aqui utilizadas indiferentemente e referem-se a proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (número de acesso Genebank X03363) . A expressão "erbB2" refere-se ao gene que codifica ErbB2 humana e "neu" refere-se ao gene que codifica pl85neu de rato. A ErbB2 preferida é ErbB2 humana de sequência nativa. "ErbB3" e "HER3" referem-se ao polipéptido receptor tal como revelado, por exemplo, nas patentes U.S. n° 5 183 884 e 5 480 968 assim como Kraus et al., PNAS (USA), 8 6:9193-9197 (1989). Os anticorpos contra ErbB3 são conhecidos na especialidade e são descritos, por exemplo, em patentes U.S. n° 5 183 884, 5 480 968 e em WO 97/35885.

As expressões "ErbB4" e "HER4" referem-se aqui ao polipéptido receptor tal como revelado, por exemplo, em pedido de patente EP n° 599 274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 9_0: 1746-1750 (1993); e Plowman et al. , Nature, 366:473-475 (1993), incluindo as suas isoformas, e.g., tal como reveladas em WO 99/19488, publicada a 22 de Abril de 1999. Descrevem-se anticorpos contra HER4 em, por exemplo, WO 02/18444.

Os anticorpos para os receptores ErbB estão disponíveis comercialmente de várias fontes incluindo, por exemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Califórnia, USA. 13

ΕΡ 1 585 966/PT "Ligando ErbB" significa um polipéptido que se liga e/ou que activa um receptor ErbB. 0 ligando ErbB pode ser um ligando ErbB humano de sequência nativa tal como factor de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247:7612-7621 (1972)); factor de crescimento por transformação alfa (TGF-a) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082 (1984)); anfirregulina também conhecida como schwanoma ou factor de crescimento autócrino para queratinócitos (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990); e Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11_: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); factor de crescimento epidérmico de ligação a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al., Oncogene, L5:2841-2848 (1997)); uma heregulina (consultar seguidamente); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad Sei., 94:9562-9567 (1997)); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, l_8:2681-89 (1999)) ou cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). Os ligandos ErbB que ligam EGFR incluem EGF, TGF-α, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Os ligandos ErbB que ligam ErbB3 incluem heregulinas. Os ligandos ErbB capazes de ligar ErbB4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e heregulinas. O ligando ErbB pode também ser um ligando ErbB sintético. O ligando sintético pode ser específico para um receptor ErbB particular ou pode reconhecer complexos de receptor ErbB particulares. Um exemplo de um ligando sintético é a birregulina quimérica sintética heregulina/egf (consultar, por exemplo, Jones et al., FEBS Letters, 447:227-231 (1999)). "Heregulina" (HRG) quando aqui utilizado refere-se a um polipéptido codificado pelo produto génico de heregulina tal como revelado em patente U.S. n° 5 641 869 ou Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Os exemplos de heregulinas incluem heregulina-α, heregulina-/31, heregulina-/32 e heregulina-/33 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); e patente U.S. n° 5 641 869); factor de diferenciação neu 14

ΕΡ 1 585 966/PT (NDF) (Peles et al., Cell, 69: 205-216 (1992)); actividade indutora de receptor de acetilcolina (ARIA) (Falis et al., Cell, 12_: 801-815 (1993)); factores de crescimento glial (GGF) (Marchionni et at., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neurónios sensoriais e motores (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)); γ-heregulina (Schaefer et al., Oncogene, 335:1385-1394 (1997)). A expressão inclui fragmentos e/ou variantes de sequência de aminoácidos de um polipéptido HRG de sequência nativa, biologicamente activos, tal como um seu fragmento de domínio do tipo EGF (e.g., HRG/31177-244) .

Um "hetero-oligómero ErbB" aqui é um oligómero associado de forma não covalente compreendendo pelo menos dois receptores ErbB diferentes. Um "dímero ErbB" é um oligómero associado de forma não covalente que compreende dois receptores ErbB diferentes. Tais complexos podem formar-se quando uma célula que expressa dois ou mais receptores ErbB é exposta a um ligando ErbB. Podem isolar-se oligómeros ErbB, tal como dímeros ErbB, por imunoprecipitação e analisar-se por SDS-PAGE tal como descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por exemplo. Os exemplos de tais hetero-oligómeros ErbB incluem complexos EGFR-ErbB2 (também referido como HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) e ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Além disso, o hetero-oligómero ErbB pode compreender dois ou mais receptores ErbB2 combinados com um receptor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 ou EGFR (ErbBl). Podem também incluir-se no hetero-oligómero outras proteínas tal como uma subunidade de receptor de citoquina (e.g., gp13 0) . "Activação por ligando de um receptor ErbB" significa transdução de sinal (e.g., aquele causado por um domínio quinase intracelular dos resíduos de tirosina de fosforilação de um receptor ErbB num receptor ErbB ou um polipéptido substrato) mediada por ligação de ligando ErbB a um hetero-oligómero ErbB compreendendo o receptor ErbB de interesse. De um modo geral, tal envolverá ligação de um ligando ErbB a um hetero-oligómero ErbB que activa um domínio de quinase de um ou mais dos receptores ErbB no hetero-oligómero resultando assim em fosforilação de resíduos de tirosina em um ou mais dos receptores ErbB e/ou fosforilação de resíduos de tirosina 15

ΕΡ 1 585 966/PT em polipéptidos substrato adicionais. A activação de receptor ErbB pode ser quantificada utilizando vários ensaios de fosforilação de tirosina.

Um polipéptido de "sequência nativa" é aquele que tem a mesma sequência de aminoácidos do que um polipéptido (e.g., receptor ErbB ou ligando ErbB) derivado da natureza. Tais polipéptidos de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Assim, um polipéptido de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos do polipéptido de ocorrência natural humano, polipéptido murino ou polipéptido de qualquer outra espécie de mamífero. A expressão "variante de sequência de aminoácido" refere-se a polipéptidos com sequências de aminoácidos que diferem em alguma extensão de um polipéptido de sequência nativa. Habitualmente, a variante de sequência de aminoácidos apresentará pelo menos cerca de 7 0% de homologia com pelo menos um domínio de ligação de receptor de um ligando ErbB nativo ou com pelo menos um domínio de ligação de ligando de um receptor ErbB nativo e preferentemente, serão pelo menos cerca de 80% homólogos, com maior preferência pelo menos cerca de 90% homólogos com tais domínios de receptor ou de ligação de ligando. A variante de sequência de aminoácidos apresenta substituições, deleções e/ou inserções em determinadas posições no interior da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa.

Define-se "homologia" como a percentagem de resíduos na sequência de aminoácidos variante que são idênticos após alinhamento de sequências e introdução de falhas, caso necessário, para obter a percentagem de homologia máxima. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na especialidade. Um de tais programas de computador é "Align 2" de Genentech, Inc., que foi apresentado com documentação do utilizador no United States Copyright Office, Washington, DC 20559, a 10 de Dezembro de 1991. A expressão "anticorpo" utiliza-se aqui no seu sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos monoclonais 16

ΕΡ 1 585 966/PT intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (e.g., anticorpos biespecificos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo, desde que apresentem a actividade biológica pretendida. A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais constituintes da população são idênticos excepto relativamente a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades minoritárias. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e são dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, contrariamente a preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque podem ser sintetizados sem contaminações por outros anticorpos. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não se deve considerar como sendo necessária produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com o presente invento podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (consultar, e.g., patente U.S. n° 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o remanescente da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra 17

ΕΡ 1 585 966/PT classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos desde que apresentem a actividade biológica pretendida (patente U.S. n° 4 816 567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8^:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos "primatizados" compreendendo sequências de ligação de antigénio de domínio variável derivadas de um primata não humano (e.g., macaco do velho mundo, macaco, etc.) e sequências de região constante humana.

Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte de um anticorpo intacto, preferentemente compreendendo a sua região de ligação de antigénio ou variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmento(s) de anticorpo.

Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende uma região variável de ligação de antigénio assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (e.g., domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes da sua sequência de aminoácidos. De preferência o anticorpo intacto tem uma ou mais funções de efector.

As "funções de efector" do anticorpo referem-se às actividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo. Os exemplos de funções de efector do anticorpo incluem ligação de Clq; citotoxicidade dependente de complemento; ligação a receptor Fc; citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (e.g., receptor de células B; BCR), etc.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser classificados em diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e vários destes podem ser adicionalmente 18

ΕΡ 1 585 966/PT divididos em "subclasses" (isotipos), e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios de cadeia pesada correspondentes às diferentes classes de anticorpos denominam-se α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. "Citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo" e "ADCC" refere-se a uma reacção mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcR) (e.g., células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado a uma célula alvo e subsequentemente provocam lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas resume-se na tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., _9:457-92 (1991). Para avaliar a actividade ADCC numa molécula de interesse pode efectuar-se um ensaio ADCC in vitro tal como o descrito em patente US n° 5 500 362 ou 5 821 337. As células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK) . Alternativa ou adicionalmente, a actividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, e.g., num modelo animal tal como o revelado em Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

As "células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efectoras. De preferência, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham funções efectoras ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK) , monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidas PBMC e células NK. As células efectoras podem ser isoladas de uma fonte nativa destas, e.g., de sangue ou PBMC tal como aqui descrito.

As expressões "receptor Fc" ou "FcR" são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. As FcR preferidas são uma FcR humana de sequência 19

ΕΡ 1 585 966/PT nativa. Além disso, uma FcR preferida é aquela que se liqa a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e Fcy RIII, incluindo variantes alélicas e formas com splicing alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. 0 receptor de activação FcyRIIA contém um motivo de activação baseado em imunorreceptor de tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em imunorreceptor de tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (Consultar revisão M. em Daêron. Annu. Rev. Immunol., R5:203-234 (1997)) . Os FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., _9:457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods, _4 :25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clín. Med., 126:330-41 (1995) . Outros FcR, incluindo os que serão identificados no futuro, são abrangidos aqui pela expressão "FcR". A expressão também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994) ) . "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à capacidade de uma molécula lisar um alvo na presença de complemento. A via de activação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Clq) a uma molécula (e.g., um anticorpo) em complexo com um antigénio cognato. Para avaliar activação de complemento pode efectuar-se um ensaio CDC, e.g., tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).

Os "anticorpos nativos" são habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150 000 Dalton, compostas por duas cadeias leves (L) e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, enquanto o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e cadeia leve tem pontes dissulfureto intracadeia regularmente espaçadas. 20

ΕΡ 1 585 965/PT

Cada cadeia pesada tem numa das extremidades um domínio variável (VH) seguido de vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa das extremidades (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Pensa-se que determinados resíduos de aminoácido formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. A expressão "variável" refere-se ao facto de determinadas partes dos domínios variáveis diferirem extensivamente em sequência entre anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antigénio específico. Contudo, a variabilidade não está distribuída uniformemente ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis dos domínios variáveis tanto de cadeia leve como de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis denominam-se regiões de esqueleto (FR) . Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada uma, quatro FR, que adoptam maioritariamente uma configuração em folha β ligada por três regiões hipervariáveis que formam ansas que ligam e nalguns casos são partes integrantes da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas ligadas em proximidade pelas FR e com as regiões hipervariáveis da outra cadeia contribuem para a formação do local de ligação de antigénio dos anticorpos (consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas apresentam várias funções efectoras tal como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) . A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigénio. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácido de 21

ΕΡ 1 585 955/PT uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (e.g., resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (e.g., resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Os resíduos de "região de esqueleto" ou "FR" são os resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável tal como aqui definidos. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação de antigénio idênticos denominados fragmentos "Fab" cada qual com um único local de ligação de antigénio e um fragmento "Fc" residual cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de ligação de antigénio e ainda é capaz de efectuar ligação cruzada de antigénio. "Fv" é um fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento de antigénio e ligação de antigénio. Esta região consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação forte e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antigénio na superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antigénio ao anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar antigénio, apesar de o fazer com uma menor afinidade do que o local de ligação completo. O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela 22

ΕΡ 1 585 966/PT adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio da cadeia pesada CHI incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobra do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta (m) pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobra entre eles. São também conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.

As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser classificadas em um de dois tipos claramente distintos denominados capa (k) e lambda (λ) com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios de anticorpo VH e VL, em que esses domínios estão presentes numa única cadeia de polipéptido. De preferência, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligante de polipéptido entre os domínios VH e VL que permite que scFv forme a estrutura pretendida para ligação de antigénio. Para uma revisão de scFv consultar Pliickthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore ed., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994) . Descrevem-se fragmentos scFv de anticorpo anti-ErbB2 em WO 93/16185; patente U.S. n° 5 571 894; e patente U.S. n° 5 587 458. A expressão "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação de antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio pesado variável (VH) ligado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipéptido (VH - VL) . Por utilização de um ligante que é demasiado pequeno para permitir emparelhamento entre os dois domínios da mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e a criar dois locais de ligação de antigénio. Os diacorpos são mais completamente descritos em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993). 23

ΕΡ 1 585 955/PT

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., de roedor) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do recebedor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano com a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Nalguns casos, substituem-se resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor nem no anticorpo dador. Efectuam-se estas modificações para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. De um modo geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem às de um imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá adicionalmente pelo menos uma parte de região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Os anticorpos anti-ErbB2 humanizados incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como descrito na tabela 3 de patente U.S. n° 5 821 337; 520C9 humanizado (WO 93/21319) e anticorpos 2C4 humanizados tal como aqui seguidamente descrito.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de uma componente do seu ambiente natural. As componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferiram com utilizações diagnósticas ou terapêuticas do anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. Em 24

ΕΡ 1 585 966/PT concretizações preferidas o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e com a maior preferência mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos do N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou preferentemente com prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes dado que pelo menos uma componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, contudo, preparar-se-á anticorpo isolado através de pelo menos uma etapa de purificação.

Um anticorpo "que liga" um antigénio de interesse, e.g., antigénio ErbB2, é aquele que é capaz de ligar esse antigénio com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil em ter como alvo uma célula que expressa o antigénio. Quando o anticorpo é o que liga ErbB2, ligará ErbB2 habitualmente preferencialmente contrariamente a outros receptores ErbB e pode ser um que não reage significativamente de forma cruzada com outras proteínas tal como EGFR, ErbB3 ou ErbB4. Em tais concretizações a extensão de ligação do anticorpo a estas proteínas não ErbB2 (e.g., ligação de superfície celular a receptor endógeno) será inferior a 10% tal como determinado por análise de separação celular activada por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Algumas vezes, o anticorpo anti-ErbB2 não reagirá significativamente de forma cruzada com a proteína neu de rato, e.g., tal como descrita em Schecter et al., Nature, 312:513 (1984) e Drebin et al., Nature, 312:545-548 (1984).

Um anticorpo que "bloqueia" activação de ligando de um receptor ErbB é aquele que reduz ou evita tal activação tal como anteriormente definido aqui, em que o anticorpo é capaz de bloquear activação de ligando do receptor ErbB de forma substancialmente mais eficaz do que o anticorpo monoclonal 4D5, e.g., de forma aproximadamente tão eficaz como os anticorpos monoclonais 7F3 ou 2C4 ou seus fragmentos Fab e preferentemente aproximadamente tão eficaz como o anticorpo monoclonal 2C4 ou um seu fragmento Fab. Por exemplo, o 25

ΕΡ 1 585 966/PT anticorpo que bloqueia activação de ligando de um receptor ErbB pode ser aquele que é cerca de 50-100% mais eficaz do que 4D5 em bloquear formação de um hetero-oligómero ErbB. O bloqueamento de activação de ligando de um receptor ErbB pode ocorrer de qualquer modo, e.g., por interferência com: ligação de ligando a um receptor ErbB, formação de complexo ErbB, actividade de tirosina quinase de um receptor ErbB num complexo ErbB e/ou fosforilação de resíduo(s) de tirosina quinase no receptor ErbB ou devido a este. Os exemplos de anticorpos que bloqueiam activação de ligando de um receptor ErbB incluem anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 (que bloqueiam activação HRG dos hetero-oligómeros ErbB2/ErbB3 e ErbB2/ErbB4; e activação EGF, TGF-α, anfirregulina, HB-EGF e/ou epirregulina de um hetero-oligómero EGFR/ErbB2); e anticorpos L26, L96 e L288 (Klapper et al., Oncogene, R4:2099-2109 (1997)), que bloqueia ligação de EGF e NDF a células T47D que expressam EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4.

Um anticorpo com uma "característica biológica" de determinado anticorpo, tal como o anticorpo monoclonal designado 2C4, é aquele que apresenta uma ou mais das características biológicas desse anticorpo que o distingue de outos anticorpos que se ligam ao mesmo antigénio (e.g., ErbB2). Por exemplo, um anticorpo com uma característica biológica de 2C4 pode bloquear activação de HRG de um hetero-oligómero ErbB compreendendo ErbB2 e ErbB3, ErbBl ou ErbB4; bloquear activação de EGF, TGF-α, HB-EGF, epirregulina e/ou anfirregulina de um receptor ErbB compreendendo EGFR e ErbB2; bloquear activação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de MAPK; e/ou ligar o mesmo epítopo do domínio extracelular de ErbB2 que é ligado por 2C4 (e.g., que bloqueia ligação de um anticorpo monoclonal 2C4 a ErbB2).

Salvo indicação em contrário, a expressão "anticorpo monoclonal 2C4" refere-se a um anticorpo que tem resíduos de ligação de antigénio do anticorpo 2C4 murino dos exemplos seguintes ou seus derivados. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 2C4 pode ser anticorpo monoclonal 2C4 murino ou uma sua variante, tal como anticorpo 2C4 humanizado apresentando resíduos de aminoácido de ligação de antigénio de anticorpo monoclonal 2C4 murino. Proporcionam-se aqui e em WO 01/00245 exemplos de anticorpos 2C4 humanizados. Salvo 26

ΕΡ 1 585 966/PT indicação em contrário, a expressão "rhuMAb 2C4" quando aqui utilizada refere-se a um anticorpo compreendendo as sequências leve variável (VL) e pesada variável (VH) de SEQ ID N° 3 e 4, respectivamente, fundida às sequências de região constante leve e pesada humanas de IgGl (alotipo não A) opcionalmente expresso por células de ovário de hamster chinês (CHO).

Salvo indicação em contrário, a expressão "anticorpo monoclonal 4D5" refere-se a um anticorpo que tem resíduos de ligação de antigénio do anticorpo 4D5 murino (ATCC CRL 10463) ou derivados deste. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 4D5 pode ser anticorpo monoclonal 4D5 murino ou uma sua variante, tal como 4D5 humanizado, apresentando resíduos de ligação de antigénio de anticorpo monoclonal 4D5 murino. Os exemplos de anticorpos 4D5 humanizados incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como na patente US n° 5 821 337 sendo huMAb4D5-8 (HERCEPTN®) um anticorpo 4D5 humanizado preferido.

Um "agente de inibição de crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou composição que inibe crescimento de uma célula, especialmente uma célula de cancro que expressa ErbB in vitro ou in vivo. Assim, o agente de inibição de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a percentagem de células que expressam ErbB na fase S. Os exemplos de agentes de inibição de crescimento incluem agentes que bloqueiam progressão do ciclo celular (num local diferente de fase S), tal como agentes que induzem paragem em G1 e paragem em fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topo II tal como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo e bleomicina. Esses agentes que param G1 também influenciam paragem de fase S, por exemplo, agentes de alquilação de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode encontrar-se informação adicional em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, ed., capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" 27

ΕΡ 1 585 966/PT de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.

Os exemplos de anticorpos de "inibição de crescimento" são aqueles que ligam ErbB2 e inibem o crescimento de células de cancro que sobrexpressam ErbB2. Os anticorpos anti-ErbB2 de inibição de crescimento preferidos inibem crescimento de células de tumor de mama SK-BR-3 em cultura de células em mais de 20% e preferentemente mais de 50% (e.g., desde cerca de 50% a cerca de 100%) a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml em que a inibição de crescimento se determina seis dias após exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (consultar patente U.S. n° 5 677 171 concedida a 14 de Outubro de 1997). Descreve-se mais detalhadamente o ensaio de inibição de crescimento de células SK-BR-3 nessa patente e aqui seguidamente. O anticorpo de inibição de crescimento preferido é o anticorpo monoclonal 4D5, e.g., 4D5 humanizado. Um anticorpo que "induz morte celular" é aquele que torna inviável uma célula viável. A célula é geralmente aquela que expressa o receptor ErbB2, especialmente quando a célula sobrexpressa o receptor ErbB2. De preferência, a célula é uma célula de cancro, e.g., uma célula de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pancreática ou de bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Pode determinar-se morte celular in vitro na ausência de complemento e células efectoras imunitárias para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por célula e dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Assim, pode efectuar-se o ensaio para morte celular utilizando soro inactivado pelo calor (i.e., na ausência de complemento) e na ausência de células efectoras imunitárias. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular pode avaliar-se perda de integridade membranar tal com avaliado por absorção de iodeto de propidio (PI), azul de tripano (consultar Moore et al., Cytotechnology, 3/7:1-11 (1995)) ou 7AAD relativamente a células não tratadas. Os anticorpos indutores de morte celular preferidos são aqueles que induzem absorção de PI no ensaio absorção de PI em células BT474 (consultar seguidamente). 28

ΕΡ 1 585 966/PT

Um anticorpo que "induz apoptose" é aquele que induz morte celular programada tal como determinada por ligação de anexina V, fragmentação de ADN, encolhimento celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas membranares (denominadas corpos apoptóticos). A célula é aquela que geralmente sobrexpressa o receptor ErbB2. De preferência, a célula é uma célula de tumor, e.g., uma célula de mama, ovário, estômago, do endométrio, de glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pancreática ou de bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, célula Caiu 3, célula MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SK0V3. Estão disponíveis vários métodos para avaliar os eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, pode medir-se translocação de fosfaditil serina (PS) por ligação de anexina; pode avaliar-se fragmentação de ADN através de escada de ADN; e pode avaliar-se condensação nuclear/cromatina conjuntamente com fragmentação de ADN através do aumento de células hipodiplóides. De preferência, o anticorpo que induz apoptose é aquele que resulta em indução em cerca de 2 a 50 vezes, preferentemente cerca de 5 a 50 vezes e com a maior preferência cerca de 10 a 50 vezes, de ligação de anexina relativamente a células não tratadas num ensaio de ligação de anexina utilizando células BT474 (consultar seguidamente). Por vezes o anticorpo pró-apoptótico será aquele que bloqueará adicionalmente activação de ligando ErbB de um receptor ErbB (e.g., anticorpo 7F3) ; i.e., o anticorpo partilha uma característica biológica com o anticorpo monoclonal 2C4. Noutras situações, o anticorpo é aquele que não bloqueia significativamente activação de ligando ErbB de um receptor ErbB (e.g., 7C2) . Além disso, o anticorpo pode ser tal como 7C2 que apesar de induzir apoptose não induz uma grande redução na percentagem de células na fase S (e.g., aquele que apenas induz cerca de 0-10% de redução na percentagem dessas células relativamente ao controlo). 0 "epítopo 2C4" é a região do domínio extracelular de ErbB2 à qual o anticorpo 2C4 se liga. De modo a rastrear anticorpos que se ligam ao epítopo 2C4 pode efectuar-se um ensaio de bloqueamento cruzado de rotina tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente 29

ΕΡ 1 585 966/PT pode efectuar-se mapeamento de epitopo para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 2C4 de ErbB2 (e.g., qualquer um ou mais resíduos na região desde cerca do resíduo 22 a cerca do resíduo 584 de ErbB2, inclusive; consultar figuras 1A-B). 0 "epitopo 4D5" é a região do domínio extracelular de ErbB2 à qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) se liga. Este epitopo é perto do domínio transmembranar de ErbB2. Para rastrear anticorpos que se ligam ao epitopo 4D5, pode efectuar-se um ensaio de bloqueamento cruzado de rotina tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente pode efectuar-se mapeamento de epitopo para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 4D5 de ErbB2 (e.g., qualquer um ou mais resíduos na região desde cerca do resíduo 529 a cerca do resíduo 625, inclusive; consultar figuras 1A-B) . 0 "epitopo 3H4" é a região do domínio extracelular de ErbB2 à qual o anticorpo 3H4 se liga. Este epitopo inclui os resíduos desde cerca de 541 a cerca de 599, inclusive, na sequência de aminoácidos do domínio extracelular de ErbB2; consultar figuras 1A-B. 0 "epitopo 7C2/7F3" é a região do terminal N do domínio extracelular de ErbB2 à qual se liga(m) o(s) anticorpo (s) 7C2 e/ou 7F3 (cada um depositado em ATCC, consultar seguidamente). Para rastrear anticorpos que se ligam ao epitopo 7C2/7F3 pode efectuar-se um ensaio de bloqueamento cruzado de rotina tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente pode efectuar-se mapeamento de epitopo para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 7C2/7F3 em ErbB2 (e.g., qualquer um ou mais resíduos na região desde cerca do resíduo 22 a cerca do resíduo 53 de ErbB2; consultar figuras 1A-B). "Mamífero" para objectivos de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta e jardim zoológico, de desporto ou animais de companhia tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De preferência o mamífero é humano. 30

ΕΡ 1 585 966/PT

Um tumor que é "sensível ao tratamento" apresenta melhorias estatisticamente significativas em resposta ao tratamento com anticorpo anti-ErbB comparativamente com ausência de tratamento ou tratamento com placebo num modelo animal reconhecido ou num ensaio clínico humano ou que é sensível a tratamento inicial com anticorpos anti-ErbB mas cresce com a continuação do tratamento.

As expressões "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto a tratamento terapêutico e profiláctico como a medidas preventivas, em que o objectivo é evitar ou abrandar (diminuir) uma alteração fisiológica não pretendida ou doença, tal como o desenvolvimento ou propagação de cancro. Para os objectivos deste invento os resultados benéficos ou pretendidos incluem entre outros, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estável (i.e., sem pioras), atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão (parcial ou total) quer seja detectável ou não. "Tratamento" pode também significar sobrevivência prolongada comparativamente com sobrevivência esperada caso não se receba tratamento. Os que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm a doença assim com aqueles que são propensos a ter a doença ou aqueles nos quais se quer evitar a doença.

Uma "doença" é qualquer doença que beneficiaria do tratamento do presente invento. Tal inclui doenças crónicas e agudas ou doenças incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero à doença em questão. Os exemplos não limitativos de doenças a ser aqui tratadas incluem tumores benignos e malignos; leucemias e malignidades linfóides, nomeadamente cancro de mama, ovários, estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiróide, pancreático, da próstata ou da bexiga; doenças neuronais, gliais, astrocítica, hipotalâmica e outras doenças glandulares, macrofágicas, epiteliais, estromais e blastocélicas; e doenças inflamatórias, angiogénicas e imunológicas. Uma doença preferida a tratar de acordo com o presente invento é tumor maligno. 31

ΕΡ 1 585 955/PT A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco que é eficaz para tratar uma doença num mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de cancro; reduzir o tamanho do tumor; inibir (i.e., abrandar em alguma extensão e preferentemente parar) infiltração de células de cancro em órgãos periféricos; inibir (i.e., abrandar em alguma extensão e preferentemente parar) metástase de tumor; inibir, em alguma extensão, crescimento de tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais sintomas associados com o cancro. Na medida em que o fármaco possa evitar crescimento e/ou matar células de cancro existentes este pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapia de cancro a eficácia pode ser medida, por exemplo, por avaliação do tempo até progressão da doença (TTP) e/ou determinar a taxa de resposta (RR).

As expressões "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a doença fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Um "tumor" compreende uma ou mais células cancerosas. Os exemplos de cancro incluem entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Os exemplos mais específicos de tais cancros incluem cancro de células escamosas (e.g., cancro de células escamosas epiteliais), cancro de pulmão incluindo cancro de pulmão de pequenas células, cancro de pulmão de não pequenas células ("NSCLC"), adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou de estômago incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro dos ovários, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro rectal, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim ou renal, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma do pénis assim como cancro da cabeça e pescoço.

Um "cancro que expressa ErbB" é aquele que compreende células que têm proteína ErbB presente na sua superfície celular. Um "cancro que expressa ErbB2" é aquele que produz 32 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ níveis suficientes de ErbB2 à superfície das suas células de modo a que um anticorpo anti-ErbB2 se possa ligar a estas e ter o efeito terapêutico relativamente ao cancro.

Um cancro "caracterizado por activação excessiva" de um receptor ErbB é aquele no qual a extensão de activação de receptor ErbB em células de cancro excede significativamente o nível de activação desse receptor em células não cancerosas do mesmo tipo de tecido. Tal activação excessiva pode resultar de sobrexpressão do receptor ErbB e/ou níveis superiores ao normal de um ligando ErbB disponível para activar o receptor ErbB em células de cancro. Tal activação excessiva pode provocar e/ou pode ser causada pelo estado maligno de uma célula de cancro. Em algumas concretizações, o cancro será submetido a um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está a ocorrer amplificação e/ou sobrexpressão de um receptor ErbB resultando em tal activação excessiva do receptor ErbB. Alternativa ou adicionalmente, o cancro pode ser submetido a um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está a ocorrer amplificação e/ou sobrexpressão de um receptor ErbB no cancro que se possa atribuir a activação excessiva do receptor. Num subconjunto de tais cancros, a activação excessiva do receptor pode resultar de uma via de estimulação autócrina.

Numa "via de estimulação autócrina", a auto-estimulação ocorre em consequência da célula de cancro produzir tanto um ligando ErbB como o seu receptor ErbB cognato. Por exemplo, o cancro pode expressar ou sobrexpressar EGFR e também expressar ou sobrexpressar um ligando EGFR (e.g., EGF, TGF-a ou HB-EGF). Noutra concretização, o cancro pode expressar ou sobrexpressar ErbB2 e também expressar ou sobrexpressar uma heregulina (e.g. γ-HRG).

Um cancro que "sobrexpressa" um receptor ErbB é aquele que tem níveis significativamente mais altos de um receptor ErbB, tal como ErbB2, à sua superfície celular comparativamente com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal sobrexpressão pode ser causada por amplificação génica ou por transcrição ou tradução aumentadas. A sobrexpressão do receptor ErbB pode ser determinada num ensaio diagnóstico ou prognóstico por 33

ΕΡ 1 585 955/PT avaliação de níveis aumentados de proteína ErbB presentes à superfície de uma célula (e.g., através de um ensaio de imuno-histoquímica; IHC) . Alternativa ou adicionalmente, podem medir-se níveis de ácido nucleico que codifica ErbB na célula, e.g., através de hibridação in situ de fluorescência (FISH; consultar WO 98/45479 publicado em Outubro de 1998), hibridação "Southern" ou técnicas de reacção de polimerização em cadeia (PCR) tal como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR) . A sobrexpressão do ligando ErbB pode ser determinada por diagnóstico avaliando os níveis do ligando (ou do ácido nucleico que o codifica) no doente, e.g., numa biópsia de tumor ou por diferentes ensaios de diagnóstico tal como IHC, FISH, hibridação "Southern", PCR ou ensaios in vivo anteriormente descritos. Pode igualmente estudar-se sobrexpressão de receptor ErbB por medição de antigénio livre em circulação (e.g., domínio extracelular de ErbB) num fluido biológico tal como soro (consultar, e.g., patente U.S. n° 4 933 294 concedida a 12 de Junho de 1990; WO 91/05264 publicado a 18 de Abril de 1991; patente U.S. n° 5 401 638 concedida a 28 de Março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)) . Além dos ensaios anteriores estão disponíveis ao perito da especialidade vários outros ensaios in vivo. Por exemplo, pode expor-se células do interior do corpo do doente a um anticorpo que está opcionalmente marcado com um marcador detectável, e.g., um isótopo radioactivo e pode avaliar-se ligação do anticorpo a células do doente, e.g., por rastreio externo de radioactividade ou por análise de uma biópsia retirada de um doente anteriormente exposto ao anticorpo.

Os tumores que sobrexpressam HER2 são classificados por pontuações imuno-histoquímicas correspondentes ao número de cópias de moléculas HER2 expressas por célula e podem ser determinadas bioquimicamente: 0 = 0-10 000 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de 200 000 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 500 000 cópias/célula, 3+ = pelo menos cerca de 2 000 000 cópias/célula. A sobrexpressão de HER2 ao nível 3+, que leva a activação de tirosina quinase independente de ligando (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7159-7163 [1987]), ocorre em aproximadamente 30% dos cancros de mama e nestes doentes a sobrevivência sem recaídas e a sobrevivência de um modo geral estão diminuídas (Slamon et 34

ΕΡ 1 585 955/PT al., Science, 244:707-712 [1989]; Slamon et al., Science, 235:177-182 [1987]).

Contrariamente, um cancro que "não se caracteriza por sobrexpressão do receptor ErbB2" é aquele que, num ensaio de diagnóstico, não expressa níveis superiores ao normal de receptor ErbB2 comparativamente com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Um cancro "independente de hormona" é aquele cuja proliferação não depende da presença de uma hormona que se liga a um receptor expresso por células do cancro. Tais cancros não sofrem regressão clínica por administração de estratégias farmacológicas ou cirúrgicas que reduzem a concentração de hormona no tumor ou perto deste. Os exemplos de cancros independentes de hormona incluem cancro de próstata independente de androgénio, cancro de mama independente de estrogénio, cancro de endométrio e cancro dos ovários. Tais cancros podem começar como tumores dependentes de hormona e progredir de um estágio sensível a hormona para tumor refractário a hormona após terapia anti-hormonal. A expressão "agente citotóxico" tal como aqui utilizada refere-se a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou provoca destruição de células. Pretende-se que a expressão inclua isótopos radioactivos (e.g., At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, BÍ212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas tal como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas activas enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tal como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tal como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenimina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; mostardas de azoto tal como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, 35 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tal como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgénios tal como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reconstituinte de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosideo de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2', 2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo ("Ara-C") ; ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, e.g., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tal como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo; 36

ΕΡ 1 585 966/PT daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores. Também se incluem nesta definição agentes anti-hormonais que actuam na regulação ou inibição da acção hormonal em tumores tal como anti-estrogénios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolídeo e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.

Tal como aqui utilizada, a expressão "fármaco que tem como alvo EGFR" refere-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e opcionalmente inibe activação de EGFR. Os exemplos de tais agentes incluem anticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Os exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8 507) , MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (consultar, patente U.S. n° 4 943 533, Mendelsohn et al.) e suas variantes, tal como 225 quimérico (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e 225 humano remodelado (H225) (consultar, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que ligam EGFR mutante do tipo II (patente U.S. n° 5 212 290); anticorpos humanizados e quiméricos que ligam EGFR tal como descrito em patente U.S. n° 5 891 996; e anticorpos humanos que ligam EGFR, tal como ABX-EGF (consultar WO 98/50433, Abgenix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico gerando assim um imunoconjugado (consultar, e.g., EP 659 439A2, patente Merck GmbH). Os exemplos de moléculas pequenas que se ligam a EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), CP-358774 (TARCEVA™; Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen). Um "inibidor de tirosina quinase" é uma molécula que inibe em alguma extensão a actividade de tirosina quinase de uma tirosina quinase tal como um receptor ErbB. Os exemplos de tais inibidores incluem os fármacos que têm como alvo EGFR referidos no parágrafo anterior assim como quinazolinas tais como PD 153035, 4 — (3 — cloroanilino)quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, 37

ΕΡ 1 585 966/PT CGP 60261 e CGP 62706 e pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas, curcumina (diferuloilmetano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas contendo partes de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas anti-sentido (e.g., aquelas que se ligam a ácido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (patente U.S. n° 5 804 396); trifostinas (patente U.S. n° 5 804 396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores genéricos de ErbB tal como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinib (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone); ou tal como descrito em qualquer das seguintes publicações de patente: patente U.S. n° 5 804 396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); e WO 96/33980 (Zeneca).

Um "agente anti-angiogénico" refere-se a um composto que bloqueia ou interfere em algum grau com o desenvolvimento de vasos sanguíneos. O factor anti-angiogénico pode ser, por exemplo, uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um factor de crescimento ou receptor de factor de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. O factor anti-angiogénico preferido aqui é um anticorpo que se liga a factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). A expressão "citoquina" é uma expressão genérica para proteínas libertadas por uma população de células que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Os exemplos de tais citoquinas são linfoquinas, monoquinas e as hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluem-se nas citoquinas as hormonas de crescimento tais como hormona de crescimento humana, hormona de crescimento humana N-metionilo e hormona de crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas de glicoproteína tais como hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante da tiróide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático, factor de crescimento de fibroblastos, prolactina; lactogénio 38

ΕΡ 1 585 965/PT placentário; factor-α de necrose de tumor e factor-β de necrose de tumor; substância inibidora muleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular, integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento de nervos tal como NGF-β; factor de crescimento de plaquetas, factores de crescimento por transformação (TGF) tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento-I do tipo insulina e factor de crescimento-II do tipo insulina; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tais como interferão-a, interferão-β e interferão-γ, factores de estimulação de colónias (CSF) tais como CSF de macrófagos (M-CSF) ; CSF de granulócito macrófago (GM-CSF); e CSF de granulócito (G-CSF); interleucinas (IL) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um factor de necrose de tumor tal como TNF-α ou TNF-β; e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Tal como aqui utilizada, a expressão citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente activas das citoquinas de sequência nativa. A expressão "pró-fármaco" tal como utilizada neste pedido refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente activa que é menos tóxica para as células de tumor comparativamente com o fármaco parental e é capaz de ser enzimaticamente activado ou convertido para a forma parental mais activa. Consultar, e.g., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, p. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), p. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos incluem entre outros, pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptidos, pró-fármacos de D-aminoácidos modificados, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo β-lactamas, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituídos ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituídos, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco citotóxico mais activo. Os exemplos de fármacos 39 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ citotóxicos que podem ser derivatizados a uma forma de pró-fármaco incluem, entre outros, os agentes quimioterapêuticos anteriormente descritos.

Um "lipossoma" é uma pequena vesícula constituída por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para entrega de um fármaco (tal como anticorpos anti-ErbB2 aqui revelados e opcionalmente um agente quimioterapêutico) a um mamífero. As componentes do lipossoma são habitualmente arranjadas numa formação em bicamada semelhante ao arranjo dos lípidos das membranas biológicas. A expressão "folheto incluso" utiliza-se em referência às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informação acerca das indicações, utilização, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos respeitantes à utilização de tais produtos terapêuticos.

Um "cardioprotector" é um composto ou composição que evita ou reduz disfunção do miocárdio (i.e., cardiomiopatia e/ou insuficiência cardíaca congestiva) associada à administração de um fármaco a um doente tal como antibióticos antraciclinas e/ou um anticorpo anti-ErbB2. Um cardioprotector pode, por exemplo, bloquear ou reduzir um efeito cardiotóxico mediado por radicais livre e/ou evitar ou reduzir lesões de stress oxidativo. Os exemplos de cardioprotectores abrangidos pela presente definição incluem o agente quelante de ferro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of pharmacotherapy, 2_8:1063-1072 (1994)); um agente de diminuição de lípidos e/ou antioxidante tal como probucol (Singal et al., J. Mol Cell Cardiol., 27:1055-1063 (1995)); amifostina (éster di-hidrogenofosfato de aminotiol-2-[(3-aminopropil)amino]etanotiol, também denominado WR-2721 e a sua forma desfosforilada para absorção celular WR-1065) e ácido S-3-(3-metilaminopropilamino)propilfosforotióico (WR-151327), consultar Green et al, Câncer Research, 54:738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R. em: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)); bloqueadores beta tal como metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs 41_: Supl4:31-9 (1994); e Shaddy et al., Am. Heart J. , 129:197-9 (1995)); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); 40

ΕΡ 1 585 955/PT armadilhas de radicais livres tais como ácido oleanólico, ácido ursólico e N-acetilcisteina (NAC); compostos armadilha de spin tal como alfa-fenil-terc-butilnitrona (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res., Γ3:1607-1612 (1993)); compostos seleno-orgânicos tal como P251 (Elbesen); e semelhantes.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está habitualmente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente na forma ou envolvimento da que se encontra na natureza. Assim, as moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que habitualmente expressam o anticorpo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente daquela das células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operacionalmente num organismo hospedeiro especifico. As sequências de controlo adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação de ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e facilitadores. O ácido nucleico está "ligado operacionalmente" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder de excreção está ligado operacionalmente ao ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteína que participa na excreção do polipéptido; um promotor ou facilitador está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se está posicionado de modo a facilitar a tradução. De um modo geral, "ligado operacionalmente" significa que as sequências de ADN a ser 41

ΕΡ 1 585 966/PT ligadas são contíguas e no caso de um líder de excreção, contíguas e em fase de leitura. Contudo, os facilitadores não têm que ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em locais de restrição convenientes. Caso tais locais não existam, utilizam-se adaptadores ou ligantes de oligonucleótidos sintéticos de acordo com a prática convencional.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura de células" são utilizadas indiferentemente e todas de tais designações incluem descendência. Assim, as expressões "produtos de transformação" e "células transformadas" incluem a célula primária do indivíduo e culturas dela derivadas sem ter em conta o número de transferências. Considera-se também que toda a descendência pode não ser precisamente idêntica em termos de conteúdo de ADN devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Incluem-se descendentes mutantes que têm a mesma função ou actividade biológica rastreada nas células originalmente transformadas. Quando se pretenderem designações distintas tal será evidente pelo contexto. Métodos de identificação de tumores sensíveis a tratamento com anticorpos anti-HER2

Fontes de tumores e células tumorais

Os tumores podem caracterizar-se como sensíveis a terapia com 2C4 com base na presença de heterodímeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 à superfície celular como uma medida de activação de HER2. As amostras de tumor podem ser ensaiadas para a presença de heterodímeros por qualquer método conhecido na especialidade. De preferência, determina-se a presença de heterodímeros por um ou mais métodos descritos seguidamente.

Dado que activação HER2 ocorre em resultado de heterodimerização e fosforilação de receptor, um método especialmente importante para identificar tumores sensíveis a terapia com 2C4 é a detecção de fosforilação do receptor ErbB, tal como fosforilação de receptor ErbB2 (HER2), tal como seguidamente descrito. 42

ΕΡ 1 585 966/PT

As fontes de células de tumor que podem ser ensaiadas incluem, entre outras, biópsias de tumor, células de tumor em circulação, proteínas do plasma circulante, fluido de ascites, tumores xenotransplantados e outros modelos de tumor e culturas de células primárias ou linhas celulares derivadas de tumores ou apresentando propriedades do tipo tumoral assim como amostras de tumor conservadas, tal como amostras de tumor fixadas com formalina e embebidas em parafina. 0 rastreio de painéis de vários tipos de células de tumor para heterodímeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 e/ou para fosforilação de receptor ErbB está abrangido pelo presente invento. As células de tumor do mesmo tipo de células de tumor que deram um resultado de ensaio positivo para heterodímeros e/ou fosforilação de receptor ErbB, tal como receptor ErbB2 (HER2), podem ser sujeitas a terapia com 2C4. Os modelos de tumor seguidamente descritos proporcionam-se como exemplos e não devem considerar-se como limitativos do invento.

As células de tumor originárias de um doente que sofre presentemente de um tumor podem ser ensaiadas relativamente a sensibilidade a terapia com 2C4. Caso se determine que as células são sensíveis com base na presença de heterodímeros HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 ou demonstrando fosforilação de receptor ErbB, o doente pode ser subsequentemente tratado com um anticorpo com uma ou mais características biológicas de 2C4. 0 doente é tratado com rhuMAb 2C4.

As células de tumor de um tipo específico de tumor ou células que se pensa terem as características de um tipo específico de tumor, podem ser ensaiadas para a presença de heterodímeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 ou para a fosforilação do receptor ErbB, preferentemente receptor ErbB2 (HER2). Caso se detectem os heterodímeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 e/ou fosforilação de receptor ErbB, considera-se que esse tipo de tumor é um bom candidato para tratamento com rhuMAb 2C4. Os doentes que sofram desse tipo de tumor podem então ser tratados com tal anticorpo. 43

ΕΡ 1 585 966/PT

Xenoenxertos de linhas celulares

Podem fazer-se xenoenxertos de células de tumor propagadas in vitro, tais como células de tumor propagadas em cultura e linhas celulares de tumor, em ratinhos por implante das células directamente num local de interesse. Tais métodos são bem conhecidos dos peritos na especialidade. As células são ensaiadas para identificar a presença de heterodimeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 ou para a fosforilação de receptor ErbB, tal como a fosforilação de receptor ErbB2 (HER2).

As células de tumor podem ser implantadas subcutaneamente num ratinho, de preferência um ratinho nu atimico. As células de tumor podem ser implantadas num local fisiologicamente relevante para criar um modelo de tumor in situ adequado. Por exemplo, podem implantar-se células de uma linha celular de cancro da mama a várias concentrações no tecido gordo mamário de ratinhos nus atimicos para mimetizar mais precisamente a biologia de cancro da mama. As células de tumor podem ser ensaiadas para a presença de heterodimeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3 ou para a fosforilação de receptor ErbB antes ou após implante. De preferência, ensaiam-se as células de tumor após as células implantadas se terem desenvolvido num tumor de um tamanho predeterminado. Os ratinhos podem também ser sujeitos a terapia com 2C4 ou um anticorpo funcionalmente equivalente, com ratinhos não tratados servindo como controlo.

Podem estabelecer-se modelos semelhantes para qualquer tipo de tumor do qual tenham sido derivadas células em cultura ou linhas celulares. Os tipos de tumor incluem, entre outros, de bexiga, cérebro, mama, cólon, esófago, rim, leucemia, fígado, pulmão, melanoma, ovário, pâncreas, próstata, sarcoma, estômago, testículos e útero. As células ou linhas celulares de tumor que sobrexpressam ErbB2 são utilizadas para implante ou podem utilizar-se para implante células ou linhas celulares de tumor que expressam quantidades normais ou inferiores ao normal de ErbB2. Podem utilizar-se para implante células ou linhas celulares de tumor que não são sensíveis a HERCEPTIN®. 44

ΕΡ 1 585 966/PT

Podem implantar-se aproximadamente 20 milhões de células de tumor de mama MDA-175 na gordura de gónadas de ratinho. Determina-se a expressão de dimeros HER2/HER1 e/ou HER2/HER3 na superfície das células do xenoenxerto, tal como por um dos métodos descritos seguidamente. Os ratinhos com tais implantes podem também ser sujeitos a tratamento com 2C4 a 0,3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg ou 100 mg/kg. Outros regimes de dosagem poderiam ser determinados por um perito na especialidade. São particularmente adequados para análise e tratamento os tumores sólidos, tais como cancro da mama, cancro dos ovários, cancro de pulmão, cancro da próstata e cancro colorrectal.

Xenoenxertos de tumor

Podem obter-se espécimes de tumor de mamífero, de preferência espécimes de tumor humano, e implantarem-se em ratinhos, de preferência ratinhos nus atímicos. Os espécimes de tumor podem ser obtidos por qualquer método conhecido na especialidade. Os espécimes de tumor podem ser ressectados cirurgicamente, tal como numa biopsia ou no processo de cirurgia para remover o tumor do mamífero. O espécime de tumor pode ser obtido por purificação de células de tumor em circulação a partir de sangue de mamíferos.

Podem implantar-se fatias de tumor humano sólido de aproximadamente 5x5x0,5 a 1 mm de diâmetro nos flancos de ratinhos nus atímicos, em geral quatro fragmentos por ratinho. Quando os tumores implantados atingem um diâmetro médio de cerca de 10-15 mm, podem ser passados em série, geralmente utilizando fragmentos menores de tumor. Descrevem-se métodos de gerar e estudar xenoenxertos de tumores humanos nas seguintes referências: Fiebig et al., "Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents" em Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Fiebig e Burger, ed. (Basel, Karger 1999), vol. 54, p. 29-50; Berger et al., "Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice" em Immunodeficient Mice in Oncology, Fiebig e Berger, ed. 45

ΕΡ 1 585 956/PT (Basel, Karger 1992), p. 23-46; Fiebig e Burger, "Human Tumor Xenografts and Explants" em Models in Câncer Research Teicher, ed. (Humana Press 2002) p. 113-137.

Os xenoenxertos humanos são considerados altamente previsores do comportamento do tumor no doente dador, dado que o xenoenxerto cresce como um tumor sólido, diferencia-se e desenvolve um estroma, vasculatura e uma necrose central. Na maioria dos casos, os xenoenxertos mantêm a maioria das caracteristicas moleculares, histológicas e patofisiológicas do tumor fresco derivado do doente. As células de tumor de ratinhos contendo tumores de primeira passagem ou de passagens em série podem ser analisadas para a presença de heterodimeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 ou para a fosforilação do receptor ErbB. Os ratinhos podem também ser sujeitos a terapia com 2C4 ou um anticorpo funcionalmente equivalente.

Pode rastrear-se um painel de xenoenxertos de tumor humano já estabelecido ou criado de novo para a presença de heterodimeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3, ou para fosforilação de receptor ErbB Fiebig e Burger, supra, descrevem um painel de mais de 300 xenoenxertos de tumores humanos estabelecidos a partir de vários tipos de cancro comuns, tais como de bexiga, cérebro, mama, cólon, esófago, rim, leucemia, figado, pulmão, melanoma, ovários, pâncreas, próstata, sarcoma, estômago, testículos e útero. O painel completo pode ser rastreado para heterodimeros ou para fosforilação de receptor ErbB, tal como receptor ErbB2 (HER2) . Os subconjuntos deste painel podem também ser rastreados para heterodimeros ou para fosforilação de receptor ErbB, em que os subconjuntos se baseiam, por exemplo, em tipo de tecido, sobrexpressão, subexpressão ou expressão normal de ErbB2 ou incapacidade de responder a HERCEPTIN®. Desta forma, os tumores podem ser classificados como candidatos para terapia com 2C4 com base na presença de heterodimeros ou por demonstrarem fosforilação de receptor ErbB, tal como receptor ErbB2 (HER2). Igualmente, os doentes com tumores assim classificados podem ser mais rapidamente considerados elegíveis para terapia com 2C4 ou com um anticorpo funcionalmente equivalente. 46

ΕΡ 1 585 966/PT

Podem ensaiar-se espécimes de tumor para a presença de heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-BrbB3 ou para a fosforilação de receptor ErbB antes ou após implante. Pode caracterizar-se aproximadamente um grama de tumor de um xenoenxerto de primeira passagem e/ou passagem em série de forma molecular para heterodímeros ou congelá-los em azoto líquido e armazená-los a -80 °C para caracterização posterior. Os xenoenxertos de tumores podem ser analisados adicionalmente por um ensaio de agar-agar macio em dupla camada, também denominado ensaio clonogénico, tal como descrito, por exemplo, em Fiebig e Burger, supra. Desagregam-se mecânica e proteoliticamente xenoenxertos de tumores humanos sólidos para uma suspensão de célula única, que se plaqueia para placas multi-poços com camadas de agar-agar, tal como descrito. O crescimento de células de tumor in vitro leva à formação de colónias, que podem ser analisadas adicionalmente para características moleculares, tais como heterodímeros, ou para fosforilação de receptor ErbB, ou para outras características histoquímicas ou morfológicas. B. Detecção de heterodímeros EGFR-ErbB2 e ErbB2-ErbB3

Pode ser utilizado qualquer método conhecido na especialidade para detectar heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3 em tumores. Descrevem-se seguidamente vários métodos preferidos. Estes métodos detectam interacções proteína-proteína não covalentes ou indicam de outra forma a proximidade entre proteínas de interesse. Os métodos descritos seguidamente apresentam-se como exemplos e não devem ser interpretados como limitando o invento.

Co-imunoprecipitação e transferência imunitária

Podem utilizar-se métodos baseados em imunoafinidade, tais como imunoprecipitação ou ELISA, para detectar heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3. Podem utilizar-se anticorpos anti-ErbB2 para imunoprecipitar complexos compreendendo ErbB2 a partir de células de tumor e seguidamente sonda-se o imunoprecipitado resultante para a presença de EGFR ou ErbB3 por transferência imunitária. Podem utilizar-se anticorpos EGFR ou ErbB3 para a etapa de imunoprecipitação e sonda-se então o imunoprecipitado com 47

ΕΡ 1 585 966/PT anticorpos ErbB2. Podem utilizar-se ligandos ErbB específicos para HER1, HER3, complexos HER2/HER1 ou complexos HER2/HER3 para precipitar complexos, que são então sondados para a presença de HER2. Por exemplo, podem conjugar-se ligandos a avidina e purificarem-se os complexos numa coluna de biotina.

Noutros ensaios, tais como ELISA ou ensaios com anticorpo do tipo "sanduíche", imobilizam-se anticorpos ErbB2 num suporte sólido, põe-se em contacto com células de tumor ou lisados de células de tumor, lavam-se e seguidamente expõe-se a anticorpo EGFR ou ErbB3. A ligação a este último anticorpo, que pode ser detectada directamente ou através de um anticorpo secundário conjugado a um marcador detectável, indica a presença de heterodímeros. 0 anticorpo EGFR ou ErbB3 pode ser imobilizado e utiliza-se o anticorpo ErbB2 para a etapa de detecção. Podem utilizar-se ligandos para receptor ErbB em substituição ou em combinação com anticorpos anti-receptor ErbB. A imunoprecipitação com anticorpo EGFR, ErbB2 ou ErbB3 pode ser seguida por um ensaio funcional para heterodímeros, como uma alternativa ou como um suplemento à imunotransferência. A imunoprecipitação com anticorpo ErbB3 pode ser seguida por um ensaio para actividade de receptor de tirosina quinase no imunoprecipitado. Dado que ErbB3 não tem actividade intrínseca de tirosina quinase, a presença de actividade de tirosina quinase no imunoprecipitado indica que ErbB3 está muito provavelmente associado a ErbB2. Graus-Porta et al., EMBO J., 1_6:1647-55 (1997); Klapper et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 9_6:4995-5000 (1999). Este resultado pode ser confirmado por imunotransferência com anticorpos ErbB2. A imunoprecipitação com anticorpo ErbB2 pode ser seguida por um ensaio para actividade de receptor EGFR de tirosina quinase. Neste ensaio, põe-se em contacto o imunoprecipitado com ATP radioactivo e um substrato de péptido que mimetiza o local de transfosforilação in vivo de ErbB2 por EGFR. A fosforilação do péptido indica co-imunoprecipitação e consequentemente heterodimerização de EGFR com ErbB2. Os ensaios para actividade de receptor de tirosina quinase são bem conhecidos na especialidade e incluem ensaios para detectar fosforilação de substratos alvo, por exemplo, por anticorpo de 48

ΕΡ 1 585 956/PT fosfotirosina e activação de vias de transdução de sinal cognato, tal como a via MAPK.

Serão óbvias e rotineiras variações dos métodos e ensaios anteriores para um perito na especialidade.

Pode utilizar-se reticulação química ou por UV para ligar covalentemente heterodímeros na superfície de células vivas. Hunter et al., Biochem. J., 320:847-53. Os exemplos de agentes químicos de reticulação incluem ditiobis(succinimidil) propionato (DSP) e 3,3'-ditiobis(sulfossuccinimidil) propionato (DTSSP). Podem analisar-se extractos celulares de células de tumor com reticulação química por SDS-PAGE e efectuar-se imunotransferência com anticorpos EGFR e/ou ErbB3. Uma banda super-desviada de peso molecular adequado representa muito provavelmente heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3, dado que ErbB2 é o parceiro de heterodimerização preferido para EGFR e ErbB3. Este resultado pode ser confirmado por imunotransferência subsequente com anticorpos ErbB2. Métodos baseados em FRET e fluorescência

Pode também utilizar-se transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) para detectar heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3. FRET detecta alterações conformacionais de proteína e interacções proteína-proteína in vivo e in vitro com base na transferência de energia de um fluoróforo dador para um fluoróforo aceitador. Selvin, Nat. Struct. Biol., Ί_:Ί30-34. (2000) . Ocorre transferência de energia apenas quando o fluoróforo dador está suficientemente próximo do fluoróforo aceitador. Numa experiência de FRET típica, marcam-se duas proteínas ou dois locais numa única proteína com sondas fluorescentes diferentes. Uma das sondas, a sonda dadora, é excitada a um estado de maior energia por luz incidente de um determinado comprimento de onda. A sonda dadora seguidamente transmite a sua energia para a segunda sonda, a sonda aceitadora, resultando numa redução da intensidade de fluorescência do dador e num aumento da emissão de fluorescência do aceitador. Para medir a extensão da transferência de energia, compara-se a intensidade do dador 49

ΕΡ 1 585 966/PT numa amostra marcada com sonda dadora e aceitadora com a sua intensidade numa amostra marcada apenas com a sonda dadora. Opcionalmente compara-se a intensidade do aceitador em amostras de dador/aceitador e apenas aceitador. São conhecidas na especialidade sondas adequadas e incluem, por exemplo, corantes capazes de permear membranas, tais como fluoresceina e rodamina, corantes orgânicos, tais como corantes de cianina, e átomos de lantanideos. Selvin, supra. São também conhecidos na especialidade métodos e instrumentação para detectar e medir transferência de energia. Selvin, supra. São também conhecidas na especialidade técnicas baseadas em FRET adequadas para detectar e medir interacções proteína-proteína em células individuais. Por exemplo, pode utilizar-se microscopia de fotodegradação de dador de transferência de energia de ressonância de fluorescência (pbFRET) e microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) para detectar a dimerização de receptores de superfície celular. Selvin, supra; Gadella e Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995) . pbFRET pode ser utilizado em células "em suspensão" ou "in situ" para detectar e medir a formação de heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-BrbB3, tal como descrito em Nagy et al., Cytometry, 3_2:120-131 (1998) . Estas técnicas medem a redução do tempo de vida da fluorescência do dador devido a transferência de energia.

Pode utilizar-se uma técnica de FRET do tipo Foerster em citometria de fluxo (FCET) para investigar a heterodimerização de EGFR-ErbB2 e ErbB2-ErbB3, tal como descrito em Nagy et al., supra e Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001) .

Utiliza-se preferencialmente FRET em conjunção com técnicas de marcação imuno-histoquímicas padrão. Kenworthy, Methods, 2_4:289-96 (2001). Por exemplo, podem utilizar-se anticorpos conjugados a corantes fluorescentes adequados como sondas para marcar duas proteínas diferentes. Caso as proteínas estejam próximas uma da outra, os corantes fluorescentes funcionam como dadores e aceitadores para FRET. Detecta-se a transferência de energia por meios padrão. A transferência de energia pode ser detectada por citometria de 50

ΕΡ 1 585 966/PT fluxo ou com sistemas de microscopia digital, tal como microscopia confocal ou microscopia de fluorescência de campo largo acoplado a uma câmara com dispositivo de carga acoplada (CCD).

Podem marcar-se directamente anticorpos ErbB2 e quer anticorpos EGFR, quer anticorpos ErbB3, com dois fluoróforos diferentes, tal como descrito, por exemplo, em Nagy et al, supra. Põe-se em contacto células de tumor ou lisados de células de tumor com os anticorpos marcados diferencialmente, que actuam como dadores e aceitadores para FRET na presença de heterodimeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3. Alternativamente, utilizam-se anticorpos não marcados contra ErbB2 e quer EGFR, quer ErbB3, conjuntamente com anticorpos secundários marcados diferencialmente que actuam como dadores e aceitadores. Consultar, por exemplo, Brockhoff et al., supra. Detecta-se transferência de energia e determina-se a presença de heterodimeros caso se determine que os marcadores estão próximos.

Podem marcar-se com fluorescência ligandos de receptor ErbB que são específicos para HER2 e quer HER1, quer HER3, e utilizam-se para estudos de FRET. A presença de heterodimeros à superfície de células de tumor é demonstrada pela co-localização de ErbB2 com EGFR ou ErbB3 utilizando técnicas de imunofluorescência directas ou indirectas padrão e microscopia de varrimento de laser confocal. Alternativamente, utiliza-se imagem por varrimento de laser (LSI) para detectar ligação de anticorpo e co-localização de ErbB2 com EGFR ou ErbB3 num formato de elevado rendimento, tal como uma placa de micropoços, tal como descrito em Zuck et al, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 96:11122-27 (1999). A presença de heterodimeros EGFR-ErbB2 e/ou ErbB2-ErbB3 pode ser determinada por identificação da actividade enzimática que é dependente da proximidade dos componentes do heterodímero. Conjuga-se um anticorpo ErbB2 com uma enzima e conjuga-se um anticorpo EGFR ou ErbB3 com uma segunda enzima. Adiciona-se um primeiro substrato para a primeira enzima e a reacção produz um segundo substrato para a segunda enzima. 51

ΕΡ 1 585 966/PT

Tal leva a uma reacção com outra molécula para produzir um composto detectável, tal como um corante. A presença de outro produto químico cliva o segundo substrato, de modo a impedir a reacção com a segunda enzima a não ser que a primeira e a segunda enzimas, e consequentemente os dois anticorpos, estejam próximos. Podem pôr-se em contacto células de tumor ou lisados celulares com um anticorpo ErbB2 que se encontra conjugado com glicose oxidase e um anticorpo ErbB3 ou ErbBl que está conjugado com peroxidase de rábano. Adiciona-se glicose à reacção, conjuntamente com um precursor de corante, tal como DAB, e catalase. A presença de heterodímeros é determinada pelo desenvolvimento de cor por coloração com DAB.

Sistema de ensaio eTag™

Podem detectar-se os heterodímeros utilizando métodos baseados no sistema de ensaio eTag™ (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA) , tal como descrito, por exemplo, em WO 83502 e em pedido de patente U.S. 2001/0049105, publicado a 6 de Dezembro de 2001.

Um eTag™ ou "marcador de electroforese" compreende uma parte de repórter detectável, tal como um grupo fluorescente. Também pode compreender um "modificador de mobilidade", que consiste essencialmente de uma parte com uma mobilidade electroforética única. Estas partes permitem separação e detecção do eTag™ numa mistura complexa em determinadas condições electroforéticas, tal como electroforese capilar (CE) . A parte de eTag™ que contém a parte de repórter e, opcionalmente, o modificador de mobilidade está ligada a uma primeira parte de ligação ao alvo através de um grupo de ligação clivável para produzir um primeiro composto de ligação. A primeira parte de ligação ao alvo reconhece especificamente um primeiro alvo específico, tal como um ácido nucleico ou proteína. A primeira parte de ligação ao alvo não está de modo algum limitada e pode ser, por exemplo, um polinucleótido ou um polipéptido. De preferência, a primeira parte de ligação ao alvo é um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Alternativamente, a primeira parte de ligação ao alvo pode ser um ligando de receptor ErbB ou seu fragmento competente para ligação. 52

ΕΡ 1 585 955/PT

De preferência, o grupo de ligação compreende uma parte clivável, tal como um substrato de enzima, ou qualquer ligação química que possa ser clivada em determinadas condições. Quando a primeira parte de ligação ao alvo se liga ao seu alvo, introduz-se ou activa-se o agente de clivagem e cliva-se o grupo de ligação, libertando assim a parte de eTag™ que contém a parte repórter e o modificador de mobilidade. Assim, a presença de um eTag™ "livre" indica ligação da parte de ligação ao alvo ao seu alvo.

De preferência, um segundo composto de ligação compreende o agente de clivagem e uma segunda parte de ligação ao alvo que reconhece especificamente um segundo alvo. A segunda parte de ligação ao alvo não está de forma alguma limitada e pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou um ligando de receptor ErbB ou fragmento de ligando competente para ligação. 0 agente de clivagem é tal que apenas clivará o grupo de ligação no primeiro composto de ligação caso o primeiro composto de ligação e o segundo composto de ligação estejam próximos.

Um primeiro composto de ligação pode compreender um eTag™ no qual um anticorpo para ErbB2 funciona como a primeira parte de ligação ao alvo. Um segundo composto de ligação pode compreender um anticorpo para EGFR ou ErbB3 ligado a um agente de clivagem capaz de clivar o grupo de ligação do eTag™. De preferência, o agente de clivagem tem que ser activado de modo a ser capaz de clivar o grupo de ligação. Põe-se em contacto células de tumor ou lisados de células de tumor com o eTag™, que se liga a ErbB2, e com o anticorpo EGFR ou ErbB3 modificado, que se liga a EGFR ou ErbB3 na superfície celular. De preferência, remove-se o composto de ligação não ligado e activa-se o agente de clivagem, caso necessário. Caso estejam presentes heterodímeros EGFR-ErbB2 ou ErbB2-ErbB3, o agente de clivagem clivará o grupo de ligação e liberta o eTag™ devido à proximidade do agente de ligação e do grupo de ligação. Pode detectar-se então eTag™ livre por qualquer método conhecido na especialidade, tal como electroforese capilar. 53

ΕΡ 1 585 955/PT Ο agente de clivagem pode ser uma espécie activável quimicamente que actua no grupo de ligação. Por exemplo, o agente de clivagem pode ser activado por exposição da amostra a luz. 0 eTag™ pode ser construído utilizando um anticorpo para EGFR ou ErbB3 como a primeira parte de ligação ao alvo e constrói-se o segundo composto de ligação a partir de um anticorpo para ErbB2.

Detecção de fosforilação de receptor ErbB

Pode utilizar-se a presença de fosforilação de receptor ErbB para demonstrar activação de HER2.

Pode avaliar-se a fosforilação de receptor ErbB por imunoprecipitação de um ou mais receptores ErbB, tal como receptor ErbB2 (HER2) e análise de hibridação "Western". Por exemplo, pode determinar-se uma resposta positiva pela presença de uma banda fosfo-HER2 no gel, utilizando um anticorpo anti-fosfotirosina para detectar resíduo(s) de tirosina fosforilado(s) no(s) receptor(es) ErbB no imunoprecipitado. Os anticorpos anti-fosfotirosina estão disponíveis comercialmente de PanVera (Madison, WI), uma subsidiária de Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA) ou Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . 0 resultado negativo determina-se pela ausência da banda. A fosforilação de receptor ErbB2 (HER2) pode ser avaliada por imuno-histoquímica utilizando um anticorpo anti-HER2 específico para fosforilação (clone PN2A; Thor et al, J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)).

Outros métodos para detectar fosforilação de receptor(es) ErbB incluem, entre outros, KIRA ELISA (patentes U.S. N° 5 766 863; 5 891 650; 5 914 237; 6 025 145; e 6 287 784), espectrometria de massa (comparando o tamanho de HER2 fosforilado e não fosforilado) e ensaio de proximidade de e-tag com anticorpo anti-HER2 (e.g., utilizando o kit de ensaio eTag™ disponível de Aclara BioSciences (Mountain View, CA) . Os detalhes do ensaio eTag™ descreveram-se aqui anteriormente detalhadamente. 54

ΕΡ 1 585 955/PT

Vectores, células hospedeiras e métodos recombinantes

Descreve-se aqui ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo humanizado anti-ErbB2 rhuMAb 2C4, vectores e células hospedeiras compreendendo o ácido nucleico e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo. Para a produção recombinante de um anticorpo, isola-se o ácido nucleico que o codifica e insere-se num vector replicável para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN que codifica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., por utilização de sondas de oligonucleótidos que são capazes de ligar especificamente os genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Encontram-se disponíveis muitos vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinalização, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento facilitador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição.

Componente de sequência de sinalização

Pode produzir-se recombinantemente Rhu MAb 2C4 não só directamente, mas também como polipéptidos de fusão com um polipéptido heterólogo, que de preferência é uma sequência de sinalização ou outro polipéptido com um local de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduro. A sequência de sinalização heteróloga é de preferência seleccionada por ser reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinalização) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem, nem processam a sequência de sinalização nativa do anticorpo anti-ErbB2, a sequência de sinalização é substituída por uma sequência de sinalização procariótica seleccionada, por exemplo, do grupo dos líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou enterotoxina II estável ao calor. Para excreção por levedura, a sequência de sinalização nativa pode ser substituída, e.g., pelo líder de invertase de levedura, líder de factor α (incluindo líderes de factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces) , ou líder de fosfatase ácida, líder de glucoamilase de C. albicans ou o sinal descrito em 55

ΕΡ 1 585 966/PT WO 90/13646. Em expressão em células de mamífero, estão disponíveis sequências de sinalização de mamífero, bem como líderes de excreção víricos, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex.

Liga-se o ADN de tal região precursora em quadro de leitura com o ADN que codifica o anticorpo anti-ErbB2.

Componente de origem de replicação

Tanto os vectores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Em geral, em vectores de clonagem, esta sequência é tal que permite que o vector replique independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas para várias bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2μ é adequada para leveduras e várias origens víricas (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Em geral, a origem do componente de replicação não é necessária para vectores de expressão em mamífero (pode ser utilizada tipicamente a origem SV40 apenas porque contém o promotor precoce).

Componente de gene de selecção

Os vectores de expressão e clonagem podem conter um gene de selecção, também denominado um marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) deficiências auxotróficas de complementos ou (c) fornecimento indisponível de nutrientes críticos no meio complexo, e.g., o gene que codifica D-alanina racemase para bacilos.

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e 56

ΕΡ 1 585 966/PT assim sobrevivem a regime de selecção. Os exemplos de tal selecção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico do anticorpo anti-ErbB2, tal como DHFR, timidina quinase, metalotioneina-I e metalotioneina-II, de preferência genes de metalotioneina de primatas, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.

Por exemplo, primeiramente identificam-se células transformadas com o gene de selecção DHFR por cultura de todos os produtos de transformação num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira adequada quando se utiliza DHFR de tipo selvagem é a linha celular de hamster chinês (CHO) deficiente na actividade DHFR.

Alternativamente, podem seleccionar-se células hospedeiras (em particular hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN que codificam anticorpo anti-ErbB2, proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador seleccionável, tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) por cultura das células num meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, e.g., canamicina, neomicina ou G418. Consultar patente U.S. n° 4 965 199.

Um gene de selecção adequado para utilização em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). 0 gene trpl proporciona um marcador seleccionável para uma estirpe de levedura mutante sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detectar transformação por crescimento na ausência de triptofano. De igual modo, complementam-se estirpes de 57

ΕΡ 1 585 966/PT levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) com plasmideos conhecidos contendo o gene Leu2.

Além disso, podem utilizar-se vectores derivados de um plasmideo circular de 1,6 pm pKDl para transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, relatou-se um sistema de expressão para produção em larga escala de quimosina de vitelo recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8_:135 (1990). Foram também revelados vectores de expressão de múltiplas cópias estáveis para excreção de albumina sérica humana recombinante madura por estirpes industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, _9:968-975 (1991).

Componente de promotor

Os vectores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado operacionalmente ao ácido nucleico de anticorpo anti-Erb2. Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas de promotor de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tal como o promotor tac. No entanto, são adequados outros promotores bacterianos conhecidos. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgamo (S.D.) ligada operacionalmente ao ADN que codifica o anticorpo anti-ErbB2.

Conhecem-se sequências de promotor para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde se inicia a transcrição. Outra sequência encontrada a 70 a 80 bases a montante do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT em que N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos encontra-se uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição de uma cauda poli A na extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são inseridas adequadamente em vectores de expressão eucarióticos. 58

ΕΡ 1 585 966/PT

Os exemplos de sequências de promotor adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tal como enolase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofructoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores induziveis com a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de cultura, são as regiões de promotor para desidrogenase alcoólica 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Descrevem-se adicionalmente vectores e promotores adequados para utilização em expressão de levedura em EP 73 657. Os facilitadores de levedura são também utilizados vantajosamente com promotores de levedura. A transcrição de anticorpo anti-ErbB2 a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus, tais como vírus de polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovina, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e com a maior preferência vírus 40 símio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, e.g., o promotor de acção ou um promotor de imunoglobulina, promotor de choque térmico, desde que os promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são obtidos convenientemente com um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação vírica de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente como um fragmento de restrição HindiII E. Revela-se um sistema para expressão de ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como um vector em patente U.S. n° 4 419 446. Descreve-se uma modificação deste sistema em patente U.S. n° 4 601 978. 59

ΕΡ 1 585 955/PT

Consultar também Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) sobre expressão de ADNc de interferão β humano em células de ratinho, sob o controlo de um promotor de timidina quinase de vírus de herpes simplex. Alternativamente, pode utilizar-se como promotor a repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous.

Componente de elemento facilitador A transcrição de um ADN que codifica o anticorpo anti-ErbB2 deste invento por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência facilitadora no vector. São conhecidas muitas sequências facilitadoras de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Contudo, tipicamente, utilizar-se-á um facilitador de um vírus de célula eucariótica. Os exemplos incluem o facilitador SV40 do lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o facilitador de promotor precoce de citomegalovírus, o facilitador de polioma do lado tardio da origem de replicação e facilitadores de adenovírus. Consultar também Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos facilitadores para activação de promotores eucarióticos. O facilitador pode ser sujeito a splicing para o vector numa posição 5' ou 3' relativamente à sequência de codificação de anticorpo anti-ErbB2, mas de preferência localiza-se num local a 5' do promotor.

Componente de terminação de transcrição

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, de fungo, de insecto, de plantas, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar o ARNm. Tais sequências são usualmente disponíveis das regiões não traduzidas a 5' e, ocasionalmente a 3', de ADN ou ADNc eucariótico ou vírico. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do ARNm que codifica o anticorpo anti-ErbB2. Uma componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação da hormona de 60 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ crescimento bovina. Consultar WO94/11026 e o vector de expressão ai revelado.

Selecção e transformação de células hospedeiras

As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o ADN nos vectores aqui são células procarióticas, de levedura ou de eucariotas superiores, descritas anteriormente. Os procariotas adequados para este objectivo incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobactérias tais como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia,

Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans e Shigella, bem como bacilos, tais como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P revelado em DD 266 710 publicado a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Um dos hospedeiros de clonagem preferidos de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora também sejam adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) e E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos.

Além dos procariotas, os micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vectores que codificam anticorpo anti-ErbB2. Saccharomyces cerevisiae, ou vulgar fermento de padeiro, é o mais comumente utilizado entre os microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Contudo, estão usualmente disponíveis e são aqui úteis vários outros géneros, espécies e estirpes, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces tais como, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K.

thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger. 61

ΕΡ 1 585 966/PT

As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo anti-ErbB2 glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insectos. Foram identificadas numerosas estirpes de baculovirus e variantes, e as correspondentes células hospedeiras de insectos permissivas, de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca do vinagre) e Bombyx mori. Encontram-se publicamente disponíveis várias estirpes de vírus para transfecção, e.g., a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser utilizados como os presentes vírus de acordo com o presente invento, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

Também podem ser utilizadas como hospedeiros culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco.

No entanto, tem havido um elevado interesse em células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento rotineiro. Os exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virai., 3_6:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovários de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)); células sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. , 2_3:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1

ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2). 52

ΕΡ 1 585 955/PT

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou clonagem anteriormente descritos para produção de anticorpo anti-ErbB2 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado como adequado para induzir promotores, seleccionar produtos de transformação ou amplificar os genes que codificam as sequências pretendidas.

Cultura das células hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo anti-ErbB2 deste invento podem ser cultivadas em vários meios. Os meios disponíveis comercialmente tais como Ham FIO (Sigma), meio mínimo essencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e meio Eagle modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, podem utilizar-se como meio de cultura para as células hospedeiras quaisquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), patentes U.S. N° 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 4 560 655; ou 5 122 469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou pedido de patente U.S. 30 985. Quaisquer destes meios podem ser suplementados como necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tal como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN®), elementais vestigiais (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes a concentrações finais na gama micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Podem também ser incluídos quaisquer outros suplementos necessários a concentrações adequadas que são conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para os peritos na especialidade.

Purificação de anticorpo anti-ErbB2

Quando se utilizam técnicas recombinantes, os anticorpos podem ser produzidos intracelularmente, no espaço 63 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ periplásmico, ou podem ser excretados directamente para o meio. Caso o anticorpo seja produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, removem-se os resíduos em partículas, quer células hospedeiras, quer fraqmentos lisados, por exemplo por centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology, 1_0:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são excretados para o espaço periplásmico de E. coli. Sucintamente, descongela-se pasta celular na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 min. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Nos casos em que o anticorpo é excretado para o meio, em geral primeiramente concentram-se os sobrenadantes de tais sistemas de expressão utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Pode incluir-se um inibidor de protease, tal como PMSF, em qualquer das etapas anteriores para inibir proteólise e podem incluir-se antibióticos para impedir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequação de proteína A como um ligando de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que se encontre presente no anticorpo. Pode utilizar-se proteína A para purificar anticorpos que se baseiam em cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., _62:1-13 (1983)). Recomenda-se proteína G para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986)). A matriz à qual se liga o ligando de afinidade é mais frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. As matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de porosidade controlada ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem fluxos mas rápidos e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser conseguidos com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3 é útil para purificação uma resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) . Estão também disponíveis 54

ΕΡ 1 585 955/PT outras técnicas para purificação de proteína, tal como fraccionação numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC em fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™ numa resina permutadora aniónica ou catiónica (tal como coluna de ácido poliaspártico), electrofocalização, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Seguindo qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser sujeita a cromatografia de interacção hidrofóbica a pH baixo, utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca 2,5-4,5, de preferência efectuada a baixas concentrações de sal (e.g., de cerca de 0-0,25 M de sal) .

Formulações farmacêuticas

As formulações terapêuticas do anticorpo utilizadas de acordo com o presente invento são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo com o grau de pureza pretendido com transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio; cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou álcool benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulina; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono 65

ΕΡ 1 585 966/PT incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tal como sódio; complexos metálicos (e.g, complexos Zn-proteina); e/ou tensioactivos não iónicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). Descrevem-se formulações de anticorpo anti-ErbB2 liofilizado preferidas em WO 97/04801.

Aqui, a formulação pode também conter mais do que um composto active, caso necessário para a doença especifica a ser tratada, de preferência compostos com actividades complementares que não se afectam adversamente entre si. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente anticorpos que se ligam a EGFR, ErbB2 (e.g., um anticorpo que se liga a um epitopo diferente em ErbB2), ErbB3, ErbB4 ou factor endotelial vascular (VEGF) numa formulação. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreender adicionalmente um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citoquina, agente de inibição de crescimento, agente anti-hormonal, fármaco que tem como alvo EGFR, agente anti-angiogénico e/ou cardioprotector. Tais moléculas são apresentadas adequadamente em combinação em quantidades que são eficazes para o fim em vista.

Os ingredientes activos podem também ser encapsulados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato) , respectivamente, em sistemas coloidais de entrega de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, micro-emulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macro-emulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Podem preparar-se preparações de libertação controlada. Os exemplos adequados de preparações de libertação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes essas que se encontram sob a forma de artigos enformados, e.g., filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, 55

ΕΡ 1 585 955/PT poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactideos (patente U.S. n° 3 773 919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etilenovinil acetato não degradável, ácido láctico-ácido glicólico degradável, copolímeros tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolideo) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Tal é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéril.

Tratamento com anticorpos anti-ErbB2

Considera-se que o anticorpo anti-ErbB2 rhuMab2C4 é utilizado para tratar cancro da mama, cancro de pulmão, cancro de ovário, incluindo cancro de ovário avançado, refractário ou reincidente, e cancro da próstata. 0 cancro compreenderá geralmente células que expressam ErbB2, de modo que o anticorpo anti-ErbB2 aqui seja capaz de se ligar ao cancro. Embora o cancro possa ser caracterizado por sobrexpressão do receptor ErbB2, o presente pedido proporciona adicionalmente tratamento de cancro que não se considera como cancro que sobrexpressa ErbB2. Para determinar a expressão de ErbB2 no cancro, encontram-se disponíveis vários ensaios de diagnóstico/prognóstico. A sobrexpressão de ErbB2 pode ser analisada por IHC, e.g. utilizando HERCEPTEST® (Dako). Podem sujeitar-se secções de tecido de uma biópsia de tumor embebidas em parafina a um ensaio IHC e de acordo com os seguintes critérios de intensidade de coloração de proteína ErbB2:

Pontuação 0 não se observa qualquer coloração ou observa-se coloração da membrana em menos de 10% das células de tumor.

Pontuação 1+ detecta-se coloração de membrana débil/fracamente perceptível em mais de 10% das células de tumor. As células apenas são coradas em parte da sua membrana. 67

ΕΡ 1 585 965/PT

Pontuação 2+ observa-se coloração fraca a moderada de toda a membrana em mais de 10% das células de tumor.

Pontuação 3+ observa-se coloração moderada a forte de toda a membrana em mais de 10% das células de tumor.

Os tumores com pontuações de 0 ou 1+ na avaliação da sobrexpressão de ErbB2 podem ser caracterizados como não sobrexpressando ErbB2, enquanto os tumores com pontuações de 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobrexpressando ErbB2.

Alternativa ou adicionalmente podem efectuar-se ensaios FISH tal como INFORM™ (comercializado por Ventana, Arizona) ou PATHVISION™ (Vysis, Illinois) em tecido de tumor fixado em formalina, embebido em parafina para determinar a extensão (caso exista) da sobrexpressão de ErbB2 no tumor.

Numa concretização, o cancro será aquele que expressa EGFR (e pode sobrexpressar EGFR, mas não necessariamente).

Aqui, o cancro a ser tratado pode ser caracterizado por activação excessiva de um receptor ErbB, e.g. EGFR. Tal activação excessiva pode ser atribuível a sobrexpressão ou produção aumentada do receptor ErbB ou de um ligando ErbB.

Pode efectuar-se um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se o cancro do doente é caracterizado pela activação excessiva de um receptor ErbB. Por exemplo, pode determinar-se amplificação do gene ErbB e/ou sobrexpressão de um receptor ErbB no cancro. Encontram-se disponíveis na especialidade vários ensaios para determinar tal amplificação/sobrexpressão e incluem os ensaios IHC, FISH e de antigénio livre em circulação descritos anteriormente. Alternativa ou adicionalmente podem determinar-se os níveis de um ligando ErbB, tal como TGF-α, no tumor ou a ele associado, de acordo com procedimentos conhecidos. Tais ensaios podem detectar proteína e/ou ácido nucleico que a codifica na amostra a ser ensaiada. Os níveis de ligando ErbB no tumor podem ser determinados utilizando imuno-histoquímica (IHC); consultar, por exemplo, Scher et al., Clin. Câncer 68

ΕΡ 1 585 966/PT

Research, 3^:545-550 (1995). Alternativa ou adicionalmente, podem avaliar-se os níveis de ácido nucleico que codifica o ligando ErbB na amostra a ser ensaiada; e.g., através de técnicas de FISH, transferência "Southern" ou PCR.

Além disso, pode avaliar-se sobrexpressão ou amplificação de receptor ErbB ou de ligando ErbB utilizando um ensaio de diagnóstico in vivo, e.g., por administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que se liga à molécula a ser detectada e que está marcado com um marcador detectável (e.g., um isótopo radioactivo) e rastreio externo do doente para localização do marcador.

Quando o cancro a ser tratado é cancro independente de hormonas, pode avaliar-se a expressão da hormona (e.g., androgénio) e/ou do seu receptor cognato no tumor utilizando qualquer um de vários ensaios disponíveis, e.g, tal como descrito anteriormente. Alternativa ou adicionalmente pode diagnosticar-se o doente como tendo cancro independente de hormona caso já não responda a terapia anti-androgénio.

Pode administrar-se ao doente um imunoconjugado compreendendo um anticorpo anti-ErbB2 conjugado a um agente citotóxico. De preferência, o imunoconjugado e/ou proteína ErbB2 à qual se liga são internalizados pela célula, resultando numa eficácia terapêutica aumentada do imunoconjugado para matar a célula de cancro à qual se liga. O agente citotóxico tem como alvo ou interfere com o ácido nucleico na célula de cancro. Os exemplos de tais agentes citotóxicos incluem maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e ADN endonucleases. O anticorpo para administração é rhuMAb 2C4. RhuMAb 2C4 é um anticorpo monoclonal humanizado baseado nas sequências de esqueleto de IgGl humana e que consiste de duas cadeias pesadas (449 resíduos) e duas cadeias leves (214 resíduos). RhuMAb 2C4 difere significativamente de outro anticorpo anti-HER2 HERCEPTIN® (Trastuzumab) nas regiões de ligação de epítopo da cadeia leve e da cadeia pesada. Em resultado, rhuMAb 2C4 liga-se a um epítopo completamente diferente em HER2. 0 presente invento proporciona métodos sensíveis para identificar cancros sensíveis a tratamento com rhuMAb 2C4 ou 69 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ seus equivalentes funcionais. Deve salientar-se que tais cancros sensíveis a tratamento com rhuMAb 2C4 não têm que necessariamente sobrexpressar HER2.

Os anticorpos ou imunoconjugados anti-ErbB2 são para administração a um doente humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, e.g., como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação. É preferida a administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo.

Podem combinar-se outros regimes terapêuticos com a administração de um anticorpo anti-ErbB2. A administração combinada inclui co-administração, utilizando formulações independentes ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem em que, de preferência, existe um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exercem simultaneamente as suas actividades biológicas. 0 doente pode ser tratado com dois anticorpos anti-ErbB2 diferentes. Por exemplo, o doente pode ser tratado com rhu mAb 2C4 como um primeiro anticorpo anti-ErbB2 e também com um segundo anticorpo anti-ErbB2 que inibe o crescimento (e.g. HERCEPTIN®) ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose de uma célula que sobrexpressa ErbB2 (e.g., 7C2, 7F3 ou suas variantes humanizadas). De preferência, tal terapia combinada resulta num efeito de sinergia terapêutica. Por exemplo, pode tratar-se o doente com HERCEPTIN® e seguidamente trata-se com rhuMAb 2C4, e.g., quando o doente não responde a terapia de HERCEPTIN®. 0 doente pode primeiramente ser tratado com rhuMAb 2C4 e seguidamente receber terapia de HERCEPTIN®. 0 doente pode ser tratado com ambos rhuMAb 2C4 e HERCEPTIN® simultaneamente.

Pode também ser desejável combinar a administração do anticorpo anti-ErbB2 com administração de um anticorpo dirigido contra outro antigénio associado a tumor. Neste caso, o outro anticorpo pode, por exemplo, ligar-se a EGFR, 70 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ

ErbB3, ErbB4 ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) . O tratamento pode envolver a administração combinada do anticorpo anti-ErbB2 e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes de inibição de crescimento, incluindo co-administração de misturas de diferentes agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos preferidos incluem taxanos (tal como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. A preparação e calendário de dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou tal como determinado empiricamente pelo perito na especialidade. A preparação e calendário de dosagem para tal quimioterapia encontra-se também descrita em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams e Wilkins, Baltimore, MD (1992). O anticorpo pode ser combinado com um composto anti-hormonal; e.g., um composto anti-estrogénio tal como tamoxifeno; uma anti-progesterona tal como onapristona (consultar, EP 616 812); ou um anti-androgénio tal como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Quando o cancro a ser tratado é cancro independente de hormona, o doente pode ter sido anteriormente sujeito a terapia anti-hormonal e, após o cancro se tornar independente de hormona, pode administrar-se o anticorpo anti-ErbB2 (e opcionalmente outros agentes tal como aqui descrito) ao doente.

Algumas vezes pode ser benéfico co-administrar também um cardioprotector (para evitar ou reduzir a disfunção miocárdica associada à terapia) ou uma ou mais citoquinas ao doente. Pode também co-administrar-se um fármaco que tem como alvo EGFR ou um agente anti-angiogénico. Além dos regimes terapêuticos anteriores, o doente pode ser sujeito a remoção cirúrgica de células de cancro e/ou radioterapia.

Aqui, os anticorpos anti-ErbB2 podem também ser combinados com um fármaco que tem como alvo EGFR, tal como os discutidos anteriormente na secção de definições, resultando num efeito terapêutico complementar e potencialmente com sinergia. 71

ΕΡ 1 585 966/PT

Os exemplos de fármacos adicionais que podem ser combinados com o anticorpo incluem agentes quimioterapêuticos tal como carboplatina, um taxano (e.g., paclitaxel ou docetaxel) , gemcitabina, navelbina, cisplatina, oxaliplatina ou combinações de quaisquer destes, tais como carboplatina/docetaxel; outro anticorpo anti-HER2 (e.g., um anticorpo anti-HER2 inibidor de crescimento, tal como HERCEPTIN®, ou um anticorpo anti-HER2 que induz apoptose tal como 7C2 ou 7F3, incluindo suas variantes humanizadas ou amadurecidas por afinidade); um inibidor de farnesil transferase; um agente anti-angiogénico (e.g., um anticorpo anti-VEGF) ; um fármaco que tem como alvo EGFR (e.g., C225 ou ZD1839); uma citoquina (e.g., IL-2, IL-12, G-CSF ou GM-CSF); ou combinações dos anteriores.

As dosagens adequadas para qualquer dos agentes co-administrados anteriores são as que se utilizam actualmente e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinergia) do agente e do anticorpo anti-ErbB2, rhuMAb 2C4.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem de anticorpo adequada dependerá do tipo de doença a ser tratada, tal como definida anteriormente, da gravidade e progressão da doença, do anticorpo ser administrado com objectivos preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, da história clínica do doente e da resposta ao anticorpo e do critério do médico assistente.

As doses são para administração intermitente de três em três semanas (e.g., de modo que o doente recebe desde cerca de dois a cerca de vinte, e.g., cerca de seis doses do anticorpo anti-ErbB2). Pode ser administrada uma dose de carga inicial superior, seguida por uma ou mais doses menores. 0 progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais. 0 rhuMAb 2C4 é para administração numa dose fixa de 420 mg (equivalente a doses de 6 mg/kg para um indivíduo de 70 kg) de 3 em 3 semanas. O tratamento pode iniciar com uma dose de carga superior (e.g., 840 mg, equivalente a 12 mg/kg de 72

ΕΡ 1 585 966/PT peso corporal) de modo a atingir concentrações séricas no estado estacionário mais rapidamente. Também se proporcionam regimes de dosagem específicos nos seguintes exemplos.

Artigos de fabrico

Também se revela um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento das doenças descritas anteriormente. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e uma etiqueta ou folheto incluso no recipiente ou a ele associado. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frasquinhos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados por vários materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a doença e pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasquinho com uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um dos agentes activos na composição é um anticorpo anti-ErbB2. A etiqueta ou folheto incluso indica que a composição é utilizada para tratar a doença seleccionada, tal como cancro. A etiqueta ou folheto incluso pode indicar que a composição compreendendo o anticorpo que se liga a ErbB2 pode ser utilizada para tratar um doente que sofre de um tumor no qual se identificou a presença de complexos HER2/HER1 e/ou HER2/HER3 e/ou HER2/HER4 e/ou em que se detectou fosforilação do receptor ErbB. Além disso, o artigo de fabrico pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um primeiro anticorpo que se liga a ErbB2 e inibe o crescimento de células de cancro que sobrexpressa ErbB2; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um segundo anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a activação de ligando de um receptor ErbB. 0 artigo de fabrico pode compreender adicionalmente um folheto incluso indicando que as composições do primeiro e do segundo anticorpos podem ser usadas para tratar cancro caracterizado pela presença de heterodímeros HER2/HER1 e/ou HER2/HER3 e/ou HER2/HER4 e/ou pela fosforilação de receptor ErbB. Além disso, o folheto incluso pode ter instruções para o utilizador da composição (compreendendo um anticorpo que se liga a ErbB2 e bloqueia 73

ΕΡ 1 585 966/PT activação de ligando de um receptor ErbB) para combinar terapia com o anticorpo e qualquer das terapias conjuntas descritas na secção anterior (e.g. um agente quimioterapêutico, um fármaco que tem como alvo EGFR, um agente anti-angiogénico, um composto anti-hormonal, um cardioprotector e/ou uma citoquina). Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabrico pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção (BWFI), solução salina tamponada de fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Depósito de materiais

As seguintes linhas celulares de hibridoma foram depositadas em American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC): N° ATCC ATCC HB-12215 ATCC HB-12216 ATCC CRL 10463 ATCC HB-12697

Nome do anticorpo 7C2 7F3 4D5 2C4

Data de depósito 17 de Outubro de 1996 17 de Outubro de 1996 24 de Maio de 1990 8 de Abril de 1999

Ilustram-se detalhes adicionais do invento pelos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1 A associação de ErbB2 com ErbB3 dependente de HRG é bloqueada pelo anticorpo monoclonal 2C4 O anticorpo monoclonal murino 2C4, que se liga especificamente ao domínio extracelular de ErbB2, descreve-se em WO 01/89566. A capacidade de ErbB3 se associar a ErbB2 foi ensaiada numa experiência de co-imunoprecipitação. Inocularam-se 1,0 x 74

ΕΡ 1 585 955/PT ΙΟ6 células MCF7 ou SK-BR-3 em placas de cultura de tecidos de seis poços em meio DMEM/F12 de Ham 50:50 contendo soro fetal bovino (FBS) a 10% e HEPES 10 mM, pH 7,2 (meio de cultura) e deixaram-se ligar durante a noite. Deixam-se as células em jejum durante duas horas em meio de cultura sem soro antes de iniciar a experiência.

Lavaram-se as células brevemente com solução salina tamponada de fosfato (PBS) e seguidamente incubaram-se com o anticorpo indicado 100 nM diluído em albumina de soro bovino (BSA) a 0,2% p/v, meio RPMI, com HEPES 10 mM, pH 7,2 (tampão de ligação) ou apenas com tampão de ligação (controlo) . Após uma hora à temperatura ambiente, adicionou-se HRG a uma concentração final de 5 nM a metade dos poços (+). Adicionou-se um volume semelhante de tampão de ligação aos outros poços (-). Continuou-se a incubação durante aproximadamente 10 minutos.

Removeram-se os sobrenadantes por aspiração e lisaram-se as células em RPMI, HEPES 10 mM, pH 7,2, TRITON X-100™ a 1,0% v/v; CHAPS a 1,0% p/v (tampão de lise), contendo PSMF 0,2 mM, leupeptina a 10 pg/ml e aprotinina a 10 TU/ml. Os lisados foram clarificados removendo o material insolúvel por centrifugação.

Imunoprecipitou-se ErbB2 utilizando um anticorpo monoclonal acoplado covalentemente a um gel de afinidade (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Este anticorpo (Ab-3, Oncogene Sciences, USA) reconhece um epítopo do domínio citoplasmático. Efectuou-se imunoprecipitação por adição de 10 μΐ de pasta de gel contendo aproximadamente 8,5 pg de anticorpo imobilizado a cada lisado e deixaram-se as amostras misturar à temperatura ambiente durante duas horas. Recolheram-se então os géis por centrifugação. Lavaram-se os géis por imersão três vezes com tampão de lise para remover material não ligado. Adicionou-se então tampão de amostra com SDS e aquecerem-se as amostras brevemente num banho de água a ferver.

Correram-se os sobrenadantes em géis de poliacrilamida a 4-12% e electrotransferiram-se para membranas de nitrocelulose. A presença de ErbB3 foi avaliada por sondagem 75 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ das transferências com um anticorpo policlonal contra um seu epitopo de domínio citoplasmático (c-17, Santa Cruz Biotech). As transferências foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente (ECL, Amersham).

Tal como apresentado nas pistas de controlo das figuras 2A e 2B, para células MCF7 e SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 encontrava-se presente num imunoprecipitado com ErbB2 apenas quando as células tinham sido estimuladas com HRG. Nos casos em que as células foram primeiramente incubadas com anticorpo monoclonal 2C4, o sinal ErbB3 desapareceu nas células MCF7 (figura 5A, pista 2C4 +) ou foi substancialmente reduzido em células SK-BR-3 (figura 5B, pista 2C4+). Tal como apresentado nas figuras 2A-B, o anticorpo monoclonal 2C4 bloqueia a associação de ErbB3 a ErbB2 dependente de heregulina tanto em células MCF7, como em SK-BR-3 de uma forma substancialmente mais eficaz do que HERCEPTIN®. A pré-incubação com HERCEPTIN® diminuiu o sinal ErbB3 nos lisados de MCF7 mas teve pouco ou nenhum efeito na quantidade de ErbB3 co-precipitado em lisados de células SK-BR-3. A pré-incubação com um anticorpo contra o receptor EGF (Ab-1, Oncogene Sciences, USA) não teve qualquer efeito na capacidade de ErbB3 co-imunoprecipitar com ErbB2 em qualquer das linhas celulares.

Exemplo 2

Sensibilidade a 2C4 de linhas celulares e modelos de xeno-enxerto de tumor humano

Ensaiaram-se aproximadamente 40 modelos de tumor para sensibilidade a 2C4. Estes modelos representam os principais cancros tais como de mama, pulmão, próstata e cólon. 50-60% dos modelos foi sensível a tratamento com 2C4. A tabela 1 seguinte apresenta uma lista de modelos de tumor seleccionados ensaiados para sensibilidade a 2C4. Sucintamente, transplantaram-se fragmentos de xeno-enxerto de tumor humano de cerca de 3 mm de tamanho por baixo da pele de ratinhos nus atímicos. Alternativamente destacaram-se das placas de cultura células de tumor humano cultivadas in vitro, ressuspenderam-se em solução salina tamponada de fosfato e injectaram-se subcutaneamente no flanco de ratinhos imunocomprometidos. Monitorizou-se o crescimento dos tumores 76 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ de 2 em 2 ou de 3 em 3 dias utilizando uma craveira eléctrica. Quando os tumores atingiram um tamanho de cerca de 30 a 100 mm, os animais foram distribuídos aleatoriamente por grupos diferentes de tratamento e de controlo. Administrou-se 2C4 por injecção intraperitoneal uma vez por semana. Os animais de controlo receberam volumes iguais de solução de veículo sem anticorpo na mesma calendarização dos grupos de tratamento. Terminou-se o estudo após aproximadamente 3-6 semanas, quando os tumores do grupo de controlo atingiram um tamanho de cerca de 1000 - 1500 mm3. A sensibilidade a tratamento foi definida como ^ 50% redução de volume de tumor.

Tabela 1: Modelos de xeno-enxerto

Modelo n° Modelo de tumor Sensibilidade a 2C4 Referência 1 LXFA 289 Não (Fiebig et al. , 1999) 2 LXFA 297 Sim 3 LXFA 526 Não (Fiebig et al. , 1999) 4 LXFA 629 Sim (Fiebig e Burger, 2002) 5 LXFA 1041 Não 6 LXFE 211 Não (Fiebig et al., 1999) 7 LXFE 397 Não (Fiebig et al., 1999) 8 LXFL 529 Não (Burger et al., 2001) 9 LXFL 1072 Sim (Fiebig et al. , 1999) 10 Calu-3 Sim (Stein et al., 2001) 11 NCI-H522 Sim (Yamori et al. , 1997) 12 NCI-H322 Não (Zou et al., 2001) 13 NCI-H441(RAM) Sim (Gridley et al. , 1996) 14 MAXF MX1 Não 15 MAXF 401 Não (Fiebig et al. , 1999) 16 MAXF 449 Sim (Burger et al. , 2001) 17 MAXF 713 Não (Berger et al., 1992) 18 MAXF 857 Não (Fiebig et al., 1999)

Os modelos representam dois tipos principais de tumores, nomeadamente cancro de pulmão de não pequenas células (NSCLC; modelos N° 1-13) e cancro da mama (modelos N° 14-18) . Nove dos modelos NSCLC (N° 1-9) e todos os modelos de cancro da mama foram derivados por passagem em série in vivo de fragmentos de tumor humano em ratinhos imunodeficientes. Os restantes modelos NSCLC (N° 10-13) são modelos baseados em células nos quais o crescimento de tumor in vivo é induzido 77

ΕΡ 1 585 955/PT por implante de células propagadas in vitro em ratinhos imunocompromometidos.

Berger, D. P., Winterhalter, B. R. e Fiebig, Η. H. (1992). Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice. Em Immunodeficient Mice in Oncology, Η. H. Fiebig e D. P. Berger, ed. (Basel: Karger), p. 23-46.

Burger, A. M., Hartung, G., Stehle, G., Sinn, H. e

Fiebig, Η. H. (2001) . Pre-clinical evaluation of a methotrexate-albumin conjugate (MTX-HSA) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Câncer, 92:718-24.

Fiebig, Η. H. e Burger, A. M. (2002) . Human Tumor Xenografts and Explants. Em Tumor Models in Câncer Research, B. A. Teicher, ed. (Totowa, New Jersey: Humana Press), p. 113-137.

Fiebig, Η. H., Dengler, W. A. e Roth, T. (1999) . Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and

Discovery of New Anticancer Agents. Em Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug

Development, Η. H. Fiebig e A. M. Burger, ed. (Basel: Karger), p. 29-50.

Gridley, D. S., Andrés, M. L., Garner, C., Mao, X. W. e Slater, J. M. (1996). Evaluation of TNF-alpha effects on radiation efficacy in a human lung adenocarcinoma model. Oncol Res., £:485-95.

Stein, R., Govindan, S. V., Chen, S., Reed, L., Spiegelman, H., Griffiths, G. L., Hansen, H. J. e Goldenberg, D. M. (2001) . Successful therapy of a human lung câncer xenograft using MAb RS7 labeled with residualizing radioiodine. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 39:173-80.

Yamori, T., Sato, S., Chikazawa, H. e Kadota, T. (1997). Anti-tumor efficacy of paclitaxel against human lung câncer xenografts. Jpn. J. Câncer Res., 88:1205-10. 78

ΕΡ 1 585 966/PT

Zou, Y., Wu, Q. P., Tansey, W., Chow, D., Hung, M. C., Charnsangavej, C., Wallace, S. e Li, C. (2001). Effectiveness of water soluble poly(L-glutamic acid)-camptothecin conjugate against resistant human lung câncer xenografted in nude mice. Int. J. Oncol., 18:331-6.

Exemplo 3

Detecgão de heterodímeros em tumores sensíveis a 2C4 por imunoprecipi tação

Sujeitaram-se tumores sensíveis e não sensíveis a 2C4 a imunoprecipitação com anticorpos anti-ErbB2 para ensaiar a presença de heterodímeros ErbB2-ErbB3 e EGFR-ErbB2. Salvo indicação em contrário, os métodos foram efectuados de acordo com Maniatis T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

Seleccionaram-se anticorpos anti-HER2, anti-HER3 e anti-HER1 sem reacção cruzada. Para determinar se os anticorpos têm reacção cruzada, expressaram-se receptores de HER1, HER2, HER3 e HER4 em células 2 93 de rim embrionário humano (HEK) . As células foram lisadas utilizando um tampão HEPES (pH 7,5) contendo Triton™ X100 (1% peso por volume). Separou-se aproximadamente 20 pg de proteína celular total de células de controlo e de células que expressam HERl, HER2, HER3 e HER4 num gel de SDS e transferiu-se para uma membrana de nitrocelulose através de um procedimento de transferência semi-seco. Após bloqueamento com gelatina, ensaiaram-se vários anticorpos anti-HERl, anti-HER2 e anti-HER3 para reactividade cruzada contra outros receptores ErbB. Os anticorpos seleccionados para utilização nas experiências seguintes não apresentaram qualquer reactividade cruzada significativa.

Esmagaram-se amostras de tumor frescas mecanicamente em gelo e lisaram-se num tampão contendo HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, glicerol a 10 % (p/v), Triton™ X-100 a 1 % (p/v), PMSF 1 mM, aprotinina a 10 pg/ml e ortovanadato 0,4 mM. Centrifugaram-se tumores completamente lisados várias vezes até os sobrenadantes serem completamente 79

ΕΡ 1 585 966/PT límpidos. Procedeu-se a imunoprecipitação por combinação dos lisados de tumor límpidos (5-7 mg proteína por lisado), 5 pg de anticorpo anti-ErbB2 (ab-3, monoclonal de ratinho; N° Cat. 0P15, Oncogene Inc., USA) e 50 μΐ de agarose acoplada a proteína G em tubos de reacção Eppendorf de 1,5 ml. Após adição de um volume igual ou duas vezes maior de tampão HEPES 50 mM, pH 7,5 contendo Triton™ X-100 a 0,1 % (p/v) rodaram-se os tubos durante 3-4 horas a 4 °C seguido por centrifugação. Lavaram-se os sedimentos duas a três vezes com 500 μΐ de tampão HEPES 50 mM pH 7,5 contendo Triton™ X-100 a 0,1 % (p/v) . Adicionou-se um volume igual de tampão de amostra Lãmmli 2x ao imunoprecipitado lavado e aqueceram-se as amostras durante 5 min a 95 °C. Separaram-se as amostras por SDS-PAGE e transferiram-se para nitrocelulose. A presença de heterodímeros de EGFR-ErbB2 e ErbB2-ErbB3 foi avaliada por sondagem das transferências com anticorpos contra EGFR (anticorpo policlonal de coelho contra EGFR, Upstate Inc., USA; N° Cat. 06-847) e ErbB3 (anticorpo policlonal contra ErbB3; Santa Cruz Inc., USA; N° Cat. SC-285) .) . Utilizou-se como anticorpo secundário um anticorpo Fc anti-coelho marcado com peroxidase (POD) (BioRad Laboratories Inc. USA). As manchas foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente (ECL plus, Amersham). A figura 3 apresenta os resultados destas experiências. Pode verificar-se a presença de heterodímeros ErbB2-ErbB3 e/ou EGFR-ErbB2. Verificou-se uma correlação entre a sensibilidade a 2C4, tal como apresentada na tabela 1, e a presença de heterodímeros ErbB2-ErbB3 e/ou EGFR-ErbB2.

Exemplo 4

Correlação de sensibilidade a rhuMAb 2C4 com fosforilação de HER2

Estudou-se o efeito de rhuMAb 2C4 no crescimento de tumor em 14 tumores humanos explantados em ratinhos (9 cancros de pulmão e 5 cancros da mama). O explante de tumor e tratamento foram efectuados tal como descrito no exemplo 2. Detectaram-se heterodímeros HER2 tal como descrito no exemplo 3. 80

ΕΡ 1 585 966/PT

Avaliou-se a fosforilação de HER2 por imunoprecipitação de HER2 e por análise de transferência "Western". Determinou-se resposta positiva pela presença da banda de fosfo-HER2 no gel. Determinou-se a resposta negativa pela ausência da banda. A fosforilação de HER2 foi confirmada por imuno-histoquímica utilizando um anticorpo anti-HER2 especifico para fosforilação (clone PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol. , 18 : 3230-9 (2000) .

Em 5 dos tumores ensaiados (3 de pulmão e 2 de mama), verificou-se uma inibição significativa de crescimento de tumor, que se correlacionava com a presença de heterodimeros detectáveis de HER2 com HER1 ou HER3 e com forte fosforilação de HER2 em todos os casos. Em 9 tumores nos quais não se verificou uma resposta significativa a tratamento com rhuMAb 2C4, não se detectaram heterodimeros e a fosforilação de HER2 estava ausente. A presença de heterodimerização de HER2 ou fosforilação de HER2 significativa é um forte previsor de resposta a tratamento com rhuMAb 2C4 em modelos não clínicos. Efectuaram-se observações semelhantes em xeno-enxertos gerados de linhas celulares de tumor.

Exemplo 5

Detecção de fosforilação de HER2 em tumores sensíveis a 2C4

Avaliou-se a eficácia de rhuMAb 2C4 em nove modelos estabelecidos de xeno-enxertos de tumor de carcinoma de pulmão de não pequenas células (NSCLC) (LXFE 211, LXFA 289, LXFA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFL 529, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Freiburg, Alemanha). Os xeno-enxertos de tumor humano são considerados os modelos mais relevantes para o desenvolvimento de fármacos anti-cancro, dado que os tumores dos doentes estão em crescimento como um tumor sólido, desenvolvem um estroma, vasculatura, uma necrose central e apresentam diferenciação da cápsula. Além disso, os modelos de xeno-enxertos de tumor assemelham-se muito aos tumores originais em termos de histologia e quimiossensibilidade. 81

ΕΡ 1 585 955/PT

Avaliou-se a inibição de crescimento tal como descrito no exemplo 2. Definiu-se actividade de inibição de crescimento significativa como >50% de inibição de crescimento do grupo de tratamento relativamente ao grupo de controlo. Em três dos modelos NSCLC (LXFA 297, LXFA 629 e LXFL 1072) verificou-se uma resposta significativa de inibição de crescimento ao tratamento com rhuMAb 2C4. Foram também investigadas várias caracteristicas distintivas de HER2 activado por ligando a nivel de proteína. Tal como apresentado na figura 4, foi possível imunoprecipitar HER2 de extractos de tumor de oito dos nove tumores NSCLC. Para determinar o estado de activação de HER2, estas transferências foram então sondadas com anticorpo anti-fosfotirosina (anti-PY). Tal como apresentado no painel inferior da figura 4, os três tumores sensíveis (LXFA 297, LXFA 629 e 1072) apresentaram forte activação HER2 .

Exemplo 6

Estudo clínico para identificar doentes de cancro de pulmão para tratamento com rhuMAb 2C4 por detecção de heterodímeros de HER2

Identifica-se um doente com cancro de pulmão de não pequenas células (NSCLC) que é sensível a tratamento com rhuMAb 2C4 caso se verifique que um tumor do doente compreende complexos HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4.

Obtém-se uma amostra de tumor por biópsia ou durante ressecção cirúrgica do tumor. Analisa-se então a amostra para a presença de heterodímeros HER2/HER3 e/ou HER2/HER1 e/ou HER2/HER4. Põe-se em contacto células de tumor ou lisados celulares com um eTag™ que se liga especif icamente a HER2. O eTag™ compreende uma parte detectável e uma primeira parte de ligação que é específica para HER2. A parte detectável está ligada à primeira parte de ligação com um ligante clivável. Após passar o tempo necessário para ligação, remove-se o excesso de eTag™. 82

ΕΡ 1 585 955/PT Põe-se em contacto as células de tumor ou Usados celulares com um segundo composto de ligação que se liga especificamente a HER1 ou HER3 ou HER4. Remove-se o composto não ligado por lavagem. 0 segundo composto de ligação é então activado. Caso o primeiro composto de ligação e o segundo composto de ligação estejam próximos, o segundo composto de ligação activado cliva o ligante clivável no eTag™, produzindo uma parte detectável livre. A identificação da parte detectável livre na amostra indica que o tumor compreende heterodímeros HER2/HER1 ou HER2/HER3 ou HER2/HER4.

Após determinar que o doente tem um tumor que compreende heterodímeros HER2/HER1 e/ou HER2/HER3 e/ou HER2/HER4, administra-se rhuMAb 2C4 intravenosamente (IV) semanalmente ou de três em três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até progressão da doença. 0 anticorpo é fornecido numa formulação líquida multi-dose (20 mL de enchimento a uma concentração de 20 mg/mL ou superior). Os pontos finais primários para eficácia incluem taxa de resposta e segurança. Os pontos finais secundários para eficácia incluem: sobrevivência global, tempo para progressão da doença, qualidade de vida e/ou duração da resposta.

Exemplo 7

Estudo clínico para identificar doentes de cancro para tratamento com rhuMAb 2C4

Obtém-se uma amostra biológica compreendendo células de cancro dos candidatos a tratamento, e.g., por biópsia de tecido de tumor, aspiração de células de tumor de fluido de ascites ou qualquer outro método conhecido na prática clínica. Analisa-se a amostra biológica para fosforilação de HER2, e.g., por análise de imunoprecipitação e transferência "Western" e/ou para a presença de heterodímeros HER2/HER3, HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 por qualquer das técnicas descritas anteriormente. Os indivíduos cuja amostra biológica seja positiva para fosforilação de HER2 e/ou para a presença de heterodímeros HER2/HER3, HER2/HER1 e/ou HER2/HER4 provavelmente mostram uma melhor resposta a tratamento com rhuMAb 2C4 do que os doentes cuja amostra de tumor não 83

ΕΡ 1 585 966/PT apresente fosforilação de HER2 ou na qual não se detecte qualquer heterodimero.

Por exemplo, sujeitam-se indivíduos diagnosticados com cancro de ovário a uma biopsia de tecido de tumor ou aspiração de células de tumor de fluido de ascites. Este tecido será analisado para fosforilação de HER2 por análise de imunoprecipitação e transferência "Western". Tal necessitará de um mínimo de cerca de 250 mg de tecido de tumor.

Após determinar que o doente sofre de cancro (tal como cancro da próstata resistente à castração - CRPC ou cancro de ovários) que é positivo para fosforilação de HER2, o doente receberá uma dose de carga de 84 0 mg de rhuMAb 2C4 no dia 1 do ciclo 1 (primeiro período de tratamento de 21 dias), seguido por 420 mg no dia 1 de cada um dos ciclos de 21 dias subsequentes, como infusão intravenosa contínua. Continua-se o tratamento por infusão intravenosa de 3 em 3 semanas até o máximo de um ano (17 ciclos), para doentes que não mostram qualquer evidência de progressão da doença. O tratamento pode ser interrompido em qualquer altura anterior devido a falta de resposta, efeitos adversos ou outros motivos, ao critério do médico assistente. 84

ΕΡ 1 585 966/PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genentech, Inc.

Koll, Hans Bossenmaier, Birgit Muller, Hans-Joachim Sliwkowski, Mark Kelsey, Stephen <120> Métodos para identificar tumores que são sensíveis a tratamento com anticorpos anti-ErbB2

<130> 39766-0114PC <150> US 60/396,290 <151> 2002-07-15 <150> US 60/480,043 <151> 2003-06-20 <160> 6 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0 <210> 1 <211> 107

<212> PRT <213> Homosapiens <400> 1

Asp Thr vai Met Thr Gin ser His Lys lie Met Ser Thr ser vai Glv 1 5 1° 15

Asp Arg vai Ser lie Thr cys Lys Ala ser Gin Asp vai ser ile Glv 20 25 30 val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 35 40 . 45

Tyr Ser Ala ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg phe Thr Gly 50 55 60 y

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser ser Val Gin Ala 65 ,70 75 80

Glu Asp Leu Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Tyr ile Tyr pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 119

<212> PRT <213> Homosapiens 85 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ <400> 2

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys pro Gly Thr 15 10 15

Ser val Lys ile ser cys Lys Alà Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Thr Met Asp Trp val Lys Gin ser hís Gly Lys ser Leu Glu Trp ile 35 40 45

Gly Asp val Asn Pro Asn ser Gly Gly ser Ile Tyr Asn Gin Arg Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Arg ile val Tyr 65 70 75 Ala val 80 Met Glu Leu Arg ser Leu Thr phe Glu ASp Thr Tyr Tyr cys 85 Phe 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly pro Ser Tyr phe Asp Tyr Trp Giy Gin Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr val ser ser 115 <210> 3 <211> 107

<212> PRT <213> Homosapiens <400> 3

Gin Ser Pro ser ser Leu Ser Ala ser val Gly 10 15 Thr Cys Lys Ala Ser 25 Gly Lys Gin Asp val Ser 30 Leu ile Gly Gin Lys pro Ala Pro Lys Leu ile 40 45 Gly Arg Tyr Thr Gly val pro ser Arg Phe ser 55 Leu Thr 60 Gin Asp Phe Thr ile Ser Ser Leu pro 70 Gin Gin 75 80 Tyr Tyr Cys Tyr Tyr Ile Tyr pro Tyr 90 95 Thr Lys val Glu 1,1 e 105 Lys

Asp Ile Gin Asp Arg Val Val Ala Trp 35 Tyr Ser Ala 50 ser Gly ser 65 Glu Asp Phe Thr Phe Gly <210> <211> <212> <213>

Met Thr 5

Thr ile 20

Tyr Gin

Ser Tyr

Gly Thr

Ala Thr 85

Gin Gly 100 4 119

PRT

Homosapiens <400> 4 86 ΕΡ 1 585 966/ΡΤ 20 100 Val 5 Glu ser Gly Gly Gly 10 r c val Gin Pro Gly 15 ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly phe Thr Phe Thr 30 Asp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 40 Gly 45 Pro Asn Ser Gly ser ile Tyr Asn Gin Arg 55 val 60 Thr Leu 7Π Ser Asp Arg Ser 7ς Lys Asn Thr Leu Ser / u Leu Arg Ala Glu ASp í j Thr Ala val Tyr Tyr 85 90 95 Gly Pro Ser Phe Tyr 105 Phe ASp Tyr Trp Gly 1 1 Λ Gin val ser ser xxu 80

Glu Vai 1 ser Leu Thr Met Ala Asp 50 Lys Gly 65 Leu Gin Ala Arg Thr Leu 35 115 <210> 5 <211> 107

<212> PRT <213> Homosapiens <400> 5

Asp ilê Gin Met Thr Gin ser Pro ser ser Leu Ser Ala ser val Gly 1 5 10 15 Page 2 ASP Arg val Thr xle Thr cys Arg Ala Ser Gl n ser xle Ser Asn Tyr 20 25 Ala 30 Ile Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Lys Leu Leu 35 40 val 45 Gly Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 Thr Xle 60 ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ser Leu Gin pro 65 70 Gin 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Tyr Asn ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 6 87

ΕΡ 1 585 966/PT

Glu Gin ser Gly Gly Giy Leu val Gin Pro Gly Gly val Leu val Glu 10 15 1 5 cys • Ι Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ser Tyr Ser Leu Arg Leu ser Α 13 25 30 Ala 20 val Arg δΊ a Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Met Ser Trp (j 1 n 40 45 Ala ΪΫ val 50 Gly 35 Ile Arg Ser Phe Gly Thr Asp Ile 70 Giy 55 ser Gly Arg Ser Asp Thr Asn Tyr ser 75 Tyr 60 Lys Ala Asn Asp Thr Ser Leu Val Tyr 80 Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85 Gly 90 95 Ala Arg Gly Arg 100 Val Tyr ser Leu 105 Tyr Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser ser 115 ·

Lisboa, 2012-02-09

Claims (6)

1. ΕΡ 1 585 966/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo 2C4 recombinante humanizado (rhuMAb 2C4) para utilização num método para tratamento de cancro de ovários, mama, pulmão ou próstata num doente de cancro, em que o rhuMAb 2C4 compreende as sequências de aminoácidos de leve variável e pesada variável de SEQ ID N° 3 e 4, respectivamente, e sequências de região constante leve e pesada de IgGl humana (alotipo não A) , e em que no método rhuMAb 2C4 é administrado a uma dose fixa de 420 mg de três em três semanas.
2. 2. Anticorpo recombinante humanizado para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o rhuMAb 2C4 é expresso em células de ovários de hamster chinês (CHO).
3. 3. Anticorpo recombinante humanizado para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o tratamento com rhuMAb 2C4 se inicia com uma dose de carga de 840 mg.
4. 4. Utilização de um anticorpo recombinante humanizado 2C4 (rhuMAb 2C4) na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro de ovários, mama, pulmão ou próstata num doente de cancro, em que o rhuMAb 2C4 compreende as sequências de aminoácidos leve variável e pesada variável de SEQ ID N° 3 e 4, respectivamente, e as sequências de região constante leve e pesada de IgGl humana (alotipo não A) e em que no tratamento se administra rhuMAb 2C4 a uma dose fixa de 420 mg, de três em três semanas.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o rhuMAb 2C4 é expresso em células de ovários de hamster chinês (CHO).
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o medicamento é para tratamento de um doente de cancro, em que o tratamento com rhuMAb 2C4 se inicia com uma dose de carga de 840 mg. Lisboa, 2012-02-09