ES2392525T3 - Tratamiento del cáncer con el anticuerpo dirigido contra ErbB2 rhuMAb 2C4 - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal humanizado recombinante 2C4 (rhuMAb 2C4) para usar en un procedimiento para el tratamiento del cancer en un paciente, en el que en el procedimiento el rhuMAb 2C4 se administra como una dosis fija de 420 mg cada 3 semanas, y en el que el rhuMAb 2C4 comprende las secuencias de aminoacidos de las cadenas ligera variable y pesada variable de SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, y las secuencias de las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada de la IgG1 humana (alotipo no A) .

Description

Tratamiento del cancer con el anticuerpo dirigido contra ErbB2 rhuMAb 2C4.

Campo de la invenci6n

[0001] La presente invencion se refiere al anticuerpo dirigido contra HER2 humanizado recombinante 2C4 (rhuMab 2C4) para usar en un procedimiento para tratar pacientes que padecen tumores.

Antecedentes de la invenci6n

[0002] La familia de receptores tirosina quinasas ErbB son mediadores importantes del crecimiento, diferenciacion y supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro miembros diferentes que incluyen el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR o ErbB1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2).

[0003] El EGFR, codificado por el gen erbB1, se ha implicado causalmente en los tumores malignos humanos. En particular, se ha observado una expresion mayor en el cancer de mama, vejiga, pulmon, cabeza, cuello y estomago, asi como en glioblastomas. La mayor expresion del receptor EGFR se asocia a menudo con una mayor

produccion del ligando del EGFR, el factor de crecimiento transformante alfa (TGF- ), por las mismas celulas

tumorales dando como resultado la activacion del receptor por una ruta estimuladora autocrina. Baselga y Mendelsohn, Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). Ademas, se ha descrito una proteina relacionada con el factor de crecimiento epidermico (ERRP), con un clon de fragmento de ADNc de 1583 pares de bases con 90-95% de homologia de secuencia con el EGFR de raton y un EGFR de rata truncado (patente de EE.UU. n° 6.399.743; y publicacion de EE.UU. n° 2003/0096373). Se han evaluado anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR o

sus ligandos, TGF- y EGF, como agentes terapeuticos en el tratamiento de dichos tumores malignos. Vease, p. ej.

Baselga y Mendelsohn., vease antes; Masui y col., Cancer Research, 44:1002-1007 (1984); y Wu y col., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995).

[0004] El segundo miembro de la familia de ErbB, p185neu, se identifico originalmente como el producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas quimicamente. La forma activada del protooncogen neu resulta de una mutacion puntual (de valina a acido glutamico) en la region de transmembrana de la proteina codificada. La amplificacion del homologo humano de neu (HBR2) se observa en canceres de mama y ovario y se correlaciona con un pronostico pobre (Slamon y col., Science, 235:177-182 (1987); Slamon y col., Science, 244:707712 (1989); y patente de EE.UU. n° 4.968.603). Hasta la fecha, no se ha descrito una mutacion puntual analoga a esta en el protooncogen neu para tumores humanos. El exceso de expresion de ErbB2 (con frecuencia pero no de modo uniforme debido a la amplificacion genica) tambien se ha observado en otros carcinomas incluyendo carcinomas de estomago, endometrio, glandula salival, pulmon, rifon, colon, tiroides, pancreas y vejiga. Vease, entre otros King y col., Science, 229:974 (1985); Yokota y col., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi y col., Mol Cell Biol., 6: 955-958 (1986); Geurin y col., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen y col., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura y col., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst y col., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner y col., Cancer Re., 50:421-425 (1990); Kern y col., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park y col., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau y col., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland y col., Br. J. Cancer, 57:358-363 (1988); Williams y col., Pathiobiology, 59:46-52 (1991); y McCann y col., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 puede ser expresado en exceso en el cancer de prostata (Gu y col., Cancer Lett., 99: 185-9 (1996); Ross y col., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross y col., Cancer, 79:2162-70 (1997); y Sadasivan y col., J. Urol., 150:126-31 (1993)). El exceso de expresion de ErbB2 puede conducir al crecimiento tumoral por la activacion independiente de ligando de ErbB2 o de homodimeros de ErbB2.

[0005] Se han descrito anticuerpos dirigidos contra los productos proteinicos ErbB2 humano y p185neu de rata. Drebin y colaboradores han producido anticuerpos dirigidos contra el producto del gen neu de rata, p185neu. Vease, por ejemplo, Drebin y col., Cell, 41:695-706 (1985); Myers y col., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991); y documento WO 94/22478. Drebin y col., Oncogene, 2: 273-277 (1988) describen que las mezclas de anticuerpos reactivas con dos regiones distintas de p185neu dan como resultado efectos antitumorales sinergicos en celulas NIH-3T3 transformadas con neu implantadas en ratones sin pelo. Vease tambien la patente de EE.UU. 5.824.311 concedida el 20 de octubre, 1998.

[0006] Hudziak y col., Mol. Cell. Biol., 9(3):1165-1172 (1989), describen la generacion de un panel de anticuerpos dirigidos contra ErbB2 que se caracterizaron usando la linea de celulas tumorales de cancer de mama humano SK-BR-3. La proliferacion celular relativa de las celulas SK-BR-3 despues de exposicion a los anticuerpos, se determino por tincion con cristal violeta de las monocapas despues de 72 horas. Usando este ensayo, se obtuvo una inhibicion maxima con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibia la proliferacion celular en 56%. Otros anticuerpos del panel reducian la proliferacion celular en menor extension en este ensayo. Se encontro ademas que el anticuerpo 4D5 sensibilizaba las lineas celulares de tumor de mama que expresaban en exceso ErbB2 frente a los efectos citotoxicos del TNF-. Vease tambien la patente de EE.UU. n° 5.677.171 concedida el 14 de octubre, 1997. Los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 discutidos por Hudziak y col. fueron mas caracterizados por Fendly y col., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts y col., In Vitro, 26(3):59A (1990); Sarup y col., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard y col., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar y col., Mol. Cell. Biol., 11(2):979-986 (1991); Lewis y col., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras y col., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta y col., Cancer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski y col., J. Biol. Chem., 269 (20): 1466114665 (1994); Scott y col., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); D'souza y col., Proc. Natl. Acad Sci.; 91:7202-7206 (1994); Lewis y col., Cancer Research, 56:1457-1465 (1996); y Schaefer y col., Oncogene, 15:1385-1394 (1997).

[0007] Una version humanizada recombinante del anticuerpo dirigido contra ErbB2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 o HERCEPTIN®; patente de EE.UU. n° 5.821.337) es clinicamente activa en paciente con canceres de mama metastaticos que expresan en exceso ErbB2 que han recibido previamente terapia anticancerigena extensa (Baselga y col., J. Clin Oncol., 14:737-744 (1996)). HERCEPTIN® recibio la aprobacion de comercializacion de la Agencia de Alimentos y Medicamentos el 25 de septiembre de 1998, para el tratamiento de pacientes con cancer de mama metastatico, cuyos tumores expresan en exceso la proteina ErbB2. Sin embargo, no todos los tumores que expresan en exceso ErbB2 responden a HERCEPTIN®. (Brockhoff y col., Cytometry, 44:338-48 (2001)). Ademas, los datos preclinicos sugieren que HERCEPTIN® puede ser terapeuticamente eficaz en el tratamiento del cancer de pulmon de celulas no pequefas (CPCNP). La proteina HER2 es expresada en exceso en 20-66% de los tumores de CPCNP extirpados y se ha mostrado que predice una respuesta pobre del paciente en series multiples (Azzoli, C.G. y col., Semin. Oncol., 29(Suppl 4):59-65 (2002)).

[0008] Se han descrito otros anticuerpos dirigidos contra ErbB2 con diferentes propiedades en Tagliabue y col., Int. J. Cancer, 47: 933-937 (1991); McKenzie y col., Oncogene, 4:543-548 (1989); Maier y col., Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus y col., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski y col., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991); Bacus y col., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu y col., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); documento WO94/00136; Kasprzyk y col., Cancer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock y col., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al, Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga y col., Cancer Res., 54:37583765 (1994); Harwerth y col., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992); patente de EE.UU. n° 5.783.186; y Klapper y col., Oncogene, 14:2099-2109 (1997). El anticuerpo monoclonal 2C4 se describe en el documento WO 01/00245, y se ha mostrado que 2C4 altera la dimerizacion de HER2 con otros miembros de la familia de receptores ErbB (documento WO 01/00245).

[0009] El cribado por homologia ha dado como resultado la identificacion de otros dos miembros de la familia de receptores ErbB; ErbB23 (patentes de EE.UU. n° 5.183.884 y 5.480.968 asi como Kraus y col., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989)) y ErbB4 (solicitud de patente EP n° 599.274; Plowman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman y col., Nature, 366: 473-475 (1993)), y ambos receptores presentan una mayor expresion en al menos algunas lineas celulares de cancer de mama.

[0010] Los receptores ErbB en general se encuentran en diferentes combinaciones en celulas y se cree que la heterodimerizacion aumenta la diversidad de las respuestas celulares a una variedad de ligandos de ErbB (Earp y col., Breast Cancer Research and Treatment, 35:115-132 (1995)). Sin embargo, el mecanismo por el cual estos receptores se agregan y como contribuye esto a la sefalizacion no se comprende del todo (Brennan, P.J. y col., Oncogene, 19:6093-6101 (2000)). Al EGFR se unen 6 ligandos diferentes; el factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-), anfiregulina, factor de crecimiento epidermico ligado a la heparina (HB-EGF), betacelulina y epiregulina (Groenen y col., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). Una familia de proteinas heregulinas que resultan del corte y empalme alternativo de un solo gen, son ligandos para ErbB3 y ErbB4. La familia de heregulinas incluye heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes y col., Science, 256:1205-1210 (1992); patente de EE.UU. n° 5.641.869; y Schaefer y col., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)); factores de diferenciacion neu (NDF), factores de crecimiento gliales (GGF); proteina inductora de actividad del receptor de acetilcolina (ARIA); y factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF). Para una revision, vease Groenen y col., Growth Factors, 11:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell. Neurosci., 7:247-262 (1996) y Lee y col., Pharm. Rev., 47:51-85 (1995). Recientemente, se han identificado tres ligandos adicionales de ErbB; neuregulina-2 (NRG-2) que se ha publicado que se une a ErbB3 o ErbB4 (Chang y col., Nature, 387:509-512 (1997); y Carraway y col., Nature, 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 que se une a ErbB4 (Zhang y col., PNAS (USA), 94(18):9562-7 (1997)); y neuregulina-4 que se une a ErbB4 (Harari y col., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epiregulina tambien se unen a ErbB4.

[0011] Aunque EGF y TGF no se unen a ErbB2, el EGF estimula al EGFR y ErbB2 para formar un heterodimero, el cual activa el EGFR y produce la transfosforilacion de ErbB2 en el heterodimero. La dimerizacion y/o transfosforilacion parece que activan la tirosina quinasa ErbB2. Vease Earp y col., vease antes. Igualmente, la heregulina no se une a ErbB2, pero cuando ErbB3 es expresado conjuntamente con ErbB2, se forma un complejo de sefalizacion activo (Nagy y col., Cytometry, 32:120-31 (1998)). Los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de alterar este complejo (Sliwkowski y col., J. Biol. Chem., 269 (20):14661-14665 (1994)). ErbB3 es una tirosina quinasa defectuosa y por lo tanto requiere la heterodimerizacion, preferiblemente con ErbB2, para la capacidad de transduccion de sefales. (Graus-Porta y col., EMBO J., 16:1647-55 (1995)). Ademas, la afinidad de ErbB3 por la heregulina (HRG) aumenta a un estado de afinidad mayor cuando es expresada conjuntamente con ErbB2. Vease tambien, Levi y col., Journal of Neuroscience, 15:1329-1340 (1995); Morrissey y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1431-1435 (1995); y Lewis y col., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996), con respecto al complejo de proteinas ErbB2-ErbB3. Realmente, ErbB2 es la pareja de heterodimerizacion preferida tanto para EGFR como para ErbB3. (Graus-Porta y col., vease antes). ErbB4, como ErbB3, forma un complejo de sefalizacion activo con ErbB2 (Carraway y Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). La heterodimerizacion dependiente de ligando de ErbB2 con EGFR o ErbB3 puede promover el crecimiento de tumores que expresan ErbB2.

[0012] La expresion de los receptores ErbB y la heregulina y el estado de fosforilacion de HER2 se ha investigado en muestras tumorales de pacientes con cancer de mama primario y carcinoma de vejiga urinaria (Esteva y col., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow y col., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001)). La correlacion entre la sefalizacion activa a traves de Her2/neu y la bioquimica clinica y la respuesta del paciente en el cancer de mama se ha descrito en Thor y col., J. Clin. Oncology, 18:3230-3239 (2000), y DiGiovanna y col., Cancer Res., 62:6667-6673 (2002).

[0013] En el presente documento se describe un procedimiento para identificar un tumor que es sensible al tratamiento con un anticuerpo dirigido contra HER-2, rhuMab 2C4.

[0014] Se obtiene una muestra del tumor y se detecta en la muestra la presencia del complejo de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4. Un tumor se identifica como sensible al tratamiento con el anticuerpo dirigido contra HER2 cuando se detecta un complejo.

[0015] La presencia de un complejo se puede detectar por inmunoprecipitacion de cualesquiera complejos de proteinas que comprendan HER2 con un anticuerpo dirigido contra HER2. Los complejos inmunoprecipitados despues se ponen en contacto con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos contra HER3, anticuerpos dirigidos contra HER1 y anticuerpos dirigidos contra HER4, y se determina cualquier union. Un complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 se detecta si se determina que los anticuerpos dirigidos contra HER3 y/o contra HER1 y/o contra HER4 se unen a los complejos inmunoprecipitados.

[0016] La presencia de un complejo de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 se puede detectar poniendo en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo dirigido contra HER2 que comprende un primer fluoroforo. La muestra de tumor despues se pone en contacto con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos contra HER3 y/o contra HER1 y/o contra HER4, en el que dicho anticuerpo comprende un segundo fluoroforo. Despues, se hacen mediciones de la transferencia de energia por resonancia de fluorescencia para determinar si el primer fluoroforo y el segundo fluoroforo estan muy cerca. La presencia de un complejo de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 se detecta si se determina que el primer y el segundo fluoroforos estan muy cerca.

[0017] La presencia de un complejo HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 se puede detectar poniendo en contacto la muestra de tumor con un primer compuesto de union. El primer compuesto de union comprende un primer resto de union a la diana que se une especificamente a HER2. El primer resto de union a la diana es preferiblemente un anticuerpo dirigido contra HER2 o fragmento de anticuerpo. El primer compuesto de union comprende ademas un resto detectable que se une al primer dominio de union mediante un conector escindible.

[0018] La muestra de tumor se pone en contacto a continuacion con un segundo compuesto de union. El segundo compuesto de union preferiblemente comprende un segundo resto de union a la diana que se une especificamente a HER3 o HER1 o HER4 y preferiblemente no se une a HER2. El segundo compuesto de union se puede unir a HER3 o HER1, y no se une a HER2 o HER4, o el segundo resto de union a la diana puede comprender un anticuerpo dirigido contra HER3 o contra HER1 o contra HER4 o un fragmento de anticuerpo. El segundo compuesto de union es capaz de escindir el conector escindible en el primer compuesto de union tras la activacion, produciendo asi el resto detectable libre si el primer compuesto de union y el segundo compuesto de union estan muy cerca. La presencia de un complejo de proteinas HER2/HER3 o HER2/HER1 o HER2/HER4 se detecta cuando se identifica la presencia del resto detectable libre. La presencia del resto detectable libre se puede identificar por electroforesis capilar.

[0019] El primero compuesto de union puede comprender un primer dominio de union a la diana que se une especificamente a HER1 o HER3 o HER4, y el segundo compuesto de union puede comprender un segundo dominio de union a la diana que se une especificamente a HER2.

[0020] La presencia de un complejo de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4, y la activacion de HER2 resultante, se pueden detectar evaluando la fosforilacion del receptor de ERbB, por ejemplo por inmunoprecipitacion de la proteina HER2 seguido de inmunodeteccion por transferencia Western de la fosfotirosina.

[0021] La muestra de tumor en la que se analiza la presencia de los complejos de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 se obtiene preferiblemente de un paciente que padece el tumor. La muestra se puede obtener, por ejemplo, por biopsia o por purificacion de celulas tumorales circulantes del paciente o durante la cirugia para eliminar el tumor del paciente.

[0022] La muestra del tumor se puede obtener de un mamifero distinto del paciente que desarrollo originalmente el tumor. Preferiblemente, la muestra se obtiene de un raton o de otro roedor. Mas preferiblemente, el tumor es un tumor xenotrasplantado. El tumor xenotrasplantado preferiblemente se produce por trasplante de un fragmento de un tumor humano en un raton u otro roedor.

[0023] El tumor puede ser un tumor de pulmon, mas preferiblemente un tumor de cancer de pulmon de celulas no pequefas. El tumor puede ser un tumor de mamifero.

[0024] En el presente documento se describe un procedimiento para identificar celulas tumorales que son sensibles al tratamiento con un anticuerpo que inhibe la asociacion de HER2 con otro miembro de la familia de receptores ErbB, que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra biologica que comprende celulas tumorales positivas para HER2; y (b) detectar la fosforilacion de un receptor ErbB en la muestra biologica, en el que dicha fosforilacion indica que las celulas tumorales son sensibles al tratamiento con el anticuerpo. La fosforilacion de un receptor ErbB2 (HER2) se puede detectar.

[0025] Al igual que antes, el otro miembro asociado con HER2 es HER3, HER1 y/o HER4, tal como HER2 y/o HER1. El procedimiento puede comprender ademas una etapa de detectar la presencia de un complejo de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4, esencialmente como se ha descrito antes.

En el presente documento se describe un procedimiento para predecir la respuesta de un sujeto al que se ha diagnosticado un tumor positivo para HER2, al tratamiento con un anticuerpo rhuMab 2C4 que inhibe la asociacion de HER2 con otro miembro de la familia de receptores ErbB, detectando la formacion de los complejos de proteinas HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4 y/o la fosforilacion de un receptor ErbB en una muestra biologica obtenida de un sujeto, que comprende celulas tumorales positivas para HER2. La presencia de dichos complejos de proteinas y/o dicha fosforilacion indican que es probable que el sujeto responda al tratamiento con el anticuerpo. La deteccion de la fosforilacion del receptor ErbB2 (HER2) puede indicar que es probable que el sujeto responda al tratamiento con el anticuerpo.

[0026] En el presente documento se describe un procedimiento para identificar un sujeto que es sensible al tratamiento con un anticuerpo dirigido contra HER2 rhuMab 2C4, detectando la fosforilacion de un receptor ErbB en las celulas tumorales circulantes del sujeto. La presencia de dicha fosforilacion indica que es probable que el sujeto responda al tratamiento con el anticuerpo dirigido contra HER2. Se puede detectar la fosforilacion de ErbB2 (HER2). El sujeto puede ser un ser humano.

[0027] Tambien se describe un articulo de fabricacion que comprende un envase que comprende un anticuerpo rhuMab 2C4 e instrucciones para administrar el anticuerpo a un paciente que padece un tumor. Preferiblemente, se ha determinado que el tumor comprende heterodimeros de HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4.

Resumen de la invenci6n

[0028] La presente invencion se define en las reivindicaciones.

Breve descripci6n de los dibujos

[0029] Las figuras 1A y 1B representan alineamientos de las secuencias de aminoacidos de los dominios ligeros variables (VL) (Fig. 1A) y pesados variables (VH) (Fig. 1B) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente); los dominios VL y VH de la version de 2C4 humanizada 574 (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente), y las regiones armazon consenso del VL y VH humanas (hum 1, ligera subgrupo kappa I; humIII, pesada subgrupo III) (SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente). Los asteriscos identifican las diferencias entre la version humanizada de 2C4 574 y el anticuerpo monoclonal murino 2C4 o entre la version humanizada de 2C4 574 y la region armazon humana. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) estan entre corchetes.

Las figuras 2A y 2B muestran el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4, el anticuerpo HERCEPTIN® o un anticuerpo dirigido contra EGFR en la asociacion dependiente de la heregulina (HRG) de ErbB2 con ErbB3 en celulas MCF7 que expresan niveles bajos/normales de ErbB2 (Fig. 2A) y celulas SK-BR-3 que expresan niveles altos de ErbB2 (Fig. 2B); vease el ejemplo 2 a continuacion.

La figura 3 es una inmunotransferencia que muestra la presencia de los heterodimeros HER1/HER2 y HER2/HER3 en extractos de proteinas de explantes de xenoinjertos de cancer de pulmon de celulas no pequefas.

La figura 4 es una inmunotransferencia que muestra la presencia de fosforilacion de HER2 en extractos de proteinas de explantes de xenoinjertos de cancer de pulmon de celulas no pequefas (CPCNP).

Descripci6n detallada de la realizaci6n preferida

[0030] En el presente documento se describe el descubrimiento experimental de que la sensibilidad al anticuerpo dirigido contra HER2 rhuMAb 2C4 se correlaciona con la presencia de heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4, y/o la fosforilacion de un receptor ErbB en celulas tumorales. Por lo tanto, un tumor se puede identificar como sensible al tratamiento con un anticuerpo dirigido contra HER2, basandose en la presencia de heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4, y/o la fosforilacion de un receptor ErbB. Los heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4, y/o la fosforilacion de un receptor ErbB, se pueden identificar por cualquier procedimiento conocido en la materia. Mediante la identificacion de tumores especificos y de tipos de tumores que son sensibles al tratamiento con el anticuerpo dirigido contra HER2, se podran identificar los pacientes que es probable que se beneficien mas mediante dicho tratamiento. Ademas, se pueden identificar los pacientes que es probable que no se beneficien de la terapia con el anticuerpo monoclonal 2C4.

Definiciones

[0031] Un "receptor ErbB" es un receptor proteina tirosina quinasa que pertenece a la familia de receptores ErbB e incluye los receptores EGFR (ErbB1), ERRP, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 y otros miembros de esta familia que se identifiquen en el futuro. El receptor ErbB en general comprendera un dominio extracelular, que se puede unir a un ligando de ErbB; un dominio transmembrana lipofilo; un dominio de tirosina quinasa intracelular conservado; y un dominio de sefalizacion de carboxilo terminal que alberga varios restos de tirosina que pueden ser fosforilados. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB de "secuencia natural" o una "variante de la secuencia de aminoacidos" de la misma. Preferiblemente, el receptor ErbB es un receptor ErbB humano de secuencia natural. Por consiguiente, un "miembro de la familia de receptores ErbB" es EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 o cualquier otro receptor ErbB conocido actualmente o que se identifique en el futuro. Preferiblemente, el miembro es EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, o ErbB4.

[0032] Las expresiones "ErbB 1", "receptor del factor de crecimiento epidermico", "EGFR" y "HER1" se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren al EGFR como se describe, por ejemplo, en Carpenter y col., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914 (1987), incluyendo las formas mutantes naturales de los mismos

(p. ej., un mutante de EGFR por eliminacion, como en Humphrey y col., PNAS (USA), 87:4207-4211 (1990)). erbB1 se refiere al gen que codifica el producto proteinico EGFR. Los anticuerpos contra HER1 se describen, por ejemplo, en Murthy y col., Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560 (1987) y en el documento WO 95/25167.

[0033] Las expresiones "ERRP", "proteina relacionada con el receptor EGF", "proteina relacionada con el EGFR" y "proteina relacionada con el receptor del factor de crecimiento epidermico" se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a la ERRP como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n°

6.399.743 y publicacion de EE.UU. n° 2003/0096373.

[0034] Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a la proteina HER2 humana descrita, por ejemplo, por Semba y col., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto y col., Nature, 319:230-234 (1986) (numero de acceso en Genebank X03363). El termino "erbB2" se refiere al gen que codifica el ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica p185neu de rata. El ErbB2 preferido es la secuencia natural de ErbB2 humano.

[0035] "ErbB3" y "HER3" se refieren al polipeptido receptor como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.183.884 y 5.480.968, asi como en Kraus y col., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989). Los anticuerpos dirigidos contra ErbB3 son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.183.884, 5.480.968 y en el documento WO 97/35885.

[0036] Los terminos "ErbB4" y "HER4" se refieren en el presente documento al polipeptido receptor como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente EP n° 599.274; Plowman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman y col., Nature, 366: 473-475 (1993), incluyendo las isoformas del mismo, p. ej., como se describe en el documento WO 99/19488, publicado el 22 de abril, 1999. Los anticuerpos dirigidos contra HER4 se describen, por ejemplo, en el documentoWO 02/18444.

[0037] Los anticuerpos contra los receptores ErbB estan disponibles en el mercado de una serie de fuentes, incluyendo, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, EE.UU.

[0038] Por "ligando de ErbB" se entiende un polipeptido que se une a y/o activa un receptor ErbB. El ligando de ErbB puede ser un ligando de ErbB humano de secuencia natural tal como el factor de crecimiento epidermico (EGF) (Savage y col., J. Biol. Chem., 247:7612-7621 (1972)); factor de crecimiento transformante alfa (TGF-) (Marquardt y col., Science, 223:1079-1082 (1984)); anfiregulina tambien conocida como factor de crecimiento autocrino de queratinocitos o schwanoma (Shoyab y col., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura y col., Nature, 348:257-260 (1990); y Cook y col., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing y col., Science, 259:1604-1607 (1993); y Sasada y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); factor de crecimiento epidermico ligado a la heparina (HB-EGF) (Higashiyama y col., Science, 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda y col., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995); y Komurasaki y col., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); una heregulina (vease antes); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway y col., Nature, 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang y col., Proc. Natl. Acad Sci., 94:9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari y col., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) (Kannan y col., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). Los ligandos de ErbB que se unen al EGFR incluyen EGF, TGF-, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligandos de ErbB que se unen al ErbB3 incluyen las heregulinas. Los ligandos de ErbB que pueden unirse al ErbB4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas. El ligando de ErbB tambien puede ser un ligando de ErbB sintetico. El ligando sintetico puede ser especifico para un receptor ErbB particular o puede reconocer complejos de receptores ErbB particulares. Un ejemplo de un ligando sintetico es la biregulina quimera heregulina/egf sintetica (vease, por ejemplo, Jones y col., FEBS Letters, 447:227-231 (1999)).

[0039] "Heregulina" (HRG) cuando se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido codificado por el producto del gen de la heregulina, como se describe en la patente de EE.UU. n° 5.641.869 o Marchionni y col.,

diferenciacion de neu (NDF) (Peles y col., Cell, 69: 205-216 (1992)); proteina inductora de actividad del receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls y col., Cell, 72:801-815 (1993)); factores de crecimiento gliales (GGF) (Marchionni y col.,

[0040] Un "heterooligomero de ErbB" en el presente documento, es un oligomero asociado de forma no covalente, que comprende al menos dos receptores ErbB diferentes. Un "dimero de ErbB" es un oligomero asociado de forma no covalente que comprende dos receptores ErbB diferentes. Dichos complejos pueden formarse cuando una celula que expresa dos o mas receptores ErbB es expuesta a un ligando de ErbB. Los oligomeros de ErbB, tales como los dimeros de ErbB, se pueden aislar por inmunoprecipitacion y analizar por SDS-PAGE, como describen Sliwkowski y col., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por ejemplo. Los ejemplos de dichos heterooligomeros de ErbB incluyen los complejos EGFR-ErbB2 (denominado tambien HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HBR2/HBR3) y ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Ademas, el heterooligomeros de ErbB puede comprender dos o mas receptores ErbB2 combinados con un receptor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 o EGFR (ErbB1). Pueden estar incluidas otras proteinas, tales como una subunidad del receptor de citoquinas (p. ej., gp130) en el heterooligomero.

[0041] Por "activacion por el ligando de un receptor ErbB" se entiende la transduccion de sefales (p. ej., que es producida por un dominio de quinasa intracelular de un receptor ErbB que fosforila restos de tirosina en el receptor ErbB o un polipeptido sustrato) mediada por la union del ligando de ErbB a un heterooligomero de ErbB que comprende el receptor ErbB de interes. En general, esto implicara la union de un ligando de ErbB a un heterooligomero de ErbB que activa un dominio de quinasa de uno o mas de los receptores ErbB en el heterooligomero y de esta forma produce la fosforilacion de restos de tirosina en uno o mas de los receptores ErbB y/o la fosforilacion de restos de tirosina en polipeptido(s) sustrato adicional(es). La activacion del receptor ErbB se puede cuantificar usando diferentes ensayos de fosforilacion de tirosina.

[0042] Un polipeptido de "secuencia natural" es el que tiene la misma secuencia de aminoacidos que un polipeptido (p. ej., receptor ErbB o ligando de ErbB) obtenido de la naturaleza. Dichos polipeptidos de secuencia natural se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sinteticos. Por lo tanto, un polipeptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoacidos natural del polipeptido humano, el polipeptido murino o el polipeptido de cualquier otra especie de mamifero.

[0043] La expresion "variante de la secuencia de aminoacidos" se refiere a polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos que difieren en cierta medida de un polipeptido de secuencia natural. Normalmente, las variantes de la secuencia de aminoacidos tendran una homologia de al menos aproximadamente 70% con al menos un dominio de union del receptor de un ligando de ErbB natural, o con al menos un dominio de union al ligando de un receptor ErbB natural, y preferiblemente, sera al menos aproximadamente 80%, mas preferiblemente, al menos aproximadamente 90% homologo con dichos dominios de union del receptor o ligando. Las variantes de la secuencia de aminoacidos tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos natural.

[0044] "Homologia" se define como el porcentaje de restos en la variante de la secuencia de aminoacidos que son identicos despues de alinear las secuencias e introducir huecos, cuando sea necesario, para lograra el porcentaje maximo de homologia. Los procedimientos y los programas de ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la materia. Uno de dichos programas de ordenador es "Align 2", del que es autor Genentech, Inc., que se presento con documentacion de usuario en la Oficina de los derechos de Autor de Estados Unidos (United States Copyright Office),Washington, DC 20559, el 10 de diciembre, 1991.

[0045] El termino "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido mas amplio y cubre especificamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (p. ej., anticuerpos biespecificos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada.

[0046] La expresion "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son muy especificos, y estan dirigidos contra un solo sitio antigenico. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antigeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto que se pueden sintetizar sin contaminacion por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo que se obtiene de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, y no debe considerarse que requiere la produccion del anticuerpo por ningun procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan de acuerdo con la presente invencion se pueden hacer por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o se puede hacer por procedimientos de ADN recombinante (vease, p. ej., la patente de EE.UU. n° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos sobre fagos usando las tecnicas descritas por Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

[0047] Los anticuerpos monoclonales del presente documento, incluyen especificamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las correspondientes secuencias de anticuerpos obtenidos de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la o las cadenas es identico u homologo a las correspondientes secuencias de anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condicion de que presenten la actividad biologica deseada (patente de EE.UU. n° 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes del presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de union al antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., monos del viejo mundo, simios etc.) y secuencias de la region constante humana.

[0048] Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la region variable o de union al antigeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; fragmentos bivalentes; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmento o fragmentos de anticuerpos.

[0049] Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una region variable de union al antigeno asi como un dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (p. ej., dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de la secuencia de aminoacidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o mas funciones efectoras.

[0050] Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de secuencia natural o region Fc de variante de la secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen la union a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; union al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulacion por disminucion de los receptores de superficie celular (p. ej., receptor de linfocitos B; BCR), etc.

[0051] Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases". Hay 5 clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir ademas en "subclases" (isotipos), p. ej., IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman , y , respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. [0052] La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reaccion mediada por celulas en la que celulas citotoxicas no especificas que expresan receptores de Fc (FcR) (p. ej., linfocitos citoliticos naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente producen la lisis de la celula diana. Las celulas principales para la mediacion de la ADCC, las celulas NK, expresan solo FC RIII, mientras que los monocitos expresan Fc RI, Fc RII y Fc RIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la tabla 3 de la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molecula de interes, se puede llevar a cabo un ensayo de ADCC in vitro, tal como el que se describe en la patente de EE.UU. n° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) y linfocitos citoliticos naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molecula de interes se puede evaluar in vivo,

p. ej., en un modelo animal tal como el descrito por Clynes y col., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

[0053] Las "celulas efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las celulas expresan al menos FC RIII y realizan la funcion efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP), linfocitos citoliticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotoxicos y neutrofilos; siendo las CMSP y las celulas NK las preferidas. Las celulas efectoras se pueden aislar de una fuente natural de las mismas, p. ej., de sangre o CMSP como se describe en el presente documento.

[0054] Las expresiones "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Ademas, un FcR preferido es uno que

(ITIM) en su dominio citoplasmatico. (Vease la revision de M. in Daeron. Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods, 4:2534 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan abarcados en el termino "FcR" del presente documento. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587 (1976) y Kim y col., J. Immunol., 24:249 (1994)).

[0055] La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molecula para producir la lisis en una diana en presencia del complemento. La ruta de activacion del complemento se inicia por la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molecula (p. ej., un anticuerpo) que forma complejo con un antigeno cognado. Para evaluar la activacion del complemento se puede llevar a cabo un ensayo de la CDC, p. ej., como describen Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).

[0056] Los "anticuerpos naturales" normalmente son glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente

150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de uniones disulfuro varia entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tienen puentes disulfuro entre cadenas espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoacidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.

[0057] El termino "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no esta distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Esta concentrada en 3 segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones de armazon (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan ampliamente una configuracion de lamina conectada por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lamina . Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas muy cerca por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antigeno de los anticuerpos (vease, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero presentan diferentes condiciones efectoras, tales como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

[0058] La expresion "de region hipervariable" cuando se usa en el presente documento, se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union al antigeno. En general, la region hipervariable comprende restos de aminoacidos de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" (p. ej., los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (p. ej., los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 2632 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Los restos de la "region armazon" o "FR" son los restos del dominio variable distintos de los restos de la region hipervariable como se define en el presente documento.

[0059] La digestion de anticuerpos por la papaina produce dos fragmentos de union al antigeno identicos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de union al antigeno, y un fragmento "Fc" residual", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union al antigeno y todavia es capaz de union cruzada con el antigeno.

[0060] "Fv" es el fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio completo de reconocimiento al antigeno y de union al antigeno. Esta region consiste en un dimero de dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociacion estrecha, no covalente. Es en esta configuracion en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de union al antigeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de union al antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antigeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de union entero.

[0061] El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de algunos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion en el presente documento para el Fab' en el que el o los restos de cisteina de los dominios constantes soportan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.

[0062] Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie vertebrada se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ( ) y lambda ( ), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes. [0063] Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en el que estos dominios estan presentes en una sola cadena de polipeptido. Preferiblemente, el polipeptido Fv comprende ademas un conector polipeptidico entre los dominios VH y VL que permite que los scFv formen la estructura deseada para la union al antigeno. Para una revision de los scFv vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pag. 269315 (1994). Los fragmentos scFv del anticuerpo dirigido contra ErbB2 se describen en el documento WO 93/16185; patente de EE.UU. n° 5.571.894; y patente de EE.UU. n° 5.587.458.

[0064] La expresion "anticuerpos bivalentes" se refiere a fragmentos pequefos de anticuerpo que tienen dos sitios de union al antigeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipeptido (VH-VL). Mediante el uso de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union al antigeno. Los anticuerpos bivalentes se describen de forma mas completa, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl, Acad Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0065] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., de roedor) son anticuerpos quimericos que contiene la secuencia minima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayoria, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una region hipervariable del que los recibe se sustituyen por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region armazon (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar mas el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente al menos uno, y tipicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tipicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

[0066] Los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D53, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como se describe en la tabla 3 de la patente de EE.UU. n° 5.821.337; 520C9 humanizado (documento WO 93/21319) y anticuerpos 2C4 humanizados como se describe mas adelante en el presente documento.

[0067] Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirian con los usos de diagnostico y terapeutico del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteinicos o no proteinicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificara (1) hasta mas de 95% en peso del anticuerpo, determinado por el procedimiento de Lowry, y mas preferiblemente hasta mas de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoacidos N-terminales o internos usando un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul Coomassie o, preferiblemente, tincion con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en celulas recombinantes hasta que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no este presente. Sin embargo, normalmente, el anticuerpo aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.

[0068] Un anticuerpo "que se une" a un antigeno de interes, p. ej., antigeno ErbB2, es uno que es capaz de unirse a ese antigeno con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea util para dirigirse a una celula que expresa el antigeno. Cuando el anticuerpo es uno que se une a ErbB2, normalmente se unira preferentemente a ErbB2 frente a otros receptores ErbB, y puede ser uno que no tenga reacciones cruzadas significativas con otras proteinas tales como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En dichas realizaciones, la extension de la union del anticuerpo a estas proteinas que no son ErbB2 (p. ej., union de la superficie celular al receptor endogeno) sera menos de 10%, determinada por analisis de separacion de celulas activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RIA). A veces, el anticuerpo dirigido contra ErbB2 no tendra reaccion cruzada significativa con la proteina neu de rata, p. ej., como describen Schecter y col., Nature, 312:513 (1984) y Drebin y col., Nature, 312:545-548 (1984).

[0069] Un anticuerpo que "bloquea" la activacion del ligando de un receptor ErbB es uno que reduce o previene dicha activacion como se ha definido en lo que antecede, en el que el anticuerpo es capaz de bloquear la activacion del ligando del receptor ErbB sustancialmente de forma mas eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, p. ej., aproximadamente de forma tan eficaz como los anticuerpos monoclonales 7F3 o 2C4 o fragmentos Fab de los mismos y preferiblemente aproximadamente de forma tan eficaz como el anticuerpo monoclonal 2C4 o un fragmento Fab del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo que bloquea la activacion del ligando de un receptor ErbB puede ser uno que es aproximadamente 50-100% mas eficaz que 4D5 en el bloqueo de la formacion de un heterooligomero de ErbB. El bloqueo de la activacion del ligando de un receptor ErbB se puede producir por cualquier medio, p. ej., por interferencia con: la union del ligando a un receptor ErbB, formacion del complejo de ErbB, actividad de tirosina quinasa del receptor ErbB en un complejo de ErbB y/o fosforilacion del o de los restos de tirosina quinasa en o por un receptor ErbB. Los ejemplos de anticuerpos que bloquean la activacion del ligando de un receptor ErbB incluyen los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 (que bloquean la activacion de HRG de los heterooligomeros ErbB2/ErbB3 y ErbB2/ErbB4; y la activacion de EGF, TGF-, anfiregulina, HB-EGF y/o epiregulina de un heterooligomero EGFR/ErbB2); y los anticuerpos L26, L96 y L288 (Klapper y col., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)), que bloquean la union de EGF y NDF a celulas T47D que expresan EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4.

[0070] Un anticuerpo que tiene una "caracteristica biologica" de un anticuerpo designado, tal como el anticuerpo monoclonal designado 2C4, es uno que tiene una o mas caracteristicas biologicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antigeno (p. ej., ErbB2). Por ejemplo, un anticuerpo con una caracteristica biologica de 2C4 puede bloquear la activacion de HRG de un heterooligomero de ErbB que

bloquea la union del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2).

[0071] Salvo que se indique otra cosa, la expresion "anticuerpo monoclonal 2C4" se refiere a un anticuerpo que tiene restos de union al antigeno de, o derivados del anticuerpo 2C4 murino de los ejemplos siguientes. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 2C4 puede ser el anticuerpo monoclonal 2C4 murino o una variante del mismo, tal como el anticuerpo 2C4 humanizado, que tienen restos de aminoacidos de union al antigeno del anticuerpo monoclonal 2C4 murino. Se proporcionan ejemplos de anticuerpos 2C4 humanizados en el presente documento y en el documento WO 01/00245. Salvo que se indique otra cosa, la expresion "rhuMAb 2C4" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias de la cadena ligera variable (VL) y de la cadena pesada variable (VH) de las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, fusionadas con las secuencias de la region constante de IgG1 (alotipo no A) de las cadenas ligera y pesada humanas, opcionalmente expresadas por una celula de ovario de hamster chino (CHO).

[0072] Salvo que se indique otra cosa, la expresion "anticuerpo monoclonal 4D5" se refiere a un anticuerpo que tiene restos de union al antigeno de, o derivados del anticuerpo 4D5 murino (ATCC CRL 10463). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser anticuerpo monoclonal 4D5 murino o una variante del mismo, tal como un 4D5 humanizado, que tiene restos de union al antigeno del anticuerpo monoclonal 4D5 murino. Los ejemplos de anticuerpos 4D5 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como en la patente de EE.UU. n° 5.821.337, siendo huMAb4D5-8 (HERCEPTN®) un anticuerpo 4D5 humanizado preferido.

[0073] Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composicion que inhibe el crecimiento de una celula, en especial una celula de cancer que expresa ErbB in vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de celulas que expresan ErbB en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S), tal como agentes que inducen la detencion en G1 y la detencion en la fase M. Los bloqueadores de la fase M clasicos incluyen vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido y bleomicina. Los agentes que detienen la fase G1 tambien se extienden a la detencion en la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Se puede encontrar informacion adicional en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami y col. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), en especial pag. 13.

[0074] Los ejemplos de anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que se unen a ErbB2 e inhiben el crecimiento de las celulas cancerigenas que expresan en exceso ErbB2. Los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las celulas de tumores de mama SK-BR-3 en el cultivo celular en mas de 20%, y preferiblemente mas de 50% (p. ej., de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) con una concentracion de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 g/ml, en el que la inhibicion del crecimiento se determina 6 dias despues de la exposicion de las celulas SK-BR-3 al anticuerpo (vease la patente de EE.UU. n° 5.677.171 concedida el 14 de octubre, 1997). El ensayo de inhibicion del crecimiento de celulas SK-BR-3 se describe con mas detalle en esta patente y en el presente documento mas adelante. El anticuerpo inhibidor del crecimiento preferido es el anticuerpo monoclonal 4D5, p. ej., 4D5 humanizado.

Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es uno que hace que una celula viable se convierta en no viable. La celula, en general, es una que expresa el receptor ErbB2, en especial en la que la celula expresa en exceso el receptor ErbB2. Preferiblemente, la celula es una celula de cancer, p. ej., una celula de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salival, pulmon, rifon, colon, tiroides, pancreatica o de vejiga. In vitro, la celula puede ser una celula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia del complemento y celulas inmunitarias efectoras para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por lo tanto, el ensayo para la muerte celular se puede realizar usando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de celulas inmunitarias efectoras. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, se puede evaluar la perdida de la integridad de la membrana por la absorcion de yoduro de propidio (PI), azul de trypan (vease, Moore y col., Cytotechnology, 17:1-11 (1995)) o 7AAD, con respecto a las celulas no tratadas. Los anticuerpos inductores de la muerte celular preferidos son los que inducen la absorcion de PI en el ensayo de absorcion de PI en celulas BT474 (vease a continuacion).

[0075] Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada determinada por la union de anexina V, fragmentacion de ADN, contraccion celular, dilatacion del reticulo endoplasmico, fragmentacion celular y/o formacion de vesiculas de membrana (llamadas cuerpos apoptoticos). La celula normalmente es una que expresa en exceso el receptor ErbB2. Preferiblemente, la celula es una celula tumoral, p. ej., una celula de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salival, pulmon, rifon, colon, tiroides, pancreatica o de vejiga. In vitro, la celula puede ser una celula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. Estan disponibles diferentes procedimientos para evaluar los sucesos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocacion de la fosfatidil serina (PS) se puede medir mediante la union de anexina; la fragmentacion de ADN se puede evaluar por escalonado del ADN ("laddering'); y la condensacion nuclear/de cromatina junto con la fragmentacion del ADN se pueden evaluar por cualquier aumento de las celulas hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo que induce la apoptosis es uno que produce aproximadamente de 2 a 50 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 a 50 veces, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 veces, la induccion de la union de anexina con respecto a la celula no tratada, en un ensayo de union de anexina usando celulas BT474 (vease a continuacion). A veces, el anticuerpo proapoptotico sera uno que bloquea ademas la activacion del ligando de ErbB de un receptor ErbB (p. ej., el anticuerpo 7E3); es decir, el anticuerpo comparte una caracteristica biologica con el anticuerpo monoclonal 2C4. En otras situaciones, el anticuerpo es uno que no bloquea significativamente la activacion del ligando de ErbB de un receptor ErbB (p. ej., 7C2). Ademas, el anticuerpo puede ser uno como 7C2, que, aunque induce la apoptosis, no induce una reduccion grande del porcentaje de celulas en la fase S (p. ej., uno que solo induce aproximadamente 0-10% de reduccion en el porcentaje de estas celulas con respecto al control).

[0076] El "epitopo 2C4" es la region en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 2C4. Con el fin de cribar los anticuerpos que se unen al epitopo 2C4, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, se puede llevar a cabo la cartografia del epitopo para evaluar si el anticuerpo se une al epitopo 2C4 de ErbB2 (p. ej., uno cualquiera o mas restos de la region desde aproximadamente el resto 22 a aproximadamente el resto 584 de ErbB2, inclusive; vease las figuras 1A-B).

[0077] El "epitopo 4D5" es la region en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463). Este epitopo esta cerca del dominio transmembranario de ErbB2. Para cribar los anticuerpos que se unen al epitopo 4D5, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, se puede llevar a cabo la cartografia del epitopo para evaluar si el anticuerpo se une al epitopo 4D5 de ErbB2 (p. ej., uno cualquiera o mas restos de la region desde aproximadamente el resto 529 a aproximadamente el resto 625 de ErbB2, inclusive; vease las figuras 1A-B).

[0078] El "epitopo 3H4" es la region en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 3H4. Este epitopo incluye los restos desde aproximadamente el 541 a aproximadamente el 599, inclusive, en la secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de ErbB2; vease las figuras 1A-B. El "epitopo 7C2/7F3" es la region en el extremo N del dominio extracelular de ErbB2 a la que se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositado con ATCC, vease mas adelante). Para cribar los anticuerpos que se unen al epitopo 7C2/7F3, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, se puede llevar a cabo la cartografia del epitopo para establecer si el anticuerpo se une al epitopo 7C2/7F3 en ErbB2 (p. ej., uno cualquiera o mas de los restos de la region desde aproximadamente el resto 22 a aproximadamente el resto 53 de ErbB2; vease las figuras 1A-B).

[0079] "Mamifero" para los propositos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamifero, incluyendo seres humanos, animales domesticos y de granja, y animales de zoo, de deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamifero es un ser humano.

[0080] Un tumor que es "sensible al tratamiento" muestra una mejora estadisticamente significativa en respuesta al tratamiento con el anticuerpo dirigido contra ErbB, cuando se compara con el no tratamiento o el tratamiento con placebo en un moldeo animal reconocido o un ensayo clinico humano, o que responde al tratamiento inicial con anticuerpos dirigidos contra ErbB, pero crece cuando el tratamiento continua.

[0081] Los terminos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiologico indeseado, tal como el desarrollo o propagacion del cancer. Para los propositos de esta invencion, los resultados clinicos beneficiosos o deseados incluye, pero sin limitar, el alivio de los sintomas, la disminucion de la extension de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, retraso o ralentizacion de la evolucion de la enfermedad, mejora o paliacion del estado patologico, y remision (sea parcial o total), sea detectable

o indetectable. "Tratamiento" tambien puede significar prolongar la supervivencia comparada con la supervivencia esperada si no se recibiera el tratamiento. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen la afeccion o trastorno asi como aquellos propensos a tener la afeccion o trastorno, o aquellos en los que se va a prevenir la afeccion o trastorno.

[0082] Un "trastorno" es una afeccion que se beneficiaria del tratamiento de la presente invencion. Esto incluye trastornos o afecciones cronicas y agudas, incluyendo las afecciones patologicas que predisponen al mamifero al trastorno en cuestion. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a tratar en el presente documento, incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y tumores malignos linfoides, en particular cancer de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salival, pulmon, rifon, colon, tiroides, pancreatico, prostata o vejiga; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalamicos y otros trastornos glandulares, macrofagicos, epiteliales, estromales y blastocelicos; y trastornos inflamatorios, angiogenicos e inmunologicos. Un trastorno preferido para tratar de acuerdo con la presente invencion es el tumor maligno.

[0083] La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un farmaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamifero. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede reducir el numero de celulas tumorales; reducir el tamafo del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferiblemente detener) la infiltracion de celulas cancerigenas en los organos epiteliales; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferiblemente detener) la metastasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer. En la medida en que el farmaco puede prevenir el crecimiento y/o matar las celulas cancerigenas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico. Para la terapia del cancer, la eficacia se puede medir, por ejemplo, evaluando el tiempo de evolucion de la enfermedad (TEE) y/o determinando la tasa de respuesta (TR).

[0084] Los terminos "cancer" y "cancerigeno" se refieren a o describen la afeccion fisiologica en mamiferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o mas celulas cancerigenas. Los ejemplos de cancer se incluyen, pero sin limitar, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Los ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas (p. ej., cancer de celulas escamosas epiteliales), cancer de pulmon incluyendo cancer de pulmon de celulas pequefas, cancer de pulmon de celulas no pequefas ("CPCNP"), adenocarcinoma del pulmon y carcinoma escamoso del pulmon, cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago incluyendo cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandulas salivares, cancer de rifon o renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma peniano asi como cancer de cabeza y cuello.

[0085] Un "cancer que expresa ErbB" es uno que comprende celulas que tienen presente la proteina ErbB en su superficie celular. Un "cancer que expresa ErbB" es uno que produce un nivel suficiente de ErbB en la superficie de sus celulas, de modo que un anticuerpo dirigido contra ErbB2 puede unirse al mismo y tener un efecto terapeutico con respecto al cancer.

[0086] Un cancer "caracterizado por la activacion excesiva" de un receptor ErbB es uno en el que la extension de la activacion del receptor ErbB en las celulas cancerigenas supera significativamente el nivel de activacion de ese receptor en celulas no cancerigenas del mismo tipo de tejido. Dicha activacion excesiva puede ser resultado del exceso de expresion del receptor ErbB y/o de niveles mayores de los normales de un ligando de ErbB disponible para la activacion del receptor ErbB en las celulas cancerigenas. Dicha activacion excesiva puede producir y/o ser producida por el estado maligno de una celula cancerigena. En algunas realizaciones, el cancer se sometera a un ensayo de diagnostico o pronostico para determinar si se esta produciendo la amplificacion y/o el exceso de expresion de un receptor ErbB que da como resultado la activacion excesiva del receptor ErbB. Alternativamente, o adicionalmente, el cancer se puede someter a un ensayo de diagnostico o pronostico para determinar si se esta produciendo la amplificacion y/o el exceso de expresion de un ligando de ErbB en el cancer, al que se atribuye la activacion excesiva del receptor. En un subconjunto de dichos canceres, la activacion excesiva del receptor puede ser resultado de una ruta estimuladora autocrina.

[0087] En una ruta estimuladora "autocrina", se produce la autoestimulacion debido a que la celula cancerigena produce tanto un ligando de ErbB como su receptor ErbB cognado. Por ejemplo, el cancer puede expresar o expresar en exceso el EGFR y tambien expresar o expresar en exceso un ligando del EGFR (p. ej., EGF,

[0088] Un cancer que "expresa en exceso" un receptor ErbB es uno que tiene niveles significativamente mayores de un receptor ErbB, tal como ErbB2, en su superficie celular, comparado con una celula no cancerigena del mismo tipo de tejido. Dicha expresion en exceso puede ser producida por la amplificacion de genes o por la transcripcion o traduccion aumentadas. La expresion en exceso del receptor ErbB se puede determinar en un ensayo de diagnostico o pronostico evaluando los niveles mayores de la proteina ErbB presente en la superficie de una celula (p. ej., mediante un ensayo inmunohistoquimico; IHC). Alternativa o adicionalmente, se pueden medir los niveles del acido nucleico que codifica ErbB en la celula, p. ej., por tecnicas de hibridacion in situ fluorescente (FISH; vease el documento WO 98/45479 publicado en octubre, 1998), transferencia southern, o reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), tal como la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). El exceso de expresion del ligando de ErbB se puede determinar mediante diagnostico por la evaluacion de los niveles del ligando (o el acido nucleico que lo codifica) en el paciente, p. ej., en una biopsia tumoral o por diferentes ensayos de diagnostico tales como los ensayos de IHC, FISH, transferencia southern, PCR o ensayos in vivo descritos antes. Tambien se puede estudiar la expresion en exceso del receptor ErbB midiendo el antigeno circulante (p. ej., dominio extracelular de ErbB) en un fluido biologico tal como el suero (vease, p. ej., patente de EE.UU. n° 4.933.294 concedida el 12 de junio, 1990; documento WO 91/05264 publicado el 18 de abril, 1991; patente de EE.UU. n° 5.401.638 concedida el 28 de marzo, 1995; y Sias y col., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). Aparte de los ensayos anteriores, estan disponibles otros ensayos in vivo diferentes para el experto en la materia. Por ejemplo, se puede exponer a las celulas dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que opcionalmente esta marcado con un marcador detectable, p. ej., un isotopo radiactivo, y se puede evaluar en el paciente la union del anticuerpo a las celulas, p. ej., mediante escaneo externo de la radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente expuesto previamente al anticuerpo.

Los tumores que expresan en exceso HER2 se clasifican por puntuaciones inmunohistoquimicas que corresponden al numero de copias de moleculas de HER2 expresadas por celula, y se pueden determinar de forma bioquimica: 0 = 0-10.000 copias/celula, 1+ = al menos aproximadamente 200.000 copias/celula, 2+ = al menos aproximadamente

500.000 copias/celula, 3+ = al menos aproximadamente 2.000.000 copias/celula. El exceso de expresion de HER2 en el nivel 3+, que conduce a la activacion independiente del ligando de la tirosina quinasa (Hudziak y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 [1987]), se produce en aproximadamente 30% de los canceres de mama, y en estos pacientes disminuye la supervivencia sin recaidas y la supervivencia general (Slamon y col., Science, 244:707712 [1989]; Slamon y col., Science, 235:177-182 [1987]).

[0089] A la inversa, un cancer que "no se caracteriza por la expresion en exceso del receptor ErbB2" es uno que, en un ensayo de diagnostico, no expresa niveles mayores de los normales de receptor ErbB2 comparado con una celula no cancerigena del mismo tipo de tejido. Un cancer "independiente de hormonas" es uno en el que su proliferacion no depende de la presencia de una hormona que se une a un receptor expresado por las celulas en el cancer. Dichos canceres no sufren remision clinica tras la administracion de las estrategias farmacologicas o quirurgicas que reducen la concentracion hormonal en o cerca del tumor. Los ejemplos de canceres independientes de hormonas incluyen el cancer de prostata independiente de androgenos, cancer de mama, cancer endometrial y cancer de ovario independientes de estrogenos. Dichos canceres pueden empezar como tumores dependientes de hormonas y evolucionar desde un estado sensible a las hormonas a un tumor refractario a las hormonas despues de la terapia antihormonal.

[0090] La expresion "agente citotoxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la funcion de celulas y/o produce la destruccion de celulas. Se pretende que la expresion incluya isotopos radiactivos (p. ej., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isotopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, y toxinas tales como toxinas moleculas pequefas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.

[0091] Un "agente quimioterapeutico" es un compuesto quimico util en el tratamiento del cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXANT), sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina, mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro del oxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimnustina; antibioticos tales como aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; 5-FU; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenergicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; restablecedores de acido folico tales como acido frolinico; aceglatona; glicosido de aldofosfamida; acido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defosfamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; acido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxima; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, p. ej., paclitaxel (TAXOL®. Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), y docetaxel (TAXOTERE®; Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vonrelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); acido retinoico; espermicinas; capecitabina; y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Tambien estan incluidos en esta definicion los agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal sobre los tumores tales como antiestrogenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

Como se usa en el presente documento, la expresion "farmaco dirigido al EGFR" se refiere a un agente terapeutico que se une al EGFR y, opcionalmente, inhibe la activacion del EGFR. Los ejemplos de dichos agentes incluyen anticuerpos y moleculas pequefas que se unen al EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen al EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vease, patente de EE.UU. n° 4.943.533, Mendelsohn y col.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBUTIX®) y 225 humano redisefado (H225) (vease el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (patente de EE.UU. n° 5.212.290); anticuerpos humanizados y quimericos que se unen a EGFR como se describe en la patente de EE.UU. n° 5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, tales como ABX-EGF (vease el documento WO 98/50433, Abgenix). El anticuerpo dirigido contra EGFR se puede conjugar con un agente citotoxico, generando asi un inmunoconjugado (vease, p. ej., el documento EP 659.439A2, Merck Patent GmbH). Los ejemplos de moleculas pequefas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinib (IRESSAT; Astra Zeneca), CP-358774 (TARCEVAT; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen). Un "inhibidor de tirosina quinasa" es una molecula que inhibe en cierta medida la actividad de tirosina quinasa de una tirosina quinasa tal como un receptor ErbB. Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen los farmacos dirigidos al EGFR indicados en el parrafo precedente, asi como las quinazolinas tales como PD 153035,4-(3-cloroanilino)quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706, y pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7Hpirrolo[2,3-d]pirimidinas, curcumina (diferuloilmetano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas que contienen restos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moleculas de sentido contrario (p. ej., las que se unen al acido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (patente de EE.UU. n° 5.804.396); trifostinas (patente de EE.UU. n° 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inhibidores de pan-ErbB tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: patente de EE.UU. n° 5.804.396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); yWO 96/33980 (Zeneca).

[0092] Un agente "antiangiogenico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere en algun grado, el desarrollo de los vasos sanguineos. El factor antiangiogenico puede ser, por ejemplo, una molecula pequefa o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento implicado en promover la angiogenesis. El factor antiangiogenico preferido en el presente documento es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

[0093] El termino "citoquina" es un termino generico para proteinas liberadas por una poblacion de celulas que actuan en otra celula como mediadores intracelulares. Los ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptidicas tradicionales. Entre las citoquinas estan incluidas la hormona del crecimiento, tal como la hormona del crecimiento humana, N-metionil-hormona del crecimiento humana y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteicas tales como la hormona foliculoestimulante (FSH), hormona estimuladora de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepatico, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina; lactogeno placentario; factor de necrosis tumoral y ; sustancia inhibidora mulleriana; peptido asociado con gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular, integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-; factor de crecimiento de plaquetas, factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF- y TGF-; factor de crecimiento similar a insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferon-, y , factores estimuladores de colonias (CSF) tales como CSF de macrofagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrofagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleuquinas tales como as IL-1, IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-o TNF-; y otros factores polipeptidicos incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el termino citoquina incluye proteinas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de citoquinas de secuencia natural.

[0094] El termino "profarmaco" como se usa en esta solicitud, se refiere a un precursor o una forma derivada de una sustancia farmaceuticamente activa que es menos citotoxica para las celulas tumorales comparada con el farmaco original y es capaz de ser activado enzimaticamente o convertirse en la forma original mas activa. Vease, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, paginas 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery. Borchardt y col. (ed.), paginas 247-267. Humana Press (1985). Los profarmacos incluyen, pero sin limitar, profarmacos que contienen fosfato, profarmacos que contienen tiofosfato, profarmacos que contienen sulfato, profarmacos que contienen peptido, profarmacos modificados con D-aminoacidos, profarmacos glicosilados, profarmacos que contienen -lactama, profarmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profarmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profarmacos de 5-fluorocitosina y otros profarmacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el farmaco libre citotoxico mas activo. Entre los ejemplos de farmacos citotoxicos que se pueden derivatizar a una forma de profarmaco se incluyen, pero sin limitar, los agentes quimioterapeuticos descritos anteriormente.

Un "liposoma" es una vesicula pequefa compuesta de varios tipos de lipidos, fosfolipidos y/o tensioactivos que es util para la liberacion de un farmaco (tal como los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 descritos en el presente documento y, opcionalmente, un agente quimioterapeutico) a un mamifero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formacion de bicapa, similar a la disposicion de las membranas biologicas.

[0095] El termino "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapeuticos, que contienen informacion sobre las indicaciones, uso, dosificacion, administracion, contraindicaciones y/o advertencias relacionadas con el uso de dichos productos terapeuticos.

[0096] Un "cardioprotector" es un compuesto o composicion que previene o reduce la disfuncion miocardica (es decir, la cardiomiopatia y/o insuficiencia cardiaca congestiva) asociada con la administracion de un farmaco, tal como un antibiotico de antraciclina y/o un anticuerpo dirigido contra ErbB2, a un paciente. El cardioprotector puede, por ejemplo, bloquear o reducir un efecto cardiotoxico mediado por radicales libres y/o prevenir o reducir el dafo por estres oxidativo. Los ejemplos de cardioprotectores abarcados por la presente definicion incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert y col., The Annals of pharmacotherapy, 28:1063-1072 (1994)); un agente reductor de lipidos y/o antioxidante tal como probucol (Singal y col., J. Mol Cell Cardiol., 27:1055-1063 (1995)); amifostina (ester de 2-[(3-aminopropil)amino]etanotiol-dihidrogenofosfato de aminotiol, llamado tambien WR-2721, y la forma de absorcion celular desfosforilada del mismo llamada WR-1065) y el acido S-3-(3metilaminopropilamino)propilfosforotioico (WR-151327), vease Green y col., Cancer Research, 54: 738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R. In: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)); betabloqueadores tales como metoprolol (Hjalmarson y col., Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994); y Shaddy y col., Am. Heart J., 129:197-9 (1995)); vitamina E; acido ascorbico (vitamina C); depuradores de radicales libres tales como acido oleanolico, acido ursolico y N-acetilcisteina (NAC); compuestos atrapadores de espin tales como alfa-fenil-terc-butilnitrona (PBN); (Paracchini y col., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)); compuestos selenoorganicos tales como P251 (Elbesen); y similares.

[0097] Una molecula de acido nucleico "aislada" es una molecula de acido nucleico que se identifica y separa de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la que normalmente esta asociada en la fuente natural del acido nucleico anticuerpo. Una molecula de acido nucleico aislada esta en una forma o entorno distinto al que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moleculas de acido nucleico aisladas se distinguen de la molecula de acido nucleico como existe en las celulas naturales. Sin embargo, una molecula de acido nucleico aislada incluye una molecula de acido nucleico contenida en celulas que normalmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molecula de acido nucleico esta en un lugar cromosomico diferente del de las celulas naturales.

[0098] La expresion "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huesped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de union al ribosoma. Se sabe que las celulas eucariotas utilizan promotores, sefales de poliadenilacion y potenciadores.

[0099] Un acido nucleico esta "operativamente unido" cuando esta situado en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia lider secretora esta operativamente unido al ADN para un polipeptido si se expresa como una preproteina que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta operativamente unido a una secuencia codificante si esta situado de forma que facilita la traduccion. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen estan contiguas y, en el caso de una secuencia lider secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La union se realiza mediante el ligado en los sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan los adaptadores o conectores oligonucleotidos sinteticos de acuerdo con la practica convencional.

[0100] Como se usa en el presente documento, las expresiones "celula", "linea celular" y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable y todas las denominaciones incluyen la progenie. Asi pues, las palabras "transformantes" y "celulas transformadas" incluyen la celula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma sin considerar el numero de transferencias. Tambien debe entenderse que toda la progenie no puede ser exactamente identica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma funcion o actividad biologica cuando se hace el cribado en la celula originalmente transformada. Cuando se proponen designaciones diferentes, seran obvias a partir del contexto.

Procedimientos para identificar tumores que son sensibles al tratamiento con anticuerpos dirigidos contra HER2

Fuentes de tumores y celulas tumorales

[0101] Los tumores se pueden caracterizar como sensibles a la terapia con 2CA, basandose en la presencia de heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-ErbB3 en la superficie celular, como una medida de la activacion de HER2. Se puede ensayar en las muestras tumorales la presencia de heterodimeros por cualquier procedimiento conocido en la materia. Preferiblemente, la presencia de heterodimeros se determina por uno o mas de los procedimientos descritos a continuacion.

[0102] Puesto que la activacion de HER2 es el resultado de la heterodimerizacion y fosforilacion del receptor, un procedimiento particularmente importante para identificar tumores sensibles a la terapia con 2C4 es la deteccion de la fosforilacion del receptor ErbB, tal como la fosforilacion del receptor ErbB2 (HER2), como se describe a continuacion.

[0103] Las fuentes de celulas tumorales que se pueden ensayar incluyen, pero sin limitar, biopsias de tumores, celulas tumorales circulantes, proteinas plasmaticas circulantes, liquido ascitico, tumores xenotrasplantados y otros modelos tumorales, y cultivos de celulas primarias o lineas celulares derivadas de tumores o que presentan propiedades de tipo tumoral, asi como muestras tumorales conservadas, tales como muestras tumorales fijadas en formalina, insertadas en parafina. La seleccion de paneles de diferentes tipos de celulas tumorales para los heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-BrbB3, y/o la fosforilacion del receptor ErbB, esta contemplada por la presente invencion. Las celulas tumorales del mismo tipo que las celulas tumorales que dan positivo el ensayo de heterodimeros y/o la fosforilacion del receptor ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2), se pueden someter a terapia con 2C4. Los modelos tumorales descritos a continuacion se proporcionan como ejemplos, y no deben considerarse limitantes de la invencion.

[0104] Se puede ensayar la sensibilidad a la terapia con 2C4 de las celulas tumorales que provienen de un paciente que padece actualmente un tumor. Si se determina que las celulas son sensibles, basandose en la presencia de los heterodimeros HER2/HER3 y/o HBR2/HBR1 o demostrando la fosforilacion del receptor ErbB, posteriormente se puede tratar al paciente con un anticuerpo con una o mas de las caracteristicas biologicas de 2C4. El paciente se trata con rhuMAb 2C4.

[0105] Se pueden ensayar en celulas tumorales de un tipo particular de tumor o celulas que se cree que tienen las caracteristicas de un tipo particular de tumor, la presencia de heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-BrbB3, o la fosforilacion del receptor ErbB, preferiblemente el receptor ErbB2 (HER2). Si se detectan los heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-BrbB3 y/o la fosforilacion del receptor ErbB, se considera que el tipo de tumor es un candidato bueno para el tratamiento con rhuMAb 2C4. Los pacientes que padecen este tipo de tumor se pueden tratar entonces con dicho anticuerpo.

Xenoijertos de lineas celulares

[0106] Las celulas tumorales propagadas in vitro, tales como celulas tumorales desarrolladas en cultivo y lineas de celulas tumorales, se pueden xenotrasplantar en ratones mediante el implante de celulas directamente en un sitio de interes. Dichos procedimientos son bien conocidos para el experto en la materia. Se ensayan las celulas para identificar la presencia de los heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-BrbB3, o la fosforilacion del receptor ErbB, tal como la fosforilacion del receptor ErbB2 (HER2).

[0107] Las celulas tumorales se pueden implantar por via subcutanea en un raton, preferiblemente un raton sin pelo atimico. Las celulas tumorales se pueden implantar en un lugar fisiologicamente relevante para crear un modelo tumoral in situ apropiado. Por ejemplo se pueden implantar celulas de una linea celular de cancer de mama con diferentes concentraciones, en la almohadilla adiposa mamaria de ratones sin pelo atimicos, para tener un modelo mas preciso de la biologia del cancer de mama. Se puede ensayar en las celulas tumorales la presencia de los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-BrbB3, o la fosforilacion del receptor ErbB sea antes o despues del implante. Preferiblemente, las celulas tumorales se ensayan despues de que las celulas implantadas se han desarrollado en un tumor de un tamafo predeterminado. El raton tambien se puede someter a terapia con 2C4 o un anticuerpo funcionalmente equivalente, sirviendo de control los ratones no tratados.

[0108] Se pueden establecer modelos similares para cualquier tipo de tumor a partir del cual se han obtenido celulas cultivadas o lineas celulares. Los tipos de tumores incluyen, pero sin limitar, vejiga, cerebro, mama, colon, esofago, rifon, leucemia, higado, pulmon, melanoma, ovario, pancreas, prostata, sarcoma, estomago, testiculo y utero. Las celulas tumorales o lineas celulares que expresan en exceso ErbB2 se usan para el implante, o se pueden usar para el implante celulas tumorales o lineas celulares que expresan cantidades normales o inferiores a las normales de ErbB2. Se pueden usar para el implante celulas tumorales o lineas celulares que no son sensibles a HERCEPTIN®.

[0109] Se pueden implantar aproximadamente 20 millones de celulas de tumor de mama MDA-175 en la almohadilla adiposa gonadal de raton. Se determina la expresion de los dimeros HER2/HBR1 y/o HER2/HER3 en la superficie de las celulas xenotransplantadas, tal como por uno de los procedimientos descritos a continuacion. Los ratones con el implante tambien se pueden someter a tratamiento con 0,3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg o 100 mg/kg de 2C4. Otros regimenes de dosificacion los puede determinar el experto en la materia.

[0110] Los tumores solidos, tales como el cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de prostata y cancer colorrectal, son particularmente adecuados para el analisis y tratamiento.

Xenoinjertos tumorales

[0111] Se pueden obtener muestras de tumor de mamifero, preferiblemente muestras de tumor humano, e implantarlas en ratones, preferiblemente ratones sin pelo atimicos. Las muestras de tumor se pueden obtener por cualquier procedimiento conocido en la materia. Las muestras de tumor se pueden extirpar quirurgicamente, tal como en una biopsia o en un procedimiento quirurgico para eliminar el tumor del mamifero. La muestra de tumor se puede obtener purificando celulas tumorales circulantes de la sangre de mamiferos.

[0112] Se pueden implantar cortes de tumor humano solido de aproximadamente 5x5x0,5 a 1 mm en los flancos de ratones sin pelo atimicos, en general cuatro fragmentos por raton. Cuando los tumores implantados alcanzan un diametro con una mediana de aproximadamente 10-15 mm se pueden someter a pases sucesivos, en general usando fragmentos de tumor mas pequefos. Se describen procedimientos para generar y estudiar xenoinjertos de tumor humano en las siguientes referencias: Fiebig y col., "Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents," en Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Fiebig & Burger, eds. (Basel, Karger, 1999), vol. 54, pag. 29-50; Berger y col., "Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice," en Immunodeficient Mice in Oncology, Fiebig & Berger, eds. (Basel, Karger 1992), pag. 23-46; Fiebig & Burger, "Human Tumor Xenografts and Explants," en Models in Cancer Research Teicher, ed. (Humana Press 2002) pag. 113-137.

[0113] Los xenoinjertos humanos se consideran muy predictivos del comportamiento tumoral en el paciente donante, ya que el xenoinjerto crece como un tumor solido, se diferencia y desarrolla un estroma, vasculatura y una necrosis central. En la mayoria de los casos, los xenoinjertos retienen la mayor parte de las caracteristicas moleculares, histologicas y fisiopatologicas del tumor recien obtenido del paciente. En las celulas tumorales de ratones que contienen tumores de primer pase o de pases sucesivos, se puede analizar la presencia de heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-ErbB3, o la fosforilacion del receptor ErbB. Los ratones tambien se pueden someter a terapia con 2C4 o un anticuerpo funcionalmente equivalente.

[0114] Se puede cribar en un panel establecido o de nueva creacion, la presencia de heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-ErbB3, o la fosforilacion del receptor ErbB. Fiebig y Burger, vease antes, describen un panel de alrededor de mas de 300 xenoinjertos de tumores humanos establecidos de una variedad de tipos de cancer comunes, tales como de vejiga, cerebro, mama, colon, esofago, rifon, leucemia, higado, pulmon, melanoma, ovario, pancreas, prostata, sarcoma, estomago, testiculo y utero. Se pueden cribar en el panel entero los heterodimeros o la fosforilacion del receptor ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2). Tambien se pueden cribar los heterodimeros o la fosforilacion del receptor ErbB en subconjuntos de este panel, en los que los subconjuntos se basan, por ejemplo, en el tipo de tejido, la expresion superior, inferior o normal de ErbB2, o el fracaso en la respuesta a HERCEPTIN®. De esta forma los tumores se pueden clasificar como candidatos para la terapia con 2C4 basandose en la presencia de heterodimeros, o demostrando la fosforilacion del receptor ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2). De la misma forma, los pacientes que tienen tumores clasificados de esta forma se pueden considerar mas rapidamente elegibles para la terapia con 2C4 o un anticuerpo funcionalmente equivalente.

[0115] En las muestras tumorales se puede ensayar la presencia de los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3, o la fosforilacion del receptor ErbB antes o despues del implante. Aproximadamente 1 gramo de tumor de un xenoinjerto de primer pase y/o de pases sucesivos, se puede caracterizar ademas molecularmente la presencia de heterodimeros, o se puede congelar instantaneamente en nitrogeno liquido y conservar a -80°C para la posterior caracterizacion. Los tumores de xenoinjertos se pueden analizar ademas mediante un ensayo de doble capa de agar blando, llamado tambien un ensayo clonogenico, como describen, por ejemplo Fiebig y Burger, vease antes. Los xenoinjertos de tumores humanos solidos se desagregan mecanica y proteoliticamente en una suspension de una sola celula, que se cultiva en placas de multipocillos estratificados con agar blanco, como se describe. El crecimiento de las celulas tumorales in vitro conduce a la formacion de colonias, en las que se puede analizar ademas las caracteristicas moleculares, tales como los heterodimeros o la fosforilacion del receptor ErbB, u otras caracteristicas histoquimicas o morfologicas.

B. Detecci6n de los heterodimeros EGFR-ErbB2 y ErbB2-ErbB3

[0116] Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la tecnica para detectar los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 en tumores. A continuacion se describen varios procedimientos preferidos. Estos procedimientos detectan interacciones proteina-proteina no covalentes o indican de otra forma la proximidad entre las proteinas de interes.

Coinmunoprecipitaci6n e inmunotransferencia

[0117] Se pueden usar procedimientos basados en inmunoafinidad, tales como inmunoprecipitacion o ELISA, para detectar los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3. Se pueden usar anticuerpos dirigidos contra ErbB2 para la inmunoprecipitacion de complejos que comprenden ErbB2 de celulas tumorales, y despues, se examina en el inmunoprecipitado resultante la presencia de EGFR o ErbB3 mediante inmunotransferencia. Los anticuerpos contra EGFR o ErbB3 se pueden usar para la etapa de inmunoprecipitacion, y despues examinar el inmunoprecipitado con anticuerpos contra ErbB2. Se pueden usar ligandos especificos de ErbB para los complejos de HBR1, HER3, HER2/HER1 o complejos de HER2/HER3 para precipitar los complejos, en los que despues se examina la presencia de HER2. Po ejemplo, los ligandos se pueden conjugar con avidina y purificar los complejos en una columna de biotina.

[0118] En otros ensayos tales como en ELISA o ensayos de tipo sandwich de anticuerpos, se inmovilizan anticuerpos contra ErbB2 sobre un soporte solido, se ponen en contacto con celulas tumorales o lisato de celulas tumorales, se lavan y despues se exponen al anticuerpo contra EGFR o ErbB3. La union de este ultimo anticuerpo, que se puede detectar directamente o por un anticuerpo secundario conjugado con un marcador detectable, indica la presencia de heterodimeros. Se puede inmovilizar el anticuerpo contra EFGR o ErbB3, y el anticuerpo contra ErbB2 se usa para la etapa de deteccion. Los ligandos del receptor ErbB se pueden usar en lugar de, o en combinacion con anticuerpos dirigidos contra el receptor ErbB.

[0119] A la inmunoprecipitacion con el anticuerpo contra EGFR, ErbB2 o ErbB3 le puede seguir un ensayo funcional de los heterodimeros, como una alternativa o complemento a la inmunotransferencia. A la inmunoprecipitacion con el anticuerpo contra ErbB3 le puede seguir un ensayo de la actividad de receptor de tirosina quinasa en el inmunoprecipitado. Debido a que ErbB3 no tiene actividad intrinseca de tirosina quinasa, la presencia de actividad de tirosina quinasa en el inmunoprecipitado indica que lo mas probable es que ErbB3 este asociado con ErbB2. Graus-Porta y col., EMBO J., 16:1647-55 (1997); Klapper y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96: 4995-5000 (1999). Este resultado se puede confirmar por inmunotransferencia con anticuerpos contra ErbB2. A la inmunoprecipitacion con el anticuerpo contra ErbB2 le puede seguir un ensayo de la actividad de receptor de tirosina quinasa del EGFR. En este ensayo, el inmunoprecipitado se pone en contacto con ATP radiactivo y un sustrato peptidico que imita el sitio in vivo de transfosforilacion de ErbB2 por EGFR. La fosforilacion del peptido indica la coinmunoprecipitacion y por lo tanto la heterodimerizacion de EGFR con ErbB2. Los ensayos de la actividad de receptor de tirosina quinasa son bien conocidos en la materia e incluyen ensayos para detectar la fosforilacion de sustratos diana, por ejemplo, por anticuerpos contra fosfotirosina, y activacion de las rutas de transduccion de sefales cognadas, tales como la ruta de MAPK.

Las variaciones de los procedimientos y ensayos anteriores seran facilmente evidentes y rutinarias para el experto en la materia.

[0120] Tambien se puede usar la reticulacion quimica o UV para unir los heterodimeros covalentemente en la superficie de las celulas vivas. Hunter y col., Biochem. J., 320:847-53. Los ejemplos de reticuladores quimicos incluyen propionato de ditiobis(succinimidilo) (DSP) y propionato de 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidilo) (DTSSP). Los extractos celulares de celulas tumorales reticuladas quimicamente se pueden analizar por SDS-PAGE e inmunotransferir con anticuerpos contra EGFR y/o ErbB3. Una banda en el ensayo en gel Super Shift del peso molecular adecuado representa lo mas probablemente heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3, ya que ErbB2 es la pareja de heterodimerizacion preferida para EGFR y ErbB3. Este resultado se puede confirmar por la posterior inmunotransferencia con anticuerpos contra ErbB2.

Procedimientos basados en fluorescencia yFRET

[0121] La transferencia de energia por resonancia de fluorescencia (FRET) tambien se puede usar para detectar los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3. Con FRET se detectan los cambios conformacionales de la proteina y las interacciones proteina-proteina in vivo e in vitro, basandose en la transferencia de energia de una fluoroforo donador a un fluoroforo aceptor. Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34 (2000). La transferencia de energia solo tiene lugar si el fluoroforo donador esta suficientemente cerca del fluoroforo aceptor. En un experimento de FRET tipico, dos proteinas o dos sitios en una sola proteina se marcan con diferentes sondas fluorescentes. Una de las sondas, la sonda donadora, se excita a un estado de energia superior mediante luz incidente a una longitud de onda especificada. Despues, la sonda donadora transmite su energia a la segunda sonda, la sonda aceptora, dando como resultado una reduccion de la intensidad de la fluorescencia del donador y un aumento de la emision de fluorescencia del aceptor. Para medir el grado de transferencia de energia, la intensidad del donador en una muestra marcada con sondas donadoras y aceptoras, se compara con su intensidad en una muestra marcada solo con la sonda donadora. Opcionalmente, la intensidad del aceptor se compara con muestras de donador/aceptor y aceptor solo. Se conocen sondas adecuadas en la materia e incluyen, por ejemplo, colorantes permanentes de membrana, tales como fluoresceina o rodamina, colorantes organicos tales como colorantes de cianina, y atomos lantanidos. Selvin, vease antes. Los procedimientos y la instrumentacion para detectar y medir la transferencia de energia tambien se conocen en la materia. Selvin, vease antes.

[0122] Las tecnicas basadas en FRET adecuadas para detectar y medir las interacciones proteina-proteina en celulas individuales son conocidas en la materia. Por ejemplo, se pueden usar la microscopia de transferencia de energia por resonancia de fluorescencia tras fotoblanqueo (pbFRET) y microscopia de visualizacion de vida media de fluorescencia (FLIM) del donador, para detectar la dimerizacion de los receptores de la superficie celular. Selvin, vease antes; Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995). pbFRET se puede usar en celulas "en suspension" o "in situ" para detectar y medir la formacion de heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-BrbB3, como describen Nagy y col., Cytometry, 32:120-131 (1998). Estas tecnicas miden la reduccion de la vida media de la fluorescencia del donador debido a la transferencia de energia.

[0123] Se puede usar una tecnica de FRET de tipo Foerster y citometria de flujo (FCET) para investigar la heterodimerizacion de EGFR-ErbB2 y ErbB2-ErbB3, como describen Nagy y col., vease antes, y Brockhoff y col., Cytometry, 44:338-48 (2001).

[0124] La tecnica FRET se usa preferiblemente junto con las tecnicas convencionales de marcaje inmunohistoquimicas. Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001). Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes adecuados como sondas para el marcaje de dos proteinas diferentes. Si las proteinas estan proximas una a otra, los colorantes fluorescentes actuan como donadores y aceptores para la FRET. La transferencia de energia se detecta por medios convencionales. La transferencia de energia se puede detectar por medio de citometria de flujo o por sistemas de microscopia digital, tales como microscopia confocal o microscopia de fluorescencia de campo amplio acoplada con una camara con dispositivo de carga acoplada (CCD).

[0125] Los anticuerpos contra ErbB2 y los anticuerpos contra EGFR o ErbB3 se pueden marcar directamente con dos fluoroforos diferentes, por ejemplo, como describen Nagy y col., vease antes. Las celulas tumorales o lisatos de celulas tumorales se ponen en contacto con los anticuerpos diferentemente marcados, que actuan como donadores y aceptores para FRET en presencia de los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3. Alternativamente, los anticuerpos no marcados contra ErbB2 y EGFR o ErbB3 se pueden usar junto con anticuerpos secundarios diferentemente marcados que sirven como donadores y aceptores. Vease, por ejemplo, Brockhoff y col., vease antes. Se detecta la transferencia de energia y se determina la presencia de heterodimeros si se encuentra que los marcadores estan muy proximos.

[0126] Los ligandos de receptores ErbB que son especificos para HER2 y HER1 HER3, se pueden marcar con marcadores fluorescentes y usar para los estudios de FRET.

[0127] La presencia de heterodimeros en la superficie de las celulas tumorales se puede demostrar mediante la localizacion conjunta de ErbB2 con EGFR o ErbB3 usando tecnicas convencionales de inmunofluorescencia directa

o indirecta y microscopia de barrido laser confocal. Alternativamente, se usan las imagenes de barrido laser (LSI) para detectar la union del anticuerpo y la localizacion conjunta de ErbB2 con EGFR o ErbB3 en un formato de alto rendimiento, tal como una placa de micropocillos, como describen Zuck et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA. 96:1112227 (1999).

La presencia de heterodimeros EGFR-ErbB2 y/o ErbB2-ErbB3 se puede determinar identificando la actividad enzimatica que depende de la proximidad de los componentes del heterodimero. Se conjuga un anticuerpo contra ErbB2 con una enzima y se conjuga un anticuerpo contra EGFR o ErbB3 con una segunda enzima. Se afade un primer sustrato para la primera enzima y la reaccion produce un segundo sustrato para la segunda enzima. Esto conduce a una reaccion con otra molecula para producir un compuesto detectable, tal como un colorante. La presencia de otro producto quimico rompe el segundo sustrato, de modo que previene la reaccion con la segunda enzima salvo que la primera y la segunda enzimas, y por lo tanto los dos anticuerpos, esten muy proximos. Las celulas tumorales o lisatos celulares se pueden poner en contacto con un anticuerpo contra ErbB2 que esta conjugado con glucosa oxidasa y un anticuerpo contra ErbB3 o ErbB1 que esta conjugado con peroxidasa de rabano picante. Se afade glucosa a la reaccion, junto con un precursor del colorante, tal como DAB, y catalasa. La presencia de los heterodimeros se determina mediante el desarrollo de color tras la tincion por DAB.

Sistema de ensayo eTagT™

[0128] Los heterodimeros se pueden detectar usando procedimientos basados en el sistema de ensayo eTagT (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA), como se describe, por ejemplo, en el documento WO 83502 y en la solicitud de patente de EE.UU. 2001/0049105, publicada el 6 de diciembre, 2001.

Un eTagTM o "marcador electroforetico", comprende un resto indicador detectable, tal como un grupo fluorescente. Tambien puede comprender un "modificador de la movilidad", que consiste esencialmente en un resto que tiene una movilidad electroforetica unica. Estos restos permiten la separacion y la deteccion del eTagTM de una mezcla compleja en condiciones electroforeticas definidas, tal como por electroforesis capilar (CE). La parte del eTagTM que contiene el resto indicador, y opcionalmente, el modificador de la movilidad, esta conectado a un primer resto de union a la diana mediante un grupo conector escindible para producir un primer compuesto de union. El primer resto de union a la diana reconoce especificamente una primera diana particular, tal como un acido nucleico o proteina. El primer resto de union a la diana no esta limitado de ninguna forma, y puede ser, por ejemplo, un polinucleotido o un polipeptido. Preferiblemente, el primer resto de union a la diana es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Alternativamente, el primer resto de union a la diana puede ser un ligando de receptores ErbB o un fragmento del mismo competente para la union.

[0129] El grupo conector preferiblemente comprende un resto escindible, tal como un sustrato de enzima, o cualquier enlace quimico que se puede escindir en condiciones definidas. Cuando el primer resto de union a la diana se une a su diana, se introduce y/o activa el agente de escision, y el grupo conector se escinde, liberando asi la parte del eTagTM que contiene el resto indicador y el modificador de la movilidad. Por lo tanto, la presencia de un eTagTM "libre" indica la union del resto de union a la diana a su diana.

[0130] Preferiblemente, un segundo compuesto de union comprende el agente de escision y un segundo resto de union a la diana que reconoce especificamente una segunda diana. El segundo resto de union a la diana tampoco esta limitado de ninguna forma y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o un ligando de receptores ErbB o un fragmento de ligando competente para la union. El agente de escision es tal que solo escindira el grupo conector en el primer compuesto de union si el primer compuesto de union y el segundo compuesto de union estan muy cerca.

[0131] Un primer compuesto de union puede comprender un eTagTM en el que un anticuerpo contra ErbB2 sirve como el primer resto de union a la diana. Un segundo compuesto de union puede comprender un anticuerpo contra EGFR o ErbB3 unido a un agente de escision capaz de escindir el grupo conector del eTagTM. Preferiblemente, el agente de escision debe ser activado con el fin de poder escindir el grupo conector. Las celulas tumorales o lisatos de celulas tumorales se ponen en contacto con el eTagTM, que se une a ErbB2, y con el anticuerpo contra EGFR o ErbB3 modificado, que se une a EGFR o ErbB3 en la superficie celular. Preferiblemente se separa el compuesto de union no unido, y si es necesario, se activa el agente de escision. Si los heterodimeros EGFR-ErbB2 o ErbB2-ErbB3 estan presentes, el agente de escision escindira el grupo conector y liberara el eTagTM debido a la proximidad del agente de escision al grupo conector. El eTagTM libre se puede entonces detectar por cualquier procedimiento conocido en la materia, tal como por electroforesis capilar.

[0132] El agente de escision puede ser una especie quimica activable que actue en el grupo conector. Por ejemplo, el agente de escision puede ser activado por exposicion de la muestra a la luz.

[0133] El eTagTM se puede construir usando un anticuerpo contra EGFR o ErbB3 como el primer resto de union a la diana, y el segundo compuesto de union se construye a partir de un anticuerpo contra ErbB2.

Detecci6n de la fosforilaci6n del receptor ErbB

[0134] La presencia de la fosforilacion del receptor ErbB se puede usar para demostrar la activacion de HER2.

[0135] La fosforilacion del receptor ErbB se puede evaluar por inmunoprecipitacion de uno o mas receptores ErbB, tal como el receptor ErbB2 (HER2), y por analisis de transferencia Western. Por ejemplo, se determina que es positiva, por la presencia de una banda de fosfo-HER2 en el gel, usando un anticuerpo dirigido contra la fosfotirosina para detectar el o los restos de tirosina fosforilados en el o los receptores ErbB inmunoprecipitados. Los anticuerpos dirigidos contra la fosfotirosina estan disponibles en el mercado en PanVera (Madison, WI), una filial de Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA), o Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Se determina que es negativa por la ausencia de la banda.

[0136] La fosforilacion del receptor ErbB2 (HER2) se puede evaluar por inmunohistoquimica usando un anticuerpo dirigido contra HER2 fosfoespecifico (clone PN2A; Thor y col., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)).

Otros procedimientos para detectar la fosforilacion del o de los receptores ErbB incluyen, pero sin limitar, KIRA ELISA (patentes de EE.UU. n° 5.766.863; 5.891.650; 5.914.237; 6.025.145; y 6.287.784), espectrometria de masas (que compara el tamafo de HER2 fosforilado y no fosforilado), y ensayo de proximidad de marcador electroforetico con anticuerpo dirigido contra HER2 (p. ej., usando el kit de ensayo de eTagT disponible en Aclara BioSciences (Mountain View, CA). Se describen detalles del ensayo con eTagT en lo que antecede.

Vectores, celulas huesped y procedimientos recombinantes

[0137] En el presente documento se describen el acido nucleico aislado que codifica los vectores de rhu MAb 2C4, el anticuerpo dirigido contra ErbB2 humanizado, y celulas huesped que comprenden el acido nucleico, y tecnicas recombinantes para la produccion del anticuerpo. Para la produccion recombinante de un anticuerpo, se aisla el acido nucleico que lo codifica y se inserta en un vector que se puede replicar para la posterior clonacion (amplificacion del ADN) o para la expresion. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aisla facilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse especificamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Estan disponibles muchos vectores. Los componentes del vector en general incluyen, pero sin limitar, uno o mas de los siguientes: una secuencia sefal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion.

Componente secuencia sefal

[0138] El rhu MAb 2C4 se puede producir de forma recombinante no solo directamente, sino tambien como polipeptidos de fusion con un polipeptido heterologo, que es preferiblemente una secuencia sefal u otro polipeptido que tiene un sitio de escision especifico en el extremo N de la proteina madura o polipeptido. La secuencia sefal heterologa seleccionada, preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una sefal peptidasa) por la celula huesped. Para las celulas huesped procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia sefal del anticuerpo dirigido contra ErbB2 natural, la secuencia sefal se sustituye por una secuencia sefal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilasa, lpp, o secuencias lider de la enterotoxina II termicamente estables. Para la secrecion de levaduras, la secuencia sefal natural se puede sustituir,

p. ej., por la secuencia lider de invertasa de levadura, secuencia lider de factor (incluyendo secuencias lider de factor

de Saccharomyces y Kluyveromyces), o secuencia lider de fosfatasa acida, la secuencia lider de glucoamilasa de C. albicans, o la sefal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresion en celulas de mamifero, estan disponibles las secuencias sefal de mamiferos asi como las secuencias lider secretoras viricas, por ejemplo, la sefal gD de herpes simplex.

[0139] El ADN para dichas regiones precursoras esta ligado en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo dirigido contra ErbB2.

Componente origen de replicaci�n

[0140] Tanto los vectores de expresion como de clonacion contienen una secuencia de acido nucleico que permite que el vector se replique en una o mas celulas huesped seleccionadas. En general, en los vectores de clonacion esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomico del huesped, e incluye origenes de replicacion o secuencias de replicacion autonoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion del plasmido pBR322 es adecuado para la mayoria de las bacterias Gram negativas, el origen de replicacion del plasmido 2 es adecuado para levaduras, y diferentes origenes viricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son utiles para los vectores de clonacion en celulas de mamifero. En general, el componente origen de replicacion no es necesario para los vectores de expresion de mamiferos (el origen de SV40 se puede usar tipicamente solo porque contiene el promotor temprano.

Componente gen de selecci�n

[0141] Los vectores de expresion y de clonacion pueden contener un gen de seleccion, denominado tambien un marcador seleccionable. Los genes de seleccion tipicos codifican proteinas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles de medios complejos, p. ej., el gen que codifica la Dalanina racemasa para bacilos.

[0142] Un ejemplo de un esquema de seleccion usa un farmaco que detiene el crecimiento de una celula huesped. Estas celulas que son transformadas satisfactoriamente con un gen heterologo, producen una proteina que confiere resistencia a farmacos y por lo tanto sobreviven al regimen de seleccion. Los ejemplos de dicha seleccion dominante usan los farmacos neomicina, acido micofenolico e higromicina.

[0143] Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mamifero, son aquellos que permiten la identificacion de celulas competentes para absorber el acido nucleico del anticuerpo dirigido contra ErbB2, tales como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina I y II, preferiblemente genes de metalotioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

[0144] Por ejemplo, las celulas transformadas con los genes de seleccion de DHFR se identifican primero mediante cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una celula huesped adecuada cuando se usa la DHFR natural es la linea celular de ovario de hamster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR.

[0145] Alternativamente, se pueden seleccionar celulas huesped (en particular, huespedes naturales que contienen DHFR endogena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo dirigido contra ErbB2, la proteina DHFR natural y otro marcador seleccionable tal como la aminoglicosido 3'fosfotransferasa (APH), por crecimiento celular en medio que contiene un agente de seleccion para el marcador seleccionable, tal como un antibiotico aminoglicosidico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418. Vease la patente de EE.UU. n° 4.965.199.

[0146] Un gen de seleccion adecuado para usar es el gen trp1 presente en el plasmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de trp1 en el genoma de la celula huesped de levadura, proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformacion por crecimiento en ausencia de triptofano. Igualmente, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) son complementadas por plasmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

[0147] Ademas, los vectores derivados del plasmido circular de 1,6 m pkD1 se pueden usar para la transformacion de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se ha publicado un sistema de expresion para la produccion a gran escala de quimosina de ternero recombinante por K. lactis. Van den Berg, Bio�Technology, 8:135 (1990). Tambien se han descrito vectores de expresion estables de multiples copias para la secrecion de albumina de suero humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer y col., Bio� Technology, 9:968-975 (1991).

Componente promotor

[0148] Los vectores de expresion y de clonacion normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huesped y esta operativamente unido al acido nucleico del anticuerpo dirigido contra ErbB2. Los promotores adecuados para usar con huespedes procariotas incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp), y promotores hibridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos tambien contendran una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el anticuerpo dirigido contra ErbB2.

[0149] Son conocidas las secuencias promotores para eucariotas. Practicamente todos los genes eucariotas tienen una region rica en AT situada aproximadamente 25 a 30 bases en la direccion 5' desde el sitio en el que se inicia la transcripcion. Otra secuencia que se encuentra 70 a 80 bases en la direccion 5' desde el comienzo de la transcripcion de muchos genes es una region CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleotido. En el extremo 3' de la mayoria de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la sefal para la adicion de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresion eucariotas.

[0150] Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con huespedes levaduras incluyen los promotores para las enzimas 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicoliticas, tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

[0151] Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripcion controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrogeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables del uso de la maltosa y galactosa. Se describen mas vectores y promotores adecuados para usar en la expresion en levaduras en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levaduras tambien se usan ventajosamente con promotores de levaduras.

[0152] La transcripcion del anticuerpo dirigido contra ErbB2 a partir de vectores en celulas huesped de mamifero, es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y mas preferiblemente el virus de simio 40 (SV40), de los promotores de mamifero heterologos, p. ej., el promotor de accion o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque termico, con la condicion de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las celulas huesped.

[0153] Los promotores temprano y tardio del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restriccion de SV40 que contiene tambien el origen de replicacion virico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restriccion HindIII E. Se describe un sistema para expresar el ADN en huespedes mamiferos usando el virus del papiloma bovino como vector, en la patente de EE.UU. n° 4.419.446. Se describe una modificacion de este sistema en la patente de EE.UU. n° 4.601.978. Vease tambien, Reyes y col., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresion de ADNc de -interferon humano en celulas de raton bajo el control de un promotor de timidina quinasa de virus del herpes simple. Alternativamente, se puede usar la repeticion terminal larga del virus del sarcoma de Rous, como promotor.

Componente elemento potenciador

[0154] La transcripcion de un ADN que codifica el anticuerpo dirigido contra ErbB2 de esta invencion por eucariotas superiores, a menudo se aumenta mediante la insercion de una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamiferos (globina, elastasa, albumina, -fetoproteina e insulina). Sin embargo, normalmente se usara un potenciador de un virus de celula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardio del origen de replicacion (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del papiloma en el lado tardio del origen de replicacion, y potenciadores de adenovirus. Vease tambien, Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre los elementos potenciadores para la activacion de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posicion 5' o 3' respecto a la secuencia que codifica el anticuerpo dirigido contra ErbB2, pero preferiblemente esta situado en un sitio 5' respecto al promotor.

Componente de terminaci�n de la transcripci�n

[0155] Los vectores de expresion usados en celulas huesped eucariotas (celulas de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) tambien contendran secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias estan normalmente disponibles de las regiones 5', y ocasionalmente 3', no traducidas, de ADN o ADNc eucariotas o viricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos de poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo dirigido contra ErbB2. Un componente de terminacion de la transcripcion util es la region de poliadenilacion de la hormona del crecimiento bovino. Vease el documento WO94/11026 y el vector de expresion descrito en el mismo.

Selecci�n y transformaci�n de c�lulas hu�sped

[0156] Las celulas huesped adecuadas para la clonacion y expresion del ADN en los vectores en el presente documento, son las celulas procariotas, de levaduras o eucariotas superiores descritas antes. Los procariotas adecuados para este proposito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo enterobacteriaceas tales como Escherichia, p. ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salinonella, p. ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescans, y Shigella, asi como bacilos, tales como B. subtilis y B. licheniformis (p. ej., B. licheniformis 41P descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huesped de clonacion E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537, y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes.

[0157] Ademas de los procariotas, son huespedes adecuados para la clonacion o expresion para vectores que codifican el anticuerpo dirigido contra ErbB2, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panaderia comun, son los usados mas habitualmente entre los microorganismos huespedes eucariotas inferiores. Sin embargo, hay una serie de otros generos, especies y cepas que estan normalmente disponibles y son utiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huespedes Kluyveromyces tales como, p. ej., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, p. ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huespedes Aspergillus tales como

A. nidulans y A. niger.

[0158] Las celulas huesped adecuadas para la expresion del anticuerpo dirigido contra ErbB2 glicosilado se obtienen de organismos multicelulares. Los ejemplos de celulas de invertebrados incluyen celulas de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes celulas de insecto permisivas de huespedes tales como Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruitfly), y Bombyx mori. Esta disponible al publico una variedad de cepas viricas para la transfeccion, p. ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden usar como el virus del presente documento de acuerdo con la presente invencion, en particular para la transfeccion de Spodoptera frugiperda.

[0159] Tambien se pueden usar como huespedes los cultivos de celulas vegetales de algodon, maiz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

[0160] Sin embargo, el mayor interes ha sido el de las celulas de vertebrados, y la propagacion de celulas de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de lineas celulares huespedes de mamifero utiles son la linea de rifon de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linea de rifon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham y col., J. Gen Viral., 36:59 (1977)); celulas de rifon de hamster recien nacido (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. URSA, 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); celulas de rifon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rifon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rifon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de higado de rata Bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de higado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather y col., Annals N.�. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2).

[0161] Las celulas huesped se transforman con los vectores de expresion o de clonacion descritos antes para la produccion del anticuerpo dirigido contra ErbB2, y se cultivan en medio nutriente convencional modificado segun sea adecuado para la induccion de promotores, seleccion de transformantes o amplificacion de genes que codifican las secuencias deseadas.

Cultivo de las c�lulas hu�sped

[0162] Las celulas huesped usadas para producir el anticuerpo dirigido contra ErbB2 de esta invencion se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles en el mercado, tales como medio Ham F10 (Sigma), medio esencial minimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma), son adecuados para el cultivo de celulas huesped. Ademas, se puede usar cualquier de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem., 102:255 (1980), patentes de EE.UU. n° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de EE.UU. Re. 30.985, como medio de cultivo para las celulas huesped. Cualquier de estos medios se puede complementar, segun sea necesario, con hormonas y/o factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidermico), sales (tales como cloruro sodico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleotidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos (tales como el farmaco GENTAMYCIN®), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo de micromolar), y glucosa o una fuente de energia equivalente. Tambien se pueden incluir cualesquiera otros complementos necesarios en las concentraciones adecuadas, que seran conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones, tales como la temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la celulas huesped seleccionadas para la expresion, y seran evidentes para el experto en la materia.

Purificaci�n de un anticuerpo dirigido contra ErbB�

[0163] Cuando se usan tecnicas recombinantes, se pueden producir anticuerpos de forma intracelular, en el espacio periplasmatico, o segregar directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como primera etapa, se separan los restos en particulas, sean celulas huesped o fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugacion o ultrafiltracion. Carter y col., Bio�Technology, 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son segregados al espacio periplasmatico de E. coli. En resumen, se descongela la pasta celular en presencia de acetato sodico (pH 3,5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a lo largo de aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden separar por centrifugacion. Cuando el anticuerpo es segregado al medio, los liquidos sobrenadantes de dichos sistemas de expresion, en general, primero se concentran usando un filtro de concentracion de proteinas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores, para inhibir la proteolisis, y se pueden incluir antibioticos para prevenir el crecimiento de contaminantes inesperados.

[0164] La composicion del anticuerpo preparada a partir de las celulas, se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografia en hidroxilapatito, electroforesis en gel, dialisis, y cromatografia de afinidad, siendo la cromatografia de afinidad la tecnica de purificacion preferida. La idoneidad de la proteina A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que este presente en el anticuerpo. La

los mas frecuente de agarosa, pero estan disponibles otras matrices. Las matrices estables mecanicamente tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales mas rapidos y tiempos de procesamiento mas cortos que lo que se puede lograr con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXT (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es util para la purificacion. Tambien estan disponibles otras tecnicas de purificacion de proteinas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitacion en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia en silice, cromatografia en heparina, cromatografia en SEPHAROSET o una resina de intercambio anionico o cationico (tal como una columna de poli(acido aspartico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitacion con sulfato amonico, dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

[0165] Despues de cualquier etapa o etapas de purificacion preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interes y contaminantes, se puede someter a cromatografia de interaccion hidrofoba de pH bajo usando un tampon de elucion a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente realizada con concentraciones de sal bajas (p. ej., sal en aproximadamente 0-0,025 M).

Formulaciones farmaceuticas

[0166] Las formulaciones terapeuticas del anticuerpo usado de acuerdo con la presente invencion se preparan para el almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehiculos, excipientes

o estabilizantes opcionales farmaceuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol,

A.

Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehiculos, excipientes o estabilizantes aceptables no son toxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones usadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencilico; alquil-parabenes tales como metil o propilparaben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteinas, tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metalicos (p. ej, complejos de Zn-proteina); y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEENT, PLURONICST o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones liofilizadas del anticuerpo dirigido contra ErbB2 preferidas se describen en el documento WO 97/04801.

[0167] La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un compuesto activo, segun sea necesario, para la indicacion particular que se va a tratar, preferiblemente, aquellos con actividades complementarias que no se afectan entre si de forma adversa. Por ejemplo, puede ser conveniente proporcionar ademas anticuerpos que se unen a EGFR, ErbB2 (p. ej., un anticuerpo que se une a un epitopo diferente en ErbB2), ErbB3, ErbB4, o factor endotelial vascular (VEGF) en una formulacion. Alternativamente, o adicionalmente, la composicion puede comprender ademas un agente quimioterapeutico, agente citotoxico, citoquina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal, farmaco dirigido al EGFR, agente antiangiogenico y/o cardioprotector. Dichas moleculas estan presentes adecuadamente en combinacion y en cantidades que son eficaces para el proposito pretendido.

[0168] Los principios activos tambien pueden estar atrapados en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de farmacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980).

[0169] Se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de articulos moldeados, p. ej., peliculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinilico)), polilactidas (patente de EE.UU. n° 3.773.919), copolimeros de acido L-glutamico y L-glutamato de etilo, copolimeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, acido lactico-acido glicolico degradables tales como LUPRON DEPOTT (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida), y poli-(acido D-(-)-3-hidroxibutirico).

[0170] Las formulaciones que se van a usar para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.

Tratamiento con anticuerpos dirigidos contra ErB2

[0171] Se contempla que, segun la presente invencion, el anticuerpo dirigido contra ErbB2, el rhuMab2C4, se usa para el tratamiento, tal como se define en las reivindicaciones.

[0172] Entre los ejemplos de canceres se incluyen, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o tumore linfoides. Ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celula escamosa (por ejemplo, cancer de celula escamosa epitelial), cancer de pulmon que incluyen cancer de pulmon de celula pequefa, cancer de pulmon de celula no pequefa, adenocarcinoma del pulmon y carcinoma escamoso del pulmon, cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago que incluye cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer del cuello de utero, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, carcinoma de endometrio or uterino, carcinoma de glandula salivar, cancer de rifon o renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma penil, asi como cancer de cabeza y cuello. Preferiblemente, el cancer a tratar se identifica como sensible al tratamiento con anticuerpos dirigidos contra ErbB2 en base a la identificacion de heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 o la fosforilacion del receptor ErbB en una muestra de tumor. Un grupo particular de canceres en los que se espera detectar la formacion de heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o la fosforilacion del receptor ErbB incluye, sin limitacion, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de ovario, incluyendo cancer de ovario avanzado, refractario o recurrente, cancer de prostata, cancer colorrectal y cancer pancreatico.

[0173] El cancer, en general, comprendera celulas que expresan ErbB2, de modo que el anticuerpo dirigido contra ErbB2 del presente documento sea capaz de unirse al cancer. Aunque el cancer se puede caracterizar por el exceso de expresion del receptor ErbB2, la presente solicitud proporciona ademas el tratamiento del cancer que no se considera que sea un cancer que expresa en exceso ErbB2. Para determinar la expresion de ErbB2 en el cancer, estan disponibles diferentes ensayos de diagnostico/pronostico. El exceso de expresion de ErbB2 se puede analizar por IHC, p. ej., usando el HERCEPTEST® (Dako). Las secciones de tejido insertadas en parafina de una biopsia de tumor, se pueden someter al ensayo de IHC de acuerdo con un criterio de intensidad de tincion de la proteina ErbB2 como sigue:

Puntuacion 0

No se observa tincion o se observa tincion de las membranas en menos de 10% de las celulas tumorales.

Puntuacion +1

Se detecta una tincion de las membranas debil/poco perceptible en mas de 10% de las celulas tumorales. Las celulas se tifen solo en parte de su membrana.

Puntuacion +2

Se observa una tincion de las membranas completas de debil a moderada en mas de 10% de las celulas tumorales.

Puntuacion +3

Se observa una tincion de las membranas completas de moderada a fuerte en mas de 10% de las celulas tumorales.

Los tumores con puntuaciones 0 o +1 en la evaluacion del exceso de expresion de ErbB2 se pueden caracterizar como que no expresan en exceso ErbB2, mientras que los tumores con puntuaciones 2+ o 3+ se pueden caracterizar como que expresan en exceso ErbB2.

[0174] Alternativamente, o adicionalmente, se pueden llevar a cabo ensayos de FISH tales como INFORMT (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISIONT (Vysis, Illinois) en tejido tumoral insertado en parafina, fijado en formalina, para determinar la extension (si la hay) del exceso de expresion de ErbB2 en el tumor.

[0175] En una realizacion, el cancer sera uno que expresa (y puede, pero no tiene que, expresar en exceso) el EGFR.

[0176] El cancer que se va a tratar en el presente documento, puede ser uno caracterizado por la activacion excesiva de un receptor ErbB, p. ej., EGFR. Dicha activacion excesiva se puede atribuir al exceso de expresion o a la produccion aumentada del receptor ErbB o un ligando de ErbB.

[0177] Se puede llevar a cabo un ensayo de diagnostico o pronostico para determinar si el cancer del paciente se caracteriza por la activacion excesiva de un receptor ErbB. Por ejemplo, se puede determinar la amplificacion del gen de ErbB y/o el exceso de expresion de un receptor ErbB en el cancer. Estan disponibles en la tecnica varios ensayos para determinar dicha amplificacion/exceso de expresion, e incluyen los ensayos IHC, FISH y de antigeno circulante, descritos antes. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden determinar los niveles de un ligando de ErbB, tal como TGF-, en o asociado con el tumor, de acuerdo con procedimientos conocidos. Dichos ensayos pueden detectar la proteina y/o el acido nucleico que la codifica en la muestra que se va a ensayar. Los niveles de ligando de ErbB en el tumor se pueden determinar usando inmunohistoquimica (IHC); vease, por ejemplo, Scher y col., Clin. Cancer Research, 1: 545-550 (1995). Alternativamente, o adicionalmente, se pueden evaluar los niveles del acido nucleico que codifica el ligando de ErbB en la muestra que se va a ensayar; p. ej., por FISH, transferencia southern o tecnicas de PCR.

[0178] Ademas, el exceso de expresion o amplificacion del receptor ErbB o el ligando de ErbB se pueden evaluar usando un ensayo de diagnostico in vivo, p. ej., administrando una molecula (tal como un anticuerpo) que se une a la molecula que se va a detectar y esta marcada con un marcador detectable (p. ej., un isotopo radiactivo) y escaneando externamente al paciente para localizar el marcador.

[0179] Cuando el cancer que se va a tratar es un cancer independiente de hormonas, se puede ensayar la expresion de la hormona (p. ej., androgeno) y/o su receptor cognado en el tumor, usando cualquiera de los diferentes ensayos disponibles, p. ej., como se ha descrito antes. Alternativamente, o adicionalmente, se puede diagnosticar que el paciente tiene un cancer independiente de hormonas que ya no responde a la terapia antiandrogenos.

[0180] Se puede administrar al paciente un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo dirigido contra ErbB2 conjugado con un agente citotoxico. Preferiblemente, el inmunoconjugado y/o la proteina ErbB2 a la que se une son internalizados por la celula, dando como resultado una mayor eficacia terapeutica del inmunoconjugado para matar a la celula cancerigena a la cual esta unido. El agente citotoxico se dirige o interfiere con el acido nucleico en la celula cancerigena. Los ejemplos de dichos agentes citotoxicos incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas.

[0181] El anticuerpo para la administracion es rhuMAb 2C4. RhuMAb 2C4 es un anticuerpo monoclonal humanizado basado en secuencias de la region armazon de la IgG1 humana y consiste en dos cadenas pesadas (449 restos) y dos cadenas ligeras (214 restos). RhuMAb 2C4 difiere significativamente de otro anticuerpo dirigido contra HER2, HERCEPTIN® (Trastuzumab), en las regiones de union al epitopo de la cadena ligera y la cadena pesada. Como resultado, rhuMAb 2C4 se une a un epitopo completamente diferente en HER2. La presente invencion proporciona procedimientos sensibles para identificar canceres que responden al tratamiento con rhuMAb 2C4 o equivalentes funcionales del mismo. Hay que indicar que dichos canceres que responden al tratamiento con rhuMAb 2C4 no es necesario que expresen en exceso HER2.

[0182] El anticuerpo dirigido contra ErbB2 o inmunoconjugados son para la administracion a un paciente humano de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administracion intravenosa, p. ej., en forma de un bolo o por infusion continua a lo largo de un periodo de tiempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o por inhalacion. Se prefiere la administracion del anticuerpo por via intravenosa o subcutanea.

[0183] Se pueden combinar otros regimenes terapeuticos con la administracion del anticuerpo dirigido contra ErbB2. La administracion combinada incluye la coadministracion, usando formulaciones separadas o una sola formulacion farmaceutica, y la administracion consecutiva en cualquier orden, en la que preferiblemente hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultaneamente sus actividades biologicas.

[0184] El paciente se puede tratar con dos anticuerpos dirigidos contra ErbB2 diferentes. Por ejemplo, el paciente se pueden tratar con rhu hAb 2C4 como primer anticuerpo dirigido contra ErbB2, asi como con un segundo anticuerpo dirigido contra ErbB2 que es inhibidor del crecimiento (p. ej., HERCEPTIN®) o un anticuerpo dirigido contra ErbB2 que induce la apoptosis de una celula que expresa en exceso ErbB2 (p. ej., 7C2, 7F3 o las versiones humanizadas de los mismos). Preferiblemente, dicha terapia combinada da como resultado un efecto terapeutico sinergico. Se puede, por ejemplo, tratar al paciente con HERCEPTIN® y despues tratarlo con rhuMAb 2C4, p. ej., cuando el paciente no responde a la terapia con HERCEPTIN®. El paciente se puede tratar primero con rhuMAb 2C4 y despues recibir terapia con HERCEPTIN®. El paciente se puede tratar tanto con rhuMAb 2C4 como con HERCEPTIN® simultaneamente.

[0185] Tambien puede ser conveniente combinar la administracion del anticuerpo dirigido contra ErbB2 con la administracion de un anticuerpo dirigido contra otro antigeno asociado a tumor. En este caso, el otro anticuerpo puede, por ejemplo, unirse a EGFR, ErbB3, ErbB4, o el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

[0186] El tratamiento puede implicar la administracion combinada del anticuerpo dirigido contra ErbB2 y uno o mas agentes quimioterapeuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministracion de cocteles de diferentes agentes quimioterapeuticos. Los agentes quimioterapeuticos preferidos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibioticos de antraciclina. Se pueden usar la preparacion y los esquemas de dosificacion para dichos agentes quimioterapeuticos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o pueden ser determinadas empiricamente por el experto en la materia. La preparacion y los esquemas de dosificacion para dicha quimioterapia se describen tambien en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

[0187] El anticuerpo se puede combinar con un compuesto o antihormonal; p. ej., un compuesto antiestrogenos tal como tamoxifeno; una antiprogesterona tal como onapristona (vease, el documento EP 616812); o un antiandrogeno tal como flutamida, en las dosificaciones conocidas para dichas moleculas. Cuando el cancer que se va a tratar es un cancer independiente de hormonas, el paciente se puede haber sometido previamente a terapia antihormonal, y despues de que el cancer se convierta en independiente de hormonas, se puede administrar al paciente el anticuerpo dirigido contra ErbB2 (y opcionalmente otros agentes como se describe en el presente documento).

[0188] A veces, puede ser beneficioso coadministrar al paciente tambien un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfuncion miocardica asociada con la terapia) o una o mas a citoquinas. Tambien se puede coadministrar un farmaco dirigido al EGFR o un agente antiangiogenico. Ademas de los regimenes terapeuticos anteriores, el paciente se puede someter a eliminacion quirurgica de celulas cancerigenas y/o a terapia de radiacion.

[0189] El anticuerpo dirigido contra ErbB2 del presente documento, tambien se pueden combinar con un farmaco dirigido al EGFR tales como los discutidos antes en la seccion de definiciones, dando como resultado un efecto terapeutico complementario y potencialmente sinergico.

[0190] Los ejemplos de farmacos adicionales que se pueden combinar con el anticuerpo incluyen agentes quimioterapeuticos tales como carboplatino, un taxano (p. ej., paclitaxel o docetaxel), gemcitabina, navelbina, cisplatino, oxaliplatino, o combinaciones de cualquiera de estos tales como carboplatino/docetaxel; otro anticuerpo dirigido contra HER2 (p. ej., un anticuerpo dirigido contra HER2 inhibidor del crecimiento tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo dirigido contra HER2 que induce apoptosis tal como 7C2 o 7F3, incluyendo las variantes maduras de afinidad o humanizadas de los mismos); un inhibidor de la farnesil transferasa; un agente antiangiogenico (p. ej., un anticuerpo dirigido contra VEGF); un farmaco dirigido al EGFR (p. ej., C225 o ZD1839); una citoquina (p. ej., IL-2, IL12, G-CSF o GM-CSF); o combinaciones de los anteriores.

[0191] Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son las que se usan actualmente y se pueden reducir debido a la accion combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo dirigido contra ErbB2, rhuMAb 2C4.

[0192] Para la prevencion o tratamiento de la enfermedad, la dosificacion adecuada del anticuerpo dependera del tipo de enfermedad que se va a tratar, como se ha definido antes, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con proposito preventivo o terapeutico, la terapia previa, la historia clinica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del medico que atiende.

[0193] Las dosis son para la administracion en intervalos de tres semanas (p. ej., de modo que el paciente recibe de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, p. ej., aproximadamente 6 dosis del anticuerpo dirigido contra ErbB2). Se puede administrar una dosis de carga inicial mas alta, seguido de una o mas dosis menores.

[0194] La evolucion de esta terapia se puede seguir facilmente por tecnicas y ensayos convencionales.

[0195] El rhuMAb 2C4 es para la administracion en una dosis fija de 420 mg (equivalente a dosis de 6 mg/kg para un sujeto de 70 kg) cada 3 semanas. El tratamiento puede empezar con una dosis de carga mas alta (p. ej., 840 mg, equivalente a 12 mg/kg de peso corporal) con el fin de lograr concentraciones de estado estacionario en el suero, mas rapidamente. En los siguientes ejemplos tambien se proporcionan regimenes de dosificacion especificos.

Articulos de fabricaci6n

[0196] Tambien se describe un articulo de fabricacion que contiene materiales utiles para el tratamiento de los trastornos descritos antes.

[0197] El articulo de fabricacion comprende un envase y una etiqueta o prospecto en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. El envase contiene una composicion que es eficaz para tratar la afeccion y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de disolucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable mediante una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo en la composicion es un anticuerpo dirigido contra ErbB2. La etiqueta o prospecto indican que la composicion se usa para el tratamiento de la afeccion elegida, tal como el cancer. La etiqueta o prospecto pueden indicar que la composicion que comprende el anticuerpo que se une a ErbB2 se puede usar para tratar a un paciente que padece un tumor, en el que se han identificado la presencia de los complejos HER2/HER1 y/o HER2/HER3 y/o HER2/HER4, y/o se ha detectado la fosforilacion del receptor ErbB. Ademas, el articulo de fabricacion puede comprender (a) un primer envase con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un primer anticuerpo que se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de las celulas cancerigenas que expresan en exceso ErbB2; y (b) un segundo envase con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un segundo anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activacion del

ligando de un receptor ErbB. El articulo de fabricacion puede comprender ademas un prospecto que indica que la primera y la segunda composiciones de anticuerpos se pueden usar para tratar el cancer caracterizado por la presencia de los heterodimeros HER2/HER1 y/o HER2/HER3 y/o HER2/HER4, y/o por la fosforilacion del receptor ErbB. Ademas, el prospecto puede ensefar al usuario de la composicion (que comprende un anticuerpo que se une 5 a ErbB2 y bloquea la activacion del ligando de un receptor ErbB) a combinar la terapia con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la seccion precedente (p. ej., un agente quimioterapeutico, un farmaco dirigido a EGFR, un agente antiangiogenico, un compuesto antihormonal, un cardioprotector y/o una citoquina). Alternativamente, o adicionalmente, el articulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo (o tercer) envase que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, tal como agua bacteriostatica para inyeccion

10 (BWFI), disolucion salina tamponada con fosfato, disolucion de Ringer y disolucion de dextrosa. Puede incluir ademas otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Dep6sito de materiales

[0198] Las siguientes lineas celulares de hibridomas se han depositado en la American Type Culture Collection, 15 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. (ATCC):

Denominaci6n del anticuerpo N� en ATCC Fecha de dep6sito

7C2 ATCC HB-12215 17 de octubre, 1996

7F3 ATCC HB-12216 17 de octubre, 1996

4D5 ATCC CRL 10463 24 de mayo, 1990

2C4 ATCC HB-12697 8 de abril, 1999

[0199] Se ilustran mas detalles de la invencion en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

20 �a asociaci6n de ErbB2 con ErbB3 dependiente de HRG es bloqueada por el anticuerpo monoclonal 2C4

[0200] El anticuerpo monoclonal murino 2C4, que se une especificamente al dominio extracelular de ErbB2 se describe en el documento WO 01/89566.

[0201] Se ensayo la capacidad de ErbB3 para asociarse con ErbB2 en un experimento de inmunoprecipitacion conjunta. Se sembraron 1,0 x 106 celulas MCF7 o SK-BR-3 en 6 placas de cultivo tisular en medio DMEM/Ham F12

25 50:50 que contenia suero de ternero fetal (FBS) al 10% y HEPES 10 mM, pH 7,2 (medio de crecimiento), y se dejo que se unieran durante la noche. Las celulas se privaron de suero durante dos horas en el medio de crecimiento antes de empezar con el experimento.

Las celulas se lavaron brevemente con disolucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con el anticuerpo indicado 100 nM diluido en albumina de suero bovino (BSA) al 0,2% en p/v, medio RPMI, con HERPES

30 10 mM, pH 7,2 (tampon de union) o con tampon de union solo (control). Despues de una hora a temperatura ambiente, se afadio HRG hasta una concentracion final de 5 nM a la mitad de los pocillos (+). Se afadio un volumen similar de tampon de union a los otros pocillos (-). La incubacion se continuo durante aproximadamente 10 minutos.

[0202] Los liquidos sobrenadantes se separaron por aspiracion y las celulas se lisaron en RPMI, HEPES 10 mM, pH 7,2, TRITON X-100 TM al 10% en v/v, CHAPS al 1,0% en p/v (tampon de lisis), que contenia PMSF 0,2 mM,

35 leupeptina 10 g/ml y aprotinina 10 UT/ml. Se elimino el material insoluble en los lisatos por centrifugacion.

[0203] ErB2 se inmnunoprecipito usando un anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente a un gel de afinidad (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Este anticuerpo (Ab-3, Oncogene Sciences, EE.UU.) reconoce un epitopo del dominio

40 ambiente durante 2 horas. Despues los geles se recogieron por centrifugacion. Los geles se lavaron en lotes 3 veces con tampon de lisis para separar el material no unido. Despues se afadio el tampon de muestra SDS y las muestras se calentaron brevemente en un bafo de agua hirviendo.

[0204] Los liquidos sobrenadantes se desarrollaron en geles de poliacrilamida al 4-12% y se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. La presencia de ErbB3 se evaluo examinando las transferencias con un anticuerpo policlonal contra un epitopo del dominio citoplasmatico del mismo (c-17, Santa Cruz Biotech). Las transferencias se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente (ECL, Amersham).

5 [0205] Como se muestra en las bandas de control de las figuras 2A y 2B, para las celulas MCF7 y SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 estaba presente en un inmunoprecipitado de ErbB2 solo cuando las celulas se estimularon con HRG. Si las celulas se incubaban primero con el anticuerpo monoclonal 2C4, se suprimia la sefal de ErbB3 en las celulas MCF7 (Fig. 5A, banda 2C4 +) o se reducia sustancialmente en las celulas SK-BR-3 (Fig. 5B, banda 2C4+). Como se muestra en las figuras 2A-B, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la asociacion de ErbB3 con

10 ErbB2 dependiente de heregulina tanto en las celulas MCF7 como SK-BR-3 de forma sustancialmente mas eficaz que HERCEPTIN®. La preincubacion con HERCEPTIN® disminuyo la sefal de ErbB3 en los lisatos de MCF7 pero tuvo poco efecto o no tuvo efecto en la cantidad de ErbB3 coprecipitada de los lisatos de SK-BR-3. La preincubacion con un anticuerpo contra el receptor EGF (Ab-1, Oncogene Sciences, EE.UU.) no tenia efecto en la capacidad de ErbB3 para inmunoprecipitar conjuntamente con ErbB2 en cualquiera de las lineas celulares.

15 Ejemplo 2

Sensibilidad de la linea celular y de los modelos de �enoinjerto de tumor humano a 2C4

[0206] Se ha ensayado en aproximadamente 40 modelos tumorales la sensibilidad a 2C4. Estos modelos representan los canceres principales tales como de mama, pulmon, prostata y colon. 50-60% de los modelos respondian al tratamiento con 2C4. La siguiente tabla 1 lista modelos tumorales seleccionados en los que se ha 20 ensayado la sensibilidad a 2C4. Brevemente, se trasplantaron fragmentos de xenoinjerto de tumor humano de aproximadamente 3 mm de tamafo bajo la piel de ratones sin pelo atimicos. Alternativamente, se desprendieron celulas tumorales humanas cultivadas in vitro, de las placas de cultivo, se volvieron a suspender en disolucion salina tamponada con fosfato y se inyectaron por via subcutanea en el flanco de los ratones inmunocomprometidos. Se siguio el crecimiento del tumor cada 2 a 3 dias usando un calibrador electrico. Cuando los tumores habian alcanzado 25 un tamafo de aproximadamente 30 a 100 mm, los animales se repartieron aleatoriamente en diferentes grupos de tratamiento y de control. Se administro 2C4 por inyeccion intraperitoneal una vez por semana. Los animales de control recibieron volumenes iguales de disolucion de vehiculo que no contenia anticuerpo con el mismo esquema que los grupos de tratamiento. El estudio se termino despues de aproximadamente 3-6 semanas, cuando los tumores del grupo de control habian alcanzado un tamafo de aproximadamente 1000-1500 mm 3. La sensibilidad al

30 tratamiento se definio como 50% de reduccion del volumen del tumor.

Tabla 1� ™odelos de �enoinjertos

™odelo n�

™odelo tumoral Sensibilidad a 2C4 Referencia

1

LXFA 289 No (Fiebig y col., 1999)

2

LXFA 297 Si

3

LXFA 526 No (Fiebig y col., 1999)

4

LXFA 629 Si (Fiebig y Burger, 2002)

5

LXFA 1041 No

6

LXFE 211 No (Fiebig y col., 1999)

7

LIFE 397 No (Fiebig y col., 1999)

8

LXFL 529 No (Burger y col., 2001)

9

LXFL 1072 Si (Fiebig y col., 1999)

10

Calu-3 Si (Stein y col., 2001)

11

NCI-H522 Si (Yamori y col., 1997)

12

NCI-H322 No (Zou y col., 2001)

(continuacion)

™odelo n�

™odelo tumoral Sensibilidad a 2C4 Referencia

13

NCI-H441(KAM) Si (Gridley y col., 1996)

14

MAXF MX1 No

15

MAXF 401 No (Fiebig y col., 1999)

16

MAXF 449 Si (Burger y col., 2001)

17

MAXF 713 No (Berger y col., 1992)

18

MAXF 857 No (Fiebig y col., 1999)

[0207] Los modelos representan dos tipos de tumores principales, en concreto el cancer de pulmon de celulas no pequefas (CPCNP; modelos n° 1-13) y el cancer de mama (modelos n° 14-18). Nueve de los modelos de CPCNP

5 (n° 1-9) y todos los modelos de cancer de mama se obtuvieron por pases sucesivos in vivo de fragmentos de tumor humano en ratones inmunodeficientes. El resto de los modelos de CPCNP (n° 10-13) son modelos basados en celulas en los que el crecimiento del tumor in vivo se induce por implantacion de celulas propagadas in vitro en ratones inmunocomprometidos.

Berger, D.P., Winterhalter, B. R., y Fiebig, H.H. (1992). Establishment and Characterization of Human Tumor

10 Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice. In Immunodeficient Mice in Oncology, H.H. Fiebig and D.P. Berger, eds. (Basel: Karger), pag. 23-46.

Burger, A.M., Hartung, G., Stehle, G., Sinn, H., y Fiebig, H.H. (2001). Pre-clinical evaluation of a methotrexatealbumin conjugate (MTX-HSA) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Cancer, 92:718-24.

Fiebig, H.H., y Burger, A.M. (2002). Human Tumor Xenografts and Explants. In Tumor Models in Cancer Research, 15 B. A. Teicher, ed. (Totowa, New Jersey: Humana Press), pag. 113-137.

Fiebig, H.H., Dengler, W.A., y Roth, T. (1999). Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents. In Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, H.H. Fiebig and A.M. Burger, eds. (Basel: Karger), pag. 29-50.

Gridley, D.S., Andres, M.L., Garner, C., Mao, X.W., y Slater, J.M. (1996). Evaluation of TNF-alpha effects on radiation 20 efficacy in a human lung adenocarcinoma model. Oncol Res., 8:485-95.

Stein, R., Govindan, S.V., Chen, S., Reed, L., Spiegelman, H., Griffiths, G.L., Hansen, H.J., y Goldenberg, D.M. (2001). Successful therapy of a human lung cancer xenograft using MAb RS7 labeled with residualizing radioiodine. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 39:173-80.

Yamori, T., Sato, S., Chikazawa, H., y Kadota, T. (1997). Anti-tumor efficacy of paclitaxel against human lung cancer 25 xenografts. Jpn. J. Cancer Res., 88:1205-10.

Zou, Y., Wu, Q.P., Tansey, W., Chow, D., Hung, M.C., Charnsangavej, C., Wallace, S., y Li, C. (2001). Effectiveness of water soluble poly(L-glutamic acid)-camptothecin conjugate against resistant human lung cancer xenografted in nude mice. Int. J. Oncol., 18:331-6.

30 Ejemplo 3

Detecci6n de heterodimeros en tumores sensibles a 2C4 por inmunoprecipitaci6n

[0208] Tumores sensibles y no sensibles a 2C4 se sometieron a inmunoprecipitacion con anticuerpos dirigidos contra ErbB2 para ensayar la presencia de los heterodimeros ErbB2-ErbB3 y EGFR-ErbB2. Salvo que se indique lo contrario, los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con Maniatis T. y col., Molecular Cloning: A Laboratory

35 Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

[0209] Se seleccionaron anticuerpos dirigidos contra HER2, contra HER3 y contra HER1 que no tuvieran reacciones cruzadas. Para determinar si los anticuerpos tenian reacciones cruzadas, los receptores HER1, HER2, HER3 y HER4 se expresaron en celulas 293 de rifon embrionario humano (HEK). Las celulas se lisaron usando un tampon HEPES que contenia TritonT X100 (1% en peso/volumen) (pH 7,5). Aproximadamente 20 g de proteina celular total de las celulas de control y las celulas que expresaban HER1, HER2, HER3 y HER4, se separaron en un gel de SDS y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa por un procedimiento de transferencia semiseca. Despues de bloquear con gelatina, se ensayo en una variedad de anticuerpos dirigidos contra HER1, contra HER2 y contra HER3 su reactividad cruzada contra otros receptores ErbB. Los anticuerpos seleccionados para usar en los experimentos descritos a continuacion no presentaban ninguna reactividad cruzada significativa.

[0210] Las muestras de tumores recientes se trituraron mecanicamente en hielo y se lisaron en un tampon que contenia HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl 2 1,5 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10% (p/v), TritonT X-100 al 1% (p/v), PMSF 1 mM, aprotinina 10 g/ml y ortovanadato 0,4 mM. Los tumores completamente lisados se centrifugaron varias veces hasta que los liquidos sobrenadantes eran completamente transparentes. La inmunoprecipitacion se produjo combinando lisatos tumorales clarificados (5-7 mg de proteinas por lisato), 5 g de anticuerpos dirigido contra ErbB2 (ab-3, monoclonal de raton; Cat. n° OP15, Oncogene Inc., EE.UU.) y 50 l de agarosa acoplada a proteina G en tubos de reaccion Eppendorf de 1,5 ml. Despues de la adicion de un volumen de una a dos veces, de tampon HEPES 50 mM, pH 7,5 que contenia TritonT X-100 al 0,1% (p/v) los tubos se rotaron durante 3-4 horas a 4�C seguido de centrifugacion. Los sedimentos se lavaron de 2 a 3 veces con 500 l de tampon HEPES 50 mM pH 7,5 que contenia TritonT X-100 al 0,1% (p/v). Se afadio un volumen igual de tampon de muestra L�mmli 2x al inmunoprecipitado lavado y las muestras se calentaron durante 5 min a 95�C. Las muestras se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La presencia de los heterodimeros EGFR-ErbB2 y ErbB2-ErbB3 se evaluo examinando las transferencias con anticuerpos contra EGFR (anticuerpo policlonal de conejo contra EGFR, Upstate Inc., EE.UU.; Cat. n° 06-847) y ErbB3 (anticuerpo policlonal contra ErbB3; Santa Cruz Inc., EE.UU.; Cat. n° SC-285). Se uso un anticuerpo dirigido contra Fc de conejo marcado con peroxidasa (POD) (BioRad Laboratories Inc. EE.UU.) como anticuerpo secundario. Las transferencias se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente (ECL plus, Amersham).

[0211] La figura 3 muestra los resultados de estos experimentos. Se puede ver la presencia de los heterodimeros ErbB2-ErbB3 y/o EGFR-ErbB2. Se observo una correlacion entre la sensibilidad a 2C4, como se muestra en la tabla 1, y la presencia de los heterodimeros ErbB2-ErbB3 y/o EGFR-ErbB2.

Ejemplo 4

Correlaci6n de la sensibilidad a rhu™Ab 2C4 con la fosforilaci6n de HER2

[0212] Se ha estudiado el efecto de rhuMAb 2C4 en 14 tumores humanos explantados en ratones (9 canceres de pulmon y 5 canceres de mama). La explantacion del tumor y el tratamiento se llevaron a cabo como se ha descrito en el ejemplo 2. Se detectaron los heterodimeros de HER2 como se ha descrito en el ejemplo 3.

[0213] La fosforilacion de HER2 se evaluo por inmunoprecipitacion de HER2 y analisis por transferencia Western. Se determino que era positiva por la presencia de la banda de fosfo-HER2 del gel. Se determino que era negativa por la ausencia de la banda. La fosforilacion de HER2 se confirmo por inmunohistoquimica usando un anticuerpo dirigido contra HER2 fosfoespecifico (clone PN2A, Thor y col., J. Clin. Oncol., 18:3230-9 (2000).

[0214] En 5 de los tumores ensayados (3 de pulmon y 2 de mama), se observo una inhibicion significativa del crecimiento tumoral, que se correlacionaba con la presencia de heterodimeros detectables de HER2 con HER1 o HER3, y con una fosforilacion fuerte de HER2 en todos los casos. En 9 tumores en los que no se observo una respuesta significativa al tratamiento con rhuMAb 2C4, no se detectaron heterodimeros y no habia fosforilacion de HER2. La presencia de heterodimerizacion de HER2 o fosforilacion significativa de HER2 es una prediccion buena de la respuesta al tratamiento con rhuMAb 2C4 en modelos no clinicos. Se han hecho observaciones similares con xenoinjertos generados a partir de lineas de celulas tumorales.

Ejemplo 5

Detecci6n de la fosforilaci6n de HER2 en tumores sensibles a 2C4

[0215] La eficacia de rhuMAb 2C4 se evaluo en 9 modelos tumorales xenotrasplantados de carcinomas de pulmon de celulas no pequefas (CPCNP) establecidos (LXFE 211, LXFA 289, LXFA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFL 529, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Freiburg, Alemania). Los xenoinjertos de tumores humanos se han considerado los modelos mas importantes para el desarrollo de farmacos anticancerigenos puesto que los tumores de los pacientes crecen como un tumor solido, desarrollan un estroma, vasculatura, una necrosis central y presentan diferenciacion. Ademas, los modelos de tumores xenotrasplantados se parecen mucho a los tumores originales en la histologia y quimiosensibilidad.

[0216] La inhibicion del crecimiento se evaluo como se ha descrito en el ejemplo 2. La actividad inhibidora del crecimiento significativa se definio como �50% de inhibicion del crecimiento del grupo de tratamiento con respecto al grupo de control. En 3 de los modelos de CPCNP (LXFA 297, LXFA 629, y LXFL 1072), se observo una respuesta inhibidora del crecimiento significativa al tratamiento con rhuMAb 2C4. Tambien se han investigado varias caracteristicas de HER2 activado por ligando a nivel de la proteina. Como se muestra en la figura 4, HER2 puede inmunoprecipitar de extractos tumorales de 8 de los 9 tumores de CPCNP. Para determinar el estado de activacion de HER2, estas transferencias despues se examinaron con anticuerpo dirigido contra fosfotirosina (anti-PY). Como se muestra en el panel inferior de la figura 4, los 3 tumores sensibles (LXFA 297, LXFA 629 y 1072) presentaron una fuerte activacion de HER2.

Ejemplo 6

Estudio clinico para identificar los pacientes con c�ncer de pulm6n para el tratamiento con rhu™Ab 2C4 por la detecci6n de heterodimeros de HER2

[0217] Se identifica que un paciente tiene cancer de pulmon de celulas no pequefas (CPCNP) que es sensible al tratamiento con rhuMAb 2C4, si se encuentra que un tumor del paciente comprende complejos de HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4.

[0218] Se obtiene una muestra del tumor por biopsia o durante la extirpacion quirurgica del tumor. Despues, se analiza en la muestra la presencia de los heterodimeros HER2/HER3 y/o HER2/HER1 y/o HER2/HER4.

[0219] Las celulas tumorales o los lisatos celulares se ponen en contacto con un eTagTM que se une especificamente a HER2. El eTagTM comprende un resto detectable y un primer resto de union que es especifico para HER2. El resto detectable esta unido al primer resto de union con un conector escindible. Despues de dejar tiempo para la union, se elimina el exceso de eTagTM.

[0220] Las celulas tumorales o los lisatos celulares se ponen en contacto con un segundo compuesto de union que se une especificamente a HER1 o HER3 o HER4. El compuesto no unido se elimina mediante lavado. Despues se activa el segundo compuesto de union. Si el primer compuesto de union y el segundo compuesto de union estan muy proximos, el segundo compuesto de union activado escinde el conector escindible en el eTagTM para producir un resto detectable libre. La identificacion del resto detectable libre en la muestra indica que el tumor comprende heterodimeros HER2/HER1 y/o HER2/HER3 y/o HER2/HER4.

[0221] Tras determinar que el paciente padece un tumor que comprende heterodimeros HER2/HER1 y/o HER2/HER3 y/o HER2/HER4, se administra rhuMAb 2C4 por via intravenosa (IV) cada semana o cada 3 semanas, con 2 o 4 mg/kg, respectivamente, hasta la evolucion de la enfermedad. El anticuerpo se suministra como una formulacion liquida de multiples dosis (20 ml de carga con una concentracion de 20 mg/ml o concentracion superior). Los criterios de valoracion principales de la eficacia incluyen la tasa de respuesta y la seguridad. Los criterios de valoracion secundarios de la eficacia incluyen: supervivencia general, tiempo de evolucion de la enfermedad, calidad de vida y/o duracion de la respuesta.

Ejemplo 7

Estudio clinico para identificar pacientes con c�ncer para el tratamiento con rhu™Ab 2C4

[0222] Se obtiene una muestra biologica que comprende celulas cancerigenas de candidatos para el tratamiento,

p. ej., por biopsia del tejido tumoral, aspiracion de celulas tumorales del liquido ascitico, o por cualquier otro procedimiento conocido en la practica clinica. Se analizara en la muestra biologica la fosforilacion de HER2, p. ej., por inmunoprecipitacion y analisis de transferencia Western, y/o la presencia de los heterodimeros HER2/HER3, HER2/HER1 y/o HER2/HER4 por cualquiera de las tecnicas descritas antes. Los sujetos cuya muestra biologica era positiva para la fosforilacion de HER2 y/o la presencia de heterodimeros HER2/HER3, HER2/HER1 y/o HER2/HER4, es probable que muestren una mejor respuesta al tratamiento con rhuMAb 2C4 que los pacientes cuya muestra tumoral no presento fosforilacion de HER2 o en la que no se detectaron heterodimeros.

[0223] Por ejemplo, los sujetos a los que se diagnostico cancer de ovario se someteran a biopsia del tejido tumoral

o aspiracion de las celulas tumorales del liquido ascitico. Se analizara en este tejido la fosforilacion de HER2 por inmunoprecipitacion y analisis de transferencia Western. Esto requerira un minimo de aproximadamente 250 mg de tejido tumoral.

[0224] Tras determinar que el paciente padece un cancer (tal como, cancer de prostata resistente a la castracion -CPRC, o cancer de ovario) que es positivo para la fosforilacion de HER2, el paciente recibira una dosis de carga de 840 mg de rhuMAb 2C4 el dia 1 del ciclo 1 (primer periodo de tratamiento de 21 dias), seguido de 420 mg el dia 1 de cada ciclo posterior de 21 dias, en forma de infusion intravenosa continua. El tratamiento continua por infusion intravenosa cada 3 semanas durante un afo (17 ciclos), para los pacientes que no muestran pruebas de evolucion de la enfermedad. El tratamiento se puede interrumpir en cualquier momento anterior, por la falta de respuesta, efectos adversos, u otras razones, segun el criterio del medico.

LISTA DE SECUENCIAS

[0225]

�110� Genentech, Inc. Koll, Hans Bossenmaier, Birgit Muller, Hans-Joachim Sliwkowski, Mark Kelsey, Stephen �120� Procedimientos para identificar tumores que son sensibles al tratamiento con anticuerpos dirigidos contra

ErbB2 �130� 39766-0114PC �150� US 60/396.290 �151� 2002-07-15 �150� US 60/480.043 �151� 2003-06-20 �160� 6 �170� FastSEQ para windows version 4.0 �210� 1 �211� 107 �212� PRT �213� Homosapiens �400� 1 �210� 2

�211� 119

�212� PRT

�213� Homosapiens 5 �400� 2

�210� 3 �211� 107 �212� PRT

10 �213� Homosapiens �400� 3

�210� 4 �211� 119 15 �212� PRT �213� Homosapiens

�400� 4

�210� 5 �211� 107

5 �212� PRT �213� Homosapiens �400� 5

10 �210� 6 �211� 119 �212� PRT �213� Homosapiens �400� 6

Claims (2)

1. REIVINDICACIoNES

   1. Anticuerpo monoclonal humanizado recombinante 2C4 (rhuMAb 2C4) para usar en un procedimiento para el tratamiento del cancer en un paciente, en el que en el procedimiento el rhuMAb 2C4 se administra como una dosis fija de 420 mg cada 3 semanas, y en el que el rhuMAb 2C4 comprende las secuencias de aminoacidos de las

   5 cadenas ligera variable y pesada variable de SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, y las secuencias de las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada de la IgG1 humana (alotipo no A).
2. 2. RhuMAb 2C4 para usar, de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el procedimiento para el tratamiento con rhuMAb 2C4 empieza con una dosis de carga de 840 mg.