ES2637411T3 - Métodos y ensayos para medir p95 Y/O p95 en una muestra y anticuerpos específicos para p95 - Google Patents

Métodos y ensayos para medir p95 Y/O p95 en una muestra y anticuerpos específicos para p95 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado, o fragmentos de anticuerpos, que se unen específicamente al dominio extracelular de p95 pero no a Her-2 de longitud completa, donde el anticuerpo se une específicamente al péptido que tiene la SEC. ID. N. º 5.

Description

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positividad determinada por inmunoblot obtenido de la Figura 7b se indica mediante una flecha en el eje y en la Figura 9b.
Por lo general, una señal de p95 más alta es más probable que esté asociada con una señal de H2T alta en ambas cohortes.
Una amplia cohorte de pacientes tratados con trastuzumab cuyos tumores habían sido testados previamente para H2T fueron investigados para determinar si existía alguna correlación entre los malos resultados y las muestras en el rango de HER2 elevado teóricamente enriquecido para p95. Esta cohorte se obtuvo del grupo de estudio Serum Her2/neu Study Group (ISHSG) y se conoce como cohorte Lipton. Estos pacientes fueron seleccionados inicialmente mediante IHC realizada en un establecimiento central (la Universidad de Viena, Austria) por un único patólogo. El 90% de los pacientes eran IHC3+, y 80/92 recibieron trastuzumab en combinación con quimioterapia, mientras que 12 recibieron trastuzumab como único fármaco. 88/92 padecían cáncer de mama metastásico y podrían haber recibido trastuzumab como terapia de primera, segunda o tercera línea. Para el rango de HER2 alto, se estableció un valor límite de logio(H2T) > 1,95, justo por encima de la muestra p95-negativa más alta (el límite se muestra en la Figura 9a). Por encima de este límite de H2T, los tumores se podrían describir como p95-enriquecidos, mientras que por debajo del límite serían p95-equívocos. Entre los pacientes confirmados como HER2-FISHpositivos, los del grupo p95-enriquecidos presentaban un tiempo hasta la progresión notablemente más corto (mostrado en la Figura 9c) y una supervivencia global (mostrada en la Figura 9d) significativamente menor que los del grupo de tumores p95-equívocos.
La Figura 10 muestra la inmunohistoquímica (IHC) colorimétrica de líneas celulares FFPE y muestras de tumores positivas o negativas para p95. En la Figura 10a, se muestran los datos del ensayo (panel superior) de los niveles de p95 (expresados en RPA*uL/sqcm) y los datos de la IHC (panel inferior) de las líneas celulares FFPE sometidas a una sonda con D9.1. Las líneas celulares mostradas son MCF7, MCF7 transfectadas con p95 o Her2 de longitud completa, SKBR3 y SKBR3 transfectadas con CTF, el fragmento C-terminal de HER2 que se encuentran tanto en el núcleo como en el citoplasma. Se sabe que MCF7 expresa bajos niveles de Her2, mientras que la línea de células madre SKBR3 se sabe que expresa altas cantidades de HER2 de longitud total y bajos niveles de p95. Las células MCF7 y SKBR3 teñidas con D9.1 muestran escasa tinción, coherente con el bajo nivel de p95. Las células MCF7-p95 teñidas con D9.1 muestran tinción localizada principalmente en la membrana celular, coherente con la ubicación del p95.
El anticuerpo del isotipo de control IgG2a no mostró ninguna tinción en la membrana celular, lo que demuestra la especificidad del anticuerpo D9 (datos no mostrados). Los resultados de la IHC son coherentes con los resultados observados utilizando el ensayo VeraTag.
La Figura 10b muestra los datos tanto del ensayo como de la IHC para las muestras tumorales FFPE. En el panel izquierdo, los datos del ensayo de p95 se muestran para tres muestras tumorales (n.º 5, 6 y 12), así como dos líneas celulares (MCF7 y MCF7 transfectadas con p95). Las unidades para los niveles de p95 se expresan como RPA*uL/sqcm. En el panel derecho, los datos de la IHC se muestran para las muestras FFPE sometidas a una sonda con D9.1, un anticuerpo específico para p95 (paneles superiores)
o CB11, un anticuerpo dirigido al dominio intracelular de HER2 (paneles inferiores). Los tres tumores muestran tinción con el anticuerpo CB11, coherente con la presencia de HER2 de longitud completa, mientras que solamente el tumor 5, para el que tanto el inmunoblot como el ensayo VeraTag demostraron que era p95-positivo, se tiñe con D9.1. Estos datos sugieren también que el epítopo reconocido por el anticuerpo D9.1 se encuentra en formas naturalmente presentes de p95 en el tejido del cáncer de mama.
La Figura 11 muestra los resultados de estudios de cuantificación de p95 utilizando anticuerpos anti-p95 etiquetados directamente con etiquetas moleculares. El experimento se realizó como se explica en la Figura 5, salvo por el hecho de que los anticuerpos fueron etiquetados directamente con etiquetas moleculares en lugar de utilizando un anticuerpo anti-murino secundario. Los anticuerpos monoclonales purificados utilizados en estos estudios fueron D4.1, D8.2, D9.1 y D12.1 como se muestra en el eje x; el eje y recoge el área relativa pico multiplicada por µl/cm2, tal y como se recoge en el Ejemplo 4. El anticuerpo anti-HER2 Ab8 se utilizó como control positivo. Las líneas celulares testadas fueron, de arriba a abajo en la leyenda y de izquierda a derecha en el gráfico de barras, MCF-7, MCF-7-CTF, MCF-7-her2, MCF-7-p95, SKBR3 y SKBR3-CTF. Los resultados mostrados son muy similares a los que se observan en la Figura 6, salvo por una reducción del rango dinámico entre las líneas celulares que expresan altos niveles de p95 (MCF-7-CTF, MCF-7-p95 y SKBR3-CTF) y las líneas celulares que expresan bajos niveles de p95 (MCF-7, MCF-7-Her2 y SKBR3).
La Figura 12 muestra dos conjuntos de resultados utilizando el anticuerpo D9.1 para medir los niveles de p95 en parámetros de líneas celulares y tumores, de izquierda a derecha, respectivamente. En las Figuras 12a y 12b, D9.1 se etiqueta con VeraTag para cuantificar p95 en parámetros de líneas celulares (Figura 12a) y muestras tumorales de la Cohorte A (Figura 12b) utilizando un ensayo de un único anticuerpo. Los parámetros de líneas celulares testados son, de izquierda a derecha en el eje x mostrado en la Figura 12a, 12a, MCF-7, MCF-7-p95, MCF-7-CTF, MCF-7-HER2, SKBR3, SKBR3-CTF y MDA-MB-453. El eje x muestra los niveles de p95 en área relativa pico multiplicada por µl/cm2, tal y como se expone en el Ejemplo 4. En la Figura 12b, los resultados del ensayo de un único anticuerpo se muestran para las muestras tumorales de la Cohorte A, que han sido clasificadas como p95-positivas o p95-negativas en
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función de los datos del inmunoblot. El eje x muestra las líneas celulares p95-positivas o negativas; el eje y muestra los niveles de p95 en área relativa pico multiplicada por µl/cm2.
Las Figuras 12c y 12d muestran los mismos parámetros de líneas celulares y muestras de tumores utilizando un sistema de ensayo de dos anticuerpos en el que tanto D9.1, que es específico para p95, como Ab8, que es específico para el dominio intracelular de HER2, se utilizan para detectar p95. El anticuerpo Ab8 está etiquetado con biotina; el anticuerpo D9.1 tiene un VeraTag clivable, lo que permite un ensayo de proximidad en el que la presencia de los dos anticuerpos dentro de la distancia efectiva de la misma molécula de p95 causa la liberación del fluoróforo del VeraTag. Como muestran los datos, la separación de subgrupos p95-negativos y p95-positivos se mantiene con esta forma de ensayo. El eje x muestra las líneas celulares p95-positivas o negativas; el eje y muestra los niveles de p95 en área relativa pico multiplicada por µl/cm2.
La Figura 13 muestra la inhibición del crecimiento de la línea celular del cáncer de mama SKBR3 y BT474 utilizando anticuerpos anti-p95 en comparación con 4D5, la versión murina de trastuzumab. Varios anticuerpos monoclonales generados con ratones a los que se les administró el péptido D de p95 se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento en células SKBR3 y BT474, de las que se sabe que expresan elevados niveles de HER2. Se utilizó 4D5 como control positivo. Se utilizó un anticuerpo (A3) con un péptido no relacionado como control negativo. Los tres paneles superiores muestran los resultados para las células SKBR3; los tres paneles inferiores muestran los resultados para las células BT474. El eje x muestra la concentración de anticuerpos; el eje y muestra la diferencia de absorbancia a 492nM y 690nM. En este experimento, se cultivaron las células durante tres días en presencia de un anticuerpo y, a continuación, se valoró el crecimiento utilizando el ensayo XTT. Los resultados sugieren que D3.4 y D4.1 inhiben el crecimiento de las células SKBR3 pero no de las células BT474.
La Figura 14 muestra el gráfico del patrón del efecto del tratamiento en la subpoblación (STEPP) generado para examinar la tasa de supervivencia libre de progresión (PFS) 12 meses después del tratamiento con trastuzumab en toda la distribución de H2T. Se ordenaron grupos de 30 pacientes de menor a mayor por H2T. Se observó una tendencia de probabilidad creciente de mantenerse libre de progresión tras 12 meses a mayor H2T. Sin embargo, a los niveles de H2T más elevados se observó una pronunciada caída en la tasa de PFS, coherente con una reducción de la sensibilidad al trastuzumab.
La Figura 15 muestra un análisis de Kaplan-Meier (KM) que compara la PFS pacientes FISH(-), H2T bajo (log10H2T < 1,25) con la de pacientes FISH(+), H2T alto (Log10H2T > 1,95 y la de pacientes FISH(+), H2T intermedio (1,25 < log10H2T < 1,95). Los límites se identificaron por el valor p más bajo en un análisis de escaneo posicional. Los análisis KM demostraron que los pacientes que eran FISH(+), H2T intermedio tenían una PFS notablemente más prolongada que los pacientes FISH(-), H2T bajo (media de PFS de 12,6 frente a 4,5 meses; ratio de riesgo (HR) = 0,34; p< 0,0001). Los pacientes FISH(+), H2T alto presentaban una PFS no mejor que los pacientes FISH(-), H2T bajo (media de PFS de 4,6 frente a 4,5 meses; HR = 0,7; p = 0,68).
La Figura 16 muestra la discriminación de poblaciones de pacientes por H2T y p95 (N=90).
Los análisis anteriores de esta cohorte utilizando medidas VeraTag de la expresión de la proteína de HER2 (H2T) identificaron un subgrupo de H2T alto con un TTP más prolongado que el subgrupo de H2T bajo. Se identificó un límite para p95 por el valor p más bajo en un análisis de escaneo posicional.
Esta Figura muestra los análisis de Kaplan-Meier (KM) que comparan el % libre de progresión (TTP) de pacientes con H2T bajo (log10H2T < 1,25) con pacientes con H2T alto (Log10H2T > 1,25 o lineal >13,8) y p95 bajo (loglOH2T <90) con pacientes con H2T alto (LoglOH2T > 1.25) y p95 alto (loglOH2T >90).
Los análisis KM demostraron que los pacientes con H2T bajo tenían una media de TTP significativamente menor (en respuesta al trastuzumab) que los pacientes con H2T alto, bajo 95 (media de TTP de 4,4 frente a 11,7; ratio de riesgo (HR) = 2,4; p=0,0003). Los pacientes con H2T alto, p95 alto también presentaban una media de TTP notablemente menor en comparación con los pacientes con H2T alto/p95 bajo (media de TTP 7,2 frente a 11,7 meses; ratio de riesgo (HR)=1,9, p=0,017). Unos resultados similares se observaron para la supervivencia global, donde los análisis KM para la OS demostraron que los pacientes con H2T bajo tenían una media de OS significativamente menor (en respuesta al trastuzumab) que los pacientes con H2T alto, bajo 95 (media de OS de 29 frente a 48 meses; ratio de riesgo (HR) = 1,9; p=0,042). Los pacientes con H2T alto, p95 alto también presentaban una media de OS notablemente menor en comparación con los pacientes con H2T alto/p95 bajo (media de OS de meses frente a 48 meses; ratio de riesgo (HR)=2,3, p=0,0095).
La Figura 17 muestra análisis de Kaplan-Meier (KM) que comparan el porcentaje libre de progresión (tiempo hasta la progresión, TTP) de varios subgrupos de la cohorte Lipton, definido por mediciones VeraTag del HER2 total (H2T alto o bajo) y p95HER2 (p95 alto o bajo). Los límites se identificaron por el valor p más bajo en un análisis de screening posicional. H2T alto = (log10H2T > 1,25 o en una escala lineal >13,8). Bajo H2T = log10H2T <= 1,25 o en una escala lineal, <=13,8. p95 bajo = p95<=90 y p95 alto = p95>90 (en una escala lineal).
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Los análisis KM demostraron que los pacientes FISH-positivos, K2T alto y p95 bajo (línea verde) presentaban una media (notablemente) superior de TTP que los pacientes FISH-negativos, H2T bajo (línea roja). Los pacientes FISH-positivos, H2T bajo (línea azul) presentaban una PFS superponible (es decir, no mejor) que los pacientes FISH-negativos, H2T bajo (línea roja). Por otra parte, los pacientes FISH-positivos, H2T alto y p95 bajo (línea naranja) presentaban también una PFS prácticamente superponible con la de otros dos grupos menos favorecidos indicados por las líneas roja y azul (FISHnegativos, H2T bajo y FISH-positivos, H2T bajo, respectivamente). El grupo con los mejores resultados en este estudio fue el grupo verde, que fueron FISH-positivos, H2T alto y p95 bajo.
Descripción detallada de la invención
"Anticuerpo" significa una inmunoglobulina que se une, y por tanto se define como complementaria a, una organización espacial y polar concreta de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o recombinante, y se puede preparar mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como inmunización de un huésped y recogida de suero (policlonal) o mediante la preparación de líneas celulares híbridas continuas y la recogida de la proteína secretada (monoclonal), o bien clonando y expresando secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de estas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos necesarias para la unión. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de esta, y las inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, Íd., IgE, IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de estas pueden incluir Fab, Fv, y F(ab’)2, Fab’ y similares. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o cualquier otro derivado de anticuerpo conocido por un experto en la técnica que conserve la actividad de unión específica para un sitio de unión concreto. Por otra parte, se pueden utilizar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando proceda, siempre que se mantenga la afinidad de unión para un sitio de unión concreto. Se pueden encontrar orientaciones para la producción y selección de anticuerpos y derivados de anticuerpos para su uso en inmunoensayos, incluyendo aquellos ensayos que emplean etiquetas moleculares liberables (como se describe más abajo) en textos y manuales disponibles, tales como Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Howard y Bethell, 2001, Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press; Wild, ed., 1994, The Immunoassay Handbook, Stockton Press, Nueva York.
"Compuesto de unión" se refiere a una molécula capaz de unirse a otra molécula de interés. Un compuesto de unión puede ser un anticuerpo, un péptido, un ligando peptídico o no peptídico para un receptor de la superficie celular, una proteína, un oligonucleótido, un análogo de oligonucleótido, como un ácido nucleico peptídico, una lectina, o cualquier otra entidad molecular que sea capaz de unirse de forma específica a una molécula o complejo diana. En una realización, la molécula diana es una proteína o complejo proteico. En otra realización, un compuesto de unión comprende asimismo una sonda de proximidad. En una realización, un compuesto de unión comprende una o más etiquetas moleculares unidas a una fracción de unión. En otra realización, se puede unir un segundo compuesto de unión al compuesto de unión y medirse y cuantificarse como correlativo de la presencia del compuesto de unión, que está unido a la proteína diana.
En otro ejemplo específico, el primer o el segundo compuesto de unión puede generar una molécula que actúa conjuntamente con una sonda de proximidad dentro de una proximidad efectiva, produciendo una señal que está correlacionada con la presencia de la proteína diana. Por otra parte, en otra realización, los compuestos de unión pueden tener etiquetas moleculares que interactúan entre sí dentro de una proximidad efectiva para formar un complejo que genera una señal o se pueden detectar y medir de una manera que está correlacionada con la presencia de la proteína diana. Más concretamente, la proteína o el complejo diana puede ser p95 o un complejo de p95.
"Fracción de unión" significa cualquier molécula a la que se pueden unir, de forma directa o indirecta, etiquetas moleculares y que es capaz de unirse a un analito. Las fracciones de unión incluyen, entre otros, anticuerpos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y moléculas orgánicas de un peso molecular de hasta 1000 Daltons y que contienen átomos seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo. Preferiblemente, las fracciones de unión son anticuerpos.
"Líneas celulares" se refiere a células que han sido separadas de su tejido original, que se han multiplicado por clonación y/o mantenido en un cultivo. Como ejemplos específicos, se pueden obtener líneas celulares de cada tipo de cáncer y se pueden obtener múltiples líneas celulares diferentes de muestras del mismo tipo de cáncer. Entre los ejemplos de diferentes tipos de líneas celulares se incluyen, por ejemplo, líneas celulares del cáncer de mama, como MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, T-47D y ZR-75
1.
"Agente quimioterapéutico" significa una sustancia química que se emplea para tratar una patología, en particular un cáncer.
Un "ligamiento clivable", a efectos del presente, se refiere a un grupo de unión química que puede ser clivado para liberar una etiqueta molecular detectable conectada a una fracción de unión con el ligamiento clivable.
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Una "fracción inductora del clivaje" o "agente de clivaje", a efectos del presente, es un grupo que produce una especie activa que es capaz de clivar un ligamiento clivable. Preferiblemente, la especie activa es una especie química que muestra una actividad efímera, por lo que los efectos inductores del clivaje se producen únicamente en las proximidades del sitio en el que se genera.
Una "sonda de clivaje", a efectos del presente, se refiere a un reactivo que comprende una fracción inductora del clivaje, tal como se define aquí, y un compuesto de unión como un anticuerpo, un péptido, un ligando peptídico o no peptídico para un receptor de la superficie celular, una proteína, como estreptavidina, una molécula pequeña, como biotina, un oligonucleótido, un análogo de oligonucleótido, como un ácido nucleico peptídico, una lectina o cualquier otra entidad molecular capaz de unirse a una molécula o proteína diana o a un complejo molecular estable.
"Proximidad efectiva", a efectos del presente, describe la distancia entre dos compuestos de unión que es suficiente para generar una señal detectable, indicando la presencia de la molécula diana. Por ejemplo, una sonda de proximidad y un compuesto de unión que se encuentran unidos en p95 (o con otro analito de interés) dentro de una proximidad efectiva generarán una señal detectable, indicando y/o cuantificando la presencia de p95 y/o de un complejo de p95. Preferiblemente, el rango de proximidad efectiva para muchos sistemas de detección es inferior a 400 nM, preferiblemente inferior a 300 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, preferiblemente inferior a 100nM, y preferiblemente inferior a 50 nM.
"Epítopo" se refiere a un sitio en la superficie de una molécula, normalmente una proteína, al que se une la molécula del anticuerpo u otro compuesto de unión. Por lo general, una proteína dispone de varios o muchos epítopos diferentes y reacciona con anticuerpos con especificidades diferentes. Un epítopo preferible es un sitio de fosforilación de una proteína. Los determinantes antigénicos preferibles son epítopos crípticos que se encuentran en la secuencia de aminoácidos de Her2 que no resultan accesibles para la unión (por ejemplo, por parte de compuestos de unión) en la molécula de longitud completa, pero que se revelan y resultan accesibles para la unión en la versión p95 truncada de Her2.
"Exosoma" se refiere a una vesícula de la membrana que se ha desprendido de una membrana celular en un entorno extracelular. Los exosomas y otras vesículas de la membrana contienen fracciones unidas a la membrana, como proteínas, que pueden ser utilizadas, por ejemplo, en ensayos para detectar estas fracciones, como p95.
“Dominio extracelular” se refiere a una porción de una molécula que se encuentra fuera de la membrana de una célula. Un ejemplo de un dominio extracelular sería, entre otros, la porción de una proteína transmembrana que se encuentra fuera de la célula. Más concretamente, un ejemplo sería el dominio extracelular de HER-2, que se puede clivar para generar un ectodominio desprendido y una proteína p95 truncada unida a la membrana.
“FFPE” se referirá a una muestra o muestras fijadas con formalina e introducidas en parafina. Estas muestras se utilizan típicamente, por ejemplo, en ensayos para complejos de proteínas y receptores en forma de secciones finas, por ejemplo, de 3-10 µm de grosor, de tejido fijado montado en un portaobjetos
o superficie equivalente. Estas muestras también se someten típicamente a un procedimiento de rehidratación convencional y, opcionalmente, a un procedimiento de recuperación de antígeno como preliminar o parte de las mediciones del ensayo.
“Her-2,” “ErbB2,” “c-Erb-B2,” “HER2,” “Her2,” y “new” se utilizan de forma intercambiable en el presente y se refieren al Her-2 nativo, y variantes alélicas de este, tal y como se describe, por ejemplo, en Semba et al., 1985, P.N.A.S. USA 82:6497-650 y Yamamoto et al., 1986, Nature 319:230-234 y en el número de acceso Genebank X03363. Salvo que se indique lo contrario, los términos “Her-2,” “ErbB2,” “c-Erb-B2,” “HER2,” y “Her2”, cuando se utilizan en el presente, se refieren a la proteína humana. El gen que codifica Her2 se denomina en el presente "erbB2".
A efectos del presente, "agente que actúa sobre Her-2" se refiere a un compuesto que puede inhibir la actividad biológica de Her-2. Estas actividades biológicas incluyen, entre otras, dimerización, autofosforilación, fosforilación de otro receptor, transducción de señales y similares. Las actividades biológicas pueden incluir, entre otras cosas, la supervivencia celular y la proliferación celular, y la inhibición de tales actividades por parte de un agente que actúa sobre Her-2 podría ser la muerte celular directa o indirecta (por ejemplo, ADCC), la alteración de complejos proteicos o la formación de complejos, la modulación del tráfico de proteínas o la inhibición de enzimas. Las actividades biológicas también pueden incluir la respuesta del paciente que se recoge en la presente solicitud. Entre los ejemplos de agentes que actúan sobre Her-2 se incluyen, por ejemplo, BIBW 2992, HKI-272, 4D5, pertuzumab, trastuzumab, Herceptin-DM-1, AEE-788 y lapatinib.
“Alto” se refiere a una medida que es mayor de lo normal, como una medida predeterminada o la medida de un subgrupo o que es relativamente mayor que la medida de otro subgrupo.
Por ejemplo, un nivel alto de Her-2 o p95 se puede referir a una medida que es igual o mayor que una medida predeterminada, como un límite predeterminado. Un nivel alto de Her-2 o p95 también se puede referir a una medida de Her-2 o p95 donde un subgrupo con un nivel alto de Her-2 o p95 presenta unos niveles relativamente mayores de Her-2 o p95 que otro subgrupo. Por ejemplo, de acuerdo con la
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presente especificación, se pueden crear dos subgrupos de pacientes distintos dividiendo las muestras en función de un punto matemáticamente determinado, como, por ejemplo, una media, creando así un subgrupo cuya medida es alta (es decir, mayor que la media) y otro subgrupo cuya medida es baja. Her-2
o p95 se puede medir por cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando un ensayo VeraTag o cualquier método de inmunohistoquímica (IHC) estándar como HercepTest®.
A efectos del presente, "probable" se refiere a una mayor probabilidad de que tenga lugar un elemento, objeto, cosa o persona. Así, en un ejemplo, un sujeto que es probable que responda al tratamiento con trastuzumab tiene más probabilidades de responder al tratamiento con trastuzumab que un sujeto o grupo de sujetos de referencia.
“Prolongado”, a efectos del presente, se refiere a una medida temporal que es mayor que una medida predeterminada o la medida de un subgrupo que es relativamente más prolongada que la medida de otro subgrupo. Por ejemplo, con respecto a la longevidad de un paciente, una progresión prolongada se refiere a una progresión en el tiempo que es mayor de lo previsto. El hecho de si una progresión en el tiempo es prolongada o no se puede determinar según cualquier método disponible para un experto en la técnica.
“Bajo” es un término que se refiere a una medida que es menor de lo normal, como una medida predeterminada o la medida de un subgrupo que es relativamente menor que la medida de otro subgrupo. Por ejemplo, un nivel bajo de Her-2 o p95 se puede referir a un método que es menor que una medida predeterminada, como un límite predeterminado. Un nivel bajo de Her-2 o p95 también puede significar una medida donde un subgrupo tiene un nivel bajo de Her-2 o p95 relativamente menor que el de otro subgrupo. Por ejemplo, de acuerdo con la presente especificación, se pueden crear dos subgrupos de pacientes distintos dividiendo las muestras en función de un punto matemáticamente determinado, como, por ejemplo, una media, creando así un subgrupo cuya medida es baja (es decir, menor que la media) y otro subgrupo cuya medida es alta (es decir, mayor que la media). Un experto en la técnica puede medir Her-2 o p95 por cualquier método conocido, como, por ejemplo, utilizando el método VeraTag o cualquier método de inmunohistoquímica (IHC) estándar como HercepTest®.
Una "etiqueta molecular", a efectos del presente, se refiere a una molécula que se puede medir de forma directa o indirecta, se puede distinguir de otras moléculas en base a una o más diferencias físicas, químicas u ópticas entre las moléculas que se van a separar, incluyendo, por ejemplo, la movilidad electroforética, el peso molecular, la forma, la solubilidad, la pKa, la hidrofobicidad, la carga, el ratio carga/masa, la polaridad o similares. En una realización, las etiquetas moleculares de una pluralidad o conjunto se diferencian por la movilidad electroforética y las características de detección óptica y se pueden separar mediante electroforesis. En otra realización, las etiquetas moleculares de una pluralidad o conjunto se pueden diferenciar por el peso molecular, la forma, la solubilidad, pKa, hidrofobicidad, carga, polaridad y se pueden separar mediante HPLC de fase normal o fase inversa, HPLC con intercambio de iones, electrocromatografía capilar, espectroscopia de masas, cromatografía gaseosa o una técnica similar.
La medición de etiquetas moleculares también puede implicar el uso de interacciones moleculares secundarias, con o sin otra modificación, para detectar, mejorar o amplificar una señal mensurable que está correlacionada con la presencia y/o cantidad de un analito, como p95 o un complejo de p95. En una realización, un conjunto de dos o más etiquetas moleculares pueden interactuar dentro de una proximidad efectiva para producir una señal mensurable. Como etiquetas moleculares, se puede generar una señal mensurable, por ejemplo, por la detección de dos secuencias de ácido nucleico complementarias que se hibridarán cuando las secuencias complementarias se encuentren dentro de una proximidad efectiva.
Otros ejemplos que pueden generar una señal mensurable o que se pueden medir utilizando métodos de detección conocidos en la técnica incluyen, entre otros, FRET, BRET, BiFC, LCI y QPCR.
"Límite óptimo", a efectos del presente, se refiere al valor de una medida predeterminada en sujetos que exhiben determinados atributos que permiten la mejor discriminación entre dos o más categorías de un atributo. Por ejemplo, un límite óptimo que permite discriminar mejor entre dos categorías, como una expresión de p95 alta y una expresión de p95 baja, resultaría útil para determinar la supervivencia global. Los límites óptimos se pueden utilizar para separar a los sujetos con valores más bajos o más altos del límite óptimo con el fin de optimizar el modelo de predicción.
La "supervivencia global" u "OS" se refiere a un tiempo medido desde el comienzo del tratamiento hasta la muerte o censura. La censura se puede producir por la conclusión de un estudio o por un cambio de tratamiento. La supervivencia global puede hacer referencia a una probabilidad, como, por ejemplo, la probabilidad cuando se representa en un gráfico de Kaplan-Meier de continuar vivo en un momento determinado, siendo ese tiempo el comprendido entre el comienzo del tratamiento y la muerte o censura.
"p95" se refiere a una porción de HER-2 C-terminal y truncada en el extremo N-terminal. "p95" también se ha denominado "receptor de ErbB2 truncado", “p95ErbB2”, “p95HER2”, y más generalmente “HER-2/neu NH2-terminalmente truncado” y “fragmentos C-terminales de HER2” para reflejar el hecho de que "p95" representa una familia de proteínas HER2 truncadas, pero no idénticas en tamaño a las originalmente identificadas por tener un peso molecular aparente de 95 kiloDaltons. Se cree que p95 se produce al menos a través de dos mecanismos distintos. p95 puede resultar por el clivaje proteolítico de HER2 de
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longitud completa. p95 también puede ser el resultado de un inicio traslacional alternativo en sentido descendente desde la metionina primera canónica, incluyendo, por ejemplo, M611 y M687.
"Complejo p95" se refiere a un complejo de proteínas donde al menos uno de sus miembros es p95. Entre los ejemplos de posibles complejos p95 se incluyen homodímeros de p95, así como heterodímeros compuestos por p95 y Her2 de longitud completa, así como otros miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico, incluyendo Her1, Her3 y Her4.
Una "sonda de proximidad", a efectos del presente, se refiere a un reactivo que comprende una fracción capaz de actuar dentro de una proximidad efectiva con una etiqueta molecular de un compuesto de unión para generar una señal detectable y un anticuerpo, anticuerpo, un péptido, un ligando peptídico o no peptídico para un receptor de la superficie celular, una proteína, como estreptavidina, una molécula pequeña, como biotina, un oligonucleótido, un análogo de oligonucleótido, como un ácido nucleico peptídico, una lectina o cualquier otra entidad molecular capaz de unirse específicamente a una molécula
o proteína diana o a un complejo molecular estable. Por ejemplo, una sonda de proximidad compuesta por un anticuerpo dirigido a p95 con una etiqueta molecular puede ser capaz de unirse a p95 dentro de una proximidad efectiva con uno o más compuestos de unión de p95, o un compuesto de unión de otra proteína de interés, que tiene una o más etiquetas moleculares unidas. En una realización, una sonda de proximidad comprende una molécula de unión y un primer ácido nucleico y una molécula de unión comprende un anticuerpo y un segundo ácido nucleico, donde el primer y el segundo ácidos nucleicos son complementarios entre sí y cada uno tiene una longitud predeterminada de forma que, cuando los ácidos nucleicos se encuentran dentro de una proximidad efectiva entre sí, se hibridan. La hibridación se puede medir por cualquier método conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden unir fluoróforos a los ácidos nucleicos como indicadores de hibridación. En una realización preferible, la hibridación se mide con un método de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, un método de amplificación por círculo rodante (véase, por ejemplo, Lizardi et al,., (1998) Nat Genet. 19: 225-232).
"RECIST" significa "Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos" y es un conjunto de normas publicadas que definen cuando los pacientes mejoran ("responden"), permanecen sin cambios ("estables")
o empeoran ("progresión" durante los tratamientos. La respuesta definida por los criterios RECIST ha sido publicado, por ejemplo, en Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, n.º 3, 2 de febrero de 2000.
"Responder" al tratamiento y otras formas de este verbo, a efectos del presente, se refiere a la reacción de un sujeto al tratamiento con un agente. Por ejemplo, un sujeto responde al tratamiento si el crecimiento de un tumor en el sujeto se retarda aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. En otro ejemplo, un sujeto responde al tratamiento si un tumor en el sujeto se reduce aproximadamente en un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más, determinado mediante cualquier medida apropiada, por ejemplo, por masa o volumen. En otro ejemplo, un sujeto responde al tratamiento con un agente que actúa sobre Her2, si el sujeto experimenta una esperanza de vida ampliada en aproximadamente un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más, con respecto a la esperanza de vida prevista en caso de que no se administrase ningún tratamiento. En otro ejemplo, un sujeto responde al tratamiento con un agente, si el sujeto tiene una supervivencia global o un tiempo hasta la progresión superior. Se pueden utilizar diversos métodos para determinar si un paciente responde a un tratamiento, incluyendo los criterios RECIST mencionados en el presente.
"Muestra" o "muestra de tejido" o "muestra del paciente", "muestra de tejido o células del paciente" se refieren a una serie de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido, por ejemplo, de un tejido fresco, aspirado o biopsia o tejido u órgano congelado y/o preservado; sangre o cualquier componente de la sangre, fluidos corporales como fluido cerebroespinal, fluido amniótico, fluido peritoneal o fluido intersticial, o células de cualquier momento de la gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se encuentran naturalmente intercombinados con el tejido en la naturaleza, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares. Las células se pueden fijar de manera convencional, como FFPE.
“Corto”, a efectos del presente, se refiere a una medida temporal que es menor de lo normal, por ejemplo que una medida predeterminada o la medida de un subgrupo que es relativamente más breve que la medida de otro subgrupo. Por ejemplo, con respecto a la longevidad de un paciente, una progresión corta se refiere a una progresión en el tiempo que es más corta de lo previsto. El hecho de si una progresión en el tiempo es corta o no se puede determinar según cualquier método disponible para un experto en la técnica.
A efectos del presente, "evento significativo" se referirá a un evento en la enfermedad de un paciente que es importante en opinión de un experto en la técnica. Los ejemplos de acontecimientos significativos incluyen, por ejemplo, el diagnóstico primario, la muerte, la recurrencia, la determinación de que la enfermedad de un paciente es metastásica, la recidiva de la enfermedad de un paciente o la progresión de la enfermedad de un paciente desde cualquiera de las etapas anteriormente mencionadas a otra. Un evento significativo puede ser cualquier evento importante utilizado para valorar la OS, el tiempo hasta la progresión (TTP) y/o utilizar los criterios RECIST, determinados por un experto en la técnica.
A efectos del presente, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan de forma intercambiable. Tal como se
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realización preferible, la muestra de sangre o plasma contiene células tumorales circulantes. En una realización preferible, la muestra contiene exosomas y/u otras vesículas. En una realización preferible, la muestra comprende líneas celulares. En una realización preferible, la medición puede ser cuantitativa en un amplio rango dinámico.
En una realización preferible, la determinación de la presencia y/o cantidad de compuesto de unión unido a p95 comprende asimismo el suministro de un segundo compuesto de unión, donde el segundo compuesto de unión es capaz de unirse específicamente al compuesto de unión unido a p95 y la determinación de la presencia y/o cantidad del segundo compuesto de unión como correlativa con la presencia y/o cantidad del compuesto de unión unido a p95. En una realización preferible, el segundo compuesto de unión es un anticuerpo.
El uso de un segundo compuesto de unión que es capaz de unirse específicamente al primer compuesto de unión y tiene una o más etiquetas moleculares puede ofrecer ventajas prácticas. Por ejemplo, se pueden testar múltiples primeros compuestos de unión específicos para p95 utilizando un único segundo compuesto de unión al que se unen una o más etiquetas moleculares, evitando la necesidad de unir etiquetas moleculares a cada uno de múltiples primeros compuestos de unión específicos para p95. En una primera realización preferible, el primer compuesto de unión es un anticuerpo de ratón y el segundo compuesto de unión es un anticuerpo anti-murino administrado a una especie no murina (por ejemplo, anticuerpos de cabra antimurinos) a los que se han unido etiquetas moleculares clivables. Normalmente los segundos compuestos de unión se etiquetan con sondas útiles para la detección.
Los sistemas de detección normalmente utilizados para detectar segundos compuestos de unión incluyen, por ejemplo, etiquetas moleculares clivables, como las descritas en el presente, radioetiquetas (es decir, radioisótopos como 1-125); enzimas que convierten un producto químico en una señal electroquímica o fluorescente colorimétrica mensurable (por ejemplo, peroxidasas) y proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde y sus múltiples derivados). Uno de los sistemas de detección utilizados más habitualmente, por ejemplo, para la inmunohistoquímica, consiste en conjugar peroxidasa de rábano (HRP) con un anticuerpo u otro compuesto de unión. A continuación se puede oxidar un sustrato mediante HRP, obteniendo un producto detectable por un método espectrofotométrico. Los sustratos para HRP incluyen tanto sustratos cromogénicos (por ejemplo, 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina [TMB] o 3,3'diaminobencidina [DAB]), que producen productos coloreados y sustratos quimioluminiscentes (por ejemplo, quimioluminiscencia por luminol mejorada [ECL]), que produce luz. Los métodos de detección por inmunohistoquímica que utilizan compuestos de unión secundarios y peroxidasas típicamente implican el etiquetado del compuesto de unión primario con una molécula pequeña que se puede unir a un segundo compuesto de unión que se ha conjugado con una peroxidasa (por ejemplo, un sistema de estreptavidina/biotina) o el uso de un anticuerpo secundario que se ha conjugado con peroxidasa dirigido al primer anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo de cabra anti-murino). A continuación se añade un sustrato en condiciones que permitirán la conversión en un producto de manera relativamente cuantitativa y después se utilizan métodos espectrofotométricos para detectar el producto.
El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o recombinante y se puede preparar mediante técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de esta, y las inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, como IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de estas pueden incluir Fab, Fv, y F(ab’)2, Fab’ y similares. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o cualquier otro derivado de anticuerpo conocido por un experto en la técnica que conserve la actividad de unión específica para un sitio de unión concreto. Por otra parte, se pueden utilizar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando proceda, siempre que se mantenga la afinidad de unión.
Para facilitar el desarrollo de métodos para medir p95 en muestras biológicas, se crearon anticuerpos monoclonales específicos para p95. Los ratones se inmunizaron contra péptidos de p95 y se utilizaron métodos estándar recogidos en el presente y conocidos por un experto en la técnica para crear hibridomas. Son muchos los métodos conocidos para la creación y producción de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, el método del hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al. (1975) Nature 256:495-497 u otros métodos descritos en la bibliografía (véase Goding, JW (1980) J. Immunol. Methods 34:285-308; Harlow E y Lane D (1988) en Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 6; Kennett RH et al.(1980) Monoclonal Antibodies, Plenum Press; Zola H (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press).
En una realización, el método para crear hibridomas comienza por inmunizar a un animal huésped, como un ratón, para provocar la producción de linfocitos que produzcan anticuerpos dirigidos al péptido o proteína(s) de interés. También se pueden inmunizar linfocitos in vitro. El antígeno utilizado puede ser un péptido, una proteína o una célula que presenta el antígeno en la superficie de la célula. A continuación se recogen los linfocitos fusionados a través de métodos químicos (por ejemplo, con PEG) o eléctricos (por ejemplo, por electrofusión) con células de mieloma para formar células hibridomas, típicamente en condiciones que impiden el crecimiento y/o la supervivencia de las células madre del mieloma. Se deja que crezcan las células fusionadas porque contienen enzimas que facilitan la supervivencia en el medio de cultivo. En una realización preferible, el medio de cultivo contiene hipoxantina, aminopterina y timidina
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un cáncer de próstata. En otra realización, el cáncer es un cáncer testicular. En otra realización, el cáncer es un cáncer de tiroides, por ejemplo papilar, folicular, medular o anaplásico o un carcinoma tiroideo indiferenciado. En otra realización, el cáncer es un cáncer del tracto urinario, por ejemplo de vejiga, riñones o uretra.
Los métodos para preparar células cultivadas in vitro como muestras frescas, congeladas o fijadas son conocidos por los expertos en la técnica y en el presente se describen métodos de ejemplo. En una realización, se realizan ensayos de la invención con muestras de tejido que han sido fijadas e introducidas en parafina, y se puede realizar un paso de desparafinado. Una muestra de tejido se puede fijar (es decir, preservar) utilizando una metodología convencional. Véase, por ejemplo, Lee G. Luna, HT (ASCP) Ed., 1960, Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology 3a edición, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, Nueva York; Ulreka V. Mikel, Ed., 1994, The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C. Un experto en la técnica apreciará que la opción de utilizar un fijador se determina en función del propósito para el que se va a teñir histológicamente o analizar de otro modo el tejido. Un experto en la técnica apreciará también que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y del fijador utilizado.
Por lo general, una muestra de tejido se fija primero y después se deshidrata a través de una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y empapa en parafina u otro medio de seccionamiento para que la muestra de tejido se pueda seccionar. Alternativamente, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. A modo de ejemplo, la muestra de tejido se puede introducir y procesar en parafina mediante una metodología convencional según las técnicas convencionales o descritas en el presente. Una vez que se ha introducido la muestra de tejido, puede ser seccionada con un micrótomo según las técnicas convencionales. Las secciones pueden tener un grosor de entre unos tres y doce micrones y preferiblemente de entre unos cinco y diez micrones. En una realización, una sección puede tener un área de entre unos 10 mm2 y 1 cm2. Una vez cortadas, las secciones se pueden fijar en los portaobjetos mediante diversos métodos estándar. Los ejemplos de adhesivos para portaobjetos incluyen, entre otros, silano, gelatina y poli-L-lisina. Las secciones introducidas en parafina se pueden unir a portaobjetos cargados positivamente y/o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.
Si se ha utilizado parafina para introducir la muestra, por lo general las secciones de tejido se desparafinan y rehidratan antes de proceder a la detección de biomarcadores. Las secciones se pueden desparafinar mediante diversas metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, se pueden utilizar xilenos y una serie gradualmente descendente de alcoholes según las técnicas convencionales descritas por las referencias que se mencionan en el presente. Alternativamente se pueden utilizar agentes no orgánicos para el desparafinado disponibles en el mercado, como Hemo-De® (CMS, Houston, Tex).
Se pueden preparar lisados celulares de cultivos de tejido de mamíferos, o tejidos frescos o congelados, utilizando técnicas de lisado celular convencionales (por ejemplo, 0,14 M NaCl, 1,5 mM MgC12, 10 mM Tris-Cl (pH 8.6), 0,5% Nonidet P-40, e inhibidores de fosfatasa y/o proteasa, cuando corresponda). Para los tejidos de mamífero frescos, la preparación de las muestras puede incluir también un paso de separación tisular, como triturado, troceado, molido o sonicación.
Los lisados celulares se prepararon y testaron mediante inmunoblot con Ab8 o CB11, anticuerpos contra Her2 que se unen a un epítopo intracelular de Her2 y, por tanto, son capaces de detectar tanto Her2 de longitud completa como p95. Los resultados confirman que las dos líneas celulares SKBR3 y MCF7 sometidas a transfección con los vectores de expresión de p95 expresan p95 y que Her2 de longitud completa sometido a transfección también se expresa en las células MCF7. La línea celular SKBR3 expresa altos niveles endógenos de Her2, así como ciertos niveles de p95, como cabe esperar porque se sabe que SKBR3 se desprende de Her2-ECD (véase Zabrecky et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17161720).
Se testaron seis líneas celulares utilizando anticuerpos monoclonales específicos para p95 putativos: MCF7; MCF7 transfectado con Her2 de longitud completa, p95 o CTF; SKBR3 y SKBR3 transfectado con fragmentos carboxi terminales (CTF) de HER2. CTF y p95 se utilizan de forma intercambiable para describir la familia de HER2 truncados con pesos moleculares aparentes determinados mediante PAGE similares a 95 kiloDalton (véase la definición de p95 y Anido et al. (2006) EMBO J. 12:3234-3244). Los resultados se muestran en la Figura 6. Se mostraron dos anticuerpos monoclonales por ser específicos para p95, D8.2 y D9.1.
La capacidad del anticuerpo específico para p95 D9.1 para detectar p95 en tumores se testó en muestras de ensayo, que se seleccionaron por presentar una alta probabilidad de contener p95. Las muestras tumorales Her2-positivas de pacientes nódulo positivos (ambos factores correlacionados con la positividad de p95) se obtuvieron en forma de muestras emparejadas frescas-congeladas y fijadas con formalina e introducidas en parafina. Se prepararon inmunoblots con lisados de material fresco-congelado y se sometieron a una sonda con CB11, un anticuerpo disponible en el mercado dirigido al dominio intracelular de Her2. Los resultados, mostrados en la Figura 7a, permitieron la designación de p95-positivas de 7 de las 12 muestras de tumores. Las muestras FFPE de los 12 tumores se testaron, a continuación, en el ensayo VeraTag, utilizando el anticuerpo D9.1 tal y como se describe en el Ejemplo 4 (véanse también,
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la estabilidad del complejo formado. En estas aplicaciones, las reacciones se deben realizar por etapas.
Por lo general, las cantidades de cada reactivo se pueden determinar empíricamente. La cantidad de muestra utilizada en un ensayo se determinará por el número previsto de complejos diana presentes y los medios de separación y detección utilizados para controlar la señal del ensayo. En general, las cantidades de los compuestos de unión y la sonda de proximidad se pueden proporcionar en exceso molar con respecto a la cantidad prevista de las moléculas diana de la muestra, por lo general a un exceso molar aproximado de al menos 1,5 y más preferiblemente 10 veces de exceso o más. En aplicaciones específicas, la concentración utilizada puede ser mayor o menor, dependiendo de la afinidad del compuesto de unión o la sonda de proximidad y del número previsto de moléculas diana presentes en una única célula.
La mezcla del ensayo se puede combinar e incubar en condiciones que permiten la unión de las sondas a las moléculas de la superficie celular, normalmente en un medio acuoso, generalmente a un pH fisiológico (comparable al pH al que se cultivan las células), mantenidas mediante un tampón a una concentración aproximada de entre 10 y 200 nM. Se pueden utilizar tampones convencionales, así como otros aditivos convencionales necesarios, tales como sales, medios de cultivo, estabilizantes, etc. Normalmente se utilizan temperaturas fisiológicas y constantes. Las temperaturas de incubación normalmente oscilan entre unos 4° y 70°C, más habitualmente entre unos 15° y 45°C, y más habitualmente entre unos 25° y 37°C.
En una realización preferible, la sonda de proximidad comprende una sonda de proximidad que tiene una fracción inductora del clivaje y donde el compuesto de unión tiene una o más etiquetas moleculares unidas al compuesto de unión a través de un ligamiento clivable, donde el ligamiento clivable puede ser clivado dentro de la proximidad efectiva produciendo una señal que está correlacionada con la presencia y/o cantidad de p95. En una realización preferible, el compuesto de unión y/o la sonda de proximidad comprenden también un anticuerpo y cada anticuerpo se une a un epítopo específico de p95 o un analito que se une a p95. En una realización preferible de la divulgación, el anticuerpo se ha presentado ante uno de los péptidos que tienen las SEC. ID. N.º 1-7. El anticuerpo es o comprende uno de los anticuerpos producidos por las líneas celulares hibridomas depositadas en ATCC con el número de acceso PTA-9738 (p95.D3.4), PTA-9739 (p95.D8.2) y PTA-9740 (p95.D9.1). En una realización, el anticuerpo es p95.D9.1. En una realización preferible, la muestra es una muestra biológica. En una realización preferible, la muestra es una muestra de tejido. En una realización preferible, la muestra es una muestra fijada, una muestra congelada o un lisado. En una realización preferible, la muestra es una muestra de tumor. En una realización preferible, la muestra es una muestra de tejido tumoral congelada. En una realización preferible, la muestra comprende un lisado tumoral. En una realización preferible, la muestra comprende una muestra de cáncer de mama. En una realización preferible, la muestra es una muestra FFPE. En una realización preferible, la muestra es una muestra de sangre, plasma o linfa. En una realización preferible, la muestra de sangre o plasma contiene células tumorales circulantes. En una realización preferible, la muestra contiene exosomas y/u otras vesículas. En una realización preferible, la muestra comprende líneas celulares. En una realización preferible, la medición puede ser cuantitativa en un amplio rango dinámico.
La medición de p95 o de un complejo de p95 utilizando etiquetas moleculares liberables ofrece múltiples ventajas, incluyendo la separación de las etiquetas moleculares liberadas de una mezcla de ensayo que proporciona un fondo notablemente reducido y una ventaja significativa en términos de sensibilidad y separación y detección que ofrece una capacidad de multiplexado útil para que múltiples componentes del complejo receptor se puedan medir de forma simultánea en el mismo ensayo. Los ensayos que utilizan estas etiquetas pueden tener diversas formas y se divulgan en las referencias siguientes: Patentes USA n.º 7 105 308; 6 627 400; 7 402 397; 7 402 398 y 7 402 399, así como en la Publicación de Patente Internacional n.º WO 2004/011900. Se pueden emplear diversas técnicas de separación que pueden distinguir moléculas basándose en una o más diferencias físicas, químicas u ópticas entre las moléculas que se van a separar, incluyendo, por ejemplo, la movilidad electroforética, el peso molecular, la forma, la solubilidad, la pKa, la hidrofobicidad, la carga, el ratio carga/masa o la polaridad. En una realización, las etiquetas moleculares de una pluralidad o conjunto se diferencian en la movilidad electroforética y las características de detección óptica y se separan mediante electroforesis. En otra realización, las etiquetas moleculares de una pluralidad o conjunto se pueden diferenciar por el peso molecular, la forma, la solubilidad, pKa, hidrofobicidad, carga, polaridad y se separan mediante HPLC de fase normal o fase inversa, HPLC con intercambio de iones, electrocromatografía capilar, espectroscopia de masas o cromatografía gaseosa.
Se proporcionan etiquetas moleculares que se pueden separar en bandas o picos distintos a través de una técnica de separación después de que se hayan liberado de los compuestos de unión. La identificación y cuantificación de estos picos proporciona una medida o perfil de la presencia y/o cantidades de p95. Las etiquetas moleculares dentro de un conjunto pueden ser químicamente diversas; sin embargo, por conveniencia normalmente se utilizan conjuntos de etiquetas moleculares químicamente relacionadas. Por ejemplo, pueden ser todas péptidos o pueden estar compuestas por diferentes combinaciones de los mismos bloques básicos o monómeros, o pueden estar sintetizadas utilizando la misma estructura básica con diferentes grupos sustitutos para impartir diferentes características de separación. El número de etiquetas moleculares en una pluralidad puede variar en función de diversos
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B10
2,212 3,03 0,095 0,115
B11
1,553 1,916 0,092 0,118
B12
2,491 2,941 0,104 0,119
B13
1,495 1,679 0,122 0,144
B14
3,693 3,858 0,129 0,14
B15
0,29 0,345 0,102 0,129
B16
0,108 1,78 0,097 0,124
B19
0,238 0,693 0,092 0,103
B20
0,447 0,855 0,102 0,114
B21
0,515 0,7 0,109 0,124
B23
2,95 3,625 0,1 0,118
B24
0,112 3,447 0,1 0,117
B25
0,089 1,556 0,093 0,104
B26
0,088 2,791 0,094 0,102
E1
3,7206 3,8345 0,1101 0,1102
E2
1,3195 1,8344 0,1023 0,0983
E3
2,7201 2,4782 0,1115 0,1106
E4
1,9273 1,9121 0,1168 0,1180
D2
1,4276 0,2555 0,0762
D3
2,3055 0,0890 0,1336
D4
3,9405 1,6825 0,1070
D5
3,4171 0,0939 0,1080
D6
0,9020 1,7200 0,0861
D7
2,0873 0,1152 0,0932
D8
3,7010 0,2191 0,0835
D9
3,4600 0,3109 0,0837
D10
3,1198 0,0865 0,0944
D11
3,3918 0,1026 0,0814
D12
3,8707 4,0000 0,0921
D13
1,1890 0,0923 0,0956
D102
3,6168 0,0968 0,0925
D111
4,0000 0,6007 0,1107
D112
0,3247 0,4424 0,1043
D115
3,9346 0,4967 0,0932
D117
4,0000 0,5348 0,0930
D119
4,0000 0,5448 0,1078
D120
0,6196 0,1175 0,1138
D121
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D123
3,7323 0,3121 0,0899
D125
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D126
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D127
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D128
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D129
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D131
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D132
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D133
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D134
3,7527 0,0934 0,1237
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