CN103238069B - 肺癌和结直肠癌中的bard1同工型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对肺癌和结直肠癌具有特异性的新型BARD1同工型、其检测方法以及用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法。

Description

肺癌和结直肠癌中的BARD1同工型及其应用
技术领域
本发明涉及对肺癌和结直肠癌具有特异性的新型BARD1同工型、其检测方法和用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法。
背景技术
肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。外科手术之外的治疗方法不是非常有效并且会引起抗性。因此，迫切需要了解肺癌及其发展的病因学。结直肠癌是癌症相关死亡的另一主要原因，是全球第四大常见癌症。结直肠癌患者的存活和预后取决于诊断时的肿瘤阶段。早期结直肠癌是可以被治愈的。不幸的是，在诊断时超过57%的患者该疾病已经区域性扩散或远端扩散。尽管在处理癌症中进行了巨大投资并取得了发展，但是对于晚期结直肠癌患者而言五年存活率仅为15%。
最近，许多研究组通过将肿瘤中的蛋白、RNA和微RNA与健康组织进行比较而提出了驱动肺癌的机制。除了TP53(肺癌中最常缺失或突变的基因)之外，认为p53-ARF途径的组分也缺失、突变或在表观遗传学上经修饰。对于结直肠癌，挑战在于理解分子基础，和确定引起形成(development)和驱动发展的因素。涉及结直肠癌发生和转移性发展的分子事件仅被部分地分类。最近的研究已经揭示了结直肠癌中的分子和生化标志物在预测化疗的后果和对化疗的反应上的潜在应用，如MLH1、MSH2、β-连环蛋白和p53。
分子谱图作为非小细胞肺癌(NSCLC)的预测和预后参数而出现，包括DNA损伤修复中涉及的基因，例如ERCC1、RRM1和BRCA1。提出了将乳癌易感基因BRCA1的上调表达作为对NSCLC治疗的反应的预后和预测标志物。关于结直肠癌，BRCA1的研究主要受限于结直肠癌风险和BRCA1突变。数种研究试图将BRCA1突变与结直肠癌风险关联起来，但没有任何明确的结论。基于当前有限的可利用证据，应当认为BRCA突变携带者具有较高额度结直肠癌风险。但是结直肠癌中BRCA1表达的具体作用是不清楚的。
BRCA1在许多增生组织中表达并且在DNA修复途径和细胞周期控制中充当肿瘤抑制剂。BRCA1蛋白稳定性和功能取决于其与BARD1(BRCA1相关的RING结构域蛋白1)的相互作用。BRCA1-BARD1异二聚体具有E3泛素连接酶活性，由此通过泛素化控制关键靶蛋白的稳定性。BARD1还参与p53-依赖性凋亡，在大多数肺癌中p53-依赖性凋亡是有缺陷的。BARD1稳定p53和促进其磷酸化，p53在导致凋亡的信号传导中发挥正确功能需要BARD1的表达。因此，BARD1在肿瘤抑制中起双重作用，同时为BRCA1和p53的结合伴侣。数个研究已经显示，BARD1在有丝分裂过程中上调，通过E2F进行转录和通过磷酸化进行翻译后修饰，并且重要的是，其对于有丝分裂是重要的。根据其它研究，BRCA1和BARD1都显示与hMSH2(通常与遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)相关的基因)相互作用，hMSH2的突变似乎占HNPCC的约30～40%。BRCA1-hMSH2信号传导过程的缺陷导致对肿瘤形成的易感性增加。
WO98/12327(BoardofRegents，德克萨斯大学系统)公开了在基于与乳癌蛋白BRCA1结合的筛选检测中鉴定出的数种基因。这些基因中的一种称为BARD1，是与BRCA1相互作用的RING蛋白，并且设想了其在各种癌症相关诊断和治疗方法中的应用，特别是与乳癌、卵巢癌和子宫癌相关的诊断和治疗方法中的应用。
WO2008/119802(日内瓦大学)公开了在妇科癌症中，带有缺失的BARD1同工型过表达，异常地定位到细胞质，并且它们的表达与乳癌和卵巢癌的预后不良相关。这些同工型的结构分析表明，它们缺乏与BRCA1相互作用或诱导凋亡的区域。这些同工型对于妇科癌症具有特异性，被命名为α、β、η、γ、ε、δ和θ。
由于肺癌和结直肠癌的严重性和不可治愈性，仍然需要开发可鉴别这些癌症的有效检测方法，和需要进一步开发治疗或预防这些癌症的有效方法和组合物。主要问题在于，迄今为止尚未开发出解决该问题的有效方法或策略。
发明内容
本发明提供一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在的方法，所述方法包括检测所述样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARD1同工型的步骤，所述至少一种BARD1同工型选自包含以下同工型的组：
同工型π，同工型π包含SEQIDNO：1、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列，和
同工型κ，同工型κ包含SEQIDNO：2、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列，
其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、患肺癌和/或结直肠癌的风险增加、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌后具有复发的风险的标志。
本发明还提供一种在权利要求1～6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQIDNO：1、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列；和提供一种在权利要求1～6所述的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQIDNO：2、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列。
本发明另一目的是选自包含SEQIDNO：13～80的组中的肽，所述肽用于本发明的检测BARD1同工型的存在的方法。
本发明的另一目的是用于检测获自受试对象的样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码至少一种所述BARD1同工型的多核苷酸具有特异性，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段和/或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或
与至少一种所述BARD1同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或
至少一种选自包含SEQIDNO：13～80的组的肽。
本发明还涉及一种将肺癌和结直肠癌与妇科癌症相区分的方法，所述方法包括检测获自受试对象的生物样品中至少一种对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的步骤，所述BARD1同工型选自包含以下同工型的组：
包含SEQIDNO：1的同工型π、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列，和
包含SEQIDNO：2的同工型κ、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列，
其中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在是肺癌和/或结直肠癌的标志。
另外，本发明涉及在治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体、重组siRNA和本发明的BARD1同工型的生物活性调节剂。
附图说明
图1显示了NSCLC中的BARD1表达。用BARD1抗体N19、C20、PVC、WFS和BRCA1对100个NSCLC病例进行免疫组织化学分析。(A)具有上述蛋白基序作为RING指(RING)、锚蛋白重复(ANK)和BRCT结构域的BARD1外显子(1-11)的示意性表示。标明各种抗体识别的表位的大概位置(N19、PVC、WFS、C20)。(B-D)使用BARD1抗体和BRCA1抗体的免疫组织化学染色的实例。BARD1N19和C20显示出细胞质颗粒状染色，并且有时共定位在相同的细胞或区域。BARD1PVC和WFS染色是细胞质的染色或弥漫性细胞核和弥漫性细胞质的染色。BRCA1染色与BARD1N19染色共定位(B)。示出了未被或几乎未被PVC和WFS(C)染色的实例和被N19和C20染色(D)可忽略不计的实例。标明了比例尺(上图=200μm；下图=100μm)。(E)观察到的用所有四种N19、PVC、WFS和C20探测的100个NSCLC病例中的73个的染色。“+”表示阳性染色，“-”表示阴性染色。具有所有四种抗体的阳性染色是频率最高的表达模式。(F)BARD1N19、PVC、WFS和C20染色的成对比较。BARD1N19和C20以及PVC和WFS强相关。在N19和PVC之间、N19和WFS之间、C20和PVC之间、C20和WFS之间观察到弱相关或不相关。
图2显示了在肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARD1表达的比较以及与临床特征的相关性。(A)20名(10名男性和10名女性)NSCLC患者的肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARD1N19、BARD1C20和BRCA1染色的比较。与“正常”组织相比，肿瘤组织中所有抗体的染色增加。(B)在10名女性和10名男性NSCLC患者的肿瘤组织中测试BARD1N19、BARD1C20和BRCA1染色。与男性患者相比，来自女性患者的肿瘤中所有抗体的染色增加。(C)100个NSCLC病例中BARD抗体染色和肿瘤类型的比较。阳性染色在非-腺癌(AC)(包括鳞状细胞癌和大细胞癌)中比在腺癌中频率更高。PVC和WFS染色增加具有统计学显著性。(D-E)BARD1表达与患者存活的相关性。(D)如图1E所定义的根据4种抗体阳性染色的组合和小于4种抗体阳性染色的组合进行的无病存活(DFS)的Kaplan-Meyer分析。(E)如图1E所定义的根据4种抗体阳性染色的组合和小于4种抗体阳性染色的组合进行的总存活(OS)的Kaplan-Meyer分析。
图3显示了在诱导了肺癌的实验小鼠模型中BARD1同工型表达的时间过程。(A)经尿烷(urethane)处理的动物的形态学正常的肺组织(正常)中的BARD1表达。在16周(wk)时BARD1PVC和WFS表位在一些II型肺泡上皮细胞中检测出，但未在I型肺泡上皮细胞中检测出。在24周和32周时所有表位都在II型和I型肺泡上皮细胞中表达，并且从24周至32周表达上调。C20染色与其它相反：在16周时强染色，在24周时弱染色，在32周时几乎是阴性的。(B)肿瘤中的BARD1表达。在肿瘤区，从16周至32周BARD1PVC、特别是WFS表达上调，而从16周至32周C20表达下调。(C-D)在三只小鼠的正常(C)组织和肿瘤(D)组织中的BARD1表位的表达模式。标出了染色分数、阳性细胞百分比(0表示阴性染色、1～4表示具有阳性染色的细胞的强度和数量增加)。
图4显示了人肺肿瘤组织和肿瘤周围组织中BARD1转录物的表达和结构。(A-D)用扩增整个BARD1编码区(一个或多个)的引物进行RT-PCR，该编码区包含外显子1-4或1-6。扩增GAPDH作为对照RT-PCR。分子尺寸标志物(M)示于左侧。推定的FLBARD1和不同剪接的同工型示于右侧。(A)正常肺组织中的BARD1RNA表达。对具有良性肺疾病的个体的肺活检组织进行的RT-PCR(参见方法部分)显示BARD1表达在多数样品中不存在，并且在8个病例中的5个中显示各同工型(γ、δ、η)的扩增。(B)使用外显子1中的正向引物、在外显子11或外显子4中的反向引物对FLBARD1和截短的同工型进行的扩增。对于来自男性和女性患者的组织，显示了成对的正常肿瘤周围(N)组织和肿瘤(T)组织的实例。推定的FLBARD1和不同剪接的同工型示于右侧。正常组织和肿瘤组织表达相同模式的同工型。(C)对外显子1～6进行扩增以区分FLBARD1、β和新型同工型κ和π。同工型π在肿瘤中特异性表达，而在正常组织中不表达或弱表达。(D)在多数病例中发现了通过RT-PCR确定的雌激素受体α的表达。在男性和女性的正常样品和肿瘤样品中发现类似的表达水平。(E)已知BARD1同工型和肺癌特异性新形式的同工型κ和π的结构。指出了FLBARD1的示意性外显子(1～11)结构与蛋白特征(RING,ANK,BRCT)和核定位信号(NLS)，以及引物的位置。下方以灰色示出同工型的示意性假定蛋白结构，以白色示出非编码外显子，并且以浅灰点(点)示出选择性开放阅读框(β、γ和η)。示出了新型同工型κ，其外显子3缺失并且推定的翻译起点(ATG)在外显子4内。将新型同工型π指定为具有外显子4内的缺失，指出了定位到该区域内的已知BARD1突变和多态性。同工型的指定名称示于左侧，大小(氨基酸)和分子量(MW)示于右侧。
图5显示了在女性和男性NSCLC患者的形态学正常的肿瘤周围组织(左侧)中和在肿瘤组织(右侧)中的BARD1、BRCA1和AuroraB表达的比较。利用BARD1(N19和C20)以及C末端特异性抗体p8、BRCA1和AuroraB抗体染色进行免疫组织化学分析。符号n=细胞核染色。
图6显示了外显子4内的选择性剪接和/或转录起始。(A)用外显子(Ex)4、外显子5和外显子6内的正向引物(位于左侧)和外显子11中的反向引物(位于右侧)扩增的BARD1的各种片段的图。引物的位置和扩增带的预期大小在括号中标出(bp)。(B)示出了用A所示的引物对在男性(左图)和女性(右图)NSCLC患者的人肺肿瘤组织(T)和邻近的正常肿瘤周围组织(N)中的BARD1转录物进行的扩增。注意用外显子4内的引物进行的扩增在不同样品中是可变的，但所有样品都可以用外显子5或外显子6内的引物进行扩增。BARD1mRNA和蛋白表达的变化可能归因于该区域中转录的选择性剪接或不同起始。
图7示出了在女性和男性患者的肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤周围组织(正常)中BARD1mRNA同工型表达的比较和相关性。对20对肿瘤/形态学上正常的组织样品(包括10名男性和10名女性)的FLBARD1和BARD1同工型进行评分并将其示出。用ImageJ软件对表达进行定量(参见方法部分)。结果在图中表示为值的平均值±SE(标准误差)。(A)肿瘤周围组织和肿瘤组织中FLBARD1和同工型的比较。除了同工型β和κ之外，所有同工型在肿瘤中上调，具有统计学显著性。(B-C)在男性(B)和女性(C)中，FLBARD1和BARD1同工型都在肿瘤组织中比在肿瘤周围组织中更丰富。(D/E)肿瘤组织(D)中和正常组织(E)中男性和女性之间BARD1表达的比较。在肿瘤组织和肿瘤周围组织中，BARD1同工型β和κ在来自男性的组织中比来自女性的组织中表达更多。这具有统计学显著性。在肿瘤组织和肿瘤周围组织中，FLBARD1和BARD1同工型γ、ε和η在来自女性的组织中可能比来自男性的组织中表达更多，但这不具有统计学显著性。(F)在年轻(<60岁)和老年(>60岁)患者组中FLBARD1和同工型的比较。FLBARD1和同工型γ在年轻(<60岁)患者中上调。这具有统计学显著性。
图8显示了结直肠癌中BARD1和BRCA1表达的免疫组织化学分析的实例。通过BARD1抗体N19、C20、PVC、WFS和BRCA1对148个结直肠癌病例的样品进行了免疫组织化学分析。将所有样品都表示为组织微阵列，每个病例一式四份。免疫组织化学检测后145个样品对于分析是合格的。
(A)针对BARD1的BRCA1抗体的阳性染色病例的频率。四个抗体中的每一个的阳性染色率是可变的。BARD1N19和C20染色以及BRCA1染色频率较低。在多数结直肠癌病例中观察到BARD1PVC和WFS阳性染色。(B)结直肠癌中的BARD1表达模式。基于每个病例的阳性(+)染色和阴性(-)染色，用4种BARD1抗体获得表达模式。PVC和WFS阳性染色，但N19和C20阴性染色是频率最高的表达模式，“所有四种抗体阳性”染色其次，N19阴性但PVC、WFS和C20阳性染色是观察到的频率第三高的表达模式。(C-F)使用BARD1抗体和BRCA1抗体的免疫组织染色的实例。BARD1N19和C20显示出细胞质颗粒状染色，并且共定位在相同的细胞和区域。BARD1PVC和WFS染色是弥漫性细胞质的。BRCA1染色在细胞质和细胞核中都是颗粒状。示出了以下实例：使用BARD1抗体和BRCA1抗体的阳性染色(C)、使用N-19和C20(D)的可忽略不计的染色(D)、使用所有四种BARD1抗体的阳性染色(E)和使用N19(F)的阴性染色。标明了比例尺(上图=200μm；下图=50μm)。
图9显示了对于结直肠癌中BARD1和BRCA1的不同抗体染色之间的相关性。(A)BARD1N19、PVC、WFS和C20染色的相关性。BARD1N19和C20染色强相关，PVC和WFS、PVC和C20以及WFS和C20弱相关。N19和PVC之间以及N19和WFS之间未观察到相关。(B)BRCA1和BARD1的抗体染色的相关性。BRCA1染色不与四种BARD1抗体的任何染色相关。
图10显示了BARD1和BRCA1的不同表位表达与结直肠癌中的临床变量的相关性。BARD1N19阳性染色在女性中频率更高(P=0.014)(A)。在不同抗体的BARD1和BRCA1染色与肿瘤组织病理学级别(级别)(B)、肿瘤大小或附近的组织浸润(肿瘤)(C)、淋巴结累及(结)(D)、远端转移(转移)(E)和肿瘤阶段(阶段)(F)之间未发现相关性。通过χ2检验获得P值。
图11显示了结直肠癌组织(T)和正常肿瘤周围组织(N)中BARD1转录物的表达和结构。(A)使用外显子1中的正向引物和外显子11(Ex1-11)或外显子4(Ex1-4)中的反向引物对FLBARD1和/或截短的同工型进行的扩增。作为实例，示出了5名男性患者和5名女性患者的成对的肿瘤周围组织和肿瘤组织。对于相同的样品示出甘油醛3-磷酸脱氢酶表达作为标准物。分子标志物示于左侧(M)。推定的FLBARD1和截短的同工型示于右侧。肿瘤周围组织和肿瘤组织表达不同模式的同工型：肿瘤周围组织比肿瘤组织中的表达频率低。也在NSCLC中鉴定出的两种新型同工型，κ和π，在结直肠癌中表达。(B)相同样品中雌激素受体α(ERα)的扩增，使用MCF-7作为阳性对照(右侧)。在结直肠组织中，无论在男性还是女性的肿瘤周围样品中还是肿瘤样品中都未观察到ERα表达。
图12示出了在患有结直肠癌的男性和女性患者的肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤周围(正常)组织中的BARD1mRNA同工型表达的比较。对结直肠癌的20对肿瘤组织/肿瘤周围组织样品(包括10名男性和10名女性)的FLBARD1和BARD1同工型进行评分并将其示出。基于各个肿瘤周围样品或肿瘤样品(A)中的存在或不存在，和各个同工型(B、C、D)的表达的存在或不存在，对表达进行定量。(A)基于任何形式的BARD1的存在和不存在，对肿瘤周围组织和肿瘤组织中(包括在男性样品、女性样品中和在联合样品中)BARD1表达的比较。无论在女性(P=0.0010)中还是在男性(P=0.0679)中，BARD1表达在来自肿瘤的组织中比在来自肿瘤周围的组织中更丰富和频率更高(P=0.0003)。(B)肿瘤周围组织和肿瘤组织中的FLBARD1和同工型表达的比较。肿瘤中所有形式都上调，具有统计学显著性(对于所有形式P<0.05)。(C/D)在来自男性和女性的结直肠组织中的FLBARD1和同工型表达的比较。无论在肿瘤周围组织(C)中还是在肿瘤组织(D)中，FLBARD1和同工型的表达在来自男性和女性的组织中相似(对于所有形式P<0.05)。通过χ2检验获得P值。
图13显示FLBARD1和同工型mRNA表达与结直肠癌中的临床病理变量的相关性。(A)在年轻(<60岁)和老年(>60岁)患者中FLBARD1和同工型表达的比较。FLBARD1和除同工型β之外的所有同工型，在老年患者中比在年轻患者中上调更多。具体而言，同工型δ和π的表达与老年患者显著相关(P<0.01)。(B-E)通过原发肿瘤和淋巴结状态、以及肿瘤阶段和级别，比较FLBARD1和同工型表达。BARD1同工型κ表达与较大尺寸的肿瘤或附近的组织浸润(B)、淋巴结累积(C)、以及晚期(III期和IV期)(D)显著相关。在BARD1同工型表达和肿瘤组织病理学级别之间未发现相关性(E)。通过χ2检验获得P值。未示出P>0.05的比较。
图14显示用于对血液或血清中的BARD1同工型特异性抗体检测的ELISA测试的实例。
图15显示用位于ATG处和π中的缺失连接(deletionjunction)处的引物进行的同工型π的扩增。鉴定出由外显子2的另外缺失导致的第二同工型，π’。
图16显示了对HeLa、MCF7、RPE1和NLF细胞用抗-Bard1抗体进行的蛋白质印迹。AbBethylBL518(BL)识别在中部外显子4中编码的表位。针对由外显子1中的β-特异性选择性ORF编码的表位产生AbPGP。识别了BARD1同工型β和BARD1同工型β-d-5(β’)和BARD1同工型η。
图17显示BARD1同工型的siRNA抑制。A)siRNA靶序列的位置。使用外显子4中的两个siRNA，K401和K423。K401位于同工型π的缺失内，K423在缺失的上游。B-C)K401比K423对生长的作用小。B)siRNA表达与GFP表达相结合。许多阳性细胞在表达K401的细胞中生长，少量在表达K423的细胞中生长。C)生长曲线确认，K423抑制细胞生长与之前报道的靶向所有形式的BARD1的K78一样有效。
图18显示微RNA影响BARD1和BARD1同工型表达。RT-PCR显示所有形式的BARD1都被miR-203轻微抑制。蛋白质印迹显示miR-203过表达对FL、β和π的强烈抑制。
具体实施方式
虽然可将与本文所述类似或等效的方法和材料用于本发明的实践或测试，但合适的方法和材料描述如下。通过参考并入本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容。提供本文所述的出版物和申请仅仅是为了公开在本申请的提交日之前的内容。此处决不能解释为承认由于之前的发明导致本发明没有资格早于此类出版物。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，不是意图进行限制。
在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
除非另外定义，本文所用所有科技术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，为了便于理解本发明提供以下定义。
术语“包含”通常以包括的意思使用，也就是说允许存在一种或多种特征或成分。
如说明书和权利要求所用，单数形式的″a″、″an″和″the″包括多个指代对象，除非上下文明确做出了不同规定。例如BARD1同工型是指至少一种BARD1同工型。
如本文所用术语“同工型”是同一蛋白的数种不同形式中的一种，如本发明的BARD1蛋白。诸如BARD1等蛋白的不同形式，可以从相关基因生产，或可以由同一基因通过选择性剪接而产生。大量同工型可由单核苷酸多态性或SNP(同一基因的等位基因之间的较小遗传学差异)引起。这些出现在基因的特定的个别核苷酸位置。
如本文所用术语“受试对象”或“患者”是本领域公知的，并且在本文中用于指哺乳动物，最优选是人。在某些实施方式中，所述受试对象是需要治疗的受试对象或患有肺癌和/或结直肠癌的受试对象。但是，在其它实施方式中，所述受试对象可以是尚未发展出肺癌和/或结直肠癌症状的正常受试对象或已经进行针对肺癌和/或结直肠癌的治疗的受试对象。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，意图覆盖成年或幼年受试对象，无论男性还是女性。
如本文所用，术语“肽”、“蛋白”、“多肽”和“肽的(peptidic)”可以相互替换地使用，来指通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接到其它氨基酸的一系列氨基酸残基。
与所预期的相反，申请人已经令人惊奇地在来自100例非小细胞肺癌(NSCLC)和165例结直肠癌的患者群组的每个样品中鉴定出除已知的同工型α、β、η、γ、ε、δ和θ之外的两个新的其它BARD1同工型。另一令人惊奇的特征是同工型α在来自100例NSCLC和165例结直肠癌的患者群组的每个样品中都不存在。将这些新型同工型命名为κ和π。实际上BARD1同工型在NSCLC和结直肠癌的肿瘤组织中表达相似的模式，它们都表达两种新型的同工型κ和π，同工型κ和π不同于在妇科癌症中鉴定出的BARD1同工型(WO2008/119802)。该发现表明BARD1的异常表达在女性激素依赖性肿瘤组织和非女性激素依赖性肿瘤组织中可能是不同的。
新型同工型κ带有外显子3的缺失，从外显子2翻译到外显子4中不是框内的，但是翻译可以在外显子4内开始。所得的蛋白产物的抗体反应性与同工型β相似。
新型同工型π带有在外显子4内的编码第301～436位氨基酸的408bp的缺失。同工型π的翻译会产生与抗体PVC和WFS反应但却缺少重要的NLS的蛋白(图4C、E和图6)。同工型π源自新的剪接机制，该剪接机制产生外显子4的部分缺失，但保留外显子1-3以及外显子4的开始部分，因此保留BRCA1结合性RING指结构域。同工型π保留外显子1-3以及外显子4的开始部分，因此保留了被PVC和WFS识别的表位，所述表位为未在任何其它同工型中发现的表位的组合。同工型π可以用抗体PVC和WFS检测，这些抗体在小鼠晚期肺肿瘤中显示出染色增加。因此，同工型π可以是NSCLC中肿瘤发展的致癌驱动物。同工型π中外显子4的部分缺失可能是重要的区域，因为其具有数种癌症相关突变和NLS(图4E)，这可能解释PVC和WFS染色的细胞质定位。异常的胞内定位可能影响蛋白修饰，例如磷酸化和蛋白-蛋白相互作用。
同工型π对于肺癌似乎特别重要，这是因为其是唯一的在肿瘤组织中显著上调和在肿瘤周围组织中缺乏或仅弱表达的同工型，而所有其它BARD1同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中都相似地表达(图4B；图7)。外显子4的部分缺失引起BARD1上重要的NLS的丧失，这可能解释细胞质定位。
由外显子2的缺失导致的另外的同工型π’，在肺癌和结直肠癌中与同工型π共表达。
申请人证明，FLBARD1(全长BARD1)和剪接同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中表达，并且可能促成肿瘤发生和发展。但是，同工型π在肿瘤中特异性表达，可能参与致癌发展。FLBARD1在mRNA水平上表达，但不存在FLBARD1的蛋白翻译。因此在蛋白水平上，BARD1同工型，而不是FLBARD1，在来自100个NSCLC和165个结直肠癌患者群组的每个样品中表达。同工型表达和定位与BRCA1不相关，表明BRCA1-BARD1异二聚体的E3泛素连接酶功能在两种类型的癌症中受损。BRCA1蛋白的稳定性和定位极大地依赖于BARD1。导致BRCA1-BARD1缺乏肿瘤抑制功能丧失的FLBARD1的缺失引起基因组不稳定和对凋亡的抗性。除了FLBARD1的丧失的这个效果之外，过表达的差异性剪接BARD1同工型可能是肿瘤形成的驱动物。
选择性剪接是肺癌中经常观察到的现象，并且对于许多调控性蛋白都得到验证。剪接同工型能够翻译成具有拮抗功能的异常蛋白同工型。对于两种BARD1剪接变体，BARD1β和BARD1δ，这已经得到验证，BARD1β和BARD1δ分别通过稳定AuroraB和作用在Erα上对FLBARD1功能起拮抗作用。因此，NSCLC中的BARD1同工型表达可能不仅是旁观者，还可能是肿瘤形成的驱动者。实际上，分别被抗体PVC和WFS识别的定位到外显子3和4的表位的表达在诱导了肺癌的小鼠模型的肺肿瘤的侵袭阶段中增加。
所有的肿瘤组织样品和肿瘤周围组织样品还表达在妇科癌症中发现的同工型；具体而言是同工型δ。BARD1同工型δ结合和稳定ERα，与BRCA1-BARD1异二聚体的功能相反。由于ERα也在所有样品中表达，BARD1同工型可能通过雌激素而得到上调并参与肺癌中的雌激素信号传导。因此，数种BARD1同工型似乎与癌形成相关。
由于癌细胞需要BARD1或BARD1同工型以增殖，NSCLC和结直肠癌中的BARD1同工型表达不仅是旁观者，还可能是肿瘤形成的驱动者。特别是表达定位到外显子3和4的表位的同工型，似乎与NSCLC和结直肠癌中的较短存活都相关。这些表位在小鼠肺癌模型的侵袭性肿瘤中上调。NSCLC和结直肠癌中表达的BARD1同工型源自选择性剪接。例如，剪接同工型能够翻译成具有拮抗功能的异常蛋白同工型。
所有的肺肿瘤样品和肿瘤周围组织样品都表达ERα和同工型δ。但是，在系列结直肠癌病例中不存在ERαmRNA表达，并且在BARD1同工型表达和性别之间未发现差异。
但是，令人感兴趣的是，高频率的N19阳性染色与结直肠癌的女性性别显著相关(P=0.014)，并且该发现和NSCLC中与女性性别相关的BARD1N端表位的表达一致(统计学显著性是临界的，P=0.051)。NSCLC中，在女性中观察到BARD1同工型γ、ε和η的高mRNA水平的表达，而在男性中同工型β和κ过表达。同工型γ和ε表达能够通过BARD1N19检测，而同工型β、κ和η不能。因此，BARD1同工型表达的蛋白水平和mRNA水平是一致的，表明性别特异性BARD1同工型在这些癌症中表达。
BARD1同工型在NSCLC和结直肠癌的肿瘤组织与肿瘤周围组织中显示了不同的表达模式。NSCLC中，除了同工型π之外的所有同工型在肿瘤周围组织中表达并在肿瘤组织中仅轻微增加，但在获自良性肺疾病的对照组织中观察到任何形式的BARD1表达较少或不表达。相反，在结直肠癌中，BARD1同工型在肿瘤组织中表达的频率较高，但在肿瘤周围组织中不表达或表达较少。该结果可以通过根据不同细胞类型对外部刺激或某些病理学状况和/或在肺组织和结直肠组织之间ERα表达的差异的应答而多样性调节选择性剪接来解释。
用PVC抗体或WFS抗体或二者获得的阳性染色与NSCLC患者的存活减少相关。但是，四种抗体的阳性染色模式与结直肠癌中的存活较长显著相关，对于N19阳性染色情况也是如此；而PVC和WFS阳性染色模式，而不是它们各自的阳性染色，与存活较短强相关。事实上，不同的表达模式不仅反映了不同BARD1同工型的表达，还反映了同工型的组合的表达。根据BARD1表达的不同表位的相关性，似乎观察到数种BARD1同工型：NSCLC和结直肠癌中的N端和C端截短形式以及内部缺失形式，以及结直肠癌中N端丧失的其它形式。四种抗体阳性染色的表达模式未表明同工型π的表达，但可能反映了BARD1的不同同工型的同时表达。
事实上，BARD1同工型π的表达与被PVC和WFS识别的表位一致，所述表位为未在任何其它同工型中发现的表位的组合。实际上，PVC和WFS染色是细胞质的染色。PVC和WFS的表达与NSCLC和结直肠癌的不良预后明显相关，PVC和WFS染色还与小鼠肺癌模型中的癌症发展相关。
PVC和WFS反应性表位的强表达，加上N端和C端表位的弱表达可能表明这些表位被空间构型和/或蛋白-蛋白相互作用封闭。FLBARD1与BARD1同工型的翻译后调节或差异性蛋白稳定性可能还解释说明了在蛋白水平上FLBARD1的不存在，而其在mRNA水平上存在。
申请人证明BARD1同工型的表达在NSCLC和结直肠癌中是常见的。这些同工型的表达与NSCLC和结直肠癌的预后(不良预后或良好预后)显著相关，强烈地表明BARD1同工型参与了肿瘤形成、发展和致死性。因此，BARD1及其同工型可以是有前景的诊断和预后标志物，不仅用于鉴定对更具侵袭性的治疗具有不良预后可能的个体，还为搜寻有效的分子靶向治疗指明了新方向。例如，诸如κ和π等BARD1同工型可以是肺癌和结直肠癌治疗新策略的靶标。
检测特异性同工型κ和π有助于在潜在的治愈性外科手术治疗之前和/或之后鉴定有死于NSCLC和结直肠癌的最高风险的受试对象，这是因为其是选择用辅助性化疗进行随后治疗的受试对象的关键步骤。
本发明提供了一种用于检测获自受试对象的生物样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在的方法，所述方法包括检测所述样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的至少一种BARD1同工型的步骤，所述至少一种BARD1同工型选自包含以下同工型的组：
同工型π，其包含SEQIDNO：1、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列，和
同工型κ，其包含SEQIDNO：2、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列，
其中，在获自所述受试对象的样品中所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的所述BARD1同工型的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌、具有升高的患肺癌和/或结直肠癌的风险、以及/或者治疗肺癌和/或结直肠癌后具有复发的风险的标志。
优选的是，所述检测步骤包括检测BARD1同工型π和BARD1同工型κ，BARD1同工型π包含SEQIDNO：1、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列，BARD1同工型κ包含SEQIDNO：2、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列。
还优选的是，本发明的方法包括检测所述生物样品中由SEQIDNO：1组成的BARD1同工型π和由SEQIDNO：2组成的BARD1同工型κ的步骤。
本发明的方法还包括检测所述生物样品中选自包含以下同工型的组中的至少一种BARD1同工型：
同工型π’，同工型π’包含SEQIDNO：105、其生物活性片段或与SEQIDNO：105具有至少95%同源性的序列，
同工型β，同工型β包含SEQIDNO：5、其生物活性片段或与SEQIDNO：5具有至少95%同源性的序列，
同工型δ，同工型δ包含SEQIDNO：6、其生物活性片段或与SEQIDNO：6具有至少95%同源性的序列，和
同工型γ，同工型γ包含SEQIDNO：7、其生物活性片段或与SEQIDNO：7具有至少95%同源性的序列，
同工型β’，同工型β’包含SEQIDNO：106、其生物活性片段或与SEQIDNO：106具有至少95%同源性的序列。
优选的是，本发明的方法还包括检测所述生物样品中选自包含以下同工型的组中的至少一种BARD1同工型：
同工型π’，同工型π’包含SEQIDNO：105、其生物活性片段或与SEQIDNO：105具有至少95%同源性的序列，
同工型β，同工型β包含SEQIDNO：5、其生物活性片段或与SEQIDNO：5具有至少95%同源性的序列，
同工型β’，同工型β’包含SEQIDNO：106、其生物活性片段或与SEQIDNO：106具有至少95%同源性的序列。
还优选的是，本发明的方法包括检测所述生物样品中由SEQIDNO：1组成的BARD1同工型π、由SEQIDNO：2组成的BARD1同工型κ和由SEQIDNO：5组成的BARD1同工型β的步骤。
在本发明的上下文中，“生物活性片段”是指本发明的BARD1同工型的区域，其对于BARD1同工型的正常功能，例如拮抗功能而言是必须的。生物活性片段包括包含与SEQIDNO：1～7、105～106的氨基酸序列具有足够同源性或源自SEQIDNO：1～7、105～106的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含的氨基酸比全长BARD1同工型少，并且展示至少一种拮抗活性。通常，生物活性片段包含具有至少一种拮抗活性的结构域或基序。本发明的BARD1同工型的生物活性片段可以是长度为例如10个、25个、50个、100个或更多个氨基酸残基的多肽。此外，其中缺失其它区域的其它生物活性片段可以通过重组技术制备，并对其就本发明的天然BARD1同工型的一种或多种功能活性进行评价。
例如，同工型π的一种生物活性片段可以由SEQIDNO：3组成，同工型κ的一种生物活性片段可以由SEQIDNO：4组成，同工型β的一种生物活性片段可以由SEQIDNO：4组成。
在另外的实施方式中，本发明的BARD1同工型是以下多肽，所述多肽包含与包含SEQIDNO：1～7、105～106的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%，优选为95%同源性的氨基酸序列，并且保持包含SEQIDNO：1～7、105～106的BARD1同工型的活性。
为了确定两个氨基酸序列的同源性百分比，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，为了与第二氨基酸序列进行最佳比对，可以在第一氨基酸序列中引入空位)。然后比较在相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置是同源的。比对和百分比同源性可以使用本领域已知的任何合适的软件，例如CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等(eds)1987,Supplement30,第7.7.18小节)中描述的软件确定。优选的程序包括GCGPileup程序、FASTA(Pearson等(1988)Proc.Natl,Acad.SciUSA85：2444-2448)和BLAST(BLASTManual,Altschul等,Natl.Cent.Biotechnol.Inf.,NatlLib.Med.(NCIBNLMNIH),Bethesda,Md.,和Altschul等,(1997)NAR25：3389-3402)。另一优选的比对程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware,PA)，优选使用默认参数。发现有用的另一序列软件程序是SequenceSoftwarePackageVersion6.0中可获得的TFASTADataSearchingProgram(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)。
片段是与本发明的BARD1同工型的各序列在长度上共有至少40%的氨基酸的序列。可以使用这些序列，只要它们展现与它们所源自的天然序列相同的生物学性质，例如拮抗活性。优选的是，这些序列与其所源自的各序列在长度上共有超过70%、优选超过80%特别是超过90%且最优选95%的氨基酸。这些片段可以通过本领域已知的各种方法和技术(例如化学合成)来制备。
本发明还包括BARD1同工型的变体。变体是这样的肽或多肽，它们具有的氨基酸序列在一定程度上不同于天然序列的肽或多肽，它们是通过保守性氨基酸取代而不同于天然序列的氨基酸序列，由此一个或多个氨基酸被具有相同特征和构象作用的另外的氨基酸取代。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置处拥有取代、缺失、侧链修饰和/或插入。此处将保守性氨基酸取代定义为在以下五组中的一组内的交换：
I.小的脂肪族的非极性或轻微极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II.极性的带正电的残基：His、Arg、Lys
III.极性的带负电的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln
IV.大的芳香族残基：Phe、Tyr、Trp
V.大的脂肪族的非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys。
应该理解，一些非常规氨基酸也可以是天然存在的氨基酸的合适的取代物。例如，Lys残基可以被鸟氨酸、高精氨酸、nor-Lys、N-甲基-Lys、N,N-二甲基-Lys和N,N,N-三甲基-Lys取代。Lys残基还可以被合成的碱性氨基酸取代，所述碱性氨基酸包括，但不限于，N-1-(2-吡唑啉基)-Arg、2-(4-哌啶基)-Gly、2-(4-哌啶基)-Ala、2-[3-(2S)吡咯啉基]-Gly和2-[3-(2S)吡咯啉基]-Ala。Tyr残基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、间-Tyr、邻-Tyr、nor-Tyr、1251-Tyr、单卤素-Tyr、二卤素-Tyr、O-磺-Tyr、O-磷-Tyr和硝基-Tyr取代。
Tyr残基还可以被3-羟基或2-羟基异构体(分别为间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-磺-和O-磷衍生物取代。Tyr残基还可以被合成的含有羟基的氨基酸取代，合成的含有羟基的氨基酸包括但不限于4-羟基甲基-Phe、4-羟基苯基-Gly、2,6-二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr。脂肪族氨基酸可以被带有非天然脂肪族支链或直链侧链CnH2n+2的合成衍生物取代，CnH2n+2中n是从1至最多8且包括8的数值。合适的被非常规氨基酸保守性取代的实例在WO02/064740中给出。
插入包括加入一个或多个天然存在的或非常规的氨基酸残基。缺失包括一个或多个氨基酸残基的缺失。
此外，由于天然肽(为L型)的固有问题是被天然酶降解，可以将本发明的生理活性蛋白制备为包括所述肽的D型和/或“逆反异构体(retro-inversoisomers)”。优选的是，制备本发明生理活性蛋白的较短部分的逆反异构体、变体或组合。例如如Sela和Zisman在出版于FASEBJ.1997May;11(6)：449-56的综述中所述，为已知序列的肽制备逆反肽。“逆反异构体”是指直链肽的异构体，其中序列的方向相反并且各氨基酸残基的手性反转，因此可以不存在端基互补。
本发明还包括其中一个或多个肽键已经被备选类型的不容易受肽酶切割影响的共价键代替的类似物(“肽模拟物”)。在注入受试对象之后肽的蛋白水解降解成为问题的情况下，将特别敏感的肽键替换为不可切割的肽模拟物会使所得的肽更稳定，因此作为活性物质更有用。此类模拟物以及将它们引入肽的方法是本领域公知的。
优选的是，所述生物样品选自包含以下样品的组：活组织检查样品、组织学样品、肺液、冷冻组织样品、肿瘤组织样品、粪便样品、脑脊髓液(CSF)、循环肿瘤细胞(CTC)和血液样品，更优选的是受试对象是人类。最优选的是生物样品是源自获自受试对象的血液样品的血清。
检测本发明的BARD1同工型的存在可以通过常规方法进行，例如蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA蛋白检验、蛋白质印迹、分光光度法。BARD1同工型的存在还可以利用常规方法经由其相应的mRNA的存在来检测，所述常规方法例如RNA印迹、核酸酶保护检验(NPA)、原位杂交和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。优选的是，在循环肿瘤细胞(CTC)中检测BARD1同工型特异性RNA的表达。
在本发明的实施方式中，BARD1同工型的存在通过使用对本发明的BARD1同工型具有特异性的抗体来检测。优选的是，所述抗体是与至少一种BARD1同工型特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体或它们的片段，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。还优选的是，所述抗体是与至少一种BARD1同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。优选的是，所述表位是外显子3和4。
优选的是，所述多克隆抗体或单克隆抗体或抗体的所述组合与至少一种BARD1同工型特异性结合，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1和2、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
例如，允许检测本发明的BARD1同工型的抗体为以下抗体：
-N19、C20和H300(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA),
-生成PVC和WSF(外显子4的开始部分)并如之前所述应用(Irminger-FingerI等,MolCell8：1255-66,2001；FekiA等,Oncogene24：3726-36,2005；HayamiR等,CancerRes65：6-10,2005；LiL等,IntJBiochemCellBiol39：1659-72,2007；RedenteEF等,AnticancerRes29：5095-101,2009；FabbroM等,JBiolChem277：21315-24,2002)，
-BL(BethyLaboratories),
-JH2和JH3(Gautier等CancerRsearch,2000),
-PGP(Ryser等,CancerResearch,2000),
-ELS和KPD，由Applicants生产
-MIQ(Irminger-Finger等,JCB1998)
所述检测可以通过免疫组织化学分析进行，并总结于表1中：
-BARD1同工型π应该对N19(或PVC或MIQ)加上或者BL(或WFS)为阳性，并且对JH2为阴性。为了区分同工型π和π’(π-d-2)，可以通过蛋白质印迹中的尺寸(size)来完成。
-BARD1同工型κ应该对BL(或WFS)为阳性，并且对N19(或PVC或MIQ)为阴性。
-BARD1同工型β应该对PGP，以及或者WFS或BL为阳性。为了区分同工型β和β’(β-d-5)，同工型β对ELS为阳性。
-BARD1同工型δ应该对N19为阳性，对PVC(或MIQ)为阴性并且对BL(或WFS)为阴性。
-BARD1同工型γ应该对N19以及任一PVC(或MIQ)为阳性，但对C20(或KPD)为阴性。
β-D-5是同工型β’的别称，pi-D-5是同工型π’的别称。
在本发明的另一实施方式中，所述BARD1同工型的存在通过检测编码至少一种BARD1同工型的mRNA的水平(表达)来检测，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。优选的是，所述mRNA编码至少一种BARD1同工型，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1和2、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。所述mRNA的表达优选在体外在获自受试对象的循环肿瘤细胞(CTC)中进行。
在本发明的另一实施方式中，通过检测获自受试对象的血液样品中，优选血清中对本发明的BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，来检测所述BARD1同工型的存在。优选的是，所述自身免疫抗体是对BARD1同工型π和κ具有特异性的抗体。
在本发明的上下文中，“自身免疫抗体”或“自身抗体”是指针对本发明的BARD1同工型的天然存在的抗体，即使这些BARD1同工型是实际上源自该受试对象，受试对象的免疫系统也将其认为是外源蛋白。因此这些BARD1同工型引发免疫应答。优选的是，所述BARD1同工型是同工型π和κ。
自身免疫抗体可以通过本领域公知的常规免疫检验来检测，例如不同的ELISA技术(使用固定在板表面上的抗体或使用固定在板表面上的抗原来捕获抗体)、放射免疫检验等(见Immunoassay,E.Diamandis和T.Christopoulus,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA,；1996)。用于检测具有特定免疫学特异性的抗体的免疫检验需要使用对所测试的抗体展示有特异性免疫反应性的试剂(抗原)。取决于所述检验的形式，该抗原可以固定在固体支持体上。使要测试抗体的存在的样品(例如血液样品)与该抗原接触，并且如果所需免疫特异性的抗体存在于该样品中，它们会与该抗原免疫反应，从而形成之后可被检测或被定量测定的抗体-抗原复合物。
因此根据本发明的实施方式，通过检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，来检测BARD1同工型的存在，其中使用选自包含SEQIDNO：13–80的组中的至少一种抗原(肽)、优选至少四种抗原(肽)以检测对所述BARD1同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。所述BARD1同工型选自包含同工型α、β、β’、η、γ、ε、δ、θ、π、π’和κ的组。优选的是，所述BARD1同工型选自包含同工型β、β’、δ、γ、π、π’和κ的组。更优选的是，所述BARD1同工型选自包含同工型β、π和κ的组。最优选的是，所述BARD1同工型选自包含同工型π和κ的组。自身免疫抗体的检测优选在体外对获自受试对象的血液样品、优选血清进行。
更优选的是，BARD1同工型是对肺癌和结直肠癌具有特异性的同工型π和κ，抗原选自包含SEQIDNO：16、17、18、23、59-67、68、69、74、75、76-80的组。最优选的是，抗原选自包含SEQIDNO：16、17、18、23、68、69、74和75的组。
在一个实施方式中，本发明提供选自包含SEQIDNO：13～80的组中的肽以用于检测本发明的BARD1同工型的存在的方法。
申请人已经发现，选自包含SEQIDNO：13～80的组中的抗原也可以通过检测对选自包含同工型α、β、β’、η、γ、ε、δ、θ、π、π’和κ的组中的BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，而用于检测选自乳癌、卵巢癌、前列腺癌、成神经细胞瘤和白血病的其它癌症。例如，选自包含SEQIDNO：13、14、15、23、59-67、69、70、75-80的组中的抗原可用于检测乳癌、卵巢癌和前列腺癌。
因此在另一实施方式中，本发明提供选自包含SEQIDNO：13～80的组中的肽，所述肽在检测获自受试对象的生物样品中BARD1同工型的存在的方法中用作抗原，其中通过检测对所述BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在来检测所述BARD1同工型的存在，并且其中所述BARD1同工型在所述样品中的存在是所述患者罹患癌症的标志。所述BARD1同工型选自包含同工型α、β、β’、η、γ、ε、δ、θ、π、π’和κ的组。
应该将至少一种抗原用于检测对BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在。优选使用至少4种抗原，更优选使用4～10种抗原，最优选使用4～6种抗原。
还可以将本发明的抗原与阴性对照样品(健康对照血液样品)接触以获得基线，这有助于区分癌症受试对象与健康受试对象(参见实施例–肺癌患者血液中抗-BARD1自身免疫抗体的检测)。可选的是，还可以将本发明的抗原与阳性对照样品(已确认的癌症血液样品)接触以获得明确的阳性结果。
在另一实施方式中，可以将来自受试对象的血液样品与本发明的BARD1同工型(优选同工型π和κ)或其片段接触。然后可以检测自身免疫抗体和所述BARD1同工型之间的特异性结合，从而基于自身免疫抗体和所述BARD1同工型之间的特异性结合的量确定肺癌和/或结直肠癌的存在或不存在。自身免疫抗体的检测优选在体外对获自受试对象的血液样品、优选血清进行。
作为另一选择，根据本发明的实施方式，本发明的BARD1同工型的存在通过以下方式来检测：
检测编码至少一种BARD1同工型的mRNA的水平，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和
检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，并且其中使用选自包含SEQIDNO：13–80的组中的至少四种抗原以检测对所述BARD1同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
本发明还提供了一种在本发明的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQIDNO：1、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列；还提供一种在本发明的方法中用作生物标志物的分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含SEQIDNO：2、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列。
本发明还提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段与BARD1同工型π上的SEQIDNO：143(DTKSRNEVVTPIKGDIPSVEYLLQNGS)所示的表位结合。优选的是，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQIDNO：144(NEVVTPIKGDIPSVEY)所示的表位结合。
本发明还提供一种在用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQIDNO：143所示的表位结合。优选的是，本发明提供一种在用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的抗体或其片段，所述抗体或其片段与SEQIDNO：144所示的表位结合。
本发明还包括在用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的、与至少一种BARD1同工型特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体或它们的片段，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，并且其中不包括以下抗体：N19、C20、H300、PVC、WSF、BL、JH2、JH3、PGP、ELS、KPD、MIQ。
本发明还包括在用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的、与至少一种BARD1同工型的不同表位特异性结合的抗体或或其片段的组合，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，并且其中不包括以下抗体：N19、C20、H300、PVC、WSF、BL、JH2、JH3、PGP、ELS、KPD、MIQ。
本发明的抗体还可用于检测受试对象的组织样品、受试对象的体液或受试对象的血液中的循环细胞中的BARD1同工型，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
优选的是，所述多克隆抗体或单克隆抗体或抗体的所述组合与至少一种BARD1同工型特异性结合，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1和2、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
如本文所用，术语“抗体”是指具有特定结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体(例如本发明的BARD1同工型)的抗原或与与其密切相关的抗原相互作用(即，结合)。此外，抗体可以是抗体的片段或经修饰的抗体，只要其与标志物基因编码的一种或多种蛋白结合即可。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv(scFv)，其中来自重链和轻链的Fv片段通过合适的接头连接(HustonJ.S.等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-83.)。更具体而言，抗体片段可以通过用酶(包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理抗体来产生。作为另一选择，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体中并在合适的宿主细胞中表达(参见，例如CoM.S.等,(1994)J.Immunol.152：2968-76；BetterM.和HorwitzA.H.(1989)MethodsEnzymol.178：476-96.；PluckthunA.andSkerraA.(1989)MethodsEnzymol.178：497-515.；LamoyiE.(1986)MethodsEnzymol.121：652-63.；RousseauxJ.等,(1986)MethodsEnzymol.121：663-9.；BirdR.E.和WalkerB.W.(1991)TrendsBiotechnol.9：132-7.)。
抗体可以通过与各种分子，例如聚乙二醇(PEG)缀合而进行修饰。可以通过对抗体进行化学修饰而获得经修饰的抗体。此类修饰方法在本领域是常规的。
作为另一选择，抗体可以包括嵌合抗体或人源化抗体，所述嵌合抗体具有来自非人类抗体的可变区和来自人类抗体的恒定区，所述人源化抗体包含来自非人类抗体的互补决定区(CDR)、来自人类抗体的框架工作区(FR)和恒定区。此类抗体可以通过使用已知技术制备。人源化可以通过用啮齿动物的一个或多个CDR序列取代人类抗体的对应序列来进行{参见，例如Verhoeyen等,(1988)Science239：1534-6)。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人类物种的对应序列替代。还可以使用包含除人类框架区和恒定区之外的人类可变区的全长人抗体。此类抗体可以使用本领域已知的各种技术生产。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.MoI.Biol.227：381-8)。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物(例如小鼠)中来制造。该方法例如描述于美国专利6,150,584、5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016中。此类抗体可以通过使用已知技术制备。
本发明还提供一种在用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的重组siRNA分子，所述重组siRNA分子与单链或双链RNA分子结合，其中所述单链或双链RNA分子包含编码至少一种BARD1同工型的mRNA，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，由此所述BARD1同工型的表达受到抑制。
优选的是，所述mRNA编码至少一种BARD1同工型，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1和2、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，siRNA(RNA干扰或小干扰RNA)抑制或减少BARD1同工型的表达。优选的是，所述同工型是π、π’、κ、β、β’、δ和γ，更优选π、κ、β，最优选π和κ。此处，术语“siRNA”是指阻止靶mRNA的翻译的双链RNA。通常，siRNA包括针对一种或多种BARD1同工型的表达的正义核酸序列和反义核酸序列，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
通常，siRNA可以是分离的。“分离的”siRNA是从其起始环境中取出的siRNA。例如，如果将siRNA克隆到不是天然环境的一部分的载体中时，则认为该siRNA是分离的。
siRNA可以完全通过合成来构建并由两个互补单链RNA组成，或者通过生物合成来构建。将siRNA构建成兼具来自靶基因的正义序列和互补的反义序列的一个转录物(例如单发夹RNA或shRNA)。可以使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中将DNA作为转录RNA的模板的技术。
通常，siRNA与单链RNA分子结合，其中所述单链RNA分子包含编码至少一种BARD1同工型的mRNA，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，该siRNA通过与正常的单链mRNA转录物结合，由此干扰BARD1同工型的翻译并进而干扰其表达。因此，本发明的siRNA分子可以通过它们与编码至少一种BARD1同工型的mRNA或cDNA特异性杂交的能力来定义，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，siRNA的长度优选小于500个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷酸，还更优选小于50个核苷酸，或最优选小于25个核苷酸。更优选的是，siRNA的长度为约19～约25个核苷酸。为了增强siRNA的抑制活性，可以向靶序列的反义链的3′端添加一个或多个尿嘧啶核苷酸(″u″)。待添加的″u″的数量为至少2，通常为2～10，优选为2～5。添加的″u″在siRNA的反义链的3′端处形成单链。
本发明的siRNA可以以能够与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞中。在这些实施方式中，如本领域已知，通常对本发明的siRNA分子进行修饰。其它修饰也是可行的，例如胆固醇-缀合的siRNA已经显示出改善的药理学性质。Song等,NatureMed.9：347-51(2003)。作为另一选择，编码siRNA的DNA可以携带在载体中。
已经鉴定出数种有用的siRNA。例如外显子9中的siRNA(请参见图1A和图4E)是有效的，并引起增殖阻滞。在另一实例中，使用外显子4内的siRNA对于BARD1同工型π是重要的(参见图17)。一些有用的siRNA为：
K34：CATTCTGAGAGAGCCTGTG(SEQIDNO.107)
K423：GTGCTCAGCAAGACTCATA(SEQIDNO.108)
K401：AAGTCTCTTTACCATTGGCTG(SEQIDNO.109)
K78：AAGTGTATGCTTGGGATTCTC(SEQIDNO.110)
本发明还提供一种在用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的方法中使用的BARD1同工型的生物活性的调节剂，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。优选的是，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1和2、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
BARD1同工型的生物活性的调节剂可以是竞争剂。优选的是，所述竞争剂是能够扰乱所述BARD1同工型与其受体之间的相互作用的化合物。例如，所述竞争剂还可以是抑制剂或拮抗剂。术语“抑制剂”或“拮抗剂”是指通过与蛋白或多肽结合抑制蛋白或多肽的功能的分子。诸如抑制剂或拮抗剂等竞争剂，可以直接抑制本发明的BARD1同工型与其天然配体和/或受体之间的相互作用，导致受体的生化或生物功能扰乱。竞争性抑制是其中抑制剂的结合阻止了配体的结合(反之亦然)的抑制形式。在竞争性抑制中，抑制剂与天然配体结合相同的活性位点，而无需引起反应。当抑制剂在活性位点时配体分子不能进入活性位点，并且当配体在该位点时抑制剂不能进入该位点。蛋白的“生物活性或功能”是指进行多样性细胞功能或特异性紧密结合其它分子的能力。
同样在本发明的上下文中，本发明的BARD1同工型的生物活性的调节剂优选可以是调节基因表达的微RNA(miRNA)。申请人发现BARD1可以是许多微RNA的靶标。特异性微RNA的外源性表达抑制BARD1表达(参见图18)。更优选的是，在本发明的上下文中，微RNA选自包含以下微RNA的组：hsa-mir-10aMI0000266：(SEQIDNO.111)；hsa-mir-10bMI0000267(SEQIDNO.112)；hsa-mir-130aMI0000448(SEQIDNO.113)；hsa-mir-130bMI0000748(SEQIDNO.114)；hsa-mir-134MI0000474(SEQIDNO.115)；hsa-mir-144MI0000460(SEQIDNO.116)；hsa-mir-148aMI0000253(SEQIDNO.117)；hsa-mir-148bMI0000811(SEQIDNO.118)；hsa-mir-152MI0000462(SEQIDNO.119)；hsa-mir-181a-2MI0000269(SEQIDNO.120)；hsa-mir-181a-1MI0000289(SEQIDNO.121)；hsa-mir-181b-1MI0000270(SEQIDNO.122)；hsa-mir-181b-2MI0000683(SEQIDNO.123)；hsa-mir-19aMI0000073(SEQIDNO.124)；hsa-mir-19b-1MI0000074(SEQIDNO.125)；hsa-mir-19b-2MI0000075(SEQIDNO.126)；hsa-mir-203MI0000283(SEQIDNO.127)；hsa-mir-301aMI0000745(SEQIDNO.128)；hsa-mir-301bMI0005568(SEQIDNO.129)；hsa-mir-452MI0001733(SEQIDNO.130)；hsa-mir-454MI0003820(SEQIDNO.131)；hsa-mir-517aMI0003161(SEQIDNO.132)；hsa-mir-517cMI0003174(SEQIDNO.133)；hsa-mir-553MI0003558(SEQIDNO.134)；hsa-mir-570MI0003577(SEQIDNO.135)；hsa-mir-576MI0003583(SEQIDNO.136)；hsa-mir-579MI0003586(SEQIDNO.137)；hsa-mir-580MI0003587(SEQIDNO.138)；hsa-mir-613MI0003626(SEQIDNO.139)；hsa-mir-618MI0003632(SEQIDNO.140)。
通常微RNA是短的核糖核酸(RNA)分子，具有至少约22个核苷酸，优选约60～约100个核苷酸，其可以与靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列结合，通常引起翻译抑制或靶标降解和基因沉默。
本发明还包括一种将肺癌和结直肠癌与妇科癌症区分的方法，所述方法包括检测获自受试对象的生物样品中至少一种对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的步骤，所述BARD1同工型选自包含以下同工型的组：
同工型π，同工型π包含SEQIDNO：1、其生物活性片段或与SEQIDNO：1具有至少95%同源性的序列，和
同工型κ，同工型κ包含SEQIDNO：2、其生物活性片段或与SEQIDNO：2具有至少95%同源性的序列，
其中，所述对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在是肺癌和/或结直肠癌的标志。
用于将肺癌和结直肠癌与妇科癌症区分的另一特征是BARD1同工型α在肺癌和结直肠癌中不存在。从PCT/EP2008/053881已知BARD1同工型α的氨基酸序列。因此可选的是，所述方法还包括检测所述样品中BARD1同工型α、其生物活性片段或与BARD1同工型α具有至少95%同源性的序列，其中所述BARD1同工型α的不存在是所述受试对象胃未罹患肺癌和/或结直肠癌的标志。
优选的是，妇科癌症是女性生殖系统的一组不同的恶性肿瘤。最常见类型的妇科恶性肿瘤是子宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜(子宫)癌。还存在其它较不常见的妇科恶性肿瘤，包括阴道癌、外阴癌、妊娠滋养细胞肿瘤和输卵管癌。在本发明的上下文中，乳癌也包括在妇科癌症中。
本发明还提供一种用于检测获自受试对象的样品中对肺癌和结直肠癌具有特异性的BARD1同工型的存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码至少一种BARD1同工型的多核苷酸具有特异性，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段和/或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或
与至少一种所述BARD1同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，和/或
至少一种选自包含SEQIDNO：13～80的组中的肽。
优选的是，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-22、其生物活性片段或与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列。
编码至少一种BARD1同工型的多核苷酸是包含以下核酸序列的多核苷酸：选自包含SEQIDNO：8(同工型π)、SEQIDNO：9(同工型κ)、SEQIDNO：10(同工型β)、SEQIDNO：11(同工型δ)、SEQIDNO：12(同工型γ)、SEQIDNO：141(同工型π’)、SEQIDNO：142(同工型β’)的组中的核酸序列；优选的是选自包含SEQIDNO：8和9的组中的核酸序列。
引物、探针和/或抗体可以以试剂盒的形式与其它需要的检测试剂一起包装。例如，它们可以包装在分开的容器中，例如核酸或抗体(与固体基质结合或者与用于将它们结合至所述基质的试剂分开包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)和/或可检测标记。试剂盒中还可以包括用于进行所述检测的说明(例如，书面形式、磁带、VCR、CD-ROM等)。
本发明还包括疫苗和免疫方法。例如，治疗或预防罹患肺癌和/或结直肠癌的受试对象中的肺癌和/或结直肠癌的方法可以包括对受试对象施用疫苗组合物，所述组合物包含：
一种或多种BARD1同工型或其免疫活性片段，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-7、105-106、其生物活性片段、与SEQIDNO：1-7、105-106具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，
或一种或多种选自包含SEQIDNO：13～80的组中的肽(抗原)。
优选的是，所述BARD1同工型包含选自包含SEQIDNO：1-2、其生物活性片段、与SEQIDNO：1-2具有至少95%同源性的序列的组中的氨基酸序列，并且所述肽选自包含SEQIDNO：16、17、18、23、59-67、68、69、74、75、76-80的组中。
在本发明的上下文中，免疫活性片段是长度上比天然存在的全长蛋白短的多肽，例如BARD1同工型之一，其诱导与全长蛋白所诱导的免疫应答类似的免疫应答。例如，免疫活性片段应该在长度上为至少8个残基，并且能够刺激免疫细胞，例如T细胞或B细胞。免疫细胞刺激可以通过检测细胞增殖、细胞因子(例如IL-2)的详情或抗体的产生来检测。参见，例如Harlow和Lane,UsingAntibodies：ALaboratoryManual,1998,ColdSpringHarborLaboratoryPress；和Coligan,等,CurrentProtocolsinImmunology,1991-2006,JohnWiley&Sons。
本发明还包括一种用于治疗或预防罹患肺癌和/或结直肠癌的受试对象中的肺癌和/或结直肠癌的药物组合物，其中所述组合物包含药学上有效量的本发明的抗体。
本发明还包括一种用于治疗或预防罹患肺癌和/或结直肠癌的受试对象中的肺癌和/或结直肠癌的药物组合物，其中所述组合物包含药学上有效量的本发明的siRNA。
本发明还包括一种用于治疗或预防罹患肺癌和/或结直肠癌的受试对象中的肺癌和/或结直肠癌的药物组合物，其中所述组合物包含药学上有效量的本发明的调节剂。优选的是，所述调节剂是微RNA，其调节基因表达。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施。需要治疗的对象包括已经罹患疾病，如肺癌和/或结直肠癌的对象，以及要预防所述疾病的对象。因此，本文要治疗的哺乳动物，优选人类可以已经诊断为具有所述疾病或可以倾向于患有有所述疾病或对所述疾病易感，所述疾病例如肺癌和/或结直肠癌。
如本文所用的“预防”是指施用本发明所述的调节剂、siRNA和/或抗体从而减少对肺癌和/或结直肠癌有高风险的受试对象将来确实发展成所述癌症的可能性或概率。
“药学有效量”是指当对人类或动物生物体施用时活性成分(例如化学或生物材料)诱导可检测的药理学和/或生理学效应。
各药学有效量可以取决于待治疗的具体受试对象、取决于待治疗的疾病和取决于施用方法。治疗通常包括多次施用药物组合物，通常间隔为数小时、数天或数周。诸如抗体、siRNA或调节剂等本发明的活性成分的剂量单位的药学有效量，通常为0.001ng～100mg每千克待治疗受试对象的体重。应该理解，本发明活性成分的合适剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康和体重、同时存在的治疗的种类(如果有的话)和所期望效果的性质。
对于全身施用，治疗有效量或剂量可以最初由体外检验评估。例如，可以在动物模型中配制药剂以达到包括如细胞培养所确定的IC50在内的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人类中的有用剂量。
初始剂量还可以使用本领域公知的技术从体内数据(例如动物模型)评估。本领域普通技术人员能够基于动物数据容易地对对人类的施用进行优化，并且当然会取决于待治疗的受试对象、取决于受试对象体重、疾病严重性、施用方式和处方医师的判断。
在用于本发明时，“施用”是指将药物组合物与受试对象，优选人类接触。
可以将药物组合物溶解于或分散于本领域技术人员公知的药学上可接受的载体中，以用于进行胃肠外施用，例如通过静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射或通过静脉内滴注进行胃肠外施用。
对于胃肠外施用的药物组合物，可以使用任何常规添加剂，例如赋形剂、佐剂、粘合剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、稀释剂、吸收增强剂、缓冲剂、表面活性剂、加溶剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、注射用增溶剂、pH调节剂等。
药学上可以使用的有助于将活性化合物加工至制剂的可接受的载体、稀释剂和佐剂在所用的剂量和浓度时对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、邻丁基苄基醇(butylorbenzylalcohol)；烷基对羟基苯甲酸酯，例如甲基对羟基苯甲酸酯或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子(counter-ion)，例如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENPLURONICS或聚乙二醇(PEG)。
药物组合物的施用形式可以是全身的或局部的。例如，此类药物组合物的施用可以是各种胃肠外途径，例如皮下、静脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、鼻内、透皮、口腔途径或经由植入装置，并且还可以通过蠕动装置递送。
还可以将包含本发明的活性成分的药物组合物引入或浸渍到生物可吸收的基质中，所述基质以基质悬浮液、凝胶或固体载体的形式施用。此外，基质还可以由生物聚合物组成。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，该基质为成型制品，例如膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRONDEPOT(TM)(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)等降解性乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这容易地实现，例如通过无菌过滤膜进行过滤而实现。
本领域技术人员会意识到，本文描述的本发明容易进行除具体所述的那些之外的改变或变型。应该理解，本发明包括所有此类改变或变型而无需背离其精神或基本特征。本发明还包括说明书中指出或指明的所有步骤、特征、组合物和化合物，无论是单独的还是全体的，以及所述步骤或特征的任意两种以上的任何组合和所有组合。因此认为本公开内容是所列举的所有方面，而不是限制性的，本发明的范围由所附权利要求指明，并且在等效含义和范围内的所有变化都意图包括在内。
参照以下实施例会更全面地理解以上描述内容。但是，此类实施例是实施本发明的方法的示例，而不是意图限制本发明的范围。
实施例
I-患者–肺癌
在两个中心收集来自100个NSCLC患者的肿瘤组织(表1)。所有患者都从当地伦理委员会获得知情同意。使用8个具有良性肺疾病的病例(5名男性和3名女性，年龄从24～66岁(中值年龄，38岁))；5个肺气肿病例，剩下的是肺结核和类癌发育异常(carcinoiddysplasia))作为BARD1表达的对照样品。
从Napoli获得60名病人中48名的随访记录，随访从1个月～69个月；围手术期中两名患者死亡，并且有10名患者未获得数据。48名具有随访记录的患者中，仅17名通过外科手术治疗，4名在外科手术后用化疗治疗，一名在外科手术后用化疗和放疗治疗，7名患者用化疗和放疗治疗，4名仅用化疗治疗，1名仅用放疗治疗，剩下的14名至最后一次随访或死亡为止未进行治疗。这48名患者中，35名死亡，13名在最后一次随访期间仍然存活。
来自Cagliari的40名患者中的17名有随访记录；随访从5个月～95个月；11名患者在最后一次随访期间(2010年3月)仍然存活，并且6名患者死亡。从外科手术、开始化疗或放疗之日，或者未进行治疗的患者的诊断之日起至最后一次随访或死亡为止计算总存活。
表1.患者特征–肺癌
患者特征–结直肠癌
基于WHO标准由有经验的病理学家进行病理学诊断，并根据美国癌症分期联合委员会进行分期。所有患者都知情和依从，并获得当地伦理委员会的批准。
检查了总共168个具有结直肠癌的病例，包含20个来自Cagliari的病例和148个来自德国的病例(表2)。将来自Cagliari的20个病例(包括肿瘤组织样品和它们周围的形态学正常的组织(肿瘤周围)样品)用于逆转录酶PCR检测。将来自德国的148个具有结直肠癌的病例用于组织阵列的免疫组织化学分析。这168个病例由106个结肠癌和62个直肠癌组成，它们都是腺癌。患者是93名男性和75名女性，诊断时的年龄为33岁～78岁(中值年龄，61岁)。21名患者具有I期疾病，34名具有II期，50名具有III期，23名具有IV期；剩余的40名患者为未知的分期，因为不能对原发肿瘤或/和区域性淋巴结或/和远端转移进行评估。10名患者具有良好分化(G1)的肿瘤，116名具有中等分化(G2)的肿瘤，38名具有不良分化(G3)的肿瘤；剩余的2名患者未分级(GX)。
用于免疫化学染色的切片是组织微阵列，每个病例一式四份。148个病例中的75个具有随访记录，随访从1个月～72个月，并且剩余的73名患者没有存活数据。具有随访记录的这75名患者中，22名死亡，48名失踪，5名在最后一次随访期仍存活。
表2.结直肠癌的患者特征
免疫组织化学
用针对BARD1的不同区的抗体和针对BRCA1的抗体对相邻的切片进行免疫组织化学分析。
针对所用BARD1的不同区(即N19(外显子1)(sc-7373)和C20(外显子11)(sc-7372))的抗体购自SantaCruz(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)，如之前所述生产和应用PVC(外显子3)和WSF(外显子4的开始部分)(Irminger-FingerI等,MolCell8：1255-66,2001；FekiA等,Oncogene24：3726-36,2005；HayamiR等,CancerRes65：6-10,2005；LiL等,IntJBiochemCellBiol39：1659-72,2007；RedenteEF等,AnticancerRes29：5095-101,2009；FabbroM等,JBiolChem277：21315-24,2002)。针对BRCA1的抗体来自SantaCruz(D16；SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)。通过使用缀合有HRP的第二抗体(山羊抗兔或兔抗山羊)，以1：100稀释液在室温下应用1小时，将染色可视化。DAB染色在室温下进行2分钟～15分钟。在脱水和封片之前用苏木精对载玻片进行复染色。为了确定灵敏度和特异性，进行免疫组织化学分析，省去对照切片上的第一抗体。为了将BARD1或BRCA1的表达定量，对于每个肿瘤切片选择4个不同的区；将阳性细胞百分比和染色强度组合来计算各样品的平均分数。三个无任何临床数据知识的人独立地进行该定量。
对于在具有诱导的肺癌的小鼠上进行的免疫组织化学分析，在16、24和32周后处死经治疗的小鼠和年龄匹配的未经治疗的小鼠，并且通过使用抗体PVC、WFS和C20的免疫组织化学分析对两只对照小鼠和三只荷瘤小鼠进行肿瘤解剖和分析。如对人类样品所述那样进行分析和定量。
将福尔马林固定并且石蜡包埋的5μm组织切片在二甲苯中脱石蜡，并通过浓度递减的乙醇(100%醇、95%醇、70%醇、dH2O)进行复水。在微波中使切片沸腾5分钟以进行抗原修复，并且内源性过氧化物酶被封闭。在将非特异性表位进行BSA(牛血清白蛋白)封闭后用第一抗体将载玻片在加湿室中在4℃温育过夜。用于BARD1检测的第一抗体是N19(sc-7373,SantaCruzBiotechnology)(1：25稀释)、PVC(1：100稀释)、WFS(1：100稀释)和C20(sc-7372,SantaCruz,CA)(1：20稀释)，它们分别识别外显子1、3、4和11中的表位；BRCA1抗体是C20(sc-642,SantaCruzBiotechnology)(1：100稀释)，识别BRCA1C-端表位。将缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的第二抗体(山羊抗兔或兔抗山羊)在室温下以1：100的稀释液应用1小时。然后在室温下使二氨基联苯胺(DAB)染色进行最大15分钟。在脱水和封片之前用苏木精对载玻片复染色。为了确定灵敏度和特异性，进行免疫组织化学分析，省去对照切片上的第一抗体。
半定量地测量BARD1和BRCA1的表达水平。使用染色肿瘤细胞的强度和百分比对染色进行评分。染色强度和阳性细胞百分比的值相乘以获得最终的染色分数。各抗体的总染色分数为0～100，25以下的染色分数是明确的阴性染色(“-”)，大于25是明确的阳性染色(“+”)，并且根据总染色分数大于25～50、大于50～75和大于75来区分为“+”、“++”和“+++”。对于统计学分析，仅考虑阳性情况和阴性情况，除了使用染色分数的不同抗体染色的相关性之外。对于各肿瘤切片选择了4个不同的区，并由不具有临床数据知识的三名观察者(Y,Z；L,L和J,W)独立地评分。
RNA/RT-PCR分析
进行RT-PCR以定量地确定不同同工型的表达和研究其结构。使用Trizol试剂从冷冻组织切片中分离RNA。添加氯仿(0.1ml)并在4℃在14,000g将样品离心15分钟以分离各相。将水相转移到不含RNA酶的Eppendorf管，加入等体积的异丙醇以进行RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤RNA球团，并将其溶解在20μl不含RNA酶的水中。测定浓度从而确定D260/D280比为至少1.8。
对于逆转录，在21μl含有1μldNTPs(10mM)、1μl寡dT、2μlDTT(0.1M)、4μl第一标准缓冲液和1μlSuperscriptII的逆转录酶缓冲液中使用1μg的RNA。在65℃反应5分钟，然后在42℃反应2分钟，在42℃反应50分钟，并在70℃反应15分钟。使用2μlcDNA作为使用不同引物的PCR的模板。
使用引物5’-ACAAGCGCCAGAGAGATGAT-3’(SEQIDNO：81)和5’-GATGTGGGAGAGGATGAGGA-3’(SEQIDNO：82)采用56℃的退火温度和1分钟的延伸时间将雌激素受体α(ERα)扩增。使用引物5’-AGCCACATCGCTCAGACACC-3’(SEQIDNO：83)和5’-GTATCTAGCGCCAGCATCG-3’(SEQIDNO：84)将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)扩增作为内部对照。在含有0.1μg/ml溴化乙锭(EtBr)的琼脂糖/TBE凝胶(对于FL为0.8%，对于其它为1%)上使用相同体积的PCR产物，以分析相同大小片段的BARD1(对于外显子1-11为20μl，对于外显子1-4为10μl，对于其它为5μl)并在紫外光下可视化。
在补充有溴化乙锭的1%琼脂糖/TAE凝胶上对PCR产物(10μl)进行分析并在紫外光下使其可视化。对于引物和条件的完整列表请参见表3。
将QIAEXII试剂盒(Qiagen,Hombrechtikon,瑞士)用于DNA纯化。用内部BARD1引物进行测序。
表3
PCR的图像分析
通过ImageJ，基于Java的图像处理软件(NationalInstitutesofHealth,http：//rsbweb.nih.gov/ij/)处理图像。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色来可视化并拍照。在转化成分析用灰度之前将图像保存为JPG文件。在ImageJ中打开图像，在测量前对于各图像将校准功能设定为未校准的OD。使用矩形工具来画出区域以测定相同尺寸的PCR带。基于调整矩形的面积，使用在样品中与目的带尺寸接近的DNA梯度中相同尺寸的带来在不同凝胶中获得相对精确的值。勾画出(outlined)峰的面积。将作为曲线下总面积的百分比的峰面积比例用于统计分析。
总RNA提取、逆转录和PCR
进行RT-PCR以定量地显示不同同工型的表达和以确定其结构。根据RNA分离规程使用Trizol试剂从冷冻组织切片分离RNA。添加氯仿(0.1ml)并在4℃在14,000g将样品离心15分钟以分离各相。将水相转移到不含RNA酶的Eppendorf管，加入等体积的异丙醇以进行RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤RNA球团，并将其溶解在20μl不含RNA酶的水中。测定浓度从而确定D260/D280比为至少1.8。
对于逆转录，以含有M-MLVRT5x反应缓冲液5μl、2μl寡dT(500μg/ml)、1.5μl10mMdNTP’s、RecombinantRNasin核糖核酸酶抑制剂1μl(25u/μl)和1μl的M-MLV逆转录酶(200u/μl)的25μl终体积使用1.5μg的RNA。温育反应：在70℃下5分钟，然后42℃下60分钟，和70℃下10分钟。使用3μlcDNA作为FLBARD1扩增用模板，将2μlcDNA用于BARD1的各种片段的扩增。以50μl的终体积利用Taq聚合酶进行PCR。对于所有PCR反应，起始变性(94℃，2分钟)和最终延伸(72℃，10分钟)都相同。根据不同引物和预期的BARD1产物的长度，退火温度和延伸时间是可变的(表3)。
使用引物5’-ACAAGCGCCAGAGAGATGAT-3’(SEQIDNO：81)和5’-GATGTGGGAGAGGATGAGGA-3’(SEQIDNO：82)采用56℃的退火温度和1分钟的延伸时间将雌激素受体α(ERα)扩增。使用引物5’-AGCCACATCGCTCAGACACC-3’(SEQIDNO：83)和5’-GTATCTAGCGCCAGCATCG-3’(SEQIDNO：84)将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)扩增作为内部对照。将相同体积的PCR产物加载到在含有0.1μg/ml溴化乙锭(EtBr)的琼脂糖/TBE凝胶(对于FL为0.8%，对于其它为1%)上，以在紫外光下将BARD1的片段(对于外显子1-11为20μl，对于外显子1-4为10μl，对于其它为5μl)可视化。
根据制造商说明使用QIAEXII试剂盒(Qiagen,Hombrechtikon,瑞士)进行RT-PCR产物的DNA纯化，然后使用用于PCR的正向引物和反向引物或片段内的其它引物(如果未产生重叠序列)进行测序。
小鼠模型
如RedenteEF,Dwyer-NieldLD,BarrettBS,等(LungtumorgrowthisstimulatedinIFN-gamma-/-miceandinhibitedinIL-4Ralpha-/-mice，AnticancerRes29：5095-101,2009)所述在BALB/c小鼠中化学诱导肺肿瘤。用1mg尿烷每克体重对6周～8周龄的雄性小鼠进行腹膜内注射，每周一次，连续7周。处理后16、24和32周处死小鼠。解剖肺组织和肿瘤，并进行处理以用于免疫化学分析。每个时间点分析来自3只小鼠的组织。
统计分析
施用斯皮尔曼相关系数ρ来评估BARD1的表达水平和BRCA1表位之间的相关性。使用χ2检验来比较肿瘤组织和肿瘤周围组织中阳性例的百分比和BARD1表达的阳性例与临床变量的相关性。采用T检验来测定BARD1表达水平与临床变量的相关性。对于与存活的关联，将患者根据其BARD1表达水平进一步分为两个组。使用Kaplan–Meier法来评估存活差异，并通过对数秩检验来进行比较。对于所有计算，检验是双向的，并且认为P<0.05的值具有统计学显著性。使用StatisticalPackagefortheSocialSciences(SPSS)forWindowsversion13(SPSSInc,Chicago,IL)进行分析。
II-结果
对肿瘤切片进行免疫组织化学分析，包括来自100个患者的不同类型、级别和阶段(表1)。使用识别BARD1的4个不同表位(定位到外显子1、3、4和11)的抗体，理论上其可以产生16种不同的染色模式。令人惊奇的是，仅观察到少数不同的模式，并且在多数肿瘤中观察到针对所有4种抗体的染色(图1A-E)。相邻切片的染色显示，不同表位在肿瘤切片的不同区中和在不同的亚细胞区室中表达(图1B-D)，表明BARD1的不同同工型在单个的肿瘤中表达。通常，BARD1-N19(外显子1)和C20(外显子11)显示细胞质颗粒状染色，并且共定位于肿瘤的相同区。BARD1PVC(外显子3)和WFS(外显子4)免疫染色是弥漫性的并且位于细胞质中。染色的强度和细胞内定位的这些差异表明，所有4种表位的表达不反映野生型BARD1的表达，而是不同同工型的同时表达。
N19和C20的表达水平彼此强相关，与PVC和WFS的情况一样(图1F)，但其它抗体染色模式不相关。因此可以总结出N端和C端截短形式、以及具有内部缺失的形式在NSCLC中表达。具体而言，WFS(外显子4的5’末端)染色在许多肺癌中上调，与卵巢癌所观察到的表位表达模式(WFS染色稀少)相反。
研究了相邻组织切片中BRCA1和BARD1的共表达(图1B-D)。BRCA1在66.7%的NSCLC样品中表达，但其不与任何BARD1表位的表达相关。由于BRCA1不与BARD1共表达，这些数据表明BRCA1-BARD1异二聚体的功能在NSCLC中丧失。
观察到肿瘤组织和肿瘤周围组织中的BARD1表达，不过在肿瘤中上升的更多(图2A；图5)。在来自女性患者的肿瘤中的表达通常比来自男性患者的肿瘤中表达更高(图2B)。
特异性BARD1表位的表达在腺癌中比在非腺癌(包括鳞状细胞癌和大细胞癌)中频率低(图2C)。但是，未发现抗体染色与肿瘤级别和阶段的相关性(数据未示出)。
还对在具有随访数据的65名患者中BARD1表达的各个表位和表达模式以及无病存活(DFS)和总存活(OS)进行了评价。具有单独PVC和WFS阳性染色的患者比阴性染色的患者具有显著更短的DFS和更短的OS。更重要的是，具有PVC和WFS同时阳性染色模式的患者与具有不同组合的患者相比显示出非常短的存活。在N19、C20和其它染色模式与DFS或OS之间未观察到相关性。
进行采用Cox的比例危险度模型的单变量分析和多变量分析，以评价所分析的标志物是否具有独立的预后意义。在单变量分析中，病理学阶段也显示了DFS和OS的预测(表5)。将病理学阶段和另两种可能的预后因素，组织类型和患者性别，输入多变量模型中。该后一种分析表明，单独的PVC和WFS阳性染色、PVC和WFS同时阳性染色模式、以及病理学阶段对于DFS和OS都保留了独立的预后意义(表5)。
表4.具有随访数据的65名NSCLC患者中存活的单变量分析。
注意：HR，危险度比；95%CI，95%置信区间；P,P值；pos,阳性染色；neg,阴性染色。AC，腺癌；非AC，包括鳞状细胞癌和大细胞癌；其它，所有其它组合。
表5.具有随访数据的65名NSCLC患者中存活的多变量分析。
注意：HR，危险度比；95%CI，95%置信区间；P，P值；pos,阳性染色；neg，阴性染色。AC，腺癌；非AC，包括鳞状细胞癌和大细胞癌；其它，所有其它组合。*在模型中对于所有其它预测因素(病理学、阶段和性别)调整的HR
在本发明的另一实例中，显示了BARD1同工型与肺癌的起始和发展的相关性，其中监视在经实验诱导的肺癌中的BARD1表达。将尿烷多次注射到BALB/c小鼠中诱导原发性肺肿瘤，并发展到腺癌。该处理引起在16周引起肉眼可见的肿瘤，它们在24周变大，并在32周后侵入正常邻近组织。选择所有阶段的正常组织和肿瘤区，并对抗体染色进行评分(图3)。PVC和WFS的表达始终较弱，而C20在对照动物中始终较强。该模式在16周肿瘤中类似。但是，在24周肿瘤中，PVC和WFS的表达与C20相比增加，并且在32周肿瘤中较大地上调。这些实验证明在肿瘤发生的不同阶段BARD1表达模式发生变化，并且表明定位到外显子3和4的BARD1表位参与肿瘤促进和向侵袭性阶段的发展。
使用可扩增来自10名女性患者和10名男性患者的样品的完整BARD1编码区的引物，通过RT-PCR来确定NSCLC中表达的不同同工型的结构。从肿瘤组织和从正常肿瘤周围组织中提取RNA。从具有良性呼吸道疾病的患者获得正常肺对照组织。BARD1的表达在正常肺中不存在或非常低；通过RT-PCR(图4A)和通过免疫组织化学分析(数据未示出)发现对照中BARD1仅弱表达。来自NSCLC患者的RT-PCR显示了在多数肿瘤和肿瘤周围样品中FLBARD1及其数种不同的同工型的表达。在多数情况下，FLBARD1和同工型的特异性表达模式在正常肿瘤周围组织和肿瘤组织中是相同的(图4B)。
为了区分相同分子量的同工型，使用扩增外显子1和4，或1和6的引物进行RT-PCR。发现除了FLBARD1之外，已知的同工型β而不是α(WO2008/119802)的表达，以及另外两个新型同工型κ和π的表达(图4B、C、E、图6和图7)。
对女性和男性病例中通过RT-PCR获得的同工型的表达进行定量。FL和同工型在肿瘤组织和肿瘤周围组织中都类似地表达，与BARD1同工型在蛋白水平上的显著上调相反(图1A和图5)。与女性相比，在男性中同工型BARD1β和κ的表达显著上调(P<0.05)；而与男性相比，在女性中同工型BARD1η、BARD1γ和BARD1ε的表达上调(图7)。
在本发明的另一实例中，在来自女性和男性的所有肺组织中，无论正常组织还是肿瘤周围组织中都发现了ERα表达(图4D)，这表明BARD1同工型可能与NSCLC中的雌激素信号传导相关。
III-结果
通过对肿瘤切片进行IHC来对结直肠癌中的BARD1表达进行研究，所述肿瘤切片来自结直肠癌的148个石蜡包埋组织样品，表现为组织微阵列，每例一式四份。IHC检验后145例对于分析是合格的，在该研究中对它们进行分析。使用针对BARD1的不同区(分别是外显子1、外显子3、外显子4和外显子11)的4种抗体(N19、PVC、WFS和C20)来区分位于相邻组织切片上的不同BARD1表位(图1A)。还使用针对BRCA1的C端表位的BRCA1C20抗体研究BRCA1表达。
在结直肠癌中四种抗体的每一种的阳性染色是可变的(图9A)。分别在结直肠癌的36(24.8%)、122(84.1%)、129(89%)和61(42.1%)个病例中，将BARD1N19、PVC、WFS和C20染色归类为阳性。观察到142个病例具有至少一种抗体阳性染色，仅在3个病例中未发现BARD1的表达(图9B)。换言之，97.9%(145中的142例)的结直肠癌病例表达BARD1的至少一种表位。
虽然原则上对于表达4种表位可能有16种不同的组合，但仅发现3种主要组合(图9B)。结直肠癌中这3种BARD1表达模式包括：仅有中间表位的表达是最常见的(38.6%)(图2B、D)，针对所有4种抗体的染色其次(18.6%)(图8B、C、E)，N-端表位的丧失是第三常见的观察到的表达模式(17.9%)(图8B、F)。
与NSCLC组织中的BARD1表达类似，发现所有4种抗体染色是细胞质的，但位于不同的区域。BARD1N19和C20显示出颗粒状染色，而PVC和WFS显示出弥漫性染色，它们分别共定位于相同的细胞或相同的区域(图8C-F)。为了对此进一步研究，将用各抗体获得的表达模式定量并比较结果。在N19和C20的表达水平之间观察到强相关性(ρ=0.71；P=0.000)。其它比较，例如PVC和WFS(ρ=0.39；P=0.000)，PVC和C20(ρ=0.36；P=0.000)，以及WFS和C20(ρ=0.27；P=0.001)显示了弱相关性。在N19和PVC，以及N19和WFS染色之间未发现相关性(图10A)。
从不同的表位的表达水平、细胞内定位、使用不同抗体的染色强度、不同BARD1表位的相关或不相关的表达、以及使用针对不同BARD1表位的4种抗体的表达模式可以推断出，N端和C端截短形式、N端失去的形式、以及含有与本研究中所用抗体具有反应性的4种表位的形式，在结直肠癌中表达。
IV-BARD1和BRCA1的非协调表达
与BARD1不同，BRCA1染色在同一细胞内显示出细胞质和细胞核颗粒状染色(图8C)。在22.1%(145中的32例)的结直肠癌病例中观察到BRCA1阳性染色，而在24.8%(145中的36例)的病例中观察到N19阳性染色。令人感兴趣的是，为N19阳性的61个病例中仅7个也是BRCA1阳性。此外，在BARD1表达的不同表位和BRCA1表达之间未发现相关性(图10B)。这些结果证明，在结直肠癌中BRCA1表达不与BARD1协调一致。
V-BARD1蛋白表达与临床病理学特征和患者预后的相关性
N19阳性染色的频率与女性性别显著相关(P=0.014)(图11A)，这与在NSCLC中BARD1N19在女性比在男性中过多表达的结果一致(图2a-B)。BARD1的不同表位表达和BRCA1表达与任何其它临床病理学变量，例如肿瘤级别、原发肿瘤、淋巴结和远端转移状态以及肿瘤阶段都不相关(图4B-F)。此外，在不同表达模式和临床病理学变量之间未获得显著相关(数据未示出)。
还在75个具有随访数据的结直肠癌病例中通过将不同BARD1表达模式(图9B)以及BRCA1和BARD1的单独4种表位的表达与存活进行比较来评估BARD1和BRCA1表达与存活的相关性。据发现(表6)，与阴性染色的患者相比，具有BARD1N19阳性染色的患者具有较高的1年、2年和3年存活率，具有C20阳性染色的患者具有较高的1年和3年存活率。从BARD1PVC和WFS(阴性染色案例不足以进一步分析)、BRCA1阳性染色和阴性染色与存活之间的比较得出没有差异。
当将表达模式用来比较时(表7)发现，与组中仅中间表位表达的表达模式和其它表达模式相比，所有4种抗体阳性染色的表达模式与较高的1年、2年和3年存活率相关。但是，与组中的其它表达模式相比，以及与所有4种抗体阳性染色模式相比，仅中间表位表达的表达模式(用PVC和WFS检测)与较低的1年、2年和3年存活率相关。在组中，在失去N端表位的表达模式和其它表达模式(包括所有4种抗体阳性染色模式的表达模式(除1年存活率外))、仅中间表位表达的表达模式和所有其它表达模式之间，未发现相关性。
总之可以概括出在结直肠癌中，所有4种阳性染色模式的BARD1表达模式以及BARD1的N端表位的表达是正面的预后因素；相反地，仅中间的两种表位同时表达是负面的预后因素，但它们单独的表位表达则不是。
表6.在75名结直肠癌患者中BARD1的不同表位和BRCA1表达与存活的相关性
注意：“-”,阴性染色；“+”,阳性染色。
对于WFS，阴性染色病例不足以进一步分析。
表7.在75名结直肠癌患者中BARD1表达模式与存活的相关性
注意：++++，4种抗体阳性染色；-++-，仅PVC和WFS阳性染色；-+++，仅N19阴性染色；其它，除所比较的表达模式之外。
VI-结直肠癌中表达的BARD1同工型的结构
在20个肿瘤组织和肿瘤周围组织(包括10名男性和10名女性病例)中，通过RT-PCR评估BARD1mRNA表达水平。从冷冻组织切片提取RNA。使用外显子1中的正向引物以及外显子11和外显子4中的反向引物进行RT-PCR，以扩增BARD1编码区(外显子1～外显子11，和外显子1～外显子4)，扩增GAPDH作为对照。同时，如NSCLC中所做一样，从该系列的样品还扩增ERα(图11A)。
与NSCLC中不同，BARD1mRNA表达模式在结直肠的肿瘤组织和肿瘤周围组织中相当不同。FLBARD1和同工型在多数肿瘤样品(90%，20个病例中的18个)中频繁地表达，但是在肿瘤周围组织中，没有BARD1的表达是频繁的(65%，20个病例中的13个)，7个病例(35%)仅表达FLBARD1和/或较少的同工型。这具有统计学显著性(P=0.0003)。该类似的结果在男性(分别为8/10和4/10)(P=0.0679)中和在女性(分别为10/10和3/10)(P=0.0010)中也观察到(图12A)。在NSCLC组织中表达的所有BARD1同工型，包括具有外显子3的缺失的新型同工型κ和具有在外显子4的3’端内的408bp的缺失的新型同工型π，也在结直肠癌组织中表达。为强调起见，FLBARD1和所有BARD1同工型在肿瘤组织中频繁表达，但在肿瘤周围组织中表达较少或不表达(对于所有都P<0.05)(图12B)。
VII–在来自男性和女性的组织中观察到的相似BARD1表达模式
BARD1同工型β和κ在来自男性的肺组织中显著上调，同工型η、γ和ε在来自女性的肺组织中高度表达。与肺组织不同，FLBARD1和同工型表达的频率在来自男性和女性的结直肠组织中，包括在肿瘤周围组织(对于所有都P>0.05)(图12C)和肿瘤组织(对于所有都P>0.05)(图12D)中类似。
在一系列样品的结直肠组织中，包括男性和女性的肿瘤周围组织和肿瘤组织中，未发现ERα表达。该结果能够至少部分地解释：与肺组织中的BARD1表达相比，在结直肠组织中BARD1表达与男性和女性没有相关性。
VIII-BARD1同工型表达与临床变量的相关性
据发现FLBARD1和BARD1同工型在年龄超过60岁的患者中比年龄在60以下的患者中表达更频繁。具体而言，BARD1同工型、δ和π表达的频率与老年患者显著相关(P<0.01)(图13A)。此外，BARD1同工型κ表达在频率上与较大的肿瘤尺寸或相邻的肿瘤侵入(T3和T4)(P=0.0098)、淋巴结累及(N1和N2)(P=0.0422)和晚期(III期和IV期)(P=0.0422)显著相关(图6B-D)。在BARD1表达和肿瘤组织病理学级别之间未观察到相关性(图13E)。
IX–肺癌患者血液中抗-BARD1自身免疫抗体的检测
方法
使用本发明的抗原(BARD1肽)基于免疫吸附检验开发了测试，以用于捕获肺癌患者血液中的自身免疫抗体。用于所进行的测试的方法是改进的标准ELISA抗体捕获测试。具体而言应用以下方案：
-用于PBS中稀释的BARD1肽[10微克/ml]包被微量滴定板(96孔)并在4℃温育过夜。
-用封闭剂(例如5%BSA)代替磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，在室温于搅动下将孔封闭1小时。
-向孔中添加稀释于含1%封闭剂的PBS中的患者血清和对照，并在室温于搅动下进行温育2小时。
-用PBS将孔冲洗3次。
-向孔中添加稀释于PBS和1%封闭剂中的与HRP或Sulfo-Tag或等效的检测试剂偶联的抗人的第二抗体，并在室温于搅动下温育1小时。
-用PBS将孔洗涤3次。
-通过添加HRP底物或用于等效检测方法的底物而进行读出，立即测量反应。
测试
对来自肺癌患者的血清样品和对来自健康血液供体的对照样品进行以下抗原(肽)测试：SEQIDNO：46、33、48、20、50、19、22、16、32、26。
结果
参见图14。将健康对照与肺癌患者比较。测量的值为任意值。值在癌症患者中通常比在对照中高。数种肽的组合值在对照和癌症病例之间产生明显的区别：如果使用11种肽，则敏感性为100%，特异性为95%。
测试描述
例如可以使用来自患者的血清来检测针对BARD1同工型的自身免疫抗体。在对照样品(健康血液供体)中，反应值显著低于癌症样品中的值。各个肽对于一个对照可能给出较高的值，但是使用肽的组合排除了假阳性。

Claims (27)

1.一种分离和/或纯化的多肽，所述分离和/或纯化的多肽包含由SEQIDNO：1构成的BARD1同工型π。
2.一种由SEQIDNO：8构成的分离的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。
3.权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核苷酸序列在制备用于检测非小细胞肺癌和结肠直肠癌的生物标志物中的应用。
4.一种特异性结合权利要求1所述多肽上的SEQIDNO：143所含表位的抗体或其片段。
5.如权利要求4所述的抗体，所述抗体与SEQIDNO：144所示的表位结合。
6.用于特异性检测由SEQIDNO：1构成的BARD1同工型π或编码BARD1同工型π的多核苷酸序列的要素在制造试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断肺癌和/或结直肠癌，或用于确定受试对象是否罹患肺癌和/或结直肠癌。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述要素包括用于通过蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA蛋白检验、蛋白质印迹、分光光度法来检测BARD1同工型π的要素，或用于通过RNA印迹、核酸酶保护检验(NPA)、原位杂交和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BARD1同工型π的mRNA的存在的要素。
8.如权利要求6或7所述的应用，其中，所述要素包括至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对由SEQIDNO：1氨基酸序列组成的BARD1同工型π的编码多核苷酸具有特异性。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述多核苷酸引物或探针特异性结合所述同工型π的mRNA。
10.如权利要求8所述的应用，其中所述多核苷酸引物或探针允许检测对BARD1同工型π特异的RNA的表达。
11.如权利要求6所述应用，其中所述要素包括结合所述BARD1同工型π的至少一个表位的抗体。
12.如权利要求11所述的应用，其中所述抗体是特异性结合由SEQIDNO：1氨基酸序列组成的BARD1同工型π的不同表位的抗体或其片段的组合。
13.如权利要求12所述的应用，其中所述抗体的组合包括：
选自由WFS和BL组成的组的一种或两种抗体；和
抗体JH2，
或分别与WFS、BL和JH2结合相同表位的抗体，
并且其中与WFS和/或BL结合并同时不与JH2结合表明存在BARD1同工型π。
14.如权利要求6所述的应用，其中诊断用生物样品选自包含以下样品的组：活组织检查样品、组织学样品、肺液、冷冻组织样品、肿瘤组织样品、粪便样品、脑脊髓液(CSF)、循环肿瘤细胞(CTC)和血液样品。
15.如权利要求6所述的应用，其中所述受试对象是人类。
16.如权利要求6所述的应用，所述应用还在生物样品中检测由SEQIDNO：2组成的BARD1同工型κ。
17.如权利要求6所述的应用，所述应用还在生物样品中检测选自包含以下同工型的组中的至少一种BARD1同工型：
同工型π’，同工型π’包含SEQIDNO：105，
同工型β，同工型β包含SEQIDNO：5，
同工型δ，同工型δ包含SEQIDNO：6，和
同工型γ，同工型γ包含SEQIDNO：7，
同工型β'，同工型β'包含SEQIDNO：106。
18.如权利要求6所述的应用，所述应用还在生物样品中检测由SEQIDNO：1组成的BARD1同工型π、由SEQIDNO：2组成的BARD1同工型κ、和由SEQIDNO：5组成的BARD1同工型β。
19.如权利要求6所述的应用，其中所述由SEQIDNO：1组成的BARD1同工型π的存在通过检测获自所述受试对象的血液样品中与所述BARD1同工型结合的自身免疫抗体的存在来检测。
20.如权利要求19所述的应用，其中所述要素包括选自包含SEQIDNO：13–80的组中的至少四种抗原，以检测对所述BARD1同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
21.如权利要求6所述的应用，其中，所述BARD1同工型的存在通过以下方式来检测：
检测编码由SEQIDNO：1氨基酸序列构成的BARD1同工型的mRNA的水平，和
检测获自所述受试对象的血液样品中对所述BARD1同工型具有特异性的自身免疫抗体的存在，并且其中使用选自包含SEQIDNO：13–80的组中的至少四种抗原以检测对所述BARD1同工型具有特异性的所述自身免疫抗体。
22.如权利要求6所述的应用，其中，所述试剂盒包含：
至少一种多核苷酸引物或探针，其中所述多核苷酸引物或探针对编码由SEQIDNO：1氨基酸序列构成的BARD1同工型的多核苷酸具有特异性，和/或
与由SEQIDNO：1氨基酸序列构成的BARD1同工型的不同表位特异性结合的抗体或其片段的组合，和/或
至少一种选自包含SEQIDNO：13～80的组中的肽。
23.至少一种多核苷酸引物或探针在制造诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于在获自受试对象的生物样品中检测由SEQIDNO：1构成的BARD1同工型π的存在，
其中在获自所述受试对象的所述样品中所述BARD1同工型π的存在是所述受试对象罹患肺癌和/或结直肠癌的标志，和，
其中所述多核苷酸引物或探针对编码由SEQIDNO：1构成的同工型π的多核苷酸具有特异性。
24.与单链或双链RNA分子结合的重组siRNA分子在制备用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的药物中的应用，其中所述单链或双链RNA分子包含编码由SEQIDNO：1氨基酸序列构成的BARD1同工型的mRNA，由此所述BARD1同工型的表达受到抑制。
25.由SEQIDNO：1氨基酸序列构成的BARD1同工型的生物活性的调节剂在制备用于治疗和/或预防肺癌和结直肠癌的药物中的应用。
26.如权利要求25所述的应用，所述调节剂是选自包含SEQIDNO.111～140的组中的微RNA。
27.如权利要求12所述的应用，其中所述抗体的组合包括：
选自由PVC、MIQ、与PVC结合相同表位的抗体、与MIQ结合相同表位的抗体组成的第一组的一种或多种抗体；
选自由WFS、BL、与WFS结合相同表位的抗体、与BL结合相同表位的抗体组成的第二组的一种或多种抗体；和
选自由JH2、和与JH2结合相同表位的抗体组成的第三组的一种或多种抗体，
并且其中与第一组和第二组的抗体结合并且不结合第三组的抗体表明存在BARD1同工型π。
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