CN111253483B

CN111253483B - 一种抗brca1单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN111253483B
Application number: CN202010135544.4A
Authority: CN
Inventors: 刘晗青; 屠志刚
Original assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2040-03-02
Also published as: CN111253483A

Abstract

本发明属于诊断技术领域，具体涉及一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途。本发明以纯化后的BRCA1蛋白片段作为免疫原，免疫小鼠后提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞，通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗BRCA1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得抗BRCA1单克隆抗体，本发明的抗BRCA1单克隆抗体可用于检测BRCA1蛋白的生物学检测试剂，并应用在制备卵巢癌相关检测产品中。

Description

一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物诊断技术领域，具体涉及一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途。

背景技术

卵巢癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，也是最为致命的女性生殖系统癌症，死亡率位于妇科肿瘤首位。大量病例对照研究及临床报告资料显示，卵巢癌的发生与遗传因素有着密切联系，卵巢癌家族史是卵巢癌发病最重要的危险因素。遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因BRCA1（breast and ovarian cancer susceptibility gene）的突变在遗传性卵巢癌的发生、发展中具有重要作用，且其突变率与家族中具有卵巢癌病史的人数呈正相关。研究表明，BRCA1突变与多数遗传性卵巢癌相关，且主要在遗传性及早发性卵巢癌中起作用。BRCA1在遗传性卵巢癌患者中的突变率最高约为50％~100％，在卵巢患者的1~3级亲属中突变携带率约10％~30％，而在普通人群中仅不到0.1％，BRCA1基因的突变以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。BRCA1作为一种肿瘤抑制基因，在正常卵巢上皮细胞中起重要的转录调控作用，参与细胞周期的调节，抑制细胞增殖，促进细胞终末分化，诱导细胞凋亡和参与细胞DNA损伤修复，对维持基因组的稳定发挥重要作用，而BRCA1基因的突变或缺失则导致基因组的不稳定性，继而发生恶变，成为诱发卵巢癌的主要原因之一。因此，建立一种可行的、快速的、准确的卵巢癌早期检测方法，对指导临床上评估卵巢癌遗传风险，卵巢癌的治疗，改善卵巢癌预后的意义十分关键。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途。

本发明利用BRCA1蛋白片段作为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合筛选能够稳定分泌抗BRCA1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产BRCA1单克隆抗体，经纯化后获得高纯度的抗BRCA1单克隆抗体，获得的抗BRCA1单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测BRCA1抗原的免疫检测工具中。可用于制备抗BRCA1的生物诊断试剂的研究与开发。

本发明的方案通过如下技术手段得以实现：

本发明所述抗BRCA1单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在某一具体实施方式中，本发明还具体公开了所述BRCA1单克隆抗体的制备方法，首先用BRCA1蛋白片段免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗BRCA1单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗BRCA1单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗BRCA1单克隆抗体。

所述蛋白免疫为经过三次蛋白免疫；所述骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞。

本发明还提供了一种能产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明还提供所述的抗BRCA1单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。

所述的抗BRCA1单克隆抗体在制备抗BRCA1的生物学检测试剂中的用途。

进一步的所述的用途为制备用于检测BRCA1蛋白抗原的试剂中的用途。

本发明提供的单克隆抗体在制备卵巢癌相关检测产品中的应用。采用本发明所提供的抗BRCA1单克隆抗体能特异地识别卵巢组织中的BRCA1蛋白，实现对卵巢组织中BRCA1蛋白的准确定位。BRCA1蛋白在正常人卵巢组织中均正常表达，表达于细胞核中，无细胞浆的错位表达；而在卵巢癌组织中则出现明显的错位表达，定位于细胞浆。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的抗BRCA1单克隆抗体能够特异性的结合BRCA1蛋白，减少了可能的交叉反应，特异性高。包含本发明所述抗BRCA1单克隆抗体的检测工具可以用于组织样本的免疫组化检测，有效提高非治疗目的的肿瘤标本免疫组化检测的精确度，尤其有助于提高低分化或未分化肿瘤的检测手段的准确率。

附图说明

图1是重组蛋白BRCA1组分收集的SDS-PAGE电泳图；

图2是纯化后的BRCA1单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；

图3是不同稀释度BRCA1单克隆抗体的免疫效价检测结果；

图4是BRCA1单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；

图5 是对临床患者卵巢组织进行了BRCA1蛋白的免疫组化检测结果示意图。

具体实施方式

本发明公开了一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1：BRCA1单克隆抗体制备

（1）重组BRCA1蛋白片段的表达与纯化

重组质粒pET-30a-BRCA1（购自Addgene公司），采用42℃热激90 s的方法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500 mL LB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。

将菌体裂解液上清加入镍柱（购自Thermo Fisher）进行纯化蛋白， 500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，图1是重组蛋白BRCA1组分收集的SDS-PAGE电泳图；如图1所示， BRCA1蛋白经一次洗脱即能获得较高的纯度，收集洗脱后的蛋白，冻干后进行后续动物免疫。

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测

本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫（参考北京大学出版社出版的《现代抗体技术及其应用》和科学出版社的《抗体制备与使用实验指南》）。用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价。取重组BRCA1蛋白，用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将BRCA1蛋白稀释为1 μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：105以上小鼠，进行第三次免疫。

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选

制备饲养层细胞，准备SP2/0骨髓瘤细胞，免疫结束后3~4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。融合后的细胞铺板（6块96孔板），利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，经过两轮亚克隆筛选得到抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株编号命名为：3-1-C2-C6。

（4）抗BRCA1单克隆抗体的生产及纯化。

按常规方法制备小鼠单克隆抗体腹水，利用正辛酸-蛋白G法对腹水抗体进行纯化，抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，如图2所示，3-1-C2-C6抗体经洗脱后能获得较高的纯度，抗BRCA1单克隆抗体IgG(H+L)分子量约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD，IgG轻链约为25 KD。

实施例2：BRCA1单克隆抗体效价测定及特异性

（1）单克隆抗体的效价测定：

用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将BRCA1蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将以上单克隆抗体按1:10³、1:10⁴、1：10⁵、1：10⁶、1：10⁷稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h；取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30 min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值，图3是不同稀释度BRCA1单克隆抗体的免疫效价检测结果图；如图3所示，纯化后的单克隆抗体的效价均达到1×10⁶。

（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：

用将碳酸盐缓冲液将HSP90、HB-EGF、EGFR、TNF-α、IL-1β、HGF蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，用BRCA1单克隆抗体进行间接法ELISA检测，图4是BRCA1单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；如图4所示，BRCA1单克隆抗体与HSP90、HB-EGF、EGFR、TNF-α、IL-1β、HGF蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体的特异性较好。

实施例3：BRCA1单克隆抗体重轻链可变区的测序及鉴定

单克隆细胞长期保存，可能由于多次传代后不稳定及污染问题导致阳性克隆丢失，为解决上述问题，本发明利用分子生物学技术，对阳性单克隆细胞株利用Mouse Ig-Primer Set试剂盒（69831，Merck Millipore）进行重链可变区（mVH）和轻链可变区（mVL）基因扩增，进行序列鉴定，获得杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，即：EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCGTSGFTFTDYVMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKTSRYTTEYSASVKGRFSISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDDYGIARFYWGQGTLVTVSA；轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示，即：DVPGTQTPLSLPVTLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPNLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCHLMSTHIPFTFGSGTKLELKR。

实施例4：BRCA1单克隆抗体在免疫组织化学技术中的应用

BRCA1是一种核蛋白，在正常的卵巢中定位于细胞核，当BRCA1基因表达异常时，细胞核内BRCA1蛋白表达下降甚至消失，并可在细胞浆中错位表达。本实施例应用免疫组织化学技术实现对卵巢组织中BRCA1蛋白的准确定位。具体方法如下：

正常卵巢和卵巢癌组织石蜡切片由江苏大学附属医院提供，进行免疫组化染色。首先对玻片进行脱蜡（二甲苯浸泡5 min，共3次），洗脱二甲苯（无水乙醇浸泡1 min、无水乙醇浸泡1 min、95%酒精浸泡1 min、80%酒精浸泡1 min、自来水冲洗1 min），抗原修复（将玻片置于抗原修复液煮沸15 min后，自来水冲洗1 min后晾干），封闭内源性H₂O₂酶（3% H₂O₂溶液浸泡10 min后，自来水冲洗5 min），一抗孵育（BRCA1单克隆抗体，稀释度比为1：100，4℃孵育过夜，次日PBS冲洗三次），二抗孵育（通用型二抗即用液，37℃孵育30 min，PBS冲洗三次），DAB-H₂O₂显色（经苏木素复染，1%盐酸酒精分化，1%氨水回蓝），梯度乙醇中脱水（80%酒精浸泡5 min、85%酒精浸泡5 min，95%酒精浸泡5 min，无水乙醇浸泡 5 min，无水乙醇浸泡5 min），吹风机吹干无水乙醇，中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。图5是对临床患者卵巢组织中BRCA1蛋白的免疫组化检测结果示意图；图中，（a）是正常卵巢组织，（b）卵巢癌组织。如图5所示，抗BRCA1单克隆抗体均能特异地识别组织中的BRCA1蛋白，在正常人卵巢组织中BRCA1蛋白均正常表达于细胞核中，无细胞浆的错位表达，而在卵巢癌组织中BRCA1蛋白则出现了明显的错位表达，定位于细胞浆。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司

<120> 一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ile Ala Arg Phe Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 2

Asp Val Pro Gly Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys His Leu Met

85 90 95

Ser Thr His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg

Claims

1.一种抗BRCA1单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述抗体还包括轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的抗BRCA1单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的抗BRCA1单克隆抗体的应用，其特征在于，在制备检测BRCA1蛋白的生物检测试剂中的用途。

4.根据权利要求2所述的抗BRCA1单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测BRCA1抗原的试剂。

5.根据权利要求1所述的抗BRCA1单克隆抗体在制备卵巢癌相关检测产品中的应用。