WO2022154288A1 - 단백질 키나아제 a의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 활용한 암 진단 용도 - Google Patents
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Classifications
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
Definitions
- the present invention provides a polynucleotide encoding the antibody or fragment of the antibody.
- the antibody may be selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE and IgD, but is not limited thereto.
- Polynucleotides herein may also be described as oligonucleotides or nucleic acids, which are produced using DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA), RNA molecules (eg, mRNA), nucleotide analogues. DNA or RNA analogues (eg, peptide nucleic acids and non-naturally occurring nucleotide analogues) and their hybrids.
- DNA or RNA analogues eg, peptide nucleic acids and non-naturally occurring nucleotide analogues
- the polynucleotide is single-stranded or double-stranded. It can be double stranded.
- the polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof of the present invention can be obtained by methods well known in the art. For example, based on the DNA sequence or the corresponding amino acid sequence encoding a part or all of the heavy and light chains of the antibody, an oligonucleotide synthesis technique well known in the art, for example, the polymerase chain reaction (PCR) method, etc. It can be synthesized using
- the present invention comprises the steps of (a) transforming a host cell with the recombinant expression vector;
- ELISA methods such as direct sandwich ELISA using a solid support, and indirect sandwich ELISA using a labeled secondary antibody recognizing the antibody after reacting with another antibody recognizing the antigen in a complex of an antibody attached to a solid support and the antigen, are included.
- the coupling-wash-deprotection-wash cycle is repeated to remove excess reagent.
- peptides are synthesized from the C-terminus to the N-terminus.
- a sandwich ELISA was performed using the PKA antibody of the present invention on serum samples from prostate cancer, breast cancer and healthy people.
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Abstract
본 발명은 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 등에 관한 것으로서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원결합 단편은 PKA 촉매 서브 유닛 알파(PKACA)의 특정 도메인에 특이적으로 결합함으로써, 기존 PKA 항원과 비교하여 본 발명의 특이적 항원에 대한 친화도가 현저히 증대되었으며, 실제 암 환자를 진단할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 향후 PKA 촉매 서브 유닛 알파(PKACA) 및 PKA 자가항체를 단백질 수준에서 특이적으로 검출하여 암의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있다.
Description
본 발명은 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파(PKACA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
본 출원은 2021년 1월 12일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0003891호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
암은 현재 전 세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로서, 암 발생 연령은 점차 낮아지고 있는 반면 평균 수명은 점차 연장되어가고 있어 암 발생률은 더욱 증가할 것으로 전망되고 있다. 암은 유전적 요인과 환경적 요인에 의해 세포의 분열이 정상적으로 조절되지 않고 비정상적인 세포분열을 하게 됨으로써 발생한다. 그러나 인체의 각종 암에 있어 조기에 간편하게 진단할 수 있는 시약이 개발된다면, 조기 치료를 실시할 수 있어 예후가 좋아지고, 궁극적으로 인류의 수명을 연장할 수 있을 것으로 예상된다.
한편, 사이클릭 AMP(cAMP)-의존성 단백질 키나아제인 PKA(protein kinase A)는 전사 후 변형(posttranscriptional modifications)을 위한 가장 중요한 효소의 하나이며, 세포 증식, 대사, 유전자 유도, 혈관 형성, 이온 채널의 조절 및 세포사멸과 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 유형 I과 유형 II를 포함하는 PKA는 주로 세포내 효소로, 2개의 조절(regulatory) 유닛 및 2개의 일반 촉매(common catalytic) 서브 유닛으로 구성되는 4량체 효소이며, cAMP에 의해 R 이합체와 2개의 프리 C서브 유닛으로 분리된다.
특히, 다양한 종류의 암 세포가 PKA의 C 서브유닛을 세포 밖으로 방출(Extracellular cAMP-dependent protein kinase A; ECPKA)함으로써, 상기 암 세포를 배양한 배지 내에서 PKA Cα가 존재하는 것으로 보고된 바 있다 (Proc Natl Acad Sci, 2000, 97(2): 835-40). 또한, 상기 문헌에서는 다양한 암 환자의 혈청에서 ECPKA의 활성이 높게 나타나는 것을 확인하였고, 이와 대조적으로 정상 대조군에서는 ECPKA 활성이 상대적으로 나타나지 않는 것을 확인함으로써, ECPKA를 이용한 암 진단의 가능성을 시사하였다.
이와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 보다 개선된 암 진단 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 혈청 내 인간 ECPKA 특정 도메인에 특이적으로 결합하는 신규 단일클론항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 문제점 및 니즈를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 상기 항체가 실제 암 진단에 사용할 수 있음을 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 항원결정부(epitope)로 인식하는 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 ECPKA 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 ECPKA 자가항체 진단 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 항원결정부(epitope)로 인식하는 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 6 및 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 18 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 항체의 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, dsFv, Fd, Fd' 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34 내지 37로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발현벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 항체의 단편을 생산하는 단계; 및
(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 항체의 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편의 암 진단 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편의 암 진단제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 정보제공방법은 상기 자가항체 수준이 정상 대조군에서 측정된 수준에 비하여 높은 경우, 암 환자로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 암이 의심되는 개체는 자각 증상이 없는 정상인으로 보이는 환자, 암 발병이 의심되는 환자, 및 암의 수술 후 또는 치료 중인 환자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 자가항체는 상기 생물학적 시료를 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드와 접촉시켜 생성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 또는 이에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 또는 이에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 발병 위험도를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원결합 단편은 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파의 특정 도메인에 특이적으로 결합함으로써, 기존 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 항원과 비교하여 친화도가 현저히 증대되었으며, 실제 암 환자를 진단할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 향후 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파를 단백질 수준에서 특이적으로 검출하여 암의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 PKA clone cell의 배양 상등액을 PKA 항원 검출을 위한 Indirect ELISA법으로 사용하기 위한 펩타이드 접합 기작의 모식도이다.
도 2는 PKACA 항원 검출을 위한 Indirect ELISA법의 모식도이다.
도 3a 내지 도 3e는 PKACA와 PKA clone cell의 배양 상층액을 이용한 ELISA 결과로서, 도 3a는 PKA1 clone, 도 3b는 PKA2 clone, 도 3c는 PKA3 clone, 도 3d는 PKA4 clone, 도 3e는 PKA5 clone의 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 PKACA-자가항체에 대한 항원-항체 검출법에 대한 sandwich ELISA법의 모식도이다.
도 5는 PKACA 펩타이드 1 및 4 표준시료에 대한 PKA1-7 및 PKA4-9의 결합력을 측정하기 위한 sandwich ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 전립선암 및 유방암 환자의 혈청 시료에 대한 PKA1-7 및 PKA4-9를 이용한 sandwich ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 PKACA 항원-PKA 자가항체 접합체 검출을 위한 direct ELISA법의 모식도이다.
도 8은 전립선암 및 유방암 환자의 혈청 시료로부터 PKA 1-7 및 PKA 4-9를 이용한 direct ELISA법을 통해 PKACA 항원-PKA 자가항체 접합체를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 항원결정부(epitope)로 인식하는 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.
본 발명에서, "단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 α(PKACA)"는 인간에서 PKACA 유전자에 의해 암호화되는 주요 조절 효소이다. 이 효소는 다른 단백질과 기질을 인산화하여 활성을 변화시키는 역할을 한다. PKACA는 인간의 19 번 염색체에서 발견된다. Cα1이라고 하는 가장 일반적인 형태는 인간 조직 전체에서 발현되며, 또 다른 전사체인 Cα2는 주로 정자 세포에서 발견되며 처음 15개 아미노산에만 Cα1과 차이가 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 전술한 바와 같이 암 세포가 방출하는 PKA의 C 서브유닛(Extracellular cAMP-dependent protein kinase A; ECPKA)을 특이적으로 검출하면서, PKACA의 일부 도메인 영역을 검출할 수 있다. 상기 PKACA의 구체적 서열은 당업계에 PKACA로서 알려진 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 일례로 본 발명의 PKACA는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_001291278.1, NP_002721.1, NP_997401.1, XP_016882437.1 등으로 공지된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "항원결정부(epitope)"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 항원결정부는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면기로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성 및 특이적 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 항원결정부는 변성 용매의 존재 하에서 입체형태적 항원결정부에 대한 결합은 손실되지만 비-입체형태적 항원결정부에 대해서는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 항원결정부는 결합에 직접 관련되는 아미노산 잔기(항원결정부의 면역원성 성분으로도 칭해짐) 및 결합에 직접 관련되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기(즉, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트 (footprint) 내에 존재함)를 포함할 수 있다.
바람직하게는 PKACA N-말단 서열로부터 유래된 본 발명의 항체가 결합하는 부위로, 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 연속되는 영역이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으며, 통상 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 11 내지 52개, 더욱 바람직하게 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42 개의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 본 발명의 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 연속되는 영역은 전체 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편과 비교하여 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질 서열의 전장 또는 이들의 단편에 비해서 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 비해서 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이들의 단편에 비해서 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원결합 단편(항체 단편)을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다.
상기 "완전한 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 완전한 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "항체의 단편"은 완전한 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diabody, Fd 및 Fd'등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중사슬 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단일사슬 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중사슬 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. diabody(디아바디)는 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드쇄 또는 단백질의 복합체로서, 각각 적어도 1개의 VL 및 VH 도메인 또는 그 단편을 포함하고, 양 도메인이 단일의 폴리펩티드쇄 내에 포함되어 있는 복합체를 말한다. 어떠한 실시형태에서, diabody에는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인을 포함하는 분자가 포함된다. 이러한 복합체의 폴리펩티드쇄는 동일하여도 달라도 좋고, 즉 diabody는 모노 다량체 또는 헤테로 다량체일 수 있다.
이러한 항체의 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 완전한 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 항원결정부에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원결정부(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 항원결정부에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명에서 용어, "키메라성 항체(chimeric antibody)"는 DNA 재조합 기술에 의하여 생쥐, 닭 등 사람에 대해서는 이종(異種)인 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역을 재조합시킨 형태의 항체이며, 상기 키메라성 항체의 면역반응은 생쥐, 닭 등 사람에 대해서는 이종(異種)인 항체에 비하여 크게 개선되므로, 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체(humanized antibody)"는 생쥐, 닭 등 사람에 대해서는 이종(異種)인 단일클론항체의 CDR 서열의 전부 또는 일부를 인간 항체에 이식시킨 형태의 항체를 의미하며, 그 예로 닭 또는 생쥐 단일클론항체의 CDRs를 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변영역과 재조합시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 닭 또는 생쥐 유래의 CDRs만을 이식하는 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 3차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각될 수 있는 FR 아미노산 잔기를 닭 또는 생쥐 항체의 아미노산으로 치환시켜 친화도를 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원결합 단편은 상기 서열로 한정된 항체에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
본 발명에서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 6 및 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 18 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 항체의 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, dsFv, Fd, Fd' 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double stranded)이 될 수 있다.
본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 염기 서열과 “실질적으로 동일한” 염기 서열일 수 있다. 염기 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이들의 단편에 비해서 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한"은, 만약 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 실질적으로 상보성이면, 제1 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 300, 360, 450, 540개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 또는 핵산에 대해, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을 의미한다.
본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34 내지 37로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 염기 서열과 “실질적으로 동일한” 염기 서열일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 "재조합(recombinant)"은 "유전자 조작(genetic manipulation)"과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다. 본 발명에서 "발현(expression)"은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 "발현조절서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 클로닝과 항체 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다. 파지 표시 등에 통상적으로 사용되는 pComb3 계열의 벡터를 사용할 수도 있고, 항체를 포유류 세포에서 발현하기 위하여 포유류 세포에서 단백질을 발현하기 위하여 통상적으로 사용되는 벡터, 예를 들어 pcDNA나 pVITRO 등의 벡터를 사용할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 전술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 제작물을 의미한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 재조합 발현벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다. 예를 들어, HEK293T, 293F 세포 등을 이용할 수 있다.
상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 발현벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체의 단편을 생산하게 된다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발현벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 항체의 단편을 생산하는 단계; 및
(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 항체의 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
(a) 단계는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 숙주세포를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터로 형질전환하는 단계이다.
통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현벡터의 종류에 따라 앞서 서술한 바와 같이 적절한 형질전환방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터는 동일한 숙주세포에 공동형질전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고, 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있다.
(b) 단계는 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현벡터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체의 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계이다.
통상의 기술자는 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 PKACA에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
(c) 단계는 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩티드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 전립선암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 여부, 정도 (증세), 및/또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바로서, "암의 진단"은 암의 발병 여부, 암 부위의 정도, 암 (암 세포)의 위치, 대장암의 정도 등의 암의 병리 상태를 확인하는 것으로, 보다 정확한 진단을 위하여 암 세포 또는 암 세포 및/또는 조직을 정상 세포 또는 정상 조직과 정확하고 신속하게 구별하는 것이 중요하다.
또한 본 발명에 따른 암 진단용 조성물은 본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편 외에, 2차 항체, 2차 항체의 발색 반응을 위한 기질, 보조 인자 등 항체로 단백질을 감지하기 위하여 통상적으로 사용되는 요소들을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 암 진단용 키트는, 항-인간 PKACA의 자가항체를 검출하기 위한 수단으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 키트는 자가항체의 항원으로서 당업계에 알려진 PKA 또는 PKACA 항원을 포함할 수 있으며, 본 발명의 PKACA 유래 펩타이드를 포함할 수도 있다. 상기 PKACA는 항-인간 PKACA 자가항체와 항원-항체 반응으로 특이적으로 결합될 수 있는 한, 공지된 PKACA 또는 이와 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 등의 상동성을 가지는 변이체일 수 있으며, 공지서열로부터 일부 서열의 결실, 치환 또는 부가도 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있다. 예컨대, PKACA 유래 펩타이드는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 정보제공방법은 상기 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 또는 이에 대한 자가항체 수준이 정상 대조군에서 측정된 수준에 비하여 높은 경우, 암 환자로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 암이 의심되는 개체는 자각 증상이 없는 정상인으로 보이는 환자, 암 발병이 의심되는 환자, 및 암의 수술 후 또는 치료 중인 환자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 자가항체는 상기 생물학적 시료를 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드와 접촉시켜 생성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 자가항체는 당업계에 알려진 PKA 또는 PKACA 항원에 대한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "자가항체(autoantibody)"는 동일 개체 유래의 항원을 표적으로 하는 항체를 의미한다. 다양한 암 환자에서 항-인간 PKACA 자가 항체의 혈청, 전혈, 혈장 또는 소변 내 수준이 높다는 사실을 근거로 실제 임상에 적용할 수 있는 수준으로 높은 민감성 및 특이성으로 검출하여 암을 조기 진단할 수 있는 기술은 현재까지 개발된 바는 없었다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 PKACA 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 PKACA 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, 양자점(quantum dot), Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하거나 고체에 부착된 항체가 항원-항체 복합체에서 항원을 인지하며 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 단백질 키나아제 A(PKA, Protein Kinase A) 촉매 서브 유닛 알파 검출 펩타이드의 합성
단백질 키나아제 A 촉매 서브 유닛 알파(PKACA) 검출용 항원은 PKACA의 아미노산 서열정보와 3차원 구조를 분석하여 항원지수가 높고 친수성이 높은 구역을 정하고 위치상 샌드위치결합이 가능하도록 다른 위치를 선택하여 펩타이드를 합성하여 사용하였다. Fmoc 고체상 펩타이드 합성법을 사용하여 펩타이드를 제작하고, MS와 Reverse-HPLC를 통하여 확인한 후 정제하여 PKACA 펩타이드를 합성하였다 (표 1 참조).
구체적으로, Fmoc 고체상 펩타이드 합성법의 경우, 커플링-세척-탈보호-세척 사이클을 반복하여 과잉 시약을 제거하는 방법이다. 이 방법을 통하여 펩타이드가 C-말단에서부터 N-말단까지 합성된다.
먼저, Rink Amide MBHA resin (Fmoc Linker MBHA resin로 불림)은 DCM을 넣고, 30분 동안 실온에 두어 팽창시켰다. 그 다음에 DCM을 빼고, DMF로 3차례 세척하였다. 피페리딘으로 아미노 그룹 fmoc을 탈보호시키고, DMF로 세척한 후, HBTU을 넣어주고, 다음 아미노-보호된 아미노산 Fmoc-Trp(Boc)-OH의 카보닐 그룹과 30분 동안 반응시켰다. 원하는 펩타이드 체인을 형성할 때까지 위 과정을 반복하였다. 유리 암모니아를 검출하기 위해 카이저 테스트(Kaiser test)를 사용하였으며, 이때 색깔이 변하지 않으면, 다음 단계를 진행하였다.
앞선 반응이 완료된 후에 시약 K TFA/thioanisole/물/페놀/EDT (82.5%/5%/5%/5%/2.5%)를 이용하여 합성된 펩타이드를 수지에서 분리시켰다. 그 후, cold DEE를 넣어 생성물을 침전시키고, cold DEE로 세척하고, 진공 건조하여 펩타이드를 수득하였다.
합성된 펩타이드는 GC-MS를 통하여 M.W.를 측정하였고, C18 컬럼을 사용하여 Reverse-HPLC로 220nm 파장에서 순도를 확인하였다.
펩타이드명 | 서열정보 (N말단→C말단) | 서열번호 |
PKA1 | EQESVKEFLAKAC | 1 |
PKA2 | KEDFLKKWESPAQNTAC | 2 |
PKA3 | SGKVRFPSHFSSDLC | 3 |
PKA4 | SNFDDYEEEEIRVC | 4 |
PKA5 | EEIRVSINEKC | 5 |
실시예 2. PKACA 검출 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)의 합성
합성된 펩타이드를 도 1에 나와 있듯이, Sulfo-SMCC crosslinker를 이용하여 KLH(carrier 단백질)인 BSA와 실시예 1에서 합성한 펩타이드들을 각각 접합하여 이를 마우스에 면역하고 마우스 비장에서 채취한 B림프구와 골수종 세포를 융합한 하이브리도마 세포를 배양하여 펩타이드에 특이적인 항-PKACA 항체를 합성하였고, ELISA 스크리닝에 이용해 PKA에 대해 역가가 높은 항체를 선별하였다.
구체적으로, BALB/c 마우스 1마리 당 항원 100μg을 아쥬반트와 섞어 앱클론 사의 MANI법(Monoclonal Antibody Next Innovation)을 이용하여 주사하였다. 융합 3일 전 항원 100μg을 1X PBS에 섞어 주사하여 면역반응을 증가시키고, 3일 뒤 마우스의 비장에서 B림프구를 분리하여 골수종 세포인 SP2/0-Ag14 (ATCC, CRL-1581)와 섞고 PEG-1500(Roche, 783641) 용액을 이용하여 융합시켰다. 융합된 세포는 하이포잔틴(hypoxanthin), 아미노프테린(aminopterine), 티미딘(thymidine)이 첨가되어 있는 배지 (HAT supplement, Sigma-Aldrich, H0262)에 배양하여 골수종 세포와 B림프구가 융합된 세포(hybridoma)를 선택적으로 선별 배양하였다(형질 전환된 하이브리도마 세포만 HAT 배지 선택으로 살아남음). 얻어진 하이브리도마 세포는 ELISA법을 이용하여 항원과 반응정도가 높은(OD>0.5) 항체를 생산하는 세포종을 확인하여 선별하였다.
도 2에서 간접 ELISA 방식을 나타낸 것처럼, 96웰 ELISA 플레이트(Corning, 3590)에 PKA 항원 100ng을 코팅 버퍼(0.1M sodium carbonate buffer) 100μl에 희석하여, 로딩 후 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 배양 후 1X PBST용액을 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 후, 2% skim milk 200μl로 실온에서 30분간 블록킹한 후, 1X PBST용액을 300μl/well씩 넣어 3차례 세척하였다. 그 다음, 하이브리도마 세포 배양 상층액(sup.; 포획 항체 포함액)을 100μl/well 씩 로딩하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 앞의 과정과 같은 방법으로 세척한 후, 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP(Abclon, Abc5001)을 1:20,000로 희석하여 100μl/well씩 로딩한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음, 앞의 과정과 같은 방법으로 세척 후, TMB 용액(Biofx, TMBC-1000)을 100μl/well씩 로딩한 후, 5분간 발색 하고, 1N 황산(sulfuric acid)을 100μl/well씩 로딩하여 반응을 종료시켰다. 그 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 ELISA를 통해, 항원과 특이적으로 반응하는 양성세포는 한계희석법(limiting dilution method)을 이용하여 양성세포와 음성세포를 분리하는 과정(cloning)을 반복하여 항원에 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 생산하였다. 생산된 하이브리도마 세포는 1X106cell/ml씩 동결하여 액체질소통 안에 보관하였다.
실시예 3. PKACA clone cell 상층액 내 항체 선정
Invitrogen사의 PKACA(이하, PKA) 재조합 인간 단백질을 항원으로 하여, 실시예 2에서 제조한 PKA 클론 세포 배양 상층액을 항체로 사용하여 Indirect ELISA Test를 두 차례 진행하여 상위 10개의 PKACA 클론 세포 배양 상층액을 선정하였다.
구체적으로, 96-well 면역플레이트에 PKA 재조합 인간 단백질을 항원으로 하여 0.1% BSA+0.05% Tween20 로 희석하여 1ng/μl를 만든 후, 100μl/well씩 코팅하고, 19시간 동안 4℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, 실시예 2에서 제조한 PKA 클론 세포 배양 상층액을 항체로 사용하여 100μl/well씩 로딩하였고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST로 앞의 과정과 동일하게 세척한 다음, 항-마우스 IgG-HRP 0.2ng/μl를 100μl/well씩 로딩하여, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 TMB를 100μl/well씩 로딩하여 호일로 싸서 어둡게 하여 10분 동안 상온에서 발색하였다. 0.5M H2SO4를 100μl/well씩 로딩하여 반응을 멈춘 후, 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
도 3a 내지 3e에 나타난 바와 같이, O.D@450nm에서 강도가 높은 상위 4개의 PKA 1 내지 5 Clone인 항체 PKA1-7(4F9), 1-6(7E12), 4-9(15G11), 5-10(5H2)을 선정하였다.
실시예 4. Indirect ELISA법을 이용한 PKA 항원 코팅량의 최적화
Invitrogen사에서 구입한 PKA 재조합 인간 단백질를 항원으로, 실시예 3에서 확인된 PKA 클론 세포 배양 상층액 중 상위의 상층액을 항체로 사용하여 Indirect ELISA 시험을 진행하여 O.D@450nm 값을 통해 최적의 코팅량을 분석하였다.
구체적으로, 96well 면역플레이트에 PKA 재조합 인간 단백질을 0.5, 1, 2ng/μl를 100μl씩 로딩한 후, 19시간 동안 4℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, 0.1% BSA+0.05% Tween20를 이용하여 블로킹을 하고 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, 실시예 3에서 확인된 PKA 클론 세포 배양 상층액 중 상위의 상층액을 1차 항체로 사용하여 100μl/well씩 로딩하였고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST로 앞의 과정과 동일하게 세척한 다음, 항 마우스 IgG-HRP 0.2ng/μl를 100μl/well씩 로딩하여, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 TMB를 100μl/well씩 로딩하여 호일로 싸서 어둡게 하여 10분 동안 실온에서 발색을 한 후, 0.5M H2SO4를 100μl/well씩 로딩하여 반응을 멈춘 후, 450nm에서 O.D값을 측정하였다. 200ng/well씩 PKA 재조합 인간 단백질을 로딩하여 진행한 O.D@450nm에서 가장 강도가 높은 것을 확인하였고, 이후 해당 조건으로 실험을 진행하였다.
실시예 5. 각 PKACA 펩타이드와 상위 4개 PKA 클론 세포 배양 상층액(항체)의 상호작용 확인
상위 4개 PKA 클론 세포 배양 상층액인 항 PKA1-7(4F9), 1-6(7E12), 4-9(15G11), 5-10(5H2) 내 항체와 각각의 PKACA 펩타이드(항원)와의 결합 정도를 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA법을 이용하여 O.D@450nm에서의 값을 측정하였다.
구체적으로, 상위 4개의 PKA 클론 세포 배양 상층액을 96well 면역플레이트에 100μl씩 로딩하여 19시간 동안 4℃에서 배양을 하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, 0.1% BSA+0.05% Tween20를 이용하여 블로킹을 하고 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, 실시예 1에서 제작된 펩타이드를 0.1% BSA+0.05% Tween20로 희석하여 2ng/μl로 만들었다. 각자의 상층액 로딩 well에 100μl/well씩 로딩하였고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST로 앞의 과정과 동일하게 세척한 다음, PKA α/β CAT 항체를 0.1% BSA+0.05% Tween20를 이용하여 10,000:1로 희석하여 100μl씩 로딩하고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, 토끼 항 마우스 IgG HRP(@0.8mg/ml)을 0.1% BSA+0.05% Tween20를 이용하여 10,000:1로 희석하여 100μl씩 로딩하고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well씩 넣어 3차례 세척한 다음, TMB를 100μl/well씩 로딩하여 호일로 싸서 어둡게 하여 10분 동안 실온에서 발색을 하였다. 그리고 0.5M H2SO4를 100μl/well씩 로딩하여 반응을 멈춘 후, 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
표 2에 나타난 바와 같이, 클론에 따라서 O.D@450nm에서 강도가 다르게 나타남을 확인하였다. PKACA 항원 펩타이드 중 PKA 1, 3, 4에 대한 흡광도 값이 크고 오차범위가 작은 샘플을 선택하고자 하였으며, 여러 클론 중에서도 PKA1-7과 4-9가 가장 적합한 항원 결합력을 나타낸다고 사료되어 확정하고 이후의 정제 및 검출실험을 진행하였다.
No. |
PKA Clone cell
culture sup. |
Antigen | O.D@450nm | Error |
1 | 1-6(7E12) | PKA peptide1 | 3.117 | 1.390 |
2 | 1-7(4F9) | PKA peptide1 | 3.250 | 0.280 |
3 | 2-1(3G2) | PKA peptide2 | 3.136 | 3.6582 |
4 | 2-2(2D5) | PKA peptide2 | 3.329 | 3.463 |
5 | 3-1(1A6) | PKA peptide3 | 2.971 | 3.561 |
6 | 3-5(4E7) | PKA peptide3 | 2.998 | 1.010 |
7 | 4-4(11E12) | PKA peptide4 | 3.005 | 2.359 |
8 | 4-9(15G11) | PKA peptide4 | 3.381 | 0.038 |
9 | 5-1(3A9) | PKA peptide5 | 3.527 | 2.377 |
10 | 5-10(5H2) | PKA peptide5 | 3.634 | 1.944 |
실시예 6. 샌드위치 ELISA 법을 이용하여 기존 PKA 항원의 유용성 확인
Invitrogen사에서 구입한 PKA 재조합 인간 단백질(Invitrogen_PKA Ag)과 PKA 클론 세포 배양 상층액을 도 4에서 나타낸 샌드위치 ELISA법을 이용하여 항원으로서 유용성을 확인하였고, 실시예 1에서 제작한 PKA 펩타이드와 비교하였다.
구체적으로, 96well 면역플레이트에 실시예 5에서 확인한 O.D@450nm 강도가 높은 상위 10개의 상층액을 100μl/well씩 로딩하고, 19시간 동안 4℃에서 배양하였다. 1X PBST를 300μl/well 씩 로딩하여 3차례 세척하고, 0.1% BSA+0.05% Tween20를 300μl/well씩 로딩하여 블로킹을 하여 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well 씩 로딩하여 3차례 세척하고, 0.1% BSA+0.05% Tween20로 희석하여 Invitrogen_PKA Ag을 2ng/μl로 만든 후, 100μl/well씩 로딩하여 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well 씩 로딩하여 3차례 세척하고, 0.1% BSA+0.05% Tween20를 이용하여 토끼 항 마우스 IgG H&L (HRP) (ab6728, 2mg/ml)를 1:10,000으로 희석하여 만든 0.2ng/μl를 100μl/well 씩 로딩하고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 1X PBST를 300μl/well 씩 로딩하여 3차례 세척하고, TMB를 100μl/well 씩 넣어 10분간 발색 후, 0.5M H2SO4를 100μl/well씩 로딩하여 반응을 멈춘 후, 450nm에서 O.D값을 측정하였다.
대부분 상층액에서 흡광도가 0.5이상이 나와서 실시예 2에서 합성한 PKA clone cell의 배양 상등액에 대한 Invitrogen_PKA의 항원으로서 유용성을 확인할 수 있었다.
또한, 그리고 실시예 1에서 합성한 PKACA 펩타이드를 항원의 흡광도와 비교한 결과 PKA 클론 세포 배양 상층액과의 반응에선 실시예 1에서 합성한 PKACA 펩타이드의 강도가 더 높음을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 본 발명의 PKA 항체 서열의 확인
선별된 항체 라이브러리의 가변영역 서열 분석을 위해 각 하이브리도마 세포주로부터 RNA 추출(prep.) 진행한 다음 cDNA 합성 후에 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 유전자를 PCR 증폭하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
VL | VH | |||||
Clone | CDR1 | CDR2 | CDR3 | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
PKA 1-7 | SASSSVSYMY | DTPNLAS | QQWSSYPFT | TYAMN | RIRSKSNNYATYYADSVKD | PYYYYGSSYMDY |
PKA 4-9 | TASSSVSSSYLH | STSNLAS | HQFHRSPFT | HYAMH | VISIYYDNTNYNQKFKG | SGSTMITGFAY |
VL | VH | |
Clone | ||
PKA 1-7 | DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTPNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPFTFGSGTKLELK | EVQRVESGGGLVQPKGSLKLSCAVSGFTFKTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVSPYYYYGSSYMDYWGQGTTVTVSS |
PKA 4-9 | DVVMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYLQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQFHRSPFTFGSGTKLEIK | EVQLQQSGPELVRPGESVRISCKGSGYTFTHYAMHWVKQSHAKSLEWIGVISIYYDNTNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARSGSTMITGFAYWGQGTLVTVSA |
* CDR : 진하게 표시
실시예 8. 본 발명 항체의 결합력 확인
PKA 1-7 및 4-9 하이브리도마 배양 상층액(2차 항체는 항-mIgG-HRP)을 사용하여, 각 항원에 대한 결합력을 ELISA를 통해 확인하였다. ELISA 조건은 하기 표 5와 같다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명 상층액 내 IgG 항체의 각 항원에 대한 결합능이 우수함을 확인하였다.
실시예 9. 본 발명 항체의 암 진단 효과 확인 (1)
본 발명 PKA 항체의 암 진단 효과를 확인하기 위하여, 전립선암, 유방암 및 건강한 사람의 혈청 샘플에 대해 본 발명 PKA 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 실시하였다.
구체적으로, 500μL의 항체 PKA 1-7 및 PKA 4-9 (0.1, 1.0, 2.0, 2.0, 10.0 μg/mL)를 10mL의 탄산염 및 중탄산염 완충액 (pH 9.5)에 용해시키고 표면 코팅을 위해 96 웰 플레이트 (100μL/웰)에 두었다. 4℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 300μL/well 블로킹 용액[1% BSA in PBS (300μL/well)]을 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 블로킹 웰을 PBST (3X)로 세척하고 혈청 샘플 (10μL)을 100μL/well에 첨가하여 0.1% BSA + 0.05% Tween20(1μL/10mL) 10mL 용액을 준비하였다. 37℃에서 항원으로 2시간 배양한 후 PBST로 3 회 세척하고 2차 항체인 염소 항 인간 IgG HRP (1μg/mL)를 1μL/10mL 농도의 동일한 용액에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 TMB 기질 용액을 100μL/well로 첨가하고 37℃에서 15분 동안 두었다. 이 반응은 0.5M H2SO4 (100μL/well)를 추가하여 중단되었으며 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항체 PKA 1-7 및 PKA 4-9는 정상 대조군과 암 환자를 유의하게 구분함을 확인하였는 바, 본 발명의 항체를 암 진단에 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 10. 본 발명 항체의 암 진단 효과 확인 (2)
본 발명 PKA 항체의 암 진단 효과를 확인하기 위하여 전립선암, 유방암 및 건강한 사람의 혈청 샘플에 대해 검출분석을 실시하였다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, direct ELISA법을 이용하여 PKA 항원-PKA 자가항체 접합체를 본 발명 PKA 항체를 통해 direct ELISA법을 실시하였다.
구체적으로, 500μL의 항체 PKA 1-7 및 PKA 4-9 (0.1, 1.0, 2.0, 2.0, 10.0 μg/mL)를 10mL의 탄산염 및 중탄산염 완충액 (pH 9.5)에 용해시키고 표면 코팅을 위해 96 웰 플레이트 (100μL/웰)상에 4℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 300μL/well 블로킹 용액[1% BSA in PBS (300μL/well)]을 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 블로킹 웰을 PBST (3X)로 세척하고 혈청 샘플 (10μL)을 100μL/well에 첨가하여 0.1% BSA + 0.05% Tween20(1μL/10mL) 10mL 용액을 준비하였다. 37℃에서 혈청샘플을 2시간 배양한 후 PBST로 3 회 세척하고 2차 항체인 염소 항 인간 IgG HRP (1μg/mL)를 1μL/10mL 농도의 동일한 용액에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 TMB 기질 용액을 100μL/well로 첨가하고 37℃에서 15분 동안 두었다. 이 반응은 0.5M H2SO4 (100μL/well)를 추가하여 중단되었으며 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항체 PKA 1-7 및 PKA 4-9는 정상 대조군과 암 환자를 유의하게 구분함을 확인하였는 바, 본 발명의 항체를 암 진단에 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원결합 단편은 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파의 특정 도메인에 특이적으로 결합함으로써, 기존 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 항원과 비교하여 친화도가 현저히 증대되었으며, 실제 암 환자를 진단할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 향후 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 또는 이에 대한 자가항체를 단백질 수준에서 특이적으로 검출하여 암의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있어, 본 발명은 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (20)
- 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 항원결정부(epitope)로 인식하는 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 6 및 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체의 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 18 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체의 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체의 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체의 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, dsFv, Fd, Fd' 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체의 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서,상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서,상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34 내지 37로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제9항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
- (a) 제9항의 재조합 발현벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 항체의 단편을 생산하는 단계; 및(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 항체의 단편을 수득하는 단계를 포함하는,단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
- 제12항에 있어서,상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물.
- 제12항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보제공방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보제공방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 조성물의 암 진단 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편의 암 진단제를 생산하기 위한 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 또는 이에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 단백질 키나아제 A의 촉매 서브 유닛 알파 또는 이에 대한 자가항체를 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 발병 위험도를 예측하는 방법.
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PCT/KR2021/019380 WO2022154288A1 (ko) | 2021-01-12 | 2021-12-20 | 단백질 키나아제 a의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 활용한 암 진단 용도 |
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KR102314451B1 (ko) * | 2021-01-12 | 2021-10-20 | 크레너지 주식회사 | 단백질 키나아제 a의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 활용한 암 진단 용도 |
Citations (4)
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KR20030036011A (ko) * | 2001-10-30 | 2003-05-09 | 주식회사 에이.비.아이 | 암 진단을 위한 항프로테인 키나제 에이 항체를 이용한효소면역측정법 |
KR20050054387A (ko) * | 2003-12-04 | 2005-06-10 | 주식회사 에이.비.아이 | 암진단용 프로테인 키나제 에이 항체 분절 및 알칼리성포스파타제의 융합단백질 |
US20120322080A1 (en) * | 2009-10-15 | 2012-12-20 | Traxxsson, Llc | Measurement of PKA for Cancer Detection |
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- 2021-12-20 WO PCT/KR2021/019380 patent/WO2022154288A1/ko active Application Filing
Patent Citations (4)
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---|---|---|---|---|
KR20030036011A (ko) * | 2001-10-30 | 2003-05-09 | 주식회사 에이.비.아이 | 암 진단을 위한 항프로테인 키나제 에이 항체를 이용한효소면역측정법 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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SMITH F. DONELSON, SAMELSON BRET K., SCOTT JOHN D.: "Discovery of cellular substrates for protein kinase A using a peptide array screening protocol", BIOCHEMICAL JOURNAL, PUBLISHED BY PORTLAND PRESS ON BEHALF OF THE BIOCHEMICAL SOCIETY., GB, vol. 438, no. 1, 15 August 2011 (2011-08-15), GB , pages 103 - 110, XP055951538, ISSN: 0264-6021, DOI: 10.1042/BJ20110720 * |
Also Published As
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