WO2021107725A1 - Cobll1 단백질 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도 - Google Patents

Cobll1 단백질 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도 Download PDF

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seq
sequence
antibody
cobll1
variable region
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김동욱
김홍태
김용환
안유리
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가톨릭대학교 산학협력단
울산과학기술원
성균관대학교 산학협력단
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof specific for Cobll1 protein, and uses thereof.
  • Leukemia refers to a disease in which white blood cells proliferate as a tumor.
  • the types of leukemia can be divided into myeloid leukemia and lymphocytic leukemia according to the white blood cells from which the leukemia originates, and are divided into acute leukemia and chronic leukemia according to the rate of progression.
  • the clinical manifestations of leukemia vary depending on the type of disease and the nature of the cells involved. Lymphocytic leukemia is caused by lymphoid blood cells, myeloid leukemia is caused by myeloid blood cells, and chronic myelogenous leukemia is caused by malignant clones of mutated hematopoietic stem cells (HSCs).
  • HSCs mutated hematopoietic stem cells
  • chronic myelogenous leukemia is a malignant blood cancer that mainly occurs in adults as a malignant blood disease in which hematopoietic stem cells proliferate in large quantities in the bone marrow and abnormally increased various blood cells invade peripheral blood or other organs .
  • Chronic myeloid leukemia progresses through three clinical stages: chronic phase (CP), accelerated phase (AP), and blast crisis (BC).
  • CP chronic phase
  • AP accelerated phase
  • BC blast crisis
  • the most common method for diagnosing chronic myeloid leukemia is to find the Philadelphia chromosome through a chromosome test.
  • translocation between chromosome 9 and chromosome 22 is found, and the translocation is a part of the abelson oncogene (ablson oncogene) gene present at position q34 of chromosome 9, chromosome 22 q11.2 It is formed by translocation to the bcr (break point cluster region) gene present in the position, and this rearrangement is called a BCR-ABL1 rearrangement.
  • ablson oncogene ablson oncogene
  • the translocation leading to the BCR-ABL1 fusion gene is the major cause of CML initiation, and the BCR-ABL1 fusion gene encodes a BCR-ABL1 fusion protein, which is a constitutively active tyrosine kinase.
  • Imatinib was the first tyrosine kinase inhibitor (TKI) to target BCR-ABL1 and was found to be very effective in the treatment of CML.
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • imatinib has a problem in that it cannot completely eliminate CML clones due to the resistance and insensitivity of primitive CML cells to imatinib treatment.
  • nilotinib is being used to treat CML as a TKI.
  • BCR-ABL1 TKIs including ATP and allosteric site inhibitors
  • some patients still develop resistance to TKIs in the acute stage. This resistance was found to be either BCR-ABL1 kinase dependent or independent. While the majority of patients develop resistance through BCR-ABL1 kinase-dependent mechanisms such as point mutations or amplification, the presence of BCR-ABL1-independent resistance suggests that there are other mechanisms of TKI resistance.
  • Cobll1 protein is known as a negative regulator of apoptosis and is associated with low insulin resistance.
  • CP chronic phase
  • BP acute phase
  • Cobll1 protein is not expressed in the chronic phase (CP)
  • BP acute phase
  • Cobll1 protein is known to induce TKI resistance and blastic transformation through activation of the NF- ⁇ B signaling pathway in CML (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Korean Patent No. 10-1820572
  • Non-Patent Document 1 Han, S., et al. Cobll1 is linked to drug resistance and blastic transformation in chronic myeloid leukemia. Leukemia 31, 1532 (2017)
  • the onset or progression of CML is diagnosed at an early stage by detecting the Cobll1 protein, which is highly expressed in the acute phase cells of chronic myeloid leukemia (CML) or cells resistant to the existing target anticancer drugs, and the prognosis of the patient is more rapidly and accurately aimed at predicting.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention effectively detects Cobll1 protein, and can be effectively used in a method for diagnosing advanced stages of chronic myeloid leukemia (CML) or cancer.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • novel antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to the Cobll1 protein, thereby effectively detecting the Cobll1 protein.
  • the acute stage of chronic myelogenous leukemia, cervical cancer or osteosarcoma can be quickly, accurately and conveniently diagnosed, and the diagnosis, prevention, treatment, etc. of chronic myelogenous leukemia or cancer It can be used in various fields of
  • FIG. 2 shows the results of Western blot on the antigen of the N-terminal region of the Cobll1 protein expressed and purified in Example 1.
  • Example 3 and 4 show that the monoclonal antibody prepared in Example 1 normally detects Cobll1 protein expressed in 293T cells (Myc-Cobll1) and acute CML patient cells (KRCMC 1885 PBMC, BC) overexpressing Myc-Cobll1 protein.
  • Myc-Cobll1 protein expressed in 293T cells Myc-Cobll1
  • KRCMC 1885 PBMC, BC acute CML patient cells
  • Example 5 is a Western blot result showing that the polyclonal antibody prepared in Example 2 normally detects Cobll1 protein.
  • K562 denotes human-derived chronic myeloid leukemia cells
  • 293T denotes human-derived kidney cells
  • HeLa denotes human-derived cervical cancer cells
  • H1299 denotes human-derived lung cancer cells.
  • FIG. 6 shows the amino acid sequences of VH and VL of monoclonal antibodies 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 and 18D12.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the Cobll1 protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the Cobll1 protein of the present invention may be selected from the group consisting of the following (1) to (5).
  • CDRH1 having the sequence of SEQ ID NO: 1; CDRH2 having the sequence of SEQ ID NO:2; and a heavy chain variable region comprising a CDRH3 having the sequence of SEQ ID NO:3; and CDRL1 having the sequence of SEQ ID NO:4; CDRL2 having the sequence of SEQ ID NO: 5; and a light chain variable region comprising a CDRL3 having the sequence of SEQ ID NO: 6, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a Cobll1 protein.
  • CDRH1 having the sequence of SEQ ID NO: 13; CDRH2 having the sequence of SEQ ID NO: 14; and a heavy chain variable region comprising a CDRH3 having the sequence of SEQ ID NO: 15; and CDRL1 having the sequence of SEQ ID NO: 16; CDRL2 having the sequence of SEQ ID NO: 17; and a light chain variable region comprising a CDRL3 having the sequence of SEQ ID NO: 18.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a Cobll1 protein.
  • CDRH1 having the sequence of SEQ ID NO:25; CDRH2 having the sequence of SEQ ID NO:26; and a heavy chain variable region comprising a CDRH3 having the sequence of SEQ ID NO: 27; and CDRL1 having the sequence of SEQ ID NO: 28; CDRL2 having the sequence of SEQ ID NO: 29; and a light chain variable region comprising a CDRL3 having the sequence of SEQ ID NO: 30.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a Cobll1 protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be an antibody 1 to antibody 5 or an antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain CDR and a light chain CDR consisting of the amino acid sequences of Table 1 below.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the Cobll1 protein of the present invention may be selected from the group consisting of the following (6) to (10).
  • (6) a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 31; and a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 32, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a Cobll1 protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be an antibody 1 to antibody 5 or an antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region consisting of the amino acid sequences shown in Table 2 below.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the Cobll1 protein of the present invention may be selected from the group consisting of the following (11) to (15).
  • (11) a heavy chain variable region having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41; and a light chain variable region having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is antibody 1 to antibody 5 or antigen-binding thereof comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region consisting of amino acid sequences each encoded by the nucleotide sequences of Table 3 below. It can be short.
  • antibody refers to a polypeptide that specifically binds to and recognizes an antigen, such as Cobll1 protein.
  • the present invention includes not only the complete antibody form that binds to the Cobll1 protein, but also antigen-binding fragments of the antibody molecule.
  • antibody may include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • An antibody is composed of two heavy chains and two light chains, and has a variable region in which the amino acid sequence varies depending on the type of antigen and a constant region in which the sequence does not change.
  • the antibody in the present invention may be a monoclonal antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody referred to herein as 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 or 18D12.
  • the term "monoclonal antibody” means that the antibody molecule is prepared as a single molecule.
  • Monoclonal antibodies have specificity to respond only to antigens having the same epitope, and also show affinity for only a specific epitope.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be one that specifically binds to the Cobll1 protein.
  • the monoclonal antibody of the present invention may specifically bind to a small fragment or isoform of the Cobll1 protein having a size of 140 kDa or 180 kDa.
  • the 18D12 monoclonal antibody of the present invention can specifically bind to a small fragment or isoform of the Cobll1 protein having a size of 180 kDa.
  • the 3A11 or 6A2 monoclonal antibody of the present invention can specifically bind to a small fragment or isoform of the Cobll1 protein having a size of 140 kDa.
  • the monoclonal antibody may be produced in a hybridoma cell line.
  • the hybridoma cells can be prepared using methods known in the art. For example, the hybridoma cells immunize an animal with an antigenic protein, fuse B cells, which are antibody-producing cells derived from the immunized animal, with myeloma cells to prepare a hybridoma, and then It can be prepared by a method of selecting a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds.
  • the animal to be immunized may be not only the mouse used in Examples, but also animals such as goats, sheep, guinea pigs, rats, or rabbits.
  • the present invention also provides a hybridoma cell line producing the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain linked to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain has the types of IgG, IgM, IgD, and IgA, and the light chain has the kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • the heavy chain may be IgM, and the light chain may be a kappa type.
  • variable regions of the light and heavy chains contain three highly variable regions called “complementarity-determining regions (CDRs)".
  • the CDRs bind to an epitope of an antigen, and the CDRs of each chain typically have three regions (CDR1, CDR2 and CDR3).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 regions
  • the CDRs of the heavy chain are also referred to as CDRH1, CDRH2 and CDRH3
  • These CDRs are very important regions in antigen specificity for each antibody, and thus are the most important parts for specifying the antibody.
  • the term "antigen-binding fragment (of an antibody)” refers to a fragment retaining antibody function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv, and the like.
  • Fab fragment antigen binding
  • Fab fragment antigen binding
  • CH1 heavy chain first constant region
  • F(ab') differs from Fab in that it has a hinge region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • the F(ab') 2 antibody is produced by forming a disulfide bond with a cysteine residue in the hinge region of F(ab').
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombinant technique for generating an Fv fragment is known in the art.
  • a double-chain Fv two-chain Fv
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked by a non-covalent bond
  • single-chain variable fragment scFv
  • scFv is generally a heavy chain variable region and a light chain variable region through a peptide linker.
  • the regions may be linked by covalent bonds or linked directly at the C-terminus to form a dimer-like structure like a double-stranded Fv.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., papain-restricted digestion of the whole antibody yields Fab and pepsin digestion yields F(ab') 2 fragments), or It can be produced through genetic recombination technology.
  • FR refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues, also referred to as CDRs.
  • HVR hypervariable region
  • FRs of a variable domain generally consist of the four FR domains FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • CDR HVR
  • FR sequences generally appear in the heavy chain variable region (VH) in the following order:
  • VL light chain variable region
  • the term “specifically binds” or the like means that an antibody or antigen-binding fragment thereof, or other construct such as an scFv, forms a complex with an antigen that is relatively stable under physiological conditions.
  • Specific binding may be characterized by an equilibrium dissociation constant of at least about 1 x 10 -6 M or less (eg, a KD less than this indicates tighter binding).
  • Methods for determining whether two molecules specifically bind are well known in the art and include, for example, equilibrium dialysis, surface plasmon resonance, and the like.
  • the antibody of the present invention may be a human antibody, a humanized antibody, or a chimeric antibody.
  • human antibody or “humanized antibody” refers to an antibody produced by a human or human cell, or from a non-human source using human antibody repertoires or other human antibody coding sequences. has an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of an antibody derived from
  • chimeric antibody means that a portion of the heavy and/or light chain is derived from a particular source or species and the remainder of the heavy and/or light chain is derived from a different source or species. means antibodies.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include a variant of the amino acid sequence described in the accompanying sequence list within a range capable of specifically recognizing Cobll1 protein.
  • changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be said to be biologically functional equivalents.
  • Amino acid exchanges in proteins that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ Exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the nucleic acid of the present invention encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is interpreted to include a nucleotide nucleotide sequence showing substantial identity to the nucleotide nucleotide sequence described above.
  • the substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. homology, more preferably at least 90% homology, and most preferably at least 95% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.
  • BLAST The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI), etc. It can be used in conjunction with sequencing programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLAST can be accessed through the BLAST page of the ncbi website. A method for comparing sequence homology using this program can be found on the BLAST help page of the ncbi website.
  • NBCI National Center for Biological Information
  • the present invention also provides an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the term "expression vector” refers to a vector comprising recombinant nucleotides comprising an expression control sequence operably linked to a nucleotide base sequence to be expressed in order to express a target gene in a host cell.
  • the expression vector contains sufficient cis-acting elements for expression, and other elements for expression may be provided by a host cell or an in vitro expression system.
  • the expression vector may include a plasmid vector containing a recombinant polynucleotide; cozmid vector; and viral vectors such as bacteriophage vectors, adenoviral vectors, lentiviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • the nucleic acid molecule encoding the switch molecule in the vector of the present invention is operatively linked to the promoter of the vector.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence to regulate the transcription and/or translation of said other nucleic acid sequences.
  • the recombinant vector system of the present invention can be constructed through a variety of methods known in the art, and specific methods thereof are described in [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)], etc. disclosed, which is incorporated herein by reference.
  • cloning is a genetic engineering technique that mass-produces the same gene, and is introduced into a plasmid or virus that acts as a vector to mass-produce a gene or DNA fragment, which is then introduced through cell division. It refers to the technology of cloning entirely identical clones.
  • cDNA refers to DNA complementary to mRNA.
  • clone refers to identical copies, which refer to identical copies of the same population of cells or specific gene segments.
  • transformation refers to a change in the genetic properties of a host cell by introducing a foreign gene into a host cell, and when the host is a eukaryotic cell, the term “transfection” is used.
  • Transformation used in the present invention may include any method of introducing a foreign gene into an organism, cell, tissue or organ, and preferably means introducing the foreign gene into E. coli.
  • a transformation method a method generally used such as electroporation, a method using liposomes, and a DNA transport method using Ca++ can be used.
  • the present invention also provides a kit for detecting Cobll1 protein, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Cobll1 protein was not expressed in the chronic phase (CP), which is the early stage of CML, but the expression level of the Cobll1 protein was significantly increased in the patient sample that reached the acute phase (BC). In addition, it was confirmed that Cobll1 protein was expressed in HeLa cells, which are cervical cancer cells, and U2OS cells, which are osteosarcoma cells.
  • the kit of the present invention can be used for diagnosing the acute stage of chronic myeloid leukemia, or diagnosing cervical cancer or osteosarcoma.
  • the kit for detecting the Cobll1 protein of the present invention includes a tool for collecting a test sample or applying a detection reagent, a reagent or device for confirming antigen-antibody binding, etc. using an antibody to check the presence or absence of an antigen protein from a biological sample.
  • Tools, devices, or reagents that may be included in conventional detection or diagnostic kits may further be included.
  • the kit of the present invention can be used for diagnosing the acute stage of chronic myelogenous leukemia by detecting Cobll1 protein according to an immunoassay method, or for diagnosing cervical cancer or osteosarcoma.
  • This immunoassay may be performed according to various previously developed immunoassays or immunostaining protocols.
  • the immunoassay or immunostaining format may be, for example, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELISA), flow cytometry, immunofluorescence staining, immunoaffinity purification, immunochromatography. (immunochromatography) and the like.
  • the kit of the present invention may be for use in a sandwich enzyme-linked immunoassay (Sandwich ELISA).
  • the kit may comprise the antibody or antigen binding site thereof as a capturing antibody; and a polyclonal antibody against the Cobll1 protein as a detection antibody. It may be a kit for detecting Cobll1 protein.
  • the antibody or antigen-binding site thereof as the capture antibody may be preferably a monoclonal antibody, and more preferably, a monoclonal antibody 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 or 18D12.
  • the polyclonal antibody as the detection antibody preferably binds specifically to the C-terminal region of the Cobll1 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53.
  • the detection antibody may be linked to a detection label.
  • detection labels include chemicals (eg, biotin), enzymes (eg, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, Horseradish peroxidase (HRP), and cytochrome P450). ), radioactive materials (e.g., C14, I125, P32 and S35), fluorescent materials (e.g. fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • the detection label is biotin.
  • the test target sample may be a biological material derived from an individual.
  • the subject may be a vertebrate.
  • the vertebrate may be a mammal, preferably a human.
  • the sample may be collected or isolated from a subject, for example, blood or blood constituent, bodily fluid, saliva, sputum, or a combination thereof.
  • the present invention provides a method for detecting Cobll1 protein, comprising the step of contacting the capture antibody and the detection antibody with a test target sample using the detection kit, and detecting the antigen-antibody complex formed therefrom.
  • the detection method of the present invention comprises
  • the term “antigen-antibody complex” refers to a combination of the Cobll1 protein antigen in a sample and the antibody according to the present invention that recognizes it.
  • Such antigen-antibody complexes are prepared by a colormetric method, an electrochemical method, a fluorimetric method, a luminometry, a particle counting method, a visual assessment and a scintillation method. counting method) can be detected by any method selected from the group consisting of. By this detection, the Cobll1 protein can be analyzed qualitatively or quantitatively.
  • the N-terminus of the Cobll1 protein was selected through secondary structure analysis and hydrophobicity & antigenicity analysis of the Cobll1 protein (SEQ ID NO: 51) to prepare an antigen.
  • Example 1 The antigen purified in Example 1 was injected into BALB/C mice for primary immunization. Two weeks later, the antigen was re-injected for a second immunization. Immune response tests were performed by collecting blood from mice and measuring antibody titers by ELISA. Antigen was injected every 2 weeks to enhance the immune response until the measured titer reached the reference titer (O.D. > 1.5 at serum dilution 1:1000) that can be said to have produced an appropriate antibody.
  • ELISA was performed using the culture supernatant. Cells in wells showing a positive result in ELISA were aliquoted into 96-well plates. After the first cloning, when colonies were formed, ELISA was performed to select a positive well having a high O.D. value and one colony in the well from among the wells showing a positive result, and secondary cloning was performed.
  • Cloning was performed three times in this way, and the clones with the highest ELISA score were selected through ELISA screening to obtain hybridoma cell lines 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 and 18D12. This was cultured to obtain monoclonal antibodies 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 and 18D12.
  • the gene sequence of the C-terminal region (SEQ ID NO: 53) of the Cobll1 protein was inserted into a GST-vector, and the vector was first injected into rabbits through subcutaneous injection as an antigen. Two weeks later, after the second injection of the vector, blood was collected on day 55, and Rabbit-anti-Cobll1 antibody was isolated from the collected rabbit blood according to the established protocol using the Aminolink Coupling Gel Column Kit.
  • the prepared polyclonal antibody is a cell expressing the Cobll1 protein, that is, chronic myeloid leukemia cells (K562), kidney cells (293T), cervical cancer cells (HeLa), lung cancer cells (H1299). ) was confirmed to bind to. From this, it was confirmed that the polyclonal antibody binding to the Cobll1 protein was normally prepared.
  • amino acid sequences and base sequences of VH and VL of monoclonal antibodies 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 and 18D12 are shown in FIGS. 6 to 11 .
  • Example 2 Using the 5 hybridoma cell lines of Example 2, the isotype of each monoclonal antibody was analyzed using the Isotype ELISA kit. As a result, as shown in Table 5, it was confirmed that all isotypes of monoclonal antibodies were IgG (kappa).

Abstract

본 발명은 Cobll1 단백질에 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Cobll1 단백질을 효과적으로 검출하여, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia; CML)의 진행 단계 또는 암의 진단 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

Cobll1 단백질 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도
본 발명은 Cobll1 단백질에 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성 백혈병과 만성 백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상학적 양상은 질환의 유형과 침범한 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성 골수성 백혈병은 변이가 생긴 조혈모세포(hematopoietic stem cell; HSC)의 악성 클론들에 의해서 발생한다.
특히, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML)은 조혈모세포가 골수 내에서 대량 증식하여 비정상적으로 증가한 각종 혈구 세포가 말초 혈액이나 기타 장기를 침습하는 악성 혈액 질환으로 성인에서 주로 발병하는 악성 혈액암이다. 만성 골수성 백혈병은 만성기(chronic phase; CP), 가속기(accelerated phase; AP) 및 급성기(blast crisis; BC)의 세 가지 임상 단계를 통해 진행된다. 만성 골수성 백혈병의 진단을 위한 가장 일반적인 방법은 염색체 검사를 통해서 필라델피아 염색체를 발견하는 것이다. 실제 만성 골수성 백혈병 환자의 95% 정도에서 9번 염색체와 22번 염색체 사이의 전좌가 발견되며, 상기 전좌는 9번 염색체의 q34 위치에 존재하는 abl(abelson oncogene) 유전자 일부가 22번 염색체 q11.2 위치에 존재하는 bcr(break point cluster region) 유전자로 전위되어 형성되는데, 이러한 재배열을 BCR-ABL1 재배열(BCR-ABL1 rearrangement)이라고 한다.
일반적으로, BCR-ABL1 융합 유전자를 초래하는 전위는 CML 개시의 주요 원인이며, BCR-ABL1 융합 유전자는 항상적으로 활성화된(constitutively active) 티로신 키나아제인 BCR-ABL1 융합 단백질을 암호화한다. 이매티닙(imatinib)은 BCR-ABL1을 표적으로 하는 최초의 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor; TKI)로서, CML 치료에 매우 효과적임이 밝혀졌다. 그러나 이매티닙은 이매티닙 치료에 대한 primitive CML 세포의 내성(resistance) 및 비감수성(insensitivity)으로 인해, CML 클론을 완전히 제거할 수 없다는 문제가 있다. 그 외에도, 닐로티닙(nilotinib)이 TKI로서 CML 치료에 사용되고 있다. ATP 및 allosteric 부위 억제제를 포함한 차세대 BCR-ABL1 TKI의 개발에도 불구하고 일부 환자는 급성기로의 진행 단계에서 여전히 TKI에 대한 내성을 나타낸다. 이러한 내성은 BCR-ABL1 키나아제 의존성이거나 또는 비의존성인 것으로 밝혀졌다. 대다수의 환자는 점 돌연변이(point mutation)나 증폭(amplification)과 같은 BCR-ABL1 키나아제 의존성 메커니즘을 통해 내성을 나타내는 반면, BCR-ABL1 비의존성 내성의 존재는 TKI 내성의 다른 메커니즘이 있음을 시사한다.
그 외에도 만성 골수성 백혈병의 급성기에서는 상당수의 환자가 표적항암제에 내성을 보이는데, 병기의 진단이 이루어지지 못한 채 항암제 치료를 진행하다가 골수이식 등의 대체적인 치료 전략을 세우는 시기 등이 지연되는 문제가 발생하기도 한다.
따라서 만성 골수성 백혈병에 대한 새로운 바이오마커로서의 단백질을 확인하고 이의 기능을 분석하는 연구가 진행되고 있다.
Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1) 단백질은 세포사멸의 음성 조절인자(negative regulator)로 알려져 있으며 낮은 인슐린 내성과 관련되어 있다. 또한, Cobll1의 발현이 높은 CML 환자의 경우 임상 결과가 좋지 않다고 알려져 있다. 특히 Cobll1 단백질은 CML의 진행 초기인 만성기(CP)에서는 발현되어 있지 않으나, 급성기(BP)에서 발현이 확연히 증가하여, Cobll1 단백질이 CML의 급성기로의 진행과 연관되어 있음이 확인된 바 있다. 또한 Cobll1의 발현시 TKI에 내성을 갖는 것으로 연구된 바 있다(특허문헌 1). 나아가 Cobll1은 CML에서 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 통해 TKI 내성과 모세포 전환(blastic transformation)을 유도하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).
(특허문헌 1) 한국등록특허 제10-1820572호
(비특허문헌 1) Han, S., et al. Cobll1 is linked to drug resistance and blastic transformation in chronic myeloid leukemia. Leukemia 31, 1532 (2017)
본 발명에서는 만성 골수성 백혈병(CML)의 급성기 세포 또는 기존의 표적 항암제에 내성을 보이는 세포에서 많이 발현되는 Cobll1 단백질을 검출함으로써, CML의 발병 또는 진행을 조기에 진단하여 환자의 예후를 보다 신속하고 정확하게 예측하는 것을 목적으로 한다.
이를 위해 본 발명에서는 Cobll1 단백질에 특이적인 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Cobll1 단백질을 효과적으로 검출하여, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia; CML)의 진행 단계 또는 암의 진단 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하여, Cobll1 단백질을 효과적으로 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용함으로써, 만성 골수성 백혈병의 급성기, 또는 자궁경부암 또는 골육종을 신속하고, 정확하며, 간편하게 진단할 수 있어, 만성 골수성 백혈병 또는 암의 진단, 예방, 치료 등의 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
또한 본 발명의 항체를 이용한 ELISA 키트를 사용함으로써, 시료의 대량 검사가 가능하며, 분자적 진단으로써의 응용 가능성을 기대할 수 있다.
도 1은 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 Cobll1 단백질의 N-말단 부위의 항원을 정제한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 발현 및 정제된 Cobll1 단백질의 N-말단 부위의 항원에 대해 Western blot을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3 및 4는 각각 실시예 1에서 제조된 단클론항체가 Myc-Cobll1 단백질을 과발현하는 293T 세포(Myc-Cobll1) 및 CML 급성기 환자 세포(KRCMC 1885 PBMC, BC)에서 발현되는 Cobll1 단백질을 정상적으로 검출하였음을 보여주는 Western blot 결과이다.
도 5는 실시예 2에서 제조된 다클론항체가 Cobll1 단백질을 정상적으로 검출하였음을 보여주는 Western blot 결과이다. K562는 인간 유래 만성골수성백혈병 세포, 293T는 인간 유래 신장세포, HeLa는 인간 유래 자궁경부암 세포, H1299는 인간 유래 폐암 세포를 나타낸다.
도 6은 단클론항체 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 및 18D12의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7 내지 11은 각각 단클론항체 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 및 18D12의 VH 및 VL의 아미노산 서열 및 염기 서열을 나타낸다.
본 발명은 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (1) 내지 (5)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
(1) 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(2) 서열번호 7의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 8의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 9의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 11의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 12의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(3) 서열번호 13의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 14의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 15의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 17의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 18의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(4) 서열번호 19의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 20의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 21의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 22의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 23의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 24의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(5) 서열번호 25의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 26의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 27의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 28의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 29의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 30의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 1의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항체 1 내지 항체 5 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
구분
　		 중쇄 CDR 경쇄 CDR
CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
항체 1
(3A11)		 서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 5 서열번호 6
항체 2(4H8) 서열번호 7 서열번호 8 서열번호 9 서열번호 10 서열번호 11 서열번호 12
항체 3(5C12) 서열번호 13 서열번호 14 서열번호 15 서열번호 16 서열번호 17 서열번호 18
항체 4(6A2) 서열번호 19 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23 서열번호 24
항체 5(18D12) 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27 서열번호 28 서열번호 29 서열번호 30
또다른 실시태양에서, 본 발명의 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (6) 내지 (10)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
(6) 서열번호 31의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 32의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(7) 서열번호 33의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 34의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(8) 서열번호 35의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 36의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(9) 서열번호 37의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 38의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(10) 서열번호 39의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 40의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 1 내지 항체 5 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
구분 중쇄 가변 영역 경쇄 가변 영역
항체 1
(3A11)		 서열번호 31 서열번호 32
항체 2
(4H8)		 서열번호 33 서열번호 34
항체 3
(5C12)		 서열번호 35 서열번호 36
항체 4
(6A2)		 서열번호 37 서열번호 38
항체 5
(18D12)		 서열번호 39 서열번호 40
또다른 실시태양에서, 본 발명의 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (11) 내지 (15)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
(11) 서열번호 41의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 42의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(12) 서열번호 43의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 44의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(13) 서열번호 45의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 46의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(14) 서열번호 47의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 48의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
(15) 서열번호 49의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 50의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 3의 염기 서열에 의해 각각 암호화되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 1 내지 항체 5 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
구분 중쇄 가변 영역 경쇄 가변 영역
항체 1
(3A11)		 서열번호 41 서열번호 42
항체 2
(4H8)		 서열번호 43 서열번호 44
항체 3
(5C12)		 서열번호 45 서열번호 46
항체 4
(6A2)		 서열번호 47 서열번호 48
항체 5
(18D12)		 서열번호 49 서열번호 50
본 발명에서 "항체(Antibody)"는 Cobll1 단백질과 같은 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명은 Cobll1 단백질에 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다.
본 발명에서 "항체"는 단클론항체, 다클론항체 및 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 모두 포함할 수 있다. 항체는 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)로 구성되며, 대상 항원의 종류에 따라 아미노산 서열이 달라지는 가변 영역(variable region)과 서열이 달라지지 않는 불변 영역(constant region)을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 항체는 단클론항체일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 항체는 본원에서 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 또는 18D12로 지칭되는 단클론항체일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단클론항체(monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다. 본 발명의 단클론항체는 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 다르게는, 본 발명의 단클론항체는 140 kDa 또는 180 kDa 크기의 Cobll1 단백질의 소단편(small fragment) 또는 이소형 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시태양에서, 본 발명의 18D12 단클론항체는 180 kDa 크기의 Cobll1 단백질의 소단편(small fragment) 또는 이소형 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 3A11 또는 6A2 단클론항체는 140 kDa 크기의 Cobll1 단백질의 소단편(small fragment) 또는 이소형 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
발명의 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주에서 생산되는 것일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
이에 따라 본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄는 IgG, IgM, IgD, IgA의 타입을 가지고, 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 항체에서 중쇄는 IgM이고, 경쇄는 카파 타입일 수 있다.
경쇄 및 중쇄의 가변 영역들은 "상보성 결정 부위(complementarity-determining region, CDR)"라고 하는 매우 가변적인 3개의 영역을 포함한다. CDR은 항원의 에피토프(epitope)에 결합하며, 각 체인의 CDR은 전형적으로 3개의 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 갖는다. 본원에서는 중쇄의 CDR을 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로, 경쇄의 CDR을 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3로 표기하기도 한다. 이러한 CDR은 각 항체에 있어 항원 특이성에서 매우 중요한 부위이며, 따라서 항체를 특정하는데 있어 가장 중요한 부분이다.
본원에서 사용된 용어 "(항체의) 항원 결합 단편"은 항체 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab(fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "프레임워크(Framework)" 또는 "FR"은 CDR로도 불리는 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR (CDR) 및 FR 서열은 일반적으로 중쇄 가변 영역(VH)에서 다음의 순서로 나타난다:
FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4.
또한, HVR (CDR) 및 FR 서열은 일반적으로 경쇄 가변 영역(VL; 경쇄의 타입에 따라 Vκ 또는 Vλ로도 표기됨)에서 다음의 순서로 나타난다:
FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 발명의 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체(human antibody)" 또는 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다.
본원에서 사용된 용어 "키메라(chimeric) 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, Cobll1 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 본 발명의 핵산은 상기한 뉴클레오타이드 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 염기 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 염기 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482(1981)]; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970)]; [Pearson and Lipman, Methods inMol. Biol. 24: 307-31(1988)]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988)]; [Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989)]; [Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988)]; [Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992)] 및 [Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)] 등에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오타이드 염기 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 일례에서, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 연결(operatively linked)되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "작동적으로 연결"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)] 등에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본원에서 사용된 용어 "클로닝(cloning)"은 동일한 유전자를 대량 생산하는 유전 공학기술로, 유전자 또는 DNA 절편을 대량 생산하기 위하여 벡터(vector)로 작용하는 플라스미드 또는 바이러스에 도입하여 세포분열을 통하여 유전적으로 동일한 클론을 복제하는 기술을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "cDNA"는 mRNA와 상보적인 DNA를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "클론(clone)"은 동일한 복제물을 의미하는 것으로, 동일한 세포집단 또는 특정 유전자 절편의 동일한 복제물을 뜻한다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하여 숙주 세포의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미하고, 숙주가 진핵세포인 경우에는 "형질주입(transfection)"이라는 용어를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 형질전환은 외래 유전자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 모든 방법을 포함할 수 있고, 바람직하게는 외래 유전자를 대장균에 도입하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 형질전환하는 방법으로는 전기천공법, 리포좀을 이용한 방법, Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 등 일반적으로 쓰이는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트를 제공한다.
Cobll1 단백질의 경우, CML의 진행 초기인 만성기(CP)에는 Cobll1이 발현되어 있지 않지만 급성기(BC)에 도달한 환자 시료에서는 Cobll1 단백질의 발현량이 확연하게 증가하는 것으로 나타났다. 또한 자궁경부암 세포인 HeLa 세포와 골육종 세포인 U2OS 세포에서도 Cobll1 단백질이 발현되어 있는 것을 확인하였다.
이에 따라 본 발명의 키트는 만성 골수성 백혈병의 급성기의 진단, 또는 자궁경부암 또는 골육종의 진단에 사용될 수 있다.
본 발명의 Cobll1 단백질 검출용 키트에는 검사대상시료를 채취 또는 검출 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 항원 단백질의 존재유무를 확인하는 통상의 검출 또는 진단 키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 Cobll1 단백질을 면역분석 방법에 따라 검출하여 만성 골수성 백혈병의 급성기의 진단, 또는 자궁경부암 또는 골육종의 진단에 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은, 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 효소결합면역측정법(ELISA), 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 면역친화성 정제, 면역 크로마토그래피(immunochromatography) 등을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 포획 항체(capturing antibody)로서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위; 및 검출 항체(detection antibody)로서 Cobll1 단백질에 대한 다클론항체를 포함하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트일 수 있다. 상기 포획 항체로서의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 바람직하게는 단클론항체일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 단클론항체 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 또는 18D12일 수 있다. 상기 검출 항체로서의 다클론항체는 바람직하게는 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 Cobll1 단백질의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 검출 항체는 검출 표지와 연결될 수 있다. 검출 표지의 구체적인 예로는 화학물질(예를 들어, 비오틴), 효소(예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase, HRP) 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출 표지는 비오틴이다.
상기 검사대상시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있다. 상기 척추동물은 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 채취되거나 분리된 것, 예를 들어, 혈액 또는 혈액 구성성분(blood constituent), 체액(bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명은 상기 검출 키트를 사용하여, 상기 포획항체 및 검출항체를 검사대상시료와 접촉시켜, 이로부터 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 Cobll1 단백질의 검출 방법을 제공한다. 일 실시태양에서, 본 발명의 검출 방법은
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 포획 항체로서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위; 및
(iii) 검출 항체로서 Coll1 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론항체
를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 포획 항체 및 상기 검출 항체가 Coll1 단백질과 결합하는 조건 하에 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 포획 항체와 Coll1단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 Cobll1 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 항체의 결합물을 의미한다. 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particlecounting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 상기 검출에 의해, Cobll1 단백질을 정성적 또는 정량적 분석할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
항원 제작 및 정제
Cobll1 단백질에 대한 단클론항체를 제조하기 위해, Cobll1 단백질(서열번호 51)의 2차 구조 분석 및 hydrophobicity & antigenicity 분석을 통해 Cobll1 단백질의 N-말단을 선택하여 항원을 제작하였다.
Cobll1 단백질의 N-말단 1-330 mutant를 발현하는 벡터를 제작하기 위하여 하기 두가지 프라이머를 이용하여 PCR 한 후, 그 결과 증폭된 DNA 조각을 분리하여 Gateway plasmid system인 pDONR223에 클로닝 하였다. Entry vector를 제작한 이후에 His-tag이 있는 pDEST17 vector에 LR reaction 한 이후, 이 벡터를 항체 개발을 위한 항원 정제에 이용하였다. 상기 벡터를 E.coli, BL21(DE3) 균주에 형질 전환하고, 단백질 발현을 유도하였다. Ni-NTA 컬럼을 이용하여 발현된 Cobll1 N-말단 항원을 분리·정제하였다(도 1). 분리·정제한 단백질에 대해 His-tag 항체를 이용하여 Western blot을 수행하여 목적하는 항원이 정제되었음을 확인하였다(도 2).
Cobll1_5'_ATTB1 GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT GGA CGG CCG AAC CCC GCG
Cobll1_3' for 300_ATTB2 GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA CAT CGG GGG CAG TGG AGC
[실시예 2]
단클론항체의 제조
실시예 1에서 정제한 항원을 BALB/C 마우스에 주사하여 1차 면역접종하였다. 그로부터 2주 후 항원을 다시 주사하여 2차 면역접종하였다. 마우스에서 채혈하여 ELISA로 항체 역가를 측정하여 면역반응 테스트를 수행하였다. 측정된 역가가 적합한 항체가 생성되었다고 할 수 있는 기준 역가(serum dilution 1:1000에서 O.D.> 1.5) 이상이 될 때까지, 매 2주마다 항원을 주사하여 면역반응을 증강시켰다.
그 후 마우스의 비장을 절제하고 B 세포를 분리하여 마우스의 골수종 세포(myeloma cell)와 융합한 후, 배양하였다. 배양 상층액을 이용하여 ELISA를 수행하였다. ELISA 결과에서 양성결과를 보인 well의 세포를 96 well 플레이트로 분주하였다. 1차 클로닝 후 콜로니가 형성되면 ELISA를 수행하여 양성결과를 나타낸 well 중에서 O.D.값이 높고 well 내 콜로니가 1개인 positive well을 선정하여 2차 클로닝하였다. 이와 같은 방식으로 3차에 걸쳐 클로닝을 수행하였고 ELISA 스크리닝을 통해 ELISA score가 가장 높은 클론들을 선별하여 하이브리도마 세포주 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 및 18D12를 얻었다. 이를 배양하여 단클론항체 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 및 18D12를 획득하였다.
단클론항체가 정상적으로 제조되었는지를 확인하기 위해, Myc-Cobll1 단백질을 과발현하는 293T 세포(Myc-Cobll1), 실제 CML 급성기 환자의 혈액(KRCMC 1885 PBMC, BC), CML 만성기 환자의 혈액(KRCMC 1922, PBMC, CP)를 이용하여 Western blot을 수행하였다. Western blot의 loading control로서 actin을 사용하였다. 그 결과는 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 제조된 5개의 단클론항체 모두 Myc-Cobll1 단백질 과발현 세포(Myc-Cobll1) 및 CML 급성기 환자 세포(KRCMC 1885 PBMC, BC)에서 발현되는 Cobll1 단백질을 검출하였음을 확인하였다. CML 만성기 환자 세포(KRCMC 1922, PBMC, CP)에서는 Cobll1 단백질이 검출되지 않았다.
[실시예 3]
다클론항체의 제조
항체 제조를 위하여 GST-벡터에 Cobll1 단백질의 C-말단 부위(서열번호 53)의 유전자 서열을 삽입하고, 이 벡터를 항원(antigen)으로서 피하 주사를 통하여 토끼에 1차 주입하였다. 2주 후에 벡터를 다시 2차 주입한 후에 55일째 채혈하였고, 채혈된 토끼의 혈액으로부터 Aminolink Coupling Gel Column Kit를 이용하여 정해진 프로토콜에 따라 Rabbit-anti-Cobll1 antibody를 분리하였다.
그 결과는 도 5에 나타난 바와 같이, 제조된 다클론항체는 Cobll1 단백질을 발현하는 세포, 즉, 만성골수성백혈병 세포(K562), 신장세포(293T), 자궁경부암 세포(HeLa), 폐암 세포(H1299)에 결합하는 것을 확인하였다. 이로부터 Cobll1 단백질에 결합하는 다클론항체가 정상적으로 제조되었음을 확인하였다.
[실시예 4]
단클론항체의 서열 분석
실시예 2에서 얻은 5개의 단클론항체 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 및 18D12의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역(variable region)의 아미노산 서열 및 염기 서열을 분석하였다.
이를 위해 실시예 2의 5개의 하이브리도마 세포주로부터 total RNA를 분리하였고 이로부터 cDNA를 제작하였다. total RNA의 추출은 RNeasy mini kit을 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. 또한 제조된 cDNA를 이용하여 PCR, TA 클로닝 및 시퀸싱을 수행하여 가변 영역을 분석하였다. 문헌 [Larrick, J.W., et al. 1989. Biochem. Biophys. Res. Comm. 160, 1250] 및 [Jones, S.T. and Bendig, M.M. 1991]를 바탕으로 개발된 마우스의 VH 및 VL 유전자를 증폭하기 위한 Mouse Ig-Primer set (Millipore, Cat#69831-3)를 구매하여 PCR 실험을 통하여 각 유전자 부분을 증폭하는 실험을 수행하였다. Band isolation 후, pMD20-TA 벡터를 사용하여 TA 클로닝을 수행하였다. TA 클로닝 산물의 시퀸싱을 수행하여 가변 영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 분석하였다.
단클론항체 3A11, 4H8, 5C12, 6A2 및 18D12의 VH 및 VL의 아미노산 서열 및 염기 서열을 도 6 내지 11에 나타내었다.
[실시예 5]
단클론항체의 isotype 분석
실시예 2의 5개의 하이브리도마 세포주를 사용하여 Isotype ELISA kit를 통해 각 단클론항체의 isotype를 분석하였다. 그 결과는 표 5에 나타낸 바와 같이, 단클론항체의 isotype은 모두 IgG(kappa)임이 확인되었다.
Hybridoma clones Antibody isotype
3A11 Kappa / IgG1
4H8 Kappa / IgG2b
5C12 Kappa / IgG2a
6A2 Kappa / IgG2b
18D12 Kappa / IgG1
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (30)

  1. 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 서열번호 7의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 8의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 9의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 11의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 12의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 서열번호 13의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 14의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 15의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 16의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 17의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 18의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 서열번호 19의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 20의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 21의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 22의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 23의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 24의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 서열번호 25의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 26의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 27의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 28의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 29의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 30의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 서열번호 31의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 32의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 서열번호 33의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 34의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 서열번호 35의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 36의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 서열번호 37의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 38의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 서열번호 39의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 40의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 서열번호 41의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 42의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 서열번호 43의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 44의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 서열번호 45의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 46의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 서열번호 47의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 48의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 서열번호 49의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 50의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체인 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 면역글로불린 M(IgM)인 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 카파 타입인 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산.
  20. 제19항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  23. 제22항에 있어서, 만성 골수성 백혈병의 급성기의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  24. 제22항에 있어서, 자궁경부암 또는 골육종의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  25. 포획 항체(capturing antibody)로서 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체; 및
    검출 항체(detection antibody)로서 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 Cobll1 단백질의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하는 다클론항체
    를 포함하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 표지와 연결된 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 검출 표지는 비오틴인 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  28. 제25항에 있어서, 상기 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  29. 제25항에 있어서, 만성 골수성 백혈병의 급성기의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
  30. 제25항에 있어서, 자궁경부암 또는 골육종의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는, Cobll1 단백질의 검출용 키트.
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