WO2023223796A1 - コリバクチン産生大腸菌結合性抗体 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
Definitions
- the present invention relates to an antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli.
- Colibactin causes genetic mutations in the host by inducing double-strand breaks in the host's DNA and interstrand crosslinks (Non-Patent Document 1). It is known that the presence of an E. coli strain carrying a gene cluster involved in the biosynthesis of colibactin, called the clb cluster or pks cluster, is involved in the formation of colon cancer (Non-Patent Document 2). The subgroup of colibactin-producing bacteria (clb+) of Escherichia coli is classified into the commensal B2 phylogenetic group, lives in the human large intestine, and is presumed to be involved in the development of colon cancer as a result of symbiosis.
- colibactin Upon contact of clb+ strains with eukaryotic cells, colibactin is believed to cause cell cycle arrest in the G2/M phase of the cells and/or the formation of megakaryocytes. It has been reported that the detection rate of clb cluster genes from biopsy samples of colorectal cancer patients is 67%, which is higher than that of healthy individuals, which is 21-27%. In order to more accurately understand the role of clb+ strains in the development of colorectal cancer, it is desirable to obtain more detailed and accurate knowledge about the chemical and biological properties of colibactin.
- Colibactin is a genotoxin secreted by bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae, which secrete polyketide synthase (PKS), nonribosomal peptide synthetase (NRPS), and PKS-NRPS, which are required for colibactin biosynthesis. It is known to have a 54 kilobase genomic island encoding a hybrid megasynthetase (Non-Patent Document 3). The gene cluster involved in colibactin production includes genes for various auxiliary enzymes, one of which is the peptidase ClbP.
- Patent Document 1 discloses a high-throughput method for measuring colibactin-producing bacteria in a clinical specimen using a fluorescent probe that is specifically activated by ClbP. The fluorescent probes are also useful for identifying high colibactin producing strains from E. coli strains.
- Non-Patent Documents 6 and 7 disclose the structure of N-myristoyl-D-asparagine (N-myr-Asn) as a prodrug motif of colibactin and its detection method by LC-MS.
- precolibactin colibactin precursor
- clb+ strains formed by genetic mutations and various chemical structures have been identified as precolibactin candidate substances.
- these substances have not been isolated from wild-type clb+ E. coli strains, and it is unclear whether they actually exist as pre-colibactin in colibactin-producing bacteria present in the human large intestine.
- Patent Document 1 discloses a method for identifying colibactin-producing E. coli using a fluorescent probe, but this method requires a step of culturing candidate E. coli in the presence of the probe. A more convenient method for identifying colibactin-producing E. coli is desired. Furthermore, no method has been developed to specifically control colibactin-producing bacteria, and its development is also desired.
- An object of the present invention is to provide a means and method for specifically detecting colibactin-producing Escherichia coli, and a means and method for specifically controlling colibactin-producing bacteria.
- the present invention provides the following.
- the antibody according to [1] which has binding activity to at least one of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 and the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40.
- the antibody according to [1] which is a monoclonal antibody.
- CDR homology determining regions
- a light chain variable region comprising CDRs 1 to 3 shown in (b1) to (b3) below: (b1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (b2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14; and (b3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15, CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence;
- Example 5 colibactin-producing E. coli using a monoclonal antibody derived from the ⁇ strain.
- 2 is a photograph showing the results of Western blotting of E. coli-50 protein.
- 5 is a photograph showing the results of epitope mapping in Example 5.
- 2 is a photograph showing the results of Western blotting of E. coli-50 protein.
- the first embodiment of the present invention is an antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli (hereinafter also referred to as "colibactin-producing bacteria"). More specifically, the antibody of this embodiment is an antibody that binds to colibactin-producing bacteria but does not bind to E. coli that does not produce colibactin.
- Escherichia coli 50 high colibactin producing bacteria (Hirayama, Y. et al., Org. Lett. Vol. 21, No. 12, pp. 4490-4494 (2019)), which is a high colibactin producing bacterium. (hereinafter also referred to as "E. coli-50”) was used as an immunogen to immunize mice, and the samples obtained from the mice were appropriately screened to specifically bind to colibactin-producing strains. We succeeded in obtaining antibodies for this purpose.
- antibody refers to a protein that specifically binds to a specific substance (antigen).
- the antigen is a substance derived from E. coli that produces colibactin.
- the antibody is not particularly limited as long as it binds to E. coli that produces colibactin and does not bind to E. coli that does not produce colibactin. It may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but monoclonal antibodies preferable.
- the isotype of the antibody is not particularly limited and may be any of IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, etc., but immunoglobulin M (IgM) is particularly preferred.
- the animal from which the antibody is derived is not particularly limited, and may be, for example, a mouse, rat, rabbit, goat, cow, pig, sheep, dog, cat, monkey, camel, alpaca, bird, fish, or the like.
- the organism from which the antibody is derived is a mouse.
- the term "antibody” does not necessarily mean an intact antibody, but also includes binding fragments such as Fab, Fab', F(ab') 2 , and the like.
- the antibody may be a single domain antibody.
- Single-domain antibodies also called single-chain antibodies or nanobodies (registered trademark) are antibodies consisting of the variable region of an antibody (immunoglobulin) composed only of heavy chains, and are associated with VHH found in mammals of the camelid family and of the shark family.
- VNAR which can be seen in
- the antibody of this embodiment preferably has binding activity to at least one of the polypeptides having the following amino acid sequences, and preferably has binding activity to both polypeptides having the following amino acid sequences. More preferred. KRLLFMIKSV (SEQ ID NO: 39) YTAVVKKSS (SEQ ID NO: 40)
- the state of an antibody "having binding activity" to a polypeptide means that the amount of the antibody binding to the polypeptide of interest is significantly greater than that of a polypeptide having an arbitrary amino sequence, and/or , refers to a polypeptide having a higher binding strength to a target polypeptide than a polypeptide having an arbitrary amino acid sequence.
- the amount of antibody bound here is not particularly limited, and can be measured, for example, by immunoblot, ELISA, or the like. Furthermore, the binding strength of antibodies is not particularly limited, and can be measured using a device such as Biacore (registered trademark), for example.
- SEQ ID NOs: 39 and 40 are partial sequences of E. coli PapA.
- the present inventors constructed four types of monoclonal antibodies that react with colibactin-producing E. coli but not with non-colibactin-producing E. coli, and performed Western blotting using the antibodies on proteins derived from colibactin-producing E. coli. Since a similar band was observed, it was inferred that the antibody reacts with a protein having a repeating sequence.
- the present inventors focused on PapA as a protein that constitutes the repeating structure of fimbriae, and conducted epitope mapping of the four antibodies based on the amino acid sequence of PapA (SEQ ID NO: 42). . As a result, it was confirmed that all four types of antibodies had strong binding activity to polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 39 and 40.
- the first aspect of this embodiment is a monoclonal IgM antibody, which has the following characteristics. It has a light chain variable region 1 comprising the following polypeptide (a) or (a'): (a) 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 , a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more; or (a') the amino acid sequence of the polypeptide described in (a).
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 1 are shown as (a1) to (a3) below: (a1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (a2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11; and (a3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12; CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence.
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 2 are shown as (b1) to (b3) below: (b1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (b2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14; and (b3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15, CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence; And CDR1 to CDR3 in the heavy chain variable region are shown as (c1) to (c3) below: (c1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (c2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 or an
- the second aspect of this embodiment is a monoclonal IgM antibody, which has the following characteristics. It has a light chain variable region 1 comprising the following polypeptide (a) or (a'): (a) 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 , a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more; or (a') the amino acid sequence of the polypeptide described in (a).
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 1 are shown as (a1) to (a3) below: (a1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (a2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11; and (a3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12; CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence.
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 2 are shown as (d1) to (d3) below: (d1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (d2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14; and (d3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15; CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence; And CDRs 1 to 3 in the heavy chain variable region are shown as (e1) to (e3) below: (e1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (e2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 or an
- the third aspect of this embodiment is a monoclonal IgM antibody, which has the following characteristics. It has a light chain variable region 1 comprising the following polypeptide (a) or (a'): (a) 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 , a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more; or (a') the amino acid sequence of the polypeptide described in (a).
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 1 are shown as (a1) to (a3) below: (a1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (a2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11; and (a3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12; CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence.
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 2 are shown as (f1) to (f3) below: (f1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (f2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17; and (f3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18, CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence; And CDR1 to CDR3 in the heavy chain variable region are represented by the following (g1) to (g3): (g1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (g2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 25 or
- the fourth aspect of this embodiment is a monoclonal IgM antibody, which has the following characteristics. It has a light chain variable region 1 comprising the following polypeptide (a) or (a'): (a) 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 , a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more; or (a') the amino acid sequence of the polypeptide described in (a).
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 1 are shown as (a1) to (a3) below: (a1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (a2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11; and (a3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12; CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence.
- CDRs 1 to 3 in light chain variable region 2 are shown as (h1) to (h3) below: (h1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (h2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17; and (h3) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19 or one or two amino acids deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19; CDR3 consisting of a substituted or added amino acid sequence; And CDR1 to CDR3 in the heavy chain variable region are represented by the following (i1) to (i3): (i1) CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 or an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added; (i2) CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28
- a second embodiment of the present invention involves contacting a sample with at least one antibody described in the section "1. Antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli.” This method includes the step of detecting colibactin-producing E. coli in a sample.
- the method of the present embodiment is a method for measuring colibactin production contained in a sample in vitro, for a sample taken from a subject, particularly a sample taken from a subject suspected of having colon cancer or having a high risk of developing colon cancer.
- a sample taken from a subject particularly a sample taken from a subject suspected of having colon cancer or having a high risk of developing colon cancer.
- subjects include humans, primates including chimpanzees, pet animals such as dogs and cats, domestic animals such as cows, pigs, horses, sheep, and goats, rodents such as mice and rats, and zoo animals. This includes mammals kept in captivity.
- the subject herein is preferably a human.
- sample refers to a sample taken from a subject, such as blood (e.g., whole blood, serum, plasma), urine, feces, milk, tissue or cell extract, nasal secretion, saliva, or a mixture thereof. can do. Preferably, it can be a fecal sample.
- the method of this embodiment is a method for immunoassay, which includes a step of contacting a sample taken from a subject with an antibody that binds to colibactin-producing bacteria.
- immunoassays include, for example, direct competition methods, indirect competition methods, and sandwich methods.
- immunoassays include chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay (CLEIA), chemiluminescent immunoassay (CLIA), immunoturbidimetric assay (TIA), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) (e.g., direct competitive ELISA, indirect Competitive ELISA, and Sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), latex agglutination, fluorescence immunoassay (FIA), and immunochromatography.
- CLIA chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay
- CLIA chemiluminescent immunoassay
- TIA immunoturbidimetric assay
- EIA enzyme-linked immunosorbent assay
- RIA radioimmunoassay
- FIA fluorescence immunoassay
- immunochromatography immunochromatography
- colibactin-producing bacteria may be detected qualitatively or quantitatively.
- a qualitative method for example, a method can be used to determine the presence or absence of colibactin-producing bacteria in a sample by comparing the signal obtained from the sample with a preset cutoff.
- a quantitative method a standard solution containing a known amount of antigen can be subjected to immunoassay in the same way as the sample, and the amount of antigen in the sample can be calculated by comparing the signal intensities obtained from the sample and the standard solution.
- the method of this embodiment may include the steps of detecting the antigen in the standard solution, and calculating the amount of colibactin-producing bacteria in the sample from the detection results of the standard solution.
- the subject from whom the sample was taken is infected with E. coli or is infected with E. coli. It can support the determination that the person is at high risk.
- the present invention includes a composition containing at least one antibody described in the section "1. Antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli.”
- a third embodiment of the present invention provides a composition for detecting colibactin-producing E. coli, comprising at least one antibody described in the section "1. Antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli.” It is.
- the composition of this embodiment contains at least one type of antibody among the antibodies of the first embodiment of the present invention.
- the composition of this embodiment can be used to carry out the method described in "2. Method for detecting colibactin-producing E. coli", and can be used to detect colibactin-producing bacteria in a sample. can do. In particular, by using samples taken from subjects suspected of developing colorectal cancer or at high risk of developing colorectal cancer to detect colibactin-producing bacteria, it is possible to reduce the risk of developing colorectal cancer or developing colorectal cancer. Enables diagnosis assistance.
- the "sample” and “subject” herein are as described in the section "2. Method for detecting colibactin-producing E. coli.”
- composition of this embodiment can be used alone or in combination with other reagents, equipment, etc., as a reagent or kit for detecting colibactin-producing bacteria.
- reagents or kits are for immunoassays using antibodies that specifically bind to colibactin-producing bacteria.
- immunoassays include, for example, direct competition methods, indirect competition methods, and sandwich methods.
- immunoassays also include CLEIA, CLIA, TIA, EIA (eg, direct competitive ELISA, indirect competitive ELISA, and sandwich ELISA), RIA, latex agglutination, FIA, and immunochromatography.
- the principles and specific techniques of the above immunoassay are all well known to those skilled in the art.
- the composition of this embodiment may contain a phosphate buffer, a pH buffer such as Tris, MES, HEPES, or PIPES, a chelating agent such as EDTA, a preservative, or the like, as necessary. Further, as an antibody stabilizer, BSA, casein, glycine, etc. may be included. Further, the composition of the present embodiment preferably has a pH of 5 to 9, particularly a pH of 6 to 8, and more preferably a pH of 6.5 to 7.5.
- the fourth embodiment of this embodiment is a pharmaceutical composition comprising at least one antibody described in the section "1. Antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli.”
- the pharmaceutical composition of this embodiment can specifically control colibactin-producing bacteria in a subject. Thereby, the pharmaceutical composition of this embodiment can be used for the treatment and/or prevention of colon cancer.
- the "subject” here refers to a subject to whom the pharmaceutical composition is administered, and specifically includes humans, primates including chimpanzees, pet animals such as dogs and cats, cows, pigs, horses, sheep, goats, etc. This includes domestic animals, rodents such as mice and rats, and mammals kept in zoos. Preferably it is a human.
- the administration route of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, and may be any known administration route such as oral, nasal, sublingual, subcutaneous, and intramuscular.
- the pharmaceutical composition of this embodiment may contain a pharmaceutically acceptable carrier as necessary.
- pharmaceutically acceptable carrier refers to additives commonly used in the field of pharmaceutical technology. Examples include excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow additives, lubricants, and the like.
- Excipients include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, dextrin, malt). dextrins, starches, and cellulose), metal salts (e.g., sodium chloride, sodium or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium, and high molecular weight polyethylene glycols ( Examples include PEG), Pluronic®, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
- sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol,
- binders include starch paste using corn, wheat, rice, or potato starch, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac, and/or polyvinylpyrrolidone. It is mentioned as.
- Disintegrants include the above-mentioned starch, lactose, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride. or salts thereof.
- filler examples include the aforementioned sugar and/or calcium phosphate (eg, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
- emulsifiers examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
- flow additives and lubricants examples include silicates, talc, stearates or polyethylene glycols.
- Such carriers are mainly used to facilitate the formation of the dosage form and to maintain the dosage form and pharmacological effects, and may be used as appropriate as necessary.
- flavoring agents solubilizers, suspending agents, diluents, surfactants, stabilizers, absorption enhancers, fillers, wetting agents, humectants, adsorbents, It may also contain disintegration inhibitors, coating agents, colorants, preservatives, antioxidants, fragrances, flavors, sweeteners, buffers, and the like.
- the pharmaceutical composition of this embodiment can also contain other drugs as long as the effects of the antibody are not lost.
- it may contain a predetermined amount of another antibiotic.
- the dosage form of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited as long as it does not inactivate the antibody as an active ingredient and other additional active ingredients.
- it may be liquid, solid, or semi-solid.
- Specific dosage forms include, for example, oral dosage forms such as liquids, powders, granules, tablets, capsules, sublingual preparations, and troches, or injections, suspensions, emulsions, eye drops, and nasal drops.
- parenteral dosage forms such as creams, ointments, plasters, poultices, and suppositories.
- the pharmaceutical composition of this embodiment can be administered by any suitable method that does not deactivate the active ingredients contained therein.
- it may be administered orally or parenterally (eg, injection, aerosol, application, eye drops, nasal drops).
- the pharmaceutical composition of the present embodiment preferably contains the antibody in an amount that is effective in controlling colibactin-producing bacteria and has an extremely low possibility of causing serious side effects.
- the frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as a sufficient control effect on colibactin-producing bacteria is obtained and serious side effects do not occur, but for example, once every 3 days to 5 times a day. It is particularly preferable to administer the treatment once a day to three times a day.
- the administration period of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, but can be, for example, 3 days to 1 month, particularly 1 week to 2 weeks.
- the present specification also provides a method for manufacturing the pharmaceutical composition of this embodiment.
- the method for producing the pharmaceutical composition disclosed herein uses at least one antibody described in the section "1. Antibody that specifically binds to colibactin-producing E. coli" to produce the pharmaceutical composition of the present embodiment. It is a method of manufacturing things.
- a fifth embodiment of the present invention is a method for treating or preventing colorectal cancer using at least one antibody described in the section "1.
- the method of this embodiment includes, for example, a mode in which the antibody is administered orally or parenterally to a subject as a pharmaceutical composition to kill colibactin-producing bacteria in the intestine, and a mode in which the antibody labeled with a fluorescent dye is administered under an endoscope.
- a mode in which the location of colibactin-producing bacteria that is sprayed into the intestine of a subject and fluorescently stained is used as a therapeutic target (for example, tumor resection).
- Example 1 Preparation of antibodies binding to colibactin-producing bacteria
- Immunization Colibactin-producing bacterial strains 50 high colibactin-producing bacteria (Hirayama, Y. et al., Org. Lett. Vol. 21, No. 12, pp. 4490) -4494 (2019)) (hereinafter also referred to as "E. coli-50”) was cultured in LB liquid medium at 37°C for 20 hours. Bacterial cells were collected from the culture solution and incubated twice with PBS (-). After washing, the cells were suspended in PBS (-) at 1 ⁇ 10 10 cells/mL and heat treated at 60° C. for 60 minutes. 100 ⁇ L of the heated E.
- mice were transferred to a Sigma Adjuvant System (Catalog No. S6322, Sigma) was mixed with 100 ⁇ L to prepare a mixed solution, and 50 ⁇ L of this was subcutaneously injected into both legs of two mice (BALB/c, female, 8 weeks old). Two weeks later, the mice were The animal was sacrificed, and the spleen and below-the-knee lymph nodes were collected.
- Sigma Adjuvant System Catalog No. S6322, Sigma
- mouse myeloma P3U1 cells were counted and suspended in FBS(+) at 10 8 cells/mL.
- E. E. coli-50 and colibactin-negative E. coli #A were each cultured in an LB liquid medium at 37° C. for 20 hours.
- #A is a strain that was confirmed to be colibactin negative by the method described in Patent Document 1.
- T-PBS PBS(-)
- Tween 0.05% Tween
- coli-50 or #A suspension was dispensed into each well of a 96-well microwell plate (Nunc Immunoplate, Catalog No. 439454), and the suspension was allowed to stand at 4° C. for one day or more to solidify. After washing this plate three times with T-PBS, 1% BSA (dissolved in T-PBS) was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours to perform blocking. This was washed three times with T-PBS to obtain antigen-immobilized wells. A large number of antibody-producing cells (hybridomas) obtained by the cell fusion in (2) above were each cultured for one week. 100 ⁇ L or 50 ⁇ L of the culture supernatant was added to each well and left at 4° C. overnight.
- Example 2 Examination of binding specificity of monoclonal antibodies to colibactin-producing E. coli The binding specificity of the four monoclonal antibodies obtained in Example 1 to colibactin-producing E. coli was examined.
- E. Solid-phase wells were prepared for E. coli-50, Nissle 1917 strain (colibactin-positive strain), and four strains of E. coli obtained from clinical specimens in the same manner as described in Example 1 (3). All four strains were confirmed to be colibactin negative/positive by the method described in Patent Document 1.
- Example 1 The four hybridoma strains obtained in Example 1 and E.
- One hybridoma strain (non-specific reaction strain) that was positive for both E.coli-50 and #A was cultured for one week, and 100 ⁇ L of the culture supernatant was added to each of the six types of antigen-immobilized wells. Dispensed. Thereafter, ELISA was performed in the same manner as described in Example 1 (3). ELISA was performed in duplicate. The ELISA results are shown in Table 1. When absorbance of 0.15 or higher is determined as positive using an absorbance of 0.15 as a cutoff, the positive determination rate using each antibody is 75% (3 cases/4 cases) for colibactin-positive E. coli, The percentage of negative E. coli was 0% (0 cases/2 cases). All of the monoclonal antibodies produced by the four hybridoma strains obtained were shown to bind to colibactin-positive E. coli with high specificity.
- Example 3 Sequencing of homology-determining regions (CDRs) of monoclonal antibodies CDR sequence analysis was performed on the four monoclonal antibodies obtained in Example 1. CDR sequencing was performed at PGL LLC (Okazaki City, Aichi Prefecture). Specifically, CDR sequences were determined through RNA extraction from each hybridoma, cDNA preparation, variable region amplification by PCR, cloning, and sequence analysis by capillary sequencing. It was confirmed that all clones produced IgM antibodies. Furthermore, two light chain sequences (L chain, ⁇ ) and one heavy chain sequence were detected from all clones. The amino acid sequences and nucleic acid sequences of each chain obtained from the ⁇ strain, ⁇ strain, ⁇ strain, and ⁇ strain are shown in Tables 2, 3, 4, and 5, respectively.
- Example 4 Immunohistochemical staining of colon tissue specimens from colon cancer patients using monoclonal antibodies
- Ten tissue specimens from colon adenoma patients were analyzed using an automatic staining device (Roche Diagnostics, Benchmark XT). , immunohistological staining was performed.
- the detailed staining method is as follows. The specimen was deparaffinized and hydrated according to conventional methods. It was immersed in CC1 buffer (Roche Diagnostics) and heat-treated (60° C.) for 60 minutes. The specimen was immersed in a primary antibody reaction solution prepared by diluting the ⁇ strain cell supernatant obtained in Example 2 5 times with PBS, and incubated at room temperature for 32 minutes.
- Example 5 Epitope determination of monoclonal antibodies (1) Western blotting Colibactin-producing E. coli. E. coli-50 and E. coli #A, which does not produce colibactin, were suspended in PBS and disrupted by ultrasonication, then loaded onto an acrylamide gel with a protein content of 0.3 to 5.0 ⁇ g, and then incubated with SDS- PAGE was performed. After transferring the gel-like protein to a membrane, 10 ng/mL of ⁇ strain monoclonal antibody (cell culture supernatant diluted 150,000 times with PBS) was used as the primary antibody, and HRP-labeled goat anti-mouse IgM heavy chain antibody was used as the secondary antibody.
- ⁇ strain monoclonal antibody cell culture supernatant diluted 150,000 times with PBS
- E. coli The repeating structure of E. coli was estimated to be the repeating structure of pili PapA, and recombinant PapA was generated and its reactivity with antibodies was confirmed.
- the papA gene of E. coli-50 (SEQ ID NO: 41, Table 8) was integrated and introduced into E. coli BC21 (DE3). It is known that E. coli BC21 (DE3) itself does not have the papA gene. After culturing the E. coli in a medium containing 0.1 mM IPTG, the culture solution was centrifuged to obtain a bacterial pellet.
- the membrane was immersed in 10 ng/mL of ⁇ strain monoclonal antibody/PBS solution as the primary antibody, reacted overnight, washed with 0.05% Tween-PBS, and then incubated with horseradish peroxidase (HRP)-labeled goat as the secondary antibody. The reaction was carried out for 2 hours in PBS containing anti-mouse IgM antibody heavy chain secondary antibody. After washing with 0.05% Tween-PBS, it was reacted with ImmunoStar (registered trademark) LD substrate solution to develop color, and photographed using Luminograph I (manufactured by ATTO).
- HRP horseradish peroxidase
- Figure 2 is a photograph of the membrane after color development.
- the sequences of the peptides immobilized on spots A1 to A4, D4 to D10, and F3 to F15 where color development was observed are shown in Table 10 below.
- the antibody epitope was estimated to be the following two polypeptides.
- KRLLFMIKSV SEQ ID NO: 39
- YTAVVKKSS SEQ ID NO: 40
- Peptide competition test Peptide KRLLFMIKSV (SEQ ID NO: 39, hereinafter "peptide "KR") and peptide YTAVVKKSS (SEQ ID NO: 40, hereinafter "peptide YT”) were synthesized using ResPep SL (manufactured by Intavis).
- E. The E. coli-50 strain was heat-treated at 60° C. for 60 minutes, and then freeze-dried according to a conventional method to obtain a freeze-dried extract.
- the freeze-dried extracts of E. coli-50 strain were each reacted in a 10 ng/mL ⁇ strain monoclonal antibody/PBS solution at room temperature for 3 hours.
- Immunostar (registered trademark) LD manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Figure 3 shows a photograph of the Western blot.
- Antibodies that did not undergo a competitive reaction showed a strong reaction with the peptide on the membrane.
- antibodies reacted with either peptide KR or peptide YT also showed a strong reaction with the peptide on the membrane.
- peptide KR+peptide YT mixture or E Regarding the antibody reacted with the freeze-dried extract of E. coli-50 strain, almost no reaction with the peptide on the membrane was observed.
- the above results showed that the epitopes of the ⁇ strain monoclonal antibody are two peptides, peptide KR and peptide YT. Similar tests were performed on other monoclonal antibodies, monoclonal antibodies derived from ⁇ , ⁇ , and ⁇ strains, and similar results were obtained, indicating that the epitopes of these monoclonal antibodies are almost identical. .
- the present invention relates to antibodies useful for determining, treating, and/or preventing diseases associated with colibactin-producing Escherichia coli, such as colorectal cancer. It can be used in industries such as testing reagents and pharmaceuticals. All publications, patents, and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entirety.
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Abstract
コリバクチンを産生する大腸菌を特異的に検出する手段及び方法、並びにコリバクチン産生菌を特異的に防除する手段及び方法を提供する。 コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体を用いて、試料中のコリバクチンを産生する大腸菌を検出する。コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体を用いて、コリバクチン産生菌を特異的に防除する。
Description
本発明は、コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体に関する。
コリバクチンは、宿主のDNA二本鎖の切断と、鎖間架橋を誘導することで、宿主に遺伝子変異を生じさせる(非特許文献1)。大腸がんの形成には、clbクラスター又はpksクラスターと称される、コリバクチンの生合成に関与する遺伝子クラスターを保有する大腸菌株の存在が関与することが知られる(非特許文献2)。大腸菌のコリバクチン産生菌(clb+)のサブグループは、共生B2系統発生群に分類され、ヒト大腸に生息して、共生の結果として大腸がん発症に関与すると推測されている。clb+株と真核細胞との接触により、コリバクチンは、細胞のG2/M期の細胞周期停止及び/又は巨核球の形成を生じさせると考えられている。大腸がん患者の生検試料からのclbクラスター遺伝子の検出率は67%であり、健常者の21~27%よりも高いことが報告されている。大腸がん発症における、clb+株の役割をより正確に理解するために、コリバクチンの化学的および生物学的特性に関する、より詳細かつ正確な知見を得ることが望まれる。
コリバクチンは、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する細菌が分泌する遺伝子毒素であり、この分泌細菌は、コリバクチン生合成に必要な、ポリケチドシンターゼ(PKS)、非リボソームペプチドシンテターゼ(NRPS)およびPKS-NRPSハイブリッドメガシンテターゼをコードする54キロベースのゲノムアイランドを有することが知られる(非特許文献3)。コリバクチン産生に関与する遺伝子クラスターには、多様な補助酵素の遺伝子が含まれ、その1つとしてペプチダーゼClbPが含まれる。ClbPは、その結晶構造及び他の知見により、コリバクチン前駆体であるプレコリバクチンを活性化して遺伝毒性を有する最終産物にすることが示唆されている(非特許文献4、5)。特許文献1には、ClbPによって特異的に活性化される蛍光プローブを用いて、臨床検体中のコリバクチン産生菌の測定をハイスループットで行う方法が開示されている。当該蛍光プローブはまた、大腸菌株からの高コリバクチン産生菌株の同定にも有用である。
コリバクチンは非常に不安定な構造を有するとされており、その不安定性のため、化学構造は完全には解明されていない。非特許文献6、7には、コリバクチンのプロドラッグモチーフとしてのN-ミリストイル-D-アスパラギン(N-myr-Asn)の構造と、LC-MSによるその検出方法が開示されている。今日まで、遺伝子変異により形成したclb+株を用いて、プレコリバクチン(コリバクチン前駆体)の研究が進められており、多様な化学構造がプレコリバクチン候補物質として同定された。しかし、これらの物質は、野生型clb+大腸菌株からは単離されておらず、これらがヒト大腸に存在するコリバクチン産生菌において、実際にプレコリバクチンとして存在するかは不明である。
Nougayrede, J. P. et al., Science Vol. 313 (5788), pp. 848-851 (2006)
Putze, J. et al., Infect. Immun. Vol. 77 (11), pp. 4696-4703 (2009)
Homburg, S. et al., FEMS Microbiol. Lett. Vol. 275 (2), pp. 255-262 (2007)
Dubois, D. et al, J. Biol. Chem. Vol. 286 (41), pp. 35562-35570 (2011)
Brotherton, C. A. and Balskus, E. P., J. Am. Chem. Soc. Vol. 135 (9), pp. 3359-3362 (2013)
Bian, X. et al., Chembiochem. Vol. 14 (10), 1194-1197 (2013)
Brotherton C. A. et al., Org. Lett., Vol.17, pp. 1545-1548 (2015)
上記の通り、特許文献1には、蛍光プローブを用いてコリバクチンを産生する大腸菌を同定する方法が開示されているが、この方法は候補大腸菌をプローブの存在下で培養する工程を要する。より簡便にコリバクチンを産生する大腸菌を同定する方法が望まれる。また、コリバクチン産生菌を特異的に防除する方法は現在のところ開発されておらず、その開発も望まれる。
本発明は、コリバクチンを産生する大腸菌を特異的に検出する手段及び方法、並びにコリバクチン産生菌を特異的に防除する手段及び方法を提供することを目的とする。
本発明は、以下を提供する。
[1]コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体。
[2]配列番号39で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号40で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一方に対して結合活性を有する、[1]に記載の抗体。
[3]モノクローナル抗体である[1]に記載の抗体。
[4]IgMである、[3]に記載の抗体。
[5]以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを備える、[3]に記載の抗体:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[6]さらに、以下の(b)又は(b’)及び(c)又は(c’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号2で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b’)(b)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号3で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c’)(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[7]さらに、以下の(d)又は(d’)及び(e)又は(e’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号4で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(d’)(d)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号5で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(e’)(e)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[8]さらに、以下の(f)又は(f’)及び(g)又は(g’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(f’)(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(g)配列番号7で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号7で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(g’)(g)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[9]さらに、以下の(h)又は(h’)及び(i)又は(i’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(h)配列番号8で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号8で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(h’)(h)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(i’)(i)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[10]以下の(a1)~(a3)で示される相同性決定領域(CDR)1~3を含む軽鎖可変領域を備える、[3]に記載の抗体:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
[11]以下の(b1)~(b3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(b1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(b2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(b3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(c1)~(c3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(c1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(c2)配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(c3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[12]以下の(d1)~(d3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(d1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(d2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(d3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(e1)~(e3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(e1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(e2)配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(e3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[13]以下の(f1)~(f3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(f1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(f2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(f3)配列番号18で示されるアミノ酸配列又は配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(g1)~(g3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(g1)配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(g2)配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(g3)配列番号26で示されるアミノ酸配列又は配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[14]以下の(h1)~(h3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(h1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(h2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(h3)配列番号19で示されるアミノ酸配列又は配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(i1)~(i3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(i1)配列番号27で示されるアミノ酸配列又は配列番号27で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(i2)配列番号28で示されるアミノ酸配列又は配列番号28で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(i3)配列番号29で示されるアミノ酸配列又は配列番号29で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[15]試料と、[1]~[14]のいずれかに記載の抗体とを接触させる工程を含む、試料中のコリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法。
[16]前記試料が、対象から取り出した試料である、[15]に記載の方法。
[17]前記対象がヒトである、[16]に記載の方法。
[18][1)~[14]のいずれかに記載の抗体を含む、組成物。
[19]コリバクチンを産生する大腸菌の検出するための、[18]に記載の組成物。
[20]医薬組成物である、[18]に記載の組成物。
[21][1)~[13]のいずれかに記載の抗体を対象に投与することを含む、大腸癌を治療又は予防する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-079941号の開示内容を包含する。
[1]コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体。
[2]配列番号39で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号40で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一方に対して結合活性を有する、[1]に記載の抗体。
[3]モノクローナル抗体である[1]に記載の抗体。
[4]IgMである、[3]に記載の抗体。
[5]以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを備える、[3]に記載の抗体:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[6]さらに、以下の(b)又は(b’)及び(c)又は(c’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号2で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b’)(b)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号3で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c’)(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[7]さらに、以下の(d)又は(d’)及び(e)又は(e’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号4で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(d’)(d)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号5で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(e’)(e)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[8]さらに、以下の(f)又は(f’)及び(g)又は(g’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(f’)(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(g)配列番号7で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号7で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(g’)(g)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[9]さらに、以下の(h)又は(h’)及び(i)又は(i’)のポリペプチドを備える、[5]に記載の抗体:
(h)配列番号8で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号8で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(h’)(h)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(i’)(i)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
[10]以下の(a1)~(a3)で示される相同性決定領域(CDR)1~3を含む軽鎖可変領域を備える、[3]に記載の抗体:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
[11]以下の(b1)~(b3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(b1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(b2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(b3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(c1)~(c3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(c1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(c2)配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(c3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[12]以下の(d1)~(d3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(d1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(d2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(d3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(e1)~(e3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(e1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(e2)配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(e3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[13]以下の(f1)~(f3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(f1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(f2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(f3)配列番号18で示されるアミノ酸配列又は配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(g1)~(g3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(g1)配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(g2)配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(g3)配列番号26で示されるアミノ酸配列又は配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[14]以下の(h1)~(h3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(h1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(h2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(h3)配列番号19で示されるアミノ酸配列又は配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(i1)~(i3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(i1)配列番号27で示されるアミノ酸配列又は配列番号27で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(i2)配列番号28で示されるアミノ酸配列又は配列番号28で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(i3)配列番号29で示されるアミノ酸配列又は配列番号29で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、[3]に記載の抗体。
[15]試料と、[1]~[14]のいずれかに記載の抗体とを接触させる工程を含む、試料中のコリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法。
[16]前記試料が、対象から取り出した試料である、[15]に記載の方法。
[17]前記対象がヒトである、[16]に記載の方法。
[18][1)~[14]のいずれかに記載の抗体を含む、組成物。
[19]コリバクチンを産生する大腸菌の検出するための、[18]に記載の組成物。
[20]医薬組成物である、[18]に記載の組成物。
[21][1)~[13]のいずれかに記載の抗体を対象に投与することを含む、大腸癌を治療又は予防する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-079941号の開示内容を包含する。
本発明によれば、コリバクチンを産生する大腸菌を特異的に検出する手段及び方法、並びにコリバクチン産生菌を特異的に防除する手段及び方法を提供することが可能である。
1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体
本発明の第1の実施形態は、コリバクチンを産生する大腸菌(以下、「コリバクチン産生菌」とも称する)に特異的に結合する抗体である。より具体的には、本実施形態の抗体は、コリバクチン産生菌に結合するが、コリバクチンを産生しない大腸菌には結合しない抗体である。
本発明の第1の実施形態は、コリバクチンを産生する大腸菌(以下、「コリバクチン産生菌」とも称する)に特異的に結合する抗体である。より具体的には、本実施形態の抗体は、コリバクチン産生菌に結合するが、コリバクチンを産生しない大腸菌には結合しない抗体である。
従来、コリバクチン産生菌に直接結合する抗体は取得されておらず、コリバクチン産生菌の検出は、特許文献1に示す通り、コリバクチン産生酵素に基質を反応させる方法が適用されてきた。本発明者らは、高コリバクチン産生菌であるEscherichia coli 50(高コリバクチン産生菌(Hirayama, Y. et al., Org. Lett. Vol. 21, No. 12, pp. 4490-4494 (2019))(以下「E.coli-50」とも称する)の菌体懸濁液を免疫原としてマウスに免疫し、同マウスより得られたサンプルを適切にスクリーニングすることで、コリバクチン産生株に特異的に結合する抗体を得ることに成功した。
本明細書において、「抗体」とは、特定の物質(抗原)に特異的に結合するタンパク質を指す。本発明においては、抗原はコリバクチンを産生する大腸菌に由来する物質である。抗体は、コリバクチンを産生する大腸菌に結合し、かつ、コリバクチンを産生しない大腸菌に結合しない抗体であれば、特に限定されず、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されず、IgM、IgD、IgG、IgA、IgE等のいずれであってもよいが、特に、免疫グロブリンM(IgM)であることが好ましい。抗体の由来動物は、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、ラクダ、アルパカ、鳥類、魚類等のいずれであってもよい。好ましくは、抗体の由来生物は、マウスである。なお、本明細書において「抗体」の用語は、必ずしもインタクトな抗体である必要はなく、Fab、Fab’、F(ab’)2等の結合性断片も包含するものとする。あるいは、抗体は、単ドメイン抗体であってもよい。単ドメイン抗体は、単鎖抗体、ナノボディ(登録商標)とも称される、重鎖のみで構成される抗体(免疫グロブリン)の可変領域からなる抗体であり、ラクダ科哺乳類でみられるVHH、サメ科でみられるVNARが知られる。
本実施形態の抗体は、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくともいずれか一方に対して結合活性を有することが好ましく、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドの両方に対して結合活性を有することがより好ましい。
KRLLFMIKSV(配列番号39)
YTAVVKKSS(配列番号40)
本明細書において、抗体のポリペプチドに対する「結合活性を有する」状態は、任意のアミノ配列を有するポリペプチドと比較して、目的のポリペプチドに対する抗体の結合量が有意に多くなる、及び/あるいは、任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して、目的のポリペプチドへの結合力が高いことを指す。ここでいう抗体の結合量は、特に限定されないが、例えば、イムノブロット、ELISA等で測定することができる。また、抗体の結合力は、特に限定されないが、例えば、Biacore(登録商標)等の機器を使用して測定することができる。
KRLLFMIKSV(配列番号39)
YTAVVKKSS(配列番号40)
本明細書において、抗体のポリペプチドに対する「結合活性を有する」状態は、任意のアミノ配列を有するポリペプチドと比較して、目的のポリペプチドに対する抗体の結合量が有意に多くなる、及び/あるいは、任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して、目的のポリペプチドへの結合力が高いことを指す。ここでいう抗体の結合量は、特に限定されないが、例えば、イムノブロット、ELISA等で測定することができる。また、抗体の結合力は、特に限定されないが、例えば、Biacore(登録商標)等の機器を使用して測定することができる。
配列番号39及び40は、具体的には大腸菌のPapAの部分配列である。本発明者らは、コリバクチン産生大腸菌に反応し、コリバクチンを産生しない大腸菌には反応しないモノクローナル抗体4種を構築し、コリバクチン産生大腸菌由来タンパク質について、前記抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、ラダー状のバンドがみられたことから、前記抗体は繰り返し配列を有するタンパク質に反応すると推察した。次いで、本発明者らは、大腸菌タンパク質のうち、線毛の繰り返し構造を構成するタンパク質としてPapAに着目し、PapAのアミノ酸配列(配列番号42)に基づいて前記抗体4種のエピトープマッピングを行った。その結果、4種の抗体のいずれも、配列番号39及び40で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに強い結合活性を有することが確認された。
1-1 第1態様
以下、本実施形態の具体的な態様を挙げて本実施形態を説明するが、本実施形態を以下の態様に限定することを意図するものではない。
本実施形態の第1態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(b)又は(b’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号2で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b’)(b)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(c)又は(c’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号3で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c’)(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
以下、本実施形態の具体的な態様を挙げて本実施形態を説明するが、本実施形態を以下の態様に限定することを意図するものではない。
本実施形態の第1態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(b)又は(b’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号2で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b’)(b)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(c)又は(c’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号3で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c’)(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第1態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
本実施形態の第1態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(b1)~(b3)で示され:
(b1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(b2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(b3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(c1)~(c3)で示される:
(c1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(c2)配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(c3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(b1)~(b3)で示され:
(b1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(b2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(b3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(c1)~(c3)で示される:
(c1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(c2)配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(c3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
1-2 第2態様
本実施形態の第2態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(d)又は(d’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号4で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(d’)(d)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(e)又は(e’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号5で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(e’)(e)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第2態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(d)又は(d’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号4で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(d’)(d)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(e)又は(e’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号5で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(e’)(e)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第2態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
本実施形態の第2態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(d1)~(d3)で示され:
(d1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(d2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(d3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(e1)~(e3)で示される:
(e1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(e2)配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(e3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(d1)~(d3)で示され:
(d1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(d2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(d3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(e1)~(e3)で示される:
(e1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(e2)配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(e3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
1-3 第3態様
本実施形態の第3態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(f)又は(f’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(f’)(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(g)又は(g’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(g)配列番号7で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号7で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(g’)(g)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第3態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(f)又は(f’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(f’)(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(g)又は(g’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(g)配列番号7で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号7で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(g’)(g)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第3態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
本実施形態の第3態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(f1)~(f3)で示され:
(f1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(f2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(f3)配列番号18で示されるアミノ酸配列又は配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(g1)~(g3)で示される:
(g1)配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(g2)配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(g3)配列番号26で示されるアミノ酸配列又は配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(f1)~(f3)で示され:
(f1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(f2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(f3)配列番号18で示されるアミノ酸配列又は配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(g1)~(g3)で示される:
(g1)配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(g2)配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(g3)配列番号26で示されるアミノ酸配列又は配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
1-4 第4態様
本実施形態の第4態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(h)又は(h’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(h)配列番号8で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号8で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(h’)(h)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(i)又は(i’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(i’)(i)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第4態様は、モノクローナルIgM抗体であり、以下の特徴を有する。
以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域1を有し:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(h)又は(h’)のポリペプチドを含む軽鎖可変領域2を有し:
(h)配列番号8で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号8で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(h’)(h)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
かつ、以下の(i)又は(i’)のポリペプチドを含む重鎖可変領域を有する:
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(i’)(i)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
本実施形態の第4態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域1におけるCDR1~3が、以下の(a1)~(a3)で示される:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
本実施形態の第4態様は、好ましくは、上記特徴に加えて、あるいは上記特徴に代えて以下の特徴を有する。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(h1)~(h3)で示され:
(h1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(h2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(h3)配列番号19で示されるアミノ酸配列又は配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(i1)~(i3)で示される:
(i1)配列番号27で示されるアミノ酸配列又は配列番号27で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(i2)配列番号28で示されるアミノ酸配列又は配列番号28で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(i3)配列番号29で示されるアミノ酸配列又は配列番号29で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
軽鎖可変領域2におけるCDR1~3が、以下の(h1)~(h3)で示され:
(h1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(h2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(h3)配列番号19で示されるアミノ酸配列又は配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
かつ、重鎖可変領域におけるCDR1~3が、以下の(i1)~(i3)で示される:
(i1)配列番号27で示されるアミノ酸配列又は配列番号27で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(i2)配列番号28で示されるアミノ酸配列又は配列番号28で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(i3)配列番号29で示されるアミノ酸配列又は配列番号29で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。
2.コリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法
本発明の第2の実施形態は、試料と、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体とを接触させる工程を含む、試料中のコリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法である。
本発明の第2の実施形態は、試料と、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体とを接触させる工程を含む、試料中のコリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法である。
本実施形態の方法は、対象から取り出した試料、特に大腸癌への罹患が疑われる、又は大腸癌罹患リスクが高いと疑われる対象から取り出した試料について、in vitroで試料中に含まれるコリバクチン産生菌を検出することによって、対象の大腸癌罹患又は大腸癌罹患リスクの診断を補助することが可能である。
本明細書において「対象」には、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される哺乳類動物などが含まれる。本明細書における対象は、好ましくは、ヒトである。本明細書において「試料」は、対象から取り出した試料、例えば、血液(例、全血、血清、血漿)、尿、糞便、乳汁、組織又は細胞抽出液、鼻汁、唾液、あるいはこれらの混合物とすることができる。好ましくは、糞便試料とすることができる。
本実施形態の方法は、具体的には、対象から取り出した試料をコリバクチン産生菌に結合する抗体と接触させる工程を含む、免疫測定のための方法である。このような免疫測定としては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このような免疫測定としては、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)、化学発光イムノアッセイ(CLIA)、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、及びサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。上記の免疫測定の原理及び具体的な手法は、いずれも当業者にとって周知である。
本実施形態の方法において、コリバクチン産生菌の検出は、定性的であっても定量的であってもよい。定性的手法としては、例えば、試料から得られるシグナルを予め設定したカットオフと比較することで、試料中のコリバクチン産生菌の存在の有無を判定する手法をとり得る。定量的手法としては、既知量の抗原を含む標準液について、試料と同様に免疫測定を行い、試料と標準液より得られるシグナル強度を比較して試料中の抗原量を算出する手法をとり得る。また、本実施形態の方法は、標準液中の抗原を検出する工程、及び標準液の検出結果より試料中のコリバクチン産生菌量を算出する工程を含んでいてもよい。
本実施形態の方法において、コリバクチン産生菌が定性的に「陽性」と判定された場合、あるいは定量値が判定基準を上回る場合に、試料を取り出した対象が、大腸菌に罹患している、又は罹患リスクが高い状態にあるという判定をサポートすることができる。
3.コリバクチン産生菌検出用組成物
本発明は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を含む組成物を包含する。本発明の第3の実施形態は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を含む、コリバクチンを産生する大腸菌を検出するための組成物である。
本発明は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を含む組成物を包含する。本発明の第3の実施形態は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を含む、コリバクチンを産生する大腸菌を検出するための組成物である。
本実施形態の組成物は、本発明の第1の実施形態の抗体のうち、少なくとも1種類の抗体を含む。本実施形態の組成物は、「2.コリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法」の項に記載の方法を実施するために使用することができ、試料中のコリバクチン産生菌を検出するために使用することができる。特に、大腸癌への罹患が疑われる、又は大腸癌罹患リスクが高いと疑われる対象から取り出した試料について、コリバクチン産生菌の検出に使用することで、対象の大腸癌罹患又は大腸癌罹患リスクの診断の補助を可能とする。ここでいう「試料」及び「対象」は、「2.コリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法」の項に記載した通りである。
本実施形態の組成物は、単独で、又は他の試液、器材等と組み合わされて、コリバクチン産生菌検出用試薬又はキットとして使用することができる。このような試薬又はキットは、コリバクチン産生菌に特異的に結合する抗体を使用する免疫測定のための試薬又はキットである。このような免疫測定としては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このような免疫測定としては、CLEIA、CLIA、TIA、EIA(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、及びサンドイッチELISA)、RIA、ラテックス凝集反応法、FIA及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。上記の免疫測定の原理及び具体的な手法は、いずれも当業者にとって周知である。
本実施形態の組成物は、必要に応じてリン酸バッファー、Tris、MES、HEPES、PIPES等のpH緩衝剤、EDTA等のキレート剤、防腐剤等を含有させてもよい。また、抗体の安定化剤として、BSA、カゼイン、グリシン等を含有させてもよい。また、本実施形態の組成物は、pH5~9、特にpH6~8、さらにpH6.5~7.5とすることが好ましい。
4.医薬組成物
本実施形態の第4の実施形態は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を含む、医薬組成物である。本実施形態の医薬組成物は、対象において、コリバクチン産生菌を特異的に防除することが可能である。これにより、本実施形態の医薬組成物は、大腸癌の治療及び/又は予防のために使用することができる。
本実施形態の第4の実施形態は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を含む、医薬組成物である。本実施形態の医薬組成物は、対象において、コリバクチン産生菌を特異的に防除することが可能である。これにより、本実施形態の医薬組成物は、大腸癌の治療及び/又は予防のために使用することができる。
ここでいう「対象」は、医薬組成物の投与を受ける対象を指し、具体的には、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される哺乳類動物などが含まれる。好ましくは、ヒトである。
本実施形態の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口、経鼻、舌下、皮下、筋肉内等の公知のいずれの投与経路としてもよい。
本実施形態の医薬組成物は、前記抗体に加えて、必要に応じて製薬上許容される担体を含有してもよい。ここでいう「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖(より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む)、金属塩(例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム)、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール(PEG)、プルロニック(登録商標)、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び/又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
充填剤としては、前記糖及び/又はリン酸カルシウム(例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム)が例として挙げられる。
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬理効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
本実施形態の医薬組成物は、前記抗体の効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、他の抗生物質を所定量含有していても良い。
本実施形態の医薬組成物の剤形は、有効成分である前記抗体、及び他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形、又は、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形が挙げられる。
本実施形態の医薬組成物は、含有される有効成分が失活しない、あらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、経口又は非経口(例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻)のいずれであってもよい。
本実施形態の医薬組成物は、前記抗体を、コリバクチン産生菌の防除に効果的で、かつ重篤な副作用が発生する可能性が極めて低い量で含むことが好ましい。本発明の医薬組成物の投与回数は、コリバクチン産生菌の防除効果が十分に得られ、かつ重篤な副作用が生じない限り、特に限定しないが、例えば、3日に1回~1日5回、特に1日1回~1日3回とすることが好ましい。本実施形態の医薬組成物の投与期間は特に限定されないが、例えば、3日間~1ヶ月、特に1週間~2週間とすることができる。
本明細書はまた、本実施形態の医薬組成物を製造する方法を提供する。ここで開示される医薬組成物を製造する方法は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を使用して、本実施形態の医薬組成物を製造する方法である。
5.大腸癌を治療又は予防する方法
本発明の第5の実施形態は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を用いて、大腸癌を治療又は予防する方法である。より具体的には、本実施形態の方法は、「4.医薬組成物」の項に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含むことを特徴とする。
本発明の第5の実施形態は、「1.コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体」の項に記載の少なくとも1つの抗体を用いて、大腸癌を治療又は予防する方法である。より具体的には、本実施形態の方法は、「4.医薬組成物」の項に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含むことを特徴とする。
本実施形態の方法は、例えば、前記抗体を医薬組成物等として対象に経口又は非経口で投与して腸内のコリバクチン産生菌を殺傷する態様、内視鏡下で蛍光色素標識した前記抗体を対象の腸内に噴霧し、蛍光染色したコリバクチン産生菌の存在位置を治療標的(例えば腫瘍切除)とする態様等を包含する。
[実施例1]コリバクチン産生菌結合性抗体の調製
(1)免疫
コリバクチン産生菌株50(高コリバクチン産生菌(Hirayama, Y. et al., Org. Lett. Vol. 21, No. 12, pp. 4490-4494 (2019))(以下「E.coli-50」とも称する)を、LB液体培地で37℃、20時間培養した。培養液から菌体を集菌して、PBS(-)で2回洗浄した後、PBS(-)に1×1010細胞/mLとなるように懸濁し、60℃、60分間の熱処理を行った。加熱後の大腸菌懸濁液100μLをSigma Adjuvant System(カタログNo.S6322、シグマ社)100μLと混和して混合溶液を調製し、これをマウス(BALB/c、メス、8週齢)2匹に対して、両脚部に50μLずつ皮下注射した。2週間後にマウスを屠殺し、脾臓および膝下リンパ節を採取した。
(1)免疫
コリバクチン産生菌株50(高コリバクチン産生菌(Hirayama, Y. et al., Org. Lett. Vol. 21, No. 12, pp. 4490-4494 (2019))(以下「E.coli-50」とも称する)を、LB液体培地で37℃、20時間培養した。培養液から菌体を集菌して、PBS(-)で2回洗浄した後、PBS(-)に1×1010細胞/mLとなるように懸濁し、60℃、60分間の熱処理を行った。加熱後の大腸菌懸濁液100μLをSigma Adjuvant System(カタログNo.S6322、シグマ社)100μLと混和して混合溶液を調製し、これをマウス(BALB/c、メス、8週齢)2匹に対して、両脚部に50μLずつ皮下注射した。2週間後にマウスを屠殺し、脾臓および膝下リンパ節を採取した。
(2)細胞融合
採取した脾臓、膝下リンパ節をそれぞれ半分に切断し、デッキピンセットで細胞をシャーレに押し出し、FBS(+)5mLに懸濁した。細胞を100μmセルストレイナーに通した後、50mL遠心管に移した。FBS(+)10mLでシャーレとセルストレイナーを洗い込み、遠心分離(1000rpm、5分間、室温)した。上清を捨てペレットをタッピングし、FBS(+)に懸濁して細胞数を計数した。また、マウスミエローマP3U1細胞を計数し、108細胞/mLとなるようにFBS(+)に懸濁した。脾細胞・リンパ節細胞:P3U1=3~4:1の割合になるように、50mL遠心管にP3U1を加えて懸濁した。遠心分離(1000rpm、5分間、室温)した後、FBS(-)30mLで再懸濁し、遠心分離(1000rpm、5分間、室温)をした。上清を除去後、ペレットをタッピングした。PEG 1mLを1mL/minの速度で添加し1分間静置した。さらに、FBS(-)30mLを、1mL/分の速度で振りながら加え、残りの20mLもゆっくり加えた。遠心分離(1000rpm、5分間、室温)した後、上清を捨てペレットをタッピングした。HAT培地に細胞を懸濁し、96穴マイクロウェルプレートに1ウェルあたり200μLずつ分注し、37℃、5%CO2で培養した(以後、細胞培養は同条件)。細胞の状態を確認し、細胞培養上清を回収した。
採取した脾臓、膝下リンパ節をそれぞれ半分に切断し、デッキピンセットで細胞をシャーレに押し出し、FBS(+)5mLに懸濁した。細胞を100μmセルストレイナーに通した後、50mL遠心管に移した。FBS(+)10mLでシャーレとセルストレイナーを洗い込み、遠心分離(1000rpm、5分間、室温)した。上清を捨てペレットをタッピングし、FBS(+)に懸濁して細胞数を計数した。また、マウスミエローマP3U1細胞を計数し、108細胞/mLとなるようにFBS(+)に懸濁した。脾細胞・リンパ節細胞:P3U1=3~4:1の割合になるように、50mL遠心管にP3U1を加えて懸濁した。遠心分離(1000rpm、5分間、室温)した後、FBS(-)30mLで再懸濁し、遠心分離(1000rpm、5分間、室温)をした。上清を除去後、ペレットをタッピングした。PEG 1mLを1mL/minの速度で添加し1分間静置した。さらに、FBS(-)30mLを、1mL/分の速度で振りながら加え、残りの20mLもゆっくり加えた。遠心分離(1000rpm、5分間、室温)した後、上清を捨てペレットをタッピングした。HAT培地に細胞を懸濁し、96穴マイクロウェルプレートに1ウェルあたり200μLずつ分注し、37℃、5%CO2で培養した(以後、細胞培養は同条件)。細胞の状態を確認し、細胞培養上清を回収した。
(3)ELISAによる抗体価の測定
E.coli-50、コリバクチン陰性大腸菌#A(以下「#A」とも称する)を、それぞれLB液体培地で、37℃、20時間培養した。ここで#Aは、特許文献1に記載の方法でコリバクチン陰性であることを確認した株である。培養後、菌体を純水で3回洗浄し、液体窒素を用いて急速冷凍した後、凍結乾燥を行った。それぞれの菌株が0.5mg/mLとなるように0.05%Tween添加のPBS(-)(以下T-PBS)に懸濁した。E.coli-50又は#Aの懸濁液を96穴マイクロウェルプレート(Nunc イムノプレート、カタログNo.439454)の各ウェルに100μL分注して、4℃で1日以上静置し固相化した。このプレートをT-PBSで3回洗浄した後、1%BSA(T-PBSに溶解)を添加し、室温で2時間静置し、ブロッキングを行った。これを、T-PBSで3回洗浄して、抗原固相化ウェルを得た。上記(2)の細胞融合により得られた多数の抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をそれぞれ1週間培養した。培養上清を、各ウェルに100μLまたは50μLずつ加え、4℃で一晩静置した。T-PBSで4回洗浄後、0.5ng/mL HRP標識ヒツジ抗マウスIgG+IgM+IgA抗体100μLを加え、37℃で1時間静置した。T-PBSで4回洗浄後、基質液(0.04% o-フェニレンジアミン)100μLを加え、遮光して室温にて30分間静置した。2N硫酸 450μLを添加して反応を停止させ、マルチプレートリーダーで各ウェルの490nmの吸光度を測定した。
E.coli-50、コリバクチン陰性大腸菌#A(以下「#A」とも称する)を、それぞれLB液体培地で、37℃、20時間培養した。ここで#Aは、特許文献1に記載の方法でコリバクチン陰性であることを確認した株である。培養後、菌体を純水で3回洗浄し、液体窒素を用いて急速冷凍した後、凍結乾燥を行った。それぞれの菌株が0.5mg/mLとなるように0.05%Tween添加のPBS(-)(以下T-PBS)に懸濁した。E.coli-50又は#Aの懸濁液を96穴マイクロウェルプレート(Nunc イムノプレート、カタログNo.439454)の各ウェルに100μL分注して、4℃で1日以上静置し固相化した。このプレートをT-PBSで3回洗浄した後、1%BSA(T-PBSに溶解)を添加し、室温で2時間静置し、ブロッキングを行った。これを、T-PBSで3回洗浄して、抗原固相化ウェルを得た。上記(2)の細胞融合により得られた多数の抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をそれぞれ1週間培養した。培養上清を、各ウェルに100μLまたは50μLずつ加え、4℃で一晩静置した。T-PBSで4回洗浄後、0.5ng/mL HRP標識ヒツジ抗マウスIgG+IgM+IgA抗体100μLを加え、37℃で1時間静置した。T-PBSで4回洗浄後、基質液(0.04% o-フェニレンジアミン)100μLを加え、遮光して室温にて30分間静置した。2N硫酸 450μLを添加して反応を停止させ、マルチプレートリーダーで各ウェルの490nmの吸光度を測定した。
490nmの吸光度の0.09以上となる上清が、膝下リンパ節からは7サンプル、脾臓からは96サンプル得られた。これらの上清を限界希釈してモノクローン化し、753株の細胞を得た。これらの細胞について、上記と同様に、培養、ELISAを行い、641株の陽性細胞を得た。これらを限界希釈して培養した後、E.coli-50のプレートと、#Aのプレートとで吸光度の差(ΔABS)が特に高い4株(α株、β株、γ株、δ株)を選定した。4株はいずれも脾臓由来のハイブリドーマであった。
[実施例2]モノクローナル抗体のコリバクチン産生大腸菌結合特異性の検討
実施例1で得られた4株のモノクローナル抗体について、コリバクチン産生大腸菌への結合特異性を検討した。E.coli-50、Nissle 1917株(コリバクチン陽性株)及び臨床検体から得られた4株の大腸菌について、実施例1(3)に記載の方法と同様の方法で、固相化ウェルをそれぞれ調製した。4株は、いずれも特許文献1に記載の方法でコリバクチン陰性/陽性が確認された株である。
実施例1で得られた4株のモノクローナル抗体について、コリバクチン産生大腸菌への結合特異性を検討した。E.coli-50、Nissle 1917株(コリバクチン陽性株)及び臨床検体から得られた4株の大腸菌について、実施例1(3)に記載の方法と同様の方法で、固相化ウェルをそれぞれ調製した。4株は、いずれも特許文献1に記載の方法でコリバクチン陰性/陽性が確認された株である。
実施例1で得られたハイブリドーマ4株及びE.coli-50と#Aの両方で陽性を示したハイブリドーマ1株(非特異的反応株)について、1週間培養を行い、その培養上清について、6種の抗原固相化ウェルに、それぞれ100μLずつ分注した。以後、実施例1(3)に記載した方法と同様にして、ELISAを行った。ELISAは二重測定で実施した。ELISAの結果を表1に示す。吸光度0.15をカットオフとして、0.15以上を陽性と判定する場合、各抗体を用いた場合の陽性判定率は、いずれも、コリバクチン陽性大腸菌において75%(3例/4例)、コリバクチン陰性大腸菌において0%(0例/2例)であった。得られた4株のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれも、高い特異性でコリバクチン陽性の大腸菌に結合することが示された。
[実施例3]モノクローナル抗体の相同性決定領域(CDR)の配列決定
実施例1で得られた4株のモノクローナル抗体について、CDR配列解析を行った。CDR配列決定は、合同会社PGL(愛知県岡崎市)にて行った。具体的には、各ハイブリドーマからのRNA抽出、cDNA調製、PCRによる可変領域の増幅、クローニング、キャプラリーシークエンスによる配列解析を経て、CDR配列を決定した。いずれのクローンもIgM抗体を産生することが確認された。また、いずれのクローンからも軽鎖配列(L鎖、κ)が2つ、重鎖配列が1つ検出された。α株、β株、γ株、δ株から得られた各鎖のアミノ酸配列及び核酸配列をそれぞれ表2、表3、表4、表5に示す。
実施例1で得られた4株のモノクローナル抗体について、CDR配列解析を行った。CDR配列決定は、合同会社PGL(愛知県岡崎市)にて行った。具体的には、各ハイブリドーマからのRNA抽出、cDNA調製、PCRによる可変領域の増幅、クローニング、キャプラリーシークエンスによる配列解析を経て、CDR配列を決定した。いずれのクローンもIgM抗体を産生することが確認された。また、いずれのクローンからも軽鎖配列(L鎖、κ)が2つ、重鎖配列が1つ検出された。α株、β株、γ株、δ株から得られた各鎖のアミノ酸配列及び核酸配列をそれぞれ表2、表3、表4、表5に示す。
各株のモノクローナル抗体のCDR配列を表6に示す。
上記に示す通り、コリバクチン産生菌に特異的な抗体を取得することに成功した。さらに、該抗体の構造、特にCDRの構造を特定することに成功した。
[実施例4]モノクローナル抗体を用いた大腸癌患者の大腸組織検体の免疫組織染色
大腸腺腫患者の組織検体10症例について、自動染色装置(ロシュ・ダイアグノスティックス社、ベンチマークXT)を使用して、免疫組織染色を行った。詳細な染色方法は、以下の通りである。常法に従って検体の脱パラフィン及び水和を行った。CC1バッファー(ロシュ・ダイアグノスティックス社)に浸漬して60分間の熱処理(60℃)を行った。検体を、実施例2で取得したδ株細胞上清をPBSで5倍に希釈した一次抗体反応液に浸漬して、室温で32分間インキュベートした。その後、常法に従って、二次抗体反応及び基質反応を行った。さらに、UltraWash(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いて洗浄した後、HEMATOXYLIN II(ロシュ・ダイアグノスティックス社)に浸漬して核染色を行った。UltraWash(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いて洗浄した後、BLUING REAGENTを滴下した。自動染色装置から検体を取り出し、中性洗剤で反応バッファーを洗浄した後、精製水で洗浄した。常法に従って、脱水及び透過処理を行い、パラフィンで封入した。
大腸腺腫患者の組織検体10症例について、自動染色装置(ロシュ・ダイアグノスティックス社、ベンチマークXT)を使用して、免疫組織染色を行った。詳細な染色方法は、以下の通りである。常法に従って検体の脱パラフィン及び水和を行った。CC1バッファー(ロシュ・ダイアグノスティックス社)に浸漬して60分間の熱処理(60℃)を行った。検体を、実施例2で取得したδ株細胞上清をPBSで5倍に希釈した一次抗体反応液に浸漬して、室温で32分間インキュベートした。その後、常法に従って、二次抗体反応及び基質反応を行った。さらに、UltraWash(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いて洗浄した後、HEMATOXYLIN II(ロシュ・ダイアグノスティックス社)に浸漬して核染色を行った。UltraWash(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いて洗浄した後、BLUING REAGENTを滴下した。自動染色装置から検体を取り出し、中性洗剤で反応バッファーを洗浄した後、精製水で洗浄した。常法に従って、脱水及び透過処理を行い、パラフィンで封入した。
各症例における、腺腫部分と非腫瘍部分の免疫組織染色での染色の強度を、検鏡下で目視で判定した。判定結果を表7に示す。
[実施例5]モノクローナル抗体のエピトープ決定
(1)ウェスタンブロッティング
コリバクチン産生大腸菌E.coli-50及びコリバクチンを産生しない大腸菌#Aのそれぞれ菌体をPBSで懸濁して超音波破砕した後、アクリルアミドゲルにタンパク質量が0.3~5.0μgとなるようにロードして、SDS-PAGEを行った。ゲル状のタンパク質をメンブレンに転写した後、一次抗体として10ng/mLのδ株モノクローナル抗体(細胞培養上清をPBSで150000倍希釈したもの)、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgM重鎖抗体(10000倍希釈したもの)を用いて、常法に従ってウェスタンブロットを行った。基質は、Immunostar(登録商標)LD(富士フイルム和光純薬社製)を使用した。図1にウェスタンブロットの結果を示す。E.coli-50株のバンドがラダー状になっていることから、抗体は、繰り返し構造を有するタンパク質に反応することが推測された。
(1)ウェスタンブロッティング
コリバクチン産生大腸菌E.coli-50及びコリバクチンを産生しない大腸菌#Aのそれぞれ菌体をPBSで懸濁して超音波破砕した後、アクリルアミドゲルにタンパク質量が0.3~5.0μgとなるようにロードして、SDS-PAGEを行った。ゲル状のタンパク質をメンブレンに転写した後、一次抗体として10ng/mLのδ株モノクローナル抗体(細胞培養上清をPBSで150000倍希釈したもの)、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgM重鎖抗体(10000倍希釈したもの)を用いて、常法に従ってウェスタンブロットを行った。基質は、Immunostar(登録商標)LD(富士フイルム和光純薬社製)を使用した。図1にウェスタンブロットの結果を示す。E.coli-50株のバンドがラダー状になっていることから、抗体は、繰り返し構造を有するタンパク質に反応することが推測された。
(2)組換えPapAの生成とウェスタンブロット
大腸菌の繰り返し構造を線毛のPapAの繰り返し構造と推定し、組換えPapAを生成して抗体との反応性を確認した。pET21cベクターのT7プロモーター下流にE.coli-50のpapA遺伝子(配列番号41、表8)を組み込み、大腸菌BC21(DE3)に導入した。大腸菌BC21(DE3)自体は、papA遺伝子を有しないことが知られている。0.1mM IPTGを含む培地で前記大腸菌を培養した後、培養液を遠心分離して菌体ペレットを得た。菌体をPBSで懸濁して超音波破砕した後、常法に従ってSDS-PAGE及びCBB染色を行い、PapAタンパク質の約20kDaのタンパク質の生成を確認した。次いで、(1)と同様に、一次抗体として10ng/mLのδ株モノクローナル抗体、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgM重鎖抗体を用いて、常法に従ってウェスタンブロットを行った。その結果、約20kDaと約16kDaの2本の強い発色を示すバンドが確認された。以上により、δ株モノクローナル抗体がPapAに反応することが確認された。
大腸菌の繰り返し構造を線毛のPapAの繰り返し構造と推定し、組換えPapAを生成して抗体との反応性を確認した。pET21cベクターのT7プロモーター下流にE.coli-50のpapA遺伝子(配列番号41、表8)を組み込み、大腸菌BC21(DE3)に導入した。大腸菌BC21(DE3)自体は、papA遺伝子を有しないことが知られている。0.1mM IPTGを含む培地で前記大腸菌を培養した後、培養液を遠心分離して菌体ペレットを得た。菌体をPBSで懸濁して超音波破砕した後、常法に従ってSDS-PAGE及びCBB染色を行い、PapAタンパク質の約20kDaのタンパク質の生成を確認した。次いで、(1)と同様に、一次抗体として10ng/mLのδ株モノクローナル抗体、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgM重鎖抗体を用いて、常法に従ってウェスタンブロットを行った。その結果、約20kDaと約16kDaの2本の強い発色を示すバンドが確認された。以上により、δ株モノクローナル抗体がPapAに反応することが確認された。
(3)エピトープマッピング
ResPep SL(Intavis社製)を用いて、E.coli-50のPapAのアミノ酸配列(配列番号42、表9)上の12アミノ残基を有するポリペプチドを、N末端側から1アミノ酸残基ずらしで計179種類、メンブレン上に合成した(図2)。図2に示すメンブレン上の、A1~F29のスポットにPapAの部分ペプチドをそれぞれ固相化した。0.05%Tween-PBSでメンブレンを洗浄後、4%BSA-PBSで2時間、室温でブロッキングした。一次抗体としての10ng/mLのδ株モノクローナル抗体/PBS溶液にメンブレンを浸漬して一晩反応させ、0.05%Tween-PBSで洗浄後、二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgM抗体重鎖二次抗体を含むPBS中に2時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、ImmunoStar(登録商標)LDの基質液と反応させて発色させ、LuminograghI(ATTO社製)で撮影した。
ResPep SL(Intavis社製)を用いて、E.coli-50のPapAのアミノ酸配列(配列番号42、表9)上の12アミノ残基を有するポリペプチドを、N末端側から1アミノ酸残基ずらしで計179種類、メンブレン上に合成した(図2)。図2に示すメンブレン上の、A1~F29のスポットにPapAの部分ペプチドをそれぞれ固相化した。0.05%Tween-PBSでメンブレンを洗浄後、4%BSA-PBSで2時間、室温でブロッキングした。一次抗体としての10ng/mLのδ株モノクローナル抗体/PBS溶液にメンブレンを浸漬して一晩反応させ、0.05%Tween-PBSで洗浄後、二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgM抗体重鎖二次抗体を含むPBS中に2時間反応させた。0.05%Tween-PBSで洗浄後、ImmunoStar(登録商標)LDの基質液と反応させて発色させ、LuminograghI(ATTO社製)で撮影した。
図2は、発色後のメンブレンの写真である。発色が見られたA1~A4、D4~D10、F3~F15のスポットに固相化されたペプチドの配列を下記表10に示す。
特にδ株モノクローナル抗体との反応性が高かったスポットに固相化したペプチドの構造から、抗体エピトープは以下の2つのポリペプチドと推定した。
KRLLFMIKSV(配列番号39)
YTAVVKKSS(配列番号40)
KRLLFMIKSV(配列番号39)
YTAVVKKSS(配列番号40)
(4)ペプチド競合試験
ペプチドKRLLFMIKSV(配列番号39、以下「ペプチド「KR」)、ペプチドYTAVVKKSS(配列番号40、以下「ペプチドYT」)をResPep SL(Intavis社製)を用いて合成した。E.coli-50株を、60℃で60分間加熱処理したのち、常法に従って凍結乾燥を行い、凍結乾燥抽出物を得た。ペプチドKR、ペプチドYT、ペプチドKR+ペプチドYT混合物、及び、E.coli-50株凍結乾燥抽出物を、それぞれ、10ng/mLのδ株モノクローナル抗体/PBS溶液中で、室温で3時間反応させた。
ペプチドKRLLFMIKSV(配列番号39、以下「ペプチド「KR」)、ペプチドYTAVVKKSS(配列番号40、以下「ペプチドYT」)をResPep SL(Intavis社製)を用いて合成した。E.coli-50株を、60℃で60分間加熱処理したのち、常法に従って凍結乾燥を行い、凍結乾燥抽出物を得た。ペプチドKR、ペプチドYT、ペプチドKR+ペプチドYT混合物、及び、E.coli-50株凍結乾燥抽出物を、それぞれ、10ng/mLのδ株モノクローナル抗体/PBS溶液中で、室温で3時間反応させた。
E.coli-50をPBSで懸濁して超音波破砕した後、アクリルアミドゲルにタンパク質量が1μgとなるようにロードして、SDS-PAGEを行った。ゲル状のタンパク質をメンブレンに転写した後、一次抗体として、10ng/mLのδ株モノクローナル抗体溶液、及びδ株モノクローナル抗体と各種ペプチド又はE.coli-50株凍結乾燥抽出物をδ株モノクローナル抗体反応させた抗体溶液をそれぞれ使用して、メンブレンを反応させた。二次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgM重鎖抗体(10000倍希釈したもの)を用いて、常法に従ってウェスタンブロットを行った。基質は、Immunostar(登録商標)LD(富士フイルム和光純薬社製)を使用した。
図3にウェスタンブロットの写真を示す。競合反応を行わなかった抗体は、メンブレン上のペプチドと強い反応を示した。また、ペプチドKR及びペプチドYTのどちらか一方を反応させた抗体についても、同様にメンブレン上のペプチドに強い反応を示した。これに対して、ペプチドKR+ペプチドYT混合物又はE.coli-50株凍結乾燥抽出物を反応させた抗体については、メンブレン上のペプチドとの反応がほとんど見られなかった。以上の結果より、δ株モノクローナル抗体のエピトープは、ペプチドKR及びペプチドYTの2つのペプチドであることが示された。他のモノクローナル抗体である、α、β、γ株由来のモノクローナル抗体についても同様の試験を行い、同様の結果が得られたことから、これらのモノクローナル抗体のエピトープはほぼ一致することが示された。
本発明は、コリバクチンを産生する大腸菌に関連する疾患、例えば、大腸癌について、その罹患の有無及び/又は罹患リスクの有無の判定、治療及び/又は予防に有用な抗体に係る発明であり、臨床検査試薬、医薬品等の業界において利用可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (20)
- コリバクチンを産生する大腸菌に特異的に結合する抗体。
- 配列番号39で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号40で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一方に対して結合活性を有する、請求項1に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- IgMである、請求項3に記載の抗体。
- 以下の(a)又は(a’)のポリペプチドを備える、請求項4に記載の抗体:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(a’)(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。 - さらに、以下の(b)又は(b’)及び(c)又は(c’)のポリペプチドを備える、請求項5に記載の抗体:
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号2で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b’)(b)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号3で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c’)(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。 - さらに、以下の(d)又は(d’)及び(e)又は(e’)のポリペプチドを備える、請求項5に記載の抗体:
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号4で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(d’)(d)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号5で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(e’)(e)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。 - さらに、以下の(f)又は(f’)及び(g)又は(g’)のポリペプチドを備える、請求項5に記載の抗体:
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(f’)(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド;
(g)配列番号7で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号7で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(g’)(g)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。 - さらに、以下の(h)又は(h’)及び(i)又は(i’)のポリペプチドを備える、請求項5に記載の抗体:
(h)配列番号8で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号8で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(h’)(h)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(i’)(i)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を部分配列として含むポリペプチド。 - 以下の(a1)~(a3)で示される相同性決定領域(CDR)1~3を含む軽鎖可変領域を備える、請求項3に記載の抗体:
(a1)配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号10で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(a2)配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(a3)配列番号12で示されるアミノ酸配列又は配列番号12で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3。 - 以下の(b1)~(b3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(b1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(b2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(b3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(c1)~(c3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(c1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(c2)配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;からなるCDR2;及び
(c3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、請求項3に記載の抗体。 - 以下の(d1)~(d3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(d1)配列番号13で示されるアミノ酸配列又は配列番号13で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(d2)配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(d3)配列番号15で示されるアミノ酸配列又は配列番号15で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(e1)~(e3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(e1)配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(e2)配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(e3)配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、請求項3に記載の抗体。 - 以下の(f1)~(f3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(f1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(f2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(f3)配列番号18で示されるアミノ酸配列又は配列番号18で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(g1)~(g3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(g1)配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(g2)配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(g3)配列番号26で示されるアミノ酸配列又は配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、請求項3に記載の抗体。 - 以下の(h1)~(h3)で示されるCDR1~3を含む軽鎖可変領域と:
(h1)配列番号16で示されるアミノ酸配列又は配列番号16で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(h2)配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(h3)配列番号19で示されるアミノ酸配列又は配列番号19で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
以下の(i1)~(i3)で示されるCDR1~3を含む重鎖可変領域と:
(i1)配列番号27で示されるアミノ酸配列又は配列番号27で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR1;
(i2)配列番号28で示されるアミノ酸配列又は配列番号28で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR2;及び
(i3)配列番号29で示されるアミノ酸配列又は配列番号29で示されるアミノ酸配列のうち、1個若しくは2個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるCDR3;
を備える、請求項3に記載の抗体。 - 試料と、請求項1~14のいずれか1項に記載の抗体とを接触させる工程を含む、試料中のコリバクチンを産生する大腸菌を検出する方法。
- 前記試料が、対象から取り出した試料である、請求項15に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項16に記載の方法。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載の抗体を含む、組成物。
- コリバクチンを産生する大腸菌の検出するための、請求項18に記載の組成物。
- 医薬組成物である、請求項18に記載の組成物。
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