KR101742928B1 - 인터루킨-31 단클론성 항체 - Google Patents

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Abstract

개 인터루킨-31(IL-31) 또는 고양이 IL-31 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 상기 항체는 개 또는 고양이에서 소양성 및/또는 알레르기성 질환을 치료하는데 유용한 진단 및/또는 수의학적 조성물의 형태일 수 있다.

Description

인터루킨-31 단클론성 항체{INTERLEUKIN-31 MONOCLONAL ANTIBODY}
본 발명은 재조합 단클론성 항체 분야, 및 진단 절차를 포함하여 임상 및 과학적 절차에서 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개 또는 고양이에서 소양성 질환 또는 알레르기성 질환을 치료하는데 유용한 수의학적 조성물 형태의 단리된 항-IL-31 항체를 제공한다.
아토피성 피부염은 미국 수의학 피부과학회(American College of Veterinary Dermatology) 특별전문위원회에 의해 "특유의 임상적 특징을 갖는, 유전적 소인을 갖는 염증 및 소양성 알레르기성 피부 질환"으로 정의되었다[Olivry, et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 81:143-146 (2001)]. 상기 특별전문위원회는 또한 개에서 상기 질환이 알레르겐-특이적 IgE와 연관된 것으로 인식하였다[Olivry, et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 81:143-146 (2001); Marsella & Olivry, Clinics in Dermatology, 21:122-133 (2003)]. 2차성 탈모증 및 홍반과 함께 중증의 소양증이 애완동물 주인에게 가장 두드러지고 걱정되는 증상이다.
아토피성 피부염의 유병률은 빈약하고 일관되지 않는 역학적 데이터로 인해 정확하게 알려지진 않았지만, 전체 개 개체군의 10%인 것으로 추정된다[Marsella & Olivry, Clinics in Dermatology, 21:122-133 (2003); Scott, et al., Canadian Veterinary Journal, 43:601-603 (2002); Hiller, Veterinary Immunology and Immunopathology, 81:147-151 (2001)]. 세계적으로, 약 450만 마리의 개가 상기 만성적이고 평생 계속되는 질환에 걸린다. 발병률은 증가하고 있는 것으로 보인다. 품종 및 성별에 따른 호발성(predilection)이 의심되었지만, 지리학적 지역에 따라 크게 달라질 수 있다[Hiller, Veterinary Immunology and Immunopathology, 81:147-151 (2001); Picco et al., Vet Dermatol. 19:150-155 (2008)].
알레르기성 피부염에 수반되는 잠재적 요인들은 수많으며 잘 알려지지 않았다. 식품 중의 성분들이 아토피성 피부염을 유발할 수 있을 뿐 아니라[Picco et al., Vet Dermatol. 19:150-155 (2008)], 벼룩, 집먼지 진드기, 두드러기쑥(ragweed), 식물 추출물 등과 같은 환경적 알레르겐들도 아토피성 피부염을 유발할 수 있다. 유전적 요인들도 또한 중요한 역할을 한다. 품종에 따른 호발성이 확인되지는 않았지만, 일부 유전 방식이 아토피성 피부염에 대한 소인을 증가시키는 것으로 생각된다[Sousa & Marsella Veterinary Immunology and Immunopathology, 81: 153-157 (2001); Schwartzman, et al., Clin. Exp. Immunol. 9:549-569 (1971)].
인터루킨-31(IL-31)은 2004 년에 클로닝된 사이토카인이다. 이것은 주로 활성화 T 헬퍼(Th) 2 세포에 의해 생성되지만[Dillon et al., Nat Immunol, 5:752-760 (2004)], 비만 세포 및 대식세포에서도 생성된다. IL-31은 IL-31 수용체 A(IL-31RA) 및 온코스타틴(oncostatin) M 수용체(OSMR)로 이루어진 보조수용체(co-recptor)에 결합한다[Dillon et al., Nat Immunol, 5:752-760 (2004); and Bilsborough et al., J Allergy Clin Immunol. 117(2):418-425 (2006)]. 수용체 활성화는 JAK 수용체(들)를 통한 STAT의 포스포릴화를 야기한다. 상기 보조수용체의 발현은 대식세포, 각질세포 및 배근 신경절에서 나타났다. 최근에, IL-31이 피부염, 소양성 피부 병변, 알레르기 및 기도 과민성에 관여되는 것으로 밝혀졌다(도 1 참조).
항-CD3 및 항-CD28 항체로 T 세포를 자극하면 즉시 IL-31 mRNA 발현이 상향조절된다[Dillon et al., Nat Immunol, 5:752-760 (2004)]. 마이크로어레이(microarray) 분석에 의해 IL-31이 특정 주화성(chemotactic) 유전자, 예를 들면, CXCL1, CLL17(흉선 및 활성화-조절 케모카인[TARC]), CCL19(대식세포 염증 단백질[MIP] 3β), CCL22(단핵구-유도성 케모카인[MDC]), CCL23(MIP3) 및 CCL4(MIPβ)를 유도하는 것으로 밝혀졌다[Dillon et al., Nat Immunol, 5:752-760 (2004)].
IL-31을 과발현하는 유전자전이 마우스는 피부 염증, 소양증, 중증 피부염 및 탈모를 나타낸다[Dillon et al., Nat Immunol, 5:752-760 (2004)]. 마우스에 IL-31의 피하 주사는 염증 세포, 호중구, 호산구, 림프구 및 대식세포에 의한 침윤을 유발하며, 표피층 두께증가 및 피부 극세포증을 야기한다. 자연적 원인으로 인한 아토피성 피부염(AD)을 갖는 NC/Nga 마우스에서, IL-31은 피부 병변에서 과발현되고 소양증과 상관된다[Takaoka et al., Eur J. Pharmacol. 516: 180-181 (2005); Takaoka et al., Exp. Dermatol. 15:161-167 (2006)]. 또한, 뮤린 모델에서, IL-31은 신속 발현되는 소양증을 유도하는 것으로 밝혀졌다[Raap et al., J Allergy Clin Immunol. 122(2):421-423 (2008)].
또 다른 연구는 IL-31이 인간에서 아토피성 피부염-유도성 피부 염증 및 소양증과 연관됨을 나타내었다. 인간 AD 환자에서, IL-31 mRNA의 발현은 비-병변성 피부보다 피부 병변에서 훨씬 더 높으며, 비-병변성 피부에서의 발현은 건강한 환자의 정상 피부에서보다 더 크다[Sonkoly et al., J Allergy Clin Immunol, 117:411-417 (2006)]. 또 다른 연구는 AD 환자의 피부에서 CD45RO+ (기억) 피부 림프구 항원(CLA)-양성 T 세포가 IL-31 mRNA 및 단백질을 발현한다고 보고하였다[Bilsborough et al., J Allergy Clin Immunol. 117(2):418-425 (2006)]. 또한, 환자의 피부 또는 알레르기성 접촉 피부염에서 IL-31 mRNA 과발현은 IL-4 및 IL-13 mRNA 발현과 상관되지만, 인터페론(IFN)-γ mRNA 발현과는 상관되지 않는 것으로 보고되었다[Neis et al., J. Allergy Clin. Immunol. 118:930-937 (2006)]. 또한, IL-31 혈청 수준은 만성 자발성 두드러기를 갖는 인간 환자에서 상승되며 AD를 갖는 환자에서 훨씬 더 그러한 것으로 나타났다[Raap et al., Exp Dermatol. 19(5):464-466 (2010)]. 또한, AD의 중증도와 혈청 IL-31 수준과의 상관성이 인간에서 관찰되었다[Raap et al., J Allergy Clin Immunol. 122(2):421-423 (2008)]. IL-31 분비는 또한 IgE-가교결합후 비만 세포에서 및 아토피를 갖는 개인에서 스태필로코커스(Staphylococcus) 초항원(superantigen)에 대한 반응으로서 증대되는 것으로 나타났다. 또한, IL-31은 IL-6, IL-8, CXCL1, CC17, 및 인간 결장 근섬유아세포내 여러 메탈로프로테이나제를 포함하여 여러 전-염증성 매개인자의 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌다[Yagi, et al., International Journal of Molecular Medicine, 19(6):941-946 (2007)].
환경적 알레르겐에 대한 타입 I 과민성은 개 AD의 주 메카니즘인 것으로 간주되며, IL-4와 같은 Th2-매개 사이토카인의 수준은 AD를 갖는 개의 피부 병변에서 증가된다[Nuttall, et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 87:379-384 (2002)]. 또한, 염증 세포, 림프구 및 호중구에 의한 침윤은 피부 병변 악화의 근간을 이루는 중요한 메카니즘이며; CCL17/TARC, CCR4 및 CCL28/점막-관련 상피 케모카인(MEC)과 같은 주화성 유전자들의 과발현은 AD를 갖는 개에서 피부 병변의 악화에 원인이 된다(문헌 [Maeda, et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 103:83-92 (2005); Maeda, et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 90:145-154 (2002b); and Maeda, et al., J. Vet. Med. Sci. 70:51-55 (2008)] 참조).
최근의 증거는 IL-31이 알레르기성 염증 및 알레르기성 천식의 기도 상피 반응 특성을 촉진하는데 관여될 수 있음을 시사하였다[Chattopadhyay, et al., J Biol Chem, 282:3014-3026 (2007); and Wai, et al., Immunology, 122:532-541 (2007)].
상기 관찰결과들은 IL-31이 소양성 및 알레르기성 질환 둘 다에서 중요한 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다. 개 또는 고양이에서 소양성 질환 및/또는 알레르기성 질환을 치료하는데 유용한 IL-31에 대한 치료용 항체를 제공하는 것이 바람직하다.
개 또는 고양이에서 소양성 질환 및/또는 알레르기성 질환을 치료하는데 유용한 IL-31에 대한 치료용 항체를 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 개 IL-31 또는 고양이 IL-31 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 태양에서, 상기 항체는 단클론성 항체이다. 한 태양에서, 상기 단클론성 항체는 키메라성이다. 또 다른 태양에서, 상기 항체는 개화되거나 또는 고양이화된다.
일부 태양에서, 항체는 개 또는 고양이에서 IL-31 활성을 감소시키거나, 억제하거나 또는 중화시킨다. 바람직한 태양에서, 항체는 소양성 질환 또는 알레르기성 질환을 감소시키거나, 억제하거나 또는 중화시킨다. 소양성 질환으로는, 예를 들면, 아토피성 피부염, 습진, 건선, 피부경화증 및 소양증이 포함된다. 알레르기성 질환으로는, 예를 들면, 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 식노(heaves), 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 자가면역으로부터 비롯된 염증 과정, 예를 들어, 과민성 대장 증후군(IBS)이 포함된다. 한 태양에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
아미노산 서열 YYDIN(서열번호 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS(서열번호 2; 19D07-VH-CDR1), 또는 NYGMS(서열번호 3; 34D03-VH-CDR1)를 갖는 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역(CDR, complementary determining region)1;
아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG(서열번호 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(서열번호 5; 19D07-VH-CDR2), 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG(서열번호 6; 34D03-VH-CDR2)를 갖는 가변 중쇄 CDR2;
아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY(서열번호 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY(서열번호 8; 19D07-VH-CDR3), 또는 VRGYGYDTMDY(서열번호 9; 34D03-VH-CDR3)를 갖는 가변 중쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하기 군의 하나 이상을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
아미노산 서열 RASESVDNYGISFMH(서열번호 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA(서열번호 11; 19D07-VL-CDR1), 또는 KASQSVSFAGTGLMH(서열번호 12; 34D03-VL-CDR1)를 갖는 가변 경쇄(VL) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 RASNLES(서열번호 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES(서열번호 14; 19D07-VL-CDR2), 또는 RASNLEA(서열번호 15; 34D03-VL-CDR2)를 갖는 가변 경쇄 CDR2;
아미노산 서열 QQSNKDPLT(서열번호 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT(서열번호 17; 19D07-VL-CDR3), 또는 QQSREYPWT(서열번호 18; 34D03-VL-CDR3)를 갖는 가변 경쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
다른 태양에서, 전술한 가변 경쇄 CDR 중 하나 이상을 갖는 항체는 또한 하기 가변 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
아미노산 서열 YYDIN(서열번호 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS(서열번호 2; 19D07-VH-CDR1), 또는 NYGMS(서열번호 3; 34D03-VH-CDR1)를 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG(서열번호 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(서열번호 5; 19D07-VH-CDR2), 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG(서열번호 6; 34D03-VH-CDR2)를 갖는 가변 중쇄 CDR2;
아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY(서열번호 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY(서열번호 8; 19D07-VH-CDR3), 또는 VRGYGYDTMDY(서열번호 9; 34D03-VH-CDR3)를 갖는 가변 중쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
일부 태양에서, 상기 항체는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a) 다음을 포함하는 가변 경쇄:
Figure 112016017353426-pat00001
b) 다음을 포함하는 가변 중쇄:
Figure 112016017353426-pat00002
및
c) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
한 태양에서, 본 발명은 서열번호 32의 개 IL-31 아미노산 서열의 아미노산 잔기 95 내지 125 사이의 영역, 또는 고양이 IL-31의 상응하는 영역에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공한다. 일부 태양에서, 상기 항체는 서열번호 32의 개 IL-31 아미노산 서열의 아미노산 잔기 102 내지 122 사이의 영역 또는 고양이 IL-31의 상응하는 영역에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 치료 효과량의 하나 이상의 전술한 항체를 포함하는 수의학적 조성물을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 전술한 항체를 생성하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
아미노산 서열 YYDIN(서열번호 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS(서열번호 2; 19D07-VH-CDR1), 또는 NYGMS(서열번호 3; 34D03-VH-CDR1)를 갖는 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG(서열번호 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(서열번호 5; 19D07-VH-CDR2), 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG(서열번호 6; 34D03-VH-CDR2)를 갖는 가변 중쇄 CDR2;
아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY(서열번호 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY(서열번호 8; 19D07-VH-CDR3), 또는 VRGYGYDTMDY(서열번호 9; 34D03-VH-CDR3)를 갖는 가변 중쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
다른 태양에서, 전술한 단리된 핵산은 다음 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다:
아미노산 서열 RASESVDNYGISFMH(서열번호 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA(서열번호 11; 19D07-VL-CDR1), 또는 KASQSVSFAGTGLMH(서열번호 12; 34D03-VL-CDR1)를 갖는 가변 경쇄(VL) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 RASNLES(서열번호 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES(서열번호 14; 19D07-VL-CDR2), 또는 RASNLEA(서열번호 15; 34D03-VL-CDR2)를 갖는 가변 경쇄 CDR2;
아미노산 서열 QQSNKDPLT(서열번호 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT(서열번호 17; 19D07-VL-CDR3), 또는 QQSREYPWT(서열번호 18; 34D03-VL-CDR3)를 갖는 가변 경쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
본 발명은 또한 하나 이상의 전술한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 전술한 숙주 세포를 항체의 생성을 야기하는 조건하에서 배양하고, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다. 치료 효과량의 전술한 항체를 투여하는 것을 포함하는, 소양성 질환 또는 알레르기성 질환으로부터 선택된 질환 또는 질병을 치료하는 방법도 또한 제공된다. 일부 태양에서, 소양성 질환은 아토피성 피부염, 습진, 건선, 피부경화증 및 소양증으로부터 선택된다. 다른 태양에서, 치료될 알레르기성 질환은 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 식노, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 자가면역으로부터 비롯된 염증 과정, 예를 들어, 과민성 대장 증후군(IBS)으로부터 선택된다.
전술한 항체를 투여함으로써 개 또는 고양이에서 IL-31 활성을 억제하는 방법이 또한 제공된다.
또한, IL-31을 함유하는 임상적 또는 생물학적 샘플을 전술한 항체의 존재하에서 배양하고; 샘플중 IL-31에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 IL-31을 검출 또는 정량하는 방법이 제공된다. 한 태양에서, 항체는 검출가능하게 표지화된다. 또 다른 태양에서, 항체는 비표지되며, 표지된 제 2 항체와 함께 사용된다.
본 발명은 개 또는 고양이에서 소양성 질환 또는 알레르기성 질환을 치료하는데 유용한 수의학적 조성물 형태의 항-IL-31를 제공한다.
도 1은 IL-31 경로를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 항원 결합 부위를 강조한 마우스 면역글로불린 G(IgG)의 일반적 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 마우스:개 키메라 IgG의 일반적 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 마우스 CDR이 서열 데이터베이스로부터 확인된 개의 프레임워크 상에 그라프트된 마우스 IgG의 종분화(speciation) 또는 "개화(caninization)"를 나타낸 도해이다.
도 5는 키메라 경쇄를 완전히 개화된 중쇄와 짝을 이룬 "헤테로키메라" 단클론성 항체의 도해이다.
도 6은 사전-출혈시킨 양성 대조군 마우스에 대한 IL-31 면역화 마우스(CF-1 MU#1 - 4)로부터의 ELISA 역가이다.
도 7은 불변 영역에 대한 프라이머 및 마우스 가변 영역에서 유도된 축퇴(degenerate) 프라이머를 나타내고 있는 항체 가변 쇄들의 도해이다.
도 8은 위약 대조군, 단일 용량 SC 연구(76A60)에서 키메라 11E12의 파일럿 효능(pilot efficacy)의 그래프이다.
도 9는 연구 76A60에 등록된 개들로부터 얻은 개개의 소양성 점수를 나타낸 표이다.
도 10은 개 IL-31에 대한 11E12의 키메라(블롯 #1), 개화(블롯#2) 및 헤테로키메라(블롯 #3 및 #4) 버전의 결합을 나타낸 웨스턴 블롯(Western blot) 결과이다. 블롯 #3의 헤테로키메라는 키메라 중쇄와 짝을 이룬 개화된 경쇄를 갖는다. 블롯 #4의 헤테로키메라는 개화된 중쇄와 짝을 이룬 키메라 경쇄를 갖는다. 각각의 니트로셀룰로스 블롯은 좌측 레인: 미리-염색된 표준 단백질(씨블루 플러스 2(Seeblue plus 2), 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 우측 레인: 800 ng의 개 IL-31을 함유한다.
도 11은 개화된 11E12 경쇄 프레임워크 치환 작업의 개관을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 12는 마우스 프레임워크 2 경쇄 잔기들에 대한 단일 역돌연변이(backmutation)와 11E12의 개화된 버전의 결합을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다. 각각의 니트로셀룰로스 블롯은 좌측 레인: 미리-염색된 표준 단백질(씨블루 플러스 2, 인비트로겐 코포레이션) 및 우측 레인: 800 ng의 개 IL-31을 함유한다.
도 13은 전장(full length) 및 절두된 개 IL-31 단백질의 웨스턴 블롯 결과이다. 개개의 니트로셀룰로스 블롯들은 A) 항-His, B) 34D03 및 C) 11E12 항체로 침지하였다. 블롯들의 레인 1 내지 9는 다음에 상응한다: 레인 1 - 미리염색된 표준 단백질(씨블루 플러스 2, 인비트로겐 코포레이션); 레인 2 - 전장 개 IL-31; 레인 3 - N-말단 절두화 -20N; 레인 4 - N-말단 절두화 -40N; 레인 5 - N-말단 절두화 -60N; 레인 6 - C-말단 절두화 -20C; 레인 7 - C-말단 절두화 -40C; 레인 8 - C-말단 절두화 -60C; 및 레인 9 - 베타-갈락토시다제(lacZ). 주석: 전장 IL-31 및 C-말단 절두화를 갖는 단백질(-20C, -40C 및 -60C)은 상기 조건하에서 검출가능한 발현을 나타내지 않았다.
도 14는 절두된 개 IL-31 단백질의 웨스턴 블롯 결과이다. 개개의 니트로셀룰로스 블롯들은 A) 항-His, B) 11E12 및 C) 34D03 항체로 침지하였다. 블롯들의 레인 1 내지 5는 다음에 상응한다: 레인 1 - 미리염색된 표준 단백질(씨블루 플러스 2, 인비트로겐 코포레이션); 레인 2 - 위치 20 내지 122에서 C-말단 절두화; 레인 3 - 위치 20 내지 100에서 C-말단 절두화; 레인 4 - 위치 20 내지 80에서 C-말단 절두화; 및 레인 5 - 베타-갈락토시다제(lacZ).
도 15는 각각의 아미노산 위치(76 내지 122)에 치환된 알라닌을 갖는 개 IL-31을 발현하는 이. 콜라이(E. coli) 균주 용해물의 웨스턴 블롯의 분획이다. 개개의 니트로셀룰로스 블롯들은, 도면에 나타낸 바와 같이, 항-His, 11E12 및 34D03 항체로 침지하였다.
도 16은 개 IL-31에서 이중 및 삼중 돌연변이의 웨스턴 블롯의 분획이다. -20N 단백질 용해물을 양성 대조군으로서 실행하였다.
도 17은 개화된 34D03 항체(1.0 mg/kg)를 피하 주사한 개에 대한 소양성 점수를 나타낸 그래프이다. 소양성 점수는 1.5 ㎍/kg 개 IL-31에 의한 자극(challenge) 전(기준선 반응) 및 후(2 시간 반응)에 각각의 연구일에 측정하였다.
도 18은 정제된 개 및 고양이 IL-31 단백질을 사용한 4 내지 12% 비스 트리스(Bis Tris) SDS PAGE의 결과이다. 패널 A는 환원 조건하에서 실행된 단백질의 쿠마시(Coomassie) 염색 결과를 나타낸 것이다. 패널 B는 비-환원 조건하에 실행된 단백질의 쿠마시 염색 결과를 나타낸 것이다. 패널 C 및 D는 항-His 항체로 침지된, A 및 B 각각과 동일한 겔의 웨스턴 블롯 결과이다. 레인 1 - 개 IL-31; 레인 2 - 고양이 IL-31; 레인 3 - 미리염색된 표준 단백질(씨블루 플러스 2, 인비트로겐 코포레이션); 레인 4 - 개 IL-31; 및 레인 5 - 고양이 IL-31.
도 19는 이. 콜라이에서 생성된 개 및 고양이 IL-31에 의해 유도된 개 DH-82 단핵구에서 pSTAT 신호전달의 그래프이다. 개 IL-31(CHO)은 모든 종래 세포-기초 분석법들, 개 소양증 모델에, 및 항체의 초기 확인을 위한 면역원으로서 사용되는 기준 단백질이다.
도 20은 11E12 및 34D03 항체(플러스 기호로 주석 붙여짐)의 결합에 수반된 단백질 영역에서 고양이 및 개 IL-31 사이의 서열 보존을 보여주는 배열이다.
도 21은 IL-31 단백질의 웨스턴 블롯 결과이다. 개개의 니트로셀룰로스 블롯들은 A) 항-His, B) 11E12 및 C) 34D03 항체로 침지하였다. 주석 - 개 IL-31(CHO)은 6-His 태그를 함유하지 않는다.
도 22는 고양이화 및 개화 항체 34D03을 비교한, 개 DH82 단핵구에서 개 IL-31 유도된 pSTAT 신호전달의 억제를 나타낸 그래프이다.
도 23은 고양이화 항체 34D03으로 침지한, 환원 조건하에서의 고양이 및 개 IL-31의 웨스턴 블롯 결과이다.
서열에 대한 설명
서열번호 1은 본원에서 11E12-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이다;
서열번호 2는 본원에서 19D07-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이다;
서열번호 3은 본원에서 34D03-VH-CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1이다;
서열번호 4는 본원에서 11E12-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이다;
서열번호 5는 본원에서 19D07-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이다;
서열번호 6은 본원에서 34D03-VH-CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2이다;
서열번호 7은 본원에서 11E12-VHCDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이다;
서열번호 8은 본원에서 19D07-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이다;
서열번호 9는 본원에서 34D03-VH-CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3이다;
서열번호 10은 본원에서 11E12-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이다;
서열번호 11은 본원에서 19D07-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이다;
서열번호 12는 본원에서 34D03-VL-CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1이다;
서열번호 13은 본원에서 11E12-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이다;
서열번호 14는 본원에서 19D07-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이다;
서열번호 15는 본원에서 34D03-VL-CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2이다;
서열번호 16은 본원에서 11E12-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이다;
서열번호 17은 본원에서 19D07-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이다;
서열번호 18은 본원에서 34D03-VL-CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3이다;
서열번호 19는 본원에서 MU-11E12-VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 20은 본원에서 CAN-11E12-VL-cUn-FW2로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 21은 본원에서 CAN-11E12-VL-cUn-13으로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 22는 본원에서 MU-19D07-VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 23은 본원에서 CAN-19D07-VL-998-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 24는 본원에서 MU-34D03-VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 25는 본원에서 CAN-34D03-VL-998-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 26은 본원에서 MU-11E12-VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 27은 본원에서 CAN-11E12-VH-415-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 28은 본원에서 MU-19D07-VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 29는 본원에서 CAN-19D07-VH-400-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 30은 본원에서 MU-34D03-VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 31은 본원에서 CNA-34D03-VH-568-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 32는 진뱅크(GenBank) 수탁번호 C7G0W1에 상응하는 아미노산 서열이며, 개 IL-31 전장 단백질에 상응한다;
서열번호 33은 진뱅크 수탁번호 C7G0W1에 상응하는 뉴클레오티드 서열이며, 개 IL-31 전장 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상응한다;
서열번호 34는 본원에서 MU-11E12-VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 35는 본원에서 MU-11E12-VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 36은 본원에서 MU-19D07-VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 37은 본원에서 MU-19D07-VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 38은 본원에서 MU-34D03-VL로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 39는 본원에서 MU-34D03-VH로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 40은 본원에서 HC-64(진뱅크 수탁번호 AF354264)로 지칭되는 개의 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다;
서열번호 41은 본원에서 HC-64(진뱅크 수탁번호 AF354264)로 지칭되는 개의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 42는 본원에서 HC-65(진뱅크 수탁번호 AF354265)로 지칭되는 개의 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다;
서열번호 43은 본원에서 HC-65(진뱅크 수탁번호 AF354265)로 지칭되는 개의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 44는 본원에서 카파(진뱅크 수탁번호 XP_532962)로 지칭되는 개의 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다;
서열번호 45는 본원에서 카파(진뱅크 수탁번호 XP_532962)로 지칭되는 개의 경쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 46은 본원에서 CAN-19D07-VL-998-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 47은 본원에서 CAN-19D07-VH-998-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 48은 본원에서 CAN-34D03-VL-998-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 49는 본원에서 CAN-34D03-VH-568-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 50은 본원에서 CAN-11E12-VL-cUn-FW2로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 51은 본원에서 CAN-11E12-VH-415-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 52는 본원에서 CAN-11E12-VL-cUn-13으로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 53은 본원에서 CNA-11E12-VL-cUn-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 54는 본원에서 CNA-11E12-VL-cUn-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 55는 본원에서 이. 콜라이 발현에 사용된 개의 IL-31 전장 구조물의 아미노산 서열에 상응한다;
서열번호 56은 본원에서 이. 콜라이 발현에 사용된 개의 IL-31 전장 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 57은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 -20N 구조물의 아미노산 서열이다;
서열번호 58은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 -20N 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 59는 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 -40N 구조물의 아미노산 서열이다;
서열번호 60은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 -40N 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 61은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 -60N 구조물의 아미노산 서열이다;
서열번호 62는 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 -60N 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 63은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 20-122 구조물의 아미노산 서열이다;
서열번호 64는 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 20-122 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 65는 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 20-100 구조물의 아미노산 서열이다;
서열번호 66은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 20-100 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 67은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 20-80 구조물의 아미노산 서열이다;
서열번호 68은 이. 콜라이 발현을 위한 개의 IL-31 20-80 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 69는 이. 콜라이 발현을 위한 고양이 IL-31 전장 구조물에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 70은 이. 콜라이 발현을 위한 고양이 IL-31 전장 구조물에 상응하는 아미노산 서열이다;
서열번호 71은 본원에서 FEL-34D03-VL-021-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열이다;
서열번호 72는 본원에서 FEL-34D03-VL-021-1로 지칭되는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 73은 본원에서 FEL-34D03-VH-035-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열이다;
서열번호 74는 본원에서 FEL-34D03-VH-035-1로 지칭되는 가변 중쇄 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 75는 본원에서 HC-A 필라인(진뱅크 수탁번호 AB016710.1)으로 지칭되는 고양이 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다;
서열번호 76은 본원에서 HC-A 필라인(진뱅크 수탁번호 AB016710.1)으로 지칭되는 고양이 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다;
서열번호 77은 본원에서 LC-카파 필라인(진뱅크 수탁번호 AF198257.1)으로 지칭되는 고양이 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열이다;
서열번호 78은 본원에서 LC-카파 필라인(진뱅크 수탁번호 AF198257.1)으로 지칭되는 고양이 경쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
정의
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명에서 사용된 여러 용어들을 정의한다. 이 용어들 이외에, 명세서의 다른 곳에서 다른 용어들도 필요에 따라 정의된다. 본원에서 달리 명백히 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 당해분야의 용어들은 그의 당해분야에 공지된 의미를 갖는다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥에서 달리 명백히 나타나지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들면, "항체(an antibody)"에 대한 언급은 다수의 상기 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이, 다른 것들을 배제하지 않고, 인용된 요소들을 포함하는 것을 의미하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 에피토프는 항체의 CDR에 의해 인식되는 항원 결정기(antigenic determinant)를 말한다. 즉, 에피토프는 항체에 의해 인식되고 항체에 의해 결합될 수 있는 임의 분자의 부분을 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항-IL-31 물질이 반응하는 IL-31의 영역을 말한다.
"항원"은 항체에 의해 추가로 인식되고 결합될 수 있는, 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이다(상응하는 항체 결합 영역은 파라토프(paratope)로 지칭될 수 있다). 일반적으로, 에피토프는 분자들, 예를 들면, 아미노산 또는 당 측쇄들의 화학적 활성 표면 기들로 이루어지며, 특정한 3차원 구조 특성 및 특정한 전하 특성을 갖는다.
항체 결합의 맥락에서, 용어 "특이적으로"는 특정 항원, 즉, 폴리펩티드 또는 에피토프에 대한 항체의 고결합활성 및/또는 고친화성 결합을 말한다. 많은 태양에서, 상기 특정 항원은 그로부터 항체-생성 세포가 단리된 동물 숙주를 면역화시키기 위해 사용되는 항원(또는 항원의 단편 또는 소분획(subfraction))이다. 항원과 특이적으로 결합하는 항체는 다른 항원에 대한 동일한 항체의 결합보다 강하다. 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 폴리펩티드와는 약하지만 검출가능한 수준(예를 들면, 해당 폴리펩티드에 대해 나타낸 결합의 10% 이하)으로 결합할 수 있다. 상기 약한 결합 또는 백그라운드 결합은, 예를 들면, 적절한 대조군을 사용하여, 대상 폴리펩티드에 대한 특이적 항체 결합과 쉽게 구별가능하다. 일반적으로, 특이적 항체는 10-7 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 이하(예를 들면, 10-9 M 이하, 10-10 이하, 10-11 이하, 10-12 이하, 또는 10-13 이하 등)의 KD를 갖는 결합 친화도하에 항원에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 무손상(intact) 면역글로불린을 말한다. 따라서, 단일 단리된 항체 또는 단편은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 헤테로키메라(heterochimeric) 항체, 개화(caninized) 항체 또는 고양이화(felinized) 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 바람직하게는 단클론성 항체 및 그의 단편, 및 IL-31 단백질 및 그의 단편에 결합할 수 있는 그의 면역학적 결합 등가물을 말한다. 상기 용어 항체는 동종 분자, 또는 다수의 상이한 분자 물질로 이루어진 혈청 생성물과 같은 혼합물 둘 다를 언급하기 위해 사용된다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 통상적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머(heterotetrameric) 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유성 다이설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 다이설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입(isotype)의 중쇄 중에서 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄간(interchain) 다이설파이드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VL) 및 그의 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 생각된다. 도 2는 항원 결합 부위를 강조한 천연 마우스 면역글로불린 G(IgG)의 일반적 구조의 한 예이다.
용어 "항체 단편"은, 제한하지 않고, 단리된 단일 항체 쇄, Fv 구조물, Fab 구조물, Fc 구조물, 경쇄 가변 또는 상보성 결정 영역(CDR) 서열 등을 포함하여, 온전하지 않은 항체 구조를 말한다.
용어 "가변" 영역은 프레임워크 및 CDR(달리 초가변 영역으로도 알려져 있다)을 포함하며, 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들중에서 서열에 있어 광범위하게 상이하면서 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 것을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역으로 불리는 3개의 분절에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분들은 프레임워크 영역(FR, framework region)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 각각, α-시트 구조를 연결하고 일부 경우에서 상기 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역들에 의해 연결된 β-시트 형태를 주로 취하는 다수의 FR을 포함한다. 각 쇄에서의 초가변 영역들은 FR에 의해 매우 근접하여 결합되며, 다른 쇄로부터의 초가변 영역들과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., pages 647-669 (1991)] 참조). 불변 영역은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 관여되지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에 항체의 관여와 같은 다양한 작동인자(effector) 기능을 나타낸다.
용어 "초가변 영역"은 본원에서 사용될 때, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., pages 647-669 (1991)]로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]로부터의 상기 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기가 아닌 다양한 도메인 잔기들이다.
항체의 파파인 절단은, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 그 명칭이 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 또한 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 제공한다.
"Fv"는 완전 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 치밀한 비-공유 결합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역들이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 결정하는 것은 상기 형태로 이루어진다. 전체적으로, 6개의 초가변 영역들이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 제공한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역들만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서이지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제 1 불변 영역(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 일부 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 호칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 명백히 다른 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
그 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 현재, 면역글로불린의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 하위부류(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2(마우스 및 인간 호칭에서 정의된 바와 같이)로 더 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위(subunit) 구조 및 3차원 형태는 여러 종들에서 공지되어 있다. 상기 불변 도메인들과 관련된 우세한 개별적 이소타입들 및 기능 활성들은 종-특이적이며, 실험적으로 정의되어야 한다.
본원에서 정의된 바와 같은 "단클론성 항체"는 세포의 단일 클론(특히, 하이브리도마 세포의 단일 클론)에 의해 생성된 항체이며, 따라서 순수한 단일 동종 유형의 항체이다. 동일 클론으로부터 생성된 모든 단클론성 항체는 동일하며, 동일한 항원 특이성을 갖는다. 용어 "단클론성"은 세포들, 단일 세포, 및 상기 세포의 자손의 단일 클론에 관한 것이다.
본원에서 단클론성 항체는 특히, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도된 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성이지만 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유도된 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린), 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편들을 포함한다. 전형적으로, 키메라 항체는 그의 경쇄 및 중쇄 유전자들이 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 전형적으로 유전자 조작에 의해 제작된 항체이다. 예를 들면, 마우스 단클론성 항체로부터의 유전자들의 가변성 단편들은 개의 불변 단편들에 연결될 수 있다. 도 3은 마우스:개 IgG의 한 태양의 일반적 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 이 태양에서, 항원 결합 부위는 마우스로부터 유도되나, Fc 부분은 개로부터 유도된 것이다.
비-개(예를 들면, 뮤린) 항체의 "개화된(caninized)" 형태는 비-개 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 유전자 조작된 항체이다. 개화된 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 비-개 종(공여자 항체), 예를 들면, 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스로부터의 초가변 영역 잔기로 치환된 개 면역글로불린 서열(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 개 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-개 잔기로 치환된다. 또한, 개화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 개화된 항체는, 초가변 영역 전부 또는 실질적으로 전부가 비-개 면역글로불린 서열의 상기 영역에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 개 면역글로불린 서열의 상기 영역에 상응하는 하나 이상 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이다. 개화된 항체는 선택적으로, 완전한, 또는 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 개 면역글로불린 서열의 상기 영역을 또한 포함할 것이다. 도 4는 마우스 IgG의 종분화 또는 개화를 나타내는 한 태양을 예시한 것이다. 이 태양에서는, 마우스 CDR이 개의 프레임워크 상에 그라프트된다.
비-고양이(예를 들면, 뮤린) 항체의 "고양이화" 형태는 비-고양이 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 유전자 조작된 항체이다. 고양이화 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 비-고양이 종(공여자 항체), 예를 들면, 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스로부터의 초가변 영역 잔기로 치환된 고양이 면역글로불린 서열(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 고양이 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-고양이 잔기로 치환된다. 또한, 고양이화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 고양이화 항체는, 초가변 영역 전부 또는 실질적으로 전부가 비-고양이 면역글로불린 서열의 상기 영역에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 고양이 면역글로불린 서열의 상기 영역에 상응하는 하나 이상 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이다. 고양이화 항체는 선택적으로, 완전한, 또는 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 고양이 면역글로불린 서열의 상기 영역을 또한 포함할 것이다.
본원에서 정의된 바와 같은 용어 "헤테로키메라"는 항체 쇄들 중 하나(중쇄 또는 경쇄)가 개화된 반면 다른 하나는 키메라성인 항체를 말한다. 도 5는 헤테로키메라 분자의 항 태양을 도시한 것이다. 이 태양에서, 개화된 가변 중쇄(CDR이 모두 마우스 CDR이고 FR이 모두 개 FR인 경우)는 키메라 가변 경쇄(CDR이 모두 마우스 CDR이고 FR이 모두 마우스 CDR인 경우)와 쌍을 이룬다. 이 태양에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 둘 다 개의 불변 영역에 융합된다.
"변이체" 항-IL-31 항체는 본원에서, 모 항체 서열중 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 항-IL-31 항체 아미노산 서열로부터의 아미노산 서열이 상이하며 모 항-IL-31 항체의 하나 이상의 바람직한 활성을 보유하는 분자를 말한다. 바람직한 활성은 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 동물에서 IL-31 활성을 감소, 억제 또는 중화시키는 능력, 및 세포-기초 분석에서 IL-31-매개 pSTAT 신호전달을 억제하는 능력을 포함할 수 있다. 한 태양에서, 상기 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역(들)에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들면, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역에 하나 이상, 예를 들면, 약 1 내지 10개, 바람직하게는 약 2 내지 약 5개의 치환을 포함할 수 있다. 통상적으로, 변이체는 모 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 50% 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 상기 서열에 관하여 동일성 또는 상동성은, 본원에서, 필요한 경우 최대 서열 동일성%를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후에, 모 항체 잔기와 동일한 후보 서열중 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 항체 서열 내로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 간주되지 않는다. 변이체는 IL-31에 결합하는 능력을 보유하며, 바람직하게는 모 항체의 활성보다 우수한 바람직한 활성을 갖는다. 예를 들면, 변이체는 더 강한 결합 친화도, 동물에서 IL-31 활성을 감소, 억제 또는 중화시키는 증대된 능력, 및/또는 세포-기초 분석에서 IL-31-매개 pSTAT 신호전달을 억제하는 증대된 능력을 가질 수 있다.
"변이체" 핵산은 본원에서 "모" 핵산으로부터의 서열이 상이한 분자를 말한다. 폴리뉴클레오티드 서열 불일치(divergence)는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가와 같은 돌연변이성 변화로부터 비롯될 수 있다. 이러한 변화들은 각각 해당 서열에서 단독으로 또는 함께, 1회 이상 일어날 수 있다.
"모" 항체는 본원에서 변이체의 제조에 사용된 아미노산 서열에 의해 암호화되는 항체이다. 바람직하게, 모 항체는 개의 프레임워크 영역을 가지며, 존재하는 경우, 개의 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들면, 모 항체는 개화되거나 또는 개 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 모 항체는 고양이화되거나 또는 고양이 항체일 수 있다. 또 다른 예로서, 모 항체는 뮤린 단클론성 항체이다.
용어 "단리된"은 물질(예를 들면, 항체 또는 핵산)이 그의 천연 환경의 성분으로부터 단리되고/되거나 회수되는 것을 의미한다. 그의 천연 환경의 오염 성분들은 물질에 대한 진단 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질들을 포함할 수 있다. 핵산과 관련하여, 단리된 핵산은 통상적으로 염색체에서 결합되는 5'에서 3' 서열로부터 단리된 핵산을 포함할 수 있다. 바람직한 태양에서, 상기 물질은 물질의 95 중량% 이상, 가장 바람직학네는 99 중량% 이상까지 정제된다. 단리된 물질은, 물질의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포내에서 동일반응계내에 상기 물질을 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 물질은 하나 이상의 정제 단계에 의해 준비될 것이다.
"표지"란 용어는 본원에서 사용될 때, 항체 또는 핵산에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 자체로 단독으로 검출가능할 수 있거나(예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉진할 수 있다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, DNA 및 RNA 중의 일련의 뉴클레오티드 염기("뉴클레오티드"로도 불린다)를 말한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 그의 유사체를 함유할 수 있다. 용어 "핵산"은, 예를 들면, 단일 가닥 및 이중 가닥 분자를 포함한다. 핵산은, 예를 들면, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, DNA 분자(예, cDNA), RNA 분자(예, mRNA), 재조합 핵산, 플라스미드 및 기타 벡터, 프라이머 및 프로브일 수 있다. 5'에서 3'(센스) 및 3'에서 5'(안티센스) 폴리뉴클레오티드가 둘 다 포함된다.
"대상" 또는 "환자"는 본 발명의 분자에 의해 영향받을 수 있는 치료를 필요로 하는 동물을 말한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 동물로는 척추동물이 포함되며, 개, 고양이 및 말과 같은 포유동물이 특히 바람직한 예이다.
"치료 효과량"(또는 "효과량")은 대상 또는 환자에게 투여될 때 유리하거나 목적하는 결과를 수행하기에 충분한, 활성 성분, 예를 들면, 본 발명에 따른 약제의 양을 말한다. 효과량은 하나 이상의 투여량, 적용량 또는 복용량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 치료 효과량은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "치료 효과량"은 증상의 임상적 개선을 포함하여 소양성 질환 또는 알레르기성 질환의 치료와 관련된 하나 이상의 파라미터에서 객관적으로 측정되는 변화를 산출하는 양이다. 물론, 치료 효과량은 치료되는 특정 대상 및 질환, 대상의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 선택된 특정 화합물, 이어질 투약 요법, 투여 시기, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이것들 모두는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적"은 질환 또는 질병에 대한 전체 범위의 치료를 포함한다. 본 발명의 "치료"제는 위험한 것으로 확인될 수 있는 동물을 표적화하도록 설계된 절차를 포함하는 것을 포함하여 예방적 또는 방지적인 방식으로(약물유전학); 또는 현실적으로 개선적이거나 치유적인 방식으로 작용할 수 있거나; 또는 치료되는 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상의 진행 속도 또는 정도를 지연시키도록 작용할 수 있다.
"치료", "치료하는" 등은 치료적 치료 및 예방 또는 방지적 수단 둘 다를 말한다. 치료를 필요로 하는 동물은 이미 질병을 가진 동물 뿐 아니라 질병이 예방되어야 하는 동물을 포함한다. 질환 또는 질병의 "치료" 또는 "치료하는"이란 용어는 질환 또는 질병에 대해 예방 또는 보호(즉, 임상적 증상이 발생하지 않도록 하는)하고; 질환 또는 질병을 억제(즉, 임상적 증상의 진전을 막거나 억제)하고/하거나; 질환 또는 질병을 완화(즉, 임상적 증상의 퇴보를 야기)하는 것을 포함한다. 인지하는 바와 같이, 궁극적인 유도적 결과 또는 결과들은 알수 없거나 잠재적일 수 있기 때문에, 질환 또는 질병을 "예방"하는 것과 "억제"하는 것을 구별하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 따라서, 용어 "예방"은 "방지" 및 "억제"하는 것 둘 다를 포함하는 "치료"의 한 유형을 구성하는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "치료"는 "예방"을 포함한다.
용어 "알레르기성 질환"은 본원에서 면역계와 신체에 외부 물질 사이의 상호작용에 의해 야기된 질병 또는 질환으로 정의된다. 상기 외부 물질은 "알레르겐"으로 지칭된다. 보편적인 알레르겐으로는 공기알레르겐, 예를 들면, 꽃가루, 먼지, 곰팡이, 집먼지 진드기 단백질, 곤충 물림으로부터 주입된 침 등이 포함된다. 알레르기성 질환의 예로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 식노, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 자가면역으로부터 비롯된 염증 과정, 예를 들어, 과민성 대장 증후군(IBS).
용어 "소양성 질환"은 본원에서 완화를 위해 피부를 문지르거나 긁고싶은 충동을 야기하는 극심한 가려운 느낌을 특징으로 하는 질환 또는 질병으로 정의된다. 소양성 질환의 예로는 아토피성 피부염, 습진, 건선, 피부경화증 및 소양증이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어들은 모두 또한, 임의의 모든 후속 세대인 그의 자손을 포함한다. 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않는 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이종 핵산 서열을 발현하는 것과 관련하여, "숙주 세포"는 시험관내에 위치하든지 또는 생체내 위치하든지, 원핵 또는 진핵 세포(예를 들면, 세균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포 및 곤충 세포)를 말한다. 예를 들면, 숙주 세포는 유전자전이 동물 중에 위치할 수 있다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용체로 사용될 수 있으며, 벡터를 복제하고/하거나 벡터에 의해 암호화된 이종 핵산을 발현할 수 있는 임의의 형질전환가능한 유기체를 포함할 수 있다.
"조성물"은 불활성이거나(예를 들면, 표지) 또는 활성일 수 있는 활성 약제 및 또 다른 화합물 또는 조성물, 예를 들면, 보조제의 혼합물을 의미하는 것이다.
본원에서 정의된 바와 같이, 본 발명에 사용하기에 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 상기 담체로는, 제한하지 않고, 물, 식염수, 완충 식염수, 포스페이트 완충액, 알콜/수성 용액, 유화액 또는 현탁액이 포함된다. 다른 통상적으로 사용되는 희석제, 보조제 및 부형제를 통상적인 기술에 따라 첨가할 수 있다. 상기 담체는 에탄올, 폴리올, 및 그의 적합한 혼합물, 식물성유, 및 주사가능한 유기 에스터를 포함할 수 있다. 완충액 및 pH 조절제도 또한 사용될 수 있다. 완충액은 제한하지 않고, 유기산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적인 완충액으로는, 제한하지 않고, 유기산 염, 예를 들면, 시트르산의 염, 예를 들어, 시트레이트, 아스콜브산, 글루콘산, 히스티딘-HCl, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산, 트리스, 트라이메탄아민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액이 포함된다. 비경구용 담체는 염화나트륨 용액, 링거(Ringer)의 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 슈크로스, 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 오일 또는 고정유를 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 체액 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예를 들면, 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 보충제 등을 포함할 수 있다. 방부제, 및 예를 들면, 항균제, 산화방지제, 킬레이트화제(예, EDTA), 불활성 가스 등과 같은 기타 첨가제들도 또한 약학적 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 제한받지 않는다. 적절한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특성들을 갖는, 전술한 성분들로부터의 상기 약학적으로 허용되는 조성물은 당해 분야에 기술에 포함된다(예를 들면, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, publ. (2000); and The Handbook of Pharmaceutical Excipeints, 4. sup. th edit., eds. R.C. Rowe et al., APhA Publications (2003)]과 같은 교재를 참조하시오).
용어 "보존적 아미노산 치환"은 치환 잔기가 해당 잔기와 화학적으로 유사하여 폴리펩티드 기능(예를 들면, 효소 활성)에 실질적인 감소가 야기되지 않는, 해당 아미노산 잔기에 대한 임의의 아미노산 치환을 나타낸다. 보존적 아미노산 치환은 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있으며, 그 예는 미국 특허 제 6,790,639 호, 제 6,774,107 호, 제 6,194,167 호 또는 제 5,350,576 호에 기술되어 있다. 바람직한 태양에서, 보존적 아미노산 치환은 하기의 6개 군 중 하나 안에서 일어나는 임의의 치환이다:
1. 소형 지방족, 실질적으로 비-극성 잔기: Ala, Gly, Pro, Ser 및 Thr;
2. 대형 지방족, 비극성 잔기: Ile, Leu 및 Val; Met;
3. 극성의, 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp 및 Glu;
4. 극성의, 음으로 하전된 잔기의 아미드: Asn 및 Gln; His;
5. 극성의, 양으로 하전된 잔기: Arg 및 Lys; His; 및
6. 대형 방향족 잔기: Trp 및 Tyr; Phe.
바람직한 태양에서, 보존적 아미노산 치환은 천연 잔기(보존적 치환) 쌍으로 열거되는 다음 중 어느 하나이다: Ala(Ser); Arg(Lys); Asn(Gln; His); Asp(Glu); Gln(Asn); Glu(Asp); Gly(Pro); His(Asn; Gln); Ile(Leu; Val); Leu(Ile; Val); Lys(Arg; Gln; Glu); Met(Leu; Ile); Phe(Met; Leu; Tyr); Ser(Thr); Thr(Ser); Trp(Tyr); Tyr(Trp; Phe); 및 Val(Ile; Leu).
폴리펩티드가 보존적 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있듯이, 그의 폴리뉴클레오티드는 보존적 코돈 치환(들)을 함유할 수 있다. 코돈 치환은, 발현될 때 전술한 바와 같은 보존적 아미노산 치환을 야기하는 경우 보존적인 것으로 간주된다. 아미노산 치환을 야기하지 않는 축퇴 코돈 치환도 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 유용하다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 한 태양에서 유용한 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 그에 의해 형질전환될 발현 숙주 세포가 나타낸 코돈 활용 빈도에 근접하게 하기 위해, 또는 그의 발현을 개선하기 위해 축퇴 코돈 치환에 의해 돌연변이될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않으며, 따라서 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 특정 태양을 기술하기 위한 것일 뿐이며, 오직 특허청구범위에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 기술된 항체와 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 단수형 용어들은 복수를 포함하며, 복수형 용어들은 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법 및 그 기술들은 당해 분야에 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질감염(예를 들면, 전기천공, 리포펙션(lipofection))을 위한 표준 기술들을 사용한다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명서에 따라서 또는 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 상기 기술 및 절차들은 일반적으로 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라서 및 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 특정한 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행된다(예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience), (1993)] 참조). 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 그의 실험실 절차 및 기술은 당해 분야에서 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학적 제제, 제형 및 전달, 및 환자의 치료를 위한 표준 기술을 사용한다.
작업 실시예 이외에, 또는 달리 나타낸 경우에, 본 발명에 사용된 성분들 또는 반응 조건들의 분량을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해해야 한다.
확인된 모든 특허 및 기타 공개공보들은, 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 상기 공개공보들에 기술된 방법들을 설명하고 개시하기 위해 본원에 특별히 참고로 인용된다. 상기 공개공보들은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다.
본 발명은 재조합 단클론성 항체 및 펩티드, 및 진단 절차를 포함하여 임상 및 과학적 절차에서의 그의 용도를 제공한다. 분자 생물학 및 재조합 기술의 방법들의 출현으로, 재조합 수단에 의해 항체 및 항체-유사 분자를 생성하고 그에 의해 항체의 폴리펩티드 구조에서 발견되는 특정 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 생성하는 것이 가능하다. 상기 항체들은, 특정 에피토프 및 항원 결정기에 대한 친화도하에 활성 사량체(H2L2) 구조를 형성하기 위한 합성 쇄의 조립과 함께, 상기 항체의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 유전자 서열을 클로닝함으로써, 또는 상기 폴리펩티드 쇄의 직접 합성에 의해 생성될 수 있다. 상기 방법은 상이한 종 및 공급원으로부터의 항체를 중화시키는 서열 특성을 갖는 항체의 용이한 생성을 가능케 하였다.
항체의 공급원과 무관하게, 또는 이들이 어떻게 재조합적으로 구성되는지, 또는 이들이, 시험관내에서 또는 생체내에서, 실험실 또는 상업적 규모의 유전자 전이 동물, 거대 세포 배양물을 사용하여, 유전자 전이 식물을 사용하여, 또는 과정의 임의 단계에서 살아있는 유기체를 사용하지 않고 직접 화학 합성에 의해서, 어떻게 합성되는지와 무관하게, 모든 항체들은 유사한 전체 3차원 구조를 갖는다. 상기 구조는 종종 H2L2로 나타내며, 항체들이 통상적으로 2개의 경쇄(L) 아미노산 쇄 및 2개의 중쇄(H) 아미노산 쇄를 포함한다는 사실을 나타낸다. 두 쇄 모두 구조적으로 상보적인 항원 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 갖는다. 표적과 상호작용하는 상기 영역은 "가변" 또는 "V" 영역으로 지칭되며, 상이한 항원 특이성을 갖는 항체와 아미노산 서열에서의 차이를 특징으로 한다. H 또는 L 쇄의 가변 영역들은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 영역"은 항원과 상호작용하며 항체에 항원에 대한 그의 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 부분을 말한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 입체구조(conformation)를 유지하기 위해 필수적인 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다.
항원 결합 영역을 제공하는 H 또는 L 쇄의 가변 영역 내에 상이한 특이성을 갖는 항체들 사이에 그의 극단적인 가변성으로 인해 "초가변성"으로 지칭되는 보다 작은 서열이 존재한다. 상기 초가변성 영역은 또한 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로도 지칭된다. 이들 CDR 영역은 특정 항원 결정기 구조에 대한 항체의 기본적 특이성의 원인이 된다.
CDR은 가변 영역 내의 아미노산의 비-인접 연장부(strectch)를 나타내지만, 종과 무관하게, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내의 상기 임계 아미노산 서열의 위치상 장소는 가변성 쇄들의 아미노산 서열 내의 유사한 장소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체들의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각, 서로와 각각 비-인접한 3개의 CDR 영역을 갖는다.
모든 포유동물 종에서, 항체 펩티드는 불변(즉, 고도로 보존되는) 및 가변 영역을 함유하며, 가변 영역 내에는 CDR, 및 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내, CDR 외부의 아미노산 서열로 이루어진 소위 "프레임워크 영역"이 존재한다.
항체의 CDR 영역에 의해 인식되는 항원 결정기와 관련하여, 이것은 또한 "에피토프"로 지칭된다. 즉, 에피토프는 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 임의 분자의 부분을 말한다(상응하는 항체 결합 영역은 파라토프로 지칭될 수 있다).
"항원"은 추가로 동물이 상기 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하도록 유도할 수 있는 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 또는 하나보다 많은 에피토프를 가질 수 있다. 상기 언급된 특이적 반응은, 항원이 매우 선택적인 방식으로 그의 상응하는 항체와 반응하되 다른 항원들에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체들과는 반응하지 않을 것임을 시사하는 것이다.
용어 "항체"는 무손상 면역글로불린 분자, 및 그의 부분, 단편, 펩티드 및 유도체, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fse, CDR 영역, 파라토프, 또는 항원 또는 에피토프와 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분 또는 펩티드 서열을 포함하는 것이다. 항체는 분자와 특이적으로 반응함으로써 분자를 항체에 결합시킬 수 있는 경우 분자에 "결합할 수 있다"고 한다.
항체는 또한 효소 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술과 같은(이로 한정되지는 않는다) 임의의 공지된 기술에 의해 제공된 키메라 항체, 헤테로키메라 항체, 개화된 항체 또는 고양이화 항체 뿐 아니라, 그의 단편, 부분, 영역, 펩티드 또는 유도체를 포함한다. 본 발명의 상기 항체는 개 IL-31 또는 고양이 IL-31 중 하나 이상에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 단편 또는 부분은 무손상 항체의 Fc 단편이 결여될 수 있고, 순환으로부터 보다 신속히 제거될 수 있으며, 무손상 항체보다 비-특이적 조직 결합을 덜 가질 수 있다. 항체 단편의 예는, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들면, 파파인(Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성하기 위해)과 같은 효소를 사용한 단백질 분해에 의해 무손상 항체로부터 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)] 참조). 항체의 부분들은 임의의 상기 방법들에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 분자의 일부를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 재조합 항체의 CDR 영역(들)이 단리되어 적절한 발현 벡터 내에 서브클로닝될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 6,680,053 호 참조).
클론 11E12 , 34D03 및 19D07 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
일부 태양에서, 본 발명은 개 IL-31 또는 고양이 IL-31 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 새로운 단클론성 항체를 제공한다. 한 태양에서, 본 발명의 단클론성 항체는 개 IL-31 또는 고양이 IL-31에 결합하며, IL-31 수용체 A(IL-31Ra) 및 온코스타틴-M-특이적 수용체(OsmR 또는 IL-31Rb)를 포함하는 그의 보조수용체 복합체에 대한 그의 결합 및 상기 복합체의 활성화를 방지한다. 본 발명의 단클론성 항체는 본원에서 "11E12", "34D03" 및 "19D07"로 확인되며, 이것은 그의 하이브리도마 클론에 지정된 수를 지칭한다. 본원에서, "11E12", "34D03" 및 "19D07"은 또한 11E12, 34D03 및 19D07 항체 각각에 결합하는 그의 능력으로 인해 11E12, 34D03 및 19D07로 확인된 IL-31 에피토프와 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 파라토프 또는 CDR의 부분을 지칭한다. 본원에 기술된 11E12, 34D03 및 19D07의 여러 재조합, 키메라, 헤테로키메라, 개화 및/또는 고양이화 형태가 동일한 명칭으로 언급될 수 있다.
한 태양에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
아미노산 서열 YYDIN(서열번호 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS(서열번호 2; 19D07-VH-CDR1), 또는 NYGMS(서열번호 3; 34D03-VH-CDR1)를 갖는 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG(서열번호 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(서열번호 5; 19D07-VH-CDR2), 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG(서열번호 6; 34D03-VH-CDR2)를 갖는 가변 중쇄 CDR2;
아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY(서열번호 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY(서열번호 8; 19D07-VH-CDR3), 또는 VRGYGYDTMDY(서열번호 9; 34D03-VH-CDR3)를 갖는 가변 중쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하기 군 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다:
아미노산 서열 RASESVDNYGISFMH(서열번호 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA(서열번호 11; 19D07-VL-CDR1), 또는 KASQSVSFAGTGLMH(서열번호 12; 34D03-VL-CDR1)를 갖는 가변 경쇄(VL) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 RASNLES(서열번호 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES(서열번호 14; 19D07-VL-CDR2), 또는 RASNLEA(서열번호 15; 34D03-VL-CDR2)를 갖는 가변 경쇄 CDR2;
아미노산 서열 QQSNKDPLT(서열번호 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT(서열번호 17; 19D07-VL-CDR3), 또는 QQSREYPWT(서열번호 18; 34D03-VL-CDR3)를 갖는 가변 경쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
또 다른 태양에서, 전술한 가변 경쇄 CDR 중 하나 이상을 갖는 항체는 또한 하기 가변 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
아미노산 서열 YYDIN(서열번호 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS(서열번호 2; 19D07-VH-CDR1), 또는 NYGMS(서열번호 3; 34D03-VH-CDR1)를 갖는 가변 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG(서열번호 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(서열번호 5; 19D07-VH-CDR2), 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG(서열번호 6; 34D03-VH-CDR2)를 갖는 가변 중쇄 CDR2;
아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY(서열번호 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY(서열번호 8; 19D07-VH-CDR3), 또는 VRGYGYDTMDY(서열번호 9; 34D03-VH-CDR3)를 갖는 가변 중쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
일부 태양에서, 상기 항체는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a) 다음을 포함하는 가변 경쇄:
Figure 112016017353426-pat00003
b) 다음을 포함하는 가변 중쇄:
Figure 112016017353426-pat00004
및
c) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
다른 태양에서, 본 발명은 전술한 항체를 생성하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 그 범위 내에, 본 발명의 항-IL-31 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 범위내에 11E12, 34D03 또는 19D07의 아미노산 서열 또는 그의 펩티드를 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열이 또한 포함된다.
일부 태양에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다:
아미노산 서열 YYDIN(서열번호 1; 11E12-VH-CDR1), SYDMS(서열번호 2; 19D07-VH-CDR1), 또는 NYGMS(서열번호 3; 34D03-VH-CDR1)를 갖는 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG(서열번호 4; 11E12-VH-CDR2), TITSGGGYTYSADSVKG(서열번호 5; 19D07-VH-CDR2), 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG(서열번호 6; 34D03-VH-CDR2)를 갖는 가변 중쇄 CDR2;
아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY(서열번호 7; 11E12-VH-CDR3), ARQNWVVGLAY(서열번호 8; 19D07-VH-CDR3), 또는 VRGYGYDTMDY(서열번호 9; 34D03-VH-CDR3)를 갖는 가변 중쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
다른 태양에서, 전술한 단리된 핵산은 다음 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다:
아미노산 서열 RASESVDNYGISFMH(서열번호 10; 11E12-VL-CDR1), KSSQSLLNSGNQKNYLA(서열번호 11; 19D07-VL-CDR1), 또는 KASQSVSFAGTGLMH(서열번호 12; 34D03-VL-CDR1)를 갖는 가변 경쇄(VL) 상보성 결정 영역(CDR)1;
아미노산 서열 RASNLES(서열번호 13; 11E12-VL-CDR2), GASTRES(서열번호 14; 19D07-VL-CDR2), 또는 RASNLEA(서열번호 15; 34D03-VL-CDR2)를 갖는 가변 경쇄 CDR2;
아미노산 서열 QQSNKDPLT(서열번호 16; 11E12-VL-CDR3), QNDYSYPYT(서열번호 17; 19D07-VL-CDR3), 또는 QQSREYPWT(서열번호 18; 34D03-VL-CDR3)를 갖는 가변 경쇄 CDR3; 및
CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
본 발명은 또한 하나 이상의 전술한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
유전자 코드는 축퇴되어 있으므로, 특정 아미노산을 암호화하기 위해 하나보다 많은 코돈이 사용될 수 있다. 유전자 코드를 사용하여, 그 각각이 아미노산을 암호화할 수 있는 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열이 확인될 수 있다. 사실상, 특정 올리고뉴클레오티드가 실제 XXX-암호화 서열을 구성할 확률은, 비정상적 염기 쌍형성 관계, 및 특정 코돈이 항-IL-31 항체 또는 일부를 발현하는 진핵 또는 원핵 세포에서 (특정 아미노산을 암호화하기 위해) 실제로 사용되는 빈도를 고려함으로써 평가될 수 있다. 상기 "코돈 사용 규칙"은 문헌 [Lathe, et al., J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)]에 개시되어 있다. 상기 라쓰(Lathe)의 "코돈 사용 규칙"을 이용하여, 항-IL-31 서열을 암호화할 수 있는 이론상의 "가장 가능성 있는" 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 세트를 확인할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 항체 및 펩티드의 변이체(작용물질)를 제공하는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 존재하는 항체 유전자를 변이시킴으로써 본 발명에 사용하기 위한 항체 암호화 영역도 또한 제공될 수 있게 하고자 한다. 상기 변이체는 항-IL-31 항체 또는 펩티드의 아미노산 서열에 결실, 부가 및 치환을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
예를 들면, 한 종류의 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 상기 치환은 항-IL-31 항체 펩티드 중 해당 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것이다. 전형적으로 보존적 치환으로서 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 하나를 다른 것으로의 치환; 하이드록실 잔기 Ser과 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp와 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 간의 치환, 염기성 잔기 Lys와 Arg의 교환, 방향족 잔기 Phe, Tyr 등 중에서의 치환이 있다. 아미노산 변화가 표현형적으로 잠재적이기 쉬운 치환에 관한 지침은 문헌 [Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990)]에서 확인된다.
변이체 또는 작용물질 항-IL-31 항체 또는 펩티드는 완전히 기능적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 활성에서 기능이 결여될 수 있다. 완전히 기능성인 변이체는 전형적으로 보존적 변이 또는 비-임계 잔기 또는 비-임계 영역에서의 변이 만을 함유한다. 기능적 변이체는 또한 기능에 변화를 야기하지 않거나 사소한 변화를 야기하는 유사한 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 또는, 상기 치환은 기능에 어느 정도 유리하게 또는 불리하게 영향을 미칠 수 있다. 비-기능적 변이체는 전형적으로 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위 또는 절두(truncation), 또는 임계 잔기 또는 임계 영역에서의 치환, 삽입, 역위 또는 결실을 함유한다.
기능에 필수적인 아미노산은 부위-지향 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같이 당해 분야에 공지된 방법으로 확인할 수 있다[Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989)]. 후자의 절차는 분자내 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 생성된 돌연변이 분자는 이어서 에피토프 결합 또는 시험관내 ADCC 활성과 같은 생물 활성에 대해 검사한다. 리간드-수용체 결합에 결정적인 부위는 또한 결정학, 핵자기 공명 또는 광친화성(photoaffinity) 표지화와 같은 구조적 분석에 의해 결정될 수 있다[Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992); de Vos et al., Science, 255:306-312 (1992)].
또한, 폴리펩티드는 종종 20개의 "천연" 아미노산이 아닌 아미노산을 함유한다. 또한, 말단 아미노산을 포함하여 많은 아미노산이 가공 및 다른 번역후 변형과 같은 자연적 과정에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 공지된 변형으로는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈(flavin)의 공유 결합, 헴(heme) 잔기의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교결합, 환화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 가공, 포스포릴화, 페닐화, 라세미화, 셀레노일화(selenolyation), 설페이트화, 아르기닐화(arginylation)와 같은 단백질에 대한 아미노산의 전이-RNA 매개 부가, 및 유비퀴틴화(ubiquitination)가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
상기 변형은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있으며 과학 문헌에 매우 상세히 기술되었다. 예를 들면, 여러 특히 일반적인 변형, 글리코실화, 지질 결합, 설페이트화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화가 대부분의 기본 교재, 예를 들면, [Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY (1993)]에 기술되어 있다. 많은 상세한 검토내용들이, 예를 들면, [Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1993); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); and Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62 (1992)]에서 상기 주제에 대해 이용가능하다.
따라서, 본 발명의 항체 및 펩티드는 또한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호화된 것이 아닌 유도체 또는 유사체를 포함한다.
유사하게, 아미노산 서열에 있어서의 부가 및 치환 뿐 아니라, 전술한 바와 같은 변이 및 변형은 IL-31 항원 및/또는 그의 에피토프 또는 펩티드의 아미노산 서열에 동일하게 적용될 수 있으며, 따라서 본 발명에 포함된다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 단클론성 항체를 암호화하는 유전자는 IL-31의 인식에 특히 효과적이다.
항체 유도체
본 발명의 범위 내에 항체 유도체가 포함된다. 항체의 "유도체"는 정상적으로 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학적 잔기를 함유한다. 단백질의 공유적 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 변형은, 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자내에 도입될 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에 공지되어 있는, 이작용성 약제에 의한 유도체화가 항체 또는 단편을 수-불용성 지지체 또는 다른 거대분자 담체에 가교결합시키는데 유용하다.
유도체는 또한, 예를 들면, 방사성 요오드(125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 인듐(111In), 트리튬(3H) 등; 비오틴 또는 아비딘과, 효소, 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코아밀라제, 카복실산 언하이드라제, 아세틸콜린 에스터라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제와 단클론성 항체의 접합체; 및 또한 생물발광제(예, 루시퍼라제), 화학발광제(예, 아크리딘 에스터) 또는 형광제(예, 피코빌리단백질)과 단클론성 항체의 접합체로 표지되는 방사성 표지된 단클론성 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 유도체 이작용성 항체는 2개의 상이한 항원기를 인식하는 2개의 별개의 항체의 부분들을 결합시켜 생성된 이중특이성 항체이다. 이것은 가교결합 또는 재조합 기술에 의해 달성될 수 있다. 또한, 생체내 반감기를 증가(예를 들면, 혈류로부터 제거까지의 시간을 연장시킴으로써)시키기 위해 항체 또는 그의 일부에 잔기를 부가시킬 수 있다. 상기 기술은, 예를 들면, PEG 잔기를 부가시키는 것(페길화로도 지칭된다)을 포함하며, 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허출원 공개공보 제 20030031671 호 참조).
항체의 재조합 발현
일부 태양에서, 본 발명의 단클론성 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에 직접 도입되며, 상기 세포는 암호화된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 배양된다. 본 발명의 핵산을 세포내에 도입한 후, 상기 세포는 전형적으로 항체를 발현시키기 위해, 통상적으로 37 ℃에서, 때때로 선별하에, 약 1 내지 24 시간의 기간동안 배양된다. 한 태양에서, 항체는 세포가 성장하는 배지의 상등액 중에 분비된다.
전통적으로, 단클론성 항체는 뮤린 하이브리도마 세포주에서 천연 분자로서 생성되었다. 상기 기술 이외에, 본 발명은 단클론성 항체의 재조합 DNA 발현을 제공한다. 이에 의해, 개화 및 고양이화 항체, 및 선택된 숙주 종에서 다양한 항체 유도체 및 융합 단백질이 생성된다.
본 발명의 하나 이상의 항-IL-31 항체, 부분 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은, 접합을 위한 평활-말단화(blunt-ended) 또는 비대칭-말단화(staggered-ended) 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 절단, 적절하게 점착성 말단의 충전, 바람직하지 않은 연결을 방지하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 및 적절한 리가제에 의한 접합을 포함하여, 통상적인 기술에 따라 벡터 DNA를 사용해 재조합될 수 있다. 상기 조작 기술은, 예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993)]에 개시되어 있으며, 단클론성 항체 분자 또는 그의 항원 결합 영역을 암호화하는 핵산 서열을 구성하기 위해 사용될 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는, 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 상기 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"되는 경우, 폴리펩티드를 "발현할 수 있다"고 한다. 작동가능한 결합은 조절 DNA 서열 및 발현될 것으로 생각되는 DNA 서열이 항-IL-31 펩티드 또는 항체 부분으로서 유전자 발현을 회수가능한 양으로 허용하는 방식으로 연결되는 결합이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역들의 정확한 성질은 유사한 분야에서 공지되어 있듯이 유기체에 따라 달라질 수 있다(예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993)] 참조).
따라서, 본 발명은 원핵 또는 진핵 세포에서 항-IL-31 항체 또는 펩티드의 발현을 포함한다. 적합한 숙주로는 생체내 또는 동일반응계내에서 세균, 효모, 곤충, 진균류, 조류 및 포유동물 세포를 포함하여, 세균 또는 진핵세포 숙주, 또는 포유동물, 곤충, 조류 또는 효모 유래의 숙주 세포가 포함된다. 포유동물 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원을 가질 수 있으나, 임의의 다른 포유동물 세포도 사용될 수 있다.
한 태양에서, 도입된 뉴클레오티드 서열은 수용 숙주에서 자율 복제될 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내에 혼입될 것이다. 상기 목적을 위해 매우 다양한 임의의 벡터를 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993)] 참조). 특정한 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선별하는데 있어 중요한 요인들로는 다음이 포함된다: 벡터를 함유하는 수용 세포가 그에 의해 인식되고 상기 벡터를 함유하지 않는 수용 세포들로부터 선택될 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 바람직한 벡터의 복제 수; 및 상이한 종들의 숙주 세포들 사이에 벡터를 "셔틀(shuttle)"시킬 수 있는 것이 바람직한지 여부.
당해 분야에 공지되어 있는 예시적인 원핵세포 벡터는 이. 콜라이에서 복제될 수 있는 것과 같은 플라스미드를 포함한다(예를 들면, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, .pi.VX). 상기 플라스미드는, 예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993)]에 개시되어 있다. 바실러스(Bacillus) 플라스미드로는 pC194, pC221, pT127 등이 포함된다. 상기 플라스미드는 문헌 [Gryczan, THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI, 307-329 (Academic Press, NY, 1982)]에 개시되어 있다. 적합한 스트렙토마이세스(Streptomyces) 플라스미드로는 pIJ101[Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987)], 및 스트렙토마이세스 박테리오파지, 예를 들면, .phi.C31[Chater et al., SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungry 1986)]가 포함된다. 슈도모나스(Pseudomonas) 플라스미드는 문헌 [John et al., Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986); Izaki, Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742 (1978); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993)]에 개관되어 있다.
또는, 항-IL-31 항체 또는 펩티드를 암호화하는 cDNA의 발현에 유용한 유전자 발현 요소로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: (a) 바이러스 전사 프로모터 및 그의 인핸서 요소, 예를 들면, SV40 초기 프로모터[Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)], 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 LTR[Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:6777 (1982)], 및 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 LTR[Grosschedl et al., Cell, 41:885 (1985)]; (b) 스플라이스 영역 및 폴리아데닐화 부위, 예를 들면, SV40 후기 영역으로부터 유도된 것들[Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)]; 및 (c) SV40에서와 같은 폴리아데닐화 부위[Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)].
면역글로불린 cDNA 유전자는, 발현 요소 SV40 초기 프로모터 및 그의 인핸서, 마우스 면역글로불린 H 쇄 프로모터 인핸서, SV40 후기 영역 mRNA 스플라이싱, 토끼 S-글로빈 개재 서열(intervening sequence), 면역글로불린 및 토끼 S-글로빈 폴리아데닐화 부위, 및 SV40 폴리아데닐화 요소를 사용하여, 문헌 [Weidle et al., Gene, 51:21 (1987)]에 기술된 바와 같이 발현될 수 있다.
부분 cDNA, 부분 게놈 DNA로 이루어진 면역글로불린 유전자[Whittle et al., Protein Engin. 1:499 (1987)]의 경우, 전사 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스일 수 있으며, 상기 프로모터 인핸서는 사이토메갈로바이러스 및 마우스/인간 면역글로불린일 수 있고, mRNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화 영역은 천연 염색체 면역글로불린 서열일 수 있다.
한 태양에서, 설치류 세포에서의 cDNA 유전자 발현의 경우, 전사 프로모터는 바이러스 LTR 서열이고, 전사 프로모터 인핸서는 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 바이러스 LTR 인핸서 중 어느 하나 또는 둘 다이고, 스플라이스 영역은 31 bp보다 큰 인트론을 함유하고, 폴리아데닐화 및 전사 종결 영역은 합성되는 면역글로불린 쇄에 상응하는 천연 염색체 서열로부터 유도된다. 다른 태양에서, 다른 단백질을 암호화하는 cDNA 서열은 상기 나열한 발현 요소들과 결합되어 포유동물 세포에서 단백질의 발현을 달성한다.
각각의 융합된 유전자는 발현 벡터내에서 조립될 수 있거나, 또는 상기 벡터 내에 삽입될 수 있다. 이어서, 키메라 면역글로불린 쇄 유전자 산물을 발현할 수 있는 수용 세포를 항-IL-31 펩티드 또는 키메라 H 또는 키메라 L 쇄-암호화 유전자로 개별적으로 형질감염시키거나, 또는 키메라 H 및 키메라 L 쇄 유전자로 동시-형질감염시킨다. 형질감염된 수용 세포는 삽입된 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 발현된 면역글로불린 쇄 또는 무손상 항체 또는 단편을 배양물로부터 회수한다.
한 태양에서, 항-IL-31 펩티드 또는 키메라 H 및 L 쇄를 암호화하는 융합 유전자 또는 그의 부분들은 별개의 발현 벡터에서 조립되며, 이어서 상기 벡터들은 수용 세포를 동시-형질감염시키는데 사용된다. 또는, 키메라 H 및 L 쇄를 암호화하는 융합 유전자는 동일한 발현 벡터 상에서 조립될 수 있다.
발현 벡터의 형질감염 및 키메라 항체의 생성을 위해, 수용 세포주는 골수종 세포일 수 있다. 골수종 세포는 형질감염된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 면역글로불린을 합성하고 조립하고 분비할 수 있으며, 면역글로불린의 글리코실화에 대한 메카니즘을 갖는다. 골수종 세포는 배양액 중에서 또는 마우스의 복막강 내에서 성장될 수 있으며, 이때 분비된 면역글로불린은 복수로부터 수득될 수 있다. 다른 적합한 수용 세포로는 인간 또는 비-인간 기원의 B 림프구와 같은 림프 세포, 인간 또는 비-인간 기원의 하이브리도마 세포, 또는 종간(interspecies) 헤테로하이브리도마 세포가 포함된다.
본 발명의 키메라, 개화 또는 고양이화 항체 구조물 또는 항-IL-31 폴리펩티드를 함유하는 발현 벡터는, 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 인산칼슘-침전, 및 다이에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란과 같은 폴리양이온에 의한 적용과 같은 생화학적 방법, 및 전기천공, 직접 미세주입 및 미립자총 충격(microprojectile bombardment)과 같은 기계적 방법을 포함하여, 임의의 다양한 적합한 방법에 의해 적절한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다[Johnston et al., Science, 240:1538 (1988)].
효모는 면역글로불린 H 및 L 쇄의 생산에 있어 세균에 비해 실질적인 이점을 제공할 수 있다. 효모는 글리코실화를 포함하는 번역후 펩티드 변형을 수행한다. 현재 효모에서 목적하는 단백질의 생성에 사용될 수 있는 강한 프로모터 서열 및 높은 복제 수의 플라스미드를 사용하는 많은 재조합 DNA 방법들이 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물 유전자 산물의 리더 서열을 인식하며, 리더 서열을 갖는 펩티드(즉, 프리-펩티드)를 분비한다[Hitzman et al., 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982)].
효모 유전자 발현 시스템은 통상적으로 항-IL-31 펩티드, 항체 및 조립된 뮤린 및 키메라, 헤테로키메라, 개화 또는 고양이화 항체, 그의 단편 및 영역들의 생성 수준, 분비 및 안정성에 대해 평가될 수 있다. 효모가 글루코스가 풍부한 배지에서 성장할 때 대량으로 생성된 당분해 효소를 암호화하는 활성적으로 발현된 유전자로부터의 프로모터 및 종결 요소를 포함하는 임의의 일련의 효모 유전자 발현 시스템을 사용할 수 있다. 공지되어 있는 당분해 유전자는 또한 매우 효과적인 전사 조절 신호를 제공할 수 있다. 예를 들면, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자의 프로모터 및 터미네이터 신호를 사용할 수 있다. 효모에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA의 발현을 위한 최적 발현 플라스미드를 평가하기 위해 많은 접근방법들을 취할 수 있다(문헌 [DNA Cloning, Vol. II, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK (1985)] 참조).
세균 균주도 또한 본 발명에서 기술된 항체 분자 또는 펩티드의 생성을 위한 숙주로 사용될 수 있다. 숙주 세포와 양립가능한 종으로부터 유도된 레플리콘(replicon) 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 상기 세균 숙주들과 함께 사용된다. 상기 벡터는 복제 부위, 및 형질전환 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자를 함유한다. 세균에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA에 의해 암호화된 뮤린, 키메라, 헤테로키메라, 개화 또는 고양이화 항체, 단편 및 영역들 또는 항체 쇄의 생성을 위한 발현 플라스미드를 평가하기 위해 많은 접근방법을 취할 수 있다(문헌 [DNA Cloning, Vol. II, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK (1985); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: Greene Publishing Association/Wiley Interscience, 1993); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY (1994- 2001); Colligan et al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001)] 참조).
숙주 포유동물 세포는 시험관내에서 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 포유동물 세포는 리더 펩티드 제거, H 및 L 쇄의 폴딩 및 조립, 항체 분자의 글리코실화, 및 기능성 항체 단백질의 분비를 포함하여, 면역글로불린 단백질에 대한 번역후 변형을 제공한다.
전술한 림프구 유래 세포 이외에, 항체 단백질의 생성을 위한 숙주로 유용할 수 있는 포유동물 세포로는 섬유아세포 유래의 세포, 예를 들면, 베로(Vero)(ATCC CRL 81) 또는 CHO-K1(ATCC CRL 61) 세포가 포함된다.
많은 벡터 시스템이 포유동물 세포에서 클로닝된 항-IL-31 펩티드 H 및 L 쇄 유전자의 발현에 이용가능하다(문헌 [DNA Cloning, Vol. II, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK (1985) 참조). 완전 H2L2 항체를 수득하기 위해 다양한 접근방법들이 뒤따를 수 있다. H 및 L 쇄의 세포내 결합 및 완전 사량체 H2L2 항체 및/또는 항-IL-31 펩티드로의 연결을 달성하기 위해 동일한 세포에서 H 및 L 쇄를 동시-발현하는 것이 가능하다. 동시-발현은 동일 숙주에서 동일하거나 상이한 플라스미드를 사용하여 일어날 수 있다. H 및 L 쇄 둘 다에 대한 유전자 및/또는 항-IL-31 펩티드는 동일 플라스미드 내에 배치될 수 있으며, 이어서 세포내에 형질감염됨으로써 두 쇄를 모두 발현하는 세포를 직접 선별할 수 있다. 또는, 세포를 하나의 쇄, 예를 들면, L 쇄를 암호화하는 플라스미드로 먼저 형질감염시킨 후, 생성된 세포주를 제 2의 선택성 마커를 함유하는 H 쇄 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다. 어느 한 경로에 의해 항-IL-31 펩티드 및/또는 H2L2 분자를 생성하는 세포주는, 조립된 H2L2 항체 분자의 더 높은 생산률 또는 형질감염된 세포주의 증대된 안정성과 같은 향상된 성질을 갖는 세포주를 생성하기 위해 추가의 선택성 마커와 함께 펩티드, H, L, 또는 H와 L 쇄의 추가 복제물을 암호화하는 플라스미드로 형질감염될 수 있다.
재조합 항체의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현을 이용할 수 있다. 예를 들면, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것이 아니라, 숙주 세포는 면역글로불린 발현 카세트 및 선택성 마커로 형질전환될 수 있다. 외부 DNA의 도입 후에, 조작된 세포는 농축 배지에서 1 내지 2 일동안 성장된 후, 선택성 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드 중 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 제공하며, 세포가 플라스미드를 염색체내에 안정하게 통합시켜 집중점(focus)을 형성하도록 성장시키게 하고, 이어서 상기 집중점을 세포주 내에 클로닝시키고 확장시킬 수 있다. 상기 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물/성분의 검색 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
일단 본 발명의 항체가 생성되었으면, 상기 항체는 면역글로불린 분자의 정제에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특이적 항원에 대한 친화도, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심단리, 용해도 차이에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 많은 태양에서, 항체는 세포로부터 배양 배지 중으로 분비되고 배양 배지로부터 수거된다.
약학적 용도
본 발명의 항-IL-31 항체 또는 펩티드는, 예를 들면, 개 및 고양이와 같은 반려 동물에서의 소양성 및/또는 알레르기성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 보다 특히, 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 및 활성 성분으로서 본 발명에 따른 항체 또는 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 항체는 본 발명에 따른 키메라, 헤테로키메라, 개화, 또는 고양이화 항체일 수 있다. 무손상 면역글로불린 또는 그의 결합 단편, 예를 들어, Fab도 또한 포함된다. 본 발명의 항체 및 그의 약학 조성물은 비경구 투여, 예를 들면, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다.
본 발명의 항-IL-31 항체 및/또는 펩티드는 개별적 치료제로서 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 선택된 투여 경로 및 표준 약학 관행을 기준으로 선택된 약학적 담체와 함께 투여된다.
본원에 개시된 항체의 투여는, 비경구 주사(예를 들면, 복강내, 피하 또는 근육내 주사), 경구, 또는 기도 표면으로의 항체의 국소 투여(전형적으로 약학 제형으로 수행된다)를 포함하여, 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면으로의 국소 투여는 비내 투여(예를 들면, 점적제, 면봉 또는 흡입기를 사용하여)에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면으로의 항체의 국소 투여는 또한 흡입 투여에 의해, 예를 들면, 항체를 에어로졸 현탁액으로 함유하는 약학 제형(고체 및 액체 입자 둘 다 포함)의 호흡성 입자를 생성한 다음 대상에게 상기 호흡성 입자를 흡입하게 함으로써 수행될 수 있다. 약학 제형의 호흡성 입자를 투여하기 위한 방법 및 장치는 공지되어 있으며, 임의의 통상적인 기술을 사용할 수 있다. 경구 투여는, 예를 들면, 주사가능한 액체 또는 고체 제형의 형태일 수 있다.
일부 바람직한 태양에서, 항체는 비경구 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여의 경우, 항-IL-31 항체 또는 펩티드는 약학적으로 허용되는 비경구용 비히클과 함께 용액, 현탁액, 유화액 또는 동결건조 분말로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 상기 비히클은 수성 담체와 같은 허용되는 담체에 용해된 항체의 용액 또는 그의 혼합물일 수 있으며, 상기 담체는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 트레할로스 또는 슈크로스 용액, 또는 5% 혈청 알부민, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등이다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예를 들어, 고정유도 또한 사용될 수 있다. 상기 용액들은 멸균성이며, 일반적으로 입자 물질을 함유하지 않는다. 이들 조성물은 통상적인 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하기 위해 필요한 대로 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, pH 조정 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산 나트륨 등을 함유할 수 있다. 상기 제형중 항체의 농도는 광범위하게, 예를 들면, 약 0.5% 미만으로부터, 통상적으로 약 1% 이상에서 15 또는 20 중량% 정도까지로 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라서, 주로 유체 부피, 점도 등을 기준으로 선택될 것이다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성(예를 들면, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학 안정성(예를 들면, 완충액 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 통상적으로 사용되는 기술에 의해 멸균된다.
비경구 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있거나 명백할 것이며, 예를 들면, 문헌 [REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)]에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 저장을 위해 동결건조될 수 있으며, 사용전에 적합한 담체중에 재구성될 수 있다. 상기 기술은 통상적인 면역글로불린에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술을 이용할 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실을 유발할 수 있고 보상하기 위해 사용 수준이 조정되어야 할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 혼합물을 함유하는 조성물은 기존 질환의 재발 방지 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 적합한 약학적 담체는 상기 기술 분야에서 표준 참고 교재인 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]의 가장 최신판에 기술되어 있다.
치료 용도에서, 조성물은 질환 및 그의 합병증을 치료하거나 또는 적어도 부분적으로 억제하거나 완화시키기에 충분한 양으로, 질환을 이미 앓고 있는 대상에게 투여된다. 이를 수행하기에 적절한 양을 "치료 효과적 용량" 또는 "치료 효과량"으로 정의한다. 상기 용도에 효과적인 양은 질환의 중증도 및 대상자 자신의 면역계의 일반적 상태에 따라 달라질 것이지만, 일반적으로 약 0.1 내지 약 10 mg 항체/kg 체중, 바람직하게는 약 0.3 내지 약 5 mg 항체/kg 체중의 범위이다. 외부 물질의 최소화, 및 본 발명의 개-유사 및 고양이-유사 항체에 의해 달성되는 "외래 물질" 거부반응의 보다 낮은 가능성을 고려하여, 실질적 과량의 상기 항체를 투여하는 것이 가능할 수 있다.
투여되는 투여량은 물론 특정 약제의 약력학적 특성, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 병행 치료의 성질 및 증상의 정도, 치료 빈도, 및 목적하는 효과와 같은 공지된 요인들에 따라 달라질 것이다.
비-제한 예로서, 개 및 고양이에서 IL-31-관련 병상의 치료는 전술한 투여량 범위내의 본 발명의 항-IL-31 항체의 격주 또는 매월 투여량으로 제공될 수 있다.
개 또는 고양이 치료 용도를 위한 대표적인 항체는 본 발명에 따른, 유효한 생체내 항-IL-31 활성을 갖는 고 친화성(이들은 또한 고 결합활성일 수 있다) 항체, 및 그의 단편, 영역 및 유도체이다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 주치의에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다. 아무튼, 약학 제형은 대상을 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 항체(들)를 제공해야 한다.
진단 용도
본 발명은 또한 소양성 및/또는 알레르기성 질환을 갖는 것으로 알려졌거나 의심되는 반려 동물에서 IL-31을 검출하기 위한 진단 방법에 사용하기 위한 상기 항-IL-31 항체 및 펩티드를 제공한다.
본 발명의 항-IL-31 항체 및/또는 펩티드는 샘플에서 IL-31 또는 항-IL-31 항체를 검출하거나 정량하는 면역분석법에 유용하다. IL-31에 대한 면역분석법은 전형적으로, IL-31에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출가능하게 표지된 고 친화성(또는 고 결합활성) 항-IL-31 항체 또는 폴리펩티드의 존재하에 임상적 또는 생물학적 샘플을 배양하고, 샘플중에서 결합된 표지된 펩티드 또는 항체를 검출하는 것을 포함한다. 다양한 임상적 분석 절차들이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S (Voller et al., eds., Univ. Park, 1981)] 참조). 상기 샘플은 조직 생검체, 혈액, 혈청 및 배설물 샘플, 또는 동물 대상으로부터 수거되고 하기에 기술하는 바와 같은 ELISA 분석에 적용된 액체를 포함한다.
일부 태양에서, 항체에 대한 항원의 결합은 고체 지지체를 사용하지 않고 검출된다. 예를 들면, 항체에 대한 항원의 결합은 액체 형식으로 검출될 수 있다.
다른 태양에서, 항-IL-31 항체 또는 폴리펩티드는, 예를 들면, 니트로셀룰로스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 또 다른 고체 지지체에 고정될 수 있다. 이어서, 상기 지지체를 적당한 완충액으로 세척한 후, 검출가능하게 표지된 IL-31-특이적 펩티드 또는 항체로 처리할 수 있다. 그 다음, 고체상 지지체를 완충액으로 2회 세척하여 미결합 펩티드 또는 항체를 제거할 수 있다. 이어서, 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양을 공지된 방법에 의해 검출할 수 있다.
"고체상 지지체" 또는 "담체"는 펩티드, 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 말한다. 공지되어 있는 지지체 또는 담체로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트가 포함된다. 담체의 성질은 어느 정도 가용성이거나 또는 본 발명의 경우 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 IL-31 또는 항-IL-31 항체에 결합할 수 있는 한 실질적으로 임의의 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드에서와 같이 구형이거나, 또는 시험관의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면에서와 같이 원통형일 수 있다. 또는 상기 표면은 시트, 배양 접시, 검사 스트립 등과 같이 편평할 수 있다. 예를 들면, 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함할 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 항체, 펩티드 또는 항원에 결합하기 위한 많은 다른 적합한 담체를 알거나 또는 통상적인 실험에 의해 이들을 확인할 수 있을 것이다.
공지되어 있는 방법들은 해당 로트의 항-IL-31 펩티드 및/또는 항체의 결합 활성을 측정할 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 통상적인 실험에 의해 효과적이고 최적의 분석 조건을 결정할 수 있다.
IL-31-특이적 펩티드 및/또는 항체를 검출가능하게 표지하는 것은 효소 면역분석법(EIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 사용하기 위해 효소에 결합시킴으로써 수행될 수 있다. 결합된 효소는 노출된 기질과 반응하여, 예를 들면, 분광측정, 형광측정에 의해 또는 시각적 방법에 의해 검출될 수 있는 화학적 잔기를 생성한다. 본 발명의 IL-31-특이적 항체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소로는 말레이트 데하이드로게나제, 스태필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알콜 데하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린스테라제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
IL-31-특이적 항체를 방사성 표지함으로써, 방사성면역분석법(RIA)을 사용하여 IL-31을 검출하는 것이 가능하다(문헌 [Work et al., LAB. TECHIQUES & BIOCHEM. 1N MOLEC. Bio. (No. Holland Pub. Co., NY, 1978)] 참조). 방사성 동위원소는 감마 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 방법에 의해 또는 자가방사선술(autoradiography)에 의해 검출될 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 동위원소로는 3H, 125I, 131I, 35S, 14C 및 125I가 포함된다.
IL-31-특이적 항체를 형광 화합물로 표지하는 것도 또한 가능하다. 형광 표지된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출될 때, 그의 존재는 형광으로 인해 검출될 수 있다. 가장 보편적으로 사용되는 형광 표지 화합물 중에 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레사민이 있다.
IL-31-특이적 항체는 또한 형광-방출 금속, 예를 들면, 125Eu 또는 란타나이드 계열의 다른 금속을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트화 기를 사용하여 IL-31-특이적 항체에 결합될 수 있다.
IL-31-특이적 항체는 또한 화학발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광 표지된 항체의 존재는 이어서 화학 반응 과정동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
유사하게, 생체발광 화합물을 사용하여 본 발명의 IL-31-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩티드 또는 유도체를 표지할 수 있다. 생체발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물 시스템에서 발견되는 화학발광의 한 유형이다. 생체발광 단백질의 존재는 발광 존재를 검출함으로써 측정된다. 표지화에 중요한 생체발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라제 및 에쿼린(aequorin)이다.
IL-31-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩티드 또는 유도체의 검출은, 예를 들면, 검출가능한 표지가 방사성 감마 방사체(emitter)인 경우 섬광 계수기에 의해, 또는 예를 들어, 표지가 형광 물질인 경우 형광계(fluorometer)에 의해 수행될 수 있다. 효소 표지의 경우, 검출은 효소에 대한 기질을 사용하는 변색법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물과 비교할 때 기질의 효소 반응 정도의 시각적 비교에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분석법들에 의해 검출되는 IL-31은 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. IL-31을 함유하는 임의의 샘플을 사용할 수 있다. 예를 들면, 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 소변, 대변, 염증성 삼출액, 뇌척수액, 양수, 조직 추출액 또는 균질액 등과 같은 생물학적 유체이다. 그러나, 본 발명은 상기 샘플만을 사용하는 분석법으로 제한되지 않고, 당해 분야에 통상의 기술을 기술을 가진 자가 본 명세서를 고려하여 다른 샘플의 사용을 허용하는 적당한 조건을 결정하는 것이 가능하다.
동일반응계내 검출은, 동물 대상으로부터 조직학적 시료를 제거하고, 본 발명의 표지된 항체의 혼합물을 상기 시료에 제공함으로써 수행될 수 있다. 항체(또는 그의 부분)은 표지된 항체(또는 부분)을 생물학적 샘플에 적용하거나 중첩시킴으로써 제공될 수 있다. 상기 절차를 이용하여, IL-31의 존재 뿐 아니라 검사된 조직중에 IL-31의 분포를 측정하는 것도 가능하다. 본 발명을 이용하여, 통상의 기술을 가진 자들은 상기 동일반응계내 검출을 달성하기 위해 임의의 매우 다양한 조직학적 방법(예를 들면, 염색 절차)을 변형할 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는, "양측(two-site)" 또는 "샌드위치" 분석법으로도 알려진 면역측정 분석법에 사용하기 위해 변형될 수 있다. 전형적인 면역측정 분석법에서, 많은 비표지된 항체(또는 항체의 단편)를 검사되는 유체에 불용성인 고체 지지체에 결합시키고, 많은 검출가능하게 표지된 가용성 항체를 가하여 고체-상 항체, 항원 및 표지된 항체 사이에 형성된 3성분 복합체의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 한다.
항체를 사용하여 샘플중 IL-31을 정량적 또는 정성적으로 검출하거나 또는 IL-31을 발현하는 세포의 존재를 검출할 수 있다. 이것은, 형광 현미경검사, 유세포분석 또는 형광측정 검출과 연계된 형광 표지된 항체(하기 참조)를 사용하는 면역형광 기술에 의해 수행될 수 있다. 진단 목적으로, 항체는 표지되거나 비표지될 수 있다. 비표지된 항체는 개 또는 고양이 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 같은 항체들과 반응성인 다른 표지된 항체(제 2 항체)와 함께 사용될 수 있다. 또는, 항체는 직접 표지될 수 있다. 매우 다양한 표지, 예를 들면, 방사성핵종, 플루오르, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(특히 합텐) 등이 사용될 수 있다. 앞에서 논의된 바와 같은 많은 유형의 면역분석법들이 이용가능하며 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다.
한 태양에서, IL-31을 검출하기 위한 진단 방법은 측면 유동 면역분석(lateral flow immunoassay) 검사이다. 이것은 또한 면역크로마토그래피 분석법, 신속 면역이동(Rapid ImmunoMigration, RIM(등록상표)) 또는 스트립 검사로도 알려져 있다. 측면 유동 면역분석법은 근본적으로 검사 스트립 형식에 적합하도록 단일 축을 따라 작동하게 변형된 면역분석법이다. 상기 기술의 많은 변형들이 상업적 제품으로 개발되었지만, 이들은 모두 동일한 기본 원칙에 따라 작업된다. 전형적인 검사 스트립은 다음의 성분들로 이루어진다: (1) 샘플 패드 - 그 위에 검사 샘플이 적용되는 흡수성 패드; (2) 접합체 또는 시약 패드 - 이것은 착색된 입자(통상적으로 콜로이드성 금 입자 또는 라텍스 미세구)에 접합된 표적 분석물에 특이적인 항체를 함유한다; (3) 반응막 - 전형적으로, 그 위에 항-표적 분석물 항체가 포획 대역 또는 검사 라인으로 막을 가로질러 한 줄로 고정화되는 소수성 니트로셀룰로스 또는 셀룰로스 아세테이트 막(접합체 항체에 특이적인 항체를 함유하는 조절 대역도 또한 존재할 수 있다); 및 (4) 심지 또는 폐기물 저장소 - 모세관 작용에 의해 반응막을 가로질러 샘플을 흡수하고 수집하도록 설계된 추가의 흡수성 패드. 스트립의 성분들은 통상적으로 불활성 배면 재료에 고정되며, 단순한 딥스틱(dipstick) 형식으로 제공되거나, 또는 샘플 포트(port) 및 포획 및 조절 대역을 보여주는 반응 창을 갖는 플라스틱 포장 내에 제공될 수 있다.
미생물 검사에 사용되는 2가지 주요 유형의 측면 유동 면역분석법이 존재한다: 이중 항체 샌드위치 분석법 및 경쟁 분석법. 이중 항체 샌드위치 형식에서는, 샘플이 샘플 패드로부터 접합체 패드를 통해 이동하며, 상기 접합체 패드에서는 존재하는 임의의 표적 분석물이 접합체에 결합할 것이다. 이어서, 샘플은 표적/접합체 복합체가 고정화된 항체에 결합하는 포획 대역에 도달할 때까지 계속 막을 가로질러 이동하여 막 위에 뚜렷한 라인을 제공한다. 샘플은 이어서, 조절 대역에 도달할 때까지 스트립을 따라 더 이동하여, 상기 조절 대역에서 과량의 접합체가 결합하고 막 위에 제 2의 뚜렷한 라인을 제공할 것이다. 상기 조절 라인은 샘플이 의도한 바와 같이 막을 가로질러 이동했음을 나타낸다. 막 위의 2개의 분명한 라인은 양성 결과이다. 조절 대역에서의 단일 라인은 음성 결과이다. 경쟁 분석법은, 접합체 패드가 표적 분석물 또는 그의 유사체에 이미 결합된 항체를 함유한다는 점에서 이중 항체 샌드위치 형식과 상이하다. 표적 분석물이 샘플에 존재한다면, 따라서 표적 분석물은 접합체와 결합하지 않고 비표지된채 남아 있을 것이다. 샘플이 막을 따라 이동하여 포획 대역에 도달할 때, 과량의 비표지된 분석물은 고정화된 항체에 결합하고 접합체의 포획을 차단하므로, 뚜렷한 라인이 발생하지 않을 것이다. 이어서, 미결합 접합체가 포획 대역에서의 항체와 결합하여 가시적인 조절 라인을 제공할 것이다. 막 위의 단일 조절 라인은 양성 결과이다. 포획 및 조절 대역에 2개의 가시적인 라인들은 음성 결과이다. 그러나, 과량의 비표지된 표적 분석물이 존재하지 않는 경우, 약한 라인이 포획 대역에 나타날 수 있어 결론지을 수 없는 결과를 시사한다. 측면 유동 기술에는 많은 변형들이 있다. 막 위의 포획 대역은 항체가 아니라, 표적 분석물에 따라서 고정화된 항원 또는 효소를 함유할 수 있다. 복합적 검사를 고안하기 위해 다중 포획 대역을 적용하는 것도 또한 가능하다. 예를 들면, 동일 샘플에서 EHEC 시가(Shiga) 독소 ST1 및 ST2 둘 다를 별도로 검출할 수 있는 상업적인 검사 스트립이 개발되었다.
중요하게, 본 발명의 항체는 개 또는 고양이에서 소양성 및/또는 알레르기성 질환을 진단하는데 유용할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 항체는 반려 동물에서 IL-31의 과발현을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 중요한 면역조직화학 도구를 제공할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 발현 프로필을 측정하는데 매우 적합한 항체 어레이(array) 상에 사용될 수 있다.
키트
본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 상기 키트는 최소한, 하나 이상의 본 발명의 항체, 이를 암호화하는 핵산 또는 이를 함유하는 세포를 포함한다. 한 태양에서, 본 발명의 항체는 용기중에 통상적으로 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 표지 또는 독소와 접합되거나 또는 비접합될 수 있는 항체는 전형적으로, 트리스, 포스페이트, 카보네이트 등과 같은 완충제, 안정화제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민 등과 함께 키트에 포함된다. 일반적으로, 상기 물질들은 활성 항체의 양을 기준으로 5 중량% 미만으로 존재하며, 통상적으로 또한 항체 농도를 기준으로 약 0.001 중량%의 총량으로 존재할 것이다. 흔히, 활성 성분을 희석하기 위해 불활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직한데, 이때 부형제는 전체 조성물의 약 1 내지 99 중량%로 존재할 수 있다. 제 1 항체에 결합할 수 있는 제 2 항체를 분석에 사용하는 경우, 이것은 통상적으로 별도의 바이알에 존재할 것이다. 제 2 항체는 전형적으로 표지에 접합되며 전술한 항체 제형과 유사한 방식으로 제형화된다. 키트는 일반적으로 사용 설명서 세트를 또한 포함한다.
한 태양에서, 본 발명에 따른 키트는 샘플중 개 또는 고양이 IL-31 단백질을 검출하는데 유용한 검사 스트립 키트(측면 유동 면역분석 키트)이다. 상기 검사 스트립은 전형적으로 그 위에 검사 샘플이 적용되는 샘플 패드; 개 또는 고양이 IL-31에 특이적인 항체를 함유하는 접합체 또는 시약 패드(여기서, 항체는 착색된 입자(통상적으로 콜로이드성 금 임자)에 접합된다); 그 위에 항-IL-31 항체가 포획 대역 또는 검사 라인으로 막을 가로질러 한줄로 고정화되는 반응막(접합체 항체에 특이적인 항체를 함유하는 조절 대역도 또한 존재할 수 있다); 및 모세관 작용에 의해 샘플을 반응막을 가로질러 흡수하고 수집하도록 설계된 추가의 흡수성 패드를 포함할 것이다. 검사 스트립 키트는 일반적으로 사용 설명서를 또한 포함한다.
본 발명을 이제 하기의 비-제한 실시예로 더 설명한다.
실시예
실시예 1. 개 인터루킨 31(IL-31)을 인식하는 마우스 단클론성 항체의 확인
서열번호 32의 서열을 갖는 분비된 개의 IL-31 단백질을 생성하기 위해 크로모스(CHROMOS) ACE(Artificial Chromosome Expression, 인공 염색체 발현) 시스템(크로모스 몰레큘라 시스템즈, 인코포레이티드(Chromos Molecular Systems, Inc.,), 브리티시 컬럼비아 바나비 소재)을 사용하여 CHO 세포에서 재조합 개 IL-31을 생성하였다. 상기 단백질은 서열번호 33의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 세포 배양물(CHO 세포주)(400 ml)로부터 조정 배지를 수득하고, 10 부피의 QA 완충액(20 mM 트리스(pH 8.0), 20 mM NaCl)으로 4.5 시간동안 투석시켰다. 투석된 배지를 0.2 ㎛ 여과시키고, QA 완충액으로 미리-평형화시킨 소스(SOURCE, 등록상표) Q 컬럼 상에 1 ml/분으로 부하시켰다. 단백질은 다단계 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. IL-31의 대부분이 유체 통과(flow through, FT) 분획에 잔류하였으며, 소량의 IL-31이 구배 초기에 용출되었다. 단백질의 정체는 트립신 절단물의 웨스턴 면역블로팅(Western immunoblotting) 및 질량분석(MS) 분석법으로 미리 확인하였다. FT 분획 중 단백질을 4 내지 5배 농축하고 4 ℃에서 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 밤새 투석하였다. 단백질의 안정성은 PBS내로의 투석 후에 검사하였다. 4 ℃에서 수일후에 침전이 관찰되지 않았으며, 단백질분해도 관찰되지 않았다. N-글리코시다제 F를 사용한 탈-글리코실화 실험은 SDS-PAGE 상에서 약 15 kDa의 단일 밴드로의 단백질 농축을 야기하였다. 단백질 농도는 표준물로서 소 혈청 알부민(BSA)(터모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드(ThermoFisher Scientific, Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용한 바이신코닌산(bicinchoninic) 분석법(BCA 분석법)을 이용하여 측정하였다. 단백질 용액을 분취량으로 나누고, 순간 냉동(액체 N2)시키고, -80 ℃에서 저장하였다.
CHO 세포에서 생성된 재조합 개 IL-31을 사용한 암컷 CF-1 마우스의 표준 면역화를 이용하여 마우스 단클론성 항체를 확인하였다. 면역화된 마우스로부터의 역가는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 이용하여 측정하였다. 개 IL-31(50 ng/웰)을 폴리스티렌 마이크로플레이트에 고정화시키고, 포획 항원으로 사용하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청을 0.05% 트윈(tween)-20을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBST)에 희석하였다. 마우스 항-개 IL-31 항체의 존재는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-마우스 제 2 항체(커크가드 앤 페리 래버러토리즈, 인코포레이티드(Kirkegard & Perry Laboratories(KPL), Inc.), 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)를 사용하여 검출하였다. 발색 기질(슈어블루 리저브 TMB 1-성분 마이크로웰 퍼옥시다제 기질(SureBlue Reserve TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate), KPL Inc.)을 첨가하고 실온(RT)에서 10 분간 배양한 후, 0.1 N HCl(100 ㎕)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 각 웰의 흡광도를 450 nm의 광학 밀도(OD)에서 측정하였다. 도 6은 개 IL-31로 면역화된 개개 마우스의 항체 반응을 요약한 것이다. 마우스 3 및 4로부터의 공여체 비장세포의 풀(pool)을 융합에 사용하였다. 융합하고 직접 ELISA에 의해 항 IL-31 결합에 대해 선별한 후에, 100개 웰을 항-IL-31 활성의 확장 및 2차 선별을 위해 선택하였다. 2차 선별에 의해 81개 융합체가 항 IL-31 항체를 생성하는 능력을 보유하였음을 확인하였다. 상기 81개 후보들로부터의 냉동된 세포 저장액 및 상등액을 추가의 평가를 위해 보존하였다.
억제 활성을 갖는 후보를 확인하기 위해, 81개 상등액 모두를 세포-기초 분석법에서 IL-31-매개된 pSTAT 신호전달에 영향을 미치는 그의 능력에 대해 평가하였다. 상기 세포-기초 분석법은, IL-31 수용체 발현을 증가시키기 위해, IL-31 처리 전에, 개의 감마 인터페론(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)으로 10 ng/ml로 24 시간동안 전처리되고 2 시간동안 혈청을 결핍시킨 개 DH-82 단핵구 세포에서의 pSTAT 신호전달을 측정한다. 상기 전처리 후에, 재조합 개 IL-31을 1 ㎍/ml로 5 분동안 첨가하고, 알파 스크린(Alpha Screen) 기술(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 월탐 소재)을 이용하여 STAT 포스포릴화를 평가하였다. 하이브리도마 상등액 중에서의 항체 농도 및 순도를 모르기 때문에, 이들 상등액을, 상등액의 1:2 또는 1:20 희석액을 사용하여 1 ㎍/ml의 IL-31과 함께 1 시간동안 공-배양한 후 STAT 포스포릴화를 억제하는 그의 능력에 대해 정성적으로 측정하였다. 상기 실험으로부터 미처리 웰에 비해 STAT 포스포릴화의 >50%를 억제한 31개의 상등액을 확인함으로써, 정제 및 추가의 특성화가 타당화되었다.
각 단클론성 항체(mAb)의 정제 및 정량 후에, 31개 항체 전부의 IC50 값을 DH-82 세포 분석에서 평가하였다. 수득된 IC50 값, 및 에피토프 저장소(bin)에 근거하여 항체 부류를 정의하기 위한 경쟁적 ELISA를 기준으로, 표 1에 기재된 3개의 항체, 11E12, 19D07 및 34D03을 추가의 특성화를 위해 진행시켰다.
[표 1]
Figure 112016017353426-pat00005
실시예 2. 11E12 , 19D07 및 34D03 항체를 암호화하는 서열
Rneasy-미니 키트(키아겐 인코포레이티드(Qiagen, Inc.), 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재)를 제조사에서 설명한 대로 사용하여 하이브리도마 세포 11E12, 19D07 및 34D03으로부터 리보핵산(RNA)을 단리하였다. 각각의 하이브리도마로부터 백만개의 냉동 세포를 원심단리에 의해 수거하고, Rneasy 스핀 컬럼을 프로토콜에 기술된 방법에 따라 사용하여 세포 용해물로부터 RNA를 정제하였다. RNA를 각 컬럼으로부터 용출시키고 정량화 및 cDNA 제조를 위해 바로 사용하였다. RNA를 GeneQuant 프로 분광광도계(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 260 nm 및 280 nm에서 그의 흡광도를 측정함으로써 수율 및 순도에 대해 분석하였다. 단리후에, 남은 RNA는 추가 사용을 위해 -80 ℃에서 저장하였다.
마우스 면역글로불린(Ig) 가변 도메인의 증폭을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조사의 지시(이엠디 케미칼스 인코포레이티드(EMD chemicals, Inc.), 미국 뉴저지주 깁스타운 소재)에 따라 사용하였다. 터모스크립트(thermoscript) RT 키트(인비트로겐 코포레이션)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 역전사(RT)에 의해 전체 하이브리도마 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 각각의 하이브리도마로부터 200 내지 400 ng의 RNA를 3' Ig 불변 영역 프라이머를 함유하는 개개 반응 튜브에 가하였다. 3' 불변 Ig 프라이머는 가변 Ig 영역에 근접하게 위치하여 마우스 항체의 가변 영역을 나타내는 제 1 가닥 cDNA를 전사할 것이다. 각각의 하이브리도마 RNA의 경우, 개별적 RT 반응은 3' 불변 중쇄 및 3' 불변 카파 경쇄 프라이머를 사용하여 수행하였다.
각 하이브리도마로부터의 cDNA를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 주형으로 사용하여 서열 결정을 목적으로 가변 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 cDNA를 증폭시켰다. 마우스 Ig 가변 도메인의 신호 서열-암호화 영역에 어닐링되도록 설계된 축퇴 5' 프라이머 또는 프라이머 풀을 사용하여 각각의 PCR에 대해 여러번의 반응을 수행하였다. 뮤린 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역들의 증폭을 위해 축퇴 프라이머 또는 프라이머 풀을 사용하여 별도의 PCR 반응들을 수행하였다(도 7). PCR은 익스팬드 하이 피델리티(Expand High Fidelity) DNA 폴리머라제 키트(로슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corp.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 cDNA 반응액(1 ㎕)에 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 열순환 파라미터는 다음과 같다: 94 ℃에서 2분, 35 주기(94 ℃에서 15 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분), 72 ℃에서 7 분. PCR로부터 증폭된 단편들은 1% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 단리하고 키아겐 겔 추출 키트(키아겐 인코포레이티드(Qiagen Inc.), 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재)를 사용하여 정제하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 위한 정방향 프라이머는 EcoRI 또는 SalI(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs(NEB) Inc.), 미국 매사추세츠주 입스위치 소재) 부위를 혼입시키고 중쇄 및 경쇄 가변 HindIII(NEB 인코포레이티드)를 역전시켜 pUC19 플라스미드 내로의 클로닝을 촉진하였다. 정제된 PCR 단편 및 pUC19 플라스미드를 37 ℃에서 1 내지 2 시간동안 상기 제한 엔도뉴클레아제로 절단하였다. 절단한 후, PCR 단편을 키아퀵(Qiaquick) PCR 클린업 키트(키아겐 인코포레이티드)를 사용하여 정제하였다. 절단된 플라스미드를 1% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 단리하고, 키아겐 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 가변 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 DNA를 나타내는 정제된 PCR 단편을 4 ℃에서 T4 DNA 리가제 및 접합 완충액(NEB 인코포레이티드)을 사용하여 밤새 pUC19 플라스미드 내에 접합시켰다. 각각의 접합 반응액(3 ㎕)을 사용하여 이. 콜라이 TOP10 세포(인비트로겐 코포레이션)를 형질전환시켰다.
키아겐 미니 프레프 키트(키아겐 27106)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 각 하이브리도마의 가변 영역을 나타내는 양성 클론들로부터 플라스미드를 단리하였다. M13 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여, 빅다이(BigDye) 서열분석 반응물(어플라이드 바이오시스템즈 바이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Applied Biosystems by Life Technologies Corp.), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여 각각의 클로닝된 삽입물에 대해 DNA 서열을 증폭시켰다. 96 웰 정제 키트(지모 리서치(Zymo Research), 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 서열분석 반응물을 정제하였다. 샘플을 ABI-3730 모세관 서열분석기 상에 부하시키고, 생성된 서열 흔적들을 시퀀처(Sequencher)(진코드즈(GeneCodes) v. 4.2)를 사용하여 완전 개방 해독 프레임의 존재에 대해 분석하였다. 각 항체에 대해 결정된 뮤린의 항 개 IL-31 가변 서열들은 다음과 같다: 11E12 가변 경쇄(서열번호 19 MU-11E12-VL, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34이다), 11E12 가변 중쇄(서열번호 26 MU-11E12-VH, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 35이다), 19D07 가변 경쇄(서열번호 22 MU-19D07-VL, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 36이다), 19D07 가변 중쇄(서열번호 28 MU-19D07-VH, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 37이다), 34D03 가변 경쇄(서열번호 24 MU-34D03-VL, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 38이다), 및 34D03 가변 중쇄(서열번호 30 MU-34D03-VH, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 39이다).
각각의 항체 가변 중쇄 및 경쇄로부터 유도된 cDNA 서열의 유효성을 확인하기 위해, 어플라이드 바이오시스템즈 모델 494 가스상 단백질 서열분석기 상에서 에드만(Edman) 분해를 이용하여, 정제된 mAb 단백질 상에서 N-말단 서열 분석을 수행하였다. 하기의 표 2는 항체 11E12 및 34D03에 대한 가변 경쇄 서열 및 34D03의 가변 중쇄 서열의 확인 결과를 나타낸 것이다. cDNA 서열의 번역에 의해 유도된 항체 11E12의 가변 중쇄의 N-말단 아미노산은 글루타민인 것으로 확인되었다. 단백질의 아미노 말단 잔기로서 글루타민은 자발적으로 피로글루탐산으로 환화되어, 에드만 분해에 의한 서열 결정을 방지할 수 있다[Chelius et al., Anal Chem. 78(7):2370-2376 (2006)].
[표 2]
Figure 112016017353426-pat00006
실시예 3. 11E12 , 19D07 및 34D03 키메라 항체의 제조
전술한 바와 같이, 항체들은 2개의 헤테로이량체성 단백질이 쌍을 이루는 호모이량체로 이루어진다. 헤테로이량체의 각각의 단백질 쇄(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄)는 가변 도메인 및 불변 도메인으로 이루어진다. 각각의 가변 도메인은 항원 결합에 기여하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. CDR은 가변 도메인에서, 항체 상의 결합 부위의 적절한 공간 연출을 위한 뼈대를 제공하는 프레임워크 영역에 의해 단리된다. CDR 및 프레임워크 영역은 함께 그의 동족 항원에 결합하는 항체 능력에 기여한다(도 2).
상기에서 더 기술한 바와 같이, 키메라 항체는, 개 IgG 분자의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 위에 그라프트된 마우스 항체(상기 서열 분석에서 결정된 바와 같은)로부터의 가변 서열(CDR 및 프레임워크 둘 다)로 이루어진다(도 3). 가변 도메인은 항원 결합에 관여하기 때문에, 개 불변 영역 상으로의 전체 마우스 가변 도메인의 그라프팅은 IL-31 면역원에 결합하는 항체의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역의 정확한 서열이 확인된 것을 확인하는 동시에 재조합 동종 물질을 생성하기 위해, 포유동물 발현 시스템에서 키메라 항체를 생성하기 위한 발현 벡터를 생성하였다. 하이브리도마 11E12, 19D07 및 34D03으로부터 유도된 항체 서열의 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하였다. 포유동물 세포주로부터 재조합 항체의 발현 및 분비를 촉진하기 위해 단일 제한 엔도뉴클레아제 부위, 코작(Kozak) 공통 서열 및 분비 리더 서열을 각각의 정방향 프라이머 내에 혼입시켰다. 각각의 가변 중쇄 및 경쇄를 증폭시키기 위해 각각의 역방향 프라이머를 설계하였으며, 이들은 클로닝을 촉진하기 위해 단일 제한효소 부위를 포함하였다. 각 반응에 대한 주형으로 클로닝된 하이브리도마 가변 쇄 항체 DNA를 사용하여 각각의 중쇄 및 경쇄를 증폭시키기 위해 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 생성물을, 각각 진뱅크 수탁번호 AF354264 또는 AF354265 및 XP_532962로부터의 서열을 기준으로 개 IgG 중쇄(본원에서 HC-64 또는 HC-65로 지칭됨) 또는 경쇄(본원에서 카파로 지칭됨) 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 플라스미드 내에 클로닝하였다. HC-64의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 40 및 41로 나타낸다. HC-65의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 42 및 43으로 나타낸다. 카파의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 44 및 45로 나타낸다. CMV 프로모터의 조절하에 각각의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 표준 리포펙타민(lipofectamine) 방법을 이용하여 HEK293 세포 내에 동시-형질감염시켰다. 발현 6 일 후에, 표준 단백질 정제 방법에 따라서 MabSelect SuRe 단백질 A 수지(지이 헬쓰케어)를 사용하여 일시 형질감염된 HEK293FS 세포 상등액(30 ml)으로부터 키메라 mAb를 정제하였다. 용출된 분획들을 모아서, 10,000 공칭 MW 컷오프 나노세프 오메가(Nanosep Omega) 원심단리 장치(폴 코포레이션(Pall Corp.), 미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재)를 사용하여 약 500 ㎕로 농축하고, 4 ℃에서 1x PBS(pH 7.2)로 밤새 투석시키고, 추후의 사용을 위해 4 ℃에서 저장하였다.
키메라성 개 IgG의 발현은 천연적 및 변성 조건하에서 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동(SDS PAGE)을 이용하여 평가하였다. 각각의 형질감염으로부터 단클론성 항체(mAb)를, 제조사의 프로토콜에 따라 SDS MES 전기영동 완충액(인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아 칼스배드)을 사용하여 4 내지 12% 비스 트리스 겔 상에서 단리하였다. 전기영동 후에, 단백질을 심플리 블루 쿠마시 염색(Simply Blue Coomassie Stain)(인비트로겐 코포레이션)으로 가시화시켜 적절한 쌍형성이 일어났는지를 확인하고 단백질 동질성을 대략 평가하였다. 재조합 mAb가 개 IL-31에 결합하는 능력을 보유하였는지 여부를 평가하기 위해, 웨스턴 블롯에 의해 mAb를 개 IL-31에 결합하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 표준 단백질 및 재조합 개 IL-31(800 ng)을, 인비트로겐 iBlot 장치(인비트로겐 코포레이션)를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 SDS PAGE 상에서 단리하였다. 옮긴 후에, 막을 증류된 탈이온수로 세척하고, 실온에서 0.05% 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBST) 중의 5% 탈지 분유(NFDM)로 1 시간동안 차단하였다. 차단 후에, 막을 PBST로 세척하고, 일시적 발현으로부터 얻은 희석된 상등액 또는 정제된 키메라 항체와 함께 배양하였다. 키메라 항체의 결합은, RT에서 1 시간동안 PBST 중 1:5000 희석률로 염소 항-개 IgG 항체-퍼옥시다제 접합체(베틸 래버러토리즈 인코포레이티드(Bethyl Laboratories Inc.), 미국 텍사스주 몽고메리, 또는 록랜드 소재, 임뮤노케미칼스 인코포레이티드(Immunochemicals Inc.), 미국 펜실베니아주 길버츠빌 소재)를 사용하여 평가하였다. IL-31 결합의 확인은 블롯(케이피엘 인코포레이티드(KPL Inc.), 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)에 TMB 기질의 부가후에 개 IL-31의 글리코실화 형태에 상응하는 측색 밴드(겉보기 분자량 15 kDa)의 존재에 의해 결정하였다.
웨스턴 블롯에 의해 HEK293 세포로부터의 발현 및 재조합 개 IL-31 면역원에 대한 결합을 나타내는 키메라 mAb를 친화도 및 기능성에 대해 더 분석하였다. 후보 mAb가 IL-31에 결합하는 친화도를 특성화하기 위해, 비아코어(Biacore) 시스템(비아코어 라이프 사이언시즈(Biacore Life Sciences)(지이 헬쓰케어))을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 평가하였다. 항체를 표면에 고정화시킬 때 일어날 수 있는 차등 표면 제조와 연관된 친화도 차이를 배제하기 위해, IL-31을 표면에 직접 접합시키는 방법을 사용하였다. N-하이드록시숙신이미드(NHS)/1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC) 화학을 이용하여 5 ㎍/ml IL-31을 아민 커플링시켜 고정화를 수행하였다. 칩들을 에탄올아민으로 급냉시키고 모든 후보 mAb가 고정화된 IL-31에 결합되는 친화도를 평가하였다. 모든 곡선은 1:1 모델로 피팅하였다. E-11 미만의 친화도는 기기에 대한 검출의 정량화의 하한점 미만이다.
모든 후보 mAb를 또한 2개의 독립적인 형식으로 세포-기초 분석법에서 IL-31 신호전달을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 공-배양 형식에서, mAb:IL-31 복합체를 1 시간동안 예비-배양하여 세포 첨가 전에 복합체 형성을 확실하게 하였다. mAb 사이의 구별 가능성을 증가시키기 위해, 공-배양은 빠지고 mAb를 IL-31 첨가후 5 분동안 세포에 직접 부가하는 두번째 실험 세트를 수행하였다. 두 경우 모두에서, IL-31 자극은 5 분동안 일어났다. 하기 표 3에 개략된 바와 같이, 마우스 단일클론 11E12, 19D07 및 34D03의 개 키메라 형태로의 전환은 IL-31에 결합하거나 또는 세포-매개 신호전달을 억제하는 그의 능력에 거의 영향을 미치지 않았다. 상기 결과들은 또한 각각의 마우스 하이브리도마로부터 정확한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 유도되었음을 입증한다.
[표 3]
Figure 112016017353426-pat00007
실시예 4. 키메라 mAb의 생체내 평가
DH-82 분석에서 관찰된 IL-31 매개 세포 신호전달의 억제가 개에서 IL-31-매개된 소양증의 억제와 상관되는 것을 확인하기 위해, 표 3에서 전술한 키메라 11E12 단클론성 항체(키메라 11E12-64)를 IL-31 개 소양증 모델에서 평가하였다. 상기 모델에서, 개 IL-31은, 1 내지 1.5 ㎍/kg의 용량으로 정맥내(IV) 투여시, 2 시간의 관찰 기간동안 정량할 수 있는 신속 발현되는 일관된 소양성 반응을 야기한다. 소양성 반응을 평가하기 위해, 개를 단일 수용 우리에 두고, 비디오 감시를 이용하여 소양성 활성 측정을 수행하였다. 1 시간 이상의 순응 기간 후에, 소양증 기준선 점수를 카테고리별 점수 체계를 이용하여 실시간 비디오 감시에 의해 각각의 개에 대해 측정하였다. 특히, 연속적인 1 분 간격으로, 소양성 행동이 각각의 개에 의해 보여지는지 여부에 관해 "예/아니오"를 결정하였다. 발, 옆구리 및/또는 항문 부위의 핥기/씹기, 옆구리, 목 및/또는 바닥 긁기, 머리 흔들기, 및 우리 바닥을 가로질러 바닥에 엉덩이를 끌고다니기와 같은 동작과 같은 소양성 행동은 지정된 시간 간격에 걸쳐 "예" 반응을 유출하기에 충분하였다. 상기 기간 마지막에, 예로 결정된 수를 합계하여 누적 소양성 점수 지수(Pruritic Score Index, PSI)를 산출한다. 소양성 점수는 각 동물에 대해 2회 측정하였으며, 첫번째 측정은 검사-조항 처리 기간 개시 직전에 측정된 30분 기준선 점수이다. 각 스케줄에 따른 관찰 기간 완료 후, 개들을 그의 정상적인 수용 위치로 돌려보냈다.
키메라 11E12-64의 피하(SC) 투여가 IL-31-매개 소양증을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 처리군 및 위약군(N = 4/군) 둘 다를 포함하는 파일럿 연구(76A03)를 수행하였다. 이 연구에서, 8 마리 개 전부에 기준선 반응을 수행하였으며, 개들을 무작위로 그룹으로 나누고 그의 PSI를 기준으로 수용하였다. 중요하게, 각각의 그룹은 2 마리의 고 응답동물(PSI > 55) 및 2 마리의 중간 응답동물(PSI = 30 내지 55)로 이루어졌다. 이어서, 상기 개들에게 제 7 일에 키메라 11E12-64를 투여하고, 제 8, 14 및 22 일에 IL-31 자극(challenge)을 수행하였다. 상기 연구의 결과는 도 8에 나타내었다. 상기 결과는 키메라 11E12-64의 투여가, 11E12-64 처리된 동물의 경우, 제 1 일에 비해 제 8 일 및 14 일에 평균 PSI에 75%보다 큰 감소를 야기하였음을 보여준다. 이것은 미처리 동물의 경우 PSI 점수에서 37 내지 51%의 증가와 대조적이다. PSI는 mAb 처리 2 주후에 기준선으로 복귀되어, 투여된 0.3 mg/kg 용량에 있어 1 내지 2 주의 효능의 지속성을 시사하였다.
PSI를 평가할 때 특정한 자극은 개의 소양성 행동과 관련된 나날의 변화이다. 상기 변화에 대한 제어를 용이하게 하기 위해, IL-31 자극 전 매일 각각의 개에 대해 30분 기준선 PSI를 측정하였다. 도 9는 상기 연구(76A60)에 등록된 개들로부터의 개별적 소양성 점수를 나타낸 것이다. 도 9의 데이터는 제 8 일 및 14 일 기준선 PSI가 키메라 11E12-64 처리 군에서 IL-31 자극 후의 약 25%였음을 보여준다. 상기 관찰결과는, 기준선 관찰 시한(0.5 시간)이 IL-31 이후 관찰 시한(2 시간)의 25%이기 때문에 IL-31 관련 소양증의 완전한 억제와 일치한다. 포괄하여, 상기 생체내 데이터는 1) 키메라 11E12 단일클론이 개에서 소양증을 유발하는 IL-31의 능력을 중화시킬 수 있고, 2) 세포 기초 분석에서 IL-31 매개 신호전달의 억제가 생체내 효능과 상관되며, 3) mAb 평가에 상기 IL-31 모델을 사용하기 위해 필요한 파라미터들이 다른 후보 항체의 평가를 위해 설정된다는 매우 강한 증거를 제공한다.
실시예 5. 개화(caninization) 방법
항-약물 항체(ADA)의 생성은 단클론성 항체를 포함하여 임의의 바이오치료 단백질에 대한 효능의 손실과 연관될 수 있다. 문헌의 종합적인 평가는 단클론성 항체의 종분화가 mAb가 면역원성이 될 경향을 감소시킬 수 있지만 면역원성 완전 인간 mAb 및 비-면역원성 키메라 mAb의 예들을 확인할 수 있음을 보여주었다. 본원에서 제공된 마우스 항 IL-31 단클론성 항체에 대한 ADA 형성과 연관된 위험성을 완화시키기 위해, 개화 방법을 사용하였다. 상기 개화 방법은 CDR 그라프팅에 가장 적절한 개 생식세포(germline) 항체 서열을 확인하는 것을 기초로 한다(도 4). 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 모든 이용가능한 개 생식세포 서열의 광범위한 분석 후에, 마우스 mAb에 대한 그의 상동성을 기준으로 생식세포 후보를 선택하고, 마우스 원조 mAb로부터의 CDR을 사용하여 천연 개 CDR을 대체하였다. 목적은 생체내 면역원성의 가능성을 최소화시키기 위해 완전 개 프레임워크를 사용하여 고 친화성 및 세포-기초 활성을 보유하는 것이었다. 개화된 mAb를 발현시키고 웨스턴 블로팅에 의해 IL-31에 결합하는 그의 능력에 대해 특성화하였다. 상기 결과는 하기 실시예 8에 기술되어 있다. 개화된 후 IL-31에 결합하는 능력을 보유한 mAb 만을 추가의 특성화를 위해 진행시켰다. IL-31에 결합하는 능력을 상실한 mAb는 1) 기능 상실의 원인이 되는 쇄, 2) 기능 상실의 원인이 되는 프레임워크, 및 3) 기능 상실의 원인이 되는 아미노산(들)을 확인하기 위해, 조직적으로 분석하였다.
실시예 6. 11E12 , 19D07 및 34D03 항체의 개화
mAb 11E12, 19D07 및 34D03의 개화된 가변 중쇄 및 경쇄를 대표하는 합성 뉴클레오티드 구조물을 제조하였다. 각각의 가변 쇄를 각각의 개 중쇄 또는 카파 불변 영역을 함유하는 플라스미드 내에 서브클로닝한 후, 플라스미드를 HEK293 세포에서의 항체 발현을 위해 동시-형질감염시켰다. 요약하면, 19D07 및 34D03 mAb 둘 다 개화될 때 IL-31 결합을 유지하였다. 각 항체에 대해 결정된 개화된 항-개 IL-31 가변 서열은 다음과 같다: 19D07 가변 경쇄(서열번호 23 CAN-19D07-VL-998-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46이다), 19D07 가변 중쇄(서열번호 29 CNA-19D07-VH-400-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 47이다), 34D03 가변 경쇄(서열번호 25 CAN-34D03-VL-998-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 48이다), 및 34D03 가변 중쇄(서열번호 31 CAN-34D03-VH-568-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 49이다).
대조적으로, 11E12 개화 작업에 사용된 생식세포 서열은 특정한 비-기능성 mAb를 야기하였다. 도 10과 관련하여, mAb 11E12의 키메라, 헤테로키메라 및 개화된 버전을 발현시켰으며, 웨스턴 블로팅에 의해 개 IL-31에 결합하는 그의 능력에 대해 특성화하였다. 상기 결과들은 개화된 11E12 항체가 개 IL-31에 결합하지 않음을 보여주었다(블롯 #2). 또한, 헤테로키메라와 관련하여, 개화된 경쇄와 짝을 이룬 키메라 중쇄는 IL-31 결합을 상실한(블롯 #3) 반면, 키메라 경쇄와 짝을 이룬 개화된 중쇄는 IL-31 결합 활성을 보유하였다(블롯 #4). 헤테로키메라로부터 수득된 결과에 근거하여, 개화된 경쇄가 활성 상실에 원인이 된 것으로 추정하였다.
11E12의 개화된 버전의 개 IL-31에 대한 결합을 회복시키기 위한 작업으로, 프레임워크 서열을 교환함으로써 개화된 경쇄를 변형시켰다. 도 11은 11E12 경쇄 프레임워크 치환 작업의 개관을 나타낸 것이다. 상기 작업은 개 프레임워크 II(FWII)를 마우스 프레임워크 II로 치환하고 개 IL-31에 대한 결합을 회복한 항체를 확인하였다[11E12 가변 경쇄(서열번호 20 CAN-11E12-VL-cUn-FW2, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50이다), 11E12 가변 중쇄(서열번호 27 CAN-11E12-VH-415-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 51이다)].
상기 역돌연변이의 추가의 개선에 의해 프레임워크 II에 단일 아르기닌의 류신으로의 역돌연변이(R50L)를 갖는 항체가 웨스턴 블롯 분석에 의해 IL-31 결합을 회복할 수 있음을 확인하였다[11E12 가변 경쇄(서열번호 21 CAN-11E12-VL-cUn-13, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52이다), 11E12 가변 중쇄(서열번호 27 CAN-11E12-VH-415-1)](도 12). 일단 각각의 가능한 후보의 '개화된' 버전이 확인되면, 추가의 평가를 위해 mAb를 정제하고 PBS에 투석하였다. 표 4는 친화도 측정 및 세포-기초 억제 데이터 둘 다의 결과를 요약한 것이다. 이들 데이터는 11E12 및 34D03 둘 다의 개화된 유도체가 세포 기초 분석에서 탁월한 억제 활성 및 비아코어로 측정한 바와 같은 IL-31에 대한 친화도를 보유함을 입증하였다. 또한, 주목할 것은 원래의 개화된 19D07 분자가 비아코어로 측정한 바와 같은 탁월한 효능을 보유하지만, 세포 기초 IL-31 신호전달을 억제하는 능력은 그의 마우스 원조세포에 비해 약화된 것으로 보인다는 관찰결과이다. 그의 마우스 이소타입으로부터 개 유도체로 mAb를 전환시킬 때 친화도 손실은 거의 또는 전혀 일어나지 않았다.
[표 4]
Figure 112016017353426-pat00008
Figure 112016017353426-pat00009
실시예 7. 항체 11E12 및 34D03에 결합하는 개 IL-31의 특성화
항체 11E12 및 34D03에 대한 개 IL-31의 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 결정하기 위해, 1) N 및 C 말단 둘 다로부터 IL-31 단백질의 절두, 및 2) mAb 결합에 대한 영향을 측정하기 위한 알라닌으로 개개 아미노산의 치환(ala 스캔)을 포함하는 돌연변이 방법을 사용하였다. 이. 콜라이 숙주에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 개 IL-31 유전자를 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 설계하였다. 이. 콜라이 발현을 위한 상기 코돈-최적화된 개 IL-31 전장 구조물의 서열은 서열번호 55로 나타내며, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 56이다. 전장 유전자를 증폭시키고 N 및 C 말단으로부터 안쪽으로 이동하는 단백질의 20개 아미노산 절두체를 생성하기 위해 프라이머를 설계하였다. 상기 N-말단 절두화를 위해, 위치 1은 코돈-최적화된 구조물에서 N-말단 6-His 태그 바로 뒤의 글리신 잔기에 상응하였다. PCR 증폭 생성물을 제조사의 프로토콜에 따라 pET101D(인비트로겐 코포레이션)에 클로닝하였다. pET101D 플라스미드는 발현 확인을 위한 N-말단 6-His 에피토프 태그에 재조합 단백질의 융합을 가능하게 한다. 서열 확인된 플라스미드를 사용하여 BL21 Star TOP10 이. 콜라이 세포(인비트로겐 코포레이션)를 형질전환시키고, 표준 배양 조건하에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 사용하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 유도 후에, 세포를 펠릿화시키고 세균성 단백질 추출 시약(Bacterial Protein Extraction Reagents)(B-FER로 약칭됨, 터모피셔 사이언티픽 인코포레이티드(ThermoFisher Scientific Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 용해시켰다. 조 용해물을 SDS-PAGE에 적용시키고, 웨스턴 블로팅을 전술한 바와 같이 수행하였다. 돌연변이 분석을 위한 모든 웨스턴 블로팅은, 필수 정제 항체 및 시약의 이용가능성때문에 11E12 및 34D03의 마우스 버전을 이용하여 수행하였다. 각각의 항체를 전장 및 절두된 IL-31을 나타내는 조 단백질 용해물 블롯에 결합하는 그의 능력에 대해 검사하였다. 대조군 블롯도 또한 항-His mAb로 침지하여 각각의 단백질의 발현을 확인하였다. N-말단 절두된(-20N, -40N 및 -60N) 단백질은 모두 이. 콜라이에서 강한 발현을 나타내었으며, 11E12 및 34D03에 결합할 수 있었다(도 13). -20N 구조물에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 57 및 58이다. -40N 구조물에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 59 및 60이다. -60N 구조물에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 61 및 62이다. 그러나, 전장 IL-31 및 C-말단 절두된(-20C, -40C 및 -60C) 단백질은 상기 조건하에서 발현되지 못했다.
전장 IL-31 단백질은 매우 빈약하게 발현된 것으로 관찰되었다. 그러나, N-말단으로부터 처음 20개 아미노산이 제거된(-20N) 구조물은 강한 발현을 나타내었다. 항체 11E12 및 34D03은 모두 -20N 단백질에 결합하였다. 그러므로, 상기 -20N 구조물을 사용하여 추가의 작업을 수행하였다. 위치 20 내지 122(his 태그를 갖는 MW 15.3), 20 내지 100(his 태그를 갖는 MW 12.9), 및 20 내지 80(his 태그를 갖는 MW 10.4)에서 C-말단 절두를 나타내는 구조물들을 제조하여 IL-31 단백질의 상기 영역들에 대한 mAb 결합을 평가하였다. 20 내지 122 구조물에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 63 및 64이다. 20 내지 100 구조물에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 65 및 66이다. 20 내지 80 구조물에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 67 및 68이다. 도 14는 mAb 11E12(블롯 B) 및 34D03(블롯 C)로 침지된 상기 절두된 단백질들의 조 단백질 용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 상기 도면에서 보이듯이, mAb 11E12 및 34D03은 IL-31 절두 단백질 20-122 및 20-100에 결합하였지만, 20-80엔 결합하지 못하였다. 이러한 결과는 서열번호 55의 개 IL-31 전장 구조물(N-말단으로 "SSHMA" 사용)의 위치 80 내지 100 사이의 아미노산이 상기 항체의 결합에 관여함을 보여주었다. 상기 영역은 서열번호 32의 개 IL-31 전장 단백질 서열의 아미노산 잔기 102 내지 122 사이의 아미노산 번호들에 상응한다. 항-His mAb를 사용한 대조군 블롯(블롯 A)는 모든 절두 단백질이 발현되었음을 나타내었다. 또한, pET101D-lacZ 단백질을 대조군으로 사용하여 숙주 단백질에 대한 mAb의 비-특이적 결합의 결여를 확인하였다.
mAb 11E12 및 34D03에 대한 결합에 관여하는 개 IL-31 중의 아미노산을 더 확인하기 위해, 알라닌-스캐닝 돌연변이유발을 공지된 방법에 따라 수행하였다. 아미노산 76 내지 122로부터 개 IL-31 상의 각 위치에 알라닌을 치환시키는 개개의 구조물들을 제조하였다(-20N 플라스미드에서). 서열 확인 후에, 단백질 발현을 수행하고, 조 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 도 15는 알라닌으로 돌연변이될 때 mAb 11E12 및 34D03에 의한 결합에 영향을 미치는, 개 IL-31 상의 위치를 나타내는 결과의 요약을 나타낸 것이다. 상기 도면에서 나타나는 바와 같이, 전장 IL-31 구조물의 위치 77, 78, 81 및 85는 모두 11E12 또는 34D03 항체의 결합에 영향을 미친다. 이들은 각각 서열번호 32의 개 IL-31 전장 단백질 서열의 아미노산 잔기 99, 100, 103 및 107에 상응한다.
11E12 및 34D03 항체에 대한 결합에 중요한 IL-31의 영역에서의 다중 돌연변이의 영향을 조사하기 위해, 이중(D82A, I85A) 및 삼중(I81A, D82A, I85A) 알라닌 치환을 갖는 발현 플라스미드를 제작하였다. -20N 조절 외에 상기 이중 및 삼중 돌연변이를 갖는 개 IL-31을 발현하는 이. 콜라이 용해물을 11E12 및 34D03 항체를 사용하여 블로팅하였다(도 16). 개 IL-31 상의 상기 3개의 아미노산은, 이들 부위가 알라닌으로 변화되었을 때 결합의 완전한 억제가 관찰되므로, 11E12 및 34D03의 인식에 관여됨이 분명하다. 이들 3개의 아미노산은 서열번호 32의 개 IL-31 전장 단백질 서열의 아미노산 잔기 103, 104 및 107에 상응한다.
요약하면, 개 IL-31의 절두 분석에 의해 아미노산 잔기(도 15에 위치 80과 120 사이에 주석이 달려있음)는 11E12 및 34D03 항체와 결합하는데 관여됨이 밝혀졌다. 또한, 알라닌 스캐닝을 이용한 순수 돌연변이 분석에 의해 전장 IL-31 구조물의 ASP77, LYS78, ILE81, ASP82 및 ILE85 모두 11E12 또는 34D03의 결합에 영향을 미쳐 상기 영역이 아마 상기 항체들에 의한 인식을 담당하는 에피토프를 결정함을 시사하는 것으로 드러났다. 흥미롭게도, 인간 IL-31 단백질의 상기 영역은 그의 보조수용체의 GPL 하위단위에 대한 결합에 관여되는 것으로 밝혀졌다[Le Saux S et al., Biol Chem. 2010 Jan 29, 285(5):3470-3477, Epub 2009 Nov 17]. 단핵구에서 IL-31 매개 pSTAT 활성을 중화시키는 mAb 11E12 및 34D03의 능력과 함께, 상기 관찰결과는 상기 mAb가 상기 사이토카인을 그 수용체에 결합시키는데 필수적인 개 IL-31 상의 잔기에 결합함으로써 신호전달을 유도하는 그의 능력을 억제한다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 8. 글루타민 합성( GS ) 플라스미드로부터 개화 34D03 항체의 생성
개화 34D03 mAb(중쇄 및 경쇄, 상기 표 4)를 암호화하는 유전자를 GS 플라스미드 pEE 6.4 및 pEE 12.4 각각에(론자(Lonza), 스위스 바젤 소재) 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 제조사의 프로토콜에 따라 절단하고 함께 접합시켜 단일 포유동물 발현 플라스미드를 생성하였다. 각각의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시키고 20 L의 배양 배지 중에서 발현을 수행하였다. 표준 단백질 정제 방법에 따라서 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 조정된 HEK 배지로부터 단백질을 단리하였다. 배지를 크로마토그래피 수지 상에 부하시키고 pH 변화에 의해 용출시켰다. 용출된 단백질을 pH 조정하고 투석시키고 사용전에 멸균 여과시켰다. 생성된 항체는 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 99% 이상 단량체성이었으며 고분자량 응집체들은 관찰되지 않았다. 상기 항체는 이어서 생체내 효능을 평가하기 위한 개 소양증 모델에서의 평가에 사용하였다.
실시예 9. 개 소양증 모델에서 개화 34D03 항체의 평가
개화 34D03[서열번호 42(HC-65) 및 서열번호 44(LC-카파) 상에서 서열번호 25(VL)와 짝을 이룬 서열번호 31(VH)로 나타내는 CAN 34D03-65]의 항-소양 활성을 IL-31-유도성 소양증의 개 모델을 이용하여 평가하였다. 상기 모델을 이용하여, 비글에서 일시적 기간동안의 소양성 행동을 유도하는 것으로 알려진 재조합 개 IL-31의 1.5 ㎍/kg 정맥내 자극 용량(IL-31 자극, 소양증 기간 <24 시간)을, CAN 34D03-65의 단일 1.0 mg/kg SC 투약 전에 및 상기 투약 후 63 일까지 동물에게 반복적으로 전달하였다. 각각의 IL-31 자극 기간에, 실시간 비디오 감시를 이용하여 사이토카인 전달 전 0.5 시간동안(IL-31 기준선 기간 전) 소양성 행동을 측정한 후, 사이토카인 주사후 20 분에서 시작하여 유사하게 2 시간동안(IL-31 자극 기간 후 2시간) 측정하였다. 소양성 행동이 연속적인 1분의 시간-간격으로 나타나는지에 대해 "예/아니오"를 결정하는 것에 의한 평가하에 각 시기에서 소양성 점수를 산출하였다(최대 소양성 점수 = 각 기준선 기간동안 30; IL-31 자극 기간 후에 120). 도 17은 연구의 시작일(제 0 일)에 주어진, CAN 34D03-65 처리 전 및 후에 수득된 소양성 점수를 요약한 것이다. mAb 처리 수일 전에, 개의 평균 IL-31 자극후 소양성 점수는 68 ± 13이었다(S.E., n = 4). 비교로, 연구 제 7, 14, 21 일에, 평균 IL-31 자극후 소양성 점수는 각각 5 ± 2, 8 ± 4, 및 9 ± 5로 저하되었다. 제 7 일과 제 7 내지 21 일 사이의 소양성 점수에서의 상기 변화는 IL-31에 대한 전체 소양성 반응성에서 85% 이상의 감소를 나타낸다. IL-31-유도성 소양증의 억제 정도는, 제 0 일 내지 21 일 사이에, 0.5 시간 전-IL-31 기준선 점수가 2 시간 기간동안 6 내지 7의 소양증 점수로 추정되는 수준인 1.6 ± 0.6으로 평균되는 것을 고려한다면, 실제로 상기 기간동안 100%에 더 근접했을 수 있다. 외래 IL-31에 대한 처리된 개의 소양성 반응성은 시간 경과에 따라 점차 회복되었다. CAN D03-65 처리후 63 일까지, 평균 2 시간 IL-31 자극후 소양증 점수는 57 ± 8로, 또는 제 7 일에 관찰된 mAb IL-31 자극전 반응의 약 84%까지 증가되었다. 따라서, IL-31-유도성 소양증의 모델에서, CAN 34D03-65의 단일 볼루스(bolus) SC 주사는 처리된 개에게 몇주간 항-소양성 예방을 제공하였다.
실시예 10. 고양이 IL-31의 특성화
NCBI 게놈 공급원(www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 개 IL-31과 유사하게 고양이 게놈을 검색하여 고양이 IL-31의 서열을 확인하였다. 고양이 IL-31을 나타내는 유전자를 이. 콜라이에서의 최적 발현을 위해 합성하였다. 검출 및 정제를 위한 N-말단 6-His 태그를 함유하는 전장 개 및 고양이 IL-31 유전자를 사용하여 발현 구조물을 제조하였다. 이. 콜라이에서의 발현에 사용된 고양이 전장 구조물은 서열번호 69의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 70의 단백질 서열로 나타낸다. 서열 확인된 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 BL21 Star(등록상표)(인비트로겐 코포레이션)를 형질전환시키고, 30 ℃에서 5 시간동안 발현을 수행하였다. 세포 펠릿의 용해 후, 면역반응성 단백질이 불용성 용해물 중에 고도로 농축된 것으로 나타났다. 상기 세포 펠릿을 6 M 우레아에 용해시키고, 니켈 코발트 수지(터모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 사용하여 변성 조건하에서 재조합 단백질의 정제를 수행하였다. His 태그의 존재에 대해 양성인 것으로 나타난 용출 분획들을 모아서 0.8 M 우레아 PBS로 투석시킨 후 PBS로 투석시키고, SDS PAGE로 분석하였다(도 18). 앞에서 관찰된 바와 같이, 이. 콜라이 유도로부터 재조합 개 IL-31의 수율은 낮았다. 그러나, SDS-PAGE에 의해 예상된 분자 질량에 따라 이동된 단백질을 정제후에 회수하였다.
이. 콜라이로부터 생성된 개 및 고양이 IL-31의 생물 활성을 조사하기 위해, 각각의 단백질을 DH82 세포 분석에서 pSTAT 신호전달을 유도하는 그의 능력에 대해 분석하였다. 포유동물 세포로부터의 재조합 IL-31(개 IL-31(CHO)은 매우 글리코실화되기 때문에, 비글리코실화 형태가 생물 활성을 보유하는지는 분명하지 않았다. 도 19는 고양이 IL-31이 CHO 세포에서 생성된 기준 IL-31에 필적할 만한 생체활성을 가짐을 보여준다.
개 IL-31의 알라닌-스캐닝 돌연변이유발은 11E12 및 34D03 항체에 대한 결합에 필수적인 단백질내 영역을 결정하였다. 상기 영역내 서열 보존으로 인해(도 20), 상기 mAb들이 고양이 IL-31과 교차반응한다는 가설이 성립되었다.
도 21은 mAb 11E12 및 34D03이 개 IL-31(이. 콜라이)에 결합할 수 있으며 또한 고양이 IL-31 단백질과 교차반응할 수 있음을 보여준다. 상기 데이터에 근거하여, 고양이로의 34D03 항체의 종분화(고양이화)를 실행하였다.
실시예 11. 항체 34D03의 고양이화
기술한 개화 방법과 유사하게, 적절한 생식세포 항체 서열을 mAb 34D03으로부터의 CDR 그라프팅에 모든 이용가능한 고양이 서열로부터 확인하였다. 가변 경쇄(서열번호 71 FEL-34D03-VL-021-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 72이다) 및 가변 중쇄(서열번호 73 FEL-34D03-VH-035-1, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 74이다)를, 개화된 34D03에서 그 각각의 개 프레임워크에 대한 최고 상동성에 근거하여 선택하였다. 그 각각의 불변 중쇄 IgG1(서열번호 75 HC-A 필라인, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 76 진뱅크 수탁번호 AB016710.1이다) 및 카파 불변 경쇄(서열번호 77 LC-카파 필라인, 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 78 진뱅크 수탁번호 AF198257.1이다) 서열에 연결된 선별된 가변 영역들을 이용하여 재조합 고양이화 34D03을 생성하였다. 항체는 HEK 세포로부터 생성하였으며 전술한 바와 같이 정제하였다. 도 22는 개 버전에 필적하는 IC50 하에 pSTAT 신호전달을 중화시키는 고양이 34D03의 능력을 나타낸다.
고양이화 34D03을 고양이 및 개 IL-31 둘 다에 결합하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 도 23은 포유동물 및 이. 콜라이 공급원 둘 다로부터 정제된 단백질을 사용하여 고양이화 34D03에 수행된 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 34D03의 고양이화 형태의 완전 교차-반응성을 나타내는 개 및 고양이 단백질 둘 다에 대한 결정적인 결합이 관찰되었으며, 고양이 단백질에 대한 결합이 확인되었다. 포괄하여, 상기 결과들은 고양이 IL-31 상의 보존된 에피토프가 고양이에서 상기 사이토카인의 억제에 적합한 표적일 수 있음을 시사한다.
실시예 12. 선천적 아토피성 피부염을 갖는 개에서 IL-31 사이토카인의 검출
본 실시예에서는, 아토피성 피부염을 갖는 개들을 포함하여, 개들의 집단으로부터 수집된 혈청 중 단백질을 정량적 면역분석 기술을 이용하여 평가하였다.
하기의 개들의 집단으로부터 혈청을 수집하고, IL-31 혈청 측정 전에 냉동시켰다.
1) 집먼지 진드기 알레르겐(더마토파고이데스 파리나(Dermatophagoides farina), 그리어 랩스(Greer Labs))에 대해 감작화 전 및 후의 24 마리의 목적에 따라 사육된 비글(마샬 바이오리소시즈(Marshall BioResources), 미국 뉴욕주 노쓰 로즈 소재). 모든 동물은 연령이 약 9 개월이었다. 2가지 성은 대략 균등하게 나타났다.
2) 벼룩 감염 전 또는 성체 고양이 벼룩으로 감염후 약 1 주일후 30 마리의 벼룩 알레르기성 개(영스 베터러네리 리서치 서비시즈(Youngs Veterinary Research Services), 미국 캘리포니아주 털록 소재). 상기 집단내 개들의 대부분은 잡종이었다. 평균 연령은 약 10.5 년이었다. 2가지 성이 대략 균등하게 나타났다.
3) 무증상 치주 질환을 가졌지만 그외에는 양호한 건강상태인 것으로 판단된 87 마리의 의뢰인-소유 개들. 샘플은 18개 US 동물 병원에 걸쳐 수집되었다. 동물들은 성별 및 품종 면에서 US 개 개체군을 나타내었으며, 2 내지 5년의 연령이었다.
4) 주인에 의해 평가될 때 최소 "중간정도의 가려움" 및 수의사에 의해 평가될 때 CADESI-02 상 25의 최소 피부 병변 점수를 갖는, 1년 이상 지속된 만성, 비-계절성 아토피성 피부염으로 진단된 224 마리의 의뢰인-소유 동물(변형된 윌렘스(Willemse) 기준 및 프리라우드(Prelaud)를 기준으로[Willemse T., J Small Anim Pract, 27:771-778 (1986); and Prelaud et al., Revue de Medecine Veterinaire, 149:1057-1064 (1998)]). 샘플들은 수의학 피부병학에 전문지식을 가진 14 명의 US 수의사들로부터 수집하였다. 개들의 약 75%가 순수종이었으며, 전체 집단의 약 25%가 레트리버(래브라도(Labrador)(17.3%) 및 골든(Golden)(8.2%))였다. 개들은 중간-연령(약 6세)의 경향을 보였다. 2가지 성이 대략 균등하게 나타났다.
샌드위치 면역분석법을 이용하여 개 혈청중 cIL-31 수준을 정량하였다. 혈청 샘플을 렉시프(Rexxip) 완충액(기로랩(Gyrolab), 뉴저지 워런)에 1:2로 희석하고, 기로랩 xP 단말기를 사용하여 바이오어피(Bioaffy) 1000 nL CD(기로랩) 상에서 실행하였다. cIL-31을 본 발명에 따른 비오틴-표지된 항-IL-31 단클론성 항체로 포획하고, 본 발명에 따른 알렉사플로어(Alexaflour) 647 표지된 항-IL-31 단클론성 항체를 사용하여 검출하였다. cIL-31의 샘플 농도는 기로랩 평가 소프트웨어하에 5-파라미터 피팅 모델을 사용하여 0.013 내지 250 ng/ml의 다이나믹 레인지(dynamic range)를 갖는 8-점 표준 곡선으로부터 추정하였다.
cIL-31의 수준은 선천적 아토피성 피부염(≥13 pg/ml)을 갖는 개의 57%의 혈청 샘플에서 검출할 수 있었지만, HDM에 +/- 감작화된 목적에 따라 사육된 비글, +/- 벼룩 감염된 잡종견, 또는 품종과 관계없이, 치주 질환을 갖지만 그외에는 양호한 건강상태로 간주되는 의뢰인-소유견들로부터의 혈청에서는 검출할 수 없었다(<13 pg/ml). 선천적 아토피성 피부염을 갖는 개들에서, 분석된 샘플의 53%는 13 내지 1000 pg/ml의 혈청내 IL-31 수준을 나타내었고, 4%는 1000 pg/ml 이상의 수준을 나타내었다(표 5).
[표 5]
다양한 개 집단에서의 혈청내 IL-31 수준
Figure 112016017353426-pat00010
본 실시예의 결과는 IL-31 단백질이 개 아토피성 피부염을 갖는 많은 수의 개에서 측정됨을 보여준다. 어떤 하나의 이론에 결부되길 바라는 것이 아니라, IL-31 경로는 개의 아토피성 피부염과 같은(이로 한정되지는 않는다) 소양성 알레르기성 피부 질환의 병리학에 한 역할을 하며, 올라시트닙(olacitnib)을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) IL-31 길항물질 및/또는 개 IL-31에 특이적으로 결합하는 항-IL-31 항체를 사용한 치료적 개입에 새로운 경로를 나타내는 것으로 생각된다.
<110> Zoetis LLC <120> INTERLEUKIN-31 MONOCLONAL ANTIBODY <130> PC71750 <140> PCT/IB2012/053450 <141> 2012-07-05 <150> US 61/510,268 <151> 2011-07-21 <160> 78 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Tyr Tyr Asp Ile Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Ala Arg Gln Asn 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cccataagcc cagtgtgtat gtcctgccgc catccccaaa ggagttgtca 720 tccagtgaca cagtcagcat cacctgcctg ataaaagact tctacccacc tgacattgat 780 gtggagtggc agagcaatgg acagcaggag cccgagagga agcaccgcat gaccccgccc 840 cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900 tggcagcagg gagacccctt cacatgtgcg gtgatgcatg aaactctaca gaaccactac 960 acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaa 993 <210> 42 <211> 335 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 42 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly 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780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005 <210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 44 Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp 1 5 10 15 Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln 35 40 45 Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser 65 70 75 80 His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys 100 105 <210> 45 <211> 318 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 45 aggaacgacg cccagcctgc tgtgtatctg tttcagccct cccctgatca gctgcacact 60 ggctctgcta gtgtggtgtg tctgctgaac agcttctacc caaaggatat caatgtgaag 120 tggaaagtgg acggcgtgat ccaggatact gggattcagg agtccgtgac cgaacaggac 180 aaagattcaa catatagcct gagctccact ctgaccatgt ctagtaccga gtacctgagc 240 cacgaactgt attcctgcga gatcactcat aagtccctgc cctctaccct gatcaagagc 300 ttccagagat cagagtgt 318 <210> 46 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a caninized variable light chain mAb sequence, from Mus musculus and Canis <400> 46 gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctggcc 120 tggtatcagc agaagcccgg ccaggccccc aagctgctga tctacggcgc cagcacccgc 180 gagagcggcg tgccaagcag attttccggc agcggctccg gcaccgactt cagcttcacc 240 atcagcagcc tggaacccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300 ccctacacct tcggccaggg taccaagctg gagatcaag 339 <210> 47 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a caninized variable heavy chain mAb sequence, from Mus musculus and Canis <400> 47 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcaccagcg gcggaggcta cacctacagc 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgcccggaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacagaac 300 tgggtcgtgg gcctggccta ctggggccag ggaacactcg tgaccgtctc gagc 354 <210> 48 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a caninized variable light chain mAb sequence, from Mus musculus and Canis <400> 48 gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60 atcacatgca aggccagcca gagcgtgtcc ttcgccggca caggcctgat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggc ccccaagctg ctgatctacc gggccagcaa cctggaagcc 180 ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcagctt caccatcagc 240 agcctcgaac ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcagaga gtacccctgg 300 accttcggcc agggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 49 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a caninized variable heavy chain mAb sequence, from Mus musculus and Canis <400> 49 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc aactacggca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcagctacg gcggcagcta cacctactac 180 cccgacaaca tcaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccatgt actactgcgt gcggggctac 300 ggctacgaca caatggacta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtctc gagc 354 <210> 50 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a caninized variable light chain mAb sequence, from Mus musculus and Canis <400> 50 gatatagtga tgacacaaac tcctctcagt ctttccgtat caccgggaga accggcttcc 60 atttcctgtc gggcctcaga gtctgtggac aactacggga tatccttcat gcactggtat 120 cagcagaaac ccggccagcc ccctaaactc cttatttaca gggccagtaa tctggaaagc 180 ggtgtgcccg atcgatttag cggttccggg agcggcacag atttcaccct 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nucleotide sequence encoding a caninized variable light chain mAb sequence, from Mus musculus and Canis <400> 54 gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtgt cccctggcga gcctgccagc 60 atcagctgca gagccagcga gagcgtggac aactacggca tcagcttcat gcactggttc 120 cagcagaagc ccggccagag cccccagcgg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180 ggcgtgcccg atcggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gcggatctct 240 cgggtggaag ccgatgacgc cggagtgtac tactgccagc agagcaacaa ggaccccctg 300 acctttggcg ccggtaccaa gctggagatc aag 333 <210> 55 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> canine IL-31 full length protein encoded by codon-optimized nucleotide sequence <400> 55 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala 1 5 10 15 Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu 20 25 30 Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu 35 40 45 Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser 50 55 60 Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro 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truncation (-20N) <400> 58 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 300 caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 360 ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 420 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattga 456 <210> 59 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence corresponding to canine IL-31 protein with N-terminal truncation (-40N) <400> 59 Met Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp 1 5 10 15 Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg 20 25 30 Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu 35 40 45 Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu 65 70 75 80 Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser 85 90 95 Gly Pro Gln Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile 100 105 110 Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His 115 120 125 His His His 130 <210> 60 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding canine IL-31 protein with N-terminal truncation (-40N) <400> 60 atggtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 60 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 120 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 180 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 240 caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 300 ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtcwcgat 360 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cat 393 <210> 61 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence corresponding to canine IL-31 protein with N-terminal truncation (-60N) <400> 61 Met Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro 1 5 10 15 Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys 20 25 30 Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp 35 40 45 Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser 50 55 60 Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu 85 90 95 Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His 100 105 110 <210> 62 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding canine IL-31 protein with N-terminal truncation (-60N) <400> 62 atgcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 60 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 120 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 180 caacaattct ccgcatgtct cgaatccgtc ttcaaatctc tcaattccgg tccacagaag 240 ggcgagctca attcgaagct tgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 300 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cat 333 <210> 63 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence corresponding to canine IL-31 protein with C-terminal truncation at position 20-122 <400> 63 Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30 Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu 35 40 45 Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp 50 55 60 Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu 65 70 75 80 Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile 85 90 95 Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu 100 105 110 Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg 115 120 125 Thr Gly His His His His His His 130 135 <210> 64 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding canine IL-31 protein with C-terminal truncation at position 20-122 <400> 64 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaatct ccgtacctgc cgataccttt gaatgcaaat cctttatcct cactatttta 300 caacaattct ccaagggcga gctcaattcg aagcttgaag gtaagcctat ccctaaccct 360 ctcctcggtc tcgattctac gcgtaccggt catcatcacc atcaccattg a 411 <210> 65 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence corresponding to canine IL-31 protein with C-terminal truncation at position 20-100 <400> 65 Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30 Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu 35 40 45 Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp 50 55 60 Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu 65 70 75 80 Thr Glu Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro 85 90 95 Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His 100 105 110 His His <210> 66 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding canine IL-31 protein with C-terminal truncation at position 20-100 <400> 66 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattattg acaaaattat tgaacaactc gacaaattaa aattccaaca cgaacccgaa 240 accgaaaagg gcgagctcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 300 ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 345 <210> 67 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence corresponding to canine IL-31 protein with C-terminal truncation at position 20-80 <400> 67 Met Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys 20 25 30 Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu 35 40 45 Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Lys Gly 50 55 60 Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu 65 70 75 80 Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His 85 90 <210> 68 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding canine IL-31 protein with C-terminal truncation at position 20-80 <400> 68 atgctcgaat tacaaccttt atcccgcggt ctgctcgaag attaccaaaa aaaagaaaca 60 ggcgtcccag aaagcaaccg tacattactc ctttgcctta cctccgattc ccaaccacct 120 cgtcttaact catcagccat tctcccttat ttccgtgcca ttcgccctct ttctgataaa 180 aatattaagg gcgagctcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 240 ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 285 <210> 69 <211> 444 <212> DNA <213> Felis catus <400> 69 atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggcccc cgcacatcgc 60 ctgcagccga gtgacattcg taaaattatc ttggagctgc gcccgatgtc caagggctta 120 ctgcaggatt atctgaagaa agagatcggg ctgcctgaaa gcaaccatag tagcctgccg 180 tgtttatcgt ctgatagcca gttaccacac atcaatggct ctgcgatttt gccctacttt 240 cgcgccatcc gtccgctgtc cgataaaaat accatcgaca aaattatcga acaactggat 300 aaattgaagt ttcagcgcga gcctgaagcg aaagtttcga tgccagcmga taacttcgaa 360 cgcaaaaact ttattttagc ggtgttgcag cagttttctg cctgtctgga acacgtgctc 420 cagtcactca atagtgggcc acaa 444 <210> 70 <211> 148 <212> PRT <213> Felis catus <400> 70 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala 1 5 10 15 Pro Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Ile Arg Lys Ile Ile Leu Glu 20 25 30 Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Lys Glu 35 40 45 Ile Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser 50 55 60 Asp Ser Gln Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe 65 70 75 80 Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile 85 90 95 Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val 100 105 110 Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val 115 120 125 Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn 130 135 140 Ser Gly Pro Gln 145 <210> 71 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> felinized variable light chain mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 71 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30 Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a felinized variable light chain mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 72 gagattcaaa tgacccagag tcctagctca ctgagcgcat cacccgggga ccgcgtgacc 60 atcacgtgca aggcatctca gtccgtgtca ttcgctggaa ccggtctgat gcactggtat 120 cagcaaaaac cagggaaagt ccctaaactg ctgatctatc gcgcctccaa tcttgaggcc 180 ggggtgccat ctcggttctc tggtagcggc agcggaactg actttaccct gacaatctcc 240 tcactcgagc ctgaagacgc cgccacctac tactgtcaac agtccagaga atacccatgg 300 acctttggac agggtaccaa gctggagatc aaa 333 <210> 73 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> felinized variable heavy chain mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 73 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding a felinized variable heavy chain mAb sequence, from Mus musculus and Felis catus <400> 74 gacgtgcaac tggtcgaaag cggaggcgat cttgtgaagc caggtgggag tctccggctc 60 acatgcgtgg cctctggctt tacctacagc aactacggga tgagttgggt tcgccaggca 120 ccaggaaagg gcctgcaatg ggtggccact ataagctatg gtgggtccta tacctactac 180 cctgataata tcaaggggag attcactatt tcccgcgaca atgctaagaa tactctctac 240 ctccagatga atagcctgaa gactgaggat accgctacct actattgcgt gcgcggctac 300 ggctacgata ccatggacta ctggggacag ggaacccttg tcactgtctc gagc 354 <210> 75 <211> 335 <212> PRT <213> Felis catus <400> 75 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln 145 150 155 160 Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 195 200 205 Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala 225 230 235 240 Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln 260 265 270 Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser 275 280 285 Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 76 <211> 1005 <212> DNA <213> Felis catus <400> 76 gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60 gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120 tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180 gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240 ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300 acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgagatg 360 cttggaggac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420 cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480 atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540 cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagt gtcctcccca tcctacacca ggactggctc 600 aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660 accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720 caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780 cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840 acgaccccgc cccagctgga cagcgacggg acctacttcg tgtacagcaa gctctcggtg 900 gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960 cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005 <210> 77 <211> 110 <212> PRT <213> Felis catus <400> 77 Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp 1 5 10 15 Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln 65 70 75 80 Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Leu Val Lys Ser Phe Asn Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu 100 105 110 <210> 78 <211> 330 <212> DNA <213> Felis catus <400> 78 cggagtgatg ctcagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60 ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120 tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240 agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300 agcttcaaca ggagcgagtg tcagagagag 330

Claims (26)

  1. 고양이 IL-31에 특이적으로 결합하고, 세포-기초 시험에서 IL-31 매개 pSTAT 신호전달(signaling)을 감소, 억제 또는 중화시키는 단리된 단클론성 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체가 키메라성인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  3. 제 1 항에 있어서,
    항체가 고양이화(felinized)된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  4. 제 1 항에 있어서,
    항체가 고양이에서 소양성 질환 또는 알레르기성 질환을 감소, 억제 또는 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  5. 제 4 항에 있어서,
    항체가 아토피성 피부염의 임상 징후를 감소시키는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  6. 제 5 항에 있어서,
    아토피성 피부염의 임상 징후가 가려움, 피부 병변 및 그들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상보성 결정 영역(CDR) 서열들의 하기 조합 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분:
    (1) 11E12: 서열번호 1의 가변 중쇄 (VH)-CDR1, 서열번호 4의 VH-CDR2, 서열번호 7의 VH-CDR3, 서열번호 10의 가변 경쇄(VL)-CDR1, 서열번호 13의 VL-CDR2 및 서열번호 16의 VL-CDR3;
    (2) 19D07: 서열번호 2의 VH-CDR1, 서열번호 5의 VH-CDR2, 서열번호 8의 VH-CDR3, 서열번호 11의 VL-CDR1, 서열번호 14의 VL-CDR2 및 서열번호 17의 VL-CDR3;
    (3) 34D03: 서열번호 3의 VH-CDR1, 서열번호 6의 VH-CDR2, 서열번호 9의 VH-CDR3, 서열번호 12의 VL-CDR1, 서열번호 15의 VL-CDR2 및 서열번호 18의 VL-CDR3; 또는
    (4) CDR1, CDR2 및 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 고양이 IL-31에 특이적으로 결합하는 상기 (1) 내지 (3)의 변이체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    다음으로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분:
    a) 다음을 포함하는 가변 경쇄:
    Figure 112016017353426-pat00011

    Figure 112016017353426-pat00012

    b) 다음을 포함하는 가변 중쇄:
    Figure 112016017353426-pat00013

    Figure 112016017353426-pat00014

    및
    c) 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    항체가 서열번호 32의 IL-31 아미노산 서열의 아미노산 잔기 95 내지 125 사이의 영역에 대한 고양이 IL-31의 상응하는 영역에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  10. 제 9 항에 있어서,
    항체가 서열번호 32의 IL-31 서열의 아미노산 잔기 102 내지 122 사이의 영역에 대한 고양이 IL-31의 상응하는 영역에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  11. 치료 효과량의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 소양성 질환 또는 알레르기성 질환 치료용 수의학적 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생성하는 숙주 세포.
  13. 상보성 결정 영역(CDR) 서열들의 하기 조합 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산:
    (1) 11E12: 서열번호 1의 가변 중쇄 (VH)-CDR1, 서열번호 4의 VH-CDR2 및 서열번호 7의 VH-CDR3;
    (2) 19D07: 서열번호 2의 VH-CDR1, 서열번호 5의 VH-CDR2, 서열번호 8의 VH-CDR3;
    (3) 34D03: 서열번호 3의 VH-CDR1, 서열번호 6의 VH-CDR2, 서열번호 9의 VH-CDR3; 또는
    (4) CDR1, CDR2 및 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 고양이 IL-31에 특이적으로 결합하는 상기 (1) 내지 (3)의 변이체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    CDR 서열들의 하기 조합 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산:
    (1) 11E12: 서열번호 10의 가변 경쇄(VL)-CDR1, 서열번호 13의 VL-CDR2 및 서열번호 16의 VL-CDR3;
    (2) 19D07: 서열번호 11의 VL-CDR1, 서열번호 14의 VL-CDR2 및 서열번호 17의 VL-CDR3;
    (3) 34D03: 서열번호 12의 VL-CDR1, 서열번호 15의 VL-CDR2 및 서열번호 18의 VL-CDR3; 또는
    (4) CDR1, CDR2 및 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 고양이 IL-31에 특이적으로 결합하는 상기 (1) 내지 (3)의 변이체.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 항체의 생성을 야기하는 조건하에서 제 12 항의 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
  17. 치료 효과량의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 고양이에게 투여하는 것을 포함하는, 소양성 질환 또는 알레르기성 질환으로부터 선택되는 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    소양성 질환이 아토피성 피부염, 습진, 건선, 피부경화증 및 소양증으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    소양성 질환이 아토피성 피부염인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    방법이 아토피성 피부염의 임상 징후를 감소시킴을 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    아토피성 피부염의 임상 징후가 가려움, 피부 병변 및 그들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  22. 제 17 항에 있어서,
    알레르기성 질환이 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 식노(heaves), 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 자가면역으로부터 비롯된 염증 과정으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여함으로써, 고양이에서 IL-31 활성을 억제하는 방법.
  24. (a) IL-31을 함유하는 임상적 또는 생물학적 샘플을 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 존재하에 배양하고;
    (b) 샘플 중 IL-31에 결합된 항체를 검출함을 포함하는,
    샘플에서 IL-31을 검출하거나 정량하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    항체가 검출가능하게 표지된 것인, 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    항체가 비표지되고, 검출가능하게 표지된 제 2의 항체와 함께 사용되는, 방법.
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